Universidad Autónoma

Metropolitana

Unidad Iztapalapa

División Ciencias Básicas e Ingeniería Área Ingeniería de Procesos e Hidráulica Licenciatura en Ingeniería Química

Producción de ácido cítrico a partir de Aspergillus niger

Tesis presentada para obtener el grado de Ingenieros Químicos

Presentan:

Ana Alexis Gómez Llanos Enrique Ernesto Cervantes Trujillo César Humberto Gutiérrez Sotres

Asesor:

Dr. Héctor Felipe López Isunza

Agosto de 2013

Tabla de contenido Resumen Ejecutivo .........................................................................................................................i

Nomenclatura ...............................................................................................................................ii

Lista de figuras .............................................................................................................................. iii

Lista de tablas ............................................................................................................................... iv

1 Introducción ................................................................................................................................1

1.1 Definición del Problema ........................................................................................................1

1.2 Consideraciones para la Elección del Microorganismo ...........................................................1

1.3 Justificación Económica .........................................................................................................2

2 Generalidades .............................................................................................................................2

2.1 Los Ácidos Orgánicos en la Industria de Alimentos .................................................................3

2.2 Propiedades y Aplicaciones del Ácido Cítrico .........................................................................4

2.3 Fuentes de Carbono y de Energía para la Vida Celular ............................................................6

2.4 Inoculo y Propagación de Hongos ..........................................................................................6

2.5 El Género Aspergillus .............................................................................................................7

2.5.1 Condiciones de Alimentación del Hongo ...................................................................... 33

2.5.1.1 Aspectos Nutricionales .........................................................................................8

2.5.1.2 Aspectos Físico Químicos ......................................................................................9

2.5.1.3 El Efecto del pH en el Medio .................................................................................9

2.5.1.4 El Efecto de los Iones Metálicos en la Producción de Ácido Cítrico ...................... 10

2.6 La Ruta Biosintética del Ácido Cítrico por Aspergillus Niger ............................................... 10

2.6.1 Glucolisis ....................................................................................................................... 11

2.6.2 Ciclo de los Ácidos Tricarboxílicos .................................................................................. 14

2.7 Modelo Macroscópico de Producción de Biomasa ............................................................. 16

2.7.1 Cálculo de la Biomasa .................................................................................................... 17

2.8 Métodos de Producción .................................................................................................... 17

2.8.1 El Procesos Sumergido .................................................................................................. 18

2.8.2 Proceso en Superficie (Medio Sólido) ............................................................................ 19

2.9 Tipos de Bioreactores ........................................................................................................ 20

2.9.1 El Reactor por Lote ........................................................................................................ 20

2.9.2 El Reactor Continúo ....................................................................................................... 21

2.9.3 El Reactor Semicontínuo ................................................................................................ 21

2.9.4 El Reactor de Flujo Pistón Ideal (FPI) .............................................................................. 22

2.9.5 El Caso del Reactor Quimiostato Ideal ........................................................................... 22

2.10 Termodinámica del Ciclo de Krebs .................................................................................... 22

3 Antecedentes ..............................................................................................................................2

4 Objetivos .....................................................................................................................................2

4.1 Objetivos Generales ..............................................................................................................2

4.2 Objetivos Particulares ............................................................................................................2

5 Metodología Experimental ....................................................................................................... 32

5.1 Conservación de la Cepa ...................................................................................................... 32

5.2 Conteo de Esporas ............................................................................................................... 33

5.3 Crecimiento de Biomasa ...................................................................................................... 33

5.4 Sistema Experimental .......................................................................................................... 33

5.4.1 Experimentación Medio Sólido ..................................................................................... 33

5.4.2 Experimentación Medio Líquido ................................................................................... 35

6 Nuestra contribución al Problema del Crecimiento .................................................................. 39

7 Análisis y Resultados ................................................................................................................ 40

7.1 Resultados Medio Sólido ..................................................................................................... 41

7.1.1 Resultados de Producción de Bióxido de Carbono ......................................................... 41

7.1.2 Resultados de Consumo de Oxígeno ............................................................................. 44

7.1.3 Resultados de Producción de Biomasa .......................................................................... 45

7.1.4 Comparación de la Tasa de Crecimiento y la Biomasa Generada ................................... 46

7.1.5 Los Efectos Térmicos .................................................................................................... 48

7.1.6 Cromatografía de Muestras en Medio Sólido ................................................................ 49

7.2 Resultados Medio Líquido ................................................................................................... 51

7.2.1 Resultados de Consumo de Oxigeno ............................................................................. 51

7.2.2 Estimación de Parámetros XQO2 y akL .................................................................... 51

7.2.3 Cromatografía de Muestras en Medio Líquido .............................................................. 54

8 El Modelo Cinético .................................................................................................................... 55

8.1 Cinética de Crecimiento de Biomasa .................................................................................... 56

8.2 Cinética de consumo de Glucosa ......................................................................................... 57

8.3 Cinética de Producción de Ácido Cítrico ............................................................................... 59

8.3.1 Reactor de Crecimiento ................................................................................................ 59

8.3.2 Reactor de Producción ................................................................................................. 63

9 Balance de materia Global ........................................................................................................ 30

10 Escalamiento de Reactores ..................................................................................................... 64

10.1 Escalamiento para el Reactor de Crecimiento .................................................................... 64

10.2 Escalamiento para el Reactor de Producción...................................................................... 67

11 Elección del Proceso ............................................................................................................... 23

12 Balances de Materia por Equipo ............................................................................................. 68

12.1 Balances de Materia para la Centrifuga-Filtradora ............................................................. 68

12.2 Balances de Materia para la Centrifuga-Filtradora 2 .......................................................... 69

12.3 Balances de Materia para la Centrifuga-Filtradora 3 .......................................................... 70

12.4 Balances de Materia en el Cristalizador-Evaporado ............................................................ 70

12.5 Balances de Materia para la Centrifuga-Filtradora 4 .......................................................... 71

12.6 Balances de Materia en el Secador .................................................................................... 71

13 Balances de Energía ................................................................................................................ 72

13.1 Balances de Energía en Reactor 1 ...................................................................................... 72

13.2 Balances de Energía en Reactor 2 ...................................................................................... 72

13.3 Esterilización de Reactores ................................................................................................ 72

13.3.1 Esterilización en Reactor de Producción ...................................................................... 73

13.3.2 Esterilización en Reactor de Crecimiento .................................................................... 74

14 Ubicación de la Planta de Proceso .......................................................................................... 74

15 Ingeniería Económica .............................................................................................................. 76

16 Análisis de Riesgos .................................................................................................................. 77

17 Conclusiones y Recomendaciones ........................................................................................... 79

Glosario ........................................................................................................................................ 80

Bibliografía ................................................................................................................................... 81

Apéndices

A Tablas de Experimentos ......................................................................................................... 85

B Fichas de Seguridad para los Compuestos Participantes en el Proceso .................................... 89

C Cálculos Económicos .............................................................................................................. 93

D Identificación y Evaluación de Riesgos HAZOP ........................................................................ 97

E Filtradores ............................................................................................................................ 101

F Cristalizadores ...................................................................................................................... 104

G Centrifugadoras ................................................................................................................... 107

H Secadores ............................................................................................................................ 109

I Mezcladores .......................................................................................................................... 111

J Ecuación Logística ................................................................................................................. 114

K Cálculos por Equipo .............................................................................................................. 116

i. Resumen Ejecutivo

En esta tesis se buscaron distintas alternativas para producir ácido cítrico, concluyendo que las mejores están relacionadas con los Bioprocesos, de este modo se encontró que la mejor alternativa fue utilizar A. niger como el agente transformador de glucosa en ácido cítrico. De aquí se desprenden las necesidades de estudio para obtener una mayor producción modificando la concentración de sales que impactan sobre el ciclo de Krebs.

El cambio sustancial que se logró durante la experimentación fue haber observado la precipitación de ZnSO4, esto indicó que no está biodisponible para el microorganismo. Por esta razón se cambió el tipo de sal por ZnCl2.

El ácido cítrico fue producido particularmente por el experimento 9 (medio sólido) con una

concentración de 0.419 g/L, siendo la característica principal de este experimento MgSO4= 0.3 g/L,

MnSO4= 2.15 g/L, ZnCl2= 11 g/L. Para el medio líquido esto fue de gran importancia ya que se

aproximó el rango de concentraciones de metales que orillan a la producción de ácido cítrico,

teniendo como cambio importante el uso de la sal ZnCl2.

Por último el proyecto tiene una inversión total de 5, 494, 700 US, con ganancias por año después

de impuestos 148, 416 US, haciendo que el proyecto tenga 8.6% de rentabilidad.

ii. Nomenclatura

Lk , Coeficiente convectivo de transferencia de oxigeno

a , Área específica de transferencia de Oxigeno

*C , Concentración de saturación de Oxígeno disuelto

LC , Concentración de Oxígeno disuelto

2OQ , Coeficiente especifico de consumo de O2

X , Concentración de células

Subíndice I, se utilizó para etiquetar las variables a nivel industrial.

Subíndice L, se utilizó para etiquetar las variables a nivel laboratorio.

Hl, nivel del caldo de cultivo.

DtL, diámetro del reactor.

Di, diámetro de la turbina.

Li, Ancho de la paleta.

Ai, Altura de la paleta.

Hb, distancia de la turbina a la base del reactor.

Ab, ancho de los deflectores.

N, revoluciones por minuto (RPM)

YP/S, Coeficiente de rendimiento de producto-sustrato

YX/S, Coeficiente de rendimiento de biomasa-sustrato

ri, velocidad de reacción

PAC, Producción de ácido cítrico

P, Presión

x, biomasa seca

S, Peso de sustrato

V, Volumen

v, velocidad

iii. Lista de Figuras

Figura 1. Estructura molecular del ácido cítrico

Figura 2. Consumo de ácido cítrico por destino

Figura 3. Estructura característica de Aspergillus Niger.

Figura 4. Vías metabólicas de la glucosa a ácido cítrico por (a) participación de una fijación de dióxido de carbono anaplerótico (Cleland y Johnson, 1954), y (b) la implicación exclusiva del ciclo de ácido cítrico. Solo intermediarios relevantes se muestran, y las flechas pueden indicar más de una sola etapa enzimática. Nótese que en (b), cada una de las dos moléculas de acetil-CoA es sujeta a una vuelta del ciclo tricarboxílico.

Figura 5. Vía de la biosíntesis del oxalato por Aspergillus niger. Tenga en cuenta que las concentraciones de acetato correspondiente a los de oxalato no se han detectado en filtrados de cultivo de A. niger y por lo tanto el metabolismo de acetato requiere un mayor estudio.

Figura 6. Las dos fases de la glucólisis

Figura 7. Malonato, inhibidor competitivo de la Succianato-deshidrogenasa

Figura 8. Producción de oxalacetato a partir de piruvato

Figura 9. Síntesis de ácido cítrico

Figura 10. Cámara de Neubauer (izquierda) y conteo de esporas con la cámara de Neubauer a través del microscopio (derecha).

Figura 11.. Sistema experimental en medio sólido.

Figura 12. Equipo de laboratorio utilizado.

Figura 13. Esquema geométrico del reactor de tanque agitado.

Figura 14. Se Observa el comportamiento de consumo de O2 y Producción de CO2 en tiempo real durante el muestreo del experimento 1 y 2.

Figura 15. Formación de CO2 contra el tiempo, donde se observan los diferentes tiempos de respuesta al crecimiento, máxima formación de CO2 y deceso del microorganismo.

Figura 16. Curvas obtenidas a partir del tratamiento de datos experimentales, obteniendo su máxima generación de CO2.

Figura 17. Curvas de consumo de los distintos experimentos realizados midiendo el consumo del oxígeno por parte del hongo durante su crecimiento y desactivación.

Figura 18. Graficas obtenidas integrando las áreas bajo las curvas del consumo de O2 para cada experimento.

Figura 19. Se muestran las tendencias de crecimiento de la biomasa experimental en distintos medios de cultivo cuando se utiliza celofán.

Figura 20. Se observan las curvas integrales (azul y roja), con las curvas de crecimiento de biomasa (verde), ambas con la misma fuente de carbono y nutrientes.

Figura 21 Se compara la curva integral (roja) con la curva de crecimiento de biomasa (azul) con la misma fuente de carbono y nutrientes del experimento 3.

Figura 22. Se observan las curvas integrales (azul y roja) con la curva de crecimiento de biomasa (verde), ambas con la misma fuente de carbono y nutriente, con la diferencia que el experimento 11 creció sobre celofán.

Figura 23. Efecto térmico en la producción de CO2.

Figura 24. Curva del cromatógrafo de líquidos de la muestra del experimento 9. La primera curva (de izquierda a derecha) pertenece al agar hidrolizado y la segunda curva al ácido cítrico.

Figura 25. Dinámica del Consumo de O2.

Figura 26. Consumo de Oxigeno cuando el flujo de este se apaga.

Figura 27. Linealización de la zona III.

Figura 28. Cromatograma al t=23h de experimentación, aparición de ácido cítrico.

Figura 29. Crecimiento de biomasa a través del tiempo.

Figura 30. Datos experimentales y línea de tendencia de decaimiento

Figura 31. Cinética de consumo de glucosa

Figura 32. Curva ideal de decaimiento de glucosa y datos de decaimiento.

Figura 33. Datos de producción de ácido cítrico y línea de tendencia.

Figura 34. Formación de ácido cítrico de forma ideal.

Figura 35. Producción de ácido cítrico ideal (curva continua), datos con tendencia de aumento de concentración (puntos discontinuos) en el bioreactor del ácido.

Figura 36. Consumo de glucosa ideal (curva roja), crecimiento de biomasa (curva verde)

Figura 37. Producción de ácido cítrico (curva azul) ideal, producción de biomasa (curva verde)

Figura 38. Producción de ácido cítrico (curva azul) creciente, consumo de glucosa (curva roja) decreciente.

Figura 39. Diagrama de entradas y salidas para la producción de ácido cítrico.

Figura 40. Esquema geométrico del reactor de tanque agitado

Figura 41. Dimensiones de Reactor de crecimiento a nivel Industrial.

Figura 42. Dimensiones de Reactor de Producción a nivel Industrial.

Figura 43. Diagrama de flujo, producción industrial de ácido cítrico.

Figura 44. Diagrama del Proceso Industrial para la producción de ácido cítrico.

Figura 45. Centrifuga filtradora horizontal

Figura 46. Cristalizador evaporador

Figura 47. Se muestran los terrenos donde se podría construir la planta y su cercanía con la carretera México-Cuautla.

Figura 48. Se muestra el mapa cercano a Cuautla con calles y carretera que conectarían con la planta.

Apéndice F

Figura 49. Cristalizador de enfriamiento superficial

Figura 50. Cristalizador de evaporación de circulación forzada

Apéndice G

Figura 51. Cristalizador de tubo de extracción

Figura 52. Centrifugador Horizontal

Apéndice H

Figura 53. Secador directo

Figura 54. Mezcladora de doble hélice (izquierda), mezcladora de hélice sencilla (derecha)

iv. Lista de Tablas

Tabla 1. Propiedades del ácido cítrico

Tabla 2. Objetivos del uso de ácido cítrico en la industria.

Tabla 3. Datos termodinámicos que muestran la energía utilizada en el metabolismo

Tabla 4. Composición del medio de cultivo sólido con una relación C/N =40.

Tabla 5. Composición de la solución de oligoelementos.

Tabla 6. Composición del medio de cultivo sólido con una relación C/N =40, sin levadura.

Tabla 7. Composición de la solución de oligoelementos.

Tabla 8. Composición del medio de cultivo sólido.

Tabla 9. Composición de la solución de oligoelementos.

Tabla 10. Propiedades de solubilidad del ZnSO4 [37].

Tabla 11. Composición del medio de cultivo sólido con una relación C/N =40, sin levadura.

Tabla 12. Composición de la solución de oligoelementos, con cambio de sal a ZnCl2.

Tabla 13. Valores de la tasa de crecimiento asociados a la producción de CO2.

Tabla 14. Tiempos de retención para el cromatógrafo de líquidos de compuestos esperados, que fueran producidos por Aspergillus niger.

Tabla 15. Estándares de compuestos inyectados en el cromatógrafo.

Tabla 16. Dimensiones y relaciones geométricas estándar para un fermentador.

Tabla 17. Diferentes criterios para cambio de escala en tanques geométricamente similares, con

medio y propiedades físicas constantes.

Tabla 18. Nutrientes para el medio de cultivo.

Tabla 19.Datos sobre las condiciones de operación y dimensiones de las tuberías del proceso, (cedula 80).

Rentabilidad en el proceso para la producción de 657000 ton/año de ácido cítrico.

Tabla 20. Características de los equipos del proceso.

Tabla 21. Rentabilidad en el proceso para la producción de 657 T/año de ácido cítrico.

Tabla 22. Descripción de riesgos

Apéndice A

Tabla 23. Composición del medio con una relación C/N =40. Tabla 24. Composición de la solución de oligoelementos. Tabla 25. Composición de la solución de oligoelementos, MnSO4= 5g/L. Tabla 26. Composición de la solución de oligoelementos, MnSO4= 1.075g/L. Tabla 27. Composición del medio con una relación C/N =40, MgSO4=0.1g/L. Tabla 28. Composición del medio con una relación C/N =40, MgSO4=0.3g/L. Tabla 29. Composición de la solución de oligoelementos, ZnSO4= 1.075g/L. Tabla 30. Composición de la solución de oligoelementos, ZnSO4= 1.075g/L.

Tabla 31. Composición del medio con una relación C/N =40, MgSO4=0.3g/L.

Tabla 32. Composición de la solución de oligoelementos, ZnCl2= 11g/L, cambio de sal de Zinc.

Apéndice B

Tabla 33. Identificación de los peligros de Ca(OH)2

Tabla 34. Medidas de lucha contra incendios para Ca(OH)2.

Tabla 35. Controles a la exposición y protección personal.

Tabla 36. Estabilidad y reactividad

Tabla 37. Identificación de peligros

Tabla 38. Medidas contra incendios

Tabla 39. Medidas contra derrames

Tabla 40. Identificación de peligros

Tabla 41. Medidas contra incendios

Tabla 42. Manipulación y almacenamiento

Apéndice C

Tabla 43. Costos de operación Tabla 44. Equipo programado Tabla 45. Costos de manufactura. Tabla 46. Ganancias y costos netos.

Apéndice D

Tabla 47. Análisis HAZOP

1

1. Introducción

1.1 Definición del problema

La producción de ácido cítrico por fermentación en medio superficial a partir de Aspergillus niger (A. niger), es un caso de bastante interés ya que la conversión hacia ácido cítrico es más fácil de manipular con A. niger que con otros hongos, ya que se pueden inhibir la producción de otros metabolitos tales como ácido oxálico y ácido glucónico, además de que la demanda de ácido cítrico es muy grande debido a que su aplicación en la industria es bastante amplia. Por estas razones se harán pruebas a diferentes condiciones de alimentación las cuales tendrán como objetivo maximizar la producción de ácido cítrico, y a su vez disminuir la producción de metabolitos secundarios, una vez realizado esto se hará un análisis de la cinética del crecimiento, y la producción de metabolitos, esto nos permitirá obtener las ecuaciones de diseño concluyendo con el escalamiento del bioreactor. Dando seguimiento a lo anterior se puede formar el proceso completo de la producción de ácido cítrico tomando en cuenta los aspectos económicos, de seguridad y ubicación de la planta.

Se realizará la experimentación en medio superficial debido a que en este medio se puede estudiar con mayor facilidad los cambios que tendrían el crecimiento de A.niger y producción de ácido cítrico el efecto que tienen los diferentes medios de alimentación para A. niger, los efectos que se quieren estudiar son los de los compuestos de sales de Mg, Mn, Zn, y la concentración de glucosa, si bien a nivel industrial se realizará en medio líquido, lo que se pretende en medio sólido es como ya se mencionó el efecto que tienen estas sales sin que intervengan otros parámetros que sí intervienen en medio líquido, tales como, la formación de madejas del microorganismo o crecimiento disperso de las hifas, agitación, concentración de oxígeno disuelto. Con las concentraciones de sales que mayor producción de ácido cítrico arrojen se realizará la experimentación en medio líquido y ver cómo se comporta.

1.2 Consideraciones para la Elección del Microorganismo El ácido cítrico se produce en el metabolismo primario de casi todos los seres vivos pero existen organismos como algunos hongos que lo segregan como desecho, como ejemplos están Aspergillus niger, A. wentii, A. clavatus, Penicillium luteum, P. citrinum, Mucor piriformis, Paeclomyces divaricatum, Citromyces pfefferianus, Candida guillermondii, Saccharomycopsis lipolytica, Trichoderma viridae, Arthrobacter paraffineus y Corynebacterium. Pero para la producción comercial sólo se utilizan mutantes de Aspergillus niger [16].

Las principales ventajas de A. niger son su facilidad de manejo y cosecha, su capacidad de fermentar una variedad de materias primas variadas y baratas (melazas o residuos de azúcares de otras industrias), altos rendimientos de productos, además de la eficiencia económica de la cepa de A.niger [16].

1.3 Justificación Económica

México importa 1007 toneladas al año de ácido cítrico equivalentes a 78 millones de dólares al año, precio establecido por la compañía GREAT VISION INTERNATIONAL INC, lo que a muchas empresas les provoca mayores gastos en pago de impuestos, costos de arancel, que al final impactan en el precio al consumidor, bajo estas premisas el desarrollo del proceso de producción

2

de ácido cítrico por medio de Aspergillus niger es potencialmente atractivo para una instalación de una planta que lleve a cabo la producción a nivel nacional [3,4]

Existen 42 proveedores de Ácido cítrico en México, la producción de ácido cítrico fue de 1 710 toneladas al año [5], en 1999 de acuerdo con datos del INEGI. Si se toma en cuenta que han pasado 13 años desde entonces, y con las predicciones de aumento de consumo 5-8% anuales, en el año (2012) se consumirán 3224 toneladas, tomando en cuenta la crisis económica (2008) y la subsecuente recesión que provocó un sensible descenso en la producción de materias primas entonces suponiendo que sólo creció un 5% el consumo1 [6].

2. Generalidades 2.1 Los Ácidos Orgánicos en la Industria de Alimentos

La incorporación de ácidos en alimentos cumple diversas funciones dependiendo de la aplicación particular. Tales aplicaciones se inscriben en la explotación de una o varias de las siguientes propiedades de los ácidos orgánicos, o sus sales: 1) poder acidulante,2) capacidad amortiguadora o reguladora del pH, 3) agente quelante de iones metálicos, 4) emulsificante, 5) efectos organolépticos.

El principal uso es la acidificación y control del pH en el producto final. Un pH bajo, retarda el crecimiento de microorganismos indeseables (principalmente bacterias) y aumenta la efectividad de conservadores como benzoatos y sorbatos. Asimismo, reduce la necesidad de tratamientos térmicos drásticos durante la esterilización de frutas y verduras enlatadas, o promueve la inactivación de enzimas indeseables como polifenoloxidasas. Un pH bajo alrededor de 3 es indispensable para lograr una consistencia apropiada en geles de pectina, por lo cual los ácidos orgánicos son esenciales en la producción de conservas y jaleas de frutas. También pueden potenciar el sabor de un alimento dependiendo de sus propias características como saborizante y sus propiedades ácidas [26].

Los ácidos tienen propiedades quelantes de iones metálicos. Estos iones son catalizadores de reacciones indeseables en alimentos como decoloración, rancidez, pérdida de nutrientes, etc. Consecuentemente, los ácidos orgánicos mejoran la protección producida por antioxidantes comunes como ascorbatos. Por ejemplo, mezclas de ácido cítrico con antioxidantes son agregadas comercialmente a aceites, salchichas y carnes para prevenir la coagulación al secuestrar los iones de calcio esenciales en este fenómeno [26].

En la forma de sales, los ácidos moderan sabores ácidos extremos en bebidas carbonatadas y balancean el sabor amargo de edulcorantes artificiales, asimismo las sales, principalmente el citrato de sodio, son excelentes emulsificantes durante la elaboración de quesos fundidos, promoviendo una buena textura y adecuada flexibilidad. Su uso como amortiguadores es común en gelatinas y jaleas. Durante la producción de mantequilla y margarina se puede añadir cítrico para ser convertido fermentativamente a diacetilo, compuesto típicamente asociado al sabor a mantequilla [26].

1 Las hipótesis anteriores se hicieron debido a la poca información referida sobre la producción de ácido

cítrico y las industrias que lo procesan.

3

La selección de un ácido en una aplicación particular depende en gran medida de su solubilidad en agua. El ácido cítrico es, por excelencia, el de mayor uso en alimentos por lo cual se le da un énfasis especial en este proyecto.

2.2 Propiedades y Aplicaciones del Ácido Cítrico El ácido cítrico es un ácido tricarboxílico que está presente en la mayoría de las frutas, sobre todo en cítricos como el limón y la naranja, su estructura se muestra en la figura 1 y algunas de sus propiedades se indican en la tabla 1.

Figura 1. Estructura molecular del ácido cítrico

Tabla 1. Propiedades del ácido cítrico [57]

Punto de fusión °C 153

Solubilidad en agua a 25°C (g/100ml de agua) 60

Calor de solución (Kcal/mol) a 25°C 3.9

Viscosidad de soluciones acuosas a 25 °C (Cp) 6.5

El ácido cítrico y sus sales se pueden emplear en prácticamente cualquier tipo de producto alimentario. El ácido es un componente esencial de la mayoría de las bebidas refrescantes, (excepto las de cola, que contienen ácido fosfórico) a las que confiere su acidez, también potenciando el sabor a fruta, con el mismo fin se utiliza en los caramelos, en pastelería, helados, etc. Es también eficaz para evitar el oscurecimiento que se produce rápidamente en las superficies cortadas de algunas frutas y otros vegetales. También se utiliza en la elaboración de encurtidos, pan, conservas de pescado, en la tabla 2 se muestran las utilidades que tiene el ácido cítrico según el alimento, mientras que en el figura 2 se muestra el porcentaje de ácido cítrico utilizado por destino.

4

Tabla 2. Objetivos del uso de ácido cítrico en la industria. [9]

Bebidas

Saborizante y regulador del pH; incrementa la efectividad de los conservantes antimicrobianos

Dulces y Conservas Acidulante y regulador del pH para lograr una óptima gelificación.

Caramelos Acidulante y regulador del pH con el objetivo de alcanzar la máxima dureza de los geles

Verduras Procesadas En combinación con ácido ascórbico, previene la oxidación

Alimentos Congelados

Ayuda a la acción de los antioxidantes; inactiva enzimas previniendo la oxidación indeseable; inhibe el deterioro de la harina y el color.

Frutas y Hortalizas Enlatadas Disminuye el pH; al actuar como agente quelante; previene la oxidación enzimática y la degradación del color, resalta el sabor.

Aceites y Grasas Previene la oxidación

Confitería y Repostería Se utiliza como acidulante, resaltador de sabores y para optimizar las características de los geles

Quesos Pasteurizados y Procesados En forma de sal, como emulsificante y texturizante

Lácteos Estabilizante en cremas batidas

Productos de la Pesca Para bajar el pH en presencia de otros conservantes o antioxidantes

Carnes Se utiliza como auxiliar del procesado y modificador de textura

5

Figura 2. Consumo de ácido cítrico por destino [7].

2.3 Fuentes de Carbono y de Energía para la Vida Celular Las células pueden dividirse en dos grandes grupos según la forma química del carbono que precisan tomar del entorno:

● Células autótrofas: (Autoalimentadas) pueden utilizar el dióxido de carbono como fuente única de carbono y construir a partir de los esqueletos carbonados de todas sus biomoléculas.

● Células heterótrofas: (alimentadas de otros) Que no pueden emplear el dióxido de

carbono, y tienen que obtener el carbono de su entorno en una forma reducida relativamente compleja, tal como la glucosa.

El segundo criterio por el que pueden clasificarse las células es la naturaleza de su fuente de energía:

● Células quimiótrofas: procede de las reacciones de óxido-reducción. Los quimiótrofos, que necesitan moléculas orgánicas complejas como dadores electrónicos tales como la glucosa, se designan como quimio-organótrofos [24]. 2.4 Inóculo y Propagación de Hongos Se comienza inoculando la cepa en un tubo de ensayo el cual contiene el medio de cultivo con los nutrientes necesarios para la producción de algún metabolito en especial o el crecimiento del microorganismo, después de que el microorganismo ha crecido hasta su esporulación éste se mantiene enfriado (Regularmente a 2-5°C). Después se propaga en el bioreactor de fermentación progresivamente aumentando el volumen del medio de cultivo [17].

6

Características generales de las cepas:

● La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable. ● La velocidad de crecimiento debe ser alta. ● La cepa debe estar libre de contaminantes. Sus requerimientos nutricionales deben

cubrirse con medios de cultivo de costo reducido. ● Deben ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo sin pérdida de sus

características. ● Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto. ● Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y de fácil recuperación a

partir del medio de cultivo.

2.5 El género Aspergillus

Este género comprende unas doscientas especies y una gran cantidad de variedades, siendo un grupo heterogéneo de mohos que tienen estadio sexual llamado Emericella, llevándose a cabo su reproducción mediante la producción de conidios o esclerotias (Fig. 3). Su micelio es filamentoso, constituido por hifas ramificadas, generalmente multinucleadas [29]. Por su característica de invasividad, este género es multifacético, ya que puede ser, dependiendo del lugar de su presencia, desde una plaga molesta, hasta un aliado de la industria farmacéutica y alimentaria. Del género Aspergillus se tienen los productos industriales como: antibióticos, enzimas, ácidos orgánicos y alimentos tradicionales, los cuales son de indudable valor comercial y social [29].

Figura 3. Estructura característica de Aspergillus Niger [58].

7

2.5.1 Condiciones de Alimentación del Hongo

2.5.1.1 Aspectos Nutricionales Los microorganismos al crecer experimentan afinidad por el sustrato en el que se desarrollan, promoviendo un mayor o menor crecimiento celular ante la concentración del sustrato presente. Monod expresa lo anterior mediante la ecuación 2.5.1, que determina la relación entre la tasa específica de crecimiento () y la concentración del sustrato limitante en el medio (S) [30].

s

máxKS

S

(2.5.1)

Donde Ks es la constante de saturación media, que es una medida de la afinidad del microorganismo por el sustrato.

Larralde y colaboradores [29] estudiaron el crecimiento de A. niger en un medio superficial (agar) y de G. fugikuroi en un cultivo líquido. Su investigación se enfocó en el estudio de la morfometría y del crecimiento de los microorganismos por consumo de glucosa; de este trabajo se deriva que incrementos en la concentración inicial del medio causan reducciones en la tasa específica de crecimiento.

En general la cantidad de ácido cítrico producido esta en relación inversa con el crecimiento celular. Al inicio de la fermentación, sin embargo, se requiere un balance apropiado de nutrientes que permita la propagación adecuada del micelio. Los factores nutricionales más importantes para una producción exitosa son la concentración y tipo de carbohidratos y el contenido de metales. Los carbohidratos deben ser simples y de fácil transporte a través de la membrana, gracias a la presencia de invertasas extracelulares asociadas a la membrana [25]. Las hidrolasas desdoblan la sacarosa a hexosas y son sumamente activas a las condiciones de fermentación. Gracias a ello el medio de alimentación industrial más usado son las melazas, tanto de caña como de remolacha. Estas últimas son en ocasiones preferidas por presentar un mayor contenido de nitrógeno. Se requiere una concentración particularmente alta de azúcar entre 140-240 g/L, concentraciones menores conllevan a acumulaciones de ácido oxálico y una baja relación cítrico/biomasa [25]. La fuente de nitrógeno debe ser baja, del orden de 0.1-0.4 g/L, proporcionado preferentemente por sales de amonio como sulfato o nitrato. Se ha reportado que un consumo total de nitrógeno en el medio es prerrequisito para la acumulación de ácido cítrico. En ocasiones, el contenido de nitrógeno puede ser alto en tanto el fosfato se mantenga bajo. El fosfato juega un papel regulador importante en reacciones metabólicas. El contenido recomendado se encuentra entre 0.1 y 0.2%. La presencia de metales en el medio de cultivo es indispensable para el crecimiento celular. Estos niveles se encuentran a nivel de unas cuantas partículas por millón. Sin embargo, niveles ligeramente superiores afectan el rendimiento del cítrico dramáticamente. El contenido de metales es crítico pues medios optimizados en fuentes de carbono, nitrógeno y fosforo no promueven la producción de cítrico si los metales no están ajustados adecuadamente. Los más importantes son el hierro, manganeso y zinc. Cobre funciona como antagonista de hierro y manganeso reduciendo el efecto negativo de excesos de estos metales. Finalmente un medio bajo en metales favorece el crecimiento del hongo en forma de madejas. En cultivo sumergido esta morfología es preferible porque resulta un medio de menor viscosidad, en comparación al crecimiento filamentoso disperso, que se traduce en menores costos de aireación y agitación.

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La importancia de niveles bajos de metales obliga a efectuar un pretratamiento de las materias primas usadas. Esto es particularmente el caso de las fuentes industriales de carbono, melazas, por ser el componente fundamental del medio de cultivo y por tener un contenido elevado de cenizas. Varios procedimientos pueden usarse para remover iones metálicos y su selección está dictada por criterios económicos. Entre los más comunes esta la precipitación con agentes quelantes como hexacianoferrato o ferrocianuro de potasio, EDTA y polietilenamina [26]. Es factible el uso de resinas catiónico pero se considera demasiado costoso para fines industriales. Una gran variedad de aditivos han sido recomendados en la fermentación cítrica. Ejemplos incluyen el uso de alcoholes como metanol y propanol, aceite y ácidos grasos de hasta 15 carbonos altamente insaturados o antiespumantes como ocatadecanoli. Es posible que estos compuestos incidan en la permeabilidad de la membrana celular favoreciendo la extracción de cítrico [26]. Cinética del cultivo:

● Fase lag o tasa de crecimiento nulo: adaptación del inóculo al medio. Depende del inóculo (edad y tamaño) y de los nutrientes.

● Fase exponencial o tasa de crecimiento constante: rápida multiplicación de células. ● Fase estacionaria o de retardo: velocidad de crecimiento nula. Las células aún son activas y

pueden producir metabolitos secundarios, productos de la desregulación celular.

2.5.1.2 Aspectos Físico Químicos Una vez definido el medio de cultivo y los pretratamientos adecuados en las materias primas utilizadas es necesario establecer las condiciones de fermentación. Ésta se debe controlar entre 25-30°C. Temperaturas mayores favorecen la acumulación de oxálico. El pH al inicio de la fermentación se ajusta a 3.5-4.5 para favorecer el desarrollo celular y se mantiene en 2 durante la etapa productiva. Un pH superior a 4 favorece la formación de ácido oxálico y glucónico, este último debido a la acción de glucosa oxidasa extra celular activa a pH alto. La aireación del medio es de suma importancia. Una abundante oxigenación es necesaria para garantizar una producción adecuada. El uso de aire enriquecido en oxigeno permite lograr altas productividades, pero el alto costo de esta práctica, no resulta compensado. Curiosamente, breves interrupciones en el suministro de oxígeno detienen irreversiblemente la producción de ácido cítrico sin afectar notoriamente el crecimiento [26].

2.5.1.3 El Efecto del pH en el Medio

Durante el crecimiento de los microorganismos se pueden modificar o producir gradientes en el pH del medio en el que éstos se desarrollan; estas alteraciones suelen ser originadas por una serie de procesos en los que se producen algunos metabolitos secundarios tales como los ácidos orgánicos.

La alteración del pH por el crecimiento microbiano ha sido bastante estudiada; estas investigaciones sugieren que los procesos por los cuales se producen gradientes en el pH del medio son originados por la adición de algunos nutrientes o la falta de aeración del sistema. Estudios realizados por Robinson y colaboradores revelan que las colonias bacterianas crecidas

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sobre agar con glucosa presentan acidificación del medio sólido debajo del micelio, con una zona periférica alcalina [31].

Cabe mencionar que estos efectos son muy notorios en estado líquido. En la experimentación en medio superficial que se realizó en este trabajo se llevó a cabo un inóculo tipo césped para el crecimiento homogéneo del hongo, y no se tuviera este problema de diferencias de pH a los diferentes radios del medio, ya que si el inóculo es por piquete en el centro se tiene un crecimiento radial del hongo, donde las esporas del centro serán más viejas que las de la periferia de las cajas, esto implica que el consumo de nutrientes se ve afectado por la parte fisiológica del microorganismo y por consecuencia la producción de metabolitos, lo cual generaría un gradiente de pH a diferentes radios.

2.5.1.4 El efecto de los Iones Metálicos en la Producción de Ácido Cítrico

Para la fermentación cítrica utilizando Aspergillus niger es de gran importancia el control de los metales; los cationes divalentes deben estar en concentraciones muy bajas, sin llegar al punto de su ausencia [32]. El Aspergillus niger consume el ácido cítrico en medios con presencia del ion Mn+2 (5X10-5 M), mientras que en medios con ausencia de éste la secreción aumenta significativamente (Netik et al., 1997). Los niveles bajos de Mn+2 reprimen las enzimas del ciclo de Krebs a excepción de la citrato-sintetasa; se ha reportado que niveles de 1 ppm de Mn2+ reduce el rendimiento del ácido cítrico en un 10% (Grewal y Kalra, 1995). Además, el Mn2+ tiene efectos sobre la morfología del microorganismo favoreciendo la formación de pequeñas madejas esponjosas y redondeadas, que son los deseados para una máxima productividad de ácido cítrico (Alí et al., 2002). Altos niveles de zinc en cultivos de hongos mantienen el microorganismo en fase de crecimiento y el ácido cítrico no se acumula (Hossain y Ahmed, 19992, Grewal y Kalra, 1995). Papagianni (2004) cita que para la producción de ácido cítrico con A. niger, como valores óptimos 0.3 ppm de Zn+2 y 1.3 ppm de Fe2+, Yigitoglu (1992) menciona que niveles de Fe+2 superiores a 1 ppm son necesarios para la producción de ácido cítrico, pero otros autores afirman que las concentraciones de hierro deben ser muy bajas, alrededor de 0.2 ppm. Sin embargo, se ha reportado que la adición de 2x10-5 M de CuSO4 a melazas de caña, reduce la concentración de Fe+2, debido a la formación de compuestos tales como el FeSO4, los cuales precipitan durante el curso de la fermentación, incrementándose la productividad ácido cítrico; además, reduce el crecimiento e induce una pérdida de la morfología del micelio tipo madejas esféricas (Grewal and Kalra, 1995. Papagianni 2004). También se ha reportado que la adición de Mg+2 y Cu+2, en pequeñas cantidades, aumenta significativamente la producción de ácido cítrico[32].

2.6 La Ruta Biosintética del Ácido Cítrico por Aspergillus Niger. Es bien conocido, desde los estudios de Cleland y Johnson (1954), Martin y Wilson (1951), que el ácido cítrico se forma principalmente a través de la glucolisis.

El catabolismo de la glucosa a través de la glucolisis conduce a 2 moles de piruvato, y su posterior conversión de los precursores de citrato (es decir el oxalacetato y piruvato).

Cleland y Jonshon (1954) fueron los primeros en demostrar que Aspergillus Niger utiliza 1 mol de dióxido de carbono que se libera durante la formación de Acetil-CoA y 1 mol de piruvato a formar 1 mol de oxalacetato (figura 4). Esta reacción es de suma importancia para los altos rendimientos de ácido cítrico, ya que el oxalato solo puede estar formado por una vuelta del ciclo tricarboxílicos,

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que se acompaña de la pérdida de dos moles de CO2 y solo dos tercios del carbono de la glucosa por lo tanto, podría acumularse como ácido cítrico (figura 5), [12].

Figura 4. Vías metabólicas de la glucosa a ácido cítrico por (a) participación de una fijación de dióxido de carbono anaplerótico (Cleland y Johnson, 1954), y (b) la implicación exclusiva del ciclo de ácido cítrico. Solo intermediarios relevantes se muestran, y las flechas pueden indicar más de una sola etapa enzimática. Nótese que en (b), cada una de las dos moléculas de acetil-CoA es sujeta a una vuelta del ciclo tricarboxílico.

Figura 5. Vía de la biosíntesis del oxalato por Aspergillus niger. Tenga en cuenta que las concentraciones de acetato correspondiente a los de oxalato no se han detectado en filtrados de cultivo de A. niger y por lo tanto el metabolismo de acetato requiere un mayor estudio.

2.6.1 Glucólisis

La glucólisis es la degradación de la glucosa que produce piruvato, es una de las diversas rutas catabólicas conocidas generalmente como fermentaciones, mediante las cuales muchos organismos obtienen energía química de varios combustibles orgánicos de ausencia de oxígeno molecular [24].

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Fermentación y respiración.

Los organismos aeróbicos obtienen la mayor parte de su energía de la respiración, que se define como la oxidación de los combustibles orgánicos por el oxígeno molecular; el oxígeno actúa, por tanto, como el aceptor electrónico (agente oxidante) final en la respiración.

Los heterótrofos anaeróbicos obtienen también la mayor parte de su energía de las reacciones de óxido-reducción, pero en este caso, en el proceso de fermentación, los electrones pasan desde un intermediario orgánico producido en la degradación del azúcar, el dador electrónico, hasta otro intermediario orgánico, que actúa como aceptor electrónico.

En la glucólisis anaeróbica se distinguen dos fases principales (ver figura 6). En la primera fase, la glucosa se ceba o se prepara para su catabolismo mediante su fosforilación escindiéndose después para formar el Gliceraldehído-3-fosfato, azúcar de 3 átomos de carbono; en la segunda fase el mencionado compuesto se convierte en lactato [14].

La primera fase de la glucólisis es la fase preparatoria o de recogida; en ella se incorporan a la secuencia glucolítica cierto número de hexosas diferentes después de haber sido fosforiladas por el ATP y se convierten en un producto común, el gliceraldehido-3-fosfato. En esta fase se consumen 2 moléculas de ATP para fosforilar las posiciones 1 y 6 de la hexosa, de forma parecida a como se ceba una bomba.

La segunda fase de la glucólisis es la ruta común para todos los azúcares; se producen en ella las etapas de la óxido-reducción, actuando los mecanismos de conservación de la energía mediante los cuales el ADP se fosforila a ATP, de modo que el rendimiento neto después de restar los ATP empleados en el cebado de la secuencia es de 2 moléculas de ATP por molécula de glucosa degradada a lactato.

Durante la glucólisis tiene lugar tres tipos diferentes de transformaciones químicas cuyos caminos se hallan interconectados:

1. La secuencia de reacciones, mediante las cuales el esqueleto carbonado de la glucosa se degrada y forma lactato, es decir, la ruta de los átomos de carbono.

2. La secuencia de reacciones mediante las que el fosfato inorgánico se transforma en el grupo fosfato terminal de ATP, es decir, la ruta del fosfato.

3. La secuencia del óxido-reducción, o sea la ruta de los electrones.

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Figura 6. Las dos fases de la glucólisis [14].

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2.6.2 Ciclo de los Ácidos Tricarboxílicos El ciclo de los ácidos tricarboxílicos fue postulado por vez primera por H.A. Krebs en 1937. En 1936 Krebs comenzó a estudiar las interrelaciones en el metabolismo oxidante de diversos ácidos dicarboxílicos y tricarboxílicos en suspensiones de papillas de músculo pectoral de paloma, que poseen un ritmo respiratorio muy elevado [26]. Las observaciones y razonamientos que condujeron a Krebs a postular el ciclo de los ácido tricarboxílicos se resumen a continuación:

1. Krebs señaló que las suspensiones de músculo sólo oxidaban a velocidad muy elevadas a algunos ácidos di carboxílicos, a saber, los ácidos succionico, fumárico, málico, oxalacético y oxoglutarico, y únicamente a algunos ácidos tricarboxílicos, los ácidos cítrico, isocítrico y cis-aconítrico (a pH neutro estos ácidos se hallan, por supuesto, en forma de aniones).

2. La oxidación de los glúcidos o del piruvato añadido por parte de las suspensiones de músculo, era estimulada catalíticamente no sólo por cantidades pequeñas de succianato, fumarato, malato y de oxal-acetato.

3. El malonato (figura 6) inhibía completamente la estimulación de la oxidación del piruvato por cualquiera de los ácidos di carboxílicos y tricarboxílicos catalíticamente activos, citados anteriormente. Dado que el malonato es un inhibidor competitivo específico de la succianato-deshidrogenasa y no inhibe a las deshidrogenasas que atacan a los otros ácidos di carboxílicos y tricarboxílicos, Krebs llegó a la conclusión de que la oxidación del succianato a fumarato por la succianato-deshidrogenasa debía constituir un eslabón esencial en una cadena de reacciones que implica a todos los ácidos dicarboxílicos y tricarboxílicos capaces de estimular la oxidación del piruvato.

Figura 7. Malonato, inhibidor competitivo de la

Succianato-deshidrogenasa

4. Al poner a reaccionar oxalacetato y piruvato con una suspensión de músculo en condiciones anaeróbicas, se formaba citrato, Krebs postuló que la condensación de piruvato y del oxalacetato para formar citrato, era el eslabón de unión que faltaba, mediante la cual las diversas reacciones enzimáticas conocidas de los ácidos di carboxílicos y tricarboxílicos podían disponerse formando una secuencia cíclica.

5. Al añadir malonato a las suspensiones de músculo para bloquear la succianato-deshidrogenasa, Krebs vio que se acumulaba succianato cuantitativamente como consecuencia de la oxidación del citrato, del isocitrato, del cis-aconitato o del oxoglutarato, añadidos, tal como podría esperarse de la formulación cíclica que aparece a continuación.

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Figura 8. Producción de oxalacetato a partir de piruvato

6. Además en el músculo intoxicado por malonato, la oxidación del fumarato, del malonato o

del oxalacetato, conducía también a la acumulación cuantitativa del succinato. Esta importante observación estableció claramente que debe existir una ruta para la conversión mediante la oxidación del fumarato en succinato y en la que no interviene succinato-deshidrogenasa. Estas observaciones proporcionaban, por tanto, una sólida hipótesis de Krebs sobre la existencia de una ruta desde el fumarato al succinato, pasando por el oxalacetato y el citrato, estableciendo que la secuencia global de la reacción era cíclica.

7. Krebs vio también que cuando se bloqueaba la utilización del piruvato por el malonato, la

utilización podía ser mitigada o suspendida al elevar la concentración de oxalacetato. Estas condiciones, por cada molécula de piruvato consumida desaparecía una molécula de oxalacetato. Explico este descubrimiento del modo siguiente: en el ciclo no inhibido, una molécula de oxalacetato puede estimular la separación por oxidación de muchas moléculas de piruvato, tal como podría esperarse si el oxalacetato se regenera a cada vuelta de ciclo. Sin embargo, cuando el ciclo está envenenado por el malonato, el oxalacetato ya no puede regenerarse. en estas circunstancias se necesita una molécula de oxalacetato para eliminar a cada una de las moléculas de piruvato formando citrato, el cual es oxidado a succinato. En el músculo intoxicado por el malonato tiene lugar la siguiente reacción global.

Posición del bloqueo por Malonato. Cuando la succianato-deshidrogenasa, se halla bloqueada la oxidación de citrato, del cis-aconitato, del isocitrato, o del a-oxoglutarato conduce a la acumulación de succinato. La inhibición por malonato bloquea también la acción inversa del succinato-deshidrogenasa. Dado que el fumarato se convierte en succinato en presencia de Malonato, Krebs postuló que el oxalacetato, producto final de oxidación del fumarato, reacciona con el piruvato para formar citrato, que es un precursor del succinato.

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8. Krebs demostró que todas las reacciones enzimáticas individuales del ciclo postulado tienen lugar a una velocidad lo suficientemente elevada para observar la velocidad total del empleo del piruvato y del oxígeno por parte del tejido. Por tanto, llegó a la conclusión de que esta serie de reacciones no es sólo la principal si no la única.

A partir de todos estos experimentos y razonamientos, Krebs postuló, a lo que él denominó ciclo del ácido cítrico como la principal ruta de oxidación de los glúcidos en el músculo.

2.7 Modelo Macroscópico de Producción de Biomasa

El crecimiento de una población microbiana en un sistema por lote, generalmente presenta una cinética de crecimiento sigmoidal, que comprende cuatro fases: retardo (lag), exponencial (log), estacionaria y muerte. Han sido propuestas varias expresiones para ajustar esta curva, las cuales generalmente contienen parámetros que no tienen necesariamente un sentido mecanístico o biológico, pero que, sin embargo, describen la tendencia de los datos experimentales adecuadamente. Una de estas expresiones es la ecuación logística, que es un ajuste empírico a la curva de crecimiento (Okazaki et al., 1980), y la cual considera que, al principio, el crecimiento es exponencial, con una tasa de crecimiento constante, característico de una fase en la que los elementos celulares son independientes unos de otros. Conforme pasa el tiempo, la tasa específica de crecimiento disminuye, hasta que, eventualmente, la población alcanza un valor límite (Koch, 1975). De acuerdo con esto, la forma de esta expresión es la siguiente [29]:

máxX

XX

dt

dX1 (2.7.1)

En esta ecuación, Xmax es un valor de biomasa límite del sistema, y el parámetro es aproximadamente la tasa específica de crecimiento observada en la fase exponencial (max de la curva en donde X< Xmax , la cual será considerada como el valor experimental de la tasa específica de crecimiento (obs). Esta ecuación ha sido utilizada tanto en cultivos sumergidos como en sustrato sólido. Se sabe que varía con la concentración del sustrato limitante, y que este cambio es descrito adecuadamente por la expresión de Monod, que tiene la siguiente forma:

SK

S

s max

(2.7.2)

Donde Ks es la constante de saturación, que corresponde al valor de concentración de sustrato en

donde el valor de es de max2

1 .

Es común que para altas concentraciones de sustrato se presente una disminución en la tasa específica de crecimiento, lo cual puede ser descrito introduciendo en la ecuación 2.7.2 un término de inhibición, de manera que se obtiene la siguiente expresión:

i

sK

SSK

S

1

max (2.7.3)

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Cuando sKS y suponiendo que si KK , la ecuación (2.7.3) puede reescribirse como:

)/(1

max

iKS

(2.7.4)

Cabe mencionar que es un parámetro empírico, que se determina por el ajuste matemático de modelos del crecimiento de una masa de micelio, y que ésta masa generalmente se expresa en términos gravimétricos (g/L ó mg/cm2), según se trate de cultivos sumergidos o de superficie.

2.7.1 Cálculo de la Biomasa

La teoría macroscópica, aplicada al crecimiento de los microorganismos, está definida por la cantidad de biomasa seca en el estado estacionario y considerando que no cambia la composición de la biomasa. La composición atómica de un microorganismo está dada por su fórmula elemental CHa1 Ob1 Nc1. Como puede apreciarse, sólo el C, H, O y N fueron los elementos considerados. Esto es válido, si sabemos que ellos representan 95% de la biomasa en base seca. Se considera que el microorganismo crece usando una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno, la cual puede también contener carbono, que produce biomasa y productos. La biomasa es una copia exacta del organismo, es decir con la misma composición elemental. Además, durante el crecimiento se intercambian con el medio ambiente bióxido de carbono (C02), agua (H20) y oxígeno (02) [33].

2.8 Métodos de Producción

El ácido cítrico es un compuesto natural que está presente en todos los seres vivos, aunque especialmente se encuentra más concentrado en las denominadas frutas cítricas, es decir las naranjas y los limones. Por este motivo, los primeros métodos de obtención industrial del mismo fueron a partir de estas frutas. Así, en Italia en el año 1860, el ácido cítrico se producía a partir del jugo de limón, obteniéndose con un rendimiento muy bajo, ya que se necesitaban unas 35 toneladas de limones para obtener una tonelada de ácido cítrico [13].

Los procesos originales de obtención del ácido cítrico estaban basados en un cultivo de A. niger en medio sólido y en superficie en bandejas planas superpuestas. Actualmente sólo un quinto de la producción mundial de ácido cítrico utiliza estos métodos [15].

Daremos un vistazo a los diferentes métodos de producción para la producción de ácido cítrico:

● Producción sintética de ácido cítrico.

El ácido cítrico se había sintetizado a partir de glicerol y más tarde a través de dicloroacetona simétrica, con el siguiente tratamiento;

a. Por tratamiento con ácido cianhídrico y ácido clorhídrico para obtener ácido dicloroacético.

b. Convirtiendo lo anterior en ácido dicianoacetonico. c. Finalmente se trataba con cianuro de potasio para generar la hidrólisis que formaría el

ácido cítrico (ver figura 9), [12].

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Figura 9. Síntesis de ácido cítrico

● Producción microbiana de ácido cítrico.

Currie (1917) encontró cepas de A.niger que producen ácido cítrico cuando se cultiva en medios de cultivo con pH bajos, altos niveles de azúcar y sales minerales. Antes la producción de ácido cítrico daba como producto preferencial ácido oxálico, la diferencia clave entre favorecer la producción de ácido cítrico y/o ácido oxálico fue trabajar a pH bajo, como ahora se sabe con esta condición de pH se suprimió la producción de ácido oxálico (toxico) y ácido glucónico [12].

Pre-tratamiento de materia prima: Filtración y tratamiento de la materia prima con resinas de intercambio iónico, (con el objetivo de eliminar iones metálicos como el magnesio, el zinc, el hierro y sobretodo el manganeso que favorece la producción de ácido oxálico). Currie se sumó a Chas.Pfizer & Co.Inc y su descubrimiento fue la base de la planta de producción de ácido cítrico establecido en los EE.UU por esta empresa en 1923, [12]. El ácido cítrico puede ser producido tanto en procesos de superficie como sumergidos. Varios factores afectan la elección del tipo de procesos: la existencia de capital de inversión, la abundancia de energía, el costo, el entrenamiento de la mano de obra, la existencia de técnicas para la medida y la regulación del proceso.

2.8.1 El Proceso Sumergido2

Este tipo de procesos, presenta varias ventajas en comparación con el proceso en superficie: menor inversión en la construcción y menor inversión total, es necesaria menos mano de obra. También presenta algunas desventajas respecto de los otros métodos: mayor costo de energía, la tecnología de control es más sofisticada, por lo que se requiere un personal más especializado, la formación de espuma también es un problema en la producción de ácido cítrico, pero se soluciona por la adición de antiespumantes. En resumen, el rendimiento es mayor en la producción sumergida [26].

Existen 3 factores especialmente importantes para los procesos sumergidos:

○ La calidad del material para construir el fermentador: El fermentador debe estar protegido de la acción de los ácidos o bien ser de acero inoxidable, porque de no ser

2 El 80% de la producción mundial de ácido cítrico se hace mediante procesos sumergidos.

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así, cuando se alcancen valores de pH de 1 ó 2, se liberarán metales de las paredes del fermentador, que podrán inhibir la formación de ácido cítrico.

○ La estructura del micelio: Si el micelio es largo y filamentoso, la producción de ácido

cítrico en la idiofase desciende. Para conseguir una velocidad óptima de producción, el micelio debe estar formado por madejas muy pequeñas. La relación Cu/Fe determina la estructura del micelio.

○ Suministro de O2: Aunque A. niger requiere poco oxígeno, es sensible a su ausencia.

Por lo tanto, es necesaria la presencia de oxígeno a una concentración solo del 20 – 25% de su valor de saturación.

Se pueden usar tanques agitados con múltiples turbinas o fermentadores de torres tipo air-lift. Estos últimos son favorecidos económicamente por mantener una buena oxigenación a escalas mayores que las obtenidas con tanques agitados. Asimismo, los air-lift favorecen el crecimiento compacto del micelio en forma de madejas con las consecuentes ventajas en la hidrodinámica del medio. En tanques agitados la fricción de las aspas sobre el micelio mantienen un crecimiento fragmentado y poco compacto. En todas las plantas actualmente en operación el proceso es intermitente (por lotes). Después de los pretratamientos para remover metales es necesario esterilizar el medio de melazas con vapor a un mínimo de 120°C debido a la sensibilidad del proceso a contaminaciones por bacterias. La inoculación se realiza indistintamente con esporas o con cultivo vegetativo crecido separadamente en un tanque de alrededor de 10% el volumen del fermentador [26].

2.8.2 Proceso en Superficie En este sistema se utilizan bandejas de acero inoxidable, o aluminio de alta pureza, de 1-2 m2 de superficie y 5-10 cm de altura, que se cargan con el medio de cultivo y se siembran con conidios de A.niger. Al cabo de 2-5 días la superficie está cubierta con una capa de micelio, con esto se verifica una adecuada velocidad de producción de ácido cítrico, y la fermentación se completa en 7-8 días.

Más que un proceso industrial su nivel de uso se restringe a escalas pequeño y su operación es fundamentalmente empírica. Esta metodología emplea materias primas de desperdicio como bagazo de caña, cáscaras y otros residuos de arroz y frutas humidificados al 60-75% de agua. Los sustratos son degradados por amilasas y celulasas presentes en las cepas de A.niger usadas y la operación se termina en 3-5 días. Estos cortos tiempos están ligados a la eficiente aireación en medios sólidos. Los fundamentos de este proceso son las bases de nuevas investigaciones en fase sólida dirigidas a la producción de metabolitos. Un ejemplo es el uso de sólidos inerte impregnados con nutrientes para la producción de ácido cítrico permitiendo el empleo de medios definidos. Esto evita los costosos pasos de pretratamiento para la eliminación de los metales en melazas [26]. Industrialmente existen muy pocas plantas y estas son de baja producción, muy limitadas, unas 500 toneladas al año. El pH del medio se reduce hasta 4 o 5 antes de la esterilización. Después se inocula con esporas, extendiéndose sobre bandejas en capas de 3 a 5 cm de grosor y se incuba a 28°C. El proceso dura unas 90 h, al final de las cuales la solución entera se extrae con agua caliente para aislar el ácido cítrico.

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2.9 Tipos de Bioreactores La elección del tipo de reactor y la operación queda definida por la cantidad que se quiere producir y la pureza del producto (tipo de impurezas, reactivos sin convertir). También determina si se puede lograr un producto de calidad constante y una operación confiable:

● Discontinuo o por lote: una vez que se carga, el proceso ocurre sin ingreso de sustrato ni salida de productos.

● Continuo (quimiostato): hay alimentación continua de sustrato y retiro continuo de productos

● Semicontinuo (lote alimentado): hay ingreso continuo o intermitente de sustratos, sin retiro de productos.

2.9.1 El Reactor por Lote En un lote se observan 4 etapas: 1) Preparación para la nueva operación (limpieza, esterilización, llenado del reactor). 2) Sembrado. 3) Período de crecimiento exponencial. 4) Recuperación del producto del reactor La suma del tiempo involucrado en las etapas 1,2 y 4 son un tiempo muerto, tm, a considerar en el diseño del reactor [17]:

● Varía con el tamaño del reactor y con el tipo de fermentación pero generalmente es del orden de 3–10 horas.

● Tiempo total de operación para llegar a una concentración final de biomasa xf :

(2.9.1)

Dónde: x: concentración másica de células (g/L), (biomasa) μneta: Velocidad específica neta de crecimiento (h-1). La concentración final de biomasa, xf, depende de la cantidad de sustrato limitante del crecimiento y del rendimiento [17]. La mayoría de las fermentaciones operan con una relación xf/x0 de aproximadamente 10–20. La velocidad de producción de biomasa por operación del reactor por lote, se calcula dividiendo la masa total que podemos formar por el tiempo que lleva la operación [17]:

(2.9.2)

En muchos casos no interesa el producto asociado al crecimiento; el crecimiento de las células puede incluso inhibir la producción del producto deseado. En esos casos el producto deseado se

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genera solo con velocidades de dilución muy bajas, muy por debajo de la que lleva a la productividad óptima de biomasa.

Para producción de metabolitos, la productividad en un lote puede superar significativamente a la de un quimiostato.

Otra razón importante para que se prefiera la operación por lote es la inestabilidad genética. Los microorganismos que se emplean suelen ser especies que han sido manipuladas y tienen menor velocidad de crecimiento que las originales.

Un factor a tener en cuenta es la operabilidad y la confiabilidad de la operación. Los reactores por lote conducen a productos con mucha variabilidad, que generan problemas en las etapas de purificación. Sin embargo en los sistemas continuos una falla mecánica o de control de alguna variable de operación o de la esterilización del proceso puede conducir a problemas severos.

Las consecuencias de una falla de operación son más graves en un sistema continuo y las pérdidas mayores.

La economía de mercado influye en la selección del reactor. Un sistema continuo es elegido para plantas industriales que se dedican a un único producto. Diversos productos de fermentaciones se requieren en pequeñas cantidades y su demanda es difícil de proyectar. Los sistemas por lotes son más versátiles, y el mismo reactor puede emplearse para distintos productos.

2.9.2 El Reactor Continúo

● Se agrega un medio con nutrientes en forma continua, a un volumen de control que contiene las células.

● Se retiran continuamente productos y parte de las células. ● Cuando se alcanza el estado estacionario, x, S y P permanecen constantes en un dado

punto del reactor. ● Los cultivos continuos proveen un medio de cultivo constante para el crecimiento de las

células y para la formación de productos. El crecimiento de biomasa suele estar controlado por un nutriente esencial y el resto se agrega en exceso. Las condiciones químicas del medio son constantes [17]

2.9.3 El Reactor Semicontínuo La concentración de células en el reactor en este tipo de operación se mantiene constante. La alimentación se regula mediante el monitoreo de la densidad óptica del cultivo. Se alimenta el medio con los nutrientes, cuando la turbidez supera un límite prefijado. El volumen se mantiene constante retirando una cantidad de fluido equivalente a la que se agrega [17].

● Se usa menos que el quimiostato porque es más elaborado y porque el medio cambia. ● Puede ser muy útil para seleccionar subpoblaciones que puedan soportar condiciones de

estrés, porque la concentración de células se mantiene constante.

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2.9.4 El Reactor de Flujo Pistón Ideal (FPI) Se considera que no hay retromezclado, ya que solo existe a nivel de micromezclado en el líquido, entonces considerando esto los elementos de fluido con células activas no pueden inocular elementos de fluido nuevos aguas arriba, se requiere el reciclado continuo de células para inoculación continua del medio fresco alimentado [17].

● Un FPI es equivalente a un lote, en el cual la posición en el reactor equivale a un tiempo dado en el reactor por lote.

● Equipos con células inmovilizadas (trickling filters) se asemejan a un FPI y no necesitan el reciclado, se usan extensamente en tratamiento de efluentes.

2.9.5 El Caso del Reactor Quimiostato Ideal Este es un tanque agitado que opera con circulación continua del medio de cultivo. La mayoría requiere de un control (pH, T y CO2). Se alimenta medio estéril (X0= 0) a un tanque perfectamente agitado (y aireado si es fermentación aeróbica). Se deja salir la suspensión de células para mantener las concentraciones y el volumen de líquido constante. Las concentraciones a la salida del reactor son iguales a las del interior por la hipótesis de mezclado perfecto.

2.10 Termodinámica del Ciclo de Krebs

Las células vivas se encuentran en constante trabajo. Ellas requieren de energía para el mantenimiento de sus estructuras altamente organizadas, de los componentes de síntesis celular, generar corrientes eléctricas, y muchos otros procesos [34].

El ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs, ciclo A.T.C.) es la vía catabólica prácticamente universal en la que los compuestos derivados de la descomposición de carbohidratos, grasas, y proteínas son oxidadas a CO2, con la mayor parte de la energía de oxidación dirigida temporalmente a los portadores de electrones FADH2 y NADH2. Las 10 reacciones enzimáticas de la glucólisis al principio consumen ATP para sintetizar compuestos fosforilados que tienen dos fases:

1. La glucosa es fosforilada y fragmentada, dando lugar a dos moléculas de triosa G3P. Este proceso consume 2 ATPs.

2. Las 2 G3P se convierten en piruvato, con la producción de 4 ATPs. Por consiguiente, el rendimiento neto de la glucólisis es de 2 ATPs, por molécula de glucosa [35].

El cambio de energía libre ΔG, es una variable que depende de las concentraciones de los reactivos y productos: ΔG= ΔGº+RT ln (productos/reactivos)

Al ser aditivas las energías libres se pueden sumar y obtener la energía total del ciclo y poder predecir si la reacción global es espontanea, para este caso el signo de la suma de las energías de cada reacción es negativa por lo tanto la reacción es espontanea. Lo podemos observar con detenimiento en la tabla 3.

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Tabla 3. Datos termodinámicos que muestran la energía utilizada en el metabolismo [36].

Reacción Enzima ΔG° (KJ/mol)

Citrato Sintasa -32.2

Aconitasa

Aconitasa 6.3

Isocitrato deshidrogenasa

-20.9

αCetoglutarato deshidrogenasa

-33.5

SuccinilCoA Sintasa

-2.9

Succianato deshidrogenasa

0

Fumarasa -3.8

Malato deshidrogenasa

20.7

Total -57.3

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3. Antecedentes

Desde finales de los años 60 se han desarrollado una serie de estudios sobre el crecimiento y la ramificación de hongos filamentosos en medios sólidos y líquidos, para su mayor entendimiento y control en procesos de fermentación; en dichos estudios se han desarrollado modelos para la optimización y diseño de fermentadores, así como modelos que describen el crecimiento fúngico y como éste se ve afectado por las condiciones ambientales, aunque estos modelos sólo son aproximados y no describen totalmente todo lo que ocurre en el microorganismo, por esta razón continúa siendo un tema de mucha importancia que aún sigue teniendo muchas deficiencias.

Una de las especies de hongos filamentosos más comunes es el género Aspergillus. Éste fue descrito por primera vez por Micheli en 1729. El Aspergillus es un hongo ampliamente difundido en la naturaleza ya que se llega a desarrollar en vegetales en descomposición, granos de cereal, tejidos de algodón, lana, plumas, en los edificios en obras, en los aparatos de aire acondicionado y en los alimentos enmohecidos; su medio es un ambiente oscuro, húmedo y cerrado [1].

Las esporas de este hongo pueden sobrevivir en condiciones adecuadas durante miles de años; se han encontrado esporas de A. niger y flavus en la comida, ropas, flores y otros objetos de las tumbas de los faraones del antiguo Egipto. También había una notable presencia de ambas especies en los restos del rey Casimiro de Polonia, en la momia y el sarcófago de Ramses II [1]. Industrialmente se considera que la clave en la producción de ciertos metabolitos es la morfología fúngica, la cual se ve afectada por diversos parámetros durante el proceso de fermentación, tales como: el tipo de medio de cultivo; la tasa específica de crecimiento del mismo; la disponibilidad del oxígeno y los nutrientes del medio; y la actividad de agua en el medio, entre otros [2]. En 1893, C. Wehmer descubrió que cultivos de penicillium podían producir ácido cítrico a partir de la sacarosa. En 1917 comenzó una nueva etapa, cuando el Dr. James Curie se unió a Pfizer. Como químico en alimentos, Curie había estado estudiando la fermentación en la elaboración de queso y descubrió que uno de los subproductos era el ácido cítrico. Otros científicos habían observado esto décadas antes, pero no se dieron cuenta de su potencial. Curie comenzó una serie de experimentos de fermentación usando azúcar y moho de pan, fue capaz de producir pequeñas cantidades de ácido cítrico. Sin embargo, manufacturar grandes cantidades de la sustancia era un desafío. En Pfizer, Curie y su asistente Jasper Kane, trabajaron en secreto. Mejoraron gradualmente el procedimiento y desarrollaron un proceso conocido como SUCIAC, conversión del azúcar en ácido cítrico. La compañía apostó a ese proceso, asumiendo un riesgo calculado y cambiando sus instalaciones aún rentables de bórax y ácido bórico a SUCIAC. Con el tiempo, la producción de SUCIAC comenzó a superar la extracción convencional de productos cítricos. En 1929, Pfizer ya no necesitó ningún producto cítrico importado. Kane participó en el desarrollo de un nuevo método de fermentación en tanque profundo usando melaza en vez de azúcar refinada como materia prima [8].

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4. Objetivos

4.1 Objetivos Generales

Diseñar una planta para producir ácido cítrico con una capacidad de 2 ton/día, a partir de la fermentación de glucosa, en presencia del hongo Aspergillus niger, realizando el análisis de la producción de éste a partir de la utilizando considerando diferentes medios de cultivo.

4.2 Objetivos Particulares

● Estudiar el efecto que tienen los metales como Manganeso, Magnesio y Zinc, además el uso de diversas concentraciones de glucosa en la producción de ácido cítrico y en el crecimiento de Aspergillus niger3.

● Aplicar un modelo Logístico que describa el comportamiento de crecimiento de biomasa, producción de ácido cítrico y consumo de glucosa.

● Dimensionar los equipos mayores y menores de la planta de producción de ácido cítrico.

● Analizar la factibilidad del proceso, tal como evaluación económica, ambiental y rentabilidad.

5. Metodología Experimental

Para observar el comportamiento en el crecimiento A. niger y producción de ácido cítrico con respecto a la variación de la concentración de las sales y de glucosa, se siguieron dos métodos de cultivo con diferentes objetivos; en estado sólido se cambiaron las concentraciones de SO4Mg, SO4Mn y SO4Zn, esto sirvió como una herramienta para acotar los intervalos de concentraciones de sales donde se favorecía la producción de ácido cítrico. Mientras que en medio líquido solo se hizo seguimiento a la producción de ácido cítrico haciendo uso de las concentraciones de sales obtenidas en medio sólido.

Para la experimentación se utilizó la cepa Aspergillus niger 10, de la colección fúngica de la Universidad Autónoma Metropolitana (UAM-I), que se encuentra en el Área de Biotecnología (planta piloto 4, PP4).

5.1 Conservación de la cepa4

La cepa original de A. niger 10, que se encontraba en conservación a una temperatura de 5 °C, fue reactivada por 6 horas a 30 °C en un horno de incubación. Una vez activado, se raspó el micelio con un asa bacteriológica y se inoculó en tubos de ensayo con tapón de baquelita inclinados que contenían Agar Papa Dextrosa (PDA) como medio de crecimiento. Para su crecimiento se mantuvo a la cepa a 30 °C hasta la esporulación (aproximadamente 5 días) y nuevamente se mantuvieron a

3 Se hará el estudio en medio sólido debido a la facilidad de manejo y la reducción de factores externos que

podrían modificar las lecturas de producción que se obtendrían. 4 Toda la parte se realizó en un ambiente estéril, los materiales que se utilizaron, el medio de cultivo todo se esterilizó en una autoclave a una temperatura de 120°C a una presión de 15 Psig durante 15 minutos.

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una temperatura de 5 °C, con el propósito de obtener nuevas colonias y mantener joven al microorganismo.

5.2 Conteo de Esporas

Se tomó un tubo con A. niger activo y se procedió a raspar el micelio con una espátula previamente esterilizada. Se agregaron 30 ml de una solución Tween 80 al 0.1% para emulsificar, posteriormente se agitó la suspensión de esporas. Una vez hecho esto, se realizó una serie de diluciones en tubos Ependorf para contar las esporas en una cámara de Neubauer y se inocularon 2x105 esporas por caja en cada experimento.

Figura 10. Cámara de Neubauer (izquierda) y conteo de esporas con la cámara de Neubauer a través del microscopio (derecha).

5.3 Crecimiento de Biomasa4

Se inocularon 2x105 esporas en cajas Petri de 9 cm de diámetro y 1.5 cm de profundidad que contenían 40 ml de medio de cultivo5; se colocó una placa de celofán encima del medio previamente pesado y esterilizado de tamaño y forma de la caja. Para el experimento se colocaron 21 cajas en el horno de incubación a 30°C durante una semana, tomando tres muestras por día en los horarios de 7:00 am, 3:00 pm y 11:00 pm. El procedimiento utilizado para pesar la biomasa seca fue sacar cada caja de la incubadora y retirar el celofán con biomasa; esté se puso a secar durante 4 horas a una temperatura de 50 °C. Posteriormente se pesó el celofán con la biomasa seca; de esta manera, se logró saber el peso seco de la biomasa.

Báscula Analítica La bascula analítica Cole-Parmer Symmetry fue utilizada para pesar los compuestos como para pesar la biomasa seca generada en la experimentación. Rango de medición: 220g ± 0.0001g.

5.4 Sistema Experimental

5.4.1 Experimentación Medio sólido

El sistema experimental (figura 14) consiste en una caja de vidrio circular de 12.6cm de diámetro y 2.3 cm de profundidad. En la caja se encuentran 3 orificios en los que se colocan dos sensores que

5 Se especifican los medios de cultivo para cada experimento en las tablas 2-9

26

detectan la concentración de CO2 y O2, en el tercer orificio se coloca un termopar que nos permite seguir la temperatura que se tiene dentro de la caja.

Se agregaron 100 ml de medio sólido a las cajas petri modificadas, en cuya superficie, se colocó una lámina de celofán previamente esterilizada sobre la cual se lleva a cabo el crecimiento del microorganismo, con un inóculo tipo césped para que el microorganismo crezca homogéneamente.

Figura 11. Sistema experimental en medio sólido

Al cabo de 7 días aproximadamente se termina el tiempo de vida del microorganismo, en este tiempo se retiró la biomasa con ayuda del celofán, y se colocó en un desecador para posteriormente medir la biomasa seca. El sustrato se hidrolizó con una solución de ácido sulfúrico al 0.75% en peso, para obtener en estado líquido el sustrato, con el fin de analizar la muestra en un cromatógrafo de líquidos (HPLC) y saber cuánto ácido cítrico y otros metabolitos se produjeron.

Cada caja se inoculó con 2X105 esporas, esto con el fin de asegurar la reproducibilidad de las muestras.

Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) Las características de los tres equipos que componen al cromatógrafo de líquidos es el detector, bomba y columna; el detector Perkin Elmer LC-30 RI Detector con un rango de 0.00005 – 2.000 Volts, la bomba Perkin Elmer Binary LC Pump 250 que opera con un flujo inicial 0.05 ml/min y con una rampa 0.1 ml cada 3 min y una presión máxima de operación 700 psi. La columna Eppendorf CH-30 Column Heater con una potencia eléctrica de 125 Watts y resistencia 1000 ohms, un diámetro de 1/4 de pulgada y un largo de 30 cm, la temperatura máxima de operación de la columna es de 155ºC ± 5ºC. La cromatografía se llevó a cabo en una temperatura de 65°C con un flujo de 0.6 ml/min.

Sensores de CO2 y O2

Sensores

Termopar

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El medidor de gas para bióxido de carbono Vernier Sensor de gas CO2 tiene dos escalas de medición: Rango bajo: 0-10,000 ppm ± 10%

Rango alto:0- 100,000 ppm ± 20%

Rango de temperatura: -40-65 °C

el sensor de Oxígeno Vernier Sensor de gas O2 tiene las siguientes características:

Rango de PResión: 0.5-1.5 atm

Rango de medición: 0-21 % ± 1%

Rango de temperatura: 5-40 °C

Composición del Medio de Cultivo en Sustrato Sólido

El crecimiento de A. niger 10 se llevó a cabo sobre un medio sólido (agar-agar) enriquecido con glucosa y se alimentó (NH4)2SO4 para obtener una relación C/N de 40 , además fue agregada una concentración de oligoelementos tal que no se presentaran limitaciones debido a estos componentes a lo largo del crecimiento y producción del hongo. Se variaron las concentraciones de sales como: MgSO4, ZnSO4, MnSO4, ya que estas sales (en forma de iones) intervienen en la producción de metabolitos dentro de la ruta metabólica del hongo y crecimiento de biomasa. Las composiciones del medio basal y de la solución de oligoelementos se presentan en las siguientes tablas 2-9 (para más detalles sobre la composición de cada experimento consultarse el anexo A).

En los medios de cultivo se utilizó Agar-Agar como gelificante a 39 g/L. Este es un polisacárido sin ramificaciones obtenido de la pared celular de varias especies de algas de los géneros Gelidium.

Tabla 4. Composición del medio de cultivo sólido con una relación C/N =40 [20].

Composición medio basal

Compuesto g/L

(NH4)2SO4 1.39

KH2PO4 0.50

MgSO4 •7H2O 0.1, 0.3, 0.60

Extracto de levadura 0.10

Oligoelementos 2 (ml/L)

Glucosa 25

28

Tabla 5. Composición de la solución de oligoelementos [20].

Composición de oligoelementos

Compuesto g/L

FeSO4 •7H2O 2.50

ZnSO4 •7H2O 5.0, 11.0, 13.0

MnSO4 •H2O 1.075, 2.15, 5

H3BO3 5.50

(NH4)6Mo7O24 •4H2O 0.55

Na2EDTA•2H2O 25.0

CoCl2 •6H2O 0.80

CuSO4 •5H2O 0.80

Los nutrientes que se encuentran en la tabla 5 y 6 son un medio rico en nutrientes para que el hongo A. niger se reproduzca hasta su esporulación y comience a producir metabolitos secundarios. Se realizaron cambios en las sales que como iones intervienen directamente en la producción de ácido cítrico, tales como Mg2+, Mn2+, Zn2+; estas variaciones se muestran marcadas en negritas en las tablas anteriores (5, 6).

Se propuso realizar un experimento sin extracto de levadura (tabla 7), teniendo la hipótesis de que esté compuesto, por mínima que sea su cantidad, vuelve muy rico al medio de cultivo debido a que es un producto rico en vitaminas especialmente del complejo B, aminoácidos y otros factores de crecimiento, y es una excelente fuente de nutrientes, pero no se tiene realmente la composición de cada compuesto que contiene (es compuesto complejo) y por lo tanto no se sabe realmente qué tipo de sales contiene y si su presencia modificaría la relación de oligoelementos que se requieren.

Tabla 6. Composición del medio de cultivo sólido con una relación C/N =40, sin levadura.

Composición medio basal

Compuesto g/L

(NH4)2SO4 1.39

KH2PO4 0.50

MgSO4 •7H2O 0.6, 0.1

Oligoelementos 2 (ml/L)

29

Glucosa 25

Tabla 7. Composición de la solución de oligoelementos.

Composición de oligoelementos

Compuesto g/L

FeSO4 •7H2O 2.50

ZnSO4 •7H2O 11.0

MnSO4 •H2O 5

H3BO3 5.50

(NH4)6Mo7O24 •4H2O 0.55

Na2EDTA•2H2O 25.0

CoCl2 •6H2O 0.80

CuSO4 •5H2O 0.80

5.4.2 Experimentación Medio líquido

El sistema experimental en medio líquido (figura 15) consiste en un biorreactor tipo tanque agitado de vidrio de V= 1 L (Modelo ADI 1025, Applikon) se utilizó para los estudios de bioconversiones. El biorreactor tenía un diámetro interno de Dt= 9.5 cm y el volumen de operación fue de Vr = 0.7 L. El biorreactor fue equipado con una sola turbina Rushton de 6 paletas, Di = 4.53 cm, situado a 4.53 cm de la base plana del recipiente. El biorreactor estaba equipado con 2 deflectores equidistantes de 1.0 cm de ancho para mejorar la mezcla líquido-líquido. La temperatura y agitación fueron mantenidas a 30°C y 300 rpm, respectivamente. El pH fue mantenido automáticamente a 3.8 usando NaOH 2M y un electrodo de pH (AppLiSens Z001023511, de 3250 mm longitud, Applikon). La velocidad de flujo de aire en el biorreactor fue de 0.5 vvm y se utilizó aire atmosférico como fase gas, a través de un filtro estéril de (0.22 µm) antes de la aireación al biorreactor, que se dispersó en las dos fases líquidas con un tubo perforado en forma de "L" que comprende de siete orificios de 1.0 mm de diámetro cada uno.

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Figura 12. Equipo de laboratorio utilizado.

Figura 13. Esquema geométrico del reactor de tanque agitado

Las dimensiones del reactor a nivel laboratorio son las siguientes (ver Figura 16): Hl=10.3 cm, nivel del caldo de cultivo. DtL=9.5 cm, diámetro del reactor. Di=4.53 cm, diámetro de la turbina. Li=1 mm, Ancho de la paleta. Ai=1.2 cm, Altura de la paleta. Hb=4.53 cm, distancia de la turbina a la base del reactor. Ab= 1 cm, ancho de los deflectores. El equipo está equipado con 2 deflectores equidistantes.

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El Bioreactor se esterilizó a una temperatura de 120°C a una presión de 15 Psig durante 15 minutos, con el medio de cultivo ya vaciado dentro del recipiente, después de que se enfrío se colocaron los electrodos de medición de pH y se dejaron toda la noche para calibrar y se encendió el flujo de aire (1 vvm), el siguiente paso fue inocular 2.2X108 esporas por carga (0.7L), el experimento duró 5 días.

Cabe mencionar que estos días solo fueron para que comenzara el crecimiento y formación de madejas, después de estos días se necesitaría alimentar más glucosa para iniciar con la producción de ácido cítrico, esto lo comprueba la cromatografía realizada a las muestras que se tomaron, aunque si se produjo ácido cítrico fue en una cantidad muy pequeña, entonces se tiene la hipótesis de que después de que se haya alcanzado la máxima producción de biomasa y al agregar más glucosa esta será solo destinada para la producción de metabolitos.

Las muestras en este experimento se tomaron por duplicado dos veces al día, mañana y tarde, se tomó 1 ml esto con el fin de no alterar el volumen del reactor.

Composición del Medio de Cultivo en Sustrato líquido

En medio líquido se propuso utilizar la siguiente composición de nutrientes, que fue la utilizada por el Dr. Sergio Huerta, modificando el tipo de sal de ZnSO4 por ZnCl2.

Tabla 8. Composición del medio de cultivo sólido

Composición medio basal

Compuesto g/L

Glucosa 140

Nitrato de amonio 2.5

Fosfato de amonio 1

Sulfato de magnesio 0.25

Tabla 9. Composición de la solución de oligoelementos.

Oligoelementos

Compuesto mg/L

CuSO4 •5H2O 40

ZnCl2 0.1

FeCl3 •6H2O 1.3

MnCl2 •4H2O 0.36

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Otro cambio importante fue cambiar el medio de cultivo, del tradicional empleado por Larralde (tesis doctoral) y el de Reyes Ocampo (tesis doctoral) al utilizado por el Dr. Sergio Huerta [15] que citaron los alumnos de proyecto terminal anterior, “producción de ácido cítrico vía microbiana por Aspergillus niger”, 2009, cuyas concentraciones de los nutrientes se muestran en las tablas 9 y 10. La relación carbono-nitrógeno fue modificada y la concentración de MgSO4, ya que el Dr.Huerta [15] utiliza una relación C/N=12 y MgSO4=0.5, y en nuestros experimentos se utilizó una relación C/N=40 y MgSO4=0.1, ya que los datos reportados recomiendan tener una relación mayor a 40 para la producción de ácido cítrico, recalcando que se cambió el tipo de sal que contiene al Zn debido a las razones de biodisponibilidad que ya se mencionaron anteriormente.

6. Nuestra Contribución al Problema del Crecimiento

En la preparación de oligoelementos se observó que alguno de los compuestos precipitaba, lo cual no es favorable en la experimentación ya que esto impide que este compuesto esté disponible para el microorganismo. Los resultados que se obtienen cuando alguna sal precipita no son confiables ya que los cambios que arrojen los medidores de CO2 y O2 no necesariamente se deben al cambio en las concentraciones de nutrientes sino más bien a que algún compuesto no está participando en la ruta metabólica del hongo. El compuesto que precipitaba en la solución de oligoelementos fue color blanco, a partir de esta observación se llegó a la conclusión de que el compuesto que estaba precipitado fue el ZnSO4, sus propiedades de solubilidad se encuentra en la tabla 11.

Tabla 10. Propiedades de solubilidad del ZnSO4 [37].

Compuesto Solubilidad (g/Lagua) Características de precipitado

ZnSO4 580 Color blanco

La solubilidad del Zn en el agua aumenta con la acidez, a pH 11 también aumenta la solubilidad, pero cuando el pH es casi neutro el Zn es insoluble en el agua [37]. Esto nos llevaría a pensar en modificar el pH al que se encontraba la solución de oligoelementos pH=2.5. Aunque realmente ajustar el pH de la solución no tendría mucho caso porque al agregar los oligoelementos al medio de cultivo el pH se modificaría a pH=5.7, cuyo valor está cerca de la neutralidad y este compuesto vuelve a precipitar.

Si algún compuesto está en su forma precipitada no se encuentran bio-disponible, por esta razón se propuso cambiar el tipo de sal ZnSO4 a ZnCl2, el cual es extremadamente soluble en agua (4320 g/L a 25°C [38]), y se observa una solución homogénea, sin ningún compuesto precipitado. Este fue una contribución muy importante derivada de nuestra investigación ya que se aseguró la bio-disponibilidad de todos los compuestos para así poder estudiar realmente el efecto que tiene las diferentes concentraciones de los metales iónicos en el ciclo metabólico, para el crecimiento y producción de ácido cítrico en Aspergillus niger.

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Tabla 11. Composición del medio de cultivo sólido con una relación C/N =40, sin levadura.

Composición medio basal

Compuesto g/L

(NH4)2SO4 1.39

KH2PO4 0.50

MgSO4 •7H2O 0.3, 0.1,0.6

Oligoelementos 2 (ml/L)

Glucosa 25

Tabla 12. Composición de la solución de oligoelementos, con cambio de sal a ZnCl2.

Composición de oligoelementos

Compuesto g/L

FeSO4 •7H2O 2.50

ZnCl2 •7H2O 11.0

MnSO4 •H2O 2.15,5

H3BO3 5.50

(NH4)6Mo7O24 •4H2O 0.55

Na2EDTA•2H2O 25.0

CoCl2 •6H2O 0.80

CuSO4 •5H2O 0.80

7. Análisis y Resultados

Las pruebas realizadas en la caja Petri modificada Figura 11., permitieron medir la producción de CO2 y consumo de O2, como se muestra en la figura 14. Estos resultados son importantes, pues a pesar de que no son evidencia directa de la formación del ácido cítrico, sí nos permitieron conocer fases importantes de crecimiento y la cantidad necesaria de O2 que A.niger necesita para crecer. El CO2 es un indicativo importante de la fermentación aerobia de A. niger ya que está asociado al crecimiento de biomasa, donde se tiene la máxima producción de CO2 también se tiene su máximo

34

crecimiento. El microorganismo consume el oxígeno y la fuente de carbono (en este caso glucosa C6H12O6) que tendrá tres destinos en productos: biomasa, metabolitos y CO2.

Figura 14. Se Observa el comportamiento de consumo de O2 y Producción de CO2 en tiempo real durante el muestreo del experimento 1 y 2.

El balance de masa por átomo de C da mayor certeza a la experimentación pues se pueden descartar posibles errores de medición asociados a la mal calibración de equipos y fugas. Otro parámetro importante a destacar es el tratamiento estadístico de datos experimentales ya que se puede asociar a la producción de CO2 y O2 un coeficiente específico de crecimiento que puede depender de la edad, medio de cultivo (sólido o líquido) y del tipo de microorganismo. Lo cual se explicará más adelante.

7.1 Resultados Medio Sólido

7.1.1 Resultados de Producción de Bióxido de Carbono

Las mediciones de CO2 máximas estuvieron en el rango de 10,000 hasta 100,000 ppm en aire, estas variaciones se debieron a diferentes medios de cultivo. -Se mencionan los puntos máximos de CO2 porque de estos depende el proceso de producción de metabolitos-.

En la Figura 15 se muestran las curvas de producción de CO2 de los 9 experimentos realizados. De estos datos se puede inferir cuestiones como la máxima producción de biomasa generada, regularmente este es el punto en que a nivel industrial se inyecta más fuente de carbono para que produzca los metabolitos requeridos.

Dependiendo del medio de alimentación, los experimentos tuvieron distintas respuestas de crecimiento, la terminación de la fase lag en estos experimentos arrojó respuestas más rápidas en los experimentos 1 y 2 de la Figura 15, que en tiempos cercanos a 2 horas comenzó la formación de bióxido de carbono. Las gráficas también muestran el decaimiento de producción de CO2, debido a la muerte del microorganismo por falta de nutrientes y/o fuente de carbono.

35

Figura 15. Formación de CO2 contra el tiempo, donde se observan los diferentes tiempos de respuesta al crecimiento,

máxima formación de CO2 y deceso del microorganismo.

Para saber cuánto CO2 se formó durante el proceso de crecimiento y muerte es necesario integrar las áreas bajo la curva de la Figura 15 para cada curva. Para esto se recurrió al método del trapecio:

(7.1.1)

Entonces utilizando la ecuación 7.1.1, sustituyendo los tiempos y las masas se generaron las curvas de la Figura 16. El factor más importante de estas es obtener el valor máximo de CO2 producido y utilizarlo para hacer el balance de masa del carbono.

36

Figura 16. Curvas obtenidas a partir del tratamiento de datos experimentales, obteniendo su máxima

generación de CO2.

Además la utilidad puede ir más allá del balance de masa, pues de estas graficas se puede calcular una tasa de crecimiento máxima (μmax) asociada a la generación de bióxido de carbono. Se pueden utilizar la siguiente ecuación logística (7.1.2):

(7.1.2)

Conociendo la masa inicial y final (xmax , x0) de CO2 de cada experimento se procede a sustituirlos en (7.1.2), y se resuelve la ecuación 7.1.2 iterando, así se encontró una μ para ajustar los datos obtenidos de 10.1 dando entonces una aproximación a la tasa de crecimiento de biomasa ideal.

Los valores abajo mostrados corresponden a los ajustes teóricos hechos para las curvas integrales de cada experimento. En la figura 16 las gráficas tienen un comportamiento similar al predicho por la ecuación logística, por tanto se utiliza esta ecuación para encontrar los valores de μ.

µte

x

xx

xx

o

omax

max

1

37

Tabla 13. Valores de la tasa de crecimiento asociados a la producción de CO2.

No. de Experimento μ(h-1)

1 0.132

2 0.137

3 0.108

4 0.124

5 0.118

6 0.123

7 0.152

8 0.222

9 0.208

10 0.182

11 0.123

12 0.137

El experimento 11 mostró una cantidad muy alta de CO2 pues su pendiente es mucho más pronunciada que la del resto de los experimentos y de acuerdo con la μ, fue en un tiempo relativamente corto que alcanzó una máximo crecimiento de biomasa.

7.1.2 Resultados de Consumo de Oxígeno.

Para el caso del consumo O2 se tienen las curvas de la Figura 17, en las cuales se observa un decaimiento de la cantidad inicial de oxígeno debido al consumo de A. Niger que necesita para su crecimiento. Además cambian por tener medios de cultivos diferentes.

Algo que destaca en la Figura 18 para encontrar las curvas integrales de O2, es que los datos experimentales tratados con la ecuación logística formaron líneas rectas, y a estas rectas se les asocia un coeficiente específico de consumo de O2. Siendo el mismo valor aproximado a 0.0738 g/h de O2 para cada una de ellas.

38

Figura 17. Curvas de consumo de los distintos experimentos realizados midiendo el consumo del oxígeno

por parte del hongo durante su crecimiento y desactivación.

Figura 18.Gráficas obtenidas integrando las áreas bajo las curvas del consumo de O2 para cada experimento.

7.1.3 Resultados de Producción de Biomasa

El crecimiento de la biomasa se muestra en la Figura 19 para diferentes experimentos. Un análisis de estos permite comparar las diferentes cantidades de biomasa producidas con las curvas integrales Figura 18 ( obtenidas de 7.1.1) de los experimentos 2, 3, 4 y 11.

39

Figura 19. Se muestran las tendencias de crecimiento de la biomasa experimental en distintos medios de

cultivo cuando se utiliza celofán.

Hay que recordar que las concentraciones de glucosa en los experimentos 2, 3 y 4 es de 25 g/L, mientras que para el experimento 11 fue de 50 g/L. Este aumento en la fuente de carbono da como resultado una mayor producción de biomasa. Ahora, la atención se fija en las diferencias de los experimentos 2, 3 y 4, para los cuales se tienen las variaciones de MnSO4 de: 2.15, 5 y 1.075 g/l respectivamente, las diferencias existentes se encuentran en la pendiente de crecimiento la cual en el experimento 2 es mayor, esto quiere decir que el crecimiento es mayor a diferencia de los experimentos 3 y 4, pero se genera menos biomasa, lo cual creemos que está ligado a la acción del Mn++ que se encuentra formando complejos con el ATP , siendo este uno de los cofactores más importantes para transformar la glucosa en piruvato, pero el mismo ATP participa en otras rutas metabólicas que finalmente pueden interaccionar para formar más biomasa, comparando estos tres experimentos. Siendo interesante que los experimentos 3 y 4 tardaron más tiempo en crecer, pudiendo interpretarse que con mayores o menores concentraciones de MnSO4 se tiene un efecto sobre la terminación de la fase lag extendiendo su duración, cabe mencionar que en la literatura no se encuentra que efectos concretos se tienen en el crecimiento o producción al variar Mn+2, de acuerdo a la Figura 15 experimento 3 se tiene una máxima producción de biomasa cuando la concentración de MnSO4=5 g/L.

7.1.4 Comparación de la Tasa de Crecimiento y la Biomasa generada.

Como ya se dijo antes, a las curvas integrales de los datos obtenidos de CO2 se le puede adjudicar a través de la ecuación logística, una tasa de crecimiento de biomasa μ, de este modo se puede realizar una comparación de las curvas integrales con las curvas de crecimiento de biomasa.

En esta comparación se puede observar como las pendientes de las curvas de CO2 tienen una tendencia, sino igual, si muy similar a las pendientes de la gráfica de crecimiento de la biomasa. Para la figura 20 se tiene que μ1,2 es igual a 0.132h-1 y a 0.137h-1 respectivamente, pero la

40

pendiente solo coincide en las primeras horas cuando el crecimiento es pequeño. Mientras que cuando en crecimiento es máximo, no se da el paralelismo de las pendientes.

Figura 20. Se observan las curvas integrales (azul y roja), con las curvas de crecimiento de biomasa (verde), ambas con

la misma fuente de carbono y nutrientes.

Para la figura 21 se tiene una mayor coincidencia en la pendiente del par de curvas, con una diferencia en el máximo del crecimiento a las 88 horas, mientras tanto la curva integral genera una μ=0.108h-1.

Figura 21. Se compara la curva integral (roja) con la curva de crecimiento de biomasa (azul) con la misma fuente de carbono y nutrientes del experimento 3.

41

En la figura 21 las pendientes de las curvas son casi paralelas desde las 40 hasta las 72 horas de crecimiento para este periodo puede ligarse una μ=0.124h-1, pero en el resto del crecimiento no está determinado su coincidencia.

En la figura 22 se tiene la mayor coincidencia entre las gráficas de curva de integración de CO2 y la de crecimiento de biomasa, donde incluyendo la terminación de la fase lag coinciden las curvas, a pesar de la diferencia que existe con el crecimiento con y sin celofán, debido a la difusión de nutrientes a través del celofán, y para este experimento se tiene una μ11, 12 de 0.123h-1 y 0.137h-1 respectivamente.

Figura 22. Se observan las curvas integrales (azul y roja) con la curva de crecimiento de biomasa (verde), ambas con la

misma fuente de carbono y nutriente, con la diferencia que el experimento 11 creció sobre celofán.

Para comprobar el valor de la μ teórica obtenida de las curvas integrales de CO2, se usa la ecuación logística para biomasa sustituyendo los valores de la masa obtenidos de la experimentación y comparándolos, recalculando el valor de μexp y comparando los valores de estos.

max

1M

MM

dt

dM (7.1.3)

7.1.5 Los Efectos Térmicos

Los procesos biológicos presentan una gran sensibilidad a los cambios de temperatura, las condiciones de control en estos sistemas tienen gran importancia, para esto se utilizó una cámara a temperatura controlada por medio de una resistencia con un ventilador y un reóstato que controla la corriente eléctrica a la resistencia y mantiene así la temperatura a un valor constante seleccionado.

42

En la figura 23 se muestran los efectos del cambio de temperatura más notable durante la experimentación 11:

Figura 23. Efecto térmico en la producción de CO2.

7.1.6 Cromatografía de Muestras en Medio Sólido

Se usó un HPLC para determinar la cantidad de ácido cítrico que fue generado por el proceso biológico, con los siguientes resultados de las sustancias blanco que se esperaba que pudieran producirse:

Tabla 14. Tiempos de retención para el cromatógrafo de líquidos de compuestos esperados, que fueran producidos por Aspergillus niger.

Estándar Tiempo de Retención (min) Área (mV*s)

Ácido Oxálico 7.667 567972

Ácido Cítrico 8.500 648256

Glucosa 9.333 748828

Glicerol 13.50 562370

Ácido Fumárico 14.500 700798

43

Después de realizarse la cromatografía de los experimentos, el único que arrojó resultados positivos para el ácido cítrico fue el experimento 9, y se obtuvo una señal del tiempo de retención de la columna de cromatografía a los 8.167 minuto con un área de 54408.13 mV*s.

Figura 24. Curva del cromatógrafo de líquidos de la muestra del experimento 9. La primera curva (de izquierda a

derecha) pertenece al agar hidrolizado y la segunda curva al ácido cítrico.

EL retardo en el tiempo de la señal se pudo dar porque el Agar hidrolizado retuvo al ácido cítrico durante su paso por la columna. Usando la relación para conocer que concentración de ácido cítrico:

estandar

estandar.Área

ÁreaCC muestra

CitricoAc (7.1.4)

Donde ,son la concentración de ácido cítrico resultante y la concentración de ácido cítrico estándar, y son el área de la muestra de experimentación y el área de estándar, sustituyendo valores de las áreas y la concentración estándar de 5 g/L, se obtiene un valor de 0.419 g/L de ácido cítrico.

Aunque es prematuro y simplista la comparación de las gráficas anteriores nos da una idea del problema que implica tener variaciones de temperatura. Para el A. niger la temperatura ideal de operación se encuentra alrededor 30 °C, una temperatura mayor genera problemas en las reacciones metabólicas, y las temperaturas bajas hacen más lentos a los ciclos metabólicos, vinculados también a las reacciones, pero por la complejidad del tema de los múltiples ciclos que existen y el poco tiempo para describir a profundidad sus funcionamientos se hace esta rápida mención.

44

7.2 Resultados Medio Líquido

7.2.1 Resultados de Consumo de Oxígeno

Balance de O2 en el biorreactor por lotes, utilizando 140 g de glucosa.

XQCCakdt

dCOLL

L

2)( * (7.2.1)

Donde;

Lk : Coeficiente convectivo de transferencia de oxigeno

s

m

a : Área específica de transferencia de Oxigeno

3

2

m

m

*C : Concentración de saturación de Oxígeno disuelto

L

mgO2

LC : Concentración de Oxígeno disuelto

L

mgO2

2OQ : Coeficiente especifico de consumo de O2

smg

mg

esporas

O2

X : Concentración de células

L

gesporas

7.2.2 Estimación de Parámetros XQO2y akL

Para estimar los coeficientes, específico de consumo de O2 y convectivo de transferencia de O2, se realizó el siguiente experimento en un reactor de tanque agitado en operación por lote:

Se inició el experimento con los nutrientes adecuados y una concentración de esporas inicial de Aspergillus Niger de esporas, se inició con una concentración de oxígeno disuelto de ~100%, como se muestra en la figura 26 zona I, la ecuación que describe esta zona es:

XQCCak

dt

dC

OLL

L

2)(

0

*

(7.2.2)

45

Después de 3:45 h:m se apagó la corriente de entrada de oxígeno, en este momento el microorganismo comienza a agotar el oxígeno disuelto disponible (ver figura 26) y de la ecuación 7.2.2 se sabe qué;

XQCCak

XQdt

dC

dt

dC

OLL

OLL

2

2

)(

,0

*

(7.2.3)

De lo que se puede decir, que la biorreacción está limitada físicamente (bioreactor limitado físicamente), la ecuación 7.2.3 describe la zona II que se muestra en la figura 25.

Figura 25. Dinámica del Consumo de O2.

De la zona II se puede obtener el coeficiente respiratorio del organismo ya que, en esta zona se describe la ecuación 7.2.3;

Resolviendo 7.2.3

*

0

2

2

*

CXtQC

dtXQdC

OL

t

O

C

C

L

L

(7.2.4)

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

CC

O2

t (h:m)

CCO2 vs t

zona I

zona II

zona III

46

B

CL1ln

Figura 26. Consumo de Oxígeno cuando el flujo de este se apaga.

Por lo tanto el coeficiente respiratorio de Aspergillus niger es:

s

mgXQ

XQm

O

O

O

2

2

2

0118.1

0118.1

Para estimar el coeficiente de transferencia convectivo de Oxígeno, se resuelve la ecuación 7.2.1;

atkB

CL

L

1ln (7.2.5)

Donde;

ak

XQCB

L

O2* (7.2.6)

Entonces se grafica vs t, para que de esta manera se pueda obtener el coeficiente convectivo de transferencia de oxígeno.

y = -1.0118x + 93.992 R² = 0.9551

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25 30

CC

O2

t(h:m)

Zona II

47

Figura 27. Linealización de la zona III.

De esta gráfica se obtiene que el coeficiente convectivo de transferencia de oxígeno es:

11237.0

1237.0

sak

akm

L

L

7.2.3 Cromatografía de Muestras en Medio Líquido

Los estándares inyectados en el cromatógrafo fueron:

Tabla 15. Estándares de compuestos inyectados en el cromatógrafo

Estándar t ren. (min) Área (uV*seg) Concentración (g/L)

Oxálico 7.667 567972 5

Cítrico 8.33 648256 5

Glucosa 9.333 748828 5

Glicerol 13.5 562370 5

Fumárico 14.5 700798 5

y = -0.1237x - 0.376 R² = 0.8769

-4

-3.5

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0 5 10 15 20 25 30

Ln(1

-(C

L/B

))

t (h:m)

Ln(1-(CL/B)) vs t

48

Figura 28. Cromatograma al t=23h de experimentación, aparición de ácido cítrico.

En la figura 29 se muestra la muestra al tiempo t=23 h, que fue donde inició la producción del ácido cítrico. Los demás cromatogramas se muestran en el apéndice C.

La producción de ácido cítrico en medio líquido fue 1.69g/L.

8. El Modelo cinético

Por lo regular se considera que la producción de metabolitos son reacciones de segundo orden en las cuales interviene el sustrato y una cantidad inicial de biomasa o enzimas, que interactúan entre sí para obtener un producto, pasando por un complejo sustrato-microorganismo (I).

(8.1)

Donde S es el sustrato, E enzimas (masa de microorganismo), I intermediarios, P es el producto, y las k1,2,3 son constantes de las velocidades de reacción. Este planteamiento lo establece Michaelis y Menten para describir las reacciones bioquímicas.

Como ya se dijo esta reacción es de segundo orden y ante la falta de datos de algunos factores que afectan el crecimiento y desempeño del Aspergillus niger durante su cultivo y producción se utiliza un modelo matemático que describa el crecimiento bacteriológico, para estos fines se realiza utiliza la ecuación logística, para predecir el comportamiento ideal del crecimiento de biomasa, consumo de glucosa y la producción de ácido cítrico.

Otro punto importante es la obtención de los parámetros de rendimiento (Y), de acuerdo con su definición, se obtiene de la relación de las velocidades de reacción involucradas en el proceso metabólico de las que se desprenden los productos [45].

(8.2)

49

Pero esta solo es válida para la fase exponencial relacionando el periodo crecimiento del microorganismo con este comportamiento y con la producción de metabolitos y consumo de sustrato en el mismo intervalo de tiempo.

8.1 Cinética de Crecimiento de Biomasa

El crecimiento de biomasa se realizó a 30°C con un pH de 3.8 y un flujo de aire de 3 L/min, con una agitación de 200 rpm, que ayuda a formar las madejas del hongo.

Para determinar el crecimiento de la biomasa se utiliza la ecuación logística (Anexo B) para poder observar su crecimiento a través del tiempo, esta ecuación demuestra el crecimiento exponencial de una población bajo ciertas condiciones en este caso tomando en cuenta la cantidad inicial y final de biomasa que se usó durante el cultivo, la velocidad de crecimiento calculada en la tesis doctoral de Sergio Huerta Ochoa, μ=0.03h-1, en la siguiente gráfica se muestra su comportamiento teórico con un medio de alimentación de 140 g de glucosa/L. Teniendo como masa inicial de Aspergillus niger 0.055 g .

0

10

20

30

40

0 50 100 150 200 250

Crecimiento de Biomasa

Bio

ma

sa

(g

)

Tiempo (h)

Figura 29. Crecimiento de biomasa a través del tiempo

La pendiente después de las 50 horas muestra pendiente muy pronunciada, esto significa un rápido crecimiento debido a que el medio de cultivo tiene una fuente de carbono importante. La biomasa alcanza su máximo crecimiento después 180 horas de cultivo, una vez terminado este periodo, las madejas de biomasa son inyectadas a un segundo reactor donde se llevará a cabo la fermentación de glucosa exclusivamente. En este punto se elimina de la alimentación a los oligoelementos, para evitar su intervención en un segundo proceso de crecimiento.

El valor del factor de inhibición b para la biomasa de 7.4x10-4(gh)-1. De este modo ahora la ecuación cinética o mejor dicho la velocidad de crecimiento es:

50

(8.1.1)

8.2 Cinética de Consumo de Glucosa

El seguimiento del consumo de glucosa es de primordial importancia pues es el principal indicador del crecimiento de biomasa y por acumulación interna de algunos productos desprendidos de los ciclos metabólicos, tal es el caso de este estudio de la producción de ácido cítrico, ácido oxálico, entre otros.

La tendencia observada del proceso la describe como una ecuación de segundo grado, pero solo esto es la manera en que sucede el decaimiento de la concentración de la glucosa.

40

60

80

100

120

140

160

0 20 40 60 80 100 120

Tendencia de consumo de glucosa

Cglu

re

al (g

/L)

Tiempo (h)

Figura 30. Datos experimentales y línea de tendencia de decaimiento

Los datos obtenidos de la experimentación muestran una gran irregularidad en su comportamiento, sin embargo aún se puede observar su tendencia es decreciente, se pueden además utilizar la información final e inicial de la concentración para obtener una curva que describa de manera clara lo que sucede con la glucosa, de este modo se vuelve a utilizar la ecuación logística.

La suposición bajo la cual se trabajó fue que la glucosa en principio se destinó al crecimiento del A. niger, y no a generar metabolitos. Entonces el consumo de la glucosa está asociado al crecimiento del microorganismo se puede emplear la ecuación logística con la tasa de crecimiento propuesta.

51

60

80

100

120

140

160

0 20 40 60 80 100 120

Consumo de glucosaC

glu

(g

/L)

Tiempo (h)

Figura 31. Cinética de consumo de glucosa

La cantidad inicial de glucosa es de 143.32 g/L y la final de 64.41g/L, agregando los datos que van desde el tiempo de inicio (t=0) hasta 119 horas, que fue el final del experimento, se introdujeron en la ecuación logística para observar un comportamiento ideal del consumo de la fuente de carbono. Se utilizará e parámetro reportado por el Dr. Sergio Huerta Ochoa de la relación biomasa sustrato que tiene valor de YX/S=0.29 g biomasa/g sustrato, que posteriormente será usado para el escalamiento del reactor.

40

60

80

100

120

140

0 20 40 60 80 100 120

Curva logistica y datos experimentales

Cglu

co

sa (

g/L

)

Tiempo (h)

Figura 32. Curva ideal de decaimiento de glucosa y datos de decaimiento experimentales.

52

El valor para la constante a es igual al valor de la velocidad de crecimiento de biomasa μ=0.03h-1, en tanto el valor del factor de inhibición que para el caso de consumo de la glucosa se convirtió en factor de inhibición de consumo es b=4.65x10-4L/g*h. La ecuación cinética de consumo de glucosa es:

(8.2.1)

Sin embargo aunque la suposición fue que la glucosa se destinó por completo a la biomasa, la cromatografía de líquidos (HPLC), arrojó como resultado la generación de ácido cítrico.

8.3 Cinética de producción de ácido cítrico

8.3.1 Reactor de crecimiento

El ácido cítrico como ya se ha dicho es producto del ciclo de Krebs que sucede en la mitocondria, cuando el A. niger deja de crecer, la fuente de carbono (glucosa) se deja de destinar para este fin. Entonces la glucosa se emplea para los ciclos metabólicos, que comienzan a acumular los productos de estos ciclos y son excretados hacia el exterior del microorganismo.

Parte de esta explicación da idea del porque en las primeras horas de experimentación no hay presencia de ácido cítrico, pero su aparición tan temprana podría tener su explicación en la alta concentración de glucosa, que permitió un paso rápido al piruvato y consecuentemente al ácido cítrico, descrito en el ciclo de Krebs.

0

0.5

1

1.5

2

0 20 40 60 80 100 120

Tendencia de producción de Ac. Citríco

Cac.

cit r

ea

l (g

/L)

Tiempo (h)

Figura 33. Datos de producción de ácido cítrico y línea de tendencia

El comportamiento de la formación de ácido se describió inicialmente con una línea de tendencia cúbica, pero esto no permite comprender el proceso que se está llevando a cabo, además de la limitada comprensión de los procesos catabólicos que se describen en el ciclo de Krebs, sería complejo describir e interpretar algunos de los coeficientes que emergen de la ecuación cúbica.

53

La curva de tendencia cúbica asemeja a una curva sigmoidea en este caso en particular. Además en la literatura se encuentran comportamientos similares. Esto puede suponer que para describir la cinética del ácido como el crecimiento obedece a un comportamiento que describe la ecuación logística.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

20 40 60 80 100 120

Cinética de formación de Ac. Cítrico

Cac.

cit.

(g/L

)

Tiempo (h)

Figura 34. Formación de ácido cítrico de forma ideal

La forma de simplificar la producción de ácido cítrico nuevamente se realiza con la ecuación logística, ya que la presencia de ácido desde las 23 horas de experimentación estaba ocurriendo durante el crecimiento de la biomasa, asociando la tasa de crecimiento con los datos de producción inicial y final ácido cítrico 0.55 g/L y 1.69 g/L respectivamente. De los resultados finales se pude encontrarla relación de masa de ácido respecto al sustrato YP/S=0.021.

0

0.5

1

1.5

2

0 20 40 60 80 100 120

Curva logistica Ac. Cítrico con datos experimentales

Cac.

cit (

g/L

)

Tiempo (h)

Figura 35. Producción de ácido cítrico ideal (curva continua), datos con tendencia de aumento de concentración

(puntos discontinuos) en el bioreactor del ácido.

54

La ecuación cinética para la producción de ácido cítrico durante el crecimiento del A. niger tiene los valores de a=0.03h-1y b=1.8x10-2L/g, resultando:

(8.3.1)

Cuando se compararon los comportamientos de crecimiento de biomasa y el consumo de glucosa, se observa (Figura 39) que el crecimiento del microorganismo aún no termina de alcanzar su máximo crecimiento, con la misma concentración de glucosa que el Dr. Sergio Huerta 140g/L [48], la mayor cantidad de biomasa obtenida y por tanto la máxima tasa de crecimiento se tiene a 210 horas de cultivo.

40

60

80

100

120

140

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 20 40 60 80 100 120

Consumo de Glucosa vs. Biomasa

Cglu

co

sa (

g/L

) Bio

ma

sa

(g)

Tiempo (h)

Figura 36. Consumo de glucosa ideal (curva roja), crecimiento de biomasa (curva verde)

Esto significaría que faltaron 3 días de crecimiento, sin embargo la concentración de glucosa empezó a tener un comportamiento de poca variabilidad, esto podía interpretarse como el final del crecimiento de la biomasa. El cruce de las dos curvas (crecimiento y producción) se da después de las 65 horas, cuando la curva ideal de consumo de glucosa comenzó hacer menos pronunciada su pendiente, mientras tanto el crecimiento de biomasa se encontraba en su fase exponencial.

Realizando otra comparación, ahora de producción de ácido cítrico contra generación de biomasa se observa como los datos experimentales están ligados al crecimiento de biomasa, aunque en la literatura se menciona que la producción del ácido es secundaria al crecimiento del microorganismo [46].

55

0

0.5

1

1.5

2

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 20 40 60 80 100 120

Comparación Ac. Cítrico vs. Biomasa

C a

c.

cítri

co

(g

/L)

Bio

ma

sa

(g)

Tiempo (h)

Figura 37. Producción de ácido cítrico (curva azul) ideal, producción de biomasa (curva verde)

Volumen en Bioreactores de crecimiento

De acuerdo con los resultados presentados por el Dr. Sergio Huerta Ochoa [48] en su tesis de doctorado, obtuvo un YX/S=0.29g biomasa/gS de y una tasa de crecimiento de biomasa μ=0.03h-1. En tanto la experimentación arrojó una producción de ácido cítrico de 1.69 g/L, dando como resultado un YP/S=0.021g A. cítrico/gS.

Se utiliza un balance de masa en caja negra, esto significa que pues solo es de interés la velocidad de crecimiento en el reactor, si existen metabolitos como parte del proceso en este momento pasa a un segundo plano. Para esto la ecuación en un reactor por lotes con volumen constante es:

(8.3.2)

Utilizando los datos obtenidos se sustituyen en la ecuación y finalmente se despejan para obtener un volumen aproximado del líquido V=19754 L.

El volumen total del reactor se dividirá en 5 Bioreactores de 3951 L de líquido, se suele ocupar solo es 70% entonces el volumen del reactor será de 5644 L, redondeando las cifras para adquirir o construir un reactor será de 5700 L.

Volumen de Bioreactores de producción

Se desean producir 730 toneladas de ácido cítrico por año para cubrir en 20% del mercado interno esto poniéndolo en producción por hora significaría 83.3 Kg/h de ácido cítrico.

La ecuación utilizada para dimensionar el reactor es:

(8.3.3)

Para los Bioreactores de producción puede no considerarse el término (μgxYP/s-1) se le considero

con un valor de cero porque en estos reactores el crecimiento es muy pequeño o prácticamente nulo. Además en este reactor solo es de interés el seguimiento del producto y sustrato

56

(8.3.4)

Con los parámetros de la literatura, así como los datos obtenidos que se utilizaron para calcular los coeficientes de rendimiento YP/s , que se sustituyen en ambos lados de la ecuación para encontrar un el volumen final del reactor de crecimiento de biomasa proporcionando como resultado V=13819 L. Este volumen se divide en 10 reactores, es importante aclarar que el número de reactores en que se puede dividir un reactor es arbitrario la única condición es cumplir con el caudal de producto requerido o fijado como objetivo [46], entonces el volumen de cada reactor es V=1382 Litros. También al operar al 70% entonces el volumen real de los reactores deberá ser de 1974 L que para fines prácticos serán comprados con un volumen final de 2000 L. Todos los cálculos detallados se encuentran hechos en el apéndice K.

8.3.2 Reactor de Producción

En estos reactores solamente se agregará la biomasa con glucosa, con la misma concentración con la creció el microorganismo 140g/L, para evitar el crecimiento se eliminarán las fuentes de nitrógeno así como el hierro que inhibe la producción de ácido cítrico.

El volumen se obtendrá de la misma forma que se calculó el volumen de reactor de crecimiento, solo que la eficiencia aumenta a causa del destino que tiene la fuente de carbono, en lugar de provocar el crecimiento de biomasa, la glucosa es llevada hacia la ruta del ciclo de Krebs que generara al ácido cítrico, este será excretado una vez que comience a acumular se dentro de cada espora del Aspergillus.

El tiempo de fermentación se lleva de 5 a 12 días [47], lo que nos llevó a establecer un tiempo de producción de 6 días, para poder llegar al objetivo se recalculó la velocidad de consumo de glucosa (μ). Y se dejaron variar las concentraciones de glucosa y ácido cítrico con respecto a las 144 horas de fermentación, los datos inicial y final de la glucosa son 140g/L y 2.46 g/L respectivamente.

Para calcular la cantidad máxima de ácido cítrico que se obtendría con la alimentación de glucosa de 140g/L, se considera a la eficiencia reportada por el Dr. Pedro F. Mateos González donde se tiene de 60%, con una relación teórica de 120g ácido cítrico/100 g de glucosa. Entonces en el caso real esto se convierte en 0.67 g ácido cítrico/g de glucosa.

Con la relación anterior las concentraciones de ácido cítrico al inicio es de 1.69 g/L, provenientes del reactor de cultivo, y como concentración final 93.8 g/L, con la conversión obtenida del párrafo anterior.

Dando continuidad al modelo utilizado para los casos de consumo de glucosa, crecimiento de biomasa, se aplica a las cantidades calculadas y se itera hasta encontrar un valor que dé como resultado gráfico la máxima producción de ácido cítrico.

A primera vista la velocidad de consumo es mucho más rápida, debido a que el microorganismo es solamente se dedica a comer y excretar ácido. En pocas horas la producción de ácido cítrico ha alcanzado su máxima producción.

57

0

50

100

150

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150

Producción de Ac. Cítrico

vs. Consumo de glucosaC

Bio

ma

sa

(g

/L)

CA

c. C

ítrico (g

/L)

Tiempo (h)

Figura 38. Producción de ácido cítrico (curva azul) creciente, consumo de glucosa (curva roja) decreciente.

La velocidad de consumo y de producción de ácido corresponde a 0.41h-1. Los valores de a y b para la ecuación logística son:

(8.3.5)

(8.3.6)

9. Balances de materia Global

Balance de Materia generalizado6.

Al diagrama de producción se le puede englobar en forma tal que sólo se tomen en cuenta entradas y salidas, para poder realizar un balance económico, para saber si el proceso es factible en relación a costo de reactivos y productos:

(9.1)

Como hipótesis no existe acumulación y sólo hay entrada de reactivos, salida de productos y generación:

(9.2)

Esto nos lleva al siguiente diagrama:

6 Tome en cuenta que el balance es estequiométrico y no se considera que parte de la fuente de carbono

genera Biomasa, CO2, agua entre otros metabolitos.

58

Figura 39. Diagrama de entradas y salidas para la producción de ácido cítrico.

En este caso se realizan 8 balances de materia uno para cada reactivo y producto que aparece en la figura (12), hay que recordar que G consumo o generación:

(9.3)

(9.4)

(9.5)

(9.6)

(9.7)

(9.8)

Se considera que no hay entradas de ácido cítrico entonces (12.7) queda:

(9.9)

De la relación de sustrato producto YP/S=0.68KgAC/KgS [19]. Se requiere obtener una producción de 2 toneladas diarias de ácido cítrico ya que se desea cubrir el 20% de la producción total de este, que equivale a PAC= 83.3Kg/h, por la siguiente relación se puede dar la cantidad de glucosa necesaria:

Fe,s=

(9.10)

59

Esta es la cantidad necesaria de glucosa para producir 2 toneladas de ácido cítrico diarias, que en un año equivaldrían a 730 toneladas. Sustituyendo este valor en (12.3) y suponiendo que se consume toda la glucosa y no hay salida de esta:

(9.11)

Los balances de ácido sulfúrico y cal apagada (Ca (OH)2) se realizan Estequiometricamente:

Formación de citrato de calcio

(9.12)

Recuperación de ácido cítrico con ácido sulfúrico

(9.13)

Para el balance estequiométrico se requieren 3 moles de Ca(OH)2 por 2 moles de ácido cítrico, el flujo de entrada de cal apagada es:

(9.14)

Por cada mol de citrato de calcio se necesitan 3 moles de Ca (OH)2

(9.15)

Estequiometricamente se requieren 3 moles de ácido sulfúrico para formar 2 moles de ácido cítrico.

(9.16)

Por cada 3 moles de ácido sulfúrico se producen 3 moles de Sulfato de Calcio

(9.17)

(9.18)

(9.19)

La producción de ácido oxálico se lleva a cabo en la misma ruta metabólica que genera al ácido cítrico, recordemos que al manipular la forma en que se alimenta se puede inhibir la producción

60

de este, entonces tomamos como hipótesis que por cada 100g de glucosa se producen 5g de ácido oxálico.

10. Escalamiento de Reactores

10.1 Escalamiento para el Reactor de Crecimiento

Se tienen las siguientes relaciones geométricas para poder escalar el Bioreactor.

Tabla 16. Dimensiones y relaciones geométricas estándar para un fermentador. [49] Tipo de

impelente

t

i

D

D

t

l

D

H

i

i

D

L

i

i

D

A

i

b

D

H

bN

Deflectores

t

b

D

A

Turbina de álabe

plano

1/3

1.0

1/4

1/5

1.0

4

1/10

De paleta 1/3 1.0 - 1/4 1.0 4 1/10

Hélice marina

1/3

1.0

Pitch= Di

Pitch= Di

1.0

4

1/10

Figura 40. Esquema geométrico del reactor de tanque agitado

61

Las dimensiones del reactor a nivel laboratorio son las siguientes:

Hl=10.3 cm, nivel del caldo de cultivo.

DtL=9.5 cm

El bioreactor fue equipado con una sola turbina Rushton de 6 paletas, Di=4.53 cm, diámetro de la turbina.

Li=1 mm, Ancho de la paleta.

Ai=1.2 cm, Altura de la paleta.

Hb=4.53 cm, distancia de la turbina a la base del reactor.

Ab= 1 cm, ancho de los deflectores. El equipo está equipado con 2 deflectores equidistantes.

Para el escalamiento se calculó que se requiere de un reactor con volumen Vcrecimiento=3951 L (no pierda de vista que este volumen es el 70% de la capacidad del reactor), entonces se sabe que para escalar un tanque con geometría recomendada se debe cumplir que =1 y se sabe que V=πr2h, en este caso r=Dt, h=HL y por la relación que se acaba de mencionar podemos decir que Dt=HL, entonces [2];

Entonces se obtiene que la altura del nivel del líquido es HL=1.1m, y la altura total del reactor es Ht=1.6m.

Tabla 17. Diferentes criterios para cambio de escala en tanques geométricamente similares, con medio y propiedades físicas constantes.

Criterio Relación

Velocidad tangencial constante Nl/Ni=Dtl/Dti

kLa constante Nl/Ni=(Dtl/Dti)2/3

De la tabla 18 se utilizó la siguiente relación NL/NI= (DtL/DtI)2/3 para obtener DtI, se tienen como

datos; RPMI=NI=80, RPML=NL=200, DtL=9.5 cm. Que nos da un diámetro a nivel industrial de DtI= 1.16 m. este cálculo se realizó solo con el fin de comprobar con otro método de escalamiento el valor del diámetro a nivel industrial.

Se tiene la siguiente relaciónt

b

D

A=1/10 y;

Ab= (1/10) (Dt)= (1/10) (1.1m)=0.11m, y se utilizaran 4 deflectores de esta dimensión.

3/1t

i

D

D, de esta relación se obtiene el diámetro del impulsor [49];

62

cmmmDD ti 3636.0)1.1()3/1()()3/1(

4/1i

i

D

L, de esta relación se obtiene el ancho de la paleta del impulsor [49];

cmmmDL ii 909.0)36.0()4/1()()4/1(

5/1i

i

D

A, de esta relación se obtiene la altura de la paleta del impulsor [49];

cmmmDA ii 2.7072.0)36.0()5/1()()5/1(

1i

b

D

H, de esta relación se obtiene la distancia de la turbina a la base del reactor [49];

Figura 41. Dimensiones de Reactor de crecimiento a nivel Industrial.

10.2 Escalamiento para el Reactor de Producción

Para el escalamiento del reactor de producción se siguió con el mismo procedimiento que en el anterior (reactor de crecimiento).

Vproducción=1400 L (70% de la capacidad del reactor)

cmmDH ib 3636.0

63

Para un tanque con geometría recomendada [51] se debe cumplir que =1 y se sabe que V=πr2h, entonces [50];

Las mismas relaciones que en el reactor de crecimiento se utilizaron en este caso, también se utilizaran 4 bafles.

Figura 42. Dimensiones de Reactor de Producción a nivel Industrial.

64

11 Elección del Proceso

Varios factores afectan la elección del tipo de proceso: la existencia de capital de inversión, la abundancia de energía, el costo, el entrenamiento de la mano de obra, la existencia de técnicas para la medida y la regulación [10].

Melaza Agua Oligoelementos

Mezclador Biorreactor De

Crecimiento

A. niger

Aire

Aire

BioreactorDe

Producción

Glucosa Aire

Aire

FiltradorCentrifugador 1

Biomasa

Reactor 1(Formación

de citrato de calcio)

Ca(OH)2

FiltradorCentrifugador 2

Reactor 2(Recuperación de ácido

cítrico)

FiltradorCentrifugador 3

H2SO4

CristalizadorEvaporador

Secador

CaSO4

CaC2O4

C6H8O7Filtrador

Centrifugador 4

Figura 43. Diagrama de flujo, producción industrial de ácido cítrico.

En la figura 43, se muestra la propuesta del proceso para la producción de ácido cítrico, donde en color rojo se muestran los Bioreactores, el de crecimiento y el de producción de ácido cítrico (fermentación de glucosa con A.niger), es en esta parte donde se enfoca nuestro proyecto. Corriente arriba se comienza con los depósitos de la materia prima; melaza de caña de azúcar, agua y algunos nutrientes que son necesarios para el medio de cultivo (ver tabla 4).

Tabla 18. Nutrientes para el medio de cultivo. Compuestos del medio basal

(NH4)2SO4

KH2PO4

MgSO4

Glucosa

Oligoelementos

El proceso comienza en los depósitos de la materia prima, la melaza proviene de un proceso anterior de purificación (pasa por resinas de intercambio iónico) que no se incluye en este enfoque del proceso, es necesario asegurar la purificación de la melaza debido a que, por ejemplo; El manganeso y el hierro son usados para evitar el sobrecrecimiento de A.niger, Fe provoca que el

65

ácido cítrico sea transformado en ácido isocítrico, después se mezclan en un tanque donde se prepara el medio de cultivo (agua, nutrientes, melaza), se alimenta el medio de cultivo al bioreactor de crecimiento (este fue previamente esterilizado con vapor de agua) mientras que por otra corriente se alimenta el hongo A.niger, para dar inicio al crecimiento del hongo en forma de madejas sin importar que produzca algún metabolito, se ha estudiado que durante la fase de crecimiento no se produce ácido cítrico, en el momento en que inicia a producirlo es una vez que se llegó al máximo crecimiento. Una vez que creció en forma de madejas, se descarga el reactor por gravedad separando la biomasa del medio de cultivo, la biomasa se alimenta al reactor de producción, donde se inyecta nuevamente un medio de cultivo que contiene glucosa y solo dos oligoelementos MgSO4 MnSO4, que son los únicos que intervienen en la producción de ácido cítrico, los demás compuestos ya no son necesarios porque son promovedores del crecimiento y en este bioreactor no se busca más, que la producción de ácido cítrico.

Es necesario mencionar cual es el tratamiento que se le da a la corriente que sale del reactor de producción para que finalmente podamos obtener ácido cítrico.

El proceso de obtención tiene varias fases después del bioreactor de fermentación aeróbica de la sacarosa con el Aspergillus niger [16]:

1. Filtración y centrifugación 1: Para remover la biomasa y otros residuos sólidos.

2. Reactor 1: La separación del ácido cítrico del sustrato por precipitación al añadir hidróxido de calcio o cal apagada para formar citrato de calcio.

3. Filtración y centrifugación 2: eliminación del oxalato de calcio, y dejar atrapado al ácido cítrico en medio acuoso como citrato de calcio.

4. Reactor 2: Se añade ácido sulfúrico para descomponer el citrato de calcio, formando el ácido cítrico y sulfato de calcio para después separarlos.

5. Filtración y centrifugación 3: separación de sulfato de calcio y ácido cítrico.

6. Concentración del ácido: Se utilizan evaporadores para retirar el exceso de líquidos con condiciones 70-90ºC, y a su vez en este mismo equipo ocurre la cristalización, por encima de 40°C el ácido cítrico cristaliza como ácido anhidro y por debajo de 36.5°C como monohidratado.

7. Filtración y centrifugación 4: Este proceso se realiza para retirar al oxalato cálcico del líquido y el exceso de agua.

8. Secado: Finalmente se retira la humedad del ácido cítrico para poder empacar y almacenar.

Rendimiento: El rendimiento teórico es de 68 g de ácido cítrico anhidro por 100 g de glucosa [19]. Duración: Entre 6 y 15 días que depende de la materia prima utilizada.

66

En la figura 44 se muestra el proceso más detallado. La descripción y operación de los equipos que se muestras en este diagrama de proceso, se encuentran explicadas a detalle en el anexo E-J.

67

T1

T2T3

M

V1 V2 V3

S1

F1

S2

F2

S3

F3

F4

B1

F5

RC1

F6

C1

FARC1

FARC2

FWRC1

FWRC2

CTRC

SB1

F7'

F7

RP1

FARP1

C2

FARP2

F8

CTRP

FWRP1FWRP2

CF1

B2

F9

F10'’

F10

B3

F11

R1

DHCa

F11'

F12

B4

F13

CF2

F14'

F14

B5

F15

R2

F15'

DAS

B6

CF3

F17

F18

F18'

CrE

FVCrE

P-45

P-46

CF4

F22

F22'

TT

F23

Sec.

F24

B8

F20

F21

B7

F19

F10'

AGlu

F16

Figura 44. Diagrama del Proceso Industrial para la producción de ácido cítrico.

68

En el diagrama (figura 44) donde se muestra ya el proceso con bombas y compresores, es importante que resaltemos para el reactor de crecimiento se tienen 5 en paralelo, y 10 reactores de producción en paralelo, que a su vez los de crecimiento trabajaran en serie con los de producción, cada equipo con sus respectivos accesorios.

Tabla 19. Datos sobre las condiciones de operación y dimensiones de las tuberías del proceso (cedula 80).

Lista de canalizaciones Texto

mostrado Descripción Diámetro

(cm) Flujo

(Kg/h) Presión

(psi) Temperatura

(°C) Cantidad

AGlu Tubería 2.54 1013 300 30 10

F1 Tubería 2.54 Variable 48.5 25 1

F10 Tubería 0.635 1066 0 30 1

F10' Tubería Biomasa 0.635 4 - 30 1

F10'’ Tubería 0.635 Variable - 30 1

F11 Tubería 0.635 1061 21628 30 1

F11' Tubería 0.635 53 25 1

F12 Tubería 2.54 1147 380 70 1

F13 Tubería 0.635 1147 4161 70 1

F14 Tubería 0.635 1055 0 70 1

F14' Tubería 0.635 92 0 70 1

F15 Tubería 0.635 1055 4039 70 1

F15' Tubería 0.635 105 70 1

F16 Tubería 2.54 1132 375 95 1

F17 Tubería 0.635 1132 3974 95 1

F2 Tubería 2.54 Variable 48.5 95 1

F18 Tubería 0.635 1055 0 90 1

F18' Tubería 0.635 79.5 0 90 1

F19 Tubería 0.635 1055 3965 90 1

F20 Tubería 0.635 565 0 90 1

F21 Tubería 0.635 565 2078 90 1

F22 Salida de lodo 0.635 99.5 0 90 1

F22' Tubería 0.635 465.5 0 90 1

F23 Salida de lodo 0.635 99.5 0 90 1

F24 Salida de Ac. Cit. 0.635 75 0 95 1

F3 Tubería 0.635 - - 25 1

F4 Tubería 0.635 Variable 49 25 1

F5 Tubería 0.635 Variable - 25 1

F6 Tubería 0.635 Variable - 30 5

F7 Tubería 0.635 Variable - 30 10

F7' Tubería 0.635 Variable - 30 10

F8 Tubería 0.635 1066 6703 30 10

F9 Tubería 0.635 1066 28759 30 1

69

Tabla 20. Características de los equipos del proceso.

Lista de equipamiento Texto

mostrado Descripción Material Número

B1 Bomba Acero al Carbón 1

B2 Bomba Acero al Carbón 10

B3 Bomba Acero al Carbón 1

B4 Bomba Acero al Carbón 1

B5 Bomba Acero al Carbón 1

B6 Bomba Acero al Carbón 1

B7 Bomba Acero al Carbón 1

B8 Bomba Acero al Carbón 1

C1 Compresor Acero al Carbón 1

C2 Compresor Acero al Carbón 1

CF1 Centrifuga Filtradora Acero Inox 1

CF2 Centrifuga Filtradora Acero Inox 1

CF3 Centrifuga Filtradora Acero Inox 1

CF4 Centrifuga Filtradora Acero Inox 1

CrE Cristalizador Evaporador Acero Inox 1

CTRC Control de Temperatura de Rector de Crecimiento Acero Inox 316LSS 5

CTRP Control de Temperatura de Rector de Producción Acero Inox 316LSS 10

DAS Depósito de Ácido Sulfúrico Níquel recubierto 1

DHCa Depósito de Hodroxido de Calcio Polietileno 1

M Mezcladora Acero Inox y Polietileno

1

R1 Reactor de Neutralización Acero Inox 1

FARC1 Tubería AIRE 0.635 - - 30 1

FARC2 Tubería AIRE 0.635 - - 30 1

FARP1 Tubería 0.635 - - 30 1

FARP2 Tubería 0.635 - - 30 1

FVCrE Tubería VAPOR 0.635 490 - 90 1

FWRC1 Tubería 0.635 - - 30 1

FWRC2 Tubería 0.635 - - 30 1

FWRP1 Tubería 0.635 - - 30 1

FWRP2 Tubería 0.635 - - 30 1

P-45 Tubería 0.635 - - - 1

P-46 Tubería 0.635 - - - 1

S1 Tubería 2.54 Variable 48.5 25 1

S2 Tubería 2.54 Variable 48.5 25 1

S3 Entrada de Oligoelementos

- - - 25 1

70

R2 Reactor de Acidificación Acero Inox 1

RC1 Reactor de Crecimiento Acero Inox 316LSS 5

RP1 Reactor de Producción Acero Inox 316LSS 10

SB1 Separador de Biomasa - 10

Sec. Secador Acero Inox 1

T1 Tanque de almacenamiento Polietileno 2

T2 Tanque de almacenamiento Polietileno 4

T3 Tanque de almacenamiento Polietileno 1

TT Transportadora de Tornillo Acero 1

12. Balances de Materia por Equipo

12.1 Balances de Materia para la Centrífuga-Filtradora

Los filtros para productos alimenticios operan con un 99% de eficiencia, esto significa que para el primer filtrador (rotatorio) se retira prácticamente toda la biomasa. Y la retención del líquido en el filtro es mínima, todos los productos podrán ser tratados posteriormente.

(12.1.1)

Se considera que no existe acumulación de ningún material dentro de la centrífuga, por tanto el término A es igual cero:

(12.1.2)

La biomasa retirada es recirculada al bioreactor de producción, el balance se realiza en kilogramos, porque es más sencillo manejar en términos de masa el balance. Para la centrífuga es importante considerar que tiene una sola entrada y dos salidas la que está conectada al tubo externo que descarga la fase líquida, el tubo interno que contiene al filtro descarga a la biomasa.

Tubo externo

(12.1.3)

La entrada del tubo externo se considera desde la superficie del cilindro rotatorio hasta la salida del líquido del equipo. La parte interna se queda con la biomasa que de igual manera es empujada con el tornillo hacia la parte final de la centrífuga para salir.

71

Figura 45. Centrifuga filtradora horizontal

Tubo interno

(12.1.4)

La suma de las ecuaciones 21.3 y 21.4 dan como resultado el valor del flujo total proveniente de los reactores de producción.

(12.1.5)

Que finalmente esto debe ser igual a las salidas. Pero como el filtro de Nylon funciona al 99% parte de la biomasa (sobre todo esporas que escapan a tamaño de los poros del filtro) el valor de la biomasa recuperada es 3.96 Kg/h, entonces el valor del flujo de salida del líquido sólo aumenta 0.04Kg/h, un valor insignificante para el total del flujo.

12.2 Balance para la Centrífuga Filtradora 2 (después del reactor 1)

Esta centrífuga funciona de igual modo que la primera, pero en particular el oxalato de calcio sale como la fase sólida atrapando a la glucosa y el citrato de calcio se queda en solución acuosa que es descargado por el tubo externo.

Tubo externo

(12.2.1)

Tubo interno

(12.2.2)

Balance global

(12.2.3)

72

12.3 Balance en centrífuga filtradora 3 (después del reactor 2)

En esta centrífuga se lleva más agua, además de la que traía anteriormente, por causa del ácido sulfúrico se encuentra en una solución al 60% en peso.

Tubo externo

(12.3.1)

Tubo interno

(12.3.2)

Balance global

(12.1.3)

La salida (S2) lleva exclusivamente sulfato de calcio, en tanto la (S2) lleva al ácido cítrico regenerado con agua.

12.4 Balance de Materia en el Cristalizador-Evaporador

En este equipo se perdedera máximo 50% de agua, debido a que la evaporación se logra al provocar un vacío parcial con una bomba. Haciendo hervir la mezcla menos de 90°C, formándose los cristales que después serán centrifugados nuevamente.

Figura 46. Cristalizador evaporador

La cristalización se realiza con una eficiencia del 100%, prácticamente todo el ácido cítrico monohidratado se precipita en forma de cristal. Salida de vapor

(12.4.1)

Salida de solución acuosa

73

(12.4.2)

Si la entrada es igual a la salida porque no hay acumulación teóricamente:

(12.4.3)

12.5 Balance de Materia en Centrífuga-Filtradora 4 (después de Cristalizador-Evaporador)

La última centrifuga solo deja un 5% de humedad, esto quiere decir que retirará el 95% del agua que forma la solución. Esto para facilitar el pase de los cristales por el tornillo transportador hasta el secador indirecto.

Tubo externo

(12.5.1)

Tubo interno

(12.5.2)

Balance global

(12.5.3)

El tubo interno contiene a los flujos de 75 Kg/h de ácido cítrico y 24.5 Kg/h de agua.

12.6 Balance de Materia en el Secador

El secador retirara el 99% del agua contenida en la masa de cristales de ácido cítrico, que se convertirá en el producto final.

(12.6.1)

(12.6.2)

Quedando así el ácido cítrico puro, que será comercializado con un costo que será después analizado.

13 Balances de Energía

13.1 Balance de Energía en Reactor 1 (Formación de citrato de calcio)

molkJHOHOHCCaOHCaOHC r /22.626)()(32 2275632786

Para un flujo de 117 Kg/h. Como la reacción es endotérmica necesitamos suministrar calor

74

hkJmolkJhmolHHQ

hmolhmol

esteq

n

r

r

calcit

/6.14/22.62/23.0

/23.01

/23.0

.

^...

..

.

.

(13.1.1)

El requerimiento de energía será mayor ya que en la corriente también hay glucosa y ácido oxálico.

13.2 Balance de Energía en Reactor 2 (Recuperación de ácido cítrico)

molkJHCaSOOHCSOHOHCCa r /86.8846323)( 47864227563

Para un flujo de 75.2 Kg/h

hkJmolkJhmolHHQ

hmolhmol

esteq

n

r

r

citacid

/1770/86.8846/2.0

/2.02

/4.0

.

^...

..

.

.

13.3 Esterilización de Reactores.

A diferencia de la pasteurización, la esterilización es un tratamiento térmico energético porque tiene como objetivo la destrucción total de todos los microorganismos presentes en el alimento tratado. La esterilización se lleva a cabo a temperaturas elevadas, de al menos más de 100°C.

Deseamos esterilizar dos tipos de reactores con volúmenes de 2000 y 5700 litros y un área de transferencia 5.6 y 8 m2 respectivamente.

Alimentaremos vapor a 150°C y el coeficiente de transferencia de calor para ambos reactores es

de Chm

kCalU

21580 esterilizando a 120°C y 15 psi, con una temperatura inicial de 22°C.

Utilizando la teoría de destrucción térmica asumimos ml

blesEsporasviaM o

610 y para la

bacteria a destruir bacillus stearothermophilus con RTi exk

67700

381038.7

.

Deseamos encontrar el tiempo necesario para que se lleve a cabo la esterilización y con ello saber cuánta energía a de emplearse. Se define nabla como

F

oT

M

VMln (13.3.1)

t

H eTtT 1)( (13.3.2)

75

Dónde: PH

oH

MC

UA

T

TT

; (13.3.3)

13.3.1 Esterilización en Reactor de Producción

El tiempo de desactivación total para un volumen de 2, 000,000 ml está dado por la Ec. 13.3.1

3510

000,000,210ln

3

6

T

Tiempo de calentamiento

st

CetT

cal

th

cal

1632.6

)816.0ln(150

120ln

120816.01150)(132.6

Si a una temperatura de 150°C la presión es de 5 Kg/cm2 y la entalpía específica

KgKJH /2776

, la energía necesaria para esterilizar es el tiempo de calentamiento más 20

min que es lo que dura la esterilización.

loteMJQ /1270

13.3.2 Esterilización en Reactor de Crecimiento

El tiempo de desactivación total para un volumen de 5, 700, 000 ml está dado por la Ec. 13.3.1

27.3610

000,700,510ln

3

6

T

Tiempo de calentamiento

st

CetT

cal

th

cal

3321.2

)816.0ln(150

120ln

120816.01150)(121.2

Si a una temperatura de 150°C la presión es de 5 Kg/cm2 y la entalpía específica

KgKJH /2776

, la energía necesaria para esterilizar es el tiempo de calentamiento más 30

min que es lo que dura la esterilización.

76

14. Ubicación de la Planta de Proceso Existen diversos factores que afectan la decisión para la ubicación de la planta, estas se enlistan en los siguientes puntos:

● Obtención de materia prima (Glucosa) Se eligió el municipio de Cuautla, Morelos, ya que en esta localidad se encuentra el ingenio azucarero “La Abeja Fideicomiso Ingenio Casasano” que proveerá la melaza, que se utilizará durante el proceso.

● Clima El hongo Aspergillus niger requiere de un ambiente húmedo y cálido para que este se desarrolle, sin embargo este factor no es el principal, pues el diseño del reactor será en medio líquido, donde la temperatura se controlará, pero un ambiente que no tenga cambios de temperatura extremos entre el día y la noche, el gasto en el sistema de control será menor.

Figura 47. Se muestran los terrenos donde se podría construir la planta y su cercanía con la carretera México-Cuautla.

En la figura 47, se muestra el punto A Fideicomiso Ingenio Casasano proveedor de melaza, Punto B terreno de ubicación de la planta de producción de ácido cítrico junto a la carretera México-Cuautla. Línea azul ruta de acceso desde el ingenio hacia la planta.

● Cercanía con clientes.

La mayor parte de los consumidores industriales del ácido cítrico como FEMSA, PEPSICO, Grupo Sigma, Unilever, Bimbo, etc., en el área de alimentos y bebidas, productores de detergentes y limpiadores Colgate-Palmolive, Grupo Alen ó Henkel se distribuyen por toda la parte central del

77

país, la ubicación de la planta en el estado de Morelos es una región muy cercana al Estado de México y D.F. por lo que se facilitara el trabajo de proveer a las industrias antes mencionadas.

Figura 48. Se muestra el mapa cercano a Cuautla con calles y carretera que conectarían con la planta.

En la figura 48 se muestra, la ubicación del ingenio azucarero, la planta de producción y las referencias con respecto a las carreteras cercanas para conectar con la ciudad de México.

● Vías de Comunicación Se tiene fácil acceso a la carretera México-Cuautla, además de que esta tiene mejor mantenimiento que por ejemplo las carreteras de Veracruz, el contar con estas características se traduce a rapidez en entrega producto. La elección se hizo meramente cualitativa, ya que no se toman en cuenta los costos de mano de obra en esta zona, consumo energético, impuestos gubernamentales y suministro de agua.

15. Ingeniería económica La tabla 19 resume los costos de inversión, producción, ganancias y rentabilidad del proyecto. En el apéndice C se encuentran los cálculos realizados que muestra dicha tabla [52]. En ella se puede apreciar que el costo de capital es donde se tiene que invertir más, ya que en este entra en juego el arranque de la planta, construcción, mantenimiento, suelo. Las ganancias después de impuestos ascienden a 212,022.724 US y la rentabilidad del proyecto es cerca del 9%, lo que hace que no sea muy rentable.

78

Tabla 21. Rentabilidad en el proceso para la producción de 657 ton/año de ácido cítrico. 657 Toneladas por año

Costo de equipos 1,092,300

Capital (F&W) 2,835,610.8

Ventas 998,640

Costo de fabricación 568,145.492

Ganancias $ 212,022.724

Impuesto sobre la renta 30% 63,607

Beneficio total ROI

$ 148,416 8.6%

16. Análisis de Riesgos

Tabla 22. Descripción de riesgos Descripción Causa Consecuencia Medidas preventivas o

correctivas Fuga en el

fermentador 1)fractura en el tanque del reactor 2)fractura en las tuberías de alimentación al reactor

1. Perdida del contenido 2. Contaminación por

hongos 3. Peligro de intoxicación

por hongos

1)colocar sistemas de detección y alerta 2)Desarrollar un procedimiento de inspección en el reactor 3)Esterilizar área de trabajo 4) uso obligatorio de cubre bocas

Fuga de7 Ca(OH)2 en reactor R1

1)fractura en el tanque del reactor 2)fractura en las tuberías de alimentación al reactor

1)quemaduras en piel y vías respiratorias 2)Perdida de contenido en R1

1)colocar sistemas de detección y alerta 2)Desarrollar un procedimiento de inspección en el reactor 3)uso obligatorio de ropa de trabajo, equipo respiratorio adecuado

Fuga de4 CaC2O4 en reactor R1 y

filtrador 2

1)fractura en el tanque del reactor 2)fractura en las tuberías de alimentación al reactor

1)quemaduras en piel y vías respiratorias 2)Perdida de contenido en R3

1)colocar sistemas de detección y alerta 2)Desarrollar un procedimiento de inspección en el reactor 3) uso obligatorio de ropa de trabajo.

Fuga de4 H2SO4 en 1)fractura en el 1)quemaduras en el cuerpo 1)colocar sistemas de

7 La ficha de seguridad resumida se muestra en el apéndice C, si se requiere mayor información consultar la

referencia mencionada

79

reactor R2 tanque del reactor 2)fractura en las tuberías de alimentación al reactor

2)intoxicación severa 3)peligro de muerte

detección y alerta 2)Desarrollar un procedimiento de inspección en el reactor 3)uso obligatorio de ropa de trabajo 4) colocar fuentes de agua, y ventilación en los alrededores de los tanques de depósito. 5)lavar inmediatamente el área contaminada con abundante agua 6)neutralizar la acides con lechadas de cal o alguna solución alcalina

El HAZOP8 identifica los riesgos asociados con la operación del sistema, investigando las desviaciones posibles de su operación normal, este análisis se encuentra en el Apéndice D.

17. Conclusiones y Recomendaciones

La experimentación en estado sólido fue una herramienta que se utilizó para buscar un

comportamiento de A. niger que permitiera obtener más ácido cítrico, a partir de los resultados

obtenidos e información sobre la preparación de medio de cultivo, se observó que uno de los

oligoelementos precipitaba en solución acuosa, éste era el ZnSO4, al precipitar no podía estar

presente en el medio de cultivo (no biodisponibilidad), por tanto se cambió a una sal que pudiera

estar soluble primeramente en la solución de oligoelementos y después en el medio de cultivo. Se

propuso utilizar ZnCl2 que se solubiliza por completo. La respuesta fue cuantitativa pues durante el

muestreo continuo del cultivo se mostró una mayor producción de CO2, además uno sólo de los

experimentos (experimento 9) arrojó resultados positivos para la producción de ácido cítrico en

condiciones limitadas por sustrato, este fue el caso de 25 g/L de glucosa, ya que siempre se

recomiendan cantidades mayores a 50 g/L para producir ácido.

Los resultados condujeron a realizar experimentación en estado líquido, usando como referencia

el estudio realizado por el Dr. Sergio Huerta, tomando algunos de sus parámetros y medio de

crecimiento de A. niger, para realizar las pruebas de crecimiento de biomasa y producción de

ácido cítrico. La diferencia con el medio de cultivo original fue que se cambió la sal de ZnSO4 por el

ZnCl2. La respuesta fue poco satisfactoria para la generación de ácido cítrico 1.69 g/L, sumando el

comportamiento irregular del consumo de sustrato y la falta de repetitividad de los experimentos,

llevaron a utilizar la ecuación logística para buscar las velocidades de reacción de la glucosa, ácido

cítrico y biomasa. De este modo se recalculó el coeficiente de rendimiento de producto YP/S, y se

encontró que para generar 40 g de biomasa se necesita emplear 79 g de glucosa. También se

8 Para información sobre el significado del grado de magnitud de riesgo mostrado en esta tabla se puede

consultar el siguiente documento Taller de identificación y evaluación de riesgos [39]

80

detectó un producto que no se logró identificar, y tampoco se ha encontrado en los

cromatogramas reportados en la literatura de la columna Biorad del HPLC.

Para poder emplear una planta que funcione de forma continua se seleccionaron dos tipos de

Bioreactores, uno batch para el crecimiento de biomasa y uno continúo. Los Bioreactores

continuos son solamente empleados para un sólo proceso y son más costosos en su diseño por las

trampas para evitar la salida de grandes cantidades de biomasa como también el sistema de

recirculación de la misma, para mantener la biomasa constante durante el proceso. Se tuvo en

consideración que el coeficiente de rendimiento fue modificado en el bioreactor de producción

con respecto a la constante de consumo en el bioreactor de crecimiento, a causa del cambio de la

constante de reacción, porque solamente existe glucosa para producir ácido cítrico, por tanto la

constante cambia, tendiendo a ser mayor.

El alto costo de algunos equipos como el bajo rendimiento de producción de ácido hace que las

ganancias y la recuperación de la inversión sean lentas. Para aumentar la rentabilidad será

necesario emplear cepas de A. niger genéticamente modificadas, llamadas hiperproductoras o

seguir con experimentos que puedan mejorar el rendimiento de A.niger.

18. Glosario Idiofase: fase en el crecimiento de un microorganismo en la que se producen metabolitos secundarios, que son productos no fundamentales en el metabolismo bacteriano.

Trofofase: fase en la vida de las colonias de microorganismos en que crecen de forma exponencial.

Quelante: es una sustancia que forma complejos con iones de metales pesados. A estos complejos se les conoce como quelatos, una de las aplicaciones de los quelantes es evitar la toxicidad de los metales pesados para los seres vivos.

Conidio: es una espora asexual inmóvil formada directamente a partir de una hifa .

Higroscópico: sustancias que absorben humedad del ambiente.

Reacciones Anapleróticas: Son aquellas reacciones que proporcionan intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs. El malato se forma en el citosol de la célula por la acción de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEP carboxilasa) y la malato deshidrogenasa, y una vez dentro de la matriz mitocondrial, puede ser empleado para obtener piruvato (reacción catalizada por la enzima málica) o ácido oxalacético. Ambos productos pueden entrar en el ciclo del ácido cítrico. Dado que se trata de un ciclo, la formación de cualquiera de sus intermediarios puede servir para rellenar el ciclo entero y mantener todos sus substratos al máximo.

Organoléptico: Se dice de las propiedades de los cuerpos que se pueden percibir por los sentidos: Las propiedades descritas como organolépticas son: Gusto Sabor Olor Color Aspecto Textura

81

19. Bibliografía: [1] http://sameens.dia.uned.es/Trabajos3/T1A/MorcilloRubioMP/Agente.htm,[accesado el día 10 de octubre de 2012] .

*2+ Pazouki M. y Panda T. “Understanding the morphology of fungi, Bioprocess Engineering”, 127- 143, (2000).

*3+ Smart export “el portal para exportar” (2009), Francia, disponible en: www.smartexport.com/es/Acido_citrico.291814.html [accesado el día 06 de octubre de 2012].

[4] Global trade starts (1999-2012), Hong Kong, disponible en: spanish.alibaba.com/products/citric_acid_price.html [accesado el día 06 de octubre de 2012].

[5] Provedores México Red, 2007-2012, disponible en: http://acido-citrico.mexicored.com.mx/1.html [accesado el día 10 de octubre]. [6] INEGI. XV Censo Industrial, Industrias Manufactureras Subsector 31. Producción de Alimentos, Bebidas y Tabaco Productos y Materias Primas Censos Económicos, [accesado el día 14 de octubre de 2012].

*7+El prisma, “portal para investigadores y profesionales” http://www.elprisma.com/apuntes/quimica/acidocitrico/default11.asp, [accesado el día 14 de octubre de 2012] [8] Laboratorios Pfizer http://201.159.143.150/AcercadePfizer/historia_de_pfizer/Paginas/1900_1950.aspx [accesado el día 10 de octubre 2012] [9] British Laboratorios, C.A., 2010 http://www.bristhar.com.ve/acidocitrico.html, [accesado el 6 de octubre de 2012] *10+ Proveedor Makymat, ”Inovación, calidad y servicio” http://www.makymat.com/contenido/archivospdf/AcidoCitrico.pdf, [accesado el dia 26 de octubre 2012] *12+ Bjorn kristiansen, Michael mattey, joan linden, “Citric acid biotechnology”, edit.Taylor & Francis, 2002. *13+ Consejo Argentino para la información y el desarrollo de la biotecnología, “La biotecnología en nuestra vida cotidiana”,2007. http://www.argenbio.org/index.php?action=novedades&note=433, [Consultado el día 10 de noviembre de 2012]. [14] Soccol, C. R., Vandenberghe L. P. S., Rodrigues C y Pandey A. “New Perspectives for Citric Acid Production and Apllication”. 2006. Food Technol. Biotechnol. 44 (2). Págs. 141-149.

[15] Jagnow G. y Dawid W. “Biotecnología. Introducción con experimentos modelo”. 1991. Editorial Acribia, S.A. Págs. 90-92.

82

[16] Gurpreet Singh Dhillon, Satinder Kaur Brar, Mausam Verma, Rajeshwar Dayal Tyagi, “Recent Advances in Citric Acid Bio-production and Recovery”, Food Bioprocess Technol (2011) 4:505–529 [17] Cassanello Miryan, “Biotecnología Industrial Producción industrial de Metabolitos Biorreactores “,FCEyN – UBA, Argentina. [18] Peralta Pérez María R. “Efecto de los iones metálicoss en la producción de ácido cítrico por Aspergillus niger cultivado en medio sólido”, 1996, Tesis de Maestría, UAM. [19] Nielsen J., Villadsen J. Liden G., “Bioreaction engineering principles”, segunda edición, 2003, edit. Plenium Press New York. *20+ Reyes Ocampo I., “Difusión y Crecimiento Microbiano de Aspergillus niger sobre un medio Sólido”, UAM-I, tesis de Maestría, UAM-Iztapalapa, 27 Oct. 2006.

[21] http://www.proquimsaec.com/PDF/HojaSeguridad/HS_Glicerol.pdf

[22] http://nj.gov/health/eoh/rtkweb/documents/fs/1445sp.pdf

[23] http://www.proquimsaec.com/PDF/HojaSeguridad/HS_Acido_Citrico.pdf *24+ Albert L. Lehninger, Bioquimica “las bases moleculares de la estructura y función celular”, 2° edición, edt. Omega. [25] Pfizer-Citric Acid, Boletín publicitario, Pfizer Inc., Nueva York, 1982. *26+ M. Garcia Garibay, R. Quintero Ramirez, A.L. Mugía Canales, “ Biotecnología alimentaria”, edit. Limusa, pp.553-565, 2009. *27+ Linko, P., “Immobilized Live Cells”, Advances in Biotechnology. M. Moo-Young, C.W. Robinson y C. Vzina (comps.), Pergamon Press, New York,pp.711-716, 1981. *28+ Vaija, J., Y.Y. Linko y P. Linko, “Citric Acid Production whit Alginate Bead Entrapped Aspergillus niger ATCC9142”, Appl. Biochem. Biotechnol, 7, pp.51-54, 1982. *29+ Larralde Corona P., López Isunza F., Viniegra Gonzales G., “CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE HONGOS FILAMENTOSOS (Morfometría de los micelios de A.niger y G. fujihmi y su posible utilización en la predicción de la tasa específica de crecimiento.”, pág.3, 5,8. UAM-I, 28 Nov. De 1996. *30+ Monod J.“The growth of bacterial cultures”, Annual Review of Microbiology, 1949, p. 371-394.

*31+ Robinson T.P., Wimpenny J.W.T. y Earnshaw R. G., “pH gradients through colonies of Bacillus cereus and the surrounding agar”, Journald of General Micorbiology, 1991, p. 2885-2889.

[32] C. López Ríos, A. Zuluaga Meneses, S. Herrera, ¨Producción de ácido cítrico con Aspergillus niger NRRL 2270 a partir de suero de leche”, Dyna, Medellín, N. 150, ISSN 0012-7353, noviembre 2006, pp.39-57.

83

[33]http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/termodinamica_biologica/termodinamicaycrecimien-to.pdf, pag. 185.

[34] Lehninger Albert L., Principios de Bioquímica, Editorial Omega, 4ª Edición, 2006, p. 495. [35] Voet, Judith; Voet, Donald; Pratt, Charlotte, Fundamentos de bioquímica, 2ª Edición, p. 456.

[36] http://respiracion-celular.blogspot.mx/

[37] Fumex LTDA, “ficha técnica de sulfato de zinc heptahidratado”, visitado el 10-03-2013, Fumex Ltda. Clemente Fabres 918, Providencia, Santiago Fono: 2746068, disponible en: http://www.fumex.cl/pdfs/fichas_tecnicas/SULFATO_DE_ZINC.pdf.

*38+ Winkler,”Ficha de seguridad Winkler Cloruro de zinc”, Vigente desde 22/01/2007 versión Nº 1, visitado el 15-03-2013, disponible en: http://www.winklerltda.com/ficha.php?id_producto=1830.

*39+ Juan Flores R. “Taller de identificación y evaluación de riesgos”, visitado el 10 de julio 2013, disponible en; http://www.oilproduction.net/files/HAZOP-Juan%20Flores%20Ramirez.pdf

*40+ Pontificia universidad Javeriana, “Ficha de datos de Seguridad de Hidróxido de Calcio (Ca(OH)2)”, cali, visitada el 5 de noviembre 2012, disponible en; http://portales.puj.edu.co/doc-quimica/FDS-LabQca-DianaHermith/Ca(OH)2.pdf.

[41] maquimsa, disponible en; http://www.carloerbareagenti.com/Repository/DIR199/CH1316_E.pdf. [42] http://www.proquimsaec.com/PDF/HojaSeguridad/HS_Acido_Citrico.pdf [43] http://www.proquimsaec.com/PDF/HojaSeguridad/HS_Acido_Citrico.pdf [44] Andeisa químicos, visitado el 6 de mayo de 2013, disponible en; http://iio.ens.uabc.mx/hojas-seguridad/ACIDO%20CITRICO.pdf [45] Nielsen J., Villadsen J., Gunnar L., Bioreaction Engineering Principles, Second Edition, 2003, Plenum Publishers, New York. pp 54.

[46] Atkinson B., Reactores Bioquímicos, 1986, Editorial Reverte, Barcelona. pp. 136

[47] Soccol, C. R., Vandenberghe L. P. S., Rodrigues C y Pandey A. New Perspectives for Citric Acid Production and Apllication. 2006. Food Technol. Biotechnol. 44 (2). Págs. 141-149.

*48+ S. Huerta Ochoa, “Modelling aspects of mycelia growth and citric acid formation in batch submerged culture”, University of reading, Department of food Science and Technology University of Reading, November 1993.

*49+ R. Quintero Ramírez, “Ingeniería Bioquímica, Teoría y aplicaciones”, Departamento de Biotecnología, Instituto de Investigaciones Biomedicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Edit. Alhambra Mexicana, 1981.

84

*50+Mc Cabe, J. Smith, “operaciones básicas de ingeniería química”, cuarta edición, edit. McGrawHill, 1991.

*51+ Warren. D. Seider, J.D. Seader, Daniel. R. Lewin, “Product and process design principles: synthesis, Analysis and Eva luation, 2nd

edition. *52+ Douglas, “Conceptual design of chemical processes”, McGraw-Hill, 1988.

[53] iSitios.com, http://www.elblogdefiltracion.com/ Escrito por Luis Ernesto Rodriguez. Creado: 25 Abril 2013 22:44 Última actualización: 26 Abril 2013 00:28 Visitado 31 de Mayo 2013

[54] <!subspacio> http://www.textoscientificos.com/quimica/cristales/cristalizadores 3 de junio 2013.

[55] http://www.rousselet-robatel.com/espanol/products/horiz-pilot.php 4 de junio 2013.

[56] Alibaba.com, Inc. http://spanish.alibaba.com/product-gs/industrial-mixer-agitator 918174860.html 20-06-13.

[57] A.H.Jhonson y M.S.Peterson, Encyclopedia of food technology, 1974,the AVI Pub.Co.,Westport, Connecticut

[58] Web Master, Koichi MAKIMURA, “Pathogenic Fungi Database”, 2002.09.07, disponible

en: http://www.pfdb.net/html/species/s12.htm.

85

Apéndice A Tablas de Experimentos

Experimento 1

En el primer experimento se tiene una relación C/N= 40, correspondientes a 0.0043 g/L de MnSO4 •H2O y 0.60 g/L de MgSO4 •7H2O, que como se sabe es un ion divalente que afecta directamente a la producción de ácido cítrico.

Tabla 23. Composición del medio con una relación C/N =40.

Composición medio basal (experimento 1)

compuesto g/L

(NH4)2SO4 1.39

KH2PO4 0.50

MgSO4 •7H2O 0.60

Extracto de levadura 0.10

oligoelementos 2 (ml/L)

glucosa 25

Tabla 24. Composición de la solución de oligoelementos.

Composición de oligoelementos (experimento 1)

compuesto g/L

FeSO4 •7H2O 2.50

ZnSO4 •7H2O 11.0

MnSO4 •H2O 2.15

H3BO3 5.50

(NH4)6Mo7O24 •4H2O 0.55

Na2EDTA•2H2O 25.0

CoCl2 •6H2O 0.80

CuSO4 •5H2O 0.80

Experimento 2

En el experimento 2 se tienen las mismas cantidades de nutrientes la diferencia es que en este experimento se colocó una placa de celofán encima del agar y después se inoculo.

Experimento 3

La composición del medio basal es la misma que en el experimento 3, lo que cambia es la cantidad de MnSO4 en la solución de oligoelementos.

86

Tabla 25. Composición de la solución de oligoelementos, MnSO4= 5g/L.

Composición de oligoelementos (exp.3)

compuesto g/L

FeSO4 •7H2O 2.50

ZnSO4 •7H2O 11.0

MnSO4 •H2O 2.15

H3BO3 5.50

(NH4)6Mo7O24 •4H2O 0.55

Na2EDTA•2H2O 25.0

CoCl2 •6H2O 0.80

CuSO4 •5H2O 0.80

Experimento 4

La composición del medio basal es la misma que en el experimento 3, lo que cambia es la cantidad de MnSO4 en la solución de oligoelementos.

Tabla 26. Composición de la solución de oligoelementos, MnSO4= 1.075g/L.

Composición de oligoelementos (exp.4)

compuesto g/L

FeSO4 •7H2O 2.50

ZnSO4 •7H2O 11.0

MnSO4 •H2O 5

H3BO3 5.50

(NH4)6Mo7O24 •4H2O 0.55

Na2EDTA•2H2O 25.0

CoCl2 •6H2O 0.80

CuSO4 •5H2O 0.80

Experimento 5

Tabla 27. Composición del medio con una relación C/N =40, MgSO4=0.1g/L.

Composición medio basal (exp.5)

compuesto g/L

(NH4)2SO4 1.39

KH2PO4 0.50

MgSO4 •7H2O 0.60

Extracto de levadura 0.10

oligoelementos 2 (ml/L)

glucosa 25

Las composiciones de oligoelementos son las mismas que las de las tabla 19.

87

Experimento 6

Tabla 28. Composición del medio con una relación C/N =40, MgSO4=0.3g/L.

Composición medio basal (exp.6)

compuesto g/L

(NH4)2SO4 1.39

KH2PO4 0.50

MgSO4 •7H2O 0.60

Extracto de levadura 0.10

oligoelementos 2 (ml/L)

glucosa 25

Las composiciones de oligoelementos son las mismas que las de las tabla 19.

Experimento 7

La composición del medio basal es la misma que las de la tabla 18

Tabla 29. Composición de la solución de oligoelementos, ZnSO4= 1.075g/L.

Composición de oligoelementos (exp.7)

compuesto g/L

FeSO4 •7H2O 2.50

ZnSO4 •7H2O 5

MnSO4 •H2O 2.15

H3BO3 5.50

(NH4)6Mo7O24 •4H2O 0.55

Na2EDTA•2H2O 25.0

CoCl2 •6H2O 0.80

CuSO4 •5H2O 0.80

Experimento 8

La composición del medio basal es la misma que las de la tabla 18

Tabla 30. Composición de la solución de oligoelementos, ZnSO4= 1.075g/L.

Composición de oligoelementos (exp.8)

compuesto g/L

FeSO4 •7H2O 2.50

ZnSO4 •7H2O 13.0

MnSO4 •H2O 2.15

H3BO3 5.50

(NH4)6Mo7O24 •4H2O 0.55

Na2EDTA•2H2O 25.0

CoCl2 •6H2O 0.80

CuSO4 •5H2O 0.80

88

Experimento 9

Tabla 31. Composición del medio con una relación C/N =40, MgSO4=0.3g/L.

Composición medio basal (exp.9)

compuesto g/L

(NH4)2SO4 1.39

KH2PO4 0.50

MgSO4 •7H2O 0.30

oligoelementos 2 (ml/L)

glucosa 25

Agar 39

Tabla 32. Composición de la solución de oligoelementos, ZnCl2= 11g/L, cambio de sal de Zinc.

Composición de oligoelementos (exp.9)

compuesto g/L

FeSO4 •7H2O 2.5

ZnCl2 11.0

MnSO4 •H2O 2.15

H3BO3 5.50

(NH4)6Mo7O24 •4H2O 0.55

Na2EDTA•2H2O 25.0

CoCl2 •6H2O 0.80

CuSO4 •5H2O 0.80

Experimento 10

La composición del medio basal es la misma que la de la tabla 22 y los oligoelementos de la tabla 19, en resumidas cuentas se repite el experimento 5 pero utilizando ZnCl2 en lugar de ZnSO4

89

Apéndice B Fichas de Seguridad para los Compuestos Participantes en el Proceso.

Ficha de seguridad para Ca (OH)2

Tabla 33. Identificación de los peligros de Ca(OH)2.[40]

Tabla 34. Medidas de lucha contra incendios para Ca(OH)2. [40]

Tabla 35. Controles a la exposición y protección personal. [40]

90

Tabla 36. Estabilidad y reactividad. [40]

Ficha de seguridad para Oxálico

El ácido oxálico es corrosivo a los tejidos. Cuando es ingerido quita el calcio de la sangre puede esperarse daño en el riñón en la medida que el calcio sea removido de la sangre en forma de oxalato de calcio, el cual obstruye los conductos del riñón. Tabla 37. Identificación de peligros [40]

Salud: 4- extremadamente venenoso

Inflamabilidad: 1- Leve

Reactividad: 1- Leve

Contacto: 2- Severo (corrosivo)

Tabla 38. Medidas contra incendios [41]

El producto es: Solo es combustible a 101°C

Medios de extinción adecuados: Spray de agua, polvo químico, espuma de alcohol o dióxido de carbono.

Riesgo de explosión: Reacciona explosivamente con materiales de oxidación fuertes y con algunos compuestos de plata.

Equipo de protección especial: En un incendio, usar ropa protectora y aparato respiratorio autónomo con mascarilla.

Tabla 39. Medidas contra derrames [41]

Medidas relativas a las personas Quite todas las fuentes de ignición. Ventilar el área. Usar equipo protector

Protección del medio ambiente No lanzar por el desagüe

Recojo/limpieza Limpiar el derrame de manera que no disperse polvo en el aire.

El material recogido debe ser almacenado en contenedores cerrados.

Si el material recogido entra en contacto con agua, neutraliza esta con material alcalino.

No usar materiales combustibles como aserrín.

91

Ficha de seguridad de Ácido Cítrico

Nombre Comercial: Ácido Cítrico [42] Nombre Químico: 2-hidroxi-1,2,3-ácido propanotricarboxílico monohidratado. Uso: Materia prima de uso general

RIESGOS DE FUEGO Incendio: Es posible un incendio por elevadas temperaturas o por contacto con una fuente de ignición. En caso de fuego, utilice el traje completo de protección incluido el equipo de respiración autónomo. Durante el fuego pueden generarse gases tóxicos altamente irritantes debido a la descomposición térmica o combustión. Explosión: Este material en cantidad suficiente y reducida a finas partículas es capaz de crear una explosión de polvo. Medio para extinguir el fuego: Puede utilizarse agua pulverizada, extintores con polvo químico, espuma o CO2. PROPIEDADES FISICAS Apariencia y Color: gránulos blancos Olor: sin olor Temperatura de Eb, °C: información no encontrada. Temperatura de fusión, °C: 153 Temperatura de inflamación, °C: 100 Temperatura de auto ignición, °C: 1010 Límites de inflamabilidad, vol%: 0.282.29 Gravedad específica a 16.7 °C: 1.656 g/cm3 Densidad del vapor (aire = 1) información no encontrada Solubilidad en agua: 60 mg/100 ml a 20°C (anhidro) pH, en solución 0.1 N : 2.2 Peso Molecular: 192.12

RIESGOS PARA LA SALUD Cuando se usa apropiadamente, no se conocen efectos adversos por causa del producto. Inhalación: Aún no se conoce reportes al respecto. Ingestión: No es recomendado para consumo humano. Puede ocasionar cólicos, disnea y será indispensable la atención médica. Contacto con la piel: Puede causar irritación. Contacto con los ojos: Puede causar irritación.

MANEJO Y ALMACENAMIENTO Evite contacto con los ojos, piel y ropa. Lávese bien después de manejarlo. Minimice la generación y acumulación de polvos. No permita contacto con el agua. Proteja los recipientes contra daño físico. El área de almacenamiento debe estar libre de humedad, ventilado y a temperatura ambiente, lejos de cualquier peligro de fuego, separado los productos incompatibles. Observe las precauciones de esta hoja al manejar los envases vacíos de este material, ya que podrían contener restos de polvo y finos [42].

92

El ácido cítrico anhidro es muy higroscópico por tal razón debe guardarse a baja temperatura y humedad relativa, de lo contrario se forman terrones del ácido.

Ficha de seguridad de Ácido Sulfúrico

Tabla 40. Identificación de peligros [43].

Tabla 41. Medidas contra incendios [43]

Tabla 42. Manipulación y almacenamiento [44]

93

Apéndice C

Cálculos Económicos

Para poder hacer una estimación del costo de toda la planta se utilizó la blibliografía de Douglas [52].

La inversión puede ser calculada por medio de las Ec´s C1 ó C2.

Costo de instalación

- Capital total de inversión (F&W).

Inversión = Fixed capital + work capital + start-up (C1)

Fixed capital = Costos directos + Costos indirectos

Costos directos = instalación de equipo (Onsite) + Costo de servicios (offsite)

Costos de arranque ( parte del costo de inversión)

Start-up 0.1 (Fixed)

Work capital

W.C. 0.15 (inversión)

Ecuación para el capital de inversión

Inversión = 2.36 (instalación de equipo) (C2)

Incluye: Equipo comprado Piezas de repuesto Equipo de sobra Suministros Costos de inflación Gastos de transporte Impuestos Seguro

a) Instrumentación y control

(6 a 30% del costo de equipo)

b) Tubería Costo Cuelga tubos Guarniciones Válvulas (10 a 80% del costo de equipo)

c) Instalación de equipo Soporte estructural Aislamiento de empresa Pintura (35 a 45% del costo de equipo)

d) Equipo de electricidad

Interruptores Motores Conductos instalados Cables Etc. (8 a 20% del costo de equipo)

94

El costo de inversión incluyendo todos los equipos de la tabla 42 tiene un costo total de:

C. E.=$1, 092,300 US

Para calcular la inversión, que incluye los apartados a-d anteriormente dichos, tiene una estimación que se encuentra entre los parámetros que influye cada uno. Por ejemplo la instrumentación y control va desde 6 al 30% y se consideró asignarle 0.25, pues la planta será muy automatizada

Inversión = US82,835,610...15.0..45.0..25.0..25.036.2 ECECECEC Costo total de producción

Ingresos brutos = Total de ingresos – Costo total de producción - Ingresos anuales - Costos de producción = Costos de manufactura + gastos generales

Costos de manufactura - Costos directos de producción - Materias primas - Utilidades (10 a 20% de costos totales de producción) - Mantenimiento y reparaciones - Suministros - Operadores y oficinistas - Laboratorios, patentes y regalías

Costos fijos - Depreciación - Impuestos locales - Seguro - Intereses

Ecuación para costos de producción por año

ingresos

OperadoresxonsiteutilidadesimmatPC

0256.0

1013.2)(186.0.Pr.031.1.. 5

(C3)

C.P. = US568145.492

Ecuación para ganancias antes de impuestos

G.A.I. = Ingresos – Costo total de producción

G.A.I. US8430,494.50492.145,568640,998

95

Depreciación

D = 0.181 (onsite)

D = US217,476.93

Ganancias después de impuestos

G.D.I. = 0.507 (ingresos) – [0.536(materias primas +utilidades) + 0.52(depreciación)

+ 0.0098(onsite) + 1.108 x 105 Operadores]

G.D.I. = US4212,022.72

Movimiento de dinero (Fondos)

M.D. = 0.507 (ingresos) – 0.536 (materias primas +utilidades) + 0.0098 (onsite) + v 1.108 x 105 Operadores

M.D. = US16570,260.7

Recuperación de la inversión

%ROI =

ó

%ROI = %8.6

En las tablas 43 y 44 se hace referencia al diagrama de proceso de la figura 11 de la sección 11.

Tabla 43. Costos de operación

Componente Requerimientos por tonelada de cítrico (Kg)

Costo unitario ($/T)

Costo ($/Tcítrico)

melazas 2766 80 222 Ácido sulfúrico 840 200 168 electricidad 3800 KW/h 14₵/KW*h 532 nutrientes 2.13 200 4 cal 705 180 127 agua 25m3 2₵/m3 0.5 vapor 19T 20 380 Costos variables totales 1434

96

Tabla 44. Equipo programado

Número Nombre Tamaño

T-1,2,3 4 Contenedores 250 m3 CF 4 Centrifuga 0.5 Diámetro CrE 1 Cristalizador 1 m3 Sec 1 Secador 1.8 m2 M 1 Mezcladora 22.5 KWatts

RC 5 Crecimiento 2 m3 RP 10 Producción 5.7 m3 R1 1 Formación de citrato 0.2 m3

R2 1 Recuperación de ácido 1.5 m3

Tabla 45. Costos de manufactura.

$ Costo US

T-1,2,3 16,800 CF 188,800 CrE 66,200 Sec 12,700 M 156,000

RC 118,000 RP 607,000 R1 10,200 R2 29,900 B 1,500

DAS 74,000

Total: 1,092,300

4 Rentabilidad

Capital fijo: Invertido en activos. Maquinaria, edificios, salarios, etc.

Capital de trabajo: Comprar mercancía para su producción o comercialización.

Tabla 46. Ganancia y costos netos.

657,000 Toneladas por año

Costo de equipos 1,092,300 Capital (F&W) 2,835,610.8 Ventas 998,640 Costo de fabricación 568,145.492 Ganancias $ 212,022.724 Impuesto sobre la renta 30% 63,607 Beneficio total ROI

$ 148,416 8.6%

97

Apéndice D

Identificación y Evaluación de Riesgos HAZOP

Tabla 47. Análisis HAZOP

N° Riesgo- Evento Impacto en

área-proceso

Nivel a que

afecta

MAGNITUD DEL RIESGO

Nivel de criticidad

Medidas de control

aplicadas C P

C BF- MA

P P P BF- MA

MR P MR BF

MA

1 Alumbramiento de

aguas No P,C, BF 1 1 1 2 1 2 L L 2, 3, 4

2 Aluviones Si P, C, BF 2 1 1 2 2 2 L L

3 Asentamiento de

terreno- falla geomecánica

Si O, P, PBF

2 2 2 4 4 8 L S 2, 3, 4

4

Contaminación ambiental de

fuentes externas que afecten al proyecto

Si MA,

CBF/ MA 1 1 1 1 1 1 L L 2, 3

5 Derrumbes No P, C, BF - - - - - - - - -

6 Humedad- neblina

ambiental Si MA, O 1 1 1 6 1 6 L S 2, 3

7

Incendios de bosques, pastizales,

construcciones externas que afecten

al proyecto

Si MA, P, C 1 1 1 1 1 1 S S 2,3,4

8 Inundación No C, BF, O 1 1 1 1 1 1 L L 2,3

9 Lluvias extremas Si C, O,MA 2 1 2 5 8 5 L S 2,3,4

98

10 Nevazones extremas No C,O, MA - - - - - - - - -

11 Sequía Si MA, O 1 1 1 1 1 1 L L 2, 3

12 sismo Si O,C, BF 2 3 3 6 6 18 L G 2,3,4

13 Temperatura

ambiental baja/alta Si O 1 2 3 2 3 4 L L 2,3

14 Tormenta eléctrica Si O, MR

BF/ MA 1 1 1 6 1 6 L S 1, 3

15 Viento blanco No ----------- - - - - - - - - -

16 Vientos sobre los límites aceptados como normales

Si MR P 2 2 2 6 8 12 L S 2,3,4

17

Falla o menor cantidad en el suministro de

productos para el proceso (proveedor

externo)

Si O 1 4 2 5 2 20 L G 2,3,4

18 Falta de

combustibles en planta

si O 1 4 2 5 2 20 L G 1,2,3

19 Falta de agua para procesos en planta

no - - - - - - - - - -

20 Falta/falla total de energía eléctrica.

Suministro externo Si O 1 3 2 6 4 18 L G 1,2,3

21 Material entregado por el proveedor no cumple estándares

Si O 1 4 1 3 1 24 L S 1,2,3

22 Caída de personas a

distinto nivel Si P 4 1 3 6 36 6 G S 1,2,4

23 Caída de personas al

mismo nivel Si P 1 1 4 6 16 6 S S 1,2,4

99

24 Cargas dinámicas si PP, BF 2 1 2 6 8 6 L S 1,2,4

25 Cargas

estáticas(cargas suspendidas)

si BF 2 1 2 6 8 6 L S 1,2,4

26 Colapso estructural Si P, BF, O 2 4 2 2 4 8 L S 1,2,3,4

27 Comunicación

deficiente entre personas

Si P, O 1 1 4 6 16 6 S S 2,3

28 Consumo de

alcohol/drogas Si P, BF, O 2 1 2 6 8 6 L S 1,3

29

Contacto con elementos agresores

que afecten a personas

Si P,BF 2 1 2 5 4 5 L S 1,3,4

30 corrosión Si BF, O 2 3 2 5 4 15 L G 1,2,3

31

Choques- volcamientos

(Accidentes de tránsito)

Si P, BF 2 4 2 2 4 8 L G 2,3,4

33 Derrames de

líquidos/sólidos internos en planta

Si MR P BF 2 1 2 5 4 5 L S 1,2,3

34 Exceso de fluido para un equipo o

sistema Si O, BF 4 2 3 5 24 10 S S 2,3,4

40 Falta de espacio para

operar no _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

41 Falla en un

componente de un sistema o equipo

si P, BF, O 2 4 2 2 4 8 L S 1,2,3,4

43 Fuga por uniones y empaquetaduras

si O 1 1 4 6 16 6 S S 1,2,4

100

44 Incendio si BF, O 2 3 2 5 4 15 L G 1,2,3

47 Lectura equivocada

de instrumentos Si P,BF, O 4 2 3 5 24 10 G S 1,2,3

48 Quedar atrapado en no - - - - - - - - - -

49 Saturación Si BF, O 1 4 2 5 2 20 L G 1,2,3

50 Sobre esfuerzo no - - - - - - - - - -

52 Manejo de residuos

sólidos Si BF, O, P 1 1 1 6 1 6 L S 1,3

53 Producto final contaminante- tóxico- agresivo

Si P,C 1 4 1 2 1 8 L S 1,2,3

54 Producto final no

cumple estándares no - - - - - - - - - -

55 Ruido que afecte a la

comunidad no - - - - - - - - - -

56 Robo de valores no - - - - - - - - - -

57 vandalismo no - - - - - - - - - -

Impacto en área – Proceso, SI / NO Nivel a que afecta: P: Personas C: Comunidad BF: Bien Físico (Equipos- sistemas- instalaciones) O: Operaciones MA: Medio Ambiente CP: consecuencia Personas- Comunidad CBF/MA: consecuencia Bien Físico- Operaciones – Medio Ambiente P.P: Probabilidad Personas- Comunidad PBF/MA: Probabilidad bien Físico- Operaciones- Medio Ambiente MR P: Magnitud del riesgo personas- Comunidad MR BF/ MA: magnitud del Riesgo Bien Físico- Operaciones – Medio Ambiente.

101

Apéndice E [53]

Filtradores

La filtración es la remoción de partículas que se encuentran suspendidas en un fluido líquido o gaseoso y que al pasarlo por un medio poroso o semipermeable éstas partículas quedan atrapadas en dicho medio. De forma general la intención de filtrar es reducir o eliminar el contaminante de un producto. Este contaminante pueden ser partículas sólidas o líquidas que se encuentren suspendidas en el fluido que se trata, cada filtro está diseñado para atrapar partículas de una determinado micraje. Hay situaciones en que se requiere que absolutamente todas las partículas mayores a cierto micraje sean retenidas por éste filtro, ya que si no fueran atrapadas, las consecuencias serían graves. Para poder diferenciar la eficiencia con la que trabaja cada tipo de filtro se han creado dos clasificaciones. Los filtros Grado Nominal y los filtros Grado Absoluto. Filtración grado nominal

Los filtros que caen dentro de la clasificación de Filtración Nominal (FN) atrapan un gran porcentaje de las partículas de un determinado tamaño pero nunca el 100%. Los filtros grado nominal se instalan en aplicaciones donde el factor económico es importante y donde las consecuencias de que no se atrapen todas las partículas no son tan graves.

Filtros grado absoluto

Los filtros de la clasificación de Grado Absoluto son mucho más costosos que los (FN) pero ofrecen la más alta eficiencia de filtración. Así por ejemplo un filtro grado absoluto para 5 micras atrapará por lo menos el 99% de todas las partículas de 5 micras o mayores.

Parámetros para elegir un filtrador

Media filtrante en fluidos (MF)

Este término es usado para identificar el material con que está fabricado el elemento filtrante (cartucho o bolsa filtrante) que es el que atrapará las partículas que deseamos que no estén presentes en el fluido.

Algunos de los MF más comunes son:

Polipropileno

Algodón

Nylon

Rayón

Compatibilidad del material

Este factor siempre se tiene que tomar en cuenta porque la incompatibilidad puede provocar un daño grave al fluido ya que el MF puede resultar dañado o destruido convirtiéndose en un contaminante del fluido al que se le eliminaría los contaminantes. Por ejemplo el polipropileno no es compatible con el benceno o el algodón no es compatible con el cloro.

102

Comúnmente como MF se utiliza el polipropileno porque es compatible con una mayor variedad de fluido y su precio es más razonable pero tiene la limitación de que solo opera con temperaturas no mayores a 70°C de tal manera que cuando tenemos alguna aplicación con temperatura mayor de ésta el polipropileno no funcionará teniendo que seleccionar otro material como el algodón que tolera temperaturas hasta de 180°c.

Presión

Es significativo saber éste dato porque los cartuchos como los portafiltros son diseñados para una presión máxima y que si no se respeta se corre el riesgo de dañar alguno de los componentes del sistema de filtración. Por ejemplo, un cartucho de polipropileno soporta una presión máxima de 40 lb/ ft2.

Flujo

Un cartucho o bolsa está diseñados para un flujo máximo. Por ejemplo un cartucho de 10” a 5 micras puede filtrar aproximadamente 5 galones por minuto o 0.315 litros por segundo de agua y una bolsa filtrante #2 de 7”x32” de 5 micras puede operar con un flujo máximo de 90 gpm.

Temperatura

La temperatura del fluido durante el filtrado se debe tomar en cuenta pues los filtros tienen una temperatura máxima que pueden soportar tanto el medio filtrante como también se le conoce a los cartuchos o a las bolsas como el portafiltro, de no verificarlo no solamente pueden resultar dañados alguno de los componentes, sino que el fluido se contaminaría con las partes del cartucho, bolsa o portafiltro dañado.

Viscosidad

Este parámetro se considera porque dependiendo de éste dato será el flujo que nos dará un cartucho o una bolsa determinada. Por ejemplo el agua a temperatura ambiente tiene una viscosidad de 1 cps y con un cartucho de polipropileno de 10” a 5 micras podremos filtrar 5 gpm, pero si queremos filtrar con el mismo cartucho una pintura que tenga una viscosidad de 100 cps a la misma temperatura solo se podrá filtrar un máximo de 2 gpm.

103

Apéndice F [54]

Cristalizadores

La clasificación de los cristalizadores se realiza por tamaños, normalmente sobre la base del volumen necesario para la cristalización o de las características especiales que se requieren para obtener productos. Los cristalizadores pueden operar de forma continua o por cargas. La primera condición que debe de cumplir un cristalizador es crear una solución sobresaturada para formar al cristal. El medio utilizado para producir la sobresaturación depende en principio de la curva de solubilidad del soluto. Algunos solutos como la sal común, tiene solubilidades que son prácticamente independientes de la temperatura, mientras otros como el sulfato sódico anhidro posee curva de solubilidad invertida y se hace más soluble conforme disminuye la temperatura. Para cristalizar estos materiales se precisa crear la sobresaturación mediante evaporación.

Una forma de clasificar los aparatos de cristalización se basa en el método utilizado para crear la sobresaturación:

1. Sobresaturación producida por enfriamiento sin evaporación apreciable, por ejemplo, cristalizadores de tanque.

2. Sobresaturación producida por evaporación, con enfriamiento apreciable, por ejemplo, evaporadores de cristalización, cristalizadores-evaporadores.

3. Evaporación combinada con enfriamiento adiabático: cristalizadores al vacío.

Figura 49. Cristalizador de enfriamiento superficial

La trayectoria y la velocidad de flujo de la suspensión dentro del cuerpo del cristalizador deben tener como característica que el volumen contenido sea activo. Esto quiere decir que puede haber cristales suspendidos dentro del cuerpo debido a la turbulencia y que son eficaces para descargar la sobresaturación creada por la caída de temperatura de la suspensión, al pasar por el

104

intercambiador. La bomba de circulación es parte del sistema de cristalización y es preciso prestar atención a este tipo y sus parámetros de operación para evitar influencias indebidas de la nucleación. El diseño se basa en las velocidades permisibles de intercambio de calor y la retención que se necesita para el crecimiento de los cristales. Otra forma de clasificar los cristalizadores se basa en su forma del cristalizador:

Cristalizador de evaporación de circulación forzada

En la figura 50 del lado izquierdo podemos ver la suspensión que sale bombeada a través de una tubería de circulación y por un intercambiador de calor de coraza, donde su temperatura se eleva de 2 a 6 °C. Este calentamiento se lleva a cabo sin vaporización, los materiales de solubilización no deberán producir sedimentación en los tubos. La mezcla que regresa mediante una línea de recirculación, se mezcla con la suspensión, elevando su temperatura, lo que provocara la ebullición en la superficie del líquido. En el enfriamiento subsiguiente y la vaporización que alcanzaran el equilibrio entre el líquido y el vapor, la sobresaturación que se formara provoca sedimentación y arremolinamiento de los cristales suspendidos, que se descargaran por la tubería de circulación. La cantidad y la velocidad de la recirculación, el volumen del tanque y la velocidad de la bomba de circulación son equipos críticos del diseño para poder obtener resultados predecibles. La alimentación se encuentra después de salida de la suspensión, en un lugar situado por debajo de la superficie sin líquido, para impedir la vaporización instantánea durante el mezclado.

Figura 50. Cristalizador de evaporación de circulación forzada

105

Cristalizador de refrigeración de contacto directo.

Para obtener hielo a partir de agua de mar se necesita llegar a temperaturas tan bajas que hacen que el enfriamiento utilice refrigerantes como la única solución económica. En estos casos no resulta práctico emplear equipos de enfriamiento superficial, porque la diferencia permisible de temperaturas es tan baja de menos de 3°C, que la superficie de intercambio de calor se hace excesiva o que la viscosidad es tan elevada que le energía mecánica aplicada por el sistema de recirculación es mayor que el que se puede obtener con diferencias razonables de temperatura. Entonces es conveniente mezclar el refrigerante con la suspensión que se enfría en el cristalizador, de modo que el calor de vaporización del refrigerante sea relativamente inmiscible con la mezcla madre y capaz de separación, compresión, condensación y un reciclaje subsiguiente en el sistema de cristalización. Las presiones de operación y las temperaturas tienen una influencia importante en el consumo de potencia. Resulta muy adecuado para reducir los problemas que se asocian con la acumulación de sólidos sobre una superficie de enfriador. La refrigeración de contacto directo reduce también las necesidades generales de energía del proceso, ya que es un proceso de refrigeración que incluye dos fluidos que requieren una diferencia mayor de temperaturas, cuando el refrigerante debe enfriar inicialmente la solución intermedia esa solución, enfría a la mezcla madre en el cristalizador. Los equipos de este tipo han funcionan adecuadamente a temperaturas tan bajas como -59°C.

Cristalizador de tubo de extracción (DT).

Se puede emplear en sistemas donde no necesita la destrucción de las partículas finas. En esos casos se elimina el desviador y se determina el tamaño del flujo interno para que tenga un influjo mínimo de la nucleación sobre la suspensión.

En los cristalizadores DT y DBT, la velocidad de flujo suele ser mucho mayor que la que se obtiene en un cristalizador de flujo forzado. El equipo aplica, cuando es necesario hacer circular grandes cantidades de suspensión, para minimizar la sobresaturación dentro del equipo.

Figura 51. Cristalizador de tubo de extracción.

106

Apéndice G [55]

Centrifugadoras

Las máquinas diseñadas para una separación centrifuga someten a una masa o corriente de líquidos mezclados a una fuerza centrífuga con el fin de separarlos, la fuerza que actúa sobre las partículas las obliga a moverse en una trayectoria circular que determina su aceleración hacia el centro, es decir, la rapidez con la que cambia la dirección de su velocidad separándola de la trayectoria lineal que tiende a seguir la partícula que gira; las partículas más pasadas comienzan a ser arrastradas a través de la mezcla hacia la pared del equipo. Los filtros centrífugos son el medio para contener a una de las sustancias presentes en la mezcla, por lo regular la sustancia que traspasa al medio filtrante son los líquidos.

Tipos de centrifuga

Se debe distinguir primordialmente que los equipos de centrifugación presentan dos posiciones para colocar a los tubos, vertical y horizontal, el problemas de los verticales es que dependen de un eje que es inestable, cuando las cargas de sólido se desequilibran con respecto al eje se desestabiliza el tubo contenedor y choca contra las paredes provocando la suspensión de la operación, y por lo regular su operación es manual, lo que para algunos productos como farmacéuticos y alimentos no deben tener contacto con los obreros. Las centrífugas horizontales, Figura 52 no tienen este problema pues su engranaje está dispuesto fuera del tubo con la carga del sólido, pero su diseño es más costoso, su consumo de energía es un poco mayor, pero tiene la ventaja que puede operar en continuo y descarga automática, estas dos posiciones pueden alternarse con distintas formas de operación según es el proceso.

Figura 52. Centrifugador Horizontal

Centrifugas de canasta de malla metálica

Son usadas en la industria química para separar los cristales de aguas madre, el medio filtrante es la malla que puede encontrarse con diferentes tamaños de entramado de la malla, operan hasta 500 rpm y tener un diámetro de 150 cm estas suelen tener descarga mecánica o a mano del operario.

107

Algunos compuestos que se tratan en centrífugas horizontales continuas:

Deshidratación y espesamiento de fangos procedentes de aguas residuales urbanas e industriales

Producción de plásticos como PVC, HDPE etc.

Recuperación y procesamiento de productos de origen vegetal y animal (aceites, grasas, almidón, proteínas)

Bebidas (vino, cerveza, zumos de frutas y de verdura)

Deshidratación de fangos en la industria minera y recuperación de metales

Combustibles renovables como el Biodiesel y el Bioetanol

108

Apéndice H [56]

Secadores

Hay una variedad muy grande de secadores, todos operan con los fundamentos de los directos o indirectos, pero varia su distribución. El objetivo de esta operación unitaria es eliminar un líquido de un sólido por efectos térmicos, el secado se lleva a cabo por dos procesos simultáneos la transferencia de calor para evaporar el líquido del sólido, y la transferencia de masa del líquido por evaporación a una corriente que transporte a este vapor. Regularmente el calor se transmite en los equipos industriales por convección, conducción y radiación ó diversas combinaciones de estas tres, pero lo que siempre se cumple es el proceso de transmisión de la superficie del sólido al interior de este para extraer el líquido.

Para clasificar a los secadores se basa en dos métodos: primero por las características y propiedades físicas del material húmedo, esto es una guía para la selección del equipo de secado para un estudio preliminar. El segundo método para transmitir el calor al sólido húmedo y dejando ver las diferencias de diseño y funcionamiento del equipo. Mostraremos los secadores indirectos y algunas de sus propiedades.

Secadores indirectos

Se diferencia de los directos por la transmisión de calor y eliminación de vapor. Los fundamentos generales de los secadores indirectos son:

1. El calor se transmite al material a través de una pared, regularmente metálica. 2. Las temperaturas de operación van desde la congelación del agua hasta 540°C, esta última

temperatura ocurre en secadores rotatorios calentados con combustión directa. 3. Son apropiados para operar con presiones reducidas, recuperar disolventes costosos, para

secar materiales que se pueden oxidar con el aire. 4. Son más económicos pues pude controlarse la cantidad de calor requerido para secar el

producto. 5. La recuperación de polvos ese realiza de mejor manera. 6. Estos pueden tener agitadores que permiten tener un secado homogéneo, eliminando los

gradientes desde la pared caliente hacia la carga.

Secadores indirectos continuos

Pueden operar a presiones por debajo de la atmosférica, con cerrado hermético de entrada y salida, permitiendo su trabajo continuo, además de recuperar solventes.

Secadores indirectos intermitentes

Estos son mejores para trabajar al alto vacío, secando pastas y sólidos granulados. A su vez se dividen en dos categorías estos secadores: cuando el sólido permanece estático durante el ciclo completo y el sólido es agitado durante el ciclo. Sus costos se elevan debido a la mano de obra en carga y descarga.

109

Especificaciones del secador utilizado

El secador elegido fue el indirecto continuo con un costo aproximado de $1,000 - 10,000 US.

Descripción Filtro de vacío, lavado y secado de multi-función, diseñado y fabricado sobre la base de la absorción de avanzada. Se puede en lugar de filtrado y secado de equipos (filtro de la bomba, prensas de filtro, de doble cono secador y secado al vacío horno), se puede completar todos los procesos tales como la filtración, el lavado, el secado y la descarga de sólidos dentro de un conjunto de equipos. Este puede ser ampliamente utilizado para la industria farmacéutica, la industria química, la industria de productos químicos agrícolas, la industria alimentaria cosas etc., para el proceso de producción continua. Particularmente es adecuado para el producto que tiene el requisito de asepsia o el producto de alta toxicidad. Todo el diseño es compacto y su diseño estructural es más razonable y confiable. Principio de operación El diseño de esta máquina es de doble cono tipo de la máquina, un extremo es junta de filtrado y el otro lado es de lavado y puerto de descarga. La chaqueta podría ser llenada en caliente o vapor de agua para la calefacción. El tanque se pone en el marco de la máquina a través del eje principal. Un extremo del eje principal es la entrada de vapor y el agua de condensación, el otro extremo de bombeo es puerto de vacío en el que el estado de vacío puede ser formado a través de la bomba de vacío o de vacío del sistema, el agua evaporada se pueden extraer a cabo por la bomba de vacío. En la Figura 53 vemos una imagen del secador.

Figura 53. Secador indirecto

110

Apéndice I

Mezcladores

El mezclado es un proceso difícil de someter a un análisis científico, no hay ecuaciones que describan de forma precisa la velocidad, uniformidad y condiciones para realizar eficazmente el trabajo. La principal fuente de gasto de este proceso es la energía eléctrica empleada en los motores, se podría pensar que un agitado vigoroso mejorara el mezclado, sin embargo nada más alejado pues esto no significa alcanzar una uniformidad en la consistencia de la mezcla y si un gasto mayor de energía y costo finalmente.

La forma de abordar problemas de las mezcladoras siguen dos reglas:

1. Es necesario establecer un grado de mezclado que satisfaga las características exigidas, estas dependen de las propiedades microscópicas y macroscópicas de las sustancias.

2. Se requiere establecer una velocidad y una dirección de masa de substancias de modo que se alcance el grado óptimo de mezclado siendo este punto el óptimo.

Se toman en cuenta las características físicas de las substancias, que son:

1. Consistencia o viscosidad aparente: esta se aprecia a la velocidad a la que se esté mezclando, teniendo que realizar curvas para determinar estas condiciones que pueden modificar el diseño del mezclador.

2. La densidad relativa de la mezcla y la densidad de cada fase ya que estas propiedades se modificaran durante el proceso y es necesario saber cuánta energía consumirá la agitación por este cambio.

3. Propiedades físicas antes y después de la mezcla es necesario considerar la facilidad de humedecerse de los materiales y con qué líquido en el caso de polvos, tensión superficial pues en la mezcla cambia el tamaño de partículas, efectos térmicos en la adición y la variación de viscosidad durante el mezclado.

4. La proporción de los materiales y su orden de adición aunque es casi imposible decir con exactitud la cantidad que se agrega de substancias se debe tener en cuenta las proporciones para facilitar el mezclado así como su orden si se intenta mezclas una arcilla con agua es más fácil adicionar la arcilla al agua que si sucediera al revés.

Mezcladoras elegidas

Dongguan Nosen M&E Technology Co., Ltd.

Costo de equipo $200 - 2,000 US (aprox. MXN 2,657.45 - 26,574.54)

Datos básicos

Condición: Nuevo Tipo del mezclador: Mezclador Uso: Líquido Lugar del origen: China (Continental) Marca: Nosen Número de Modelo: Rne020~rne750 Voltaje: 110vac~440vac Energía (W): 187~15000

111

Certificación: iso9001 Garantía: 1 año

Agitador/mezclador Industrial (Figura 54)

La estructura principal incluye motor y engranaje de base de apoyo. El mezclador incluye acoplamiento del eje, del eje del poste y cuchillas etc.

Agitador rotatorio de engranaje del motor: Como muchos tipos de agitadores de velocidad, sus estructuras y eficiencias son bastante diferentes así como la fijación de precios. La instalación y los espacios también podrían ser restringidos.

Base de apoyo: una fuerte carga dinámica generada por la mezcla de los fluidos, el movimiento de la estabilidad y la vida del mezclador de líquidos es determinado por la estructura de la base de apoyo. Velocidad de rotación, la viscosidad y la capacidad etc. son los factores a considerar. Todo el apoyo de la base debe ser de precisión mecanizada para aumentar su estabilidad de la operación. De acuerdo a diferentes ambientes, se selecciona el más adecuado para los materiales de base de apoyo.

La hoja de mezcla: se tienen dos tipos de hélices de tipo para la selección plana- paletas de la cuchilla (2 cuchillas) y cuchillas airscrew (3 cuchillas). Características del Mezclador líquido: Los sistemas de electricidad: 110-440vac, 50/60hz, solo/tres fases están disponibles Potencia de entrada: 0.2 -15 kW Mezclador de revoluciones: 10-430 rpm; 1000 rpm o 1500 rpm es bajo ninguna reductor de velocidad. Polo diámetros de eje: mm 20-60 polvo agitador de la licuadora de polvo Diámetros de la hélice: 100-1000 mm De la aplicación: De aguas residuales de las industrias de la batidora eléctrica agitador de procesamiento de alimentos, agricultura.

Figura 54. Mezcladora de doble hélice (izquierda), mezcladora de hélice sencilla (derecha).

112

Apéndice J

Ecuación logística

Fue propuesta por el biólogo y matemático belga P. F. Verhulst en 1840, cuando estaba investigando el crecimiento poblacional en varios países. Para describir el crecimiento de una población es poco exacta la ecuación dP/dt=kP, porque cuando las poblaciones son muy grandes existen efectos inhibitorios sobre el crecimiento, estos términos no podrían ser evaluados entonces se recurre a la siguiente ecuación:

(J1)

Donde -bP2 es un término no lineal que se interpreta como el factor de inhibición o competencia. Se ha comprobado que la ecuación logística predice el crecimiento de algunas poblaciones bacterianas, protozoario y especies de insectos en espacios limitados. Obteniéndose como resultado:

(J2)

Entonces se establecen dos condiciones P(0)=P0 y P0≠a/b, empleando estas en (2):

Sustituyendo c1 en (2):

(J3)

La ecuación (3) se puede reinterpretar en términos de población final e inicial reinterpretando a los parámetros a y b. Primero a es la tasa de crecimiento en el caso de este trabajo que a lo largo de los distintos experimentos y tratamiento de datos se considera como μ, y al factor de inhibición b se considera como la cantidad de población generada en un tiempo y volumen determinado, entonces (3) se puede escribir como:

(J4)

La relación de tasa de crecimiento a=μ y b, da como resultado la población final por inhibición en su máxima velocidad a la que creció durante un intervalo de tiempo.

(J5)

Para el crecimiento que se describe en la literatura del Aspergillus niger tiene una fase lenta de crecimiento (lag), que transcurrido un tiempo comienza su crecimiento exponencial, y finalmente deja de crecer, este comportamiento es capaz de predecirlo la ecuación logística. La glucosa y el ácido cítrico están ligados por el crecimiento del microorganismo por tanto el consumo de glucosa, como por la producción de ácido cítrico podría predecirse su comportamiento con respecto al tiempo de cultivo del Aspergillus niger.

113

(J6)

Modificando la ec. 5, ahora se tiene la concentración de un compuesto que depende del tiempo y toma como parámetro la velocidad de crecimiento del Aspergillus, entonces μ se convierte en una velocidad de consumo o velocidad de producción.

114

Apéndice K

Cálculos por equipo

Cálculos para biorreactores

Utilizando YX/S=0.29g biomasa/gS de máxima producción de biomasa del Dr. Sergio Huerta Ochoa.

En tanto la experimentación dió como resultado una producción de ácido cítrico de 1.69 g/L,

dando como consecuencia un YP/S=0.021g A. cítrico/gS.

La planta produce 730 toneladas de ácido cítrico por año, lo que en producción por hora es:

(K1)

Antes de producir esta cantidad de ácido cítrico es necesario producir una cantidad de biomasa

que sea capaz de generar esta cantidad de ácido. El biorreactor es continuo, estos operan con

recirculación de biomasa para mantenerla constante durante los días de fermentación, entonces

se utiliza la ecuación siguiente:

(K2)

Para calcular la cantidad máxima de ácido cítrico que se obtendría con la alimentación de glucosa

de 140g/L, se considera a la eficiencia reportada por el Dr. Pedro F. Mateos González donde se

tiene de 60%, con una relación teórica de 120g ácido cítrico/100 g de glucosa. Entonces en el caso

real esto se convierte en 0.67 g ácido cítrico/g de glucosa. Y una qp=0.11KgAC/KgBio h.

(K3)

Sustituyendo valores en (K2):

(K4)

=13818.8 (K5)

Este es el volumen del líquido dentro del biorreactor, este volumen se dividirá en 10 biorreactores,

esto para poder operar de forma continua y evitar el paro total de la planta si existe

contaminación del medio de alimentación y pérdida del lote producido.

El volumen da cada reactor de producción es 1382 L de líquido, estos operan a 70% entonces:

(K6)

115

(K7)

Redondeando el volumen a 2000 L, porque a nivel comercial solo hay reactores con valores de

números enteros de 100 L.

Para calcular la cantidad de biomasa necesaria para producir ácido cítrico, ahora se multiplica la

cantidad de biomasa producida en 1 L por el volumen del biorreactor de producción:

(K8)

Esto es para un solo biorreactor multiplicando por 10, da como resultado 802 Kg de biomasa, que

deben ser producidos en reactores tipo batch, ahora se hace una relación:

(K9)

Se proponen 5 biorreactores de crecimiento que alimentaran biomasa a 10 biorreactores de

producción, de este modo se tiene:

(K10)

(K11)

Este volumen es del líquido. Entonces si estos reactores también trabajan al 70% el volumen de

cada reactor es:

(K12)

La cantidad necesaria de glucosa que se consumirán para producir los 802 Kg de biomasa se puede

encontrar con:

(K13)

Y la cantidad de agua para tener una concentración de 140 g/L, se puede calcular:

(K14)

Calculo para bombas

Las heurísticas del libro de Douglas [52] propone una ecuación para calcular la potencia de las

bombas, esta relaciona a los flujo (gmp), las caídas de presión (ΔP), y la eficiencia energética (E)

de la bomba en la siguiente ecuación:

(K15)

116

El libro propone eficiencias de 60 a 80%, para realizar su trabajo los flujos másicos se transforman

en flujos volumétricos y finalmente se transfieren a unidades inglesas por ejemplo el flujo F10, los

flujos másicos deben ser multiplicados por el inverso de sus densidades:

(K16)

El flujo en unidades inglesa es 4.38 gal/min, pero encontrar la ΔP es un poco arriesgado, pues no

se conoce del todo la operación ni el tipo de tubería aun, entonces se parte de conocer la potencia

de algunas bombas como las de 1/4 o 1/2 de hp y observar su comportamiento con respecto al

flujo volumétrico.

(K17)

Pero esta presión es sólo el cambio que provoca la bomba, a esta se le tiene que sumar la presión

por ejemplo proveniente de reactores o tanque de almacenamiento. Para calcular la presión que

provoca un tanque se puede calcular con Bernoulli:

(K18)

Donde los términos de velocidad pueden ser cancelados y solos utilizar la presión ejercida por la

diferencia de altura, siempre y cuando la altura del líquido dentro del tanque no cambie.

(K19)

Si el biorreactor de producción no cambia su altura entonces y se tiene la densidad promedio de la

mezcla:

(K20)

La presión de salida del tanque es 1.6 lbf/in2, restando esta presión a la de la bomba se tiene una

presión de salida de la bomba de 76.7 lbf/in2.

Estos cálculos se realizaron a la salida de cada equipo y para cada bomba considerando que para el

cristalizador y las centrifugas la presión de salida es cero pues pierden toda presión previa por el

proceso.