cuantificaciÓn de flavonoides, expresados como...
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I
I
CUANTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES,
EXPRESADOS COMO QUERCETINA TOTAL,
EN ALGUNOS EXTRACTOS Y SOLUCIONES
DE USO ORAL A BASE DE Calendula
officinalis
John Alexander Muñoz Muñoz
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia
Bogotá D.C., Colombia
2014
II
II
CUANTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES,
EXPRESADOS COMO QUERCETINA TOTAL,
EN ALGUNOS EXTRACTOS Y SOLUCIONES
DE USO ORAL A BASE DE Calendula
officinalis
John Alexander Muñoz Muñoz
Trabajo de investigación presentado como requisito para optar al título de:
Magister en Ciencias Farmacéuticas
Director (a):
Ph.D. Mary Trujillo Gonzalez
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia
Bogotá D.C., Colombia
2014
III
III
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero dar infinitas gracias a mi madre y mi padre, quienes han sido un
gran apoyo desde que tengo razón de ser… por ellos y para ellos.
A Carolina Borrero, quien a pesar de la distancia ha hecho que todo este camino sea
mucho más fácil, quien además de ser mi compañera sentimental, ha sido mi mejor
consejera.
A mi tutora Mary Trujillo, quien depositó toda su confianza en mí desde el principio, en la
cual siempre encontré el apoyo técnico y académico, además de estar presta a conseguir
lo requerido para el desarrollo del trabajo.
A mi compañero de carrera, Jorge Morgan, con quien todo este camino se hizo mucho
más ameno y con quien compartí desde el primer hasta último semestre muchas alegrías
y dificultades.
A los compañeros del LAFUN, Diana, Angie, Luis Felipe, quienes alegraron mis jornadas
de trabajo y siempre estuvieron prestos a cualquier ayuda necesaria.
Al profesor Javier García, a quien le aprendí mucho siendo su auxiliar de docente y quien
en diversas ocasiones fue un gran apoyo técnico.
Al profesor Javier Rincón, por las incontables veces que tuvo la disposición de facilitarme
tanto equipos como espacio en su laboratorio para trabajar.
A Rigoberto, por su amabilidad y gran colaboración que recibí de su parte en cuanto a
material de laboratorio y reactivos.
A los docentes del departamento, por compartir sus conocimientos y experiencias en sus
respectivas áreas.
A la Vicedecanatura académica de la Facultad de Ciencias, por brindarme la beca de
auxiliar de docente, con la cual me incorporé al programa.
A la Dirección Académica de la sede Bogotá, por brindarme la beca de asistencia de
docencia durante los dos últimos semestres del programa.
Y por último, a la Universidad Nacional de Colombia, por permitirme ser parte de su
selecto grupo de estudiantes.
I
INDICE
RESUMEN ...................................................................................................................... IV
ABSTRACT ..................................................................................................................... VI
LISTADO DE FIGURAS ................................................................................................ VIII
LISTADO DE TABLAS ..................................................................................................... X
LISTADO DE ANEXOS ................................................................................................. XIII
LISTADO DE ECUACIONES ......................................................................................... XIV
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1
2. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................... 3
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 4
3.1. OBJETIVO GENERAL .................................................................................... 4
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 4
4. MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 5
4.1. Calendula officinalis ........................................................................................ 5
4.1.1. Generalidades ......................................................................................... 5
4.1.2. Flavonoides glicósidos y agliconas .......................................................... 5
4.1.3. Actividad antiinflamatoria y cicatrizante ................................................... 7
4.1.4. Otras propiedades ................................................................................... 7
4.1.5. Toxicidad ................................................................................................. 8
4.2. EXTRACTOS NATURALES............................................................................ 9
4.3. PREPARACIONES A BASE DE C. officinalis ............................................... 10
4.4. OPTIMIZACIÓN DE PROCESOS Y METODOLOGÍAS ................................ 11
4.5. VALIDACIÓN DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS ....................................... 13
4.5.1. Selectividad o especificidad .................................................................. 14
4.5.2. Linealidad .............................................................................................. 14
4.5.3. Precisión ................................................................................................ 14
4.5.4. Exactitud ................................................................................................ 15
4.5.5. Limites de detección y cuantificación ..................................................... 15
4.6. INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN ....................................................... 16
4.6.1. Cálculo de la incertidumbre usando la información de la validación del
método (top-down). .............................................................................................. 16
II
5. MARCO LEGAL ................................................................................................... 20
5.1. NORMAS FARMACOLÓGICAS PARA PREPARACIONES A BASE DE C.
officinalis ................................................................................................................. 20
5.2. NORMA ISO 17025 ...................................................................................... 21
6. METODOLOGIA .................................................................................................. 22
6.1. MATERIALES ............................................................................................... 22
6.2. EQUIPOS ..................................................................................................... 22
6.3. REACTIVOS ................................................................................................. 23
6.4. DESARROLLO DEL SISTEMA CROMATOGRÁFICO Y LA METODOLOGÍA
DE HIDRÓLISIS ...................................................................................................... 23
6.4.1. Preparación de la fase móvil .................................................................. 23
6.4.2. Preparación de soluciones ..................................................................... 23
6.5. OPTIMIZACIÓN DE HIDRÓLISIS DE FLAVONOIDES GLICÓSIDOS .......... 25
6.5.1. DCC para soluciones orales .................................................................. 25
6.5.2. DCC para extractos glicólicos ................................................................ 27
6.5.3. DCC para extractos hidroalcohólicos ..................................................... 28
6.6. VALIDACION DE LA METODOLOGIA ......................................................... 29
6.6.1. Idoneidad del sistema ............................................................................ 29
6.6.2. Selectividad. .......................................................................................... 29
6.6.3. Linealidad, límite de detección y cuantificación ...................................... 32
6.6.4. Precisión ................................................................................................ 34
6.6.5. Exactitud ................................................................................................ 35
6.7. DETERMINACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE .............................................. 35
6.8. CUANTIFICACIÓN DE QUERCETINA TOTAL EN PRODUCTOS DEL
MERCADO .............................................................................................................. 35
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 37
7.1. DESARROLLO DE LA METODOLOGIA ....................................................... 37
7.1.1. Desarrollo del sistema cromatográfico ................................................... 37
7.1.2. Desarrollo de la metodología para la hidrólisis de flavonoides glicósidos41
7.2. ÓPTIMIZACIÓN DE HIDRÓLISIS DE FLAVONOIDES GLISÓSIDOS EN
EXTRACTOS Y SOLUCIONES ORALES DE C. officinalis ...................................... 41
7.2.1. Diseño central compuesto para soluciones orales ................................. 42
7.2.2. Diseño central compuesto para extractos glicólicos ............................... 44
7.2.3. Diseño central compuesto para extractos hidroalcohólicos .................... 46
III
7.3. VALIDACIÓN DE LA METODOLOGIA ANALÍTICA ...................................... 50
7.3.1. Idoneidad del sistema ............................................................................ 50
7.3.2. Selectividad ........................................................................................... 51
7.3.3. Linealidad .............................................................................................. 56
7.3.4. Limite de detección y cuantificación ....................................................... 61
7.3.5. Precisión ................................................................................................ 63
7.3.6. Exactitud ................................................................................................ 66
7.4. DETERMINACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE .............................................. 69
7.5. CUANTIFICACIÓN DE QUERCETINA TOTAL EN EXTRACTOS Y
PRODUCTOS DEL MERCADO .............................................................................. 74
8. CONCLUSIONES ................................................................................................ 78
9. RECOMENDACIONES ........................................................................................ 79
10. REFERENCIAS ................................................................................................ 80
IV
RESUMEN
Para el año 2013, la C. officinalis fue la planta que contaba con mayor número de
productos fitoterapéuticos registrados ante el Instituto Nacional de Vigilancia de
Medicamentos y Alimentos [Invima, Consulta Datos de Productos]. Entre las propiedades
atribuidas a esta planta se encuentra su actividad cicatrizante y antiinflamatoria que están
relacionadas con la presencia de flavonoides, siendo los glicósidos de quercetina los de
mayor importancia.
En el presente trabajo, se desarrollaron y validaron métodos para la cuantificación de
flavonoides expresados como quercetina total, a partir de extractos glicólicos,
hidroalcohólicos y soluciones orales a base de C. officinalis, de tal forma que estos sirvan
como herramienta para el control de calidad por parte de la industria fitoterapéutica y de
la autoridad competente a nivel nacional.
Para la optimización del proceso de hidrólisis de los flavonoides glicósidos a partir de las
matrices propuestas se utilizó el Diseño Central Compuesto (DCC), el cual permitió
encontrar las condiciones óptimas para cada una. Seguidamente, se validaron las
metodologías analíticas por HPLC para la cuantificación de quercetina total en el rango
entre 0.9 y 4.5 μg/mL en las diferentes matrices, determinando además la incertidumbre
asociada a la medición.
Los resultados muestran que las metodologías desarrolladas cumplen parámetros de
selectividad, linealidad, precisión y exactitud necesarios para su utilización, por lo que
fueron utilizadas en la determinación del contenido de quercetina total en algunos
extractos glicólicos, hidroalcohólicos y soluciones de uso oral a base de C. officinalis.
En la evaluación de dos lotes diferentes de extracto hidroalcohólico 1:1, se obtuvo un
contenido de quercetina total de 64 y 19.8 μg/g para cada uno, lo cual corresponde a un
coeficiente de variación del 75%. Por su parte, para la evaluación del contenido en tres
lotes diferentes de una solución oral del mismo fabricante, se obtuvieron valores de 0.84,
3.6 y 1.9 μg/g, lo que representa un coeficiente de variación del 66%.
Además, para una de los soluciones orales a base de C. officinalis analizadas y para uno
de los extractos hidroalcohólico 0.2:1 (presentación de gotas), el contenido no alcanza a
ser cuantificable por la metodología, lo que indica un contenido de quercetina total
cercano a 0.03 μg/g para el primero caso y cercano a 0.08 μg/g para el segundo caso.
De acuerdo con los resultados obtenidos en el presente trabajo, se observa una alta
variabilidad en el contenido de quercetina total, tanto en las soluciones orales, como en
un extracto hidroalcohólico realizado por el mismo fabricante. Por lo anterior, se propone
realizar un análisis más detallado sobre la situación actual del mercado de los extractos a
V
base de C. officinalis y productos derivados, en el cual se haga participe a las
autoridades competentes, con el fin de evaluar la información recolectada y tomar
acciones al respecto, de modo que la calidad con la cual se comercialice tanto la materia
prima, como productos a base de ella, garantice la eficacia de los mismos.
Palabras clave. Flavonoides glicósidos, agliconas, quercetina, hidrólisis, superficies de
respuesta, control de calidad, validación, incertidumbre.
VI
ABSTRACT
By 2013, C. officinalis was the plant with highest number of herbal products registered
with the Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos [Invima , Advice
Product Data ]. Among the properties attributed to this plant are their healing and anti-
inflammatory activities, that are related to the presence of flavonoids, which are found in
its glycosidic form, being quercetin glycosides the most important. .
In this work, methodologies were developed and validated for the quantification of
flavonoid content expressed as total quercetin, from glycolic, hydroalcoholic extracts and
oral solutions containing C. officinalis, so that these could serve as a tool for quality
control by the phytotherapeutic industry and the competent authority.
To optimize the hydrolysis of flavonoid glycosides from the matrixes, the Central
Composite Design (CCD) was used, which allowed to find optimal conditions for each.
Then, HPLC methodologies for quantifying total quercetin content in the range between
0.9 and 4.5 μg/mL in different matrices were validated further, including the determination
of the uncertainty in the measurement.
The results show that developed methodologies meet parameters of selectivity, linearity,
precision and accuracy, so they were used in the determination of total quercetin content
in some glycolic, hydroalcoholic extracts and solutions for oral use based on C. officinalis.
For the evaluation of two different batches of 1:1 hydroalcoholic extract, a total quercetin
content of 19.8 and 64 μg/g was obtained, which corresponds to a coefficient of variation
of 75%. Meanwhile, for the evaluation of content in three different batches of the same
manufacturer for oral solution, values of 0.84, 3.6 and 1.9 μg/g were obtained, which
represents a coefficient of variation of 66% .
Furthermore, for oral solutions containing C. officinalis analyzed and one of the
hydroalcoholic extracts 0.2:1 (drops), the content does not reach to be measurable by the
method, indicating a total quercetin content near 0.03 μg/g for the first case and near 0.08
μg/g for the second case .
According to the results obtained in this study, high variability was observed in total
quercetin content for oral solutions such as a hydroalcoholic extract made by the same
manufacturer. Therefore, it’s proposed a more detailed analysis on the current market
situation of the C. officinalis based extracts and derived products, including competent
authorities, in order to evaluate the collected data and take action on the matter, so that
the quality of both the raw material and products based on it, ensure the efficacy thereof.
VII
Keywords
Flavonoid glycosides, aglicone, quercetin, hydrolysis, response surface, quality control,
validation, uncertainty.
VIII
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1. Estructura general de flavonoides. Las asteriscos (*) indican posiciones
hidroxiladas. ..................................................................................................................... 5
Figura 2. Estructura de los diferentes grupos de flavonoides. Isoflavonas 2, flavonoles 3,
flavononas 4, flavonas 5, catequinas 6 y antocianinas 7. ................................................. 6
Figura 3. Estructura de flavonoides presentes en Calendula officinalis. Glicósidos de
isorhamnetina 8a: 8b=narcisina; 8c=isorhamnetin-3-O-rutinosilrhamnosido;
8d=isorhamnetin-3-O-glucósido; 8e=isorhamnetin-3-O-glucosilclucósido. Glicósidos de
quercetina 9a: 9b=rutina; 9c=isoquercitrina; 9d=hiperósido; 9e=quercetin-3-O-
rutinosilrhamnosido (Adaptado de [Bilia, A.R., et al.,2002]). ............................................. 6
Figura 4. Representación gráfica de un modelo de segundo orden con dos variables
independientes: Superficie de respuesta y gráfico de contorno. ..................................... 12
Figura 5. Representación de los puntos para el Diseño Central Compuesto con dos
factores. ......................................................................................................................... 13
Figura 6. Componentes de incertidumbre basada en la información generada durante la
verificación de la trazabilidad. ......................................................................................... 17
Figura 7. Esquema para la hidrólisis partir de muestras de solución oral para la
realización del DCC. ....................................................................................................... 26
Figura 8. Esquema para la hidrólisis partir de muestras de extracto glicólico para la
realización del DCC ........................................................................................................ 27
Figura 9. Esquema para la hidrólisis partir de muestras de extracto hidroalcohólico para
la realización del DCC. ................................................................................................... 28
Figura 10. Esquema de selectividad frente a productos de degradación de quercetina .. 30
Figura 11. Esquema de selectividad frente a productos de degradación en el extracto de
C. officinalis. ................................................................................................................... 31
Figura 12. Esquema de las soluciones utilizadas en la evaluación de la linealidad del
sistema. .......................................................................................................................... 32
Figura 13. Esquema de las soluciones utilizadas en la evaluación de la linealidad del
método para extractos glicólicos, hidroalcohólicos, soluciones orales y cremas (M=matriz;
X= blanco). ..................................................................................................................... 33
Figura 14. Tratamiento y condiciones de hidrólisis para la evaluación de la precisión
intermedia del método para (A) soluciones orales; (B) extractos glicólicos; (C) extractos
hidroalcohólicos. ............................................................................................................. 34
Figura 15. Esquema inicial del gradiente propuesto para elución de quercetina en
extracto hidrolizado de C. officinalis ............................................................................... 38
Figura 16. Esquema final del gradiente propuesto para la óptima elución de quercetina. 39
IX
Figura 17. Espectro UV correspondiente al pico de la quercetina obtenido con el detector
de arreglo de diodos (DAD), para el extracto glicólico hidrolizado. ................................. 40
Figura 18. Superficie de respuesta para la hidrólisis de flavonoides glicósidos, en función
del tiempo y la concentración de HCl a partir de soluciones orales. ............................... 43
Figura 19. Efecto de la temperatura en la hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de
soluciones orales. ........................................................................................................... 43
Figura 20. Superficie de respuesta para la hidrólisis de flavonoides glicósidos, en función
del tiempo y la concentración de HCl, a partir de extractos glicólicos. ............................ 44
Figura 21. Quercetina obtenida a partir de extractos glicólicos frente al valor de Z del
factor tiempo, sobre la trayectoria de máxima pendiente. ............................................... 45
Figura 22. Efecto de la temperatura en la hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de
extractos glicólicos. ........................................................................................................ 46
Figura 23. Superficie de respuesta para la hidrólisis de flavonoides glicósidos, en función
del tiempo y la concentración de HCl, a partir de extractos hidroalcohólicos. ................. 47
Figura 24. Quercetina obtenida a partir de extractos hidroalcohólicos frente al valor de -Z
del factor tiempo, sobre la trayectoria de máxima pendiente. ......................................... 49
Figura 25. Efecto de la temperatura en la hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de
extractos glicólicos. ........................................................................................................ 49
Figura 26. Productos de degradación de quercetina reportados. .................................... 51
Figura 27. Espectro UV del producto de degradación de uno de los excipientes. ........... 56
Figura 28. Curva de calibración de la linealidad del sistema para quercetina en el rango
entre 0.9 y 4.5 μg/mL. ..................................................................................................... 57
Figura 29. Curva de calibración de quercetina a bajas concentraciones. ....................... 62
Figura 30. Curva de desviación estándar de las áreas vs concentración de quercetina
(bajas concentraciones). ................................................................................................ 62
Figura 31. Contribución de los componentes de incertidumbre a la incertidumbre total
para soluciones orales, extractos glicólicos e hidroalcohólicos. ...................................... 73
Figura 32. Extracción de los extractos hidroalcohólicos 0.2:1 analizados (soluciones
orales concentradas) (A) SOconc-A-L1; (B) SOconc-D-L1 (C) SOconc-E-L1. ........................ 76
X
LISTADO DE TABLAS
Tabla 1. Plantas con mayor volumen de comercialización en Colombia en los últimos
años. (Adaptado de [Guevara, H.A., et al., 2010]). ........................................................... 2
Tabla 2. Ensayos requeridos para el Diseño Central Compuesto para dos factores. ...... 12
Tabla 3. Preparaciones farmacéuticas tópicas y orales a base de C. officinalis aprobadas
para comercialización en el territorio Colombiano. ......................................................... 20
Tabla 4. Parámetros evaluados en los ensayos del DCC para la optimización de la
hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de solución oral. .......................................... 26
Tabla 5. Condiciones fijas para la optimización de la hidrólisis de flavonoides glicósidos a
partir de soluciones orales. ............................................................................................. 26
Tabla 6. Parámetros evaluados en los ensayos del DCC para la optimización de la
hidrólisis a partir de extractos glicólicos .......................................................................... 27
Tabla 7. Condiciones fijas para la optimización de la hidrólisis de flavonoides glicósidos a
partir de extractos glicólicos. .......................................................................................... 27
Tabla 8. Parámetros evaluados en los ensayos del DCC para la optimización de la
hidrólisis a partir de extracto hidroalcohólico .................................................................. 28
Tabla 9. Condiciones fijas para la optimización de la hidrólisis de flavonoides glicósidos
en extractos hidroalcohólicos por DCC ........................................................................... 28
Tabla 10. Codificación de los extractos glicólicos e hidroalcohólicos a base de C.
officinalis (materia prima) analizados. ............................................................................. 36
Tabla 11. Codificación de las muestras de soluciones orales a base de C. officinalis
analizadas. ..................................................................................................................... 36
Tabla 12. Parámetros cromatográficos obtenidos al realizar elución de extracto glicólico
de C. officinalis hidrolizado en condiciones isocráticas. .................................................. 37
Tabla 13. Parámetros cromatográficos obtenidos al realizar elución de extracto glicólico
de C. officinalis hidrolizado diferente concentración de H3PO4 en la fase acuosa. .......... 38
Tabla 14. Parámetros cromatográficos obtenidos al realizar elución de extracto glicólico
de C. officinalis hidrolizado, a diferentes temperaturas de horno. ................................... 39
Tabla 15. Sistema cromatográfico óptimo para la elución de quercetina en extractos y
productos comerciales de Calendula officinalis. ............................................................. 40
Tabla 16. Gradiente utilizado para la óptima elución de quercetina en extractos de C.
officinalis (A= H3PO4 0.08%; B= MeOH) ......................................................................... 40
Tabla 17. Resultados de la optimización de hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de
soluciones orales, a través del DCC. .............................................................................. 42
XI
Tabla 18. Resultados de la optimización de hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de
extractos glicólicos, a través del DCC. ........................................................................... 44
Tabla 19. Trayectoria de mayor pendiente para buscar el punto óptimo de hidrólisis para
flavonoides glicósidos a partir de extractos glicólicos ..................................................... 45
Tabla 20. Resultados de la optimización de hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de
extractos hidroalcohólicos, a través del DCC. ................................................................ 47
Tabla 21. Congruencia de los datos obtenidos experimentalmente para la hidrólisis de
flavonoides glicósidos a partir de extractos hidroalcohólicos y los valores propuestos por
el modelo matemático. ................................................................................................... 48
Tabla 22. Trayectoria de mayor pendiente para buscar el punto óptimo de hidrólisis de
flavonoides glicósidos a partir de extractos hidroalcohólicos. ......................................... 48
Tabla 23. Datos para la idoneidad del sistema a partir de una solución de 2.7 μg/mL de
Quercetina. ..................................................................................................................... 51
Tabla 24. Diferentes condiciones de degradación para quercetina estándar .................. 52
Tabla 25. Extracto hidrolizado de Calendula officinalis bajo diversas condiciones de
degradación. .................................................................................................................. 54
Tabla 26. Mezcla de excipientes y extracto de C. officinalis usados para la evaluación de
la selectividad frente a excipientes. ................................................................................ 55
Tabla 27. Datos de la linealidad del sistema para Quercetina ........................................ 57
Tabla 28. ANOVA para la linealidad del sistema ............................................................ 59
Tabla 29. Test de Cochran para la linealidad del sistema ............................................... 59
Tabla 30. Resumen estadístico para la linealidad del método en las matrices trabajadas.
....................................................................................................................................... 60
Tabla 31. ANOVA de la linealidad del método para extracto glicólico ............................. 60
Tabla 32. ANOVA de la linealidad del método para extracto hidroalcohólico .................. 61
Tabla 33. ANOVA de la linealidad del método para soluciones orales ............................ 61
Tabla 34. Curva de calibración a bajas concentraciones ................................................ 61
Tabla 35. Limites de detección y cuantificación en las matrices escogidas. ................... 63
Tabla 36. Datos de la repetibilidad del sistema y del método ......................................... 63
Tabla 37. Resultados para el contenido de quercetina en condiciones de precisión
intermedia a partir de soluciones orales. ........................................................................ 64
Tabla 38. Resultados para la precisión intermedia del método a partir de extractos
glicólicos. ........................................................................................................................ 64
Tabla 39. Resultados para la precisión intermedia del método a partir de extractos
hidroalcohólicos. ............................................................................................................. 65
XII
Tabla 40. Límites para el coeficiente de variación en la precisión intermedia, de acuerdo
al nivel de concentración de la muestra, para validación de métodos químicos [AOAC,
2012; FDA, 2012]. .......................................................................................................... 66
Tabla 41. Resumen del ANOVA para la precisión intermedia para las matrices trabajadas.
....................................................................................................................................... 66
Tabla 42. Datos del porcentaje de recuperación de quercetina a partir de un extracto
glicólico .......................................................................................................................... 67
Tabla 43. Datos del porcentaje de recuperación de quercetina a partir de un extracto
hidroalcohólico ............................................................................................................... 67
Tabla 44. Datos del porcentaje de recuperación de quercetina de a partir de una solución
oral ................................................................................................................................. 68
Tabla 45. Límites para el porcentaje de recuperación de acuerdo al nivel de
concentración de la muestra, para validación de métodos químicos [AOAC, 2012; FDA,
2012]. ............................................................................................................................. 68
Tabla 46. Test de Cochran para la exactitud .................................................................. 69
Tabla 47. Componentes de la incertidumbre en la cuantificación de quercetina a partir de
soluciones orales a base de C. officinalis. ...................................................................... 72
Tabla 48. Componentes de la incertidumbre en la cuantificación de quercetina a partir de
extractos glicólicos de C. officinalis. ............................................................................... 72
Tabla 49. Componentes de la incertidumbre en la cuantificación de quercetina a partir de
extractos hidroalcohólicos de C. officinalis. .................................................................... 72
Tabla 50. Determinación de quercetina total en extractos de C. officinalis usados como
materia prima en productos fitoterapéuticos y cosméticos .............................................. 74
Tabla 51. Determinación de quercetina total en productos comerciales de uso oral a base
de C. officinalis. .............................................................................................................. 75
XIII
LISTADO DE ANEXOS
Anexo 1. Elución en condiciones isocráticas de quercetina a partir de extracto glicólico de
Calendula officinalis hidrolizado, (A) %MeOH 50% y (B) %MeOH 40%. ......................... 87
Anexo 2. Elución de quercetina a partir de extracto glicólico de Calendula officinalis
hidrolizado, (A) Temperatura de 25°C, (B) Temperatura de 30°C, (C) Temperatura de
35°C, se observa resolución de interferente a 254nm. ................................................... 88
Anexo 3. Cromatograma para determinar tiempo total de elución con lavado a 100%
MeOH. ............................................................................................................................ 89
Anexo 4. (A) Extracto hidroalcohólico de C. officinalis control; (B) neutralización con TEA;
(C) Solución oral de C. officinalis control; (D) neutralización con bicarbonato de sodio. . 90
Anexo 5. Cromatograma de quercetina estándar usado como control en ensayos de
selectividad. ................................................................................................................... 91
Anexo 6. Cromatograma de la hidrólisis ácida (HCl 0.1N) de quercetina estándar. ........ 91
Anexo 7. Cromatograma de la hidrólisis básica (NaOH 0.01N) de quercetina estándar. 92
Anexo 8. Cromatograma de la oxidación con H2O2 3% de quercetina estándar. ............ 92
Anexo 9. Cromatograma de la degradación UV 254nm de quercetina estándar. ............ 93
Anexo 10. Cromatograma de la degradación UV 366nm de quercetina estándar. .......... 93
Anexo 11. Cromatograma del extracto hidrolizado control para selectividad frente a
productos de degradación. ............................................................................................. 94
Anexo 12. Cromatograma de la hidrólisis ácida del extracto hidrolizado de Calendula
officinalis. ....................................................................................................................... 94
Anexo 13. Cromatograma de la hidrólisis básica (NaOH 0.1N) del extracto hidrolizado de
C. officianlis. ................................................................................................................... 95
Anexo 14. Cromatograma de la oxidación con H2O2 3% del extracto hidrolizado de C.
officinalis. ....................................................................................................................... 95
Anexo 15. Cromatograma de la degradación UV (254nm) del extracto hidrolizado de C.
officinalis. ....................................................................................................................... 96
Anexo 16. Cromatograma de la degradación UV (370nm) del extracto hidrolizado de C.
officinalis. ....................................................................................................................... 96
Anexo 17. Cromatograma de la mezcla de posibles excipientes en una formulación oral
(sin extracto de caléndula). ............................................................................................ 97
Anexo 18. Cromatograma de la mezcla de los posibles excipientes de una formulación
oral hidrolizados (HCl 1.0M) ........................................................................................... 97
Anexo 19. Cromatograma de la mezcla hidrolizada de los posibles excipientes de una
formulación oral y el extracto de C. officinalis. ................................................................ 98
XIV
LISTADO DE ECUACIONES
Ecuación 1 .................................................................................................................... 11
Ecuación 2 .................................................................................................................... 17
Ecuación 3 .................................................................................................................... 17
Ecuación 4 .................................................................................................................... 17
Ecuación 5 .................................................................................................................... 18
Ecuación 6 .................................................................................................................... 18
Ecuación 7 .................................................................................................................... 18
Ecuación 8 .................................................................................................................... 18
Ecuación 9 .................................................................................................................... 19
Ecuación 10 .................................................................................................................. 19
Ecuación 11 .................................................................................................................. 19
Ecuación 12 .................................................................................................................. 19
Ecuación 13 .................................................................................................................. 33
Ecuación 14 .................................................................................................................. 33
Ecuación 15 .................................................................................................................. 43
Ecuación 16 .................................................................................................................. 45
Ecuación 17 .................................................................................................................. 47
Ecuación 18 .................................................................................................................. 58
Ecuación 19 .................................................................................................................. 59
Ecuación 20 .................................................................................................................. 69
Ecuación 21 .................................................................................................................. 71
Ecuación 22 .................................................................................................................. 71
Ecuación 23 .................................................................................................................. 73
Ecuación 24 .................................................................................................................. 73
Ecuación 25 .................................................................................................................. 73
1
1. INTRODUCCIÓN
Durante las últimas décadas, la ciencia de los productos naturales ha logrado
posesionarse como una alternativa terapéutica de gran interés, lo cual ha generado un
crecimiento en el mercado de materias primas de origen natural (principalmente vegetal),
así como de productos terapéuticos y cosméticos basados en ingredientes naturales.
Este fenómeno exhibido por la sociedad es conocido por algunos autores como “El
regreso a lo natural” [Cañigueral, S., et al., 2003]. Las razones para la aparición de este
fenómeno son diversas, sin embargo, dentro de las que pueden ser enunciadas están: la
percepción menos tóxica de medicamentos basados en plantas medicinales, los efectos
adversos asociados a los fármacos de síntesis (seguridad), los grandes avances en el
conocimiento químico y farmacológico de diferentes materiales de origen vegetal
(eficacia), la disposición de metodologías analíticas en pro de la calidad de los productos
basados en plantas medicinales (calidad) y la variedad de presentaciones disponibles
para algunas plantas con diversos fines terapéuticos (diversidad) [Cañigueral, S., et al.,
2003; Paniwnyk, L., et al., 2001].
El control de la calidad de estos productos, así como de la materia prima relacionada con
ellos ha sido objeto de diversos estudios, por lo cual algunas revistas de investigación
han abierto los alcances de sus publicaciones a diferentes metodologías analíticas que
aseguren un correcto desempeño para la estandarización de material de origen natural,
dada la complejidad de su composición frente a los medicamentos a base de fármacos
sintéticos [Bauer R., 1998].
Este comportamiento a nivel global del mercado de los fitoterapéuticos, ha generado
interés desde el punto de vista de calidad y seguridad, lo cual se evidencia en la Unión
Europea con regulaciones como REACH. Esta regulación está dirigida para la industria
química en general y en la cual la seguridad en las materias primas es de notoria
importancia, tanto para la salud humana como para el medio ambiente. En dicha
regulación, los extractos vegetales son considerados como Natural Complex Substances
(NCS), enfatizando la necesidad de que estos sean lo más homogéneos entre sí, de tal
forma que la variación natural presente en estas muestras no tengan efecto en la
funcionalidad o seguridad de las mismas [ECHA, 2013].
La Calendula officinalis, es una planta de uso tradicional a la cual se le adjudican
diversas propiedades, entre las que sobresalen la actividad cicatrizante, antinflamatoria y
antioxidante. En Colombia, la C. officinalis es una de las plantas con mayor volumen de
comercialización en el mercado fitoterapéutico colombiano en los últimos años (tabla 1)
[Guevara, H.A., et al., 2010] y es una de las plantas más usada en preparaciones
fitoterapéuticas de acuerdo al número de productos registrados ante la autoridad
sanitaria nacional vigentes en el año 2013 (Instituto Nacional de Vigilancia de
Medicamentos y Alimentos, INVIMA) [Invima, Consulta Datos de Productos].
2
Tabla 1. Plantas con mayor volumen de comercialización en Colombia en los últimos años. (Adaptado de [Guevara, H.A., et al., 2010]).
2003 2005 2009 Alcachofa Calendula Alcachofa Calendula Alcachofa Calendula Diente de león Valeriana Valeriana Ajo Ajo Ajo Sauco diente de león Ginkgo biloba Valeriana Ortiga Cáscara sagrada Manzanilla Totumo Boldo Gualanday Cidrón Psyllium Cola de caballo Zarzaparrilla Castaño de indias Boldo Uña de gato Diente de león
Las propiedades de la C. officinalis se encuentran soportadas por diversos estudios que
relacionan algunos compuestos como los flavonoides, entre ellos la quercetina y sus
glicósidos, con estas [Duran, V., et al., 2005; Matysik, G, et al., 2005; Ulbritch, C.; et al.,
2006; EMEA, 2008]. En la literatura se describen métodos para la cuantificación de
quercetina libre y sus glicósidos en C. officinalis, sin embargo, para la cuantificación del
contenido total de quercetina (en forma de aglicona y glicósido), es necesario una previa
hidrólisis, la cual se describe en algunos artículos, partiendo del material vegetal (flores
de calendula) basados en HPLC [Menghinello, P., et al., 1999; Olszewska, M., 2007] y
otros estudios basados en HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography),
[Chakraborthy, G.S., et al., 2010; Sujatha, K., et al., 2011].
En el presente trabajo, se desarrollaron y optimizaron metodologías de hidrólisis de
flavonoides glicósidos a partir de extractos de C. officinalis (usados como materia prima
en la industria fitoterapéutica y cosmética), así como de soluciones orales, realizando un
diseño experimental para garantizar la óptima formación de quercetina en cada caso, de
acuerdo a la matriz del producto. Dado que se proponen las metodologías como un
análisis de rutina para el control de calidad de dichas materias primas y producto
terminado, fue necesario la validación y el cálculo de la incertidumbre de acuerdo con la
norma ISO 17025, para el Laboratorio de Análisis Farmacéutico de la Universidad
Nacional (LAFUN).
3
2. JUSTIFICACIÓN
A nivel mundial se ha incrementado la comercialización de productos fitoterapéuticos, y
con ello, el esfuerzo por mejorar los estándares de calidad de estos, de forma que los
consumidores sean los más beneficiados. La falta de un control de calidad que dé
respaldo al contenido de las sustancias de interés terapéutico lleva al desconocimiento
en la variación de estas sustancias en los productos, lo cual podría derivar en la
comercialización de productos defectuosos, con bajo contenido de metabolitos activos,
viéndose afectada su eficacia. Parte de estos problemas surgen debido a la variación del
contenido de metabolitos activos en la materia prima (extractos vegetales), lo cual puede
responder a factores relacionados con las diferencias entre la misma especie del material
vegetal, condiciones del cultivo, época de la cosecha, procedimientos de recolección,
extracción y elaboración [Raal, A., et al., 2011].
La C. officinalis es una especie vegetal cuya eficacia y seguridad se encuentra
respaldada tanto por el uso tradicional, como por diversos estudios científicos, lo cual la
ha llevado a ser una de las plantas con mayor volumen de comercialización a nivel
nacional en los últimos años [Guevara, H.A., et al., 2010]. Además, es uno de los
materiales vegetales con mayor número de registros sanitarios vigentes, y gran
diversidad de preparaciones fitoterapéuticas y cosméticas [Invima, Consulta Datos de
Productos; Normas Farmacológicas, 2006].
Dada la importancia de la C. officinalis en terapéutica por sus propiedades cicatrizantes y
antiinflamatorias, además de su alto consumo y teniendo en cuenta la escasez de
métodos disponibles para la evaluación del contenido de metabolitos activos presentes
en extractos y productos derivados de ella, es necesario desarrollar metodologías
analíticas para complementar el control y el seguimiento de la calidad de los mismos.
Debido a que los flavonoides glicósidos, principalmente los derivados de quercetina,
están relacionados con las diversas aplicaciones terapéuticas de la C. officinalis, en este
trabajo se desarrollaron las metodologías para la cuantificación de flavonoides
expresados como quercetina total, tanto en materia prima, como en soluciones de uso
oral.
En este sentido, las metodologías analíticas desarrolladas, optimizadas y validadas, en el
Laboratorio de Análisis Farmacéutico de la Universidad Nacional (LAFUN) podrán ser
una herramienta útil al momento de realizar una posible normalización de los extractos
comercializados como materia prima, lo cual podría dar un valor agregado a este tipo de
productos. De igual manera, las metodologías podrán estar a disposición tanto de la
entidad regulatoria, como de los productores de preparaciones farmacéuticas basadas en
C. officinalis, para el control de calidad de estos productos en el mercado local y de
exportación.
4
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Establecer un método de cuantificación de flavonoides, expresados como quercetina
total, que pueda ser usado para el control de calidad de extractos y soluciones
comerciales de uso oral a base de Calendula officinalis.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Desarrollar y estandarizar las metodologías para la hidrólisis, extracción y
cuantificación de flavonoides por HPLC, expresados como quercetina total en
extractos y soluciones comerciales de uso oral a base de C. officinalis
Validar las metodologías para la cuantificación de flavonoides expresados como
quercetina total, en extractos glicólicos, extractos hidroalcohólicos y soluciones
orales a base C. officinalis.
Determinar la incertidumbre en el valor de cuantificación de quercetina total en
extractos glicólicos, hidroalcohólicos y soluciones orales a base de C. officinalis.
Determinar el contenido de quercetina total en algunos extractos y soluciones
orales a base de C. officinalis encontrados en el mercado Colombiano.
5
4. MARCO TEÓRICO
4.1. Calendula officinalis
4.1.1. Generalidades
La Calendula officinalis es una planta perteneciente a la familia Asteraceae, nativa de la
región mediterránea, pero que se extendió a Europa y América. La palabra “Calendula”
deriva del latín “calendulae” (calendario), que designa el primer día de cada mes
[Ulbritch, et al., 2006]. La caléndula (llamada así comúnmente) ha sido ampliamente
utilizada desde hace tiempo con fines terapéuticos, pues se le atribuyen diversas
propiedades a los extractos y tinturas realizadas principalmente a partir de sus capítulos
florales [Duke, J.A., et al. 2002; EMEA, 2008]. Entre las propiedades reportadas para el
extracto de flores de caléndula se tiene actividad antimicrobiana [Attard, A, et al. 2009;
Radioza, S.A., et al. 2007; Roopashree, T.S, et al., 2008], antiinflamatoria [Amoian, B., et
al. 2010; Chandar, P.K., et al. 2009; Ukiya, M., et al., 2006], inmunomodulatoria [Attard,
A., et al. 2009], cicatrizante [Preethi, K.C., et al. 2009; Leach, M.J., 2008], antioxidante
[Ćetković, G.S., et al., 2004; Fonseca, Y.M, et al., 2010] entre otros.
Entre los principales compuestos presentes en las flores de caléndula se encuentran
saponinas triterpénicas, principalmente glicósidos del ácido oleanólico, alcoholes
triterpénicos libres y esterificados, especialmente 3-monoesteres del faradiol,
carotenoides, polisacáridos, esteroles, sesquiterpenoides, aceites esenciales y
flavonoides basados en quecertina, isorhamnetina y kaempferol [ESCOP
MONOGRAPHS, 2003; WHO Monographs, 2002].
4.1.2. Flavonoides glicósidos y agliconas
Los flavonoides (numerados como 1 en la figura 1) son un grupo de metabolitos
secundarios de gran importancia, pues se encuentran en la mayoría de los vegetales
superiores en mayor o menor grado. Su estructura se compone de tres anillos, en donde
el anillo A proviene de la ruta del acetato, el anillo B proviene de la ruta del shikimato y el
anillo C se origina por adición nucleofílica de Michael del grupo OH en posición 1, a la
cetona α, β insaturada [Marcano, D., et al. 2002].
O
A
B
C
O
1
2
3
456
7
8 1'
2'
3'
4'
5'
6'
*
*
**
*1
Figura 1. Estructura general de flavonoides. Las asteriscos (*) indican posiciones
hidroxiladas.
6
Los flavonoides pueden dividirse en diferentes categorías, de acuerdo a sus estructuras,
las cuales conllevan a distintas propiedades biológicas. En la figura 2 se observan la
diferentes estructuras del grupo de los flavonoides (numeradas del 2 al 7), los cuales
pueden encontrarse en su forma glicosilada en la posición “3" (flavonoides glicósidos), o
pueden encontrarse en su forma libre (agliconas). La hidrólisis del enlace glicosídico da
como resultado la obtención de la aglicona respectiva.
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
HO
R
R
OH
HO
OH
OH
OH
R
R
HO
OH
R
R
HO
OH
OH
R
OH
HO
OH
OH
OH
OH
HO
OH
R
R
2 3 4
5 6 7
Figura 2. Estructura de los diferentes grupos de flavonoides. Isoflavonas 2, flavonoles 3, flavononas 4, flavonas 5, catequinas 6 y antocianinas 7.
En la Calendula officinalis, se encuentran principalmente estructuras de tipo flavonoles 3,
siendo los glicósidos de isorhamnetina 8b-e y quercetina 9b-e, los de mayor proporción
(Figura 3).
O
OOH
HO
OH
OH
OR
O
OOH
HO
OH
O
OR
8a R=H; 8b R= Rut; 8c R= Rut-Glc
8d R= Glc; 8e R= Glc-Glc
9a R=H; 9b R= Rut; 9c R= Glc
9d R= Gal; 9e R= Rut-Glc
Figura 3. Estructura de flavonoides presentes en Calendula officinalis. Glicósidos de isorhamnetina 8a: 8b=narcisina; 8c=isorhamnetin-3-O-rutinosilrhamnosido;
8d=isorhamnetin-3-O-glucósido; 8e=isorhamnetin-3-O-glucosilclucósido. Glicósidos de quercetina 9a: 9b=rutina; 9c=isoquercitrina; 9d=hiperósido; 9e=quercetin-3-O-
rutinosilrhamnosido (Adaptado de [Bilia, A.R., et al.,2002]).
7
4.1.3. Actividad antiinflamatoria y cicatrizante
Estudios previos han demostrado la actividad antiinflamatoria de la caléndula,
corroborando así el uso tradicional de esta planta para tal fin. Son diversos los
compuestos relacionados con dicha actividad, entre los que están los monoesteres de
faradiol, siendo el faradiol en su forma libre el de mayor actividad, obteniéndose
resultados comparables con la Indometacina, en dosis equimolares. Sin embargo, dada
la prevalencia en el contenido del faradiol esterificado, puede estar mas relacionado con
esta actividad [Zitterl-Eglseer, K., et al., 1997]. Por otro lado, los flavonoides glicósidos de
las agliconas isorhamnetina 8a y quercetina 9a (figura 3) aislados de C. officinalis
también contribuyen a la acción antiinflamatoria, pues se ha demostrado la inhibición de
la lipoxigenasa a nivel in vitro, la cual se encuentra relacionada con la formación de
leucotrienos durante el proceso inflamatorio [EMEA, 2008; Bezakova, L., et al., 1996].
Por otro lado, la actividad cicatrizante adjudicada a esta planta ha sido objeto de diversos
estudios. Por ejemplo, por medio del ensayo CAM (Chick Chorioallantoic Membrane) se
han detectado altos niveles de ácido hialurónico (compuesto relacionado en los procesos
de cicatrización) en áreas de neovascularización, al trabajar el extracto acuoso seco de
hojas de caléndula, relacionándose este comportamiento con la presencia de
flavonoides, por inhibición de la actividad de la hialuronidasa [Patrick, K.F., et al., 1996].
Por su parte, Matysik (2005) y colaboradores, realizaron un ensayo bioguiado con el fin
de obtener la fracción del extracto de las flores de caléndula que estimulara la
proliferación de un cultivo celular de fibroblastos de piel humana (HSF, Human Skin
Fibroblast), encontrando que la fracción de acetato de etilo (polaridad media), estimulaba
su proliferación, al mismo tiempo que mantenía los mejores niveles de viabilidad a las
concentraciones trabajadas (en comparación con los otros extractos). Esta fracción era
rica principalmente en triterpenos como ácido oleanólico, β-amirina y acetato de β-
amirina, seguida de flavonoides glicósidos de isorhamnetina, quercetina, isoquercitrina y
ácidos fenólicos como caféico, vainílico, clorogénico, p-cumárico, y siríngico.
Adicionalmente, se han realizaron pruebas in vivo para evaluar la recuperación de
quemaduras térmicas en piel de rata y el posible mecanismo de acción, tras la
administración oral de diferentes dosis del extracto de flores de C. officinalis. Con lo
anterior, se observa un aumento de la hexosamina y la hidroxiprolina en el tejido
granular, lo que muestra la efectividad del extracto en aumentar el contenido de colágeno
en el tejido expuesto a la quemadura, ya sea por aumento de su síntesis o disminución
del catabolismo, en donde la presencia de flavonoides en el extracto juega un papel
importante [Chandran, P.K., et al., 2008].
4.1.4. Otras propiedades
Otro tipo de propiedades de la C. officinalis son las que derivan de su actividad
antioxidante, la cual principalmente se debe a los flavonoides y ácidos fenólicos
8
presentes en su composición. Se ha demostrado que la respuesta inflamatoria que se da
luego de irradiación UV aguda en la piel y el proceso degenerativo relacionado con
irradiación UV en la misma, están mediados por una sobreproducción de especies
reactivas de oxigeno (ROS), radicales libres y el deterioro de los sistemas antioxidantes
[Aquino, R., et al., 2002]. Esto motivó el estudio del potencial del extracto de C. officinalis
para prevenir el estrés oxidativo en la piel inducido por radiación UV-B, con lo que se
encontró un incremento en la actividad de las gelatinasas, lo cual beneficia el proceso de
recuperación de la piel y la síntesis de pro-colágeno, lo cual es de gran interés en la
industria cosmética [Fonseca, Y.M., et al., 2010].
Otros estudios han comprobado también efectos hepatoprotectores de los extractos
acuoso y etanólicos de las flores de C. officinalis. En un primer estudio, se observa la
reducción de hepatocitólisis en ratas intoxicadas con CCl4, debido a una reducción en la
glutamo-oxalato-transaminasa (GOT) y glutamo-piruvato-transaminasa (GPT) [Rusu,
M.A., et al., 2005]. En otro estudio se encontró que el extracto acuoso de las flores de
esta planta exhibió actividad de antihepatoma contra 5 células de cáncer de hígado
humano [Muley, B.P., et al., 2009].
4.1.5. Toxicidad
Las flores de caléndula aparecen clasificadas dentro de los alimentos seguros, haciendo
parte de los alimentos dietarios [FDA, 2013]. Dentro de la monografía de la European
Medicines Agency (EMEA) para la Calendula officinalis, se encuentran revisiones sobre
toxicidad aguda, subcrónica, mutagenicidad y carcinogenicidad. Para la toxicidad
subcrónica se tienen resultados de LD50 intravenoso para extractos acuosos e
hidroalcohólicos (1:1, 30% etanol) de 375 mg/Kg de ratón y 526 mg/100g de ratón.
Incluso, no se manifiestan signos de toxicidad en ratones ni ratas cuando el extracto
hidroalcohólico se administra oralmente en dosis superiores a 5 g/Kg de peso [Silva, E.J.,
et al., 2007]. De igual manera, no se observan señales de toxicidad cuando se realizan
ensayos de toxicidad subcrónica a 18 y 21 meses en ratones [EMEA, 2008].
En cuanto a la genotoxicidad y mutagenicidad, se usó el test de Ames para determinar la
concentración de un extracto hidroalcohólico (1:1, 60% etanol) que no conllevan a
mutagenicidad. En las pruebas realizadas con Salmonella typhimurium no se observó
mutagenicidad entre 50 y 5000 μg/plato, mientras que las pruebas con Aspergillus
nidulans exhibieron toxicidad en el rango de concentraciones de 5 platos desde 0.1 a 1.0
mg de solidos/mL ensayado. Sin embargo, los resultados no fueron confirmados por el
modelo in vivo usando el test de micronúcleos, lo cual puede explicarse principalmente a
los perfiles del proceso de absorción, distribución, metabolismo y excreción [Ramos, A.,
et al., 1998].
Los datos colectados son respaldados por estudios mas recientes de toxicidad crónica y
subcrónica, en donde se evalúa la toxicidad del extracto seco de C. officinalis (extracción
9
acuosa) y se establece que el Non Observed Adverse Effects Level (NOAEL) para el
extracto seco es de 2000 mg/Kg de ratón y el ensayo de toxicidad subcrónica establece
que el Lowest Observed Effect Level (LOEL) es de 50 mg/Kg/día en ratas [Lagarto, A., et
al., 2011].
4.2. EXTRACTOS NATURALES
Un extracto es la preparación obtenida por un proceso de separación de fracciones de
interés, a partir de una materia prima por el uso de solventes selectivos. Para el caso en
el que la materia prima utilizada es un material vegetal, la legislación colombiana los
considera en la categoría de “Preparaciones farmacéuticas con base en plantas
medicinales”, cuando la seguridad y actividad farmacológica están comprobadas
[DECRETO NÚMERO 2266 DE 2004]. Los extractos, de acuerdo a la USP [USP 35,
<565>, 2012], son categorizados como:
Tinturas: “Preparaciones liquidas, por lo general preparadas por extracción de material
vegetal con alcohol o mezclas hidroalcohólicas. La mayoría de las tinturas vegetales
representan 20 g de la respectiva materia vegetal en 100mL de tintura”. De esta forma
pueden etiquetarse como extractos 1:5 ó 0.2:1.
Extractos fluidos o líquidos: “Preparaciones de materia de origen vegetal que contienen
alcohol como disolvente o como conservante, o ambos, y están hechos de forma que
cada 1 mL contiene los componentes extraídos de 1 g del material crudo que representa,
a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual”. De esta forma
pueden etiquetarse como extractos 1:1.
Extractos blandos o pilulares: “Preparaciones que tienen una consistencia entre la de los
extractos líquidos y la de los extractos en polvo y se obtienen por evaporación parcial del
disolvente, agua, alcohol o mezclas hidroalcohólicas usadas como disolventes de
extracción”.
Extractos secos: “Preparaciones sólidas que tienen una consistencia polvorienta obtenida
por evaporación del disolvente usado para la extracción. Pueden contener sustancias
adecuadas agregadas, como por ejemplo excipientes, estabilizantes y conservantes”.
En todos los extractos se encuentra permitido el uso de sustancias sintéticas con el único
objetivo de garantizar estabilidad física, química y/o microbiana. Por otro lado, es posible
clasificar los extractos, dependiendo del grado de conocimiento y variabilidad de sus
componentes:
Extractos caracterizados: Pueden ser reconocidos por medio de metodologías que
permitan su rápida identificación, por ejemplo, “huellas” por TLC.
10
Extractos normalizados: Se realiza cuantificación y se controla la variación de
marcadores (químicos o terapéuticos), entre lotes fabricados.
Extractos estandarizados: Implica una normalización en el contenido, tanto en los
metabolitos activos, como el control de las sustancias que no corresponden a metabolitos
activos. Además, implica una optimización y control de todo el proceso, desde la siembra
hasta la obtención del extracto. Como ejemplo se encuentran los productos
fitoterapéuticos a base de Ginkgo biloba, que es uno de los fitoterapéuticos mas usados
a nivel mundial [Hecker, H., et al., 2002]. El extracto estandarizado de Ginkgo biloba
EGb-761, tiene un contenido de glicósidos de ginkgoflavonas del 24%, un contenido de
lactonas terpénicas del 6%, y menos de 5ppm de ácido ginkgólico, dada la toxicidad que
puede suministrarle al producto [WHO Monographs, 2002].
La regulación REACH, que está a manos de la European Chemicals Agency (ECHA),
entró en vigor desde el año 2007 y tiene como principal objetivo que todos los productos
químicos usados como materia prima de diversas industrias a nivel europeo, tengan un
conocimiento total de estos, con el ánimo de garantizar la seguridad tanto en las
personas como en el medio ambiente. Los extractos naturales usados tanto en fitoterapia
como en cosmética son denominados Natural Complex Substances (NCS) dentro de esta
regulación, los cuales se encuentran en la categoría de Substances of Unknown or
Variable composition, Complex reaction products or Biological materials (UVCB). Estos, a
pesar de la variabilidad que puedan llegar a presentar en su composición, deben ser
registrados como sustancias homogéneas (para la comercialización dentro del mercado
Europeo), por lo cual deben tener una variabilidad controlada y un total conocimiento
sobre la seguridad de los principales constituyentes de los extractos usados como
materia prima [ECHA, 2013], lo que supone su normalización ó estandarización.
4.3. PREPARACIONES A BASE DE C. officinalis
Con el ánimo de soportar temas de seguridad y eficacia de las plantas utilizadas con
fines terapéuticos y sus extractos, es posible encontrar diversas monografías en donde
se encuentran resumidas estas características, las cuales pueden usarse como sustento
científico ante el ente regulatorio dentro del país (INVIMA), dado el bajo número de
ensayos clínicos aleatorizados que se realizan en el campo de la fitoterapia [Cañigueral,
S., 2002]. Entre éstas, resaltan las monografías de la Organización Mundial de la Salud
(OMS ó WHO por sus siglas e inglés), las monografías de la EMEA; las monografías de
la European Scientific Cooperative on Phytotherapy (ESCOP) y las monografías de la
comisión E.
En la monografía de la OMS se estipula que la droga de C. officinalis (flores), no posee
menos del 0.4% de flavonoides expresados como hiperósido, de acuerdo a la
11
metodología propuesta por la Farmacopea Europea, basada en espectrofotometría a 425
nm [European Pharmacopoeia, 2008]. La monografía de la EMEA establece que los
extractos alcohólicos 1:1 no deben igual tener menos de 0.4% de flavonoides y las
tinturas 1:5 no deben tener menos de 0.1% de flavonoides expresados ambos como
hiperósido, por medio de la metodología de la Farmacopea Europea [EMEA, 2008].
En cuanto a preparaciones a base de Calendula officinalis, la EMEA menciona cremas
que contienen el 10% del extracto 1:1 (extracción con etanol 40-50%), que han sido
comercializadas en el mercado Australiano por más de 30 años, y las cremas que
contienen 4% del mismo extracto en el mercado Alemán. Además, se mencionan los
ungüentos preparados a partir de extracción con grasas vegetales.
Aunque en las monografías mencionadas, no se encuentran consideradas estrictamente
formas farmacéuticas para uso oral, se encuentra en la literatura evidencia basada en
uso tradicional en problemas relacionados con estomatitis, piorrea, gastritis, úlceras,
hepatitis, así como otras enfermedades gastrointestinales [Valdés, H.L., et al., 1999;
Yoshikawa, M., et al., 2001; Kuttan, R.].
4.4. OPTIMIZACIÓN DE PROCESOS Y METODOLOGÍAS
La optimización de un proceso o metodología tiene lugar en el momento en que la (o las
respuestas) buscada con un experimento no corresponde al valor máximo o mínimo
esperado, debido a que ésta se ve afectada por uno o más factores. Aunque la búsqueda
de las condiciones que deriven en una respuesta óptima puede hacerse de manera
aleatoria, los diseños experimentales tienen como objetivo determinar estas condiciones
con un número reducido de experimentos. El modelo de superficie de respuesta es una
herramienta estadística que busca encontrar la ubicación del punto óptimo de
determinado proceso y el modelo de regresión que se ajusta al conjunto de datos.
[Pulido, H.G., et al., 2004].
Cuando se tienen 2 variables independientes (X1 y X2), en el análisis de una respuesta
(Y), la ecuación es descrita por un modelo de segundo (Ecuación 1).
Ecuación 1
El resultado es la obtención de un modelo matemático predictivo, el cual puede
representarse gráficamente como una superficie de respuesta o como curvas de nivel
(Figura 4) [Montgomery, D.C.; 2004].
12
Figura 4. Representación gráfica de un modelo de segundo orden con dos variables independientes: Superficie de respuesta y gráfico de contorno.
Una forma de obtener superficies de respuestas para optimización de determinados
factores son los diseños factoriales 3k, en donde se consideran todas las posibles
combinaciones de los niveles de los factores, por lo que el número de ensayos
necesarios es grande, sin incluir la determinación del error experimental, para lo cual se
deben hacer ensayos similares en el punto central.
Es por tanto, que surgen diseños opcionales que disminuyen el número de ensayos,
logrando el mismo tipo de resultado que los diseños factoriales. El diseño central
compuesto (DCC), es uno de los diseños más usados a nivel de laboratorio e industrial,
como herramienta para la optimización de procesos [Aslan, N., 2008; Liu, J.J., et al.,
2006; Ahmadi, M., et al., 2005; Gonçalves, C., et al., 2006]. Este diseño consta de un
diseño factorial 2n, con 2n combinaciones adicionales llamadas “puntos axiales”, sobre
los ejes de los factores codificados y “m” réplicas en el punto central del diseño. En la
tabla 2, se muestra una representación de los ensayos a realizar para un diseño central
compuesto con dos factores y en la figura 5 se representan estos ensayos gráficamente
[Kuehl, R.O., 2001; Montgomery, D.C., 2004].
Tabla 2. Ensayos requeridos para el Diseño Central Compuesto para dos factores.
Factor A B
Nivel codificado x1 x2
Factorial 22
-1 -1 +1 -1 -1 +1 +1 +1
Puntos axiales
-α 0
+α 0
0 -α
0 +α
Centro del diseño 0 0 0 0 0 0
13
Figura 5. Representación de los puntos para el Diseño Central Compuesto con dos
factores.
La rotabilidad es la característica de un diseño de tener una varianza constante en los
puntos equidistantes del punto central de éste, lo cual es de importancia cuando la
finalidad es encontrar el punto óptimo de la superficie, sin tener certeza de su
localización. Box y Hunter, propusieron el término de rotabilidad en estos diseños,
característica que se logra con la elección del valor de α, en los puntos axiales del
diseño, el cual depende del número de factores a evaluar. El valor de α se puede calcular
como α = (2k)1/4, donde “k” es el número de factores a evaluar. De esta manera, para un
diseño central compuesto con dos factores, el valor de α será (22)1/4= 1.414.
4.5. VALIDACIÓN DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS
La validación comprende una serie de procedimientos de laboratorio a realizar al finalizar
el desarrollo de una nueva metodología analítica, o bien, para asegurar que la eficiencia
de la metodología está asegurada para posteriores aplicaciones [USP 35, <1225>, 2012].
La norma ISO 17025 define la validación como la confirmación a través del examen y el
aporte de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso
específico previsto [NTC-ISO/IEC 17025, 2005]. Son diferentes los términos utilizados al
referirse a validación de metodologías analíticas, por lo que para octubre de 1994, The
International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use (ICH), publica la guías para la identificación de los
parámetros de validación necesarios para las diferentes metodologías analíticas. En
1996 se publican las guías ICH Q2B que incluyen los datos experimentales requeridos e
interpretación estadística de los resultados para la validación de metodologías analíticas.
En 2005, estas guías fueron integradas en las nuevas guías de la ICH Q2(R1) en las
cuales se resumen definiciones armonizadas, procesos para la validación y análisis de
resultados [ICH Q2(R1), 2005].
14
4.5.1. Selectividad o especificidad
De acuerdo a la guías de la ICH Q2(R1): “La selectividad o especificidad es la capacidad
de evaluar inequívocamente el analito en presencia de componentes que pudiesen estar
presentes, los cuales incluyen impurezas, productos de degradación, matriz, etc.” [ICH
Q2(R1), 2005].
En el caso de metodologías por HPLC, la especificidad se corrobora por la resolución del
analito con los interferentes, complementando la técnica con espectrometría de masas ó
con un sistema de Detección de Arreglo de Diodos (DAD), para comprobar la pureza del
pico del analito [A.E.F.I., 2001].
4.5.2. Linealidad
La linealidad debe ser comprobada dentro del rango de trabajo, de tal manera que se
asegure una proporcionalidad directa entre la concentración del analito en la muestra y la
respuesta del sistema. De esta manera, dentro del rango de linealidad es posible la
realización de interpolaciones para determinar la concentración de una muestra
problema.
Los arreglos matemáticos para la regresión entregarán información sobre el grado de
linealidad de los datos obtenidos. Las guías de la ICH recomiendan mínimo 5
concentraciones diferentes dentro del rango, las cuales deberían ser realizadas por
triplicado.
4.5.3. Precisión
La evaluación de la precisión de una metodología analítica es una medida de la
concordancia entre una serie de medidas obtenidas de una misma muestra a partir de
diferentes condiciones prescritas. De esta manera, se conoce la variabilidad de la
metodología relacionada con los errores aleatorios. La precisión se puede evaluar a 3
niveles diferentes:
Repetibilidad (instrumental y del método)
La finalidad es determinar la variabilidad de los resultados bajo las mismas condiciones
de operación, en un periodo corto de tiempo. Para esto, deben realizarse 6 mediciones
diferentes al 100% de la concentración del analito, a partir del estándar (instrumental o
del sistema), y deben realizarse mínimo 6 mediciones a partir de una muestra
homogénea (del método). Esta variabilidad se representa principalmente por el
coeficiente de variación.
15
Precisión intermedia
Su objetivo es la evaluación de la variabilidad de los resultados de una muestra
homogénea, bajo diferentes condiciones de operación (diferentes analistas, días,
equipos, etc.), en un mismo laboratorio. Este análisis no se realiza de manera individual,
si no de manera matricial, partiendo de una muestra homogénea trabajada por triplicado
para cada ensayo. El coeficiente de variación global es la medida de la precisión
intermedia de la metodología.
Reproducibilidad
La reproducibilidad evalúa la variación de los resultados en ensayos inter-laboratorio. En
este caso se tiene una muestra homogénea, analizada bajo diferentes condiciones de
operación, en diferentes condiciones ambientales, pero bajo la misma metodología
desarrollada.
4.5.4. Exactitud
La exactitud de un método se conoce como la aproximación del valor encontrado frente a
un valor aceptado como verdadero o de referencia. En este caso se espera determinar la
ausencia de error sistemático.
La exactitud se representa como porcentaje de recuperación a partir de una muestra
placebo cargado, el cual debe realizarse mínimo por triplicado para diferentes niveles de
concentración. La exactitud debe ser evaluada una vez se tenga certeza de la linealidad,
la precisión y especificidad del método.
4.5.5. Limites de detección y cuantificación
El límite de detección hace referencia a la mínima cantidad de analito en una muestra
que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada de una manera exacta.
Por su lado, el límite de cuantificación hace referencia a la mínima cantidad de analito en
una muestra que puede ser determinado y cuantificado con precisión y exactitud.
Hay diferentes formas de hallar el límite de detección y cuantificación de una metodología
para un analito específico.
Basado en evaluación visual
Basado en relación señal / ruido
Basado en la desviación estándar de la respuesta y la pendiente
Basado en la desviación estándar de un blanco
Basado en una curva de calibración a concentraciones bajas
16
4.6. INCERTIDUMBRE DE UNA MEDICIÓN
De acuerdo a la guía ISO 3534-1, se define la incertidumbre como “una estimación unida
al resultado de un ensayo que caracteriza el intervalo de valores dentro de los cuales se
afirma que está el valor verdadero” [ICONTEC, 1995]. Lo anterior toma las mediciones
como parte de un número infinito de valores dispersos alrededor del resultado que son
consistentes con todas las observaciones, en donde el rango depende del nivel de
probabilidad definido para ubicar el valor verdadero [Ávila, 2001].
La norma ISO 17025, presenta los requisitos necesarios para un laboratorio de ensayo
que desee demostrar un sistema de gestión de calidad, y que de acuerdo a ello, posee la
capacidad técnica para la generación de resultados válidos [ICONTEC 2005]. De acuerdo
a esta norma, se requiere que los laboratorios de ensayo que utilicen metodologías de
rutina determinen y entreguen el valor de la incertidumbre asociada a los resultados
obtenidos.
No hay una estrategia definitiva para el cálculo de la incertidumbre, por lo cual se han
propuesto diversas formas para la estimación de este parámetro. Estas estrategias se
pueden dividir en aquellas donde se hace partícipe el propio laboratorio interesado
(procedimiento intralaboratorio) y otras en donde la evaluación se realiza sobre la base
de estudios de colaboración (procedimiento interlaboratorio).
El procedimiento intralaboratorio puede llevarse a cabo mediante estrategias a saber:
Usando la propagación de la incertidumbre sobre la base de un modelo
matemático, es decir, una ecuación que da la relación cuantitativa entre la
cantidad medida y todas las cantidades de los que depende el resultado (método
Bottom up).
Usando los datos de validación de un método de laboratorio (método Top-down).
El procedimiento interlaboratorio incluye:
El uso de los datos de rendimiento del método (por ejemplo, según la norma
5725).
El uso de los datos a partir de pruebas de aptitud (PT).
4.6.1. Cálculo de la incertidumbre usando la información de
la validación del método (top-down).
Para el cálculo de la incertidumbre de los resultados obtenidos, Maroto presenta una
aproximación a partir de los datos de la validación del método, de tal forma que se
17
disminuye el trabajo adicional, pues se parte del hecho de que no tiene sentido el calculo
de la incertidumbre de un método que no ha sido validado [Maroto, A.; 2002].
Para ello, es necesario entender el resultado de una determinación como se expresa en
la ecuación 2.
Ecuación 2
Donde X, corresponde al valor medio de la medición, el cual se ve afectado por ε el cual
es el error aleatorio dentro de una misma serie, δserie es el sesgo de la serie (debido a las
condiciones en que se analiza la muestra: día, analista, etc), δpret es el sesgo debido a la
heterogeneidad de la muestra y a los tratamientos previos, δtraz es el sesgo del método
calculado durante la verificación de la trazabilidad de los resultados generados por el
método y δotros es el sesgo que no se considera en los términos anteriores.
Sin embargo, el sesgo de cada uno de los términos es desconocido, pero puede
obtenerse una estimación de la varianza asociadas a cada uno de los procesos que
contribuyen a la incertidumbre (Figura 6)
Figura 6. Componentes de incertidumbre basada en la información generada durante la
verificación de la trazabilidad.
Por lo tanto, la incertidumbre final de los resultados, U, se obtiene combinando los
términos de incertidumbre estándar, u, multiplicado por el factor de cobertura k, el cual
se selecciona de acuerdo al nivel de confianza con la cual se desea obtener el intervalo
(Ecuación 3 y 4).
Ecuación 3
√
Ecuación 4
18
La incertidumbre también puede expresarse en términos relativos, UR, (Ecuación 5), con
la cual se determina la incertidumbre absoluta dependiente de la concentración obtenida
del analito (Ecuación 6).
√
Ecuación 5
Ecuación 6
Esta última expresión considera que los términos de incertidumbre varían linealmente
con la concentración del analito en la muestra.
4.6.1.1. Incertidumbre del procedimiento (uproc)
En esta incertidumbre, se contempla la variabilidad experimental del resultado que es
debida tanto al error aleatorio como a las diversas condiciones en las que se realiza el
análisis (día, analista, etc.). El término se compone entonces por la varianza de la
repetibilidad del método y el efecto de las series.
Para su cálculo, se utiliza la desviación estándar intermedia del procedimiento (SI) y N, el
número de veces que se analizó la muestra en condiciones intermedias, el cual
generalmente es 1 (Ecuación 7).
√ Ecuación 7
4.6.1.2. Incertidumbre de verificación de la trazabilidad (utraz)
Cuando la trazabilidad se verifica utilizando un valor de referencia, la incertidumbre
asociada a la trazabilidad se calcula de acuerdo a la ecuación 8.
√
Ecuación 8
Donde u2ref, corresponde a la incertidumbre del valor de referencia asignado a un Material
de Referencia Certificado (MRC) y u2X método, es la incertidumbre del valor medio obtenido
con el método analítico.
Incertidumbre del valor de referencia
La incertidumbre del valor de referencia, debe obtenerse aplicando la ley de propagación
de errores a la expresión usada para calcular la cantidad de analito adicionada (Ecuación
19
9), donde “m”, corresponde a la cantidad de material de referencia pesado, “P”
corresponde a la potencia del material de referencia y “V” al volumen total en que fue
diluido el MRC.
Ecuación 9
Al aplicar la ley de propagación de errores a la anterior expresión, se tiene que la
incertidumbre del valor de referencia se expresa de acuerdo a la ecuación 10.
√(
) (
) (
) Ecuación 10
Incertidumbre del valor medio del método
Esta incertidumbre depende de como se ha analizado la muestra con el método analítico.
Ésta puede obtenerse analizando la muestra p veces en condiciones intermedias
(Ecuación 11).
√ Ecuación 11
SI corresponde a la desviación estándar en condiciones intermedias, la cual se calcula
como la desviación estándar de los p resultados obtenidos.
4.6.1.3. Incertidumbre de los pretratamientos (heterogeneidad)
Esta incertidumbre depende tanto de la heterogeneidad de la muestra, como de los
pretratamientos necesarios para llevar a cabo la evaluación. Para su cálculo, se requiere
el análisis de un número de porciones de una muestra homogenizada, en condiciones de
repetibilidad (mismo analista, mismo equipo en un periodo corto de tiempo). La
incertidumbre de los pretratamientos, upret, corresponde a la desviación estándar de los
resultados obtenidos (Ecuación 12)
Ecuación 12
4.6.1.4. Incertidumbre debida a otros términos
Estos términos están asociados con efectos de matriz, sobre la variabilidad de los
resultados y a otros factores no considerados en el análisis de la precisión intermedia. Es
posible hacer uso del análisis de la robustez para calcular la incertidumbre de los
términos no considerados.
20
5. MARCO LEGAL
5.1. NORMAS FARMACOLÓGICAS PARA PREPARACIONES A
BASE DE C. officinalis
Antes de la comercialización de un producto fitoterapéutico dentro del mercado
Colombiano, éste debe haber sido contemplado dentro de las Normas Farmacológicas
Colombianas, en donde el interesado expone ante la entidad regulatoria la información
que considere pertinente para demostrar que el producto final, tiene soporte de eficacia.
Posteriormente, un nuevo interesado puede sustentar la comercialización de su producto,
si este tipo de preparación se encuentra ya registrada en las normas farmacológicas.
Para el caso de la C. officinalis, en las normas farmacológicas de 2006, se tienen 17
preparaciones aprobadas que se muestran en la tabla 3, en donde se observa la gran
variedad y diferencias en equivalente de planta usada para el mismo fin terapéutico (de
aplicación tópica y de uso oral) [Normas Farmacológicas, 2006]. Además, se observa que
solo un producto hace referencia a un contenido de flavonoides (solución oral, Acta 27 de
2004).
Tabla 3. Preparaciones farmacéuticas tópicas y orales a base de C. officinalis aprobadas para comercialización en el territorio Colombiano.
21
5.2. NORMA ISO 17025
La norma ISO 17025 hace parte de la normatividad internacional en el campo de la
actividad técnica, llevada a cabo por la Organización Internacional de Normalización
(ISO), la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) y otras organizaciones
internacionales vinculadas a la ISO e IEC, que conforman el Comité de ISO para la
evaluación de la conformidad (CASCO). La norma ISO 17025 contiene los requisitos a
cumplir por los laboratorios de ensayo y de calibración para demostrar un sistema de
gestión, la competitividad técnica y la capacidad de generar resultados técnicamente
válidos. Esta normatividad cubre los ensayos y las calibraciones que se realizan
utilizando métodos normalizados, métodos no normalizados y métodos desarrollados por
el propio laboratorio. [NTC-ISO/IEC 17025, 2005].
La normatividad de esta manera cobija un amplio campo de temas, que implican el
acogimiento y cumplimiento de diferentes requerimientos, que se dividen en dos:
Requerimientos relativos a la gestión y requerimientos técnicos.
Dentro de los requerimientos relativos a la gestión se consignan diferentes temas
relacionados con la organización, sistema de gestión, control de documentos, servicio al
cliente, acciones correctivas y preventivas, auditorías internas entre otros.
En la subdivisión de requerimientos técnicos se tratan los temas o factores que de una u
otra forma determinan la exactitud y la confiabilidad de los ensayos. De acuerdo a esto,
los requerimientos de la normatividad se centran en:
Factores humanos
Instalaciones y condiciones ambientales
Métodos de ensayo y de calibración, y la validación de los métodos
Equipos
Trazabilidad de las mediciones
Muestreo
Manipulación de los ítems de ensayo y de calibración
Para la determinación de la incertidumbre de las mediciones, la norma ISO 17025 no es
estricta sobre el procedimiento para su evaluación, pero especifica que se debe tratar de
identificar todos los componentes de la incertidumbre y hacer una estimación razonable
de ésta, siendo posible su determinación por medio de los datos de validación del
método para su evaluación [NTC-ISO/IEC 17025, 2005].
22
6. METODOLOGIA
6.1. MATERIALES
Columna cromatográfica SiliaChrom C18 (150 x 4.6mm); 5μm.
Guardacolumna SiliaChrom C18 (4.6x10mm); 5μm.
Material volumétrico (Balones aforados tipo A, pipetas aforadas y graduadas tipo
A, probetas, erlenmeyers, beakers, viales con agrafe).
Jeringas desechables
Filtros 0.45 μm para muestras (HPLC)
Filtros de 0.45 μm para solventes, Millipore ®.
Soporte universal
Pinzas
6.2. EQUIPOS
Cromatógrafo MERCK-HITACHI-VWR. ELITE serie 19E20-023. Bomba L-2130,
serial 19E20-023. Desgasificador, serial 1840-046. Automuestreador L2200, serial
19E43-058. Detector UV L2400, serial 19E37-037. Organizador L-2000, serial
19E335-045. Termostato L2300, serial 19E50-049.
Cromatógrafo Agilent 1200. Desgasificador, serie JP62357603; modelo: G1322A.
Bomba, serie DE92659955; modelo G1311A. Automuestreador, serie
DEABE00746; modelo: G1329B. Termostato, serie DE63061888; modelo:
G1316A. Detector DAD, serie DE63057980; modelo: G1315B. Interfase, serie:
DE60556476; modelo: G1328B).
Balanza analítica METTLER TOLEDO AB204. Min 10 mg d=0.1mg.
pH-metro BECKMAN ϕ50 pH Meter
Ultrasonido Elma ® E 60 H, Elmasonic.
Equipo purificación de agua Merck., ULTRAPURE (TYPE 1) WATER Simplicity®
UV.
Equipo de filtración Millipore
Destilador de agua, GFL® 2008.
Termostato Julabo KASAI SW22- ± 0.1° C.
23
6.3. REACTIVOS
Metanol grado HPLC (MeOH) (Honeywell)
Ácido fosfórico (H3PO4) al 85% (Panreac)
Estándar de Quercetina Dihidratada USP
HCl 36% (Merck)
Eter etílico (Honeywell)
6.4. DESARROLLO DEL SISTEMA CROMATOGRÁFICO Y LA
METODOLOGÍA DE HIDRÓLISIS
6.4.1. Preparación de la fase móvil
Fase acuosa (1L H3PO4 0.08% (p/v) en agua)
Medir 0.6 mL de ácido fosfórico 85% (p/p) en un beaker de 1 L y diluir con 500 mL de
agua purificada (HPLC) y llevar a un balón de 1 L. Desgasificar con ultrasonido y
transvasar la solución a un reservorio. Rotular como H3PO4 0.08% en H2O.
Fase orgánica
Filtrar 1 L de MeOH grado HPLC a través de membrana de 0.45 µm y desgasificar con
ultrasonido por 30 minutos.
6.4.2. Preparación de soluciones
6.4.2.1. Soluciones estándar de quercetina
Solución de quercetina estándar 450 μg/mL
Pesar 12.6 mg de estándar de quercetina USP dihidratado y llevar a un beaker de 20 mL.
Disolver en 10mL de MeOH con ayuda de ultrasonido y llevar a un balón de 25mL con
MeOH. Homogenizar y rotular como quercetina 450 μg/mL.
Solución quercetina estándar 225 μg/mL
Tomar una alícuota de 5 mL de la solución de quercetina 450 μg/mL y llevar a 10 mL con
MeOH en balón aforado. Rotular la solución como quercetina 225μg/mL.
Solución quercetina estándar 90 μg/mL
Tomar 2 mL de la solución de quercetina estándar de 450 μg/mL, y llevar a 10 mL con
MeOH:H2O (80:20) en balón aforado. Rotular como quercetina 90 μg/mL, la cual es
solución madre para los ensayos de selectividad.
24
Solución madre de quercetina estándar 9 μg/mL
De la solución de quercetina de 225 μg/mL tomar una alícuota de 1 mL y llevar a 25 mL
en balón aforado con MeOH:H2O (80:20). Rotular la solución como quercetina 9 μg/mL,
la cual es la solución madre de los puntos de la curva para la linealidad del sistema.
Solución quercetina estándar 0.9 μg/mL
Tomar 1.0 mL de la solución madre de quercetina 9.0 μg/mL y llevar a 10 mL en balón
aforado con MeOH:H2O (80:20). Homogenizar y filtrar por membrana de 0.45 µm antes
de inyectar.
Solución quercetina estándar 1.8 μg/mL
Tomar 2.0 mL de la solución madre de quercetina 9.0 μg/mL y llevar a 10 mL en balón
aforado con MeOH:H2O (80:20). Homogenizar y filtrar por membrana de 0.45 µm antes
de inyectar.
Solución quercetina estándar 2.7 μg/mL
Tomar 3.0 mL de la solución madre de quercetina 9.0 μg/mL y llevar a 10 mL en balón
aforado con MeOH:H2O (80:20). Homogenizar y filtrar por membrana de 0.45 µm antes
de inyectar.
Solución quercetina estándar 3.6 μg/mL
Tomar 4.0 mL de la solución madre de quercetina 9.0 μg/mL y llevar a 10 mL en balón
aforado con MeOH:H2O (80:20). Homogenizar y filtrar por membrana de 0.45 µm antes
de inyectar.
Solución quercetina estándar 4.5 μg/mL
Tomar 5.0 mL de la solución madre de quercetina 9.0 μg/mL y llevar a 10 mL en balón
aforado con MeOH:H2O (80:20). Homogenizar y filtrar por membrana de 0.45 µm antes
de inyectar.
6.4.2.2. Soluciones empleadas durante la metodología
Ácido clorhídrico 6.5 N
Tomar 13 mL de HCl 36% y diluir hasta 20 mL de agua destilada.
Ácido clorhídrico 5.0 N
Tomar 10 mL de HCl 36% y diluir hasta 20 mL de agua destilada.
Ácido clorhídrico 4.0 N
Tomar 8 mL de HCl 36% y diluir hasta 20 mL de agua destilada.
Ácido clorhídrico 3.5 N
Tomar 7 mL de HCl 36% y diluir hasta 20 mL de agua destilada.
25
Ácido clorhídrico 3.0 N
Tomar 6 mL de HCl 36% y diluir hasta 20 mL de agua destilada.
Ácido clorhídrico 2.5 N
Tomar 5 mL de HCl 36% y diluir en 20 mL de agua destilada.
Ácido clorhídrico 1.0 N
Tomar 2 mL de HCl 36% y diluir en 20 mL con agua destilada.
Ácido clorhídrico 0.1N
Tomar 1 mL de HCl 1.0 N y llevar a volumen de 10 mL con agua destilada.
Ácido clorhídrico 0.01 N
Tomar 1 mL de HCl 0.1 N y llevar a volumen de 10 mL con agua destilada.
Hidróxido de sodio 1.0 N
Pesar 0.4 g de NaOH y disolver en 5 mL de agua destilada. Completar a 10 mL con agua
destilada.
Hidróxido de sodio 0.1N
Tomar 1 mL de NaOH 1.0 N y llevar a volumen de 10 mL con agua destilada.
Hidróxido de sodio 0.01 N
Tomar 1 mL de NaOH 0.1 N y llevar a volumen de 10 mL con agua destilada.
Peróxido de hidrógeno (H2O2) 3.0%
Tomar 1 mL de peróxido de hidrógeno 30% y llevar a 10 mL con agua destilada.
6.5. OPTIMIZACIÓN DE HIDRÓLISIS DE FLAVONOIDES
GLICÓSIDOS
Para la optimización del proceso de hidrólisis de flavonoides glicósidos, se realizaron tres
diseños experimentales basados en el esquema del diseño central compuesto (DCC),
con dos variables (tiempo y concentración de HCl), para las matrices trabajadas (Extracto
glicólico, extracto hidroalcohólico y soluciones orales). La temperatura óptima se confirmó
por comparación directa del proceso optimizado, a 70°C y a 90°C.
6.5.1. DCC para soluciones orales
En la tabla 4 se muestran los ensayos a realizar con los valores originales y codificados
para la concentración de HCl y tiempo. La tabla 5 muestra las condiciones que se
mantuvieron fijas durante el desarrollo del DCC, con el fin de optimizar el proceso de
26
hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de soluciones orales. En la figura 7, 8 y 9 se
muestra el procedimiento realizado para cada uno de los ensayos.
Tabla 4. Parámetros evaluados en los ensayos del DCC para la optimización de la hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de solución oral.
Factores originales Factores codificados
Tratamiento [HCl] (M) Tiempo (horas) [HCl] Tiempo
1 3.5 1.5 -1 -1
2 6.5 1.5 1 -1
3 3.5 2.5 -1 1
4 6.5 2.5 1 1
5 5 1.29 0 -√2
6 5 2.71 0 √2
7 2.88 2 -√2 0
8 7.12 2 √2 0
10 5 2 0 0
11 5 2 0 0
12 5 2 0 0
13 5 2 0 0
Tabla 5. Condiciones fijas para la optimización de la hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de soluciones orales.
CONDICIÓN VALOR
Temperatura 80°C
Volumen de muestra 3 mL
Volumen de agua 3 mL
Volumen de HCL 3 mL
Extracción éter etílico 2 veces, 10mL c/u
Volumen final luego de extracción 5mL
Figura 7. Esquema para la hidrólisis partir de muestras de solución oral para la realización del DCC.
27
6.5.2. DCC para extractos glicólicos
Tabla 6. Parámetros evaluados en los ensayos del DCC para la optimización de la hidrólisis a partir de extractos glicólicos
Factores originales Factores codificados
Tratamiento [HCl] (M) Tiempo (horas) [HCl] Tiempo
1 1.0 1.5 -1 -1 2 2.0 1.5 1 -1 3 1.0 2.5 -1 1 4 2.0 2.5 1 1
5 1.5 1.28 0 -√2 6 1.5 2.7 0 √2 7 0.79 2 -√2 0 8 2.21 2 √2 0
10 1.5 2 0 0 11 1.5 2 0 0 12 1.5 2 0 0 13 1.5 2 0 0
Tabla 7. Condiciones fijas para la optimización de la hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de extractos glicólicos.
CONDICIÓN VALOR
Temperatura 80°C
Volumen de muestra 1mL
Volumen de agua 3mL
Volumen de HCL 3mL
Extracción éter etílico 2 veces, 10mL c/u
Volumen final luego de extracción 10mL
Figura 8. Esquema para la hidrólisis partir de muestras de extracto glicólico para la realización del DCC
28
6.5.3. DCC para extractos hidroalcohólicos
Tabla 8. Parámetros evaluados en los ensayos del DCC para la optimización de la hidrólisis a partir de extracto hidroalcohólico
Factores originales Factores codificados
Tratamiento [HCl] (M) Tiempo (horas) [HCl] Tiempo
1 2 1 -1 -1 2 5.0 1 1 -1 3 2.0 3 -1 1
4 5.0 3 1 1
5 3.5 0.59 0 -√2
6 3.5 3.41 0 √2
7 1.38 2 -√2 0
8 5.62 2 √2 0
10 3.5 2 0 0
11 3.5 2 0 0
12 3.5 2 0 0
13 3.5 2 0 0
Tabla 9. Condiciones fijas para la optimización de la hidrólisis de flavonoides glicósidos en extractos hidroalcohólicos por DCC
CONDICIÓN VALOR
Temperatura 80°C
Volumen de muestra 2mL
Volumen de agua 2mL
Volumen de HCL 2mL
Extracción éter etílico 2 veces, 10mL c/u
Volumen final luego de extracción 10mL
Figura 9. Esquema para la hidrólisis partir de muestras de extracto hidroalcohólico para
la realización del DCC.
29
6.6. VALIDACION DE LA METODOLOGIA
6.6.1. Idoneidad del sistema
La metodología se valido en el Laboratorio de Análisis Farmacéutico de la Universidad
Nacional de Colombia (LAFUN), en el cromatógrafo MERCK-HITACHI ELITE. La
idoneidad del sistema se corroboró de acuerdo a criterios de repetibilidad, factor de
capacidad, platos teóricos y asimetría. Se realizaron 6 inyecciones de la solución
correspondiente al punto medio de la curva de calibración para la linealidad del sistema
(quercetina estándar 2.7μg/mL). El criterio de evaluación fue el coeficiente de variación
del conjunto de medidas y los valores aceptados por la USP 35.
6.6.2. Selectividad.
6.6.2.1. Degradación de quercetina estándar
Se realizó la degradación forzada de una solución estándar de quercetina, con el fin de
observar la estabilidad de la quercetina frente a diferentes condiciones (Figura 10). Se
realizó en el cromatógrafo Agilent 1200, con detector de arreglo de diodos (DAD).
Se realizaron los siguientes ensayos:
Control (9 μg/mL): Se tomó 1 mL de solución 90 μg/mL de quercetina disuelta en
MeOH:H2O (80:20) hasta 10 mL.
Hidrólisis ácida (HCl 0.1 N): Se tomó 1 mL de solución 90 μg/mL y 1 mL de HCl 0.1 N a
80°C por 40 minutos y se llevó a 10 mL con MeOH:H2O (80:20).
Hidrólisis básica (0.1 N): Se tomó 1 mL de solución 90 μg/mL y 1 mL de NaOH 0.1 N, por
5 minutos a temperatura ambiente. Se neutralizó con HCl 0.1 N y se llevó a 10 mL con
MeOH:H2O (80:20).
Hidrólisis básica (0.01 N): Se tomó 1 mL de solución 90 μg/mL y 1 mL de NaOH 0.01 N,
por 5 minutos a temperatura ambiente. Se neutralizó con HCl 0.01 N y se llevó a 10 mL
con MeOH:H2O (80:20).
Oxidación con peróxido de hidrógeno 3%: Se tomó 1 mL de solución 90 μg/mL y 1 mL
de H2O2 3% por 1 hora a temperatura ambiente. Se llevó a volumen de 10 mL con
MeOH:H2O (80:20).
Degradación UV 254 nm: Se tomó 1 mL de la solución madre de 90 μg/mL y se llevó a
balón aforado de 10 mL, con MeOH:H2O (80:20). El contenido se trasvasó a celda de
cuarzo y se dejó bajo radiación UV 254 nm por 1 hora.
30
Degradación UV 366 nm: Se tomó 1 mL de la solución madre de 90 μg/mL y se llevó a
balón aforado de 10 mL, con MeOH:H2O (80:20). El contenido se trasvasó a celda de
cuarzo y se dejó bajo radiación UV 366 nm por 1 hora.
Figura 10. Esquema de selectividad frente a productos de degradación de quercetina
6.6.2.2. Degradación del extracto hidrolizado
Dado que la metodología implica la hidrólisis ácida de los flavonoides glicósidos para la
formación de la quercetina (obtención de agliconas), se realizó primero la hidrólisis de un
extracto glicólico y posteriormente, este extracto hidrolizado se sometió a diferentes
condiciones de degradación (Figura 11).
Preparación extracto hidrolizado stock: Se tomaron 3 g del extracto glicólico con 3 mL de
agua destilada y 3 mL de HCl 1.0 N a 80°C por 2 horas. Se realizó la extracción con 10
mL de eter etílico, 2 veces. El éter etílico se evaporó y el resultado se llevó a volumen de
10 mL con MeOH:H2O (80:20). Esta es la “solución de extracto hidrolizado stock”. A partir
de esta solución se prepararon los diferentes ensayos de degradación forzada.
Extracto hidrolizado control: Se tomó 1 mL de la “solución de extracto hidrolizado stock” y
se llevó a volumen de 5 mL con MeOH:H2O (80:20).
Hidrólisis ácida (HCl 0.1 N): Se tomó 1 mL de la “solución de extracto hidrolizado stock” y
se adicionó 1 mL de HCl 0.1 N dejandose reaccionar por 40 minutos a 80°C al baño
maría. Al finalizar, se llevó a volumen de 5 mL con MeOH:H2O (80:20).
Hidrólisis básica (NaOH 0.1 N): Se tomó 1 mL de la “solución de extracto hidrolizado
stock” y se adicionó 1 mL de NaOH 0.1 N, dejándose reaccionar por 5 minutos a
temperatura ambiente. Se neutralizó con HCl 0.1 N y se llevó a 5 mL con MeOH:H2O
(80:20).
Hidrólisis básica (NaOH 0.01 N): Se tomó 1 mL de la “solución de extracto hidrolizado
stock” y se adicionó 1 mL de NaOH 0.01 N dejándose reaccionar por 5 minutos a
31
temperatura ambiente. Se neutralizó con HCl 0.01 N y se llevó a 5 mL con MeOH:H2O
(80:20).
Oxidación con peróxido de hidrógeno: Se tomó 1mL de la “solución de extracto
hidrolizado stock”, y 1mL de H2O2 3% por 1 hora a temperatura ambiente. Se llevó a
volumen de 5mL con MeOH:H2O (80:20).
Degradación UV 254 nm: Se tomó 1 mL de la “solución de extracto hidrolizado stock” y
se llevó a balón aforado de 5 mL, con MeOH:H2O (80:20). El contenido se trasvasó a una
celda de cuarzo y se dejó bajo radiación UV 254 nm por 1 hora.
Degradación UV 366 nm: Se tomó 1mL de la “solución de extracto hidrolizado stock” y se
llevó a balón aforado de 5 mL, con MeOH:H2O (80:20). El contenido se trasvasó a celda
de cuarzo y se dejó bajo radiación UV 366 nm por 1 hora.
Figura 11. Esquema de selectividad frente a productos de degradación en el extracto de C. officinalis.
6.6.2.3. Selectividad frente a excipientes
Para la evaluación de la selectividad frente a excipientes, estos se analizaron en mezcla
e individualmente a concentraciones usualmente trabajadas en formulación. Por último,
se realizó la evaluación de los posibles excipientes junto con el extracto de Calendula
officinalis, los cuales fueron tratados con hidrólisis ácida para la formación de quercetina
para posterior evaluación de la selectividad.
Solución de extracto hidrolizado stock
Extracto glicólico
Hidrólisis ácida
Extracción con eter y evaporación
32
6.6.3. Linealidad, límite de detección y cuantificación
6.6.3.1. Linealidad del sistema
La linealidad del sistema se evaluó con soluciones de quercetina estándar de 0.9, 1.8,
2.7, 3.6 y 4.5 μg/mL con tres réplicas (Figura 12).
Figura 12. Esquema de las soluciones utilizadas en la evaluación de la linealidad del sistema.
6.6.3.2. Linealidad del método
Dado que la metodología propuesta será utilizada en diversos productos, se realizó la
evaluación de la linealidad del método para las matrices a trabajar, por medio del método
de adición de estándar. Para ello, se enriqueció con quercetina por separado una
muestra de extracto glicólico, extracto hidroalcohólico y una mezcla de excipientes de
una solución oral. El esquema se muestra en la figura 13, en donde se utiliza una
cantidad de matriz (M) de acuerdo a la metodología (soluciones orales 3 mL; extracto
hidroalcohólico 2 mL y extracto glicólico 1 mL) para enriquecer con una solución de
quercetina estándar. El preparado es extraído con éter etílico, evaporado y llevado a
volumen, tal como especifica el método propuesto. Para la evaluación del blanco, se
realizó la extracción de la misma cantidad de matriz, sin enriquecimiento previo.
33
Figura 13. Esquema de las soluciones utilizadas en la evaluación de la linealidad del método para extractos glicólicos, hidroalcohólicos, soluciones orales y cremas (M=matriz;
X= blanco).
6.6.3.3. Límites de detección y cuantificación
Se realizó la determinación de los limites de detección y cuantificación de quercetina en
las matrices trabajadas por medio de la extrapolación de la curva de calibración a bajas
concentraciones (0.9, 1.8 y 2.7 μg/mL) [A.E.F.I., 2001].
Para el cálculo del límite de y límite de cuantificación, se utilizan las ecuaciones 13 y 14
respectivamente:
√ Ecuación 13
√ Ecuación 14
Donde Ybl corresponde a la señal media del blanco, el cual en este caso se toma como el
valor del intercepto de la ecuación de la recta a bajas concentraciones; Sbl corresponde a
la desviación estándar de la señal proporcionada por el blanco, la cual se toma como el
intercepto de la recta “Desv. Estándar vs Concentración de quercetina”, “b” corresponde
al valor de la pendiente de la curva a bajas concentraciones y “n” es el número de
concentraciones utilizadas para elaborar la curva.
34
6.6.4. Precisión
6.6.4.1. Repetibilidad del sistema y método.
La repetibilidad del sistema se evaluó realizando 6 determinaciones de la solución
correspondiente al punto central de la curva de calibración (2.7 μg/mL), evaluando el
coeficiente de variación en el área correspondiente al pico de quercetina. La repetibilidad
del método se realizó de igual forma, para el punto central de la linealidad del método
(2.7 μg/mL de quercetina) para soluciones orales, extractos glicólicos e hidroalcohólicos
(muestras enriquecidas con quercetina estándar).
6.6.4.2. Precisión intermedia
La precisión intermedia fue evaluada para la metodología de hidrólisis a partir de cada
matriz trabajada, las cuales fueron analizadas por 2 analistas y en dos días diferentes
cada vez por triplicado, partiendo de muestras independientes. El tratamiento de la
muestra para soluciones orales, extractos glicólicos e hidroalcohólicos, y las condiciones
óptimas de hidrólisis corresponden a las obtenidas en las secciones 7.2.1, 7.2.2 y 7.2.3
respectivamente (figura 14).
Figura 14. Tratamiento y condiciones de hidrólisis para la evaluación de la precisión
intermedia del método para (A) soluciones orales; (B) extractos glicólicos; (C) extractos hidroalcohólicos.
35
6.6.5. Exactitud
La determinación de la exactitud se realizó por medio del método de adición de estándar,
para tres niveles de concentración (0.9, 2.7 y 4.5 μg/mL), partiendo de soluciones orales,
extractos glicólicos e hidroalcohólicos.
6.7. DETERMINACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE
La determinación de la incertidumbre se realizó por medio del modelo “Top-Down”
(sección 4.6.1) propuesto por Maroto [Maroto, 2002], en el cual se hace uso de los
parámetros de validación. Dado que se realizó la validación del método para extractos
glicólicos, hidroalcohólicos y soluciones orales a base de C. officinalis, se obtuvo un valor
de incertidumbre asociado a la medición para cada una de las matrices trabajadas.
6.8. CUANTIFICACIÓN DE QUERCETINA TOTAL EN
PRODUCTOS DEL MERCADO
La metodología desarrollada y validada, junto con el proceso de hidrólisis optimizado
para cada uno de las matrices, fueron utilizados para la evaluación del contenido de
quercetina total en algunos productos del mercado. Debido al limitado acceso tanto a la
materia prima (Extractos glicólicos e hidroalcohólicos 1:1) y a que en el mercado se
comercializa principalmente una marca para soluciones orales a base de plantas C.
officinalis, el número de muestras analizadas es bajo.
Para el caso de materia prima cuyo acceso es restringido para las personas no
vinculadas a la industria de fitoterapéuticos, se contó con la colaboración de un
laboratorio proveedor de extractos naturales para la industria cosmética y
fitofarmacéutica.
Se realizó la cuantificación de una muestra de extracto glicólico (1:1) de un lote
determinado (EG-L1) y de dos muestras de extracto hidroalcohólico (1:1) de lotes
diferentes (HA-L1 y HA-L2) como se codifica en la tabla 10. Las muestras fueron
entregadas con el certificado de calidad de cada una, el cual consta de pruebas
fisicoquímicas (solubilidad en agua y etanol, densidad, pH, índice de refracción, solidos
totales) y microbiológicas (mesófilos aerobios, mohos y levaduras, E. coli y coliformes
totales). Para la evaluación del contenido de quercetina total, se utilizó la metodología
óptima de hidrólisis para extractos glicólicos e hidroalcohólicos (secciones 7.2.2 y 7.2.3
respectivamente) y llevando a un volumen final tal que la concentración de quercetina
estuviese dentro de los límites de la curva de calibración (0.9 - 4.5 μg/mL).
36
Tabla 10. Codificación de los extractos glicólicos e hidroalcohólicos a base de C. officinalis (materia prima) analizados.
EXTRACTO GLICÓLICO
EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO
EG-L1 HA-L1 HA-L2
Para los productos del mercado, se realizó la cuantificación de 3 soluciones orales
elaboradas por los laboratorios A, B y C (SO-A, SO-B-L1, SO-C-L1) que de acuerdo con
la etiqueta contenían extracto fluido (1:1) de C. officinalis (16 ml, 20 g y 20 g por 100 ml
de producto respectivamente) (Tabla 11). Para la solución oral elaborada por el
laboratorio A, se realizó una comparación entre tres lotes diferentes (SO-A-L1, SO-A-L2 y
SO-A-L3). La metodología de hidrólisis se realizó de acuerdo a las condiciones óptimas
para la matriz de soluciones orales (sección 7.2.1).
Por otro lado, en el mercado se encontraron “soluciones orales concentradas” con
dosificador de gotas, las cuales de acuerdo a la etiqueta corresponde a extracto de C.
officinalis 1:5 (también escrito 0.2:1) en una matriz hidroalcohólica. Se realizó la
cuantificación de tres productos diferentes elaborados por los laboratorios A, D y E
(SOconc-A-L1, SOconc-D-L1, SOconc-E-L1) (Tabla 11). La metodología de hidrólisis utilizada
para estos productos corresponde a la usada para extractos hidroalcohólicos, debido a la
naturaleza de su matriz (Sección 7.2.3). Para cada producto, marca y/o lote la
determinación se realizó por duplicado partiendo de muestras independientes.
Es de anotar que todos los productos analizados contaban con su registro sanitario ante
la autoridad competente.
Tabla 11. Codificación de las muestras de soluciones orales a base de C. officinalis analizadas.
SOLUCIONES ORALES
EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO 0.2:1 (SOLUCIÓN ORAL EN GOTAS)
SO-A SO-B-L1 SO-C-L1 SOconc -A-L1 SOconc -D-L1 SOconc -E-L1
SO-A-L1 SO-A-L2 SO-A-L3
37
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. DESARROLLO DE LA METODOLOGIA
7.1.1. Desarrollo del sistema cromatográfico
El desarrollo del sistema cromatográfico se basó en datos colectados de la literatura
[Olszewska, M., 2007; D’Mello, P.M., et al., 2011, Rajalakshmi, P.V., et al., 2009;
Menghinello, P., et al., 1999; USP 35, 2012], en los cuales se propone un sistema
constituido por una fase orgánica (metanol, acetonitrilo o mezcla de ambos) y una fase
acuosa acidificada con ácido trifluoroacético (TFA) ó ácido fosfórico (H3PO4).
Para la evaluación de los sistemas cromatográficos propuestos, se trabajó con el extracto
glicólico de Calendula Officinalis hidrolizado con HCl 1.0 N a 80°C. Los parámetros a
evaluar fueron pureza de pico (DAD), simetría, resolución y tiempo de retención. La
identificación del pico correspondiente a quercetina se realizó por comparación con
solución estándar de quercetina USP.
En principio se trabajó de manera isocrática utilizando MeOH como fase orgánica y ácido
fosfórico en la fase acuosa (0.3% p/v), con un sistema de detección con arreglo de
diodos a 257, 350 y 370 nm, siendo este último el de mejores resultados. Por ejemplo, al
comparar eluciones isocráticas con un porcentaje de fase orgánica de 40 y 50% de
MeOH las cuales se muestran en el Anexo 1, se observó que la pureza de pico
correspondiente a la quercetina varía, debido al cambio en el tiempo de retención de
esta, sin alcanzar un valor satisfactorio (Ver tabla 12).
Tabla 12. Parámetros cromatográficos obtenidos al realizar elución de extracto glicólico de C. officinalis hidrolizado en condiciones isocráticas.
%MeOH tR
(min) Pureza pico
(%) Simetría
50% 5.6 94.4 1.17 40% 8.6 95.3 1.02
Por lo anterior, se realizaron ensayos de elución en gradiente como se muestra en la
figura 15, a partir del cual se optimizaron los valores de %B1, %B2, t1 y t2.
38
Figura 15. Esquema inicial del gradiente propuesto para elución de quercetina en extracto hidrolizado de C. officinalis
Durante el desarrollo del sistema en gradiente, se observó que la concentración de
H3PO4 en la fase acuosa tenía efecto tanto en la pureza de pico de la quercetina, como
en la simetría del mismo (Tabla 13). Lo anterior, supone la presencia de algunos
compuestos presentes en la matriz, los cuales se encuentran en menor proporción, y que
pueden no presentar absorción a una longitud de onda de 370 nm, pero si a una longitud
de onda diferente. En cuanto al efecto en la simetría, se debe a que el pH de la fase
móvil afecta a compuestos ionizables; en este caso la quercetina se comporta como
ácido débil debido a su naturaleza fenólica [Tungjai, M., et al, 2008].
Tabla 13. Parámetros cromatográficos obtenidos al realizar elución de extracto glicólico de C. officinalis hidrolizado diferente concentración de H3PO4 en la fase acuosa.
%H3PO4 tR
(min) Pureza pico
(%) Simetría
0.1% 5.32 91.6 1.15
0.2% 5.54 97.1 1.28
Las condiciones que exhibían los mejores parámetros de simetría y pureza de pico
consistían en una fase acuosa compuesta por H3PO4 0.08%, comenzando la elución en
gradiente con 35% de MeOH (%B1), el cual se mantenía por 1.5 minutos (t1), para
aumentar hasta un 50% de MeOH (%B2) a los 4.0 minutos (t2) y luego de la elución del
pico de interés, recobrar las condiciones iniciales (%B1).
Luego de tener las condiciones del gradiente optimizadas, se pasó a la optimización de
los parámetros cromatográficos como flujo, temperatura y volumen de inyección, los
cuales fueron evaluados a distintos niveles para la obtención del sistema cromatográfico
de óptima elución para la quercetina.
El volumen de inyección se selecciona como 20μL, ya que volúmenes superiores saturan
la columna, llevando a la disminución de la simetría del pico. El flujo óptimo fue de 1.0
39
mL/min, pues valores superiores aunque disminuían el tiempo de retención, también
decrecían la pureza de pico por posible interferencia con picos cercanos que absorben
en otras longitudes de onda. De igual forma, este pico interferente se evidencia al
momento de comparar el efecto de la temperatura sobre la elución de la quercetina a
partir de extracto glicólico de Calendula officinalis hidrolizado (Anexo 2.C). La
temperatura de elución se evaluó a 25, 30 y 35°C, obteniéndose una mejoría en los
parámetros mencionados a 35°C (Tabla 14).
Tabla 14. Parámetros cromatográficos obtenidos al realizar elución de extracto glicólico de C. officinalis hidrolizado, a diferentes temperaturas de horno.
Temperatura (°C)
tR (min)
Pureza pico (%)
Simetría
25.0 8.31 53.7 0.927 30.0 7.89 57.9 0.960 35.0 7.66 92.4 0.953
Por último, para completar el sistema en gradiente, fue necesario complementar el
sistema de gradiente inicial, pues dado que se trabajó con extractos vegetales, puede
haber compuestos que se queden retenidos en la fase estacionaria. Por ello, se diseñó
una segunda etapa que consta de lavado con MeOH (100%), para asegurar que no se
presentarán interferencias en futuras eluciones. A partir del momento de elución de
quercetina y de las otras dos agliconas (kaempferol e isorhamnetina), se aumentó la
concentración de metanol al 100%, y se observó el cromatograma por un tiempo de 45
minutos (Anexo 3). De acuerdo a este cromatograma, luego de 20 minutos, no se
detectan más señales, por lo que el sistema puede comenzar a recobrar las condiciones
iniciales, siendo necesario que el tiempo se extienda hasta los 30 minutos para su
completa estabilización (Figura 16). Durante el tiempo de lavado (MeOH 100%), se
aumenta el flujo a 1.2 mL/min para disminuir el tiempo total de la corrida.
Figura 16. Esquema final del gradiente propuesto para la óptima elución de quercetina.
40
Tabla 15. Sistema cromatográfico óptimo para la elución de quercetina en extractos y productos comerciales de Calendula officinalis.
Parámetro Valor
Solventes de fase móvil
A= H3PO4 0.08% en H2O
B= MeOH
Columna C-18
5μm (4.6x150mm)
Guardacolumna C18
5μm, (4.6x10mm).
Temperatura 35
Volumen de inyección (μL)
20
λopt (nm) 370
Tabla 16. Gradiente utilizado para la óptima elución de quercetina en extractos de C. officinalis (A= H3PO4 0.08%; B= MeOH)
Tiempo %A %B Flujo
(mL/min)
0 65 35 1.0
1.5 65 35 1.0
4.0 50 50 1.0
12.0 50 50 1.0
13.0 0 100 1.2
20.0 0 100 1.2
21.0 65 35 1.0
30.0 65 35 1.0
La pureza de pico para la quercetina luego de hidrolizar el extracto glicólico usado para el
desarrollo del método cromatográfico fue de 99.9%, usando un detector DAD, en donde
el espectro UV arrojado para este pico, corresponde con el reportado en la literatura para
la quercetina (figura 17).
Figura 17. Espectro UV correspondiente al pico de la quercetina obtenido con el detector de arreglo de diodos (DAD), para el extracto glicólico hidrolizado.
41
7.1.2. Desarrollo de la metodología para la hidrólisis de
flavonoides glicósidos
En la literatura se reportan diversos métodos para la hidrólisis de los flavonoides
glicósidos a partir de diferente material vegetal, a través de calentamiento convencional
[Nuutila, A.M., et al., 2002; Liu, H.P., et al., 2011; Menghinello, P., et al. 1999;
Rajalakshmi, P.V., et al., 2009; Olszewska, M., 2007; Wang, F.M., et al., 2003] y algunos
con asistencia de microondas [Huang, J., et al. 2004; Chen, J.X., et al., 2008]. En el caso
del calentamiento convencional, la temperatura usada para la generación de las
respectivas agliconas de cada material vegetal es de 80°C, pero condiciones como
tiempo, concentración de ácido y volumen del mismo son diversas entre sí.
En principio se realizaron ensayos que llevaron a la formación de las agliconas de los
glicósidos presentes en la Calendula officinalis, proponiendo un procedimiento general, el
cual se optimizó posteriormente. El procedimiento general consiste en pesar una
cantidad de muestra en un vial junto con un volumen de ácido clorhídrico de
concentración conocida, y agua como medio de reacción. De esta forma, al terminar la
reacción, pueden extraerse las agliconas formadas con éter etílico, el cual se lava con
agua (para eliminar residuos del ácido), se evapora y el resultado se lleva a un volumen
conocido, para formar la solución que se inyecta en el HPLC.
7.2. ÓPTIMIZACIÓN DE HIDRÓLISIS DE FLAVONOIDES
GLISÓSIDOS EN EXTRACTOS Y SOLUCIONES ORALES DE C.
officinalis
Debido a las diferentes condiciones que pueden variar y afectar tanto el rendimiento de la
hidrólisis como la precisión del proceso, se hace necesaria la optimización de las
mismas. Como se describió anteriormente, la hidrólisis involucra la adición de un
volumen determinado de ácido, por lo cual al momento de terminar la reacción no
debería seguir presente en solución, aunque en algunos trabajos, éste remanente de
ácido sigue presente hasta el momento de la inyección [Chen, J.X., et al., 2008;
Rajalakshmi, P.V., et al., 2009; Nuutila, A.M., et al., 2002; Olszewska, M., 2007].
Una de las formas de eliminar el ácido remanente es la neutralización de la mezcla de
reacción con buffer de Tris pH= 8.8 [Menghinello, P., et al. 1999] ó la extracción con un
solvente orgánico, el cual extrae las agliconas formadas, mientras el ácido queda en la
fase acuosa. [Liu, H.P., et al., 2011].
Para el presente trabajo, se realizó la neutralización con una base fuerte (NaOH) y dos
bases débiles (trietilamina, y bicarbonato de sodio). En la tabla 24, se observa como el
NaOH produce la degradación del analito. En el caso de las bases débiles, se tienen
resultados similares, como se observa en el Anexo 4. Por lo tanto, se propuso la
42
extracción con un solvente orgánico, en este caso éter etílico, el cual luego de extraer las
agliconas formadas, es lavado con agua destilada para que el ácido remanente que
pueda quedar en la fase etérea, pase a la fase acuosa, la cual es desechada.
Teniendo en cuenta lo anterior, se realizó la optimización de la hidrólisis de flavonoides
glicósidos a partir de las matrices escogidas.
7.2.1. Diseño central compuesto para soluciones orales
En principio se realizó la optimización de la hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de
soluciones orales, sin embargo, al utilizar estas condiciones para los extractos de
caléndula, no se obtuvieron los resultados esperados, por lo cual fue necesaria la
realización de dos nuevos diseños experimentales, cada uno con el fin de optimizar la
metodología a partir de extractos glicólicos e hidroalcohólicos.
Por medio de ensayos preliminares se seleccionaron los limites superiores e inferiores de
las dos variables a estudiar: Concentración de HCl desde 3.5 hasta 6.5 M, y tiempo de
reacción desde 1.5 hasta 2.5 horas. El número total de experimentos requeridos para el
DCC y el resultado del contenido de quercetina total en la muestra original (μg/g de
producto) se presentan en la tabla 17.
Tabla 17. Resultados de la optimización de hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de soluciones orales, a través del DCC.
Factores originales Factores codificados Quercetina (μg/g
producto)
Tratamiento [HCl] (M)
(X1) Tiempo (h)
(X2) [HCl] (X1)
Tiempo (X2)
1 3.5 1.5 -1 -1 1.165 2 6.5 1.5 1 -1 0.882
3 3.5 2.5 -1 1 1.051
4 6.5 2.5 1 1 0.723
5 5 1.28 0 -√2 1.736
6 5 2.71 0 √2 1.381
7 2.88 2 -√2 0 0.438
8 7.12 2 √2 0 0.740
9 5 2 0 0 1.956
10 5 2 0 0 1.917
11 5 2 0 0 1.956
12 5 2 0 0 1.755
Los resultados se analizaron a través del software Statgraphics Plus® Versión 5.1,
obteniéndose la ecuación del modelo que se ajusta a los resultados obtenidos (Ecuación
15).
43
Ecuación 15
El modelo de segundo orden ajustado tiene un r2 de 0.9401, lo que indica que explica en
un 94.0% la variabilidad de los valores de quercetina obtenidos para este producto.
Como se observará en la sección 7.3.5.2 (Evaluación de la precisión intermedia) y 7.4
(Determinación de la incertidumbre) la metodología tienen una variabilidad inherente a
los pretratamientos, los cuales son la principal fuente de esta variación.
La superficie de respuesta generada por el software de acuerdo a los resultados de la
tabla 17 se muestra en la figura 18, donde se observa que el punto óptimo se encuentra
muy cercano al punto central del diseño experimental. Las condiciones óptimas para la
formación de quercetina son: tiempo de reacción 1.88 horas y [HCl] 4.98M, las cuales
para efectos prácticos, se aproximan a 2.0 horas y concentración de HCl 5.0 M.
Figura 18. Superficie de respuesta para la hidrólisis de flavonoides glicósidos, en función
del tiempo y la concentración de HCl a partir de soluciones orales.
Estas condiciones óptimas se evaluaron a tres temperaturas diferentes, confirmando que
80°C es el valor óptimo para este parámetro (Figura 19).
Figura 19. Efecto de la temperatura en la hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de soluciones orales.
Superficie de Respuesta estimada
Tiempo (h)[HCl] (M)Q
ue
rceti
na
(p
pm
)
Quercetina0,91,051,21,351,51,651,81,95
1,5 1,7 1,9 2,1 2,3 2,53,54
4,55 5,56 6,50,8
1
1,2
1,41,6
1,82
0,400
0,800
1,200
1,600
2,000
60 70 80 90 100
Qu
erc
eti
na
(μ
g/g
pro
du
cto
)
TEMPERATURA (°C)
44
7.2.2. Diseño central compuesto para extractos glicólicos
Ensayos previos de hidrólisis a partir de extractos glicólicos, mostraron que las
condiciones óptimas de este proceso al igual que para extractos hidroalcohólicos eran
diferentes, por lo cual se realizaron ensayos para delimitar los nuevos puntos del DCC a
aplicar en extractos glicólicos, determinándose los límites para la concentración de HCl
entre 1.0 y 2.0 N y para el tiempo de reacción entre 1.5 y 2.5 horas (Tabla 18).
Tabla 18. Resultados de la optimización de hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de extractos glicólicos, a través del DCC.
Factores originales Factores codificados Quercetina (μg/g
producto)
Tratamiento [HCl] (N)
(X1) Tiempo (h)
(X2) [HCl] (X1)
Tiempo (X2)
1 1.0 1.5 -1 -1 63.804 2 2.0 1.5 1 -1 71.753 3 1.0 2.5 -1 1 59.627
4 2.0 2.5 1 1 55.230
5 1.5 1.28 0 -√2 71.485 6 1.5 2.71 0 √2 59.828
7 0.79 2.0 -√2 0 63.738
8 2.21 2.0 √2 0 63.818
9 1.5 2.0 0 0 63.764
10 1.5 2.0 0 0 65.231
11 1.5 2.0 0 0 64.928
12 1.5 2.0 0 0 66.220
Figura 20. Superficie de respuesta para la hidrólisis de flavonoides glicósidos, en función
del tiempo y la concentración de HCl, a partir de extractos glicólicos.
Por medio del software, se obtuvo la ecuación del modelo de segundo orden que se
ajusta a los resultados obtenidos (Ecuación 16).
Superficie de Respuesta estimada
[HCl] (M)Tiempo (h)Q
ue
rce
tin
a (
pp
m) Quercetina (ppm)
63,0
64,8
66,668,4
70,2
72,0
1 1,2 1,4 1,6 1,8 21,5
1,71,9
2,12,3
2,5
56
60
64
68
72
45
Ecuación 16
La ecuación se ajusta al modelo con un r2 de 0.9373, lo cual indica que éste explica la
variabilidad obtenida para la concentración de quercetina en el producto en un 93.7%.
A diferencia de la optimización en soluciones orales, el punto óptimo se encuentra
ligeramente fuera de los valores para Z=±1 de [HCL] y “tiempo” (factores codificados X1
y X2), por lo cual, se requieren ensayos adicionales a partir del punto central (Z=0). Estos
ensayos se realizan sobre la trayectoria de máxima pendiente, es decir, donde la
respuesta aumenta en mayor proporción, hasta alcanzar el punto máximo [Kuel, R.O.,
2001; Montgomery, D.C., 2004]. Los experimentos sugeridos por el software Statgraphics
Plus® Versión 5.1 para alcanzar el punto máximo, junto con los datos obtenidos
experimentalmente se muestran en la tabla 19 y en la figura 21, en donde se grafican
respecto al valor codificado de tiempo X2 y al valor de quercetina total obtenido para el
producto final.
Tabla 19. Trayectoria de mayor pendiente para buscar el punto óptimo de hidrólisis para flavonoides glicósidos a partir de extractos glicólicos
X2 (Factor tiempo
codificado)
Factores originales Quercetina (μg/g de
producto) [HCl] (M) Tiempo (horas)
0 1.5 2 66.598
-1 1.8 1.5 71,172
-2 2.0 1.0 80.229
-3 2.3 0.5 75.392
-3.5 2.5 0.25 61.950
Figura 21. Quercetina obtenida a partir de extractos glicólicos frente al valor de Z del factor tiempo, sobre la trayectoria de máxima pendiente.
60,000
65,000
70,000
75,000
80,000
85,000
0 1 2 3 4Qu
erc
eti
na
(μg/
g p
rod
uct
o)
-X2 (factor tiempo codificado)
46
Como se observa en la figura 21, al realizar ensayos sobre la trayectoria de máxima
pendiente, se llega a un punto de máxima formación de quercetina, para luego volver a
disminuir su valor. Este punto máximo corresponde a un valor de tiempo codificado (X2)
de -2, lo cual indica de acuerdo a la tabla 19 que las condiciones óptimas para la
hidrólisis a partir de extractos glicólicos corresponden a una concentración de HCl de 2.0
N y un tiempo de 1 hora, junto con las demás condiciones establecidas en la tabla 7
(sección 6.5.2).
Estas condiciones se evaluaron también a diferentes temperaturas, en donde se
corrobora que el proceso a partir de extractos glicólicos, se optimiza al trabajar a 80°C
(Figura 22).
Figura 22. Efecto de la temperatura en la hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de extractos glicólicos.
7.2.3. Diseño central compuesto para extractos
hidroalcohólicos
Los resultados del diseño experimental (DCC) para la optimización de la hidrólisis de
flavonoides glicósidos a partir de extractos hidroalcohólicos, se muestran en la tabla 20.
25,000
35,000
45,000
55,000
65,000
75,000
85,000
65 70 75 80 85 90 95
Qu
erc
eti
na
(μg/
g p
rod
uct
o)
TEMPERATURA (°C)
47
Tabla 20. Resultados de la optimización de hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de extractos hidroalcohólicos, a través del DCC.
Factores originales Factores codificados Quercetina (μg/g
producto)
Tratamiento [HCl] (M)
(X1) Tiempo (h)
(X2) [HCl] (X1)
Tiempo (X2)
1 2 1 -1 -1 16.990
2 5.0 1 1 -1 19.957
3 2.0 3 -1 1 16.263
4 5.0 3 1 1 16.116
5 3.5 0.58 0 -√2 18.715
6 3.5 3.42 0 √2 16.400
7 1.38 2 -√2 0 14.043
8 5.62 2 √2 0 9.257
9 3.5 2 0 0 18.799
10 3.5 2 0 0 18.558
11 3.5 2 0 0 19.489
12 3.5 2 0 0 18.517
Figura 23. Superficie de respuesta para la hidrólisis de flavonoides glicósidos, en función
del tiempo y la concentración de HCl, a partir de extractos hidroalcohólicos.
La superficie de respuesta mostrada en la figura 23, está descrita por la ecuación de
segundo orden (Ecuación 17), de acuerdo al software Statgraphics Plus®:
Ecuación 17
Para este caso, el valor de r2 es de 0.7172, lo cual indica que el modelo explica el 71.7%
de la variabilidad de la quercetina obtenida. Sin embargo, al realizar una comparación
entre los valores observados y los valores propuestos por el modelo para los puntos del
diseño, se observa que el porcentaje de congruencia del modelo con los valores
obtenidos es cercano al 100% (Tabla 21).
Superficie de Respuesta estimada
[HCl] (M)TiempoQ
uerc
eti
na (
pp
m)
Quercetina (ppm)
15,0
15,8
16,6
17,4
18,2
19,0
19,8
20,6
2 2,5 3 3,5 4 4,5 51
1,41,8
2,22,6
3
13
15
17
19
21
48
Tabla 21. Congruencia de los datos obtenidos experimentalmente para la hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de extractos hidroalcohólicos y los valores propuestos por
el modelo matemático.
Tratamiento Factores codificados Quercetina
(μg/g producto)
Quercetina (μg/g producto) pronosticado
% de congruencia
[HCl] (X1) Tiempo (X2)
1 -1 -1 16.990 16.6629 98.08 2 1 -1 19.957 17.2328 86.35 3 -1 1 16.263 16.2594 99.98
4 1 1 16.116 13.7153 85.10
5 0 -√2 18.715 20.3076 108.51
6 0 √2 16.400 17.5351 106.92
7 -√2 0 14.043 13.7119 97.65
8 √2 0 9.257 12.3159 133.05
10 0 0 18.799 18.8407 100.22
11 0 0 18.558 18.8407 101.52
12 0 0 19.489 18.8407 96.67
13 0 0 18.517 18.8407 101.75
PROMEDIO 101.32
De igual manera que para los extractos glicólicos, el punto óptimo para la hidrólisis se
encuentra fuera de los límites de z = ±1 de [HCL] y “tiempo” (factores codificados X1 y
X2), por lo que se realizaron ensayos adicionales a través de la trayectoria de máxima
pendiente hasta encontrar el punto de óptimo para la hidrólisis partiendo de extractos
hidroalcohólicos. La tabla 22 y la gráfica 24 muestran los experimentos propuestos por el
software Statgraphics Plus® Versión 5.1, y los resultados obtenidos experimentalmente.
Tabla 22. Trayectoria de mayor pendiente para buscar el punto óptimo de hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de extractos hidroalcohólicos.
Factor codificado (Z) tiempo
Factores originales Quercetina (μg/g de
producto) X2 [HCl] (M) Tiempo (horas)
0 3.5 2 19.234
-1 3.45 1.5 20.321
-2 3.55 1.0 20.889
-3 3.65 0.5 20.086
49
Figura 24. Quercetina obtenida a partir de extractos hidroalcohólicos frente al valor de -Z
del factor tiempo, sobre la trayectoria de máxima pendiente.
La figura 24 muestra el punto máximo de formación de quercetina a partir de los
flavonoides glicósidos del extracto hidroalcohólico de C. officinalis. De acuerdo a la tabla
22, las condiciones óptimas de hidrólisis corresponden a una concentración de HCl de
3.55 N y un tiempo de 1.0 hora, junto con las condiciones constantes de la tabla 9
(sección 6.5.3).
Al igual que con las anteriores matrices, se realizaron ensayos de estas condiciones a
diferentes temperaturas, confirmando nuevamente que 80°C es la temperatura óptima
(Figura 25).
Figura 25. Efecto de la temperatura en la hidrólisis de flavonoides glicósidos a partir de extractos glicólicos.
De acuerdo a los diseños experimentales que se llevaron a cabo para cada una de las
matrices, se obtuvo que las condiciones óptimas para la hidrólisis de flavonoides
glicósidos fueron diferentes respecto a concentración y tiempo de reacción, mientras que
la temperatura fue igual en todos los casos (80°C).
19,0000
19,5000
20,0000
20,5000
21,0000
0 1 2 3 4Qu
erc
eti
na
(μg/
g p
rod
uct
o)
-Z (factor tiempo)
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
65 70 75 80 85 90 95Qu
erc
eti
na
(μg/
g p
rod
uct
o)
TEMPERATURA (°C)
50
El medio ácido requerido para la formación de la quercetina y las demás agliconas, como
se muestra en la sección de 7.3.2.1, es también un medio que promueve la degradación
de la misma; es decir que durante el proceso de hidrólisis, se presentan dos reacciones:
La primera, de formación y la segunda, de degradación del producto formado
(quercetina). La velocidad con la que cada una tome lugar determinará la cantidad de
quercetina máxima que puede formarse. La temperatura óptima de hidrólisis fue igual en
los tres casos, lo cual puede asociarse a que en estos, ésta temperatura logra la mejor
relación entre la cinética de formación frente a la de degradación.
Por otro lado, la diferencia en las demás condiciones como concentración de HCl y
tiempo de reacción puede ser debida a los componentes de las matrices trabajadas. De
acuerdo a las condiciones óptimas halladas, las más drásticas fueron las requeridas para
soluciones orales, las cuales a pesar de tener un menor contenido de flavonoides
glicósidos frente a los extractos usados como materia prima para su elaboración,
requieren una concentración de HCl 5.0 N y un tiempo de 2 horas; mientras que los
extractos glicólicos e hidroalcohólicos requieren una concentración de HCl de 2.0 N y
3.5 N respectivamente, por un periodo de una hora. El solvente usado para la
elaboración de estos dos últimos casos puede ser el responsable de que las condiciones
requeridas sean menos drásticas, y que a la vez el tiempo de reacción sea menor (mayor
velocidad). El propilenglicol y el etanol presentes en extractos glicólicos e
hidroalcohólicos pueden facilitar el proceso de hidrólisis, permitiendo así que la reacción
requiera condiciones menos drásticas que para soluciones orales, las cuales se
componen principalmente de agua.
Por lo tanto, de acuerdo a lo observado se hace necesaria la optimización de las
condiciones de hidrólisis de flavonoides glicósidos de acuerdo a la matriz en la que las
respectivas agliconas vayan a ser evaluadas, pues estas condiciones pueden depender
de los componentes presentes en ella.
7.3. VALIDACIÓN DE LA METODOLOGIA ANALÍTICA
7.3.1. Idoneidad del sistema
Los resultados para la evaluación de la idoneidad del sistema se presentan en la tabla
23, en donde se observa que los coeficientes de variación para los tiempos de retención,
factor de capacidad (k’), platos teóricos y asimetría, son menores al 2%, lo cual está de
acuerdo con los criterios de aceptación establecidos por la USP 35. Por lo anterior, el
sistema cromatográfico es confiable para realizar la validación de la metodología
desarrollada.
51
Tabla 23. Datos para la idoneidad del sistema a partir de una solución de 2.7 μg/mL de Quercetina.
Inyección Tiempo de
retención k'
PLATOS
TEÓRICOS ASIMETRIA
1 9.14 3.811 22280 1.241
2 9.15 3.816 22451 1.243
3 9.17 3.826 22257 1.222
4 9.16 3.821 22307 1.206
5 9.18 3.832 22189 1.213
6 9.15 3.816 22218 1.205
PROMEDIO 9.16 3.820 22284 1.222
SD 0.01 7.75x10-3
92.24 0.0169
%CV 0.161 0.203 0.414 1.38
7.3.2. Selectividad
La selectividad de la metodología desarrollada se evaluó frente a los productos de
degradación de la quercetina y de los demás compuestos presentes en el extracto de
Calendula officinalis, frente a condiciones de hidrólisis ácida, básica, oxidación con
peróxido de hidrógeno, y degradación con luz ultravioleta con un sistema de detección de
arreglo de diodos (DAD). Además, se evaluaron posibles interferentes en una
formulación oral, los cuales se evaluaron con y sin la hidrólisis ácida requerida para la
formación de quercetina.
En la literatura se reportan algunos posibles productos de degradación para la quercetina
en condiciones de irradiación UV exhaustiva y degradación oxidativa [Fahlman, B.M., et
al., 2009; Zhou, A., et al., 2007; Makris, D.P., et al.,2002], convergiendo en que el paso
inicial para la degradación es la ruptura del anillo central, para originar compuestos con
un solo anillo aromático. Entre los compuestos más comunes están el 2,4,6-
trihidroxibenzaldehído 10; el ácido 2,4,6-trihidroxibenzoico 11; el ácido 3,4-
dihidroxibenzoico 12, el 3,4-dihidroxifeniletanol 13 y el 2,4,6-benzenetriol 14 (figura 26).
HO
OH
OH
H
HO
OH
OH
OH
OH
HO
OO
OH
OH
OHHO
OH
HO OH
10 11 12
13 14
O
Figura 26. Productos de degradación de quercetina reportados.
52
7.3.2.1. Degradación de quercetina
Se sometió la quercetina estándar (Anexo 5) a diversos procesos de degradación con el
fin de identificar posibles picos interferentes provenientes de la quercetina (Tabla 24).
Tabla 24. Diferentes condiciones de degradación para quercetina estándar
Descripción % área quercetina
remanente % área quercetina
degradada % Pureza pico
Quercetina
Estándar 10μg/mL (control) 100.0 --- 999
Estándar + HCl 0.1N 80°C 72.8 27.2 99.9
Estándar + NaOH 0.1N 2.3 97.7 ---
Estándar + NaOH 0.01N 78.2 21.8 99.9
Estándar + H2O2 3% 95.1 4.9 99.9
Estándar + UV (254nm) 88.6 11.4 99.9
Estándar + UV (366nm) 102.3 -2.3 99.9
Hidrólisis ácida
Se observa la disminución de área en la señal correspondiente a quercetina en
aproximadamente 27%, sin embargo, no es notoria la formación de nuevos picos en el
cromatograma detectados a 370 y 254 nm (Ver anexo 6). Con lo anterior puede asumirse
la degradación de la quercetina a productos que no incluyen ninguno de los 2 anillos
aromáticos presentes en la estructura inicial.
Como se observa, el pH ácido y la temperatura promueven la degradación de quercetina,
lo cual sustenta el hecho de optimizar la hidrólisis de flavonoides glicósidos, pues si estas
condiciones no son las óptimas, es posible que se logre una hidrólisis parcial, lo que
conllevaría a un menor contenido de quercetina total que el valor verdadero. También
podría suceder que las condiciones de reacción propiciaran que la quercetina formada
por la hidrólisis comience el proceso de degradación, obteniéndose nuevamente, un
contenido de quercetina total menor al verdadero. Es necesario además, la eliminación
de este ambiente ácido antes de que las muestras sean evaluadas para mantener la
estabilidad de la muestra, lo cual es de gran importancia al programar una secuencia de
un número alto de análisis, por medio de automuestreador.
Hidrólisis básica
Se realizó la hidrólisis básica de quercetina a dos niveles de concentración de hidróxido
de sodio. Al utilizar NaOH 0.1 N por un período de 5 minutos, se observa la degradación
casi total de quercetina, lo cual no permite la determinación de la pureza de pico
correspondiente a la quercetina. Al utilizar NaOH 0.01 N por igual periodo de tiempo, se
observa la disminución en el área de quercetina de cerca de un 22%, generándose picos
53
de baja intensidad entre 2.3, 6.4 y 12.2 minutos, detectados a 254nm (Ver anexo 7), los
cuales no presentan interferencia con el pico de quercetina. Es posible que estos
productos de degradación detectados a 254nm correspondan a alguna de las estructuras
presentadas en la figura 26, dado que esta es una longitud de absorción característica de
compuestos con un anillo aromático no conjugado.
Oxidación con H2O2
Para la degradación de quercetina con una solución de peróxido de hidrógeno al 3% por
un período de 1 hora a temperatura ambiente, se observó la disminución de cerca de un
5% en el área de quercetina con respecto al control y la aparición de un pico
correspondiente a un producto de degradación que eluye con el frente del solvente (1.8
min), el cual se observa solo a 254 nm con muy alta intensidad, a pesar de la pequeña
cantidad de quercetina degradada (Anexo 8). Lo anterior infiere la alta absortividad del
compuesto de degradación a esta longitud de onda, sin tener efecto en la pureza de pico
de la quercetina, la cual se conserva en un 99.9%.
Degradación con UV
La degradación ultravioleta de quercetina se realizó a dos longitudes de onda (254 y 366
nm), cada una de manera independiente. Se observa que la exposición de la solución de
quercetina a una longitud de onda de 254 nm por un periodo de 1 hora disminuye el área
del pico de quercetina aproximadamente en un 11%, sin generar productos de
degradación visibles a las 2 longitudes de onda trabajadas (Anexo 9). Por otro lado, la
exposición de la solución de quercetina a una longitud de onda de 366nm no produce la
degradación de quercetina (Anexo 10). La pureza de pico correspondiente a la quercetina
del 99.9% en ambos casos confirma que no hay co-elución de picos y que el área
corresponde exclusivamente a la quercetina.
7.3.2.2. Degradación del extracto de C. officinalis hidrolizado
Dado que el extracto de caléndula se compone tanto de flavonoides como de ácidos
fenólicos y otros compuestos con posible absorción en el UV, es necesario determinar
que ninguno de ellos, ni sus posibles productos de degradación interfieren ni modifican la
respuesta obtenida para la quercetina. Para ello, se realizó la hidrólisis del extracto de
caléndula para la formación de las agliconas (Quercetina, Kaempferol e isorhamnetina),
el cual posteriomente se sometió a diferentes procesos de degradación (tabla 25).
En el anexo 11 se muestra el cromatograma correspondiente al extracto hidrolizado de
caléndula que no se sometió a ningún proceso de degradación adicional (Extracto
hidrolizado control). Como se observa en el cromatograma, los compuestos visibles a
240 nm tienen señales con mayor área que la de los flavonoides observados a 370 nm.
Sin embargo, se resuelven perfectamente de la quercetina (analito de interés), lo cual no
genera inconvenientes en el análisis.
54
Tabla 25. Extracto hidrolizado de Calendula officinalis bajo diversas condiciones de degradación.
Descripción % área quercetina
remanente % área quercetina
degradada % Pureza
pico
Extracto hidrolizado control 100.0 -- 99.9
Extracto hidrolizado + HCl 0.1 N (80°C) 34.1 65.9 99.9
Extracto hidrolizado + NaOH 0.1 N 15.2 84.8 99.9
Extracto hidrolizado + NaOH 0.01 N 99.6 0.4 99.9
Extracto hidrolizado + H2O2 3% 99.9 0.1 99.9
Extracto hidrolizado + UV (254 nm) 45.0 55.0 99.9
Extracto hidrolizado + UV (366 nm) 101.4 -1.4 99.9
Hidrólisis ácida
En la tabla 25 se observa como la hidrólisis ácida junto con la temperatura afecta a la
quercetina disminuyendo su área con respecto a la del extracto hidrolizado control
(Anexo 12), en un 66% aproximadamente. La disminución en el área de los demás picos
que hacen parte del cromatograma también es notoria, apareciendo algunas señales en
la región entre 3.5 y 4.5 minutos, y otros dos aproximadamente a los 5.5 minutos, los
cuales se observan a una longitud de onda de 254 nm Lo anterior sugiere compuestos
de degradación en los cuales no se conservan los dos anillos en la misma estructura
como los mostrados en la figura 26.
Hidrólisis básica
Se realizó a dos niveles de concentración: Hidróxido de sodio 0.01 y 0.1 N. En la primera,
dado que para este extracto no se realizó un lavado, se conserva un pH ligeramente
ácido en la solución que evita la degradación del extracto con NaOH, por el HCl
remanente. Por esta razón, se siguió con la degradación usando NaOH 0.1 N por 5
minutos a temperatura ambiente. La disminución del área de quercetina detectada a
370nm en cerca de un 85%, muestra la labilidad del analito a un pH básico, siendo
visibles señales entre 3.5 y 4.5 minutos (370nm) y otros dos cerca de los 5.5 minutos
detectados a 254 nm, los cuales no afectan la pureza de pico de la señal correspondiente
a quercetina (99.9%) (Anexo 13).
Oxidación con H2O2
A diferencia de lo ocurrido con el estándar, en este caso la adición de peróxido de
hidrógeno a la solución no produjo la degradación del pico de quercetina, pero si se
observa la aparición del pico que eluye con el frente del solvente, al igual que cuando se
realizó al estándar. Este solo es observado a una longitud de onda de 254 nm, por lo cual
se sugiere una estructura pequeña de polaridad media alta la cual no presenta
interferencia con el analito. No se detecta aparición de nuevas señales detectadas a
370nm, manteniéndose una pureza de pico para la señal correspondiente a quercetina
del 99.9% (Anexo 14).
55
Degradacion con UV
Como ocurrió con la degradación del estándar, se produjo la degradación de quercetina
solo con la luz ultravioleta de 254 nm, en este caso en un 55% con respecto al control. El
proceso con UV 366 nm no generó especies de degradación. La pureza de pico de la
señal correspondiente a quercetina se mantuvo en ambos casos en 99.9% (Anexo 15 y
16).
7.3.2.3. Selectividad frente a excipientes
La selectividad de la metodología desarrollada se realizó frente a posibles excipientes
presentes en una formulación de uso oral y los posibles productos de degradación que se
formen durante el proceso de hidrólisis, para la formación de las agliconas (Quercetina,
isorhamnetina y kaempferol).
En primer lugar se realizó la inyección de la mezcla de excipientes, en las
concentraciones que se muestran en la tabla 26, pero en ausencia del extracto de C.
officinalis. Se tomó una porción de esta mezcla y se llevó a volumen de 10 mL con
MeOH:H2O (80:20), de los cuales se inyectaron 20 μL.
Tabla 26. Mezcla de excipientes y extracto de C. officinalis usados para la evaluación de la selectividad frente a excipientes.
Componente % (p/p)
Extracto de Calendula 40
Propilenglicol 10
Ácido ascórbico 0.1
Benzoato de sodio 0.1
Metilparabeno 0.1
Propilparabeno 0.1
Sorbitol 10
Carbomero 940 0.1
agua c.s.p. 100
En el cromatograma presentado en el anexo 17 se observa la elución del ácido ascórbico
a los 1.9 minutos (frente del solvente), el benzoato de sodio a los 6.6 minutos, el
propilparabeno a los 11.4 minutos y el metilparabeno a los 12.3 minutos, los cuales solo
se observan a una longitud de onda de 254 nm, pues a 370nm ninguno de ellos exhibe
absorción. Algunas impurezas a los 3.4 y 6.4 minutos, que se encuentran presentes en la
materia prima del propilparabeno son también detectadas. El propilenglicol, sorbitol y el
carbómero 940 no presentan absorción en el UV, por lo cual no son detectados.
De igual manera, se realizó la hidrólisis de la mezcla de excipientes bajo las condiciones
normales usadas para la formación de quercetina y las demás agliconas. En el
cromatograma respectivo a la mezcla de estos excipientes hidrolizados se observa la
56
desaparición del pico correspondiente al ácido ascórbico, y la disminución en área de los
otros. Además, se observa la elución de un pico a 7.7 minutos detectado solo a 254 nm,
el cual corresponde al producto de degradación de uno de los excipientes (Anexo 18).
Este tiempo de retención es cercano al de la quercetina (7.5 minutos), sin embargo, en el
cromatograma a 370 nm no se observa ninguna señal. El espectro UV del interferente
que eluye a los 7.7 minutos se muestra en la figura 27, observándose que no presenta
absorción a 370 nm, por lo cual una posible co-elución no proporcionará un incremento
en el área de la quercetina en el caso de presentarse, siempre que la longitud de onda
con la cual se encuentre el sistema de detección sea de 370 nm.
Figura 27. Espectro UV del producto de degradación de uno de los excipientes.
El resultado de la hidrólisis de la mezcla de excipientes junto con el extracto de C.
officinalis (tabla 26), el cual se observa en el cromatograma correspondiente (anexo 19),
muestra la elución de la quercetina a los 7.7 minutos, detectada a 370nm y a 254nm. La
disminución en la pureza de pico al 92.6% se debe probablemente a la presencia del
interferente previamente discutido, el cual no genera un aumento en el área de la
quercetina, cuando es detectada a 370 nm.
Todos los ensayos de degradación forzada y de presencia de excipientes confirmaron
que no se presenta la formación de un producto de degradación ni de la quercetina ni de
los demás componentes presentes en el extracto de C. officinalis o en una formulación,
que generen una interferencia para la cuantificación de quercetina, de tal manera que el
método propuesto es selectivo para el analito de interés.
7.3.3. Linealidad
7.3.3.1. Linealidad del sistema
Se presentan los resultados de la linealidad del sistema (Tabla 27) para el rango entre
0.9 y 4.5 μg/mL, con cinco concentraciones realizadas por triplicado, y con dos
inyecciones por réplica. La curva de calibración resultante se muestra en la figura 28.
57
Figura 28. Curva de calibración de la linealidad del sistema para quercetina en el rango entre 0.9 y 4.5 μg/mL.
Tabla 27. Datos de la linealidad del sistema para Quercetina
Concentración teórica (μg/mL)
Concentración real (μg/mL)
Replica Inyección Área Promedio
0.9
0.875 1 1 278188
276640.5
2 275093
0.889 2
1 284579 284647
2 284715
0.882 3
1 267574 267739.5
2 267905
1.8
1.750 1 1 551479
551938
2 552397
1.778 2
1 559318 560943
2 562568
1.764 3
1 543828 542333.5
2 540839
2.7
2.625 1 1 826067
824947.5
2 823828
2.667 2
1 842929 845662
2 848395
2.646 3
1 833314 835333
2 837352
3.6
3.499 1 1 1090856
1092740.5
2 1094625
3.556 2
1 1161852 1169642
2 1177432
3.528 3
1 1097754 1101340
2 1104926
4.5
4.374 1 1 1404025
1402152
2 1400279
4.445 2
1 1480165 1457648
2 1435131
4.410 3
1 1441602 1443000.5
2 1444399
58
Coeficiente de variación de factores de respuesta
El factor de respuesta se calcula de acuerdo a la ecuación 18, para cada nivel de
concentración.
Ecuación 18
prom = 315380.9
Sf = 2443.4
CVf = 0.77%
El valor del coeficiente de variación de los factores de respuesta es menor al 2%, por lo
que no hay evidencia de falta de linealidad en el rango entre 0.9 y 4.5 μg/mL.
Prueba t student para la pendiente
Se enuncia la hipótesis nula:
H0: La pendiente no es significativamente diferente de cero
texp= 114.9
tcrit (0.05; n-2)= 2.16
Siendo el texp mayor al tcrit, por lo que se rechaza la hipótesis nula, de tal forma que existe
una relación lineal entre la variable X y la variable Y.
Prueba t student para el intercepto (Test de proporcionalidad)
Se enuncia la hipótesis nula :
H0: El intercepto no es significativamente diferente de cero
texp= 1.26
tcalc (0,05; n-2)= 2.16
Siendo el texp menor al tcalc, por lo que se acepta la hipótesis nula, con lo que se conluye
que no hay diferencia significativa entre el punto de corte de la recta y el origen.
ANOVA para la linealidad del sistema
59
En el Análisis de Varianza (ANOVA) para la linealidad se evaluó la significancia de la
regresión y la falta de ajuste del modelo lineal obtenido (Tabla 28). De acuerdo con los
resultados obtenidos, se tiene que la regresión es significativa, además de no haber
evidencia de falta de ajuste del modelo lineal propuesto.
Tabla 28. ANOVA para la linealidad del sistema
FUENTE SC GL CM Fcalc Fcrit
Regresión 2.39423x1012
1 2.39x1012
1.32x104 4.67
Falta de ajuste 1.96x109 3 6.54x10
8 1.52 3.71
Error residual 2.36x109 13 1.81x10
8
Error puro 4.32x10
9 10 4.32x10
8
Error total 2.39659x10
12 14
Test de Cochran
Por último se realizó el test de Cochran, con el fin de determinar la homogeneidad de las
varianzas en los niveles de concentración trabajados (Tabla 29).
Tabla 29. Test de Cochran para la linealidad del sistema
Concentración teórica (μg/mL)
Factor respuesta y/x
promedio varianza
0.9
316206.4 313307.6 7.51x10
7
320152.2 303564.3
1.8
315438.8 312781.6 2.13x10
7
315455.9 307450.1
2.7
314311.2 315687 1.87x10
6
317048.4 315701.5
3.6
312256.8
316299.4 5.00x107 324465.3
312176.1
4.5
314059.5
318828.8 1.72x107 320802.0
321624.8
Total 1.66x108
∑ Ecuación 19
Gexp = 0.45
Gcrit (0.05, K=5, n=3) =0.68
60
El Gexp, calculado de acuerdo a la ecuación 19, no supera el valor crítico, por lo que se
acepta la hipótesis nula con la cual las varianzas para cada nivel de concentración son
homogéneas entre sí y por lo tanto no afectan los resultados.
7.3.3.2. Linealidad del método
Dado que el método será utilizado para la evaluación tanto de extractos (materia prima)
como de productos del mercado a base de Calendula officinalis, se realizó la evaluación
de la linealidad del método para soluciones orales, extractos glicólicos e hidroalcohólicos,
enriqueciendo estas muestras con quercetina estándar tal como se describió en la parte
experimental (Tabla 30).
Tabla 30. Resumen estadístico para la linealidad del método en las matrices trabajadas.
MATRIZ
EXTRACTO GLICÓLICO
EXTRACTO HIDROALCOHOLICO
SOLUCIÓN ORAL
Regresión (Y= a + bX)
a 2558.3 -8294.9 284.9
b 319265.4 321799.9 323154.8
R2 0.9998 0.9984 0.9999
Proporcionalidad de factores de
respuesta
x/y prom 320778.6 317505.6 322998.2
Sf 2005.8
3855.3
1582.9
%CVf 0.63 1.21 0.49
Conclusión No hay evidencia de falta de linealidad
t-student para la pendiente
tb 245.03 90.40 433.8
tcrit 2.16 2.16 2.16
Conclusión La pendiente es significativamente diferente de cero
t-student para el intercepto
(Proporcionalidad)
ta 0.67 0.80 0.128
tcrit 2.16 2.16 2.16
Conclusión El intercepto no difiere significativamente de cero
Test de Cochran
Gexp 0.35 0.29 0.62
Gcrit 0.68 0.68 0.68
Conclusión Las varianzas entre los niveles de concentración son
homogéneas
Tabla 31. ANOVA de la linealidad del método para extracto glicólico
FUENTE SC GL CM Fcalc Fcrit
Regresión 2.4178x1012
1 2.42x1012
6.00x104 4.67
Falta de ajuste 1.14x109 3 3.82x10
8 2.29 3.71
Error residual 5.24x108 13 4.03x10
7
Error puro 1.67x109 10 1.67x10
8
Error total 2.4184x1012
14
61
Tabla 32. ANOVA de la linealidad del método para extracto hidroalcohólico
FUENTE SC GL CM Fcalc Fcrit
Regresión 2.4172x1012
1 2.42x1012
8.17x103 4.67
Falta de ajuste 2.43x109 3 8.10x10
8 1.29 3.71
Error residual 3.85x109 13 2.96x10
8
Error puro 6.27x109 10 6.27x10
8
Error total 2.4211x1012
14
Tabla 33. ANOVA de la linealidad del método para soluciones orales
FUENTE SC GL CM Fcalc Fcrit
Regresión 2.5298x1012
1 2.53x1012
1.88x105 4.67
Falta de ajuste 1.90x108 3 6.34x10
7 1.74 3.71
Error residual 1.75x108 13 1.34x10
7
Error puro 3.65x108 10 3.65x10
7
Error total 2.53x1012
14
Al igual que para la linealidad del sistema, para la linealidad del método a partir de las
matrices utilizadas se evidencia la proporcionalidad de los factores de respuesta, las
pendientes son significativamente diferentes de cero, los puntos de corte no difieren
significativamente de cero y las varianzas a los niveles de concentración trabajados no
difieren entre sí, para un 95% de confianza y n-2 grados de libertad. Los ANOVA
realizado al 95% de confianza (Tablas 31, 32 y 33) confirman la significancia del modelo
de regresión lineal de los métodos y su ajuste significativo a los datos obtenidos. Por lo
tanto, se confirma la linealidad para la quercetina en el rango entre 0.9 y 4.5 μg/mL.
7.3.4. Limite de detección y cuantificación
Se utilizaron las tres concentraciones más bajas de la curva de calibración pues son
cercanas a los valores esperados para LD y LC (Tabla 34).
Tabla 34. Curva de calibración a bajas concentraciones
Concentración teórica (μg/mL)
Concentración real (μg/mL)
Área S
0.9
0.875 276641
8457.69
0.889 284647
0.882 267740
1.8
1.750 551938
9306.36
1.778 560943
1.764 542334
2.7
2.625 824948
10357.3
2.667 845662
2.646 835333
62
Figura 29. Curva de calibración de quercetina a bajas concentraciones.
Figura 30. Curva de desviación estándar de las áreas vs concentración de quercetina (bajas concentraciones).
De acuerdo a las ecuaciones 13 y 14, se calculó el valor del límite de detección y
cuantificación respectivamente (n=3), en donde el valor del intercepto de la ecuación de
la recta a bajas concentraciones (Figura 29) es una medida de la señal del blanco Ybl y la
desviación estándar de la señal proporcionada por el blanco (Sbl) corresponderá al
intercepto de la recta “Desv. Estándar vs Concentración de quercetina” (Figura 30).
√
√
y = 316921x - 4574,3 R² = 0,9993
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000
Áre
a
Quercetina (μg/mL)
y = 1055,3x + 7474,2 R² = 0,9962
7500,00
8000,00
8500,00
9000,00
9500,00
10000,00
10500,00
11000,00
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
De
sv.
est
and
ar
Quercetina (μg/mL)
63
Estos valores corresponden a la concentración minina detectable y cuantificable en la
solución resultante luego del proceso de hidrólisis y extracción. Para el cálculo del límite
de detección y de cuantificación en cada una de la matrices, se parte del peso tomado
para cada muestra (soluciones orales= 3 g; extracto glicólico= 1 g; extracto
hidroalcohólico= 2 g) y asumiendo un volumen final de 5 mL, para el caso de matrices
con bajo contenido. Los valores se muestran en la tabla 35.
Tabla 35. Limites de detección y cuantificación en las matrices escogidas.
SOLUCIONES
ORALES EXTRACTOS GLICÓLICOS
EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS
LD (μg/g producto) 0.05 0.16 0.08
LC (μg/g producto) 0.21 0.64 0.32
7.3.5. Precisión
7.3.5.1. Repetibilidad del sistema y del método
Como se observa en la tabla 36, los valores de coeficiente de variación menores al 2%
son el indicativo de que se cumplen los criterios de repetibilidad tanto para el sistema
como para el método en las formas farmacéuticas trabajadas.
Tabla 36. Datos de la repetibilidad del sistema y del método
Área
Sistema
Método
Inyección Extracto glicólico
Extracto Hidroalcohólico
Solución oral
1 826067 840900 822615 874030 2 823828 841752 826212 874881 3 826681 845834 821045 875159 4 823655 845391 825731 872914 5 824169 843961 820053 878469 6 825092 846519 822031 875050
Promedio 824915 844060 822948 875083 Desv.
Estandar 1249.2 2292.9 2504.1 1861.5
%CV 0.15 0.27 0.30 0.21
7.3.5.2. Precisión intermedia
Dado que el extracto glicólico y las soluciones orales son de carácter viscoso, la medición
de la muestra en volumen tiene alta variación entre mediciones, por lo que se registra el
valor del peso analizado de muestra, de tal forma que el contenido se exprese como
quercetina en μg/g de producto. La precisión se evaluó frente a la concentración obtenida
64
bajo las fuentes de variación (analista y días) para la misma muestra, realizando los
tratamientos de manera independiente.
Tabla 37. Resultados para el contenido de quercetina en condiciones de precisión intermedia a partir de soluciones orales.
ANALISTA
DIA 1 DIA 2
REP Peso
muestra (g)
área μg/mL
de solución
μg/g de
producto
Peso muestra
(g) área
μg/mL de
solución
μg/g de
producto
A
1 3.9558 230951 2.867 3.624 3.9821 255564 3.171 3.982
2 3.9565 249006 3.090 3.905 3.9728 255103 3.166 3.984
3 3.9623 238586 2.961 3.737 3.9706 233477 2.898 3.650
Quercetina (μg/g) S %CV Quercetina (μg/g) S %CV
3.755 0.142 3.77 3.872 0.192 4.97
B
1 3.9790 241373 2.996 3.765 3.9783 254383 3.157 3.967
2 3.9445 230713 3.827 3.631 3.9642 233990 2.905 3.664
3 3.9498 226007 2.806 3.552 3.9610 244244 3.031 3.827
Quercetina (μg/g) S %CV Quercetina (μg/g) S %CV
3.649 0.107 2.94 3.819 0.152 3.98
Quercetina (μg/g) promedio
3.774
S TOTAL 0.155
%C.V. TOTAL 4.12
Tabla 38. Resultados para la precisión intermedia del método a partir de extractos glicólicos.
ANALISTA
DIA 1
DIA 2
REP Peso
muestra (g)
área μg/mL
de solución
μg/g de
producto
Peso muestra
(g) área
μg/mL de solución
μg/g de
producto
A
1 0.9258 231081 2.869 77.47 0.9383 241296 2.995 79.80
2 0.9334 228603 2.838 76.02 0.9216 233093 2.894 78.49
3 0.9324 236512 2.936 78.72 0.9187 226778 2.816 76.62
Quercetina (μg/g) S %CV
Quercetina (μg/g) S %CV
77.401 1.352 1.75
78.304 1.597 2.04
B
1 0.9195 225442 2.799 76.10
0.9252 229833 2.853 77.10
2 0.9245 222765 2.766 74.80
0.9376 237387 2.947 78.57
3 0.9449 236606 2.937 77.71
0.9252 231727 2.877 77.73
Quercetina (μg/g) S %CV
Quercetina (μg/g) S %CV
76.20 1.457 1.91
77.80 0.737 0.95
Quercetina (μg/g) promedio S TOTAL %C.V. TOTAL
77.43 1.39 1.80
65
Tabla 39. Resultados para la precisión intermedia del método a partir de extractos hidroalcohólicos.
ANALISTA
DIA 1
DIA 2
REP Peso
muestra (g)
área μg/mL
de solución
μg/g de
producto
Peso muestra
(g) área
μg/mL de solución
μg/g de
producto
A
1 1.8209 188885 2.348 64.46
1.8261 181799 2.260 61.88
2 1.823 192200 2.388 65.51
1.8305 186034 2.312 63.16
3 1.8179 186531 2.318 63.77
1.8317 187178 2.326 63.51
Quercetina (μg/g) S %CV
Quercetina (μg/g) S %CV
64.58 0.88 1.36
62.85 0.86 1.36
B
1 1.8252 181218 2.253 61.71
1.8216 187579 2.331 63.99
2 1.8114 188090 2.338 64.53
1.8261 184469 2.293 62.78
3 1.8201 187196 2.327 63.92
1.8343 185301 2.303 62.78
Quercetina (μg/g) S %CV
Quercetina (μg/g) S %CV
63.39 1.48 2.33
63.19 0.70 1.11
Quercetina (μg/g)
promedio S TOTAL %C.V. TOTAL
63.50 1.11 1.74
En las tablas 37, 38 y 39 se resumen los datos obtenidos para la precisión intermedia de
cada una de las matrices obtenidas. En estas se muestra una columna con concentración
de quercetina en las soluciones inyectadas al equipo luego de las diluciones (μg/mL), y
en otra columna la concentración de quercetina obtenida en el producto de partida (μg/g).
A partir de esta última se evaluaron los parámetros de la precisión intermedia dentro de
cada grupo, así como de manera global, teniendo en cuenta la variación total para cada
matriz. Se observa que el coeficiente de variación general para las soluciones orales,
extractos glicólicos e hidroalcohólicos es de 4.12, 1.80 y 1.74% respectivamente.
De acuerdo a las guías de la AOAC y de la FDA [AOAC, 2012; FDA, 2012], para
validación de métodos analíticos, el coeficiente de variación aceptable para un método de
cuantificación es dependiente del rango de concentración trabajado. Para el caso de los
extractos glicólicos e hidroalcohólicos, donde la concentración fue cercana a 100ppm, se
aceptan valores de %CV hasta del 4%, y para el caso de las soluciones orales, donde la
concentración fue cercana a 10ppm, se permiten coeficientes de variación hasta del 6%
(Tabla 40). Por lo tanto, el coeficiente de variación de la metodología para la
cuantificación de quercetina en extractos y productos orales a base de C. officinalis se
encuentra dentro de los rangos permitidos.
66
Tabla 40. Límites para el coeficiente de variación en la precisión intermedia, de acuerdo al nivel de concentración de la muestra, para validación de métodos químicos [AOAC,
2012; FDA, 2012].
Concentración %C.V. permitido
100% 1.0 10% 1.5 1% 2.0
0.1% 3.0 0.01% ó 100μg/g (ppm) 4.0
10μg/g (ppm) 6.0 1μg/g (ppm) 8.0
10μg/Kg (ppb) 15.0
Por su parte, el resumen del ANOVA para la precisión intermedia para las matrices
evaluadas presentado en la tabla 41, muestra que aunque los valores de Fcalc son más
cercanos al valor crítico cuando se trabaja en días diferentes, no hay diferencia
significativa entre ellos, lo que indica que los métodos desarrollados y optimizados para
la cuantificación de quercetina son precisos.
Tabla 41. Resumen del ANOVA para la precisión intermedia para las matrices trabajadas.
Fuente variación
Fcalc FCRIT
(0.05; 1; 9) Solución
oral Extracto glicólico
Extracto hidroalcohólico
Analista 0.92 1.35 0.49 5.12
Día 2.99 2.92 2.48 5.12
7.3.6. Exactitud
En las tablas 42, 43 y 44 se muestran los datos de porcentaje de recuperación de
quercetina estándar adicionada para cada una de las matrices trabajadas y el coeficiente
de variación en los tres niveles de concentración.
67
Tabla 42. Datos del porcentaje de recuperación de quercetina a partir de un extracto glicólico
Quercetina teórica
adicionada (μg/mL)
Quercetina adicionada
real (μg/mL)
Área neta (área-blanco)
Interpolación (linealidad sistema)
% de recuperación
Varianza % de
recuperación
% de recuperación
promedio
0.9
0.882 284897 272160.1 104.68
0.91 105.03 0.896 293623 276716.0 106.11
0.889 286225 274438.1 104.30
2.7
2.646 841326 837098.0 100.51
0.09 100.80 2.689 860203 850765.8 101.11
2.667 850463 843931.9 100.77
4.5
4.410 1397250 1402035.9 99.66
0.70 100.62 4.481 1441605 1424815.6 101.18
4.445 1427894 1413425.7 101.02
% recuperación medio 102.15
Desv. Est. 2.50
%CV 2.44
Tabla 43. Datos del porcentaje de recuperación de quercetina a partir de un extracto hidroalcohólico
Quercetina teórica
adicionada (μg/mL)
Quercetina adicionada
real (μg/mL)
Área neta (área - blanco)
Interpolación (linealidad sistema)
% de recuperación
Varianza % de
recuperación
% de recuperación
promedio
0.9
0.875 269966 269882.1 100.03
4.86 101.28 0.889 284949 274438.1 103.83
0.882 272132 272160.1 99.99
2.7
2.625 823848 830264.0 99.23
5.45 101.80 2.667 864009 843931.9 102.38
2.646 868776 837098.0 103.78
4.5
4.374 1376886 1390646.0 99.01
4.16 100.87 4.445 1456548 1413425.7 103.05
4.410 1409548 1402035.9 100.54
% recuperación medio 101.32
Desv. Est. 0.47
%CV 0.46
68
Tabla 44. Datos del porcentaje de recuperación de quercetina de a partir de una solución oral
Quercetina teórica
adicionada (μg/mL)
Quercetina adicionada
real (μg/mL)
Área adicionada
(área-blanco)
Interpolación (linealidad sistema)
% de recuperación
Varianza % de
recuperación
% de recuperación
promedio
0.9
0.896 286836 276716.0 103.66
1.02 103.77 0.896 290089 276716.0 104.83
0.903 286876 278994.0 102.83
2.7
2.689 873628 850765.8 102.69
0.09 102.53 2.689 869357 850765.8 102.19
2.710 880921 857599.7 102.72
4.5
4.481 1444205 1424815.6 101.36
0.07 101.46 4.481 1442602 1424815.6 101.25
4.517 1461539 1436205.5 101.76
% Recuperación medio 102.59
Desv. Est. 1.16
%CV 1.13
En la tabla 45 se muestran los porcentajes de recuperación aceptados por la AOAC y la
FDA [AOAC, 2012; FDA, 2012], de acuerdo al nivel de concentración para validación de
métodos analíticos. Los valores de porcentaje de recuperación de quercetina a partir de
extractos glicólicos, extractos hidroalcohólicos y soluciones orales, se encuentran dentro
de los rangos especificados para concentraciones de quercetina entre 10 y 100 μg/g.
Tabla 45. Límites para el porcentaje de recuperación de acuerdo al nivel de concentración de la muestra, para validación de métodos químicos [AOAC, 2012; FDA,
2012].
Concentración Porcentaje de recuperación
permitido
100% 98-101%
10% 95-102% 1% 92-105%
0.1% 90-108%
0.01% ó 100 μg/g 85-110%
10 μg/g (ppm) 80-115%
1 μg/g (ppm) 75-120%
10 μg/Kg (ppb) 70-125%
Por otro lado, el test de Cochran (α=0,05) confirma la homogeneidad entre las varianzas
del porcentaje de recuperación obtenido para los tres niveles de concentración
trabajados (tabla 46).
69
Tabla 46. Test de Cochran para la exactitud
MATRIZ
EXTRACTO GLICÓLICO
EXTRACTO HIDROALCOHOLICO
SOLUCIÓN ORAL
G exp 0.54 0.38 0.86
G crit
(0.05;k=3;n=3) 0.87 0.87 0.87
Conclusión No hay diferencia entre las varianzas a diferentes niveles de
concentración
De acuerdo a los datos obtenidos en la validación de las metodologías desarrolladas
para la cuantificación de quercetina en soluciones orales, extractos glicólicos e
hidroalcohólicos, éstas muestran ser selectivas, lineales, precisas y exactas, por lo que
son confiables en el análisis de quercetina total en productos a base de C. officinalis y en
las matrices trabajadas.
7.4. DETERMINACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE
La determinación de la incertidumbre en principio involucra la identificación de todas las
fuentes de incertidumbre de los términos de la expresión usada para el cálculo de la
concentración de quercetina en las diferentes matrices. Realizar una determinación de
este parámetro por medio del método “Bottom-up” y el cálculo individual de cada
contribución puede resultar complejo. De acuerdo al modelo “top-down” propuesto por
Maroto [Maroto, 2002], se realizó el cálculo de la incertidumbre estándar y relativa para
cada una de las matrices trabajadas, de tal forma que la incertidumbre absoluta fuese
dependiente de la concentración trabajada.
Para el caso de soluciones orales se partió de la ecuación 4, en donde la incertidumbre
estándar se expresa como la contribución de la incertidumbre del procedimiento, de los
pretratamientos y de la verificación de la trazabilidad (Ecuación 20). La contribución a la
incertidumbre por otros efectos no considerados en la precisión intermedia no se tiene en
cuenta en esta ecuación, pues se realizó el cálculo independiente para cada matriz
trabajada evitando incorporar la incertidumbre asociada a la variabilidad de las matrices
de las muestras de rutina.
√
Ecuación 20
70
Incertidumbre debida al procedimiento
Se realizó la determinación por medio del conjunto de valores obtenidos para el
contenido de quercetina en condiciones de precisión intermedia (dos analistas en dos
días diferentes), a partir de una muestra de solución oral homogénea.
√
El SI representa la desviación estándar del total de 12 determinaciones independientes, y
N es el número de veces que se analiza la muestra en las condiciones intermedias (N=1).
Incertidumbre debida al pretratamiento
La incertidumbre debida al pretratamiento se realizó a partir del conjunto de tres medidas
independientes de una muestra homogénea de solución oral, (teniendo en cuenta el
proceso de hidrólisis y extracción), en condiciones de repetibilidad (el mismo analista en
un corto periodo de tiempo), de tal manera que la incertidumbre requerida no se vea
afectada por otras contribuciones (efecto de analista y día).
Incertidumbre de la verificación de la trazabilidad
Al utilizar un valor de referencia, en este caso, una MRC (quercetina USP), el cálculo de
la incertidumbre debida al proceso de verificación de la trazabilidad tiene el componente
de la incertidumbre del valor medio obtenido con el método analítico y la incertidumbre
del material de referencia (Ecuación 8).
El primer término se calcula a partir del conjuto de medidas obtenidas (p=12) en
condiciones de precisión intermedia a partir de una muestra homogénea de solución oral.
√
√
Para el cálculo de la incertidumbre del valor de referencia, se toma como referencia el
punto medio de la curva de calibración, para el cual, el cálculo de la concentración puede
expresarse de la siguiente manera:
Cada término de esta expresión corresponde a:
71
( )
( ) Ecuación 21
y
Ecuación 22
Donde m es la masa equivalente a quercetina anhidra, P es la potencia y V el volumen
total de dilución para alcanzar la concentración de 2.667 μg/mL, las cuales se usan para
hallar la incertidumbre asociada al material de referencia (Ecuación 10).
√(
) (
) (
) Ecuación 10
La incertidumbre del volumen se calculó teniendo en cuenta las diluciones realizadas
para la muestra de referencia; la incertidumbre de la masa se calculó de acuerdo al
certificado de calibración de la balanza, para el peso del MRC usado (12.5 mg); y para la
incertidumbre de la potencia, se asume una variación en la última cifra del valor
reportado (0.995) en el certificado de calidad MRC (up = 0.001).
√(
)
(
)
(
)
De acuerdo a la densidad de la solución (0.8334μg/mL):
Con lo cual se calculó la incertidumbre asociada a la verificación de la trazabilidad:
√
√
Al considerar todas las contribuciones, se obtiene el valor de incertidumbre estándar y
estándar relativa a partir de soluciones orales, tal como se muestra en la tabla 47.
72
Tabla 47. Componentes de la incertidumbre en la cuantificación de quercetina a partir de soluciones orales a base de C. officinalis.
Tratamiento Incertidumbre estándar
u (μg/g) Concentración
(μg/g)
incertidumbre estándar relativa
uR
Procedimiento 0.155 3.774 0.041
Pretratamientos 0.192 3.957 0.049
Trazabilidad 0.075 3.774 0.020
Otros
Total 0.258
0.067
De igual forma, se realizó la determinación de la incertidumbre estándar y relativa para
extractos glicólicos e hidroalcohólicos, como se muestra en las tablas 48 y 49
respectivamente.
Tabla 48. Componentes de la incertidumbre en la cuantificación de quercetina a partir de extractos glicólicos de C. officinalis.
Tratamiento Incertidumbre estándar
u (μg/g) Concentración
(μg/g)
incertidumbre estándar relativa
uR
Procedimiento 1.392 77.428 0.018
Pretratamientos 1.457 77.802 0.019
Trazabilidad 0.406 77.428 5.2x10-3
Otros --- --- ---
Total 2.055 --- 0.026
Tabla 49. Componentes de la incertidumbre en la cuantificación de quercetina a partir de extractos hidroalcohólicos de C. officinalis.
Tratamiento Incertidumbre estándar
u (μg/g) Concentración
(μg/g)
incertidumbre estándar relativa
uR
Procedimiento 1.106 63.500 0.017
Pretratamientos 1.480 62.849 0.024
Trazabilidad 0.325 63.500 5.1x10-3
Otros --- --- ---
Total 1.876 --- 0.030
La figura 31 muestra la contribución de los términos de incertidumbre individuales a la
incertidumbre total estándar, cuando la cuantificación se realiza a partir de soluciones
orales, extractos glicólicos e hidroalcohólicos. Se observa que en todos los casos, la
incertidumbre debida a los pretratamientos y al procedimiento son las de mayor
contribución a la incertidumbre final del resultado. El proceso de hidrólisis puede
73
considerarse el mayor contribuyente a esta incertidumbre, aunque de acuerdo a los
parámetros de validación, los coeficientes de variación del método a partir de las tres
muestras, se encuentran en el rango permitido para los niveles de concentración de las
muestras.
Figura 31. Contribución de los componentes de incertidumbre a la incertidumbre total para soluciones orales, extractos glicólicos e hidroalcohólicos.
Haciendo uso de la incertidumbre estándar relativa obtenida para cada matriz trabajada,
es posible determinar la incertidumbre absoluta de un valor determinado de
concentración específica, para k=2, de modo que la probabilidad de que el valor
verdadero de concentración se encuentre dentro del rango obtenido sea del 95%. Estas
ecuaciones se aplican para un intervalo de concentraciones que no abarquen más de un
orden de magnitud.
Ecuación 23
Ecuación 24
Ecuación 25
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
1,800
2,000
Soluciones orales Extractos glicólicos Extractoshidroalcohólcos
Ince
rtid
um
bre
est
ánd
ar, u
Procedimiento
Pretratamientos
Trazabilidad
Total
74
7.5. CUANTIFICACIÓN DE QUERCETINA TOTAL EN
EXTRACTOS Y PRODUCTOS DEL MERCADO
El resultado del análisis para extractos glicólicos (EG-L1) e hidroalcohólicos 1:1 (HA-L1 y
HA-L2) se muestra en la tabla 50, con su desviación estándar e incertidumbre absoluta
calculada de acuerdo a las ecuaciones 24 y 25 respectivamente.
Tabla 50. Determinación de quercetina total en extractos de C. officinalis usados como materia prima en productos fitoterapéuticos y cosméticos
Quercetina
(μg/g) SD
U (Incertidumbre)
(μg/g)
%C.V. (inter-lotes)
EG-L1 76 1.4 4.0 ---
Extracto hidroalcohólico
(1:1)
HA-L1 64 0.97 3.8 75.0%
HA-L2 19.8 0.52 1.2
Con la información contenida en la tabla 50, no es posible realizar una comparación
directa entre los extractos glicólicos e hidroalcohólicos, pues para ello se requiere por lo
menos la información de un segundo lote para el extracto glicólico. Sin embargo, dado
que el propilenglicol utilizado como solvente de extracción para los extractos glicólicos es
de una polaridad moderadamente alta, el proceso de extracción es más selectivo para
compuestos polares, en comparación con los extractos hidroalcohólicos. Por lo tanto, es
posible esperar un mayor contenido de flavonoides y ácidos fenólicos en el primer tipo de
extractos, lo cual representa cierta ventaja debido a las aplicaciones dermatológicas
(cosméticas) de estos, dada la resistencia a la absorción que presenta la piel.
Por otro lado, al comparar los dos lotes de extracto hidroalcohólico realizados por el
mismo laboratorio (HA-L1 y HA-L2), se observa una diferencia de cerca de tres veces en
contenido de quercetina total (64.4 y 19.8 μg/g respectivamente), con un coeficiente de
variación del 75% entre ambos. Al ser estos extractos usados como materia prima de
diversos productos fitoterapéuticos, esta diferencia en contenido de quercetina puede
propagarse hasta el producto final.
Por su parte, el análisis en productos del mercado a base de C. officinalis, comprendió
soluciones orales (SO) y extractos hidroalcohólicos 1:5 ó 0.2:1 en presentación de gotas,
los cuales están etiquetados como soluciones orales concentradas (SOconc). Para las
primeras, se realizó la comparación entre el producto de tres laboratorios (A, B y C),
realizando una comparación entre tres lotes diferentes del producto realizado por el
laboratorio A (SO-A-L1, SO-A-L2 y SO-A-L3). Para las soluciones orales concentradas
(Extracto hidroalcohólico 0.2:1), se comparó el producto de los laboratorios A, D y E
(SOconc-A-L1, SOconc-D-L1 y SOconc-E-L1) (ver tabla 51).
75
Tabla 51. Determinación de quercetina total en productos comerciales de uso oral a base de C. officinalis.
Quercetina
(μg/g) SD
U (Incertidumbre)
%C.V. (inter-lotes)
So
lucio
ne
s O
rale
s
SO-A
SO-A-L1 0.84 0.07 0.11
66.0% SO-A-L2 3.6 0.05 0.48
SO-A-L3 1.9 0.1 0.25
SO-B-L1 < LC --- --- ---
SO-C-L1 0.76 0.03 0.10 ---
So
lucio
ne
s o
rale
s
co
ncen
trad
as
(go
tas)
SOconc-A-L1 141 1.6 8.4 ---
SOconc-D-L1 16.0 0.2 1.0 ---
SOconc-E-L1 < LC --- --- ---
Como se muestra en la tabla 51, para soluciones orales (SO) a base de caléndula, se
tienen también variaciones en contenido de quercetina, las cuales se aprecian tanto entre
productos de diferentes laboratorios (A, B, y C), como entre los tres lotes del mismo
producto (SO-A-L1, SO-A-L2 y SO-A-L3). De hecho, el contenido de quercetina total
entre estos últimos alcanza un coeficiente de variación del 66%. Para la evaluación del
producto elaborado por el laboratorio B (SO-B-L1), la solución inyectada tuvo un
contenido de quercetina total cercano al límite de detección, lo que indica un contenido
aproximado en el producto de 0.03 μg/g, lo cual es bastante bajo respecto a los otros
productos analizados de la misma categoría.
Resultados similares se encontraron al evaluar las soluciones orales concentradas a
base de caléndula, pues el contenido de quercetina total entre el producto elaborado por
los tres laboratorios analizados, exhibe grandes diferencias entre sí. Se observa en la
tabla 51, que para el producto SOconc-A-L1, el contenido de quercetina total es de 141
μg/g, para el producto SOconc-D-L1 es de 16.0 μg/g, mientras que en para el producto
SOconc-E-L1, la solución resultante exhibe un contenido de quercetina cercano al límite de
detección, lo que indica un contenido aproximado en producto de 0.08μg/g.
Como se observa, la variación en estos productos puede ser tal, que incluso el producto
SOconc-A-L1 (extracto hidroalcohólico 0.2:1) exhibe un contenido de quercetina (141 μg/g)
superior que el de los dos lotes evaluados del extracto hidroalcohólico 1:1 (64.4 y 19.8
μg/g), en donde este último por representar un mayor contenido de droga (flores de
caléndula), debería exhibir un contenido aproximadamente, cinco veces mayor. De igual
manera, la evaluación del producto SOconc-E-L1 arrojó un contenido total de quercetina
aproximado de 0.08 μg/g, lo cual puede afectar directamente la eficacia del mismo.
76
Si bien es cierto que existe una variación en el contenido de metabolitos activos en
matrices de origen natural, que puede ser influenciada por diversos factores que
dependen de la naturaleza de la planta (droga utilizada, variación natural entre plantas,
quimio-variedad); de los factores como la siembra, la cosecha, almacenamiento y de los
factores tecnológicos, que se encuentran relacionados con los procesos de secado y
extracción, al observar los resultados obtenidos tanto para los extractos utilizados como
materia prima, como para las soluciones orales comercializadas, es posible pensar en
factores adicionales que conlleven a estas discrepancias, como son la falta de un control
de calidad adecuado que de cuenta de la homogeneidad con la que se comercializan
estos productos.
En la figura 32, se muestra el registro fotográfico de la extracción de las muestras de los
tres laboratorios fabricantes del extracto hidroalcohólico 0.2:1 (SOcon-A-L1, SOconc-D-L1 y
SOconc-E-L1). Al comparar las imágenes con los resultados expuestos con la tabla 51, es
posible relacionar el contenido de quercetina obtenido, con el aspecto del extracto
analizado. En este caso, el producto SOconc-E-L1, el cual exhibió el más bajo contenido
de quercetina total (cercano a 0.08 μg/g), corresponde a la muestra cuya apariencia era
la de un líquido transparente de color verde-amarillento, lo cual difiere bastante con la
apariencia de los otros dos extractos de C. officinalis analizados; mientras que el
producto SOconc-A-L1 con mayor contenido de quercetina (141 μg/g), es aquel que
exhibía mayor turbidez y el color caramelo más intenso, lo que da cuenta de la
heterogeneidad con la que se pueden estar comercializando estos productos
actualmente.
Figura 32. Extracción de los extractos hidroalcohólicos 0.2:1 analizados (soluciones orales concentradas) (A) SOconc-A-L1; (B) SOconc-D-L1 (C) SOconc-E-L1.
77
Esto resultados contrastan con la preocupación internacional por regular cada vez más
los productos comercializados a base de plantas medicinales, en donde el objetivo es
asegurar una producción de calidad controlada y reproducible.
Es por tanto que se hace necesaria una evaluación a fondo de la calidad con la cual los
extractos a base de C. officinalis se están comercializando, al igual que los productos
fitoterapéuticos a base de esta planta dentro del mercado colombiano, utilizando como
herramienta, metodologías como la presentada en este trabajo, pues al parecer existen
anomalías o casos en los cuales estos productos no serían capaces de suplir las
necesidades del consumidor, debido a la irregularidad y falencias en el contenido.
Estos estudios deberían realizarse de la mano de las autoridades regulatorias
competentes, quienes son las encargadas de dar un juicio y determinar las acciones a
seguir en el caso de encontrar anomalías relacionadas con la calidad del producto, pues
si bien, el muestreo realizado en el presente trabajo contó con un bajo número de
muestras, se evidencia la existencia de un problema de fondo tal, que alcanza a
percibirse en un tamaño de muestra tan reducido y en donde los resultados repercuten y
cuestionan la eficacia de algunos productos comercializados actualmente.
78
8. CONCLUSIONES
El Diseño Central Compuesto (DCC) fue adecuado para la determinación de las
condiciones óptimas de hidrólisis de los flavonoides glicósidos a partir de extractos
glicólicos, hidroalcohólicos y soluciones orales a base de Calendula officinalis.
Durante la optimización de la hidrólisis, se evidenció un efecto de la matriz en la que se
encuentran los flavonoides glicósidos sobre las condiciones óptimas de este proceso,
observándose el requerimiento de condiciones menos drásticas cuando se parte de los
extractos y más drásticas cuando se parte de las soluciones orales.
Las metodologías desarrolladas para la cuantificación de quercetina total a partir de
extractos glicólicos, hidroalcohólicos y soluciones orales a base de C. officinalis muestran
ser selectivas, lineales, precisas y exactas, en el rango entre 0.9 y 4.5 μg/mL, por lo cual
se convierten en una herramienta confiable para su uso con fines de control de calidad.
La incertidumbre estándar asociada a la cuantificación de quercetina total a partir de
extractos glicólicos, hidroalcohólicos y soluciones orales a base de C. officinalis fue de
2.055, 1.876 y 0.258 μg/g respectivamente, siendo posible su expresión en función de la
concentración de quercetina hallada para cada producto.
La incertidumbre debida a los pretratamientos y al procedimiento, son las de mayor
contribución a la incertidumbre final del resultado, siendo la variación en el proceso de
hidrólisis la que afecta en mayor medida.
El contenido de quercetina encontrado en dos lotes diferentes del extracto
hidroalcohólico 1:1 a base de C. officinalis, presentan una alta variación (%C.V. 75%), al
igual que entre tres lotes diferentes para una solución oral, en donde los resultados
mostraron un coeficiente de variación del 66%, con lo cual se evidencia una falta de
homogeneidad entre productos del mismo fabricante, así como entre productos
elaborados por distintos laboratorios.
79
9. RECOMENDACIONES
La evaluación de quercetina total en una nueva matriz, debería incluir un trabajo previo
de optimización de la hidrólisis de los flavonoides glicósidos.
Aunque la utilización de un equipo de microondas no es muy aplicada a fines de control
de calidad (alto costo de manutención y calificación), pueden realizarse diseños
experimentales para la hidrólisis de las matrices trabajadas, de tal forma que se puedan
comparar los resultados óptimos del proceso con calentamiento convencional y bajo
radiación de microondas.
Es posible realizar la cuantificación de las otras dos agliconas presentes en los extractos
de C. officinalis (kaempferol e isorhamnetina), de acuerdo a las metodologías propuestas,
de tal forma que pueda determinarse el contenido total de agliconas, siendo necesario
primero, evaluar los parámetros de validación en el rango de concentraciones esperado.
La normalización de los extractos elaborados a base de C. officinalis, puede considerarse
una manera con la cual las deficiencias y heterogeneidades en contenido de quercetina
total demostradas en el presente trabajo puedan verse superadas.
Es necesario una evaluación más profunda de la situación actual de estos productos a
nivel nacional, de la mano de las autoridades regulatorias competentes, además de
estudios que relacionen la actividad de la C. officinalis con el contenido de flavonoides,
de tal manera que sea posible determinar un contenido mínimo de estos tanto en los
extractos como en los productos del mercado a base de esta planta, y así minimizar el
impacto de la variabilidad de contenido sobre su eficacia.
80
10. REFERENCIAS
A.E.F.I. (Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria). Validación de Métodos
Analíticos. 2001. 46-94.
Ahmadi, M.; Vahabzadeh, F.; Bonakdarpour, B.; Mofarrah, E.; Mehranian, M.; Application
of the central composite design and response surface methodology to the advanced
treatment of olive oil processing wastewater using Fenton’s peroxidation. Journal of
Hazardous Materials B, 123, 2005, 187–195.
Amoian, B.; Moghadamnia, A.A.; Mayandarani, M.; Amoian, M.M.; Mehrmanesh, S.; The
effect of Calendula extract toothpaste on the plaque index and bleeding in gingivitis. Res.
J. Med. Plant, 4(3), 2010, 132-140.
AOAC, Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary
Supplements and Botanicals. 2012, 22.
Aquino, R.; Morelli, S.; Tomaino, A.; Pellegrino, M.; Saija, A.; Grumetto, L.; Puglia, C.;
Ventura, D.; Bonina, F.; Antioxidant and photoprotective activity of a crude extract of
Culcitium reflexum H.B.K. leaves and their major flavonoids. Journal of
Ethnopharmacology, 79, 2002, 183–191.
Aslan, N.; Application of response surface methodology and central composite rotatable
design for modeling and optimization of a multi-gravity separator for chromite
concentration. Powder Technology, 185, 2008, 80–86.
Attard, A; Cuschieri, A; In vitro immunomodulatory activity of various extracts of Maltese
plants from the Asteraceae family. J. Med. Plant. Res., 3(6), 2009, 457-461.
Bezakova, L.; Masterova, I.; Paulikova, I.; et al. Inhibitory activity of isorhamnetina
glycosides from Calendula officinalis L. on the activity of lipoxygenase. Pharmazie. 51(2),
1996, 126-127.
Bilia, A.R.; Bergonzi, M.C.; Gallori, S.; Mazzi, G.; Vincieri, F.F.; Stability of the
constituents of Calendula, Milk-thistle and Passionflower tinctures by LC-DAD and LC-
MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 30, 2002, 613–624.
Bauer, R. Quality criteria and standarization of phytopharmaceuticals: can aceptable drug
standars be achieved?. Drug Information Journal, 32, 1998, 101-110.
Cañigueral, S.; La fitoterapia:¿una terapéutica para el tercer milenio?. Revista de
fitoterapia, 2(2), 2002, 101-121.
81
Cañigueral, S., Dellacassa, E., Bandoni, A.L., Plantas Medicinales y
Fitoterapia:¿indicadores de dependencia o factores de desarrollo?. Lat. Am. J. Pharm.,
22 (3), 2003, 265-278.
Ćetković, G.S.; Djilas, S.M.; Ćanadanović-Brunet, J.M.; Tumbas, V.T.; Antioxidant
properties of marigold extracts. Food Res. Int., 37, 2004, 643-650.
Chandran, P.K.; Kuttan, R.; Effect of Calendula officinalis flowers extract on acute phase
proteins, antioxidant defense mechanism and granuloma formation during thermal burns.
J. Clin. Biochem. Nutr., 43, 2008, 58–64.
Chandran, P.K..; Kuttan, G.; Kuttan, R.; Anti-inflammatory activity of flower extract of C.
officinalis Linn. and its possible mechanism of action. Ind. J. Exp. Biol., 47, 2009, 113-
120.
Chakraborthy, G.S.; Ghorpade, P.M.; Determination of quercetin by hptlc in “Calendula
officinalis” extract. International Journal of Pharma and Bio Sciences 1(1), 2010, 1-4.
Chen, J.X.; Zhang, Y.; Rapid Microwave-Assisted Hydrolysis for Determination of Ginkgo
Flavonol Glycosides in Extracts of Ginkgo biloba Leaves. Journal of Chromatographic
Science, 46, 2008, 117-121.
DECRETO NÚMERO 2266 DE 2004, Titulo 1, Capitulo 1, Articulo 2, Definiciones. 15 de
Julio de 2004.
D’Mello, P.M.; Joshi, U.J.; Shetgiri, P.P.; Dasgupta, T.K.; Darji, A.K.; A Simple HPLC
Method for Quantitation of Quercetin in Herbal Extracts. Journal of AOAC International,
94 (1), 2011, 100-105.
Duke, J.A.; Bogenschutz-Godwin, M.J.; Du Celliar, J.; Duke, P.A.K.; Hand Book
ofMedicinal Herbs, Ed. 2, CRC Press, Boca Raton, 2002, 139–140.
Duran, V.; Matic, M.; jovanovc, M.; Mimica, N.; Gajinov, Z.; Poljacki, M.; Boza, P.; Results
of the clinical examination of an ointment with marigold, (Calendula officinalis) extract in
the treatment of venous leg ulcers. Int. J. Tissue React., 27(3), 2005, 101-106.
ECHA - Technical and Scientific Reports. March 2013:
http://echa.europa.eu/documents/10162/13628/uvcb_modelling_methodology_en.pdf.
Revisada 19 de enero 2014.
EMEA (The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products), Doc.
Ref.:MEA/HMPC/179282/2007, Calendula officinalis L., flos, London, March, 2008.
82
ESCOP MONOGRAPHS. (European Scientific Cooperative on Phitoteraphy). Calendula
flos (Calendula flower). 2nd Ed., 2003, 58-61.
European Pharmacopoeia. Calendula flowers. Vol 2, 6th Ed., 2008, 1398-1400.
Fahlman, B.M.; Krol, E.S.; UVA and UVB radiation-induced oxidation products of
quercetin. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 97, 2009, 123–131.
FDA Food and Drug Administration. 182.1 Substances that are generally recognized as
safe. 21CFR. 182.10. Consultado 19 de enero 2014.
FDA, Guidelines for the Validation of Chemical Methods for the FDA Foods Program.
Version 1.0; 2012, 26.
Fonseca, Y.M.; Catini, C.D.; Vicentini, F.T., Nomizo, A.; Gerlach, R.F.; Fonseca, M.J.
Protective effect of C. officinalis extract against UVB-induced oxidative stress in skin:
Evaluation of reduced glutathione levels and matrix metalloproteinase secretion. J.
Ethnopharmacol., 127, 2010, 596-601.
Guevara, H.A.; Luengas, P.E.; Garavito, G., Revisión documental de los productos
naturales legalmente autorizados para su mercadeo en Colombia. Colombia Médica, Vol.
41(2), 2010, 134.
Gonçalves, C.; Carvalho, J.J.; Azenha, M.A.; Alpendurada, M.F.; Optimization of
supercritical fluid extraction of pesticide residues in soil by means of central composite
design and analysis by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of
Chromatography A, 1110, 2006, 6–14.
Hecker, H.; Johannisson, R.; Koch, E.; Siegers, C .P.; In vitro evaluation of the cytotoxic
potential of alkylphenols from Ginkgo biloba L. Toxicology, 177, 2002, 167–177.
Huang, J.; Zhang, Z.; Microwave-assisted extraction of quercetin and acid degradation of
its glycosides in Psidium guajava leaves. Analytical Science, 20, 2004, 395-397.
ICH HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE. VALIDATION OF ANALYTICAL
PROCEDURES: TEXT AND METHODOLOGY Q2(R1). Current Step 4 version. 2005.
ICONTEC Norma Técnica Colombiana NTC-ISO / IEC 17025: Requisitos generales para
la competencia de los laboratorios de ensayos y calibración. 2005.
ICONTEC ISO 3534: Estadística. Vocabulario y símbolos. Parte 1: Términos relativos a
probabilidades y estadística general. 1995.
INVIMA, Consulta Datos de Productos, Fitoterapéutico, caléndula.
83
Kuehl, R.O.; Diseño de Experimentos: Principios estadísticos de diseño y análisis de
investigación. 2da Ed., THOMSOM LEARNING, The University of Arizona, 2001, 431-
447.
Kuttan, R.; Preethi, K.C.; Hepato and reno protective action of Calendula officinalis L.
flower extract. Indian J Exp Biol., 47(3), 2009,163-168.
Lagarto, A.; Bueno, V.; Guerra, I.; Valdés, O.; Vega, Y.; Torres, L.; Acute and subchronic
oral toxicities of Calendula officinalis extract in Wistar rats. Experimental and Toxicologic
Pathology, 63, 2011, 387–391.
Leach, M.J.; C. officinalis and wound healing: A systematic review. Wounds, 20(8), 2008,
236-243.
Liu, H.P.; Shi, X.F.; Zhang, Y.Ch.; Li, Z.X.; Zhang, L.;Wang, Z.Y.; Quantitative Analysis of
Quercetin in Euphorbia helioscopia L by RP-HPLC. Cell Biochem Biophys, 61, 2011, 59–
64.
Liu, J.J.; Li, S.P.; Wang, Y.T.; Optimization for quantitative determination of four
flavonoids in Epimedium by capillary zone electrophoresis coupled with diode array
detection using central composite design. Journal of Chromatography A, 1103, 2006,
344–349.
Makris, D.P.;Rossiter, J.T.; Hydroxyl Free Radical-Mediated Oxidative Degradation of
Quercetin and Morin: A Preliminary Investigation. Journal of Food Composition and
Analysis, 15, 2002, 103-113.
Marcano, D.; Hasegawa, M; Fitoquímica orgánica. Consejo de Desarrollo Científico y
Humanístico. Universidad Central de Venezuela. 2da Ed. Editorial Torino. 2002. 137-140.
Maroto, A.; Incertidumbre en métodos analíticos de rutina. Universitat Rovira I Virgili.
Facultat de Química. Tarragona. 2002.
Matysik, G.; Wojciak-Kosior, M.; Paduch, R., The influence of Calendula Officinalis flos
extracts on cells cultures, and the chromatographic analysis of extracts, Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 38, 2005, 285-292.
Menghinello, P.; Cucchiarini, L.; Palma, F.; Agostini, D.; Dachà, M.; Stocchi, V.;
Simultaneous analysis of flavonoid aglycones in natural products using an RP-HPLC
method. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 22(19), 1999, 3007–3018.
84
Mesbah, K.M.; Khalifa, S.I; El-Gindy, A.; Tawfik, K.A.; HPLC determination of certain
flavonoids and terpene lactones in selected Ginkgo biloba L. phytopharmaceuticals. Il
Farmaco, 60, 2005, 583–590.
Montgomery, D.C.; Diseño y Análisis de Experimentos. 2da Ed., LIMUSA WILEY.
Universidad Estatal de Arizona, 2004, 427-466.
Muley, B.P.; Khadabadi, S.S.; Banarase, N.B.; Phytochemical Constituents and
Pharmacological Activities of Calendula officinalis Linn (Asteraceae): A Review. Tropical
Journal of Pharmaceutical Research, 8 (5), 2009, 455-465.
Normas Farmacológicas, Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos,
República de Colombia, Bogotá D.C. 2006.
NTC-ISO/IEC 17025. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA. Requisitos generales para la
competencia de los laboratorios de ensayo y calibración. ICONTEC. 2005.
Nuutila, A.M.; Kammiovirta, K.; Oksman-Caldentey, K.-M; Comparison of methods for the
hydrolysis of flavonoids and phenolic acids from onion and spinach for HPLC analysis.
Food Chemistry, 76, 2002, 519–525.
Olszewska, M.; Quantitative HPLC analysis of flavonoids and chlorogenic acid in the
leaves and inflorescences of Prunus serotina EHRH. Acta Chromatographica, 19, 2007,
253-269.
Paniwnyk, L.; Beaufoy, E.; Lorimer, J.P.; Mason, T.J.; The extraction of rutin from flower
buds of Sophora japonica. Ultrason. Sonochem. 8, 2001, 299–301.
Pulido, H.G.; Salazar, R.V.; Análisis y diseño de experimentos. McGraw-Hill
Interamericana. México D.F., 2004, 472-477.
Radioza, S.A.; Iurchak, L.D.; Antimicrobial activity of Calendula L. plants. Mikrobiol. Z.,
69, 2007, 21-25.
Roopashree, T.S.; Raman, D.; Shobba, R.RH.; Narendra, C.; Antibacterial activity of
antipsoriatic herbs: Cassia tora, Momordica charantia and Calendula officinalis. Int. J.
Appl. Res. Nat. Prod., 1(3), 2008, 20-28.
Patrick, K.F.; Kumar, S.;, P. A. D. Edwardson, P.A.; Hutchinson, J.J.; Induction of
vascularisation by an aqueous extract of the flowers of Calendula officinalis L. the
European marigold. Phytomedicine, 3(1), 1996, 11-18.
Preethi, K.C.; Kuttan, R.; Wound healing activity of flower extract of Calendula officinalis.
J. Basic. Clin. Physiol. Pharmacol., 20(1), 2009, 73-79.
85
Rajalakshmi, P.V.; Senthil, K.K.; Direct HPLC analysis of quercetin in exudates of abutilon
indicum (linn) Malvaceae. Journal of Pharmaceutical Science and Technology, Vol 1 (2),
2009, 80-83.
Ramos, A.; Edreira, A.; Vizoso, A.; Betancourt, J; López, M.; Décalo, M.; Genotoxicity of
an extract of Calendula officinalis L.. Journal of Ethnopharmacology, 61, 1998, 49–55.
Ruiz, S.J.; Ávila, L.F; Incertidumbre de la medición: Teoría y práctica. L & S consultores
C.A. 1 Ed., 2001. 2-4.
Rusu, M.A.; Tamas, M.; Puica, C.; Roman, I.; Sabadas, M.; The hepatoprotective action
of ten herbal extracts in CCl4 intoxicated liver. Phytother. Res., 19, 2005, 744–749
Silva, E.J.; Concalves, E.S.; Aquiar, F.; Evencio, L.B.; Lyra, M.M.; Coelho, M.C.; Fraga,
M.C.; Wanderly, A.G.;. Toxicological studies on hydroalcohol extract of Calendula
officinalis L. Phytotherapy Research, 21, 2007, 332–336.
Sujatha, K.; Chitra, K.; Polisetti, H.; Karri, S.; Nimmalapudi, S.; Reddy, C.U.;
Standardization of Calendula officinalis linn with reference to quercetin by high
performance thin layer chromatography. International Journal of Research in Pharmacy
and Chemistry, 1(4), 2011, 789-792.
Tungjai, M; Poompimon, W.; Loetchutinat, C.; Kothan, S.; Dechsupa, N.; Mankhetkorn,
S.; Spectrophotometric Characterization of Behavior and the Predominant Species of
Flavonoids in Physiological Buffer: Determination of Solubility, Lipophilicity and Anticancer
Efficacy. The Open Drug Delivery Journal, 2, 2008, 10-19.
Wang, F.M.; Yao, T.W.; Zeng, S.; Determination of quercetin and kaempferol in human
urine after orally administrated tablet of ginkgo biloba extract by HPLC. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 33, 2003, 317-321.
WHO Monographs on selected medicinal plants. Geneva, Vol 2., 2002, 35-42.
Ukiya, M.; Akihisa, T.; Yasukawa, K.; Tokuda, H.; Suzuki, T.; Kimura, Y.; Anti-
inflammatory, anti-tumor-promoting, and cytotoxic activities of constituents of marigold (C.
officinalis) flowers. J. Nat. Prod., 69, 2006, 1692-1696.
Ulbritch, C.; Basch, E.; Bent, S.; Foppa, I.; Haskmi, S; Kroll, D.; Mele, M.; Szapary, P.;
Vora, M.; Yong, S., Marigold (Calendula officinalis L.): An Evidence-Based Systematic
Review by the Natural Standard Research Colaboration, Journal of Herbal
Pharmacotherapy, Vol. 6, 2006, 135-159.
86
USP (35). The United States Pharmacopoeial Convention. 2012. Baltimore: City Press.
Extracto en Polvo de Ginkgo, 1457-1460.
USP (35).. The United States Pharmacopoeial Convention. 2012. Baltimore: City Press.
Exractos botanicos <565>, 243-244.
USP (35).. The United States Pharmacopoeial Convention. 2012. Baltimore: City Press.
Validación de procedimientos farmacopeicos <1225>, 967-971.
Valdés, H.L.; García R.P.; Calendula officinalis. Revista Cubana de Farmacia, 33(3),
1999, 188-194.
Yoshikawa, M.; Murakami, T.; Kishi, A.; Medicinal flowers. III. Marigold. (1): hypoglycemic,
gastric emptying inhibitory, and gastroprotective principles and new oleanane-type
triterpene oligoglycosides, calendasaponins A, B, C, and D, from Egyptian Calendula
officinalis. Chem Pharm Bull, 49 (7), 2001, 863-870.
Zhou, A.; Kikandi, S.; Sadik, O.A.; Electrochemical degradation of quercetin: Isolation and
structural elucidation of the degradation products. Electrochemistry Communications, 9,
2007, 2246–2255.
Zitterl-Eglseer, K.; Sosa, S.; Jurenitsch, J.; et al. Anti-edematous activities of the main
triterpendiol esters of marigold (Calendula officinalis L.). J Ethnopharmacol, 57(2), 1997,
139-144.
87
Anexo 1. Elución en condiciones isocráticas de quercetina a partir de extracto glicólico de Calendula officinalis hidrolizado, (A) %MeOH 50% y (B) %MeOH 40%.
88
Anexo 2. Elución de quercetina a partir de extracto glicólico de Calendula officinalis hidrolizado, (A) Temperatura de 25°C, (B) Temperatura de 30°C, (C) Temperatura de
35°C, se observa resolución de interferente a 254nm.
89
Anexo 3. Cromatograma para determinar tiempo total de elución con lavado a 100% MeOH.
90
Anexo 4. (A) Extracto hidroalcohólico de C. officinalis control; (B) neutralización con TEA;
(C) Solución oral de C. officinalis control; (D) neutralización con bicarbonato de sodio.
91
Anexo 5. Cromatograma de quercetina estándar usado como control en ensayos de selectividad.
Anexo 6. Cromatograma de la hidrólisis ácida (HCl 0.1N) de quercetina estándar.
Quercetina
370nm
254nm
92
Anexo 7. Cromatograma de la hidrólisis básica (NaOH 0.01N) de quercetina estándar.
Anexo 8. Cromatograma de la oxidación con H2O2 3% de quercetina estándar.
Quercetina
370nm
254nm
370nm
254nm
93
Anexo 9. Cromatograma de la degradación UV 254nm de quercetina estándar.
Anexo 10. Cromatograma de la degradación UV 366nm de quercetina estándar.
370nm
254nm
254nm
370nm
94
Anexo 11. Cromatograma del extracto hidrolizado control para selectividad frente a productos de degradación.
Anexo 12. Cromatograma de la hidrólisis ácida del extracto hidrolizado de Calendula officinalis.
254nm
370nm
95
Anexo 13. Cromatograma de la hidrólisis básica (NaOH 0.1N) del extracto hidrolizado de C. officianlis.
Anexo 14. Cromatograma de la oxidación con H2O2 3% del extracto hidrolizado de C. officinalis.
96
Anexo 15. Cromatograma de la degradación UV (254nm) del extracto hidrolizado de C. officinalis.
Anexo 16. Cromatograma de la degradación UV (370nm) del extracto hidrolizado de C. officinalis.
97
Anexo 17. Cromatograma de la mezcla de posibles excipientes en una formulación oral (sin extracto de caléndula).
Anexo 18. Cromatograma de la mezcla de los posibles excipientes de una formulación oral hidrolizados (HCl 1.0M)
98
Anexo 19. Cromatograma de la mezcla hidrolizada de los posibles excipientes de una formulación oral y el extracto de C. officinalis.