Determinación de leghemoglobina

BIOGEOQUÍMICA

BIOQUÍMICA, FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMCIA-UBA

DRA. MARÍA FLORENCIA IANNONE

2014

Desarrollo de la clase

1- Introducción teórica2- Explicación del protocolo a desarrollar3- Hacer extractos vegetales4- Centrifugación de extractos- Cálculos para

concentración de curva de calibración5- Discusión de paper (Durante el calentamiento

con ácido oxálico) 6- Espectrofluorómetro7- Análisis de resultados8- Informe individual

Ciclo del nitrógeno

Planta de soja infectada por Bradyrhizobium japonicum.

Interacción selectiva entre especie de Rhizobium y planta leguminosa a infectar

Objetivo del TP

Determinar el contenido de leg-hemoglobina en

nódulos de plantas de soja sometidas a estrés

salino y de esta manera, evaluar la fijación de N2.

Material vegetalPlantas de Soja de 45 días de crecimiento

Inoculadas con un cultivo líquido (medio de cultivo basal de extracto de

levadura-MBL) de Bradyrhizobium japonicum 10 8 bacterias/ml

Inóculo

Regadas con N

NO3- y NH4

+

Refuerzo de inóculo

Regadas sin N 200 mM NaCl.Sin N

0 7 35 45 días

Cosecha

Observaciones a realizar

• Planta entera: diferencias fenotípicas

• Nódulos: morfología

• Interior de nódulos: color rojo (presencia de Leg-Hb)

Pesar 0,5g de nódulo y agregar 5ml de Solución A

¿Qué contiene dicha solución?

¿Por qué creen que se realiza el extracto con esa solución?

• Centrifugar 15000 rpm durante 20 min

• 40 µl de sobrenadante lo llevan a 200µl con

solución A + 2ml de ácido oxálico

TRIPLICADO

2 tubos (olla a presión 0.75 atm, 40 min)

1 tubo (temperatura ambiente)

2 curvas de calibración Temp amb.

Olla a presión

Estándar: Hemoglobina

¿Por qué creen que los tubos que dejan a temperatura ambiente son los blancos?

Determinación de Leg-hemoglobina se

fundamenta en la técnica descripta por:

LaRue y Child (1979)

Producto fluorescente estableLegHb

Ác oxálico + calor

Hierro

¿Es una técnica selectiva?

Si debido a que casi todas las

hemoproteínas solubles en el nódulo son Leg-Hb

• Medición en el espectrofluorómetro a λexcitación 405nm y

λemisión 650nm

• Cálculos de concentración de legHb.

• Expresión de los resultados como mg de LegHb/g PF de

nódulo

• Nos juntamos a discutir los resultados obtenidos

• Finalmente, realizaran el informe individual

¿Dudas?

Bibliografía

Guía de Trabajos Prácticos de Biogeoquímica, Cátedra de Química Biológica Vegetal, Facultad de Farmacia y Bioquímica-UBA (2014).

Bothe H, Ferguson SJ y Newton WE (2007). Biology of the Nitrogen Cycle, ISBN:978-0-444-52857-5.

Udvardi M y Poole PS (2013) Transport and Metabolism in Legume-Rhizobia Symbioses. Annu. Rev. Plant Biol. 64:781–805.

Xu G, Fan X y Miller AJ (2012) Plant Nitrogen Assimilation and Use Efficiency. Annu. Rev. Plant Biol. 63:153–182.

Oldroyd GED y Downie JA (2008) Coordinating Nodule Morphogenesis with Rhizobial Infection in Legumes. Annu. Rev. Plant Biol. 59:519–546.