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UTILIZACIÓN DE FLAVONOIDES EN RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES
PARA LA CONSERVACIÓN DE PRODUCTOS ACUÍCOLAS
David Guillermo Piedrahita Márquez
Universidad Nacional de Colombia
Facultad De Ciencias Agrarias, Posgrado de Ciencia Y Tecnología de Alimentos
Bogotá D.C, Colombia
2017
UTILIZACIÓN DE FLAVONOIDES EN RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES
PARA LA CONSERVACIÓN DE PRODUCTOS ACUÍCOLAS
David Guillermo Piedrahita Márquez
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Magister en Ciencia y Tecnología De Alimentos
Director:
PhD., Héctor Suarez Mahecha
Codirector:
PhD., Jairo Humberto López
Línea de Investigación:
Bioconservación de productos cárnicos y acuícolas
Grupo de Investigación:
Grupo Acuicar
Grupo de Investigación Ciencia y Tecnología de Productos Cárnicos y Acuícolas
Universidad Nacional de Colombia
Facultad De Ciencias Agrarias, Posgrado de Ciencia y Tecnología de Alimentos
Bogotá, Colombia
2017
A mis padres que me han apoyado con su
cariño, comprensión y ayuda útiles todos los
aspectos académicos y personales a lo largo
de mi vida
A mi director de tesis por su apoyo
incondicional y por su guía durante la
realización del trabajo de tesis
Al grupo de investigación en ciencia y
tecnología de productos cárnicos y acuícolas
por proveerme los medios para llevar a cabo
mi proyecto, por permitirme adquirir
conocimientos útiles para continuar
progresando en mi carrera
Al Jardín Botánico de Bogotá por la
financiación de mi proyecto de maestría y por
darme un espacio para exponer mis resultados
de investigación en un evento y revista con
prestigio nacional.
Al ICTA y al posgrado en ciencia y tecnología
de alimentos por darme una oportunidad en el
programa de posgrado
“La fortuna juega a favor de una mente
preparada”.
Louis Pasteur
Resumen y Abstract VII
Resumen
Las matrices acuícolas se caracterizan por su amplia gama de constituyentes,
convirtiéndolas en alimentos con un alto valor nutricional para el organismo humano. No
obstante son susceptibles a la degradación por parte de microorganismos patógenos,
procesos enzimáticos y reacciones de carácter oxidativo, lo cual hace necesario buscar
alternativas para la conservación de los productos acuícolas. Como alternativa a los
procesos tradicionales se ha recurrido al uso de recubrimientos comestibles, estos se han
elaborado con diversos biopolímeros y metabolitos que les han conferido propiedades
barrera y una notable bioactividad. Entre las sustancias bioactivas se destacan los
extractos etanólicos de propóleos los cuales tienen un amplio rango de acción frente a
microorganismos patógenos y especies reactivas de oxígeno. Por el otro lado se ha
empleado una macromolécula como el quitosano debido sus propiedades mecánicas y a
la capacidad que tiene de potenciar la bioactividad de otras moléculas .En el pasado se
han usado ambas sustancias en distintas formulaciones de películas comestible y han
aparecido inconvenientes que han obstaculizado su aplicación como la baja
permeabilidad, la liberación no controlada, el aumento de algunos procesos oxidativos y la
alteración de las propiedades sensoriales. En este estudio se buscó diseñar una
formulación para recubrimientos comestibles a base de extracto etanólico de propóleos,
primero se encapsuló el extracto en maltodextrina, después se diseñaron películas a base
de quitosano y el encapsulado para evaluar sus propiedades mecánicas y efecto barrera
frente al vapor de agua y finalmente la formulación se aplicó en forma de recubrimiento
para proteger la matriz acuícola y se estudió su efecto en la vida útil. La matriz fue capaz
de proteger al pescado de procesos degenerativos y redujo el impacto de los agentes
externos sobre el producto acuícola
Palabras clave: Recubrimiento Comestible, Quitosano, Extracto Etanólico de
Propóleos (EEP), Vida útil, Secado Por Aspersión, Películas Comestibles
Capítulo 1 VIII
Abstract
Aquaculture matrices are characterized by their wide range of beneficial constituents for
the body, which becomes part of the diet. But nevertheless they are susceptible to face
damage due to the action of microorganisms, enzymatic processes and oxidation reactions,
which makes it necessary to find alternatives for the conservation of aquaculture products.
As an alternative to the traditional processes scientist have studied edible coatings, these
have been developed with various biopolymers and metabolites that have given them
notable barrier properties and bioactivity. Among these materials chitosan and the
flavonoids from ethanolic propolis extract are some of the most effective ones, they have
very good mechanical properties and a broad spectrum of action; the previously mentioned
the past two substances have been used in different formulations of edible films and it have
appeared drawbacks that are hampering its application as: Low permeability the
uncontrolled release, increasing some oxidative processes and impaired sensory
properties. Therefore we sought to design an optimal formulation for edible coatings with
chitosan and propolis, first the extract is encapsulated in maltodextrin, after that, edible
films based on chitosan and the encapsulated propolis were designed to evaluate their
mechanical properties and barrier effect and finally the formulation was applied as an edible
coating to protect the aquaculture matrix and its effect in the shell life of the fish was studied.
The matrix was able to protect the fish from degenerative processes and reduced the
impact of external agents on the aquaculture product
Keywords: Edible coatings, Chitosan, ethanolic extract propolis (EEP), shell life,
spray drying, edible films
Contenido IX
Contenido Pág
Resumen ....................................................................................................................... VII
Abstract........................................................................................................................ VIII
Lista de figuras ........................................................................................................................... XII
Lista de tablas ........................................................................................................................... XVI
Introducción .................................................................................................................... 1
1. ARTÍCULO DE REVISION: QUIMICA, ENCAPSULACION Y USO DE LOS EXTRACTOS ETANOLICOS DE PROPOLEOS PARA LA CONSERVACION DE ALIMENTOS .................................................................................................................... 3
1.1 Resumen ......................................................................................................... 3 1.2 Abstract ........................................................................................................... 4 1.3 Generalidades De Propóleos ........................................................................... 5 1.4. Flavonoides ......................................................................................................... 5
1.4.1. Características químicas y propiedades ................................................... 6 1.4.2. Extracción de flavonoides .......................................................................... 8 1.4.3. Métodos de separación e identificación ..................................................... 9 1.4.4 Bioactividad y propiedades funcionales ..................................................... 9
1.5. Quitosano ...................................................................................................... 11 1.5.1. Características químicas y propiedades ................................................... 11
1.6. Microencapsulación de bioactivos ..................................................................... 13 1.6.1. Generalidades ......................................................................................... 13 1.6.2. Encapsulación vía Spray- Drying ............................................................. 15
1.7. Películas y recubrimientos comestibles ............................................................. 17 1.8. Antecedentes .................................................................................................... 19
1.8.1. Caracterización de los extractos etanólicos de propóleos ........................ 19 1.8.2 Desarrollo de películas y recubrimientos comestibles con quitosano, extracto etanólicos de propóleos y flavonoides .................................................. 21 1.8.3 Desarrollo de películas y recubrimientos a base de bioactivos de propóleos .......................................................................................................... 24
1.9. Conclusiones ..................................................................................................... 27 1.10. Referencias ...................................................................................................... 27
2. EVALUACION FISICOQUIMICA Y MICROBIOLOGICA DE LA ENCAPSULACION VIA SPRAY DRYING DE EXTRACTOS ETANOLICOS DE PROPOLEOS.
Contenido IX
2.1. Resumen ........................................................................................................... 33 2.2. Abstract ............................................................................................................. 34 2.3. Introducción ....................................................................................................... 34 2.4.Materiales y métodos ......................................................................................... 34
2.4.1. Obtención del extracto etanólico de propóleos (EEP) ............................... 36 2.4.2. Contenido de fenoles totales por el método de Folin Ciocalteu ................. 36 2.4.3. Estimación de la actividad antioxidante de polen y propóleos a través de la inactivación del radical DPPH ........................................................................ 36 2.4.4. Evaluación de actividad antimicrobiana por el test de difusión en agar Mueller-Hinton ................................................................................................... 37 2.4.5. Preparación y caracterización de los microencapsulados ........................ 38 2.4.6. Evaluación de la morfología por Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) ................................................................................................................ 40 2.4.7. Análisis Estadístico ................................................................................. 40
2.5. Resultados y discusión ...................................................................................... 40 2.6. Conclusiones ..................................................................................................... 51 2.7. Agradecimientos ................................................................................................ 52
2.8. Referencias ............................................................................................................. 53
3. ELABORACIÓN y CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE PELÍCULAS COMESTIBLES A PARITR DE QUITOSANO Y EXTRACTOS ETANÓLICOS DE PROPOLEO ENCAPSULADOS EN MALTODEXTRINA ................................................ 56
3.1. Resumen ....................................................................................................... 56 3.2. Abstract ............................................................................................................. 57 3.3. Introducción ....................................................................................................... 57 3.4. Materiales y métodos ........................................................................................ 60
3.4.1. Elaboración de películas comestibles ...................................................... 60 3.4.2. Contenido de humedad y espesor ........................................................... 61 3.4.3. Propiedades mecánicas .......................................................................... 61 3.4.4. Permeabilidad al vapor de agua .............................................................. 61 3.4.5. Color ....................................................................................................... 62 3.4.6. Evaluación de la morfología por Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) ................................................................................................................ 62 3.4.7. Análisis Estadístico.................................................................................. 62
3.5. Resultados y discusión .................................................................................. 62 3.6. Conclusiones ................................................................................................. 74 3.7. Agradecimientos ............................................................................................ 75 3.8. Referencias ....................................................................................................76
4. DETERMINACION DE LA VIDA UTIL DE FILETES DE CACHAMA BLANCA (Piaractus brachypomus) UTILIZANDO RECUBRIMIENTO COMESTIBLE
CONTENIENDO BIOACTIVOS ....................................................................................... 79
4.1 Resumen ............................................................................................................ 79 4.2. Abstract ............................................................................................................. 80 4.3. Introducción ....................................................................................................... 80 4.4. Materiales Y Métodos ........................................................................................ 82
4.4.1Obtención de filetes de cachama ............................................................... 82 4.4.2. Proceso de micro encapsulación ............................................................. 82 4.4.3. Elaboración de los recubrimientos comestibles ....................................... 83
Contenido IX
4.4.4. Extracción de compuestos lipídicos vía Soxhlet ...................................... 84 4.4.5 Prueba del ácido 2-Tiobarbiturico (TBA) ................................................... 84 4.4.5.1. Curva De Calibración............................................................................ 84 4.4.5.2. Prueba de TBA por el método de extracción ........................................85 4.4.6. Prueba del índice de peróxidos por el método yodo métrico .................... 85 4.4.7. Determinación del contenido de nitrógeno volátil total (BVNT) ................ 85 4.4.8. Determinación microbiológica de las muestras de cachama .................... 86 4.4.9. Determinación de valores de pH en las muestras de cachama ........... 86 4.4.10. Análisis de perfil de textura (TPA) para la carne de cachama ................ 87 4.4.11. Análisis Sensorial .................................................................................. 88 4.4.12. Análisis Estadístico ................................................................................ 88
4.5. Resultados y discusión .................................................................................. 88 4.6. Conclusiones ............................................................................................... 100 4.7. Referencias ................................................................................................. 101
5. Conclusiones Y Recomendaciones ....................................................................... 107 5.1. Conclusiones ................................................................................................... 107 5.2. Recomendaciones ........................................................................................... 109
6. Bibliografía ................................................................................................................ 33
Capítulo 1 XII
Lista de figuras
Pág.
Figura 1.1 Estructura de los flavonoides, tomado de Lillo et al (2008) .............................................................................................................................. 6
Figura 1.2. . Clases de flavonoides de acuerdo a su estructura química, tomado de Falcone et al (2012) ....................................................................................................................... 7
Figura 1.3. Flavonoides comunes en propóleos, tomado de Viuda-Martos et al(
2008 ................................................................................................................................ 8
Figura 1.4. Estructura del quitosano, tomado de Periayah et al
(2016) ............................................................................................................................. 11
Figura 1.5. Tipos de morfología de las micro cápsulas, tomada de Villacrez Yepes (2012) ............................................................................................................................................. 14
Figura 1.6. Diagrama de un equipo Mini Spray Dryer Büchi B-290 utilizado en el marco de la investigación ............................................................................................................... 16
Figura1.7. Esquema general de recubrimientos comestibles. Tomado de Falguera et al
(2011) ............................................................................................................................. 18
Figura 1.8. Actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos de propóleos del
Santander y del altiplano Cundiboyacense obtenido por Talero (2014) .......................... 19
Figura 1.9. Actividad fungicida de los extractos etanólicos de propóleos del Santander y
del altiplano Cundiboyacense frente al hongo Trichophyton rubrum (a) Con etanol al 70%
(b) Con etanol al 96%. Obtenido por Talero (2014) ............................................................... 20
Figura 1.10. Morfología de las micro esferas de doble capa obtenidas por Pozippe Nori y colaboradores (2011) .................................................................................................... 22
Capítulo 1 XIII
Figura 1.11. Morfología de las micropartículas obtenidas por Busch et al (2011) ............ 22
Figura 1.12. Mecanismo de acción frente a Leishmania (V.) braziliensis de los propóleos
encapsulados elaborados por Do Nascimiento et al (2016)
....................................................................................................................................... 23
Figura 1.13. Comparación de las propiedades sensoriales y el índice de deterioro para
determinar la acción de recubrimiento de propóleos en papaya por un periodo igual a 1
semana .......................................................................................................................... 24
Figura 2.1. Evolución del contenido de fenoles totales en mg GAE/ g de muestra para los
micro encapsulados de acuerdo a su temperatura y concentración .................................... 46
Figura 2.2. Valores del porcentaje de inactivación para los micro encapsulados de acuerdo
a temperatura y concentración .................................................................................................... 47
Figura 2.3.Score plot obtenido del análisis de componentes principales (PCA) para
comparar las 8 formulaciones de acuerdo a los valores arrojados por los descriptores….48
Figura 2.4. Loading plot de los descriptores en la microencapsulación obtenido del análisis
de componentes principales (PCA) ................................................................................ 49
Figura 2.5. Micro encapsulados analizados por medio de microscopia electrónica de
barrido (SEM) obtenidos en diferentes relaciones de concentración propóleos: agente
encapsulante y diferentes temperaturas (magnificación 2000x; escala: 50 µm): a) EEP:
maltodextrina 1:2, 90 °C b) EEP: maltodextrina 1:2, 100 °C c) EEP: maltodextrina 1:2, 120
°C d) EEP: maltodextrina 1:2, 140 °C e) EEP: maltodextrina 1:4, 90 °C f) EEP: maltodextrina
1:4, 100 °C g) EEP: maltodextrina 1:4, 120°C h) EEP: maltodextrina 1:4, 140
°C… ................................................................................................................................................ 50
Figura 3.1. Comparación de los datos obtenidos por colorimetría, (a) Luminosidad, (b)
parámetro a*(c) parámetro b*(d) C*ab (e) h*ab.
…………………………………………………….……………………………………………………………….66-68
Capítulo 1 XIV
Figura 3.2. Comparación de las propiedades mecánicas entre las películas con el
encapsulado y el tratamiento control, (a) esfuerzo de corte (b) elongación (c) módulo
elástico (MPa) ............................................................................................................... 69
Figura 3.3. Películas analizadas por médio de microscopia electrónica de barrido (SEM)
obtenidas a partir de diferentes concentraciones de CH y EEP encapsulado a) quitosano:
1%p/v, microencapsulado EEP: 1% b) quitosano: 1%p/v, microencapsulado EEP: 1,5% c)
quitosano: 2%p/v, microencapsulado EEP: 0,5% d) quitosano: 2%p/v, microencapsulado
EEP: 1,5% ....................................................................................................................... 71
Figura 3.4. Películas analizadas por médio de microscopia electrónica de barrido (SEM)
obtenidas a partir de diferentes concentraciones de CH y EEP encapsulado a) quitosano:
1%p/v, microencapsulado EEP: 0,5% b) quitosano: 2%p/v, microencapsulado EEP: 1%
....................................................................................................................................... 72
Figura 3.5. Score plot obtenido del análisis de componentes principales (PCA) para
comparar las películas comestibles de acuerdo a los valores arrojados por los descriptores,
CH: Quitosano, PE: Propóleos encapsulado. CH 1%: Película con quitosano al 1 % p/v,
CH 2%: Película con quitosano al 2 % p/v, CH 1% PE 0,5%: Película con quitosano al 1 %
p/v y microencapsulado al 0,5 % p/v , CH 1% PE 1%: Película con quitosano al 1 % p/v y
microencapsulado al 1% p/v , CH 1% PE 1,5 %: Película con quitosano al 1 % p/v y
microencapsulado al 1,5 % p/v, CH 2% PE 0,5%: Película con quitosano al 2 % p/v y
microencapsulado al 0,5 % p/v , CH 2% PE 1%: Película con quitosano al 2 % p/v y
microencapsulado al 1% p/v , CH 2% PE 1,5 %: Película con quitosano al 2 % p/v y
microencapsulado al 1,5 % p/v ........................................................................................ 73
Figura 3.6. Loading plot de la variables fisicoquímicas y de las propiedades mecánicas de
las películas comestibles de quitosano y extracto etanólico de propóleos encapsulado en
maltodextrina obtenido del análisis de componentes principales (PCA)
....................................................................................................................................... 74
Figura 4.1. Evolución y comparación de la concentración de malonaldehído respecto al
tiempo en las muestras de cachama con y sin el recubrimiento comestible ....................... 91
Figura 4.2. Evolución y comparación del valor de la concentración de meq O2/Kg respecto
al tiempo de los filetes de cachama con y sin recubrimiento comestible… ....................... 92
Capítulo 1 XV
Figura 4.3. Evolución y comparación de los valores de pH respecto al tiempo de los filetes
de cachama con y sin recubrimiento comestible… ......................................................... 93
Figura 4.4.Evolución del contenido de bases volátiles de nitrógeno total respecto al tiempo
de los filetes de cachama con y sin recubrimiento comestible… ........................................... 93
Figura 4.5. Evolución de los datos de perfil de textura a)Dureza, b)Adhesividad
c)Elasticidad d)Cohesividad e)Masticabilidad, f) Resilencia ........................................ 95-97
Figura 4.6. Score plot obtenido del análisis de componentes principales (PCA) para
comparar las muestras de cachama con y sin recubrimientos comestibles de acuerdo a los
valores arrojados por los descriptores… .......................................................................... 99
Figura 4.7. Loading plot de los descriptores de los indicadores de oxidación lipídica y de
deterioro del alimento obtenido del análisis de componentes principales (PCA) 100
Figura 4.8. Valores obtenidos de las características sensoriales de(a) Cachama sin
recubrimiento (b) Cachama con extracto de propóleos puro (c) Cachama recubierta con
propóleos encapsulado… ....................................................................................101-102
Capítulo 1 XVI
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1.1 Evaluación de la actividad antioxidante de los propóleos encapsulados obtenidos
por Da Silva y colaboradores (2013) ......................................................................................... 22
Tabla 1.2.Parametros sensoriales para las uvas con y sin recubrimiento obtenido por el test de Dunnett (Iturriaga et al., 2014) ...................................................................................... 26
Tabla 2.1. Composición de las condiciones de los micro encapsulados a elaborar vía
Spray-Drying .................................................................................................................................. 39
Tabla 2.2. Composición y actividad antioxidante de los extractos etanólicos de propóleos
obtenidos, S1: Propóleos de Apis mellifera del Municipio de Oiba, S2: Propóleos de Apis
mellifera del Municipio de Socorro, SA: Propóleos de abejas Meliponini ............................. 40
Tabla 2.3. Promedios de los diámetros de halos de inhibición obtenidos en el análisis
Concentración Minina Inhibitoria (mm) ....................................................................................... 41
Tabla 2.4. Valores de colorimetría, rendimiento y actividad acuosa de las muestras de
encapsulados ................................................................................................................................ 43
Tabla 3.1. Formulaciones de las películas comestibles evaluadas… ............................. 59
Capítulo 1 XVII
Tabla 3.2. Contenido de humedad de las películas (%) de las películas de quitosano y
microencapsulado de propóleos y maltodextrina ..................................................................... 62
Tabla 3.3. Espesor (mm) de las películas de quitosano y microencapsulado de propóleos
y maltodextrina .............................................................................................................................. 63
Tabla 3.4. Permeabilidad al vapor de agua (g mm h-1 m -2 kPa- 1) de las películas de
quitosano y microencapsulado de propóleos y maltodextrina ................................................64
Tabla 4.1. Composición de las condiciones de las muestras compuestas de maltodextrina
para encapsular vía Spray-Drying ............................................................................................. 83
Tabla 4.2. Análisis microbiológico para filetes de cachama (Piaractus brachypomus) sin
recubrimiento comestible ............................................................................................................ 94
Tabla 4.3. Análisis microbiológico para filetes de cachama (Piaractus brachypomus) con
recubrimiento comestible ............................................................................................................ 94
Capítulo 1 2
Introducción
Los periodos de vida útil de los productos acuícolas tienden a ser muy cortos debido a su
composición química, esto supone un reto para el sector pesquero y para los comercios
encargados de la distribución de los alimentos piscícolas. Entre los problemas más
comunes se han identificado la proliferación de bacterias patógenas, la alteración de las
propiedades organolépticas de los alimentos y la disminución de la calidad nutricional. La
búsqueda de nuevas tecnologías y alternativas de conservación de los productos
acuícolas podría incentivar el crecimiento del sector pesquero, el aumento de vida útil
supondría una mejora sustancial en lo referente a la calidad del producto, reduciría los
costes y pérdidas del sector y a su vez contribuiría a incentivar el consumo de pescado
con mayor regularidad. Como alternativa a las tecnologías tradicionales se ha propuesto
la elaboración de recubrimientos comestibles, estas matrices son elaboradas a partir de
biopolímeros, metabolitos y extractos de origen natural y no alteran las propiedades
sensoriales del alimento y a futuro pueden resultar más económicos que la conservación
por medio de empaques de polímeros no biodegradables o que la conservación por frio.
Los recubrimientos comestibles han mostrado buenos resultados en el sector
agroalimentario, se han usado en matrices vegetales, lácteas, cárnicas y acuícolas con
muy buenos resultados. Esto se debe a que estas matrices actúan como una barrera frente
a los gases y a otros agentes del entorno, otro factor que ha contribuido a la efectividad de
los recubrimientos es que permiten la incorporación de aditivos y bioactivos encargados de
mejorar la acción biocida, la polaridad y la solubilidad. Como fuente de bioactivos se
destacan los extractos etanólicos de propóleos, esta matriz obtenida a partir de la
extracción con etanol de los propóleos ha sido objeto de estudio debido a la variabilidad
de su perfil químico de acuerdo a su ubicación geográfica y también debido su amplio
rango de acción frente a oxidantes, patógenos, virus, insectos y células malignas, esto ha
conllevado a que el extracto en cuestión hubiese sido objeto de diferentes estudios tanto
en fitoquímica como en el campo de la farmacia y la bromatología. El material de pared
Capítulo 1 3
usado ha sido el quitosano, este polisacárido obtenido del esqueleto de los crustáceos se
ha usado en películas y recubrimientos comestibles tanto como biopolímero estructural así
como en calidad de bactericida, sus grupos amino e hidroxilo han permitido la elaboración
de películas con una amplia bioactividad así como matrices con propiedades mecánicas
superiores frente a películas elaboradas con otros carbohidratos y proteínas estructurales.
Las ventajas de ambas sustancias son considerables, no obstante estudios previos han
demostrado que las películas y recubrimientos con quitosano y el extracto etanólicos de
propóleos presentan desventajas que limitan su acción y que merman su posibilidad de
aplicación en matrices alimenticias. En primer lugar las matrices recubiertas con quitosano
tienen una menor permeabilidad frente al vapor de agua y poseen un contenido más alto
de humedad; en segundo lugar los ensayos preliminares realizados por el grupo Acuicar
muestran que la incorporación del extracto etanólico de propóleos (EEP) sin encapsular a
matrices cárnicas y acuícolas trae como consecuencia la alteración de las propiedades
sensoriales del alimento. No obstante, debido a que sus propiedades que son en gran
parte benéficas, se buscó idear una formulación que permita controlar la acción de los
compuestos del extracto y mejorar la resistencia de las películas frente a la humedad, a
su vez se quiso garantizar la creación de una matriz cuya bioactividad y propiedades
mecánicas fueran comparables a las de otras películas y recubrimientos comestibles
diseñados a partir del extracto de polifenoles y el polisacárido en cuestión. Este trabajo
permitió determinar el efecto de recubrimientos con quitosano y extracto etanólico de
propóleos encapsulado sobre matrices acuícolas como la cachama blanca (Piaractus
brachypomus), al evaluarse los valores de las variables fisicoquímicas, la incidencia de
microorganismos Gram positivos y negativos, así como los cambios propiedades texturales
sufridas a lo largo del tiempo de almacenamiento. Al final se obtuvo un método de
conservación que aumenta la resistencia al daño mecánico, a organismos patógenos y a
procesos degenerativos que derivan en la descomposición de ácidos grasos en
hidroperóxidos así como en derivados volátiles y no volátiles.
Capítulo 1 4
1. ARTÍCULO DE REVISION: QUIMICA, ENCAPSULACION Y USO DE LOS EXTRACTOS ETANOLICOS DE PROPOLEOS PARA LA CONSERVACION DE ALIMENTOS
Resumen
Los extractos etanólicos de propóleos son matrices que han ganado mucha notoriedad
debido a su composición química así como debido a su bioactividad, la presencia de
compuestos polifenólicos en este extracto ha conducido a la realización de diversos
estudios en donde se ha evaluado la efectividad del extracto frente a agentes oxidantes,
patógenos, hongos, insectos, virus, células malignas e inflamaciones arrojando buenos
resultados. Debido a esto se han realizado investigaciones donde el extracto etanólico de
propóleos actúa como un agente bioactivo para mitigar el daño de los procesos de
descomposición. No obstante se considera necesario la producción de micro capsulas
usando biopolímeros como la maltodextrina y también es imperativo agregarlo a una
superficie que esté en contacto con el alimento, para esto se recurre a procesos de
encapsulación como el secado por aspersión y a tecnologías de conservación como las
películas y recubrimientos comestibles y su utilidad radica en que permiten la acción
controlada del bioactivo garantizando una menor tasa de reacciones indeseadas así como
un menor impacto sobre las propiedades sensoriales. Por ende se consideró necesario
indagar en la composición química, propiedades y bioactividad de los propóleos y los
flavonoides, también se efectuó una investigación relacionada con la encapsulación vía
secado por aspersión así como de las películas comestibles, por último se revisaron los
antecedentes existentes en lo referente a la encapsulación y uso en películas del extracto
etanólico de propóleos.
Palabras clave: Recubrimiento Comestible, Quitosano, Extracto Etanólico de Propóleos
(EEP), Secado Por Aspersión
Capítulo 1 5
1.1 Abstract
Ethanolic extracts of propolis (EEP) are substances who have gained the attention of the
scientific community due to their chemical composition as well as their bioactivity. The
notorious content of polyphenols and flavonoids of the propolis extracts has led to the
completion of various studies, which have evaluated the effectiveness of the extracts
against Oxidants, pathogens, fungi, insects, viruses, malignant cells and inflammation,
throwing good results. Due to their action against multiple microorganisms and chemical
compounds, investigations where the ethanoic extract of propolis acts as a bioactive agent
in fresh foods have been performed. It has been shown that the propolis are effective to
protect fresh foods and to improve the shell life .However it is necessary to consider the
production of microcapsules using biopolymers such as maltodextrin. Also is imperative to
add the propolis to a surface that has contact with the matrix. To accomplish both objectives
the encapsulation by spray drying and conservation technologies like edible films and
coatings have been used, both ensure a lower rate of unwanted reactions and a lower
impact on the organoleptic properties. Therefore it was considered necessary to investigate
the chemical composition, properties and bioactivity of propolis and flavonoids, also it was
conducted a research about the encapsulation by spray drying as well as edible films, finally
these existing researchs related to the encapsulation and use in films of propolis extracts
were reviewed
Keywords: Edible coatings, Chitosan, ethanolic extract propolis (EEP), spray drying,
Capítulo 6
1.2 Generalidades De Propóleos
Los propóleos son sustancias de carácter resinoso las cuales se recolectan en las colmenas
las abejas, estas sustancias se producen debido a recolección que hacen las abejas de
diversos compuestos encontrados en las yemas y los exudados de las plantas localizadas
tanto en regiones tropicales como en zonas subtropicales (Pellati et al., 2013). Las
características de esta mezcla referentes tanto a olor, color, constitución, composición
química y bioactividad dependen de las fuentes botánicas y de la ubicación geográfica de
la planta (Serra et al., 2011). Los propóleos son ricos en compuestos bioactivos:
Terpenóides, ceras; aldehídos, alcoholes, esteroides y polifenoles (flavonoides, ácidos
fenólicos y los esteres derivados de ambas matrices) (Viuda-Martos et al., 2008)
Los propóleos por lo general se clasifican en 2 tipos dependiendo de la zona, están los
propóleos brasileños y los propóleos europeos. Mientras que los propóleos brasileños son
ricos en sustancias de carácter terpénico y derivados del ácido p-cumárico, los propóleos
europeos poseen una alta concentración de derivados polifenólicos los cuales condicionan
su actividad biológica. Esta sustancia de carácter resinoso puede interaccionar en la
colmena con otras sustancias entre las que se encuentra la miel de abejas, la cera de las
abejas y las secreciones glandulares de los insectos, lo cual conduce a la liberación de
enzimas β-glicosidasas que catalizan una reacción de hidrolisis permitiendo la aparición de
agliconas libres, que incrementan la actividad y el potencial farmacológico. En la literatura
(Viuda-Martos et al., 2008) se ha encontrado que los propóleos poseen un amplio rango de
actividad biológica y de acción contra diversos agentes patógenos, células malignas y
sustancias químicas, la actividad anti-inflamatoria, antioxidante; anticancerígena,
antimicrobiana y antifúngica, lo cual lo convierte en una matriz que se puede usar para un
sin número de aplicaciones en la industria cosmetológica, farmacéutica y alimentaria.
1.4. Flavonoides
1.4.1. Características químicas y propiedades
Los flavonoides son uno de los metabolitos secundarios más importantes de las plantas,
estos hacen parte del grupo de compuestos polifenólicos y se caracterizan principalmente
por tener en su esqueleto 3 anillos de carácter aromático tal y como se muestra en la figura
1.1 , 2 donde dos de los anillos (A y B) poseen un esqueleto de 6 carbonos mientras y el
anillo restante es piránico se encuentra entre los 2 fenoles y se enlaza a los otros 2 grupos
Capítulo 7
por medio de un enlace covalente (Lillo et al., 2008).
Figura 1.1 Estructura de los flavonoides, tomado de Lillo et al., (2008).
Los flavonoides se pueden dividir en 6 clases (Figura 1.2) que son: Flavonoles, flavonas,
Isoflavonas, flavononas, flavones y antocianidinas (Falcone et al., 2012), las diferencias
entre estos subgrupos yace en la conformación del anillo piránico (presencia de uno o varios
grupos funcionales, existencia o ausencia de un radical así como la presencia de un doble
enlace en el anillo de C3) (Pyrzynska & Biesaga, 2009).
Capítulo 8
Figura 1.2. Clases de flavonoides de acuerdo a su estructura química, tomado de Falcone
et a., (2012)
Los fenoles pueden presentar variaciones en sus propiedades físicas, los más simples
pueden ser líquidos o solidos con un punto de fusión muy bajo y además de eso debido a
los puentes de hidrogeno, su punto de ebullición es bastante alto. Son incoloros aunque
cuando sufren reacciones de carácter oxidativo hay cambios en la estructura y en la
conjugación produciendo un cambio en las longitudes de onda en las que absorbe y por
ende puede llegar a presentar color. En las muestras de propóleos los compuestos
bioactivos más destacados son los flavonoides, como la quercetina, campferol, ficetina,
apigenina, acacetina, esteres del ácido caféico entre otros compuestos que se pueden
visualizar en la Figura 1.3. La concentración de estos flavonoides en propóleos depende de
varios factores, entre los que se encuentran: el origen botánico o plantas visitadas por las
abejas, la salud de la planta, la temporada y los factores climáticos (Viuda-Martos et al.,
2008). Así como en algunas muestras de propóleos obtenidas en Colombia y Latinoamérica
es mucho más común un flavonoide como la quercetina, en muestras de otras partes del
mundo como los Balcanes, son más comunes los derivados de ácidos como el p-cumarínico
y el ácido caféico (Medić-Šarić, et al., 2009).
Capítulo 9
Figura 1.3. Flavonoides comunes en propóleos, tomado de Viuda-Martos et al( 2008)
1.4.2. Extracción de flavonoides
En la literatura se ha encontrado múltiples maneras para aislar los polifenoles de una
muestra de propóleos que van desde la extracción liquido-liquido hasta la extracción con
fluidos supercríticos. El método más común hace referencia a la extracción vía soxhlet
donde se han empleado disolventes polares que puedan arrastrar los derivados fenólicos de
la matriz resinosa destacando así alcoholes primarios, a su vez es aún muy común obtener
flavonoles, flavononas efectuando una extracción liquido-liquido con etanol, sin embargo,
debido al gasto de disolvente y al tiempo requerido para extraer la muestra, el método está
cayendo en desuso. Hoy en día se están desarrollando métodos más rápidos,
automatizables más amigables con el medio ambiente para poder aislar los flavonoides,
entre ellos destacamos: El empleo de extracción asistida vía microondas para extraer los
flavonoides de los propóleos, el aislamiento de propóleos de la matriz usando fluidos
presurizados a altas temperaturas y la obtención de propóleos por medio de fluidos
supercríticos (Pellati et al., 2013). El primer método tratado se caracteriza por el empleo de
altas temperaturas y por su rapidez a la hora de aislar las moléculas, al igual que el método
de extracción líquido-líquido y soxhlet usa etanol, además una mezcla de agua y cada
ensayo se efectúa variando la concentración de ambos disolventes. Quizá el cambio más
significativo se dio en supercríticos, el cual pese a usar etanol también incorporo al sistema
CO2 encargado de asistir la extracción. Algunas veces estas extracciones deben ser
Capítulo 10
asistidas por nano filtración para mejorar el rendimiento y evitar interferencias (Catchpole
et al., 2004).
1.4.3. Métodos de separación e identificación
Para el análisis es necesario efectuar la separación del extracto etanólico de propóleos por
métodos electroforéticos y cromatográficos, con el fin de conocer la naturaleza química y la
concentración del compuesto en la muestra. Se han desarrollado análisis por electroforesis
capilar con tal de identificar flavonoides clave, a su vez se usa HPLC, donde la columna es
de sílica y se usa un sistema de disolventes de polaridad variable que permita la
discriminación de estos, de acuerdo a su solubilidad (un sistema muy común de eluyentes
es aquel que contiene diclorometano y acetato de etilo). Por último se usa para identificar
análisis de RMN bidimensionales que permiten la elucidación en función de los hidrógenos
y carbonos vecinos, tanto 1H RMN como 13C RMN son muy empleados (Tran et al., 2012).
1.4.4 Bioactividad y propiedades funcionales
El rango de bioactividad de los polifenoles es bastante amplio, siendo su capacidad
antioxidante la propiedad más destacada. En la literatura se han propuesto varios
mecanismos que explican la acción antioxidante de los flavonoides. Se ha encontrado que
estos tienen actividad antiradicalaria y se sabe que pueden donar iones hidronio, también
pueden quelar metales formando complejos y a su vez actúan como sustrato frente a
radicales superóxido e hidroxilo, por último se sabe que pueden frenar las reacciones en la
fase de propagación y que son capaces de desactivar sistemas enzimáticos. Dependiendo
de los otros componentes de la matriz de propóleos, así como de las condiciones del medio
y de las variables fisicoquímicas, los flavonoides presentaran variaciones muy marcadas en
su acción frente a compuestos causantes de los diversos procesos degenerativos (Viuda-
Martos et al., 2008).
Los flavonoides de los propóleos presentan una notoria actividad anti inflamatoria, estos
polifenoles obstaculizan el desarrollo de la inflamación inhibiendo la acción de enzimas
como la ciclooxigenasa e impidiendo la liberación de compuestos partir del ácido
araquidónico. Entre los flavonoides que se destacan se encuentran la ganglina y la crisina
(Viuda-Martos et al., 2008).
Los virus también son susceptibles a estos metabolitos secundarios, se ha comprobado que
algunos virus pueden frenar la replicación debido a que desactivan la polimerasa viral y a
que pueden unirse a la cápside y al material genético viral, lo cual se traduce en la inhibición
de la replicación. Además compuestos como el campferol, la quercetina y la crisina tienen
acción sobre los adenovirus y los retrovirus, los flavonoides previamente mencionados
Capítulo 11
pueden tener acción viricida por separado y pueden interactuar con otros compuestos
dando lugar a un sinergismo que produce la muerte del agente patógeno. El mecanismo en
bacterias es similar, se sabe que los flavonoides tienen un impacto en la RNA polimerasa
de las bacterias impidiendo la replicación, a su vez estos polifenoles se pueden adherir a la
membrana citoplasmática causando la alteración de la permeabilidad de la membrana, el
cambio de potencial, la imposibilidad de sintetizar ATP, la perdida de iones de potasio y la
interferencia con los procesos de transporte de nutrientes lo cual conduce a la lisis celular.
La literatura ha mostrado que la mayoría de flavonoides presenta una acción antimicrobiana
contra bacterias Gram positivas y a su vez señala que existe un sinergismo a la hora de la
inhibición (Viuda-Martos et al., 2008).
Capítulo 12
1.5. Quitosano
1.5.1. Características químicas y propiedades
Figura 1.4. Estructura del quitosano, tomado de Periayah et al (2016)
El quitosano es un polisacárido lineal obtenido de la deacetilación de la quitina, se puede
obtener de fuentes naturales entre las cuales se destacan: arácnidos, insectos, crustáceos,
moluscos, algas, esporas, levaduras y hongos multicelulares. Este es un copolímero lineal
el cual contiene unidades de β-(1–4)-2-acetamido-D-glucosa y β-(1–4)-2-amino-D-glucosa
(Figura 1.4) y se pueden producir diferentes variedades de este biopolímero cambiando los
grados de acetilación y alterando los pesos moleculares (Elsabee & Abdou , 2013). Se
pueden obtener múltiples isómeros con base en el quitosano, el grado de deacetilación de
este copolímero altera las propiedades físicas, una de las más afectadas por este parámetro
es la solubilidad ya que la presencia de los grupos amino de grupos acetato condicionan la
polaridad del polisacárido, la propiedad mencionada al inicio también tiene influencia en las
reacciones que puede sufrir el biopolímero así como en su rendimiento. Debido a la
presencia de 2 grupos amino y 1 grupo hidroxilo en los anillos de glucosa el quitosano es
capaz de sufrir reacciones de entrecruzamiento, esterificación, eterificación, alquilación,
copolimerización, adiciones nucleofílicas, acilaciones, reacciones de Schiff, etc., por lo tanto
en comparación con la quitina esta molécula tiende a reaccionar con más facilidad, lo cual
aumenta su versatilidad (Pillai, et al., 2009).
El quitosano es capaz de formar un gran número de puentes de hidrogeno, debido a que
sus grupos funcionales hidroxilo y amino pueden formar enlaces con agua y otros
compuestos polares, la cadena polimérica es lineal y al contrario que otros polisacáridos de
marcada acidez, este actúa como una base débil. Es un polisacárido biodegradable, no
toxico, actúa como un poli electrólito y a su vez es capaz de formar polisales con ácidos
tanto orgánicos como inorgánicos. Por ultimo cabe resaltar el quitosano es un biopolímero
catiónico el cual tiene una alta densidad de carga, lo que lo convierte en un agente floculante
bastante efectivo. Las redes de quitosano pueden ser encontradas en 3 estructuras
polimórficas (α, β y γ) las cuales presentan variaciones de acuerdo a su empaquetamiento,
Capítulo 13
polaridad y polimorfismo, el cual depende de las características y el origen del tejido donde
fue extraído (Zargar et al., 2015).
1.5.2. Bioactividad y propiedades funcionales del quitosano
Las propiedades funcionales del quitosano son similares a la quitina y posee una mayor
cantidad de ventajas como una mayor solubilidad y una alta reactividad, esto ha conllevado
al uso del quitosano para numerosos estudios en áreas como: Farmacia, cosméticos,
ciencias agroalimentarias, ingeniería del agua y tejidos así como en biomateriales (Zargar
et al., 2015).
El polisacárido se une con relativa facilidad a la membrana y pared celular tanto de
organismos unicelulares como multicelulares, siendo capaz de alterar la permeabilidad de
las membranas y de interferir en los procesos que ocurren en la célula, como consecuencia
es capaz de regenerar el tejido óseo y el tejido conectivo así como de detener los procesos
de hemorragia, contribuyendo así a procesos como la formación del hueso y a regeneración
de la dermis, cabe destacar la capacidad que tiene el quitosano para unirse a las células
malignas convirtiéndolo en una biomolécula con un marcado potencial como un antitumoral,
también puede actuar con facilidad tanto en el torrente sanguíneo como en el sistema
linfático, por último se sabe que este polisacárido actúa como anticolesterolémico y como
inmunoadyuvante, permitiendo la reducción del colesterol y aumentan la respuesta del
sistema inmune. No obstante la exposición excesiva a este compuesto puede tener efectos
negativos en la salud humana. Diversos estudios han reportado los efectos espermicidas y
una notoria capacidad para inducir la depresión del sistema nervioso central, como
consecuencia la ingesta de quitosano en exceso puede inducir a la esterilidad y a
disminución de la actividad neurológica (Dutta, et al., 2004).
En lo referente a la elaboración de películas y recubrimientos comestibles el quitosano
posee numerosas ventajas sobre otros materiales de pared, cabe destacar que presenta
permeabilidad más selectiva por los gases (CO2 y O2),mejores propiedades mecánicas y
una bioactividad mayor que la de otras biomoléculas usadas debido a que la interacción
electrostática que existe entre el grupo amino del polisacárido y los grupos fosforilo de la
membrana celular de los microrganismos, este fenómeno trae como consecuencia la
alteración de la estructura de la capa lipídica del patógeno y la acidificación el medio dando
como resultado la reducción del número de microbios, virus, protozoos, etc. No obstante el
quitosano presenta algunas desventajas, su alta permeabilidad dificulta el control de la
transferencia de agua y puede anular tanto las ventajas del polímero como puede reducir
su impacto positivo en la conservación de productos alimenticios (Domard et al., 2001).
Capítulo 14
1.6. Microencapsulación de bioactivos
1.6.1. Generalidades
La microencapsulación es una tecnología que permite empacar materiales sólidos, líquidos
y gases en matrices, estos liberan de manera controlada el contenido bajo condiciones
específicas. La sustancia que se busca encapsular se conoce como material de núcleo
mientras que el compuesto usado para empacar se conoce como material de pared,
encapsulante, fase externa o membrana (Fang et al., 2010). El tamaño de estas partículas
varía desde unas sub-micras hasta milímetros y se forman por medio de procesos de
oclusión o adsorción, los cuales generan una superficie uniforme que protege al compuesto
encapsulado, evitando así la descomposición y las interacciones no deseadas con otros
componentes químicos, permitiendo una liberación controlada de la sustancia y también
facilitando su manipulación, a su vez en algunos casos se pueden mitigar el impacto de
algunas propiedades sensoriales las cuales pueden ser desagradables para la población
(Villacrez, 2012).
Para desarrollar una encapsulación efectiva es esencial tener en cuenta los siguientes
parámetros:
• El núcleo, material o ingrediente activo a encapsular
• Interacciones entre el núcleo, la matriz y el ambiente.
• La estabilidad del ingrediente microencapsulante en el almacenamiento.
• El mecanismo de liberación del núcleo
Capítulo 15
La membrana que recubre el núcleo debe ser continua y poseer propiedades como
flexibilidad, resistencia, permeabilidad y ser de fácil aplicación (Villacrez, 2012). Esta
superficie por lo general es muy delgada y debe adherirse firmemente al material del núcleo.
De acuerdo al número de capas que estas presentan las partículas se pueden dividir en
partículas de monocapa y de multicapa, a su vez pueden tener forma esférica, ovalada o
irregular y también pueden tener una matriz con multicapas tal y como se ve en la Figura
1.5.
Figura 1.5. Tipos de morfología de las micro capsulas, tomada de Villacrez Yepes (2012).
Los métodos de encapsulación usados se han aplicado con éxito a una amplia gama de
compuestos entre los que se encuentran lípidos, enzimas, aceites esenciales, aminoácidos,
péptidos, saborizantes, buffers, agentes odorantes, ácidos, bases, colorantes y en algunos
casos se han podido tratar microorganismos por este método. Los materiales de pared
utilizados normalmente son biopolímeros, pero también lípidos y proteínas. Sin embargo los
carbohidratos han sido más frecuente en la producción de micropartículas, además los
almidones modificados, la celulosa y las gomas han mostrado ser más solubles, estables y
con un mejor rendimiento que otras macromoléculas a la hora de encapsular una muestra
(Gibbs et al., 1999). Existen varios procesos para obtener micro encapsulados, algunos de
los cuales están basados exclusivamente en fenómenos físicos, otros métodos usan
reacciones químicas de polimerización para producir la pared de la cápsula. Por ultimo
cabe destacar la existencia de metodologías que combinan los métodos físicos y químicos.
Sobresalen la coacervación, la extrusión, la liofilización, la inclusión, los procesos de
cocristalización y de evaporación de solvente. Por su simpleza, reproducibilidad y
Capítulo 16
efectividad el protocolo de encapsulación más usado es la encapsulación por medio del
secado por atomización mejor conocido como spray drying (Nesterenko et al., 2013).
1.6.2. Encapsulación via Spray- Drying
El proceso de Spray-Drying es un proceso continuo de deshidratación que resulta en la
obtención de polvo solido conformado por bioactivos encapsulados. Es un proceso simple,
rápido y efectivo, el cual permite el secado de una mezcla homogénea a partir de un
bioactivo y un material de pared de baja termo sensibilidad (Nesterenko et al., 2013). En el
spray drying al tener las condiciones óptimas se logra un secado eficiente y la retención
del principio activo y la manipulación de compuestos lábiles sensibles a altos cambios
en la temperatura.
Las principales variables del proceso de spray drying son:
• El caudal del líquido de entrada
• El caudal de aire de atomización suministrado por un compresor
• La Temperatura y humedad del aire de entrada al cilindro de atomización La influencia de cada una de estas variables en el secado por atomización afectará la
humedad final del producto, el rendimiento de producción, la temperatura de salida y el
tamaño de partícula
Las principales ventajas de la microencapsulación por spray-drying son (Zuidam, 2010):
• Posibilidad de efectuar el secado a bajas temperaturas y a presión atmosférica de
compuestos lábiles
• El secado por aspersión posibilita la obtención continua de microencapsulado,
exhibiendo un notorio rendimiento.
• El proceso de spray drying permite la producción de partículas uniformes en cuanto
a forma y composición.
Capítulo 17
Figura 1.6. Diagrama de un equipo Mini Spray Dryer Büchi B-290 utilizado en el marco de
la investigación
En la Figura 1.6 se muestra un esquema del equipo de secado por aspersión usado en el
proyecto de investigación. Los equipos presentan variaciones en su tamaño, en algunas de
sus partes como la bomba y la boquilla y en el material de sus compuestos de acuerdo a la
finalidad del secador y también dependiendo de la cantidad de micropartículas que se desee
obtener. El proceso de acuerdo se divide en 3 partes. En la primera parte se forma una
emulsión con el material de pared, el ingrediente activo y un tenso activo que permite
generar la mezcla homogénea, se coloca la entrada de alimentación para que la bomba se
encargue de succionar la emulsión, la cual pasa a una rueda giratoria o a una boquilla a
presión encargada de generar un aerosol como consecuencia de presiones que ejerce el
líquido. Después la muestra atomizada entra en contacto con el aire caliente cuyo objetivo
es evaporar disolvente, este proceso se efectúa en un cilindro de pulverización, el cual
atrapa el principio activo, finalmente una corriente de aire permite la separación de las
partículas y se obtiene el micro encapsulado en el vaso de recolección. Al final se obtiene
un polvo sólido, altamente higroscópico y con una notoria uniformidad en su apariencia
(Villacrez, 2012)
Capítulo 18
1.7. Películas y recubrimientos comestibles
Con el fin de poder emplear los compuestos bioactivos y los encapsulados para la
conservación de matrices alimenticias, sin que se vean alteradas las propiedades sensoriales
y la composición del alimento se emplean membranas semipermeables conocidas como
películas y recubrimientos comestibles, las cuales aparecen ilustradas en la Figura 1.7.
Las películas comestibles son redes poliméricas cuya forma se asemeja a la de una capa
uniforme y delgada. Estas películas son usadas para la conservación de diversos alimentos
entre los que se encuentran vegetales y productos cárnicos, donde la función es proteger
al producto del posible daño que puedan ocasionar actividades mecánicas, físicas, agentes
microbiológicos y compuestos químicos (Falguera et al., 2011). Estas matrices elaboradas
con materiales biodegradables son capaces de crear una barrera al intercambio de gases
y la perdida de agua, controlando así la transferencia de humedad, oxigeno, lípidos, dióxido
de carbono y el movimiento de compuestos que otorgan el “flavor” al alimento, a su vez
protegen las sustancias que componen el alimento del deterioro por acción enzimática y
regulan la migración de solutos que están en la superficie del alimento alterando la
velocidad de difusión, lo cual conduce a la mejora de la calidad y al aumento de la vida útil.
Las películas deben ser sometidas a pruebas que permitan conocer sus propiedades
mecánicas y fisicoquímicas con el fin de evaluar su efectividad; a su vez se debe garantizar
que no tengan efectos sobre las propiedades organolépticas, por ende las películas deben
ser inodoras, insípidas y transparentes (Kowalczyk et al., 2011). Con respecto a las
películas elaboradas a partir de empaques biodegradables hay que destacar que su
fabricación y uso genera menos residuos y contaminantes que los empaques tradicionales,
no obstante las propiedades mecánicas y la permeabilidad de estas películas es más pobre
en comparación con las películas sintéticas.
Por otra parte los recubrimientos comestibles son soluciones liquidas las cuales poseen los
mismos componentes y otorgan los mismos beneficios y propiedades que el alimento, la
principal diferencia con respecto a las películas radica en su aplicación (Bourtoom, 2008),
ya que el recubrimiento se debe aplicar directamente al alimento y se puede adicionar tanto
por inmersión como aspersión. Los compuestos más usados para elaborar tanto las
películas como los recubrimientos son proteínas como el gluten, colágeno, caseína, aislados
de la proteína de soya y del suero; a su vez es común el uso de polisacáridos como el
almidón, quitosano y celulosa. Dependiendo del sistema polimérico usado pueden existir
fenómenos los cuales inciden sobre las propiedades de la barrera, así como con respecto
a permeabilidad con respecto al vapor de agua; como en algunos casos ciertos
biopolímeros poseen desventajas notorias para la parte fisicoquímica, microbiológica y
sensorial; para mejorar las propiedades físicas, funcionales y la bioactividad se ha
Capítulo 19
propuesto añadir a la matriz sustancias adicionales como biopolímeros, plastificantes,
lípidos , compuestos hidrofóbicos y antimicrobianos los cuales inciden positivamente sobre
la acción del agente conservante y sobre la percepción que el consumidor tiene sobre el
producto acuícola (Vásconez et al., 2009).
Figura 1.7. Esquema general de recubrimientos comestibles. Adaptado de Debeaufort y
Voilley (2009).
Capítulo 20
1.8. Antecedentes
1.8.1. Caracterización de los extractos etanólicos de propóleos
Los extractos etanólicos de propóleos alrededor del mundo han sido ampliamente
caracterizados, se conoce tanto su perfil cromatográfíco como su bioactividad. En lo
referente a extractos provenientes de los propóleos Colombianos se tienen estudios de
bioactividad y se han cuantificado algunos flavonoides de interés, no obstante faltan
estudios acerca del perfil cromatógrafo completo. Uno de los estudios más importantes a
destacar es aquel efectuado por Talero (2014) cuyo fin fue el estudio de la acción de los
extractos de 3 zonas de Santander y del altiplano Cundiboyacense como biocidas.
Figura 1.8. Actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos de propóleos del
Santander y del altiplano Cundiboyacense obtenido por Talero (2014).
Tal y como lo muestra la Figura 1.8, se pudo observar la presencia de una marcada
actividad bactericida frente a bacterias Gram positivas y negativas. Se destaca su acción
frente a microorganismos como Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y las bacterias del
genero Klebsiella. Se pudo observar que al elaborar el extracto con etanol al 96% se obtuvo
una muestra con un mejor efecto biocida y también fue posible ver que el extracto de mejor
calidad fue el de Santander, este tuvo un mayor poder bactericida ya que en todos los
ensayos la concentración mínima inhibitoria nunca fue inferior al 1mg/mL (Talero, 2014).
Capítulo 21
(a)
(b)
Figura 1.9. Actividad fungicida de los extractos etanólicos de propóleos del Santander y
del altiplano Cundiboyacense frente al hongo Trichophyton rubrum (a) Con etanol al 70%
(b) Con etanol al 96%. Obtenido por Talero (2014).
En el caso de la acción frente a hongos, el extracto de propóleos santandereanos fue menos
efectivo que aquel obtenido de los propóleos Boyacenses. No obstante todos los extractos
obtenidos mostraron tanto actividad fungistática como una acción fungicida tal y como se
ve en la Figura 1.9. Estudiada la acción del extracto etanólico de propóleos se concluyó que
es una muestra caracterizada por un amplio rango de acción y una marcada efectividad,
también en este estudió se afirmó la existencia de la relación entre el método de extracción
y la bioactividad del extracto (Talero, 2014).
Capítulo 22
1.8.2. Elaboración de micropartículas con extractos etanólicos de propóleos
En lo referente a los procesos de encapsulación que han buscado la protección de
bioactivos hallados en propóleos se puede ver el interés por proteger el extracto etanólico
de propóleos y se destacan metodologías como: La coacervación, la liofilización y el secado
por aspersión. Han sido usados diversos materiales de pared con el fin de encontrar una
formulación que permita la protección de la molécula, entre ellos se destacan los
biopolímeros: β-ciclodextrina, poli-ε-caprolactona, pectina, aislado de proteína de soya,
alginato, gelatina y goma arábiga. Kalogeropoulos et al (2009) encontraron que la β-
ciclodextrina puede proteger los compuestos polifenólicos del extracto etanólico, así como
incrementar su solubilidad, el incremento de solubilidad fue mayor para moléculas con
menor peso molecular, además la liberación dependió de las propiedades químicas del
compuesto.
Pozippe Nori et al., (2011) efectuaron estudios referentes a la encapsulación de compuestos
extraídos de propóleos brasileños, para la parte experimental se varió la concentración de
extracto y material de pared así como el pH. Luego de obtener las micropartículas por medio
de un método de coacervación fueron determinados los valores de higroscopicidad,
actividad antioxidante, comportamiento térmico, estabilidad y contenido total de fenoles. Los
resultados obtenidos en este proyecto mostraron que fue posible la encapsulación vía
coacervación usando proteína de soya y pectina a diferentes concentraciones, el análisis
por microscopía permitió conocer la morfología de los encapsulados, tal y como se aprecia
en la figura 1.10 las partículas se caracterizan por su forma esférica por presentar una doble
capa que les confiere una mejor resistencia frente a agentes externos, así como una mayor
estabilidad.
Capítulo 23
Figura 1.10. Morfología de las micro esferas de doble capa obtenidas por Pozippe Nori
et al (2011)
Busch et al (2017) mostraron que fue posible la encapsulación de extracto etanólico de
propóleos brasileños vía Spray-drying usando maltodextrina y goma arábiga como agente
encapsulante. Los investigadores obtuvieron una gran cantidad de partículas con
superficies poco uniformes debido a que el secado por aspersión produce el encogimiento
de los encapsulados esféricos debido a la acción del vacío tal y como se ve en la figura
1.11. A su vez se determinó que las gomas ayudan a mejorar la retención de compuestos
bioactivos como los flavonoides mejorando su bioactividad, no obstante la adición de estos
polisacáridos disminuyó el rendimiento, la estabilidad de las micropartículas y la cantidad
de compuestos en la superficie, reduciéndose así parte de la biodisponibilidad de las
sustancias con actividad biocida en el sistema (Busch et al., 2011).
Figura 1.11. Morfología de las micropartículas obtenidas por Busch et al (2011)
Capítulo 24
En muchos casos, los propóleos encapsulados no solo conservan su bioactividad, sino que
además ven incrementado su acción frente a compuestos pro oxidantes, radicales libres,
microorganismos patógenos y células cancerígenas. Uno de los casos más destacados fue
el Da Silva et al., (2013) los cuales monitorearon la actividad antioxidante de los propóleos
encapsulados observando el porcentaje de inhibición de la oxidación lipídica; fue posible
detallar que los propóleos conservan su actividad antioxidante tal y como se ve en la Tabla
1.1, en la cual se pueden se ven porcentajes de inhibición de hasta el 89 % (Da Silva et al.,
2013).
Formulación
Concentración ( ppm)
Actividad Antioxidante
(%)
500 24
2000 72
T1 5000 89
500 33
2000 79
T2 5000 84
500 35
2000 62
T3 5000 88
500 52
2000 81
T4 5000 87
Tabla 1.1. Evaluación de la actividad antioxidante de propóleos encapsulados obtenidos por
Da Silva et al (2013)
Capítulo 25
Otros casos destacados son los de Onbas et al., (2016) y Do Nascimiento et al., (2016). En
el primer trabajo mencionado los propóleos encapsulados fueron capaces de actuar sobre
células involucradas en cáncer de mama y tuvieron un efecto citotóxico sobre el
microorganismo Leishmania (V.) braziliensis. En muy pocos ejemplos se sabe el
mecanismo de acción de lo propóleos encapsulados, de los pocos ejemplos hallados en la
literatura se encuentra el de Do Nascimiento et al., (2016) quienes establecieron que sus
propóleos encapsulados alteraban la permeabilidad de la membrana y atacaban las
mitocondrias. Por último, dependiendo del material de pared, del proceso de encapsulación,
el tiempo empleado y el uso de surfactantes se obtienen partículas las cuales presentan
variaciones en lo referente a rendimiento, higroscopicidad, actividad acuosa, morfología,
comportamiento térmico, etc.
Figura 1.12. Mecanismo de acción frente a Leishmania (V.) braziliensis de los propóleos
encapsulados elaborados por Do Nascimiento et al (2016). EEP= Extracto Etanólico de
Propóleos, NRPE= Nano partículas de Extracto de Propóleos Rojos
1.8.3 Desarrollo y aplicación de películas y recubrimientos a base
de bioactivos de propóleos en alimentos
Se han incorporado a las películas compuestos fenólicos como ácidos fenólicos y
flavonoides como: quercetina, catequina y flavona. Tal es el caso del trabajo efectuado por
Arcan et al (2011), en el cual se adicionaron los compuestos previamente mencionados a
películas elaboradas a partir de zeína. Al final de trabajo se manifestó que las películas con
catequina mostraron mejores propiedades elásticas, menor permeabilidad al agua y mayor
actividad antioxidante, a su vez la película con catequina permite la liberación más
controlada de los compuestos bioactivos garantizando una mayor efectividad.
La investigación del uso de extractos etanólicos de propóleos en recubrimientos
comestibles y en conservación de alimentos ha sido un tema recurrente en la ciencia de
alimentos y la mayoría de los estudios se han efectuado con el fin de aumentar el tiempo
Capítulo 26
de vida útil de frutas. Destacan trabajos como los de Barrera et al., (2012) quienes fueron
capaces de reducir el impacto de los procesos degenerativos en papaya usando
recubrimientos comestibles monocapa de extracto etanólico de propóleos. Los frutos
recubiertos con el tratamiento mostraron un índice de deterioro y un diámetro de la infección
del hongo Colletotrichum gloeosporioides inferior al de las papayas control, extendiéndose
en dos días la aparición de daños.
Figura 1.13. Comparación de las propiedades sensoriales y el índice de deterioro para
determinar la acción de recubrimiento de propóleos en papaya por un periodo igual a 1
semana. Tomado de Barrera Bello et al (2012).
También se han efectuado trabajos en matrices como pimentón y plátano, donde se evalúa
principalmente la pérdida del peso fresco y la firmeza que puede presentar el producto.
Muchos de los resultados han mostrado que debido a la acción de los bioactivos de los
propóleos sobre patógenos y agentes oxidantes los recubrimientos elaborados con estos
extractos pueden mantener la estructura del alimento fresco por un tiempo mucho más
prolongado, ayudando a una mejor retención de la humedad. Además, no solo se destacan
por atacar los procesos degenerativos sino que previenen la proliferación de patógenos
como hongos, algunos trabajos han logrado la inhibición efectiva de micelios que afectan a
varios organismos vegetales (Asgar et al., 2015). También cabe destacar el proyecto
realizado por Pastor et al., (2011), en este trabajo se elaboraron recubrimientos a base de
hidroxipropilmetilcelulosa los cuales contenían extracto etanólico de propóleos, siendo
estos aplicados a uvas moscatel. Con el fin de observar el efecto del extracto sobre la matriz
se evaluaron parámetros de calidad microbiológica, actividad antioxidante y la cantidad de
solidos solubles, por último se desarrolló un análisis sensorial para determinar la incidencia
del producto sobre las características organolépticas. Luego de efectuar las pruebas los
análisis fisicoquímicos y microbiológicos los autores determinaron que el extracto etanólico
de propóleos no tuvo efectos significativos sobre la preservación de las uvas ya que los
valores son casi idénticos tanto para las uvas con la membrana protectora como para el
tratamiento control. El compuesto bioactivo no incidió de la manera esperada y el único
Capítulo 27
efecto positivo que se pudo vislumbrar fue el incremento de la luminosidad lo que favoreció
la percepción de los consumidores frente al color (Pastor et al., 2011).
Por ultimo cabe destacar que en la literatura fue más común encontrar trabajos acerca de
la aplicación del extracto de propóleos crudo en matrices cárnicas, uno de los más
destacados fue aquel desarrollado por Gutiérrez et al., (2012) en donde los propóleos
actuaron frente a: E. coli, Salmonella sp., S. aureus y Clostridium sp, siendo considerados
como un posible sustituyente del nitrito de sodio en matrices como los embutidos. No
obstante, las muestras obtenidas solo presentaron actividad bacteriostática y debido a que
el extracto no fue sometido a un pre tratamiento y fue necesario emplear una concentración
muy elevada del extracto, lo cual tuvo un impacto negativo en las propiedades sensoriales
de los productos cárnicos. Dado el impacto negativo de los extractos etanólicos de
propóleos sobre las propiedades sensoriales del alimento y la necesidad de potenciar la
bioactividad de estos extractos, sobre aquellos alimentos a los que se aplica, se reafirma la
necesidad de encapsular los extractos y e incorporar las macropartículas a recubrimientos
comestibles que permitan la preservación del alimento sin usar una gran cantidad de
muestra que tenga como consecuencia la aparición de defectos sensoriales.
Capítulo 28
Conclusiones
Los extractos etanólicos de propóleos se caracterizan por su marcada bioactividad y
potencial antioxidante debido a la presencia de flavonoides. La encapsulación del extracto
y la incorporación del bioactivo a películas y recubrimientos comestibles permiten aumentar
la estabilidad, potenciar la acción biocida, el efecto barrera y controlar la liberación de los
compuestos funcionales en el extracto, permitiendo así la conservación del alimento y el
aumento de la vida útil sin generar defectos sensoriales.
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Capítulo 34
2. CAPITULO 2. EVALUACION FISICOQUIMICA Y MICROBIOLOGICA DE LA ENCAPSULACION VIA SPRAY DRYING DE EXTRACTOS ETANOLICOS DE PROPÓLEOS
Resumen
Es reconocido que los propóleos presentan actividad antagónica frente a microorganismos
patógenos y sustancias pro oxidantes y ante radicales libres debido al contenido de
polifenoles. El objetivo de esta investigación fue evaluar la micro encapsulación por medio
de secado por aspersión de extractos etanólicos de propóleos (EEP). Fueron utilizados
propóleos provenientes del departamento del Santander y evaluada la actividad
fisicoquímica, antioxidante y antimicrobiana. Para la micro encapsulación fue utilizado EEP,
maltodextrina, y para el secado por aspersión variaciones en concentración y temperatura.
Los resultados indicaron que los propóleos del municipio del Socorro presentaron las
mejores condiciones para la elaboración de los micro encapsulados debido a la amplia
actividad contra cepas patógenas y por la inactivación del radical DPPH (1,1 difenil-2-
picrilhidrazilo), la cual se dio gracias al alto contenido fenólico. También se concluyó que
las condiciones para la obtención de encapsulados con mejores propiedades antioxidantes
y fisicoquímicas se obtuvieron luego de someter a una solución 1: 2 (Extracto:
Maltodextrina) a un proceso de secado por atomización a 100 °C, La concentración fue el
factor que más incide en el secado por aspersión y al final se obtuvieron partículas con
morfología y tamaño variable, la uniformidad de las partículas dependió de la temperatura.
Palabras Clave
Extracto, secado por aspersión, polifenoles, maltodextrina, antioxidantes, conservación,
microscopía electrónica de barrido.
Capítulo 35
Abstract
It has been reported in the literature that propolis have an action against pathogens ,pro-
oxidant substances and free radicals because of its polyphenols content, this has motivated
the use of these compounds in the food and pharmaceutical industries. However, due to its
organoleptic properties and its ability to react with other compounds, their application has
been limited; therefore, the objective of this research was to propose a mechanism to protect
propolis and mitigate side effects granted by its components. To achieve the stated purpose
ethanolic extracts of propolis (EEP) from three samples from Santander were obtained and
their antioxidant and antimicrobial activity were evaluated in order to choose the extract with
the biggest potential. Subsequently mixtures of the extract with maltodextrin were prepared
by spray drying varying concentration and temperature, finally the yield, the
physicochemical, and antioxidant properties of the products were measured. It was
concluded that Socorro propolis was the best for the production of microencapsulated due
to their activity against pathogenic strains, for its large percentage of DPPH radical
inactivation and for his its high phenolic content. In spray drying, the concentration of
bioactive had a greater impact than temperature and the conditions set allowed a good
performance and the production of particles with high antioxidant potential and little chance
of proliferation of microorganisms. Also, it was concluded that the best conditions that
allowed us to obtain the best particles were obtained after drying a mixture 1:2 ( EEP:
Maltodextrin), besides the concentration is the most important variable in the spray drying
process, at the end we obtained particles of different sizes and shape and the uniformity of
the surface depends of the temperature.
Keywords: Spray drying, polyphenols, Maltodextrin, Encapsulation, Scanning Electron
Microscopy (SEM)
2.3. Introducción
Los propóleos son sustancias de carácter resinoso, elaborado por las abejas Apis mellifera
y Meliponini (Abejas sin aguijón) de los exudados de las plantas. Tienen como función la
protección de la colmena contra la acción de fuerzas mecánicas y agentes patógenos. La
composición es variable dependiendo de la ubicación geográfica, la especie de abeja y la
flora circundante (Ferreira et al., 2014). Han sido encontrados más de 200 compuestos en
Capítulo 36
diversas muestras de propóleos siendo los flavonoides como la quercetina y el kaempferol,
ácidos fenólicos como ácido p-cumárico y terpenóides, sustancias que tienen mayor
incidencia en la bioactividad sobre microorganismos patógenos. Esta sustancias son
usadas ampliamente en la industria de alimentos y farmacéutica como agentes
antioxidantes, bactericidas, viricidas y antiinflamatorios (Gutiérrez et al., 2012; Suarez et al.,
2014; Thirugnanasampandan et al., 2012). No obstante la utilización está limitada debido a
la presencia de compuestos volátiles, los cuales inciden negativamente en las
características organolépticas de los propóleos, igualmente la naturaleza adhesiva dificulta
la manipulación. Por ultimo cabe agregar que la composición química de los propóleos es
muy compleja y en algunos casos pueden contener hasta un 85 % de ceras, bálsamos
resinas, polen y otro tipo de impurezas. Estas sustancias junto con las sustancias bioactivas
pueden interactuar con otros componentes presentes en fármacos y matrices alimenticias
produciendo así compuestos no deseados (Da Silva et al., 2011). En este sentido la
microencapsulación podría presentarse como una alternativa que permite solucionar el
problema previamente planteado. La técnica en cuestión ha sido usada durante mucho
tiempo para poder enmascarar y proteger compuestos bioactivos de la luz, oxigeno, altas
temperaturas, agua y pH extremo. También podría permitir la liberación controlada de los
componentes, aumentando el potencial como nutracéutico y la vida útil de sustancias como
flavonoides y ácidos fenólicos (Ferreira et al., 2014). Existen diversos métodos de
microencapsulación entre los que se encuentran: La co-cristalización, la coacervación, al
gelificación iónica y el secado por aspersión. La última técnica mejor conocida como “spray
drying” consiste en la creación de un polvo a partir de la atomización y secado de una matriz
liquida conteniendo el bioactivo y el agente encapsulante, se pueden combinar varios
materiales de pared y permite obtener en corto tiempo una fracción significativa, no obstante
para garantizar una encapsulación eficiente y el mejor rendimiento posible es necesario
controlar la formulación de la mezcla para atomizar, así como las condiciones de aspiración,
presión, temperatura y flujo manométrico (Bruschi et al., 2003). El objetivo de este estudió
fue la micro encapsulación por medio de secado por aspersión de extractos etanólicos de
propóleos (EEP) provenientes del departamento del Santander en maltodextrina y evaluar
la actividad fisicoquímica, antioxidante y antimicrobiana de las micropartículas.
Capítulo 37
2.4. Materiales y métodos
2.4.1. Obtención del extracto etanólico de propóleos (EEP)
Las muestras de propóleos provenientes de abejas Apis mellifera y Meliponini (sin aguijón),
fueron obtenidas de apiarios en los municipios Oiba (6°15′50″N 73°17′57″O) y Socorro
ubicados en el departamento de Santander (6°28′04″N 73°15′35″O), los propóleos fueron
empacados al vacío hasta su utilización. Para la obtención de los extractos etanólicos de
propóleos, inicialmente fueron macerados manualmente y pesados 100 g, posteriormente
sometidos a extracción por 4 horas con 400 mL de etanol 96% y agitación constante a 500
rpm, posteriormente dejado en refrigeración en ausencia de luz por 24 horas. Después fue
filtrado, pesado el residuo, este último fue sometido a otras 2 extracciones con 100 mL de
etanol. A continuación se agregaron entre 50 y 100 mL de agua con el fin de precipitar las
ceras. La mezcla fue refrigerada de nuevo por 24 horas y las ceras fueron filtradas.
Finalmente la muestra fue colocada en roto evaporador a 40°C y determinado el porcentaje
de material soluble, material no soluble y ceras por método de gravimetría (Palomino, 2009).
2.4.2. Contenido de fenoles totales por el método de Folin Ciocalteu
Fue realizada la curva de calibración usando el reactivo de folin y ácido gálico, para este fin
fueron preparadas 7 soluciones de concentración: 0.04; 0.1;0.2;0.4; 0.6; 0.8 y 1.6 mg/mL
respectivamente y agregado a cada solución 2 ml de Na2CO3 al 10%. Las muestras fueron
mantenidas en oscuridad durante 24 horas y medida la absorbancia a 765 nm. Una vez
obtenida la ecuación de la recta se procedió a medir el contenido de fenoles totales de la
muestra tomando 500 µL de una alícuota la cual se diluyó con 47 ml de H2O destilada, luego
se adicionaron 2 mL de Na2CO3 al 10%. Las muestras fueron mantenidas en oscuridad por
igual tiempo que las muestras de la curva de calibración y finalmente la medición se efectuó
a 765 nm. Este ensayo se efectuó tanto para los EEP como para los productos del secado
por aspersión. La medición se efectuó 3 veces y se calculó el valor deseado según la
siguiente ecuación 1. (Farasata et al., 2014):
𝒅𝒙𝒎 = (𝑨𝒃𝒔𝒎−𝒃)
𝒎 Ecuación 1
Dónde:
Absm= absorbancia de la muestra
m = pendiente de la curva
Dxm = capacidad antioxidante en mg ácido Gálico/g muestra
b = intercepto
Capítulo 38
2.4.3. Estimación de la actividad antioxidante de polen y propóleos a través de la inactivación del radical DPPH
Fue preparada una solución de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) diluida en metanol con
concentración 0,0375 mg/mL. Posteriormente fue agitada la solución durante 30 minutos y
una vez terminada la agitación se procedió a la preparación del blanco, para esto fue
depositada una alícuota 5 mL en un tubo tapa rosca, se adicionó 1 mL de metanol y fue
sometida a calentamiento en un baño a 40 °C durante 5 minutos. Después del
calentamiento fue evaluada la absorbancia de la solución de DPPH a longitud de onda (λ)
de 515 nm.
Para evaluar el porcentaje de inactivación se adicionaron en un tubo 500 µL de la muestra,
500 µL de metanol y 5 ml de la solución de DPPH. El sistema con la muestra fue sometido
a calentamiento en un baño a 40 °C durante 5 minutos. Tanto el blanco como los productos
fueron sometidos a pruebas de espectrofotometría ultravioleta/visible (UV/VIS). Este ensayo
se efectuó tanto para los extractos etanólicos de propóleos (EEP) como para los productos
del secado por aspersión, la medición se efectuó por triplicado y se calculó el valor deseado
según la ecuación 2. (Ahn et al., 2007):
Ecuación 2.
Dónde:
Amuestra= absorbancia de la muestra
Amuestra= absorbancia del blanco
Capítulo 39
2.4.4. Evaluación de actividad antimicrobiana por el test de difusión en agar Mueller-Hinton
Para el análisis de la actividad inhibitoria fueron utilizadas cepas de Staphylococcus aureus
ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis ATCC13076 y Listeria
monocytogenes activadas en agar TSA durante 12 horas a 37 °C. La prueba se efectuó
sembrando 0,1 mL de cada cepa en concentraciones de 104 y 105 UFC. Adicionalmente fue
determinada la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), sembrando en pozos de 6mm de
diámetro 10 μL de las soluciones de EEP obtenidas a diferentes concentraciones 20%,
40%, 60%, 80% y 100% (diluciones en alcohol etanólico al 96%). El control negativo fue
alcohol etanólico al 96% y el positivo ampicilina 10 μL. Fueron incubadas durante 48 horas
a 37 °C (Gómez et al., 2014). Se observó el diámetro de inhibición y se calcularon el
promedio y las desviaciones estándar para cada muestra en las concentraciones
señaladas, fue establecido el diámetro igual o superior a 8mm como valor mínimo de
respuesta del extracto contra microorganismos patógenos. Se utilizó ANOVA de dos vías
para un diseño de dos factores con interacciones, utilizando el programa Matlab versión
7.12.0.635, fue realizada comparación múltiple entre tratamientos con test de Tukey y se
determinó la presencia o ausencia de una diferencia significativa (p< 0,05).
2.4.5. Preparación y caracterización de los micro encapsulados
Fue utilizada la metodología propuesta por Da Silva et al., (2011), modificando los rangos
de temperatura y concentraciones. Se elaboraron 8 muestras del microencapsulado, en
cada muestra había una mezcla de 90 g de maltodextrina en 450 mL de agua
manteniéndose así una relación constante entre el solvente y el agente encapsulante, se
agregó una cantidad variable de EEP y cada muestra sometida a diferentes temperaturas
de secado (Tabla 2.1). Las mezclas previamente mencionadas fueron sometidas a
homogenización realizada en Ultra-Turrax T25; IKA, Germany, a 15000 rpm por 2 minutos,
posteriormente se microencapsuló con ayuda del equipo Büchi B-191 Mini Spray Dryer. Las
condiciones de operación del spray drying fueron: % aspiración = 85; % bomba= 10; flujo
de aire y de alimentación: 0.60 m3/min y diámetro de la boquilla o inyector igual a 1,3 mm.
El análisis de actividad acuosa fue realizado mediante el equipo medidor de actividad de
agua marca Rotronic. modelo HygroLab C1, en este ensayo se colocaron los micro
encapsulados en las copas propias del equipo se realizaron las mediciones a
temperatura ambiente. La colorimetría fue realizada según el método Cielab y los cálculos de
rendimiento fueron realizados según la ecuación 3 (Da Silva et al., 2011):
Capítulo 1 40
(𝒎𝒎𝒊𝒄𝒓𝒐𝒆𝒏𝒄𝒂𝒑𝒔𝒖𝒍𝒂𝒅𝒐
𝒎𝒎𝒂𝒍𝒕𝒐𝒅𝒆𝒙𝒕𝒓𝒊𝒏𝒂 + 𝒎𝒔𝒐𝒍𝒊𝒅𝒐𝒔 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍𝒆𝒔 ) ∗ 𝟏𝟎𝟎 = % 𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐
Dónde:
M microencapsulado = Masa obtenida en la encapsulación
M maltodextrina = Masa del agente encapsulante
M solidos totales = Masa del contenido de solidos totales del extracto etanólico de propóleos
Tabla 2. 1. Composición de las condiciones de los micro encapsulados a elaborar vía
Spray-Drying
Muestra Relación
extracto/encapsulante
Volumen del extracto etanólico de
propóleos(ml)
Temperatura
( °C)
1 1:2 22,5 90
2 1:2 22,5 100
3 1:2 22,5 120
4 1:2 22,5 140
5 1:4 45 90
6 1:4 45 100
7 1:4 45 120
8 1:4 45 140
Capítulo 2 40
2.4.6. Evaluación de la morfología por Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
La morfología de los micro encapsulados fue observada usando microscopía electrónica de
barrido (SEM) ubicado en el edificio “Manuel Ancízar” de la Universidad Nacional De
Colombia. Los ensayos se realizaron en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de
Barrido. Las muestras fueron tratadas con carbono y aplicado recubrimiento metálico de
oro-paladio con la ayuda de un metalizador Q150R ES (Quorum). Posteriormente fueron
observados en microscopio electrónico de barrido Quanta 200 (FEI, USA), las condiciones
de operación fueron a 2×10-2 torr y 25.0 kV, empleando electrones secundarios (Sánchez,
2016).
2.4.7. Análisis Estadístico
Para el análisis estadístico de las diferentes variables fueron utilizados las pruebas: ANOVA
Kruskall Wallis y el análisis de componentes principales (PCA). Se emplearon los
programas Microsoft Excel y Matlab versión 7.12.0.635 y test de Tukey empleando
diferencia significativa (p< 0,05).
2.5. Resultados y discusión
Los resultados de la composición, contenido de fenoles totales y porcentaje de inactivación
del radical DPPH se muestran en la Tabla 2.2. Fue posible observar que el extracto obtenido
de propóleos de Apis mellifera del municipio del Socorro presentó mayor potencial como
agente oxidante y mejor calidad, debido a que el contenido de extracto predomina sobre el
porcentaje de ceras y material no soluble. El análisis de fenoles totales, según la
procedencia de los propóleos, presentó diferencia significativa (p<0.05) lo cual indica una
notable diferencia entre los extractos, es posible apreciar diferencias entre el extracto de
propóleos de abejas Meliponini con respecto a las de Apis mellifera. También fue observada
una diferencia significativa (p<0.05) en los valores del análisis DPPH entre los tratamientos,
siendo los propóleos de Socorro aquellos que poseen una actividad antiradicalaria más
marcada. Se observó que a mayor contenido fenólico total va a ser mayor la inactivación
de radicales libres debido a una mayor presencia de flavonoides y otros polifenoles.
Capítulo 2 41
Los porcentajes de ceras, material no soluble y de extracto están relacionados con la calidad
de los propóleos recolectados, a mayor cantidad de extracto etanólico y menor porcentaje de
ceras, los propóleos presentan mejores características, esto es debido a que el etanol es
miscible con la mayor parte de compuestos bioactivos como es el caso de polifenoles, ácidos
fenólicos, flavonoides y algunos terpenóides, entre otros. En este sentido según la legislación
Argentina, para que los propóleos puedan ser considerados de buena calidad, el porcentaje
de extracto obtenido debe ser superior al 30,1% y el porcentaje de ceras debe ser inferior al
40%, los propóleos provistos por apiarios de Municipios de Oiba y Socorro cumplen con ese
requisito, mientas que los propóleos de abejas Meliponini estuvo por debajo del valor
establecido para los extractos y superó los límites máximos permitidos de ceras. Este rango
tan amplio de valores se pueden deber a diferencias en la geografía, época de recolección,
técnica utilizada y en la habilidad del apicultor (Palomino, 2009).
Tabla 2.2. Composición y actividad antioxidante de los extractos etanólicos de propóleos
obtenidos, S1: Propóleos de Apis mellifera del Municipio de Oiba, S2: Propóleos de Apis
mellifera del Municipio de Socorro, SA: Propóleos de abejas Meliponini.
Muestra % ceras % no soluble % extracto % Inactivación DDPH mg GAE/g muestra
S1 10,9113 50,3747 33,6873 45,9038±0,4228a 141,395±7,1442a
S2 10,4575 42,5809 46,9616 83,006±0,1172b 147,1071±13,4636a
SA 16,3400 64,6958 18,9642 11,9837±1,2410c 40,9869±3,4669b
La muestra con mayor contenido de fenoles totales fue la obtenida a partir de propóleos de
Apis mellifera del Municipio del Socorro, seguida de las muestras del municipio de Oiba y por
ultimo están los propóleos producidos por abejas del genero Meliponini tal y como lo muestra
la Tabla 2.2. La concentración de fenoles totales para los extractos de los propóleos de
Socorro y de Oiba es alto comparado con los valores propios de propóleos originarios de
zonas tropicales de países como Brasil y Tailandia, donde el contenido de fenoles totales es
igual a 99,5 y 31,2 mg GAE/g de muestra respectivamente. Mientras que para las muestras
reportadas en la actual investigación, los valores oscilaron entre 141,3 y 147,1 mg GAE/g de
muestra tal y como se vio en la Tabla 2.2. No obstante, los valores son inferiores en
comparación con aquellos obtenidos en propóleos provenientes de zonas templadas y zonas
subtropicales como: España, Estados Unidos de América, Alemania y Japón, ya que el rango
de contenido fenólico para estos países se encuentra entre 174 y 300 mg GAE/g. Lo anterior
se debe a que en climas subtropicales y templados ciertas plantas sintetizan polifenoles con
mayor frecuencia debido a su utilidad como metabolitos secundarios (Kumazawa et al., 2004).
Los resultados indican que propóleos que presentaron alto contenido fenólico, también se
Capítulo 2 42
caracterizaron por un alto porcentaje de inactivación del radical DPPH que osciló entre el 46
y 83 % respectivamente, estos altos valores de inactivación se deben a la posible presencia
de flavonoides como quercetina, kaempferol y galangina (Ahn et al., 2009).
El resultado del análisis microbiológico por medio de la determinación del halo de inhibición,
es presentado en la Tabla 2.3. Los resultados indican que los propóleos de las abejas
Meliponini tienen poca actividad antagónica frente a las bacterias evaluadas, y solo
presentan acción contra Staphylococcus aureus en una dilución de EEP al 80 %. Caso
contrario sucede con los extractos obtenidos de muestras de los Municipios de Oiba y
Socorro de Apis mellifera, donde EEP del Municipio de Oiba al 20% presentan actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes. Las diluciones de
EEP del Municipio del Socorro al 20% presentó actividad contra Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes y además Escherichia coli. Los halos de inhibición de las bacterias
Gram positivas presentaron diámetros superiores a 15mm, mientras que el rango de los
halos de inhibición propios de las cepas Gram negativas oscilo entre 8 y 10,5 mm, los halos
de inhibición para bacterias Gram negativas solo fueron encontrados en los EEP
procedentes del municipio del Socorro. Los resultados de bioactividad y los análisis
fisicoquímicos indican que los propóleos del Socorro fueron los más indicados para la
elaboración de los micro encapsulados.
Tabla 2.3. Promedios de los diámetros de halos de inhibición obtenidos en el análisis de
actividad antimicrobiana (mm)
Propóleos Microorganismo 20% 40% 60% 80% 100%
Municipio
de Oiba
Apis
mellifera
S aureus 15,5±0,70a 15,5±2,12a
17±1,41a 17±1,41a
18,5±0,70a
E coli Xa Xa Xa Xa Xa
L
Monocytogenes
19,5±2,12b
19,5±1,41a
19,5±1,41a
19,5±1,41a
19,5±1,41a
S. enteritidis Xa Xa Xa Xa Xa
Capítulo 2 43
Municipio
de Socorro
Apis
mellifera
S aureus 19±2,82a 20,5±0,70b
21,5±2,12b 23±1,41b
25,5±2,12b
E coli 7,5±0,70b 8,5±0,70b
8,5±0,70b 8,5±0,70b
10,5±0,70b
L
Monocytogenes
19,5±0,70a
23±1,41b
24,5±0,70b
25,5±0,70b
25,5±0,70b
S enteritidis Xa Xa Xa Xa Xa
Abejas
Meliponini
S aureus Xc Xc Xc 9±1,42c 9,5±0,70c
E coli Xa Xa Xa Xa Xa
L
Monocytogenes
Xb
Xc
Xc
Xc
Xc
S enteritidis Xa Xa Xa Xa Xa
X= No hay actividad bacteriostática o bactericida del extracto etanólico de propóleos frente
al microorganismo patógeno. Letras a, b y c señalan la existencia de una diferencia
significativa (P<0,05) entre la actividad antimicrobiana de los 3 extractos etanólicos de
propóleos.
La acción antimicrobiana marcada de los 3 propóleos contra Staphylococcus aureus, así
como la amplia respuesta inhibitoria de 2 de los 3 extractos etanólicos de propóleos
estudiados contra Listeria Monocytogenes es debido principalmente a la acción de
polifenoles (resultados mencionados más adelante) que promueven la alteración de la
permeabilidad y la lisis celular, lo cual impide la formación de biopelículas microbianas
(Álvarez et al., 2012). Igualmente fueron mayores los halos de inhibición en el extracto de
propóleos del municipio del Socorro, lo cual se debió a una mayor concentración de
polifenoles o a la presencia de un constituyente base el cual puede ser el flavonoide
Quercetina. Solamente los extractos de propóleos del municipio del Socorro presentaron
actividad contra la cepa E Coli, en este sentido las bacterias Gram negativas poseen una
capa de peptidoglicano adicional que actúa como una barrera contra agentes externos lo
cual impide la acción de los polifenoles o limita su acción (Seidel et al., 2008). Según los
resultados del análisis de Concentración Mínima Inhibitoria (MIC), fueron seleccionados los
extractos etanólicos de propóleos del municipio del Socorro para elaborar los micro
encapsulados.
Capitulo 46
Tabla 2.4. Valores de colorimetría, rendimiento y actividad acuosa de las muestras de
encapsulados
Muestra
Relación
Extracto:
Encapsulante
Temperatura
( °C)
L
a
b
Rendimiento
(%)
Actividad
acuosa
1 1:2 90 92,12±0,11 1,39±0,04 9,56±0,17 52,95±3,20 0,36±0,08
2 1:2 100 90,91±1,32 1,64±0,22 10±0,34 42,29±0,96 0,39±0,03
3 1:2 120 90,91±0,27 2,005±0,05 10,77±0,25 40,64±1,19 0,39±0,02
4 1:2 140 91±0,15 1,93±0,04 10,67±0,09 40,96±1,23 0,40±0,01
5 1:4 90 90,51±0,19 2,015±0,02 10,41±0,04 76,66±5,17 0,34±0,003
6 1:4 100 90,54±0,19 2,045±0,06 10,43±0,13 73,12±2,81 0,25±0,004
7 1:4 120 89,89±0,27 2,36±0,12 10,57±0,46 52,69±1,45 0,23±0,005
8 1:4 140 88,25±0,15 2,66±0,24 11,10±0,43 51,98±1,97 0,23±0,004
Los resultados de las pruebas de colorimetría, rendimiento y actividad acuosa de micro
encapsulados son presentados en la tabla 2.4. Estos resultados indican que a mayor
cantidad de propóleos en la muestra, existe menor rendimiento de masa sólida. En
cuanto a los valores de colorimetría se puede observar que a mayor concentración del
extracto se presenta un leve decrecimiento en la luminosidad y un aumento en la
relación en los parámetros de croma. Igualmente a mayor concentración del extracto de
propóleos existe menor actividad acuosa, en este sentido los valores son inferiores a
0,6.
Los resultados sobre los valores de rendimiento (Tabla 2.4) fueron positivos, sin
embargo se puede observar que el secado por aspersión alteró la estructura de los
flavonoides y otros polifenoles, lo cual contribuyó al decrecimiento significativo del
contenido de fenoles totales. En este sentido, la variación en el contenido de fenoles
totales no se debió a la temperatura, sino al contacto no apropiado del atomizado con el
aire de secado. Otra posible explicación de ese fenómeno es que algunos ácidos
fenólicos pudieron sufrir procesos de metilación, metoxilación y esterificación al
interaccionar con el polisacárido, lo cual produjo alteraciones en la estructura química
(Jakobek, 2015). Aun así el contenido de fenoles de los micro encapsulados elaborados
a partir del extracto etanólico de propóleos del Municipio del Socorro, supera la
concentración de fenoles totales de muchos extractos obtenidos de propóleos
provenientes de regiones tropicales. Igualmente la cantidad de estos bioactivos en
polvo recolectado, supera los valores reportados en secado de propóleos por otros
autores (Da Silva et al., 2011).
Capitulo 47
Los resultados obtenidos de las muestras 1,2, 3 y 4 presentan mayor actividad acuosa que
el micro encapsulado obtenidos de las muestras 5, 6, 7 y 8 (Tabla 2.4). Esto se debe a una
mayor concentración de polifenoles, lo cual se traduce en una mayor cantidad de grupos
hidrofílicos capaces de ligarse al agua, la actividad acuosa de los extractos estuvo por
debajo de 0,6, por lo tanto es baja la probabilidad que bacterias patógenas puedan
desarrollarse. La concentración también influye en el parámetro color, debido a que se
presenta un leve cambio tanto en la luminosidad como en los parámetros de croma (Da
Silva, et al., 2013). Los rendimientos en micro encapsulaciones oscilaron entre el 40 y 76%,
existiendo una variabilidad entre las temperaturas manejadas y la concentración de los
compuesto bioactivos. Las muestras con relación 1:4 entre el agente encapsulante y el
extracto presentaron mayor rendimiento que aquellas donde esta relación fue 1:2. Esto se
debe a que una mayor cantidad de material encapsulante permite una mejor protección de
los propóleos contra altas temperaturas, lo cual podría impedir cambios degenerativos en
el bioactivo (Paini et al., 2015).
70
60
50
40
30
20
10
0 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140
Temperatura (°C)
Figura 2.1. Evolución del contenido de fenoles totales en mg GAE/ g de muestra para los
micro encapsulados de acuerdo a su temperatura y concentración. Letras a, y b señalan la
existencia de una diferencia significativa (P<0,05) entre el contenido fenólico total de los
micro encapsulados obtenidos a una misma temperatura pero con diferente concentración
del extracto etanólico de propóleos.
ab ab
ab
ab
Maltodextrina:EEP(1:4)
Maltodextrina:EEP(1:2) mg G
AE
/g m
ues
tra
Capitulo 48
ab
ab
Maltodextrina: EEP(1:4)
Maltodextrina:EEP (1:2)
% I
nac
tivac
ion D
PP
H
ab ab
72
67
62
57
52
47
42
90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 Temperatura (°C)
Figura 2.2. Valores del porcentaje de inactivación para los micro encapsulados de acuerdo
a temperatura y concentración. Letras a, b señalan la existencia de una diferencia
significativa (P<0,05) entre el porcentaje de inactivación del radical DPPH de los micro
encapsulados obtenidos a una misma temperatura pero con diferente concentración del
extracto etanólico de propóleos
La figuras 2.1 y 2.2 muestran los resultados de la evaluación del contenido de fenoles
totales y la inactivación del radical DPPH respectivamente, En las gráficas se puede ver
que existe una mayor actividad antioxidante de las muestras obtenidas con una mayor
concentración del extracto. No se presentaron cambios marcados en el contenido de
fenoles totales con la variación de la temperatura, se pudo observar que él porcentaje de
inactivación sufre un descenso a medida que incrementa la temperatura. Igualmente el
mayor descenso de pendiente se pudo ver entre 90 y 100 °C para los micro encapsulados
con una relación 1:4. Para las muestras con relación de concentración 1:2 el cambio más
brusco en la actividad antioxidante se presentó entre 100 y 120 °C. Lo anterior se dio
debido a la capacidad que tienen los flavonoides de formar interacciones hidrofóbicas y
puentes de hidrogeno con la maltodextrina. Otro factor que influyó en el contenido fenólico
fue la cantidad de extracto usado en la muestra ya que las muestras con menor proporción
del agente encapsulante maltodextrina fueron los que mostraron una mayor capacidad
para inactivar el radical DPPH, se encontró que la concentración afectó el arrastre de
radicales libres debido a las interacciones del polímero estructural con los metabolitos
secundarios (Jakobek, 2015). La temperatura tiene una incidencia en las pruebas
antiradicalaria, se pudo observar que el aumento del calor produce decrecimiento en el
Capitulo 49
potencial antioxidante debido al rompimiento de dobles enlaces y a la transformación de
los grupos ceto e hidroxi responsables de atrapar especies pro oxidantes, sin embargo los
procesos de encapsulado no afectaron drásticamente esta propiedad debido a que los
valores porcentuales de arrastre no fueron inferiores al 47% (Ferreira et al., 2014). El mejor
encapsulado obtenido fue el de la muestra 2 la cual se obtuvo efectuando el secado por
aspersión de una emulsión con una relación 1:2 de extracto etanólico de propóleos y
maltodextrina a 100 °C, debido a que presentó mejores propiedades antioxidantes y
fisicoquímicas.
Figura 2.3.Score plot obtenido del análisis de componentes principales (PCA) para
comparar las 8 formulaciones de acuerdo a los valores arrojados por los descriptores.
Muestra 1: EEP: maltodextrina 1:2, 90 °C, Muestra 2 EEP: maltodextrina 1:2, 100 °C,
Muestra 3 EEP: maltodextrina 1:2, 120 °C, Muestra 4 EEP: maltodextrina 1:2, 140 °C,
Muestra 5 EEP: maltodextrina 1:4, 90 °C, Muestra 6 EEP: maltodextrina 1:4, 100 °C,
Muestra 7 EEP: maltodextrina 1:4, 120°C, Muestra 8 EEP: maltodextrina 1:4, 140 °C
Capitulo 50
Figura 2.4. Loading plot de los descriptores en la microencapsulación obtenido del análisis
de componentes principales (PCA)
Las Figuras 2.3 y 2.4 presentan el análisis estadístico por componentes principales (PCA)
contienen los score plots y loading plots que permiten discriminar las muestras de acuerdo
a un conjunto de múltiples variables. Ambas graficas muestran que la temperatura no fue
el parámetro que presentó mayor variabilidad en la producción de encapsulados, la
diferencias de concentración y la relación entre el bioactivo y el material de pared fueron
las más significativas a la hora de llevar a cabo el proceso de secado, también tienen un
rol preponderante las diferencias significativas de la concentración de compuestos
polifenólicos que hay en una muestra así como la actividad acuosa para cada encapsulado;
a su vez fue posible observar que existe una diferencia menos marcada entre las muestras
que poseen una misma relación extracto/encapsulante.
Capitulo 51
Figura 2.5. Micro encapsulados analizados por medio de microscopia electrónica de
barrido (SEM) obtenidos en diferentes relaciones de concentración propóleos: agente
encapsulante y diferentes temperaturas (magnificación 2000x; escala: 50 µm): a) EEP:
maltodextrina 1:2, 90 °C b) EEP: maltodextrina 1:2, 100 °C c) EEP: maltodextrina 1:2, 120
°C d) EEP: maltodextrina 1:2, 140 °C e) EEP: maltodextrina 1:4, 90 °C f) EEP: maltodextrina
1:4, 100 °C g) EEP: maltodextrina 1:4, 120°C h) EEP: maltodextrina 1:4, 140
°C
a) 50 µm b) 50 µm
c) 50 µm d) 50 µm
g) 50 µm h) 50 µm
e ) 50 µm f) 200 µm
Capitulo 52
Durante el secado por aspersión fueron formadas partículas que presentaron variaciones
en forma y tamaño. Esto se puede deber a las diferencias entre la temperatura de secado,
la relación de concentración entre EEP y el material de pared, así como a la humedad que
puedan tener la muestra al encapsular y la cantidad de materia soluble que presenta el
extracto previamente tratado. La caracterización del micro encapsulado mediante SEM,
posibilitó determinar los efectos del encapsulante, concentración y temperatura utilizada.
Las imágenes de los tratamientos con maltodextrina (Figura 2.5: a, b, c, d, e, f, g y h)
muestran que los 8 tratamientos permitieron la obtención de partículas con morfología
esférica y simple. Además es posible observar formas irregulares (pliegues) y partículas
de núcleo dispersas en una matriz continua de maltodextrina. La aparición de partículas
con morfología irregular es debido al proceso de contracción y endurecimiento que ocurre
en el cilindro de pulverización, la cual es causada por el aire que queda atrapado en el
proceso de aspersión, provocando la aparición de ciertos relieves, asperezas y
depresiones (Campos et al., 2015), los fenómenos de contracción y endurecimiento
facilitan la formación de burbujas y vacuolas en el secado y estas se inflan cuando la
partícula llega a una temperatura igual a los 90 °C, en este sentido es generada presión
de vapor al interior de la partícula que excede la presión ambiente y por consiguiente es
producida ruptura de la estructura encapsulante (Nijdam & Langrich, 2006). A futuro se
puede controlar esta característica ejerciendo un mejor control de la velocidad de secado
y evaporación. También eligiendo material de pared con mejores propiedades visco
elásticas, porque el hinchamiento de las partículas es asociado con altos índices de secado
y ocurre cuando la maltodextrina es elástica, justo antes de la solidificación (Teixeira et al.,
2004). A medida que aumenta la temperatura la evaporación es mucho más rápida,
permitiendo una difusión más rápida y constante de agua, lo cual se traduce en partículas
con mayor uniformidad (Adame et al., 2015). Con una difusión más lenta de agua a menor
temperatura hay menos uniformidad, lo cual se traduce en una mayor presencia de
deformaciones, encogimiento de partículas, insolubilidades y rompimiento de la pared
(Alamilla-Beltrán et al., 2005). Adicional a esto, las micropartículas observadas tienden a
aglomerarse, esta característica es común en micro encapsulados producidos en el secado
por atomización, lo cual otorga mayor estabilidad al material de pared, evitando una
disminución drástica del contenido fenólico total y de la actividad antioxidante. Con una
mayor concentración del extracto se forman partículas más uniformes y con una mayor
aglomeración, esto se debe a una mayor humedad proporcionada por el extracto el cual
permite una difusión mucho más rápida de agua y por consiguiente permite la obtención
de superficies más lisas, sin rugosidades o depresiones.
Capitulo 53
Conclusiones
Los extractos etanólicos de propóleos de las abejas Apis Mellifera y Meliponini destacaron
por su alto contenido fenólico y su marcada actividad antiradicalaria en comparación con
extractos obtenidos de otras regiones tropicales. También hay que resaltar su poder
bactericida el cual es mucho más notorio en cepas Gram positivas. El extracto etanólico
elegido para la elaboración de los micro encapsulados fue aquel obtenido de los propóleos
del municipio de Socorro el cual se caracterizó por: Un mayor contenido fenólico, una
actividad antioxidante más pronunciada y una gama de bioactividades más amplia que con
el resto de muestras. Los procesos de microencapsulación realizados vía Spray Drying
permitieron la elaboración de micropartículas esféricas y simples, con un marcado
contenido de fenoles totales y una notable acción frente a radicales libres pese a que una
parte de los bioactivos presentaron reacciones químicas que condujeron a la reducción de
polifenoles disponibles. Por último la variable que más incidió la naturaleza de los micro
encapsulados fue la concentración de extracto etanólico de propóleos en cada formulación
y no la temperatura de secado
Agradecimientos
Agradecemos al Jardín Botánico de Bogotá por parte de la financiación y al Instituto de
Ciencia y Tecnología de Alimentos-ICTA.
Capitulo 54
2.8. Referencias
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& Bernad Bernad, M. (2015). Spray drying-microencapsulation of cinnamon infusions
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Capitulo 57
3. CAPITULO 3. ELABORACIÓN y CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE PELÍCULAS COMESTIBLES A PARITR DE QUITOSANO Y EXTRACTOS ETANÓLICOS DE PROPOLEO ENCAPSULADOS EN MALTODEXTRINA
Resumen
Uno de los aspectos más importantes en el desarrollo de nuevos métodos de conservación
fue conocer la formulación ideal para la conservación de matrices acuícolas. Con el fin de
saber cuál era la fórmula adecuada, fueron elaboradas películas comestibles que
posteriormente se sometieron a pruebas de caracterización para conocer su morfología,
propiedades fisicoquímicas, ópticas y mecánicas. Se diseñaron 6 formulaciones a base de
quitosano y extracto etanólico de propóleos encapsulado debido a su actividad frente a
patógeno y a su capacidad para crear redes poliméricas impermeables a gases y vapores
así como resistentes al daño físico. Las formulaciones se emplearon variando la
concentración del material de pared (1%p/v, 2%pv) y del bioactivo en cuestión (0,5 % p/v,
1% p/v, 1,5% pv) y se compararon los resultados obtenidos con métodos estadísticos y de
análisis multivariado. Se pudo observar que las matrices presentaron una mayor
impermeabilidad y grosor que las muestras control y que las muestras reportadas en la
literatura. Las películas también destacaron por su elevada uniformidad y su resistencia a
fuerzas mecánicas la cual fue mayor en comparación con otras matrices elaboradas a partir
de otros materiales de pared. Sin embargo la acción de algunos compuestos tuvo un
impacto negativo en las propiedades mecánicas y se dieron cambios en las propiedades
ópticas, el bioactivo tuvo un efecto en la matriz polimérica y se determinó que las películas
con 2%p/v de quitosano y 1,5 %p/v de encapsulado fueron las que exhibieron mejores
propiedades y sufrieron en menor medida el impacto negativo de sustancias no miscibles.
Palabras clave: Película comestible, Quitosano, Extracto Etanólico de propóleos
Capitulo 58
3.2. Abstract
It was necessary to establish which formulation is suitable for the preservation of
aquaculture products, that why edible films were made. These were to a characterization
in order to meet their morphology physicochemical and mechanical properties, optical. Six
Formulations of chitosan and propolis ethanolic extract encapsulated were developed
because of their activity against pathogens and due to their properties, which allows the
creation waterproof polymer networks against gases, vapor and physical damage. In the
six Formulations the concentration of comparison material (1% w / v, 2% pv) and the
bioactive concentrations (0.5% w / v, 1% w / v, 1.5% p/v) were changed and the results
obtained were compared with statistical and multivariate analysis methods. It was observed
that the matrices showed a mayor impermeability and thickness control samples and the
samples reported in the literature. Also these films showed a notorious uniformity of the
films and a bigger resistance to the physical damage compared with other edible films made
of other biopolymers .However the action of some compounds had a negative effect on the
mechanical properties and changed drastically the optical properties, the bioactive has an
effect on Polymer Matrix and it was determined that the films with 2% w / v of chitosan and
1.5% w / v encapsulated, exhibited the best properties and suffered in a lesser extent the
negative impact of immiscible substances.
Keywords: Edible film, Chitosan, Ethanolic Extract of Propolis
3.3. Introducción
Es posible elaborar a partir de biomoléculas y compuestos bioactivos recubrimientos que
permiten la conservación del alimento, las cuales sean comestibles y extiendan la vida útil
del producto, estas se conocen como películas comestibles, son capas delgadas las cuales
envuelven o protegen una matriz alimenticia y la función principal es aumentar la
resistencia del alimento del daño mecánico, físico, químico y microbiológico. Las
sustancias conservantes que podrían adicionarse mitigan el impacto de agentes externos
y patógenos en la matriz creando una atmosfera modificada, la cual regula la entrada y
salida de gases y compuestos aromáticos, a su vez su superficie contiene sustancias
bioactivas capaces de atrapar radicales libres y de producir la lisis celular de bacterias
patógenas. Cabe destacar que diversas formulaciones han probado tener actividad similar
o mayor efectividad que los métodos tradicionales de conservación (refrigeración y
empaque al vacío) y que se han podido elaborar a partir de diversos polímeros y
compuestos con acción frente a pro oxidantes, insectos, bacterias hongos y virus (Falguera
et al., 2011). En este sentido la incorporación de extracto etanólico de propóleos (EEP)
Capitulo 59
procedentes de abejas Apis mellifera donde han sido encontrados más de 200 compuestos
en diversas muestras de propóleos siendo los flavonoides como la quercetina y el
Kaempferol, ácidos fenólicos como ácido p-cumárico y terpenóides, sustancias que tienen
mayor incidencia en la bioactividad sobre microorganismos patógenos. Esta sustancias
son usadas ampliamente en la industria de alimentos y farmacéutica como agentes
antioxidantes, bactericidas, viricidas y antiinflamatorios (Gutiérrez et al., 2012; Suarez et
al., 2014; Thirugnanasampandan et al., 2012).
De otra parte las propiedades mecánicas y de barrera de las películas comestibles varían
de acuerdo a los reactivos usados y al protocolo empleado, como material de pared se han
usado proteínas, lípidos y polisacáridos entre los que se encuentran: La gelatina, la
caseína, el almidón, la pectina, la celulosa, el ácido esteárico, ceras y esteres de ácidos
grasos. Dentro de los materiales de pared destaca el quitosano, que es un polisacárido
lineal obtenido de la deacetilación de la quitina procedente del exoesqueleto de insectos y
crustáceos, y se pueden producir diferentes variedades de este copolímero cambiando los
grados de acetilación y por consiguiente alterando los pesos moleculares (Elsabee &
Abdou, 2013).
El quitosano posee numerosas ventajas sobre otros materiales de pared usados para
elaborar películas y recubrimientos, cabe la pena destacar que posee una permeabilidad
selectiva por los gases (CO2 y O2), buenas propiedades mecánicas y una bioactividad
mucho mayor que la de otros biopolímeros y biomoléculas usados debido a la interacción
electrostática entre el grupo amino del polisacárido y los grupos fosforilo de la membrana
celular la cual altera la estructura de la capa lipídica y acidifica el medio, no obstante su
alta permeabilidad al vapor de agua dificulta el control de la transferencia de agua y puede
anular tanto las ventajas del polímero como puede reducir su impacto en la conservación
de productos alimenticios (Domard et al., 2001).
La utilidad y las ventajas del polisacárido en cuestión lo hace un compuesto ideal para la
conservación de matrices alimenticias. A su vez se puede potenciar el carácter bactericida
y antioxidante de la película insertando compuestos bioactivos como el quitosano los
cuales pueden hacer sinergismo con el material de pared. La inserción de aceites
Capitulo 60
esenciales, ceras, grasas, y polifenoles puede ayudar a mejorar algunas propiedades
físicas y se debe buscar la formulación que garantice tanto el efecto barrera, una estructura
optima, una difusión controlada de gases y vapores así como un grosor y una elasticidad
óptimas (Aider, 2010). El objetivo de este trabajo fue caracterizar películas comestibles
conteniendo micro encapsulados de extracto etanólico de propóleos y quitosano por medio
de análisis fisicoquímicos y microestructurales.
3.4. Materiales y métodos
3.4.1. Elaboración de películas comestibles
Fueron utilizados ocho tratamientos correspondientes a dos formulaciones de quitosano y
cuatro concentraciones de EEP, entre los que se incluyen 6 tratamientos con
microencapsulado y 2 tratamientos control (películas sin microencapsulado) tal y como lo
indica la Tabla 3.1. Para preparar las películas comestibles fueron utilizados entre 2 y 4 g
de quitosano en 200 mL de solución de ácido láctico al 1 % v/v a 40 °C durante 2h, luego
la mezcla fue filtrada y fue adicionado tanto 1 mL de glicerol como 1 mL de tween 80 a 67
°C. Una vez adicionados los agentes plastificantes y tenso activos, fue utilizado ultra turrax
a 8000 rpm por 5 minutos. Posteriormente fueron agregados 0,5 g, 1 g y 1,5 g del micro
encapsulado de EEP. Las películas fueron desgasificadas en estufa a 45 °C por un periodo
de 24 horas o en un contenedor con vacío para eliminar la presencia de burbujas y
finalmente se almacenaron en un contenedor plástico a oscuridad hasta la realización de
las respectivas pruebas (Sánchez et al., 2010).
Tabla 3.1. Formulaciones de las películas comestibles evaluadas
Formulación
%
Microencapsulado
% Quitosano
%
Glicerol
%Tween
80
%
Ácido
láctico
%H2O
1 0 1 0,5 0,5 1 97
2 0,5 1 0,5 0,5 1 96,5
3 1 1 0,5 0,5 1 96
4 1,5 1 0,5 0,5 1 95,5
5 0 2 0,5 0,5 1 97
6 0,5 2 0,5 0,5 1 96,5
7 1 2 0,5 0,5 1 96
8 1,5 2 0,5 0,5 1 95,5
Capitulo 61
3.4.2. Contenido de humedad y espesor
Se usó el método 935.29 (AOAC, 2002) para evaluar la humedad y el espesor de la
película. Para la determinación de humedad fueron pesadas las películas una vez
elaboradas y transcurridas 48 horas. El espesor de las películas fue medido con un
micrómetro análogo marca MITUTOYO®, se obtuvo el grosor empleando 3 muestras de la
misma formulación y por cada muestra se midió el grosor en 9 puntos distribuidos a lo largo
de toda la película (Rodríguez et al., 2014).
3.4.3. Análisis de propiedades mecánicas
El método de extensibilidad fue usado para medir fuerza tensil, porcentaje de elongación
y la elasticidad, y se llevó a cabo de acuerdo al método estándar ASTM D882. Para los
ensayos fue empleado un texturómetro TA.XT Plus modelo, de marca Stable Micro
Systems®, Scarsdale, procedente de Estados Unidos. La velocidad del test fue de 50
mm/min; las muestras fueron cortadas en rectángulos de 25x100 mm. Fueron realizadas 3
réplicas para las 6 formulaciones mencionadas en la Tabla 3.1 y se obtuvieron curvas de
fuerzas vs tensión. Finalmente se compararon las variables y se determinó cual
formulación es más conveniente de acuerdo a su magnitud. El esfuerzo al corte se calculó
dividiendo la fuerza máxima por área de la sección transversal, la elongación se calculó
como el porcentaje de incremento de la longitud de la sonda y el modulo elástico se obtuvo
de la pendiente de las curvas de estrés vs tensión (Chang-Bravo et al., 2014).
3.4.4. Permeabilidad al vapor de agua
La determinación de la permeabilidad al vapor de agua se llevó a cabo de acuerdo al
método estándar ASTM E96. Primero se cortaron las muestras de cada formulación en
forma circular y se pusieron en la parte superior de los tubos de ensayo, también se agregó
sílica gel en el fondo. Estos tubos fueron colocados en un desecador con agua destilada
en el fondo y fueron pesados por 10 horas, en intervalos de 1 hora cada uno. La
permeabilidad de vapor de agua se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación
Capitulo 62
∗
𝑊𝑉𝑃 = ∆𝑚
𝑡 ∗ 𝐴 ∗ 𝑃0∗ 𝐿
Donde WVP es la permeabilidad del vapor de agua en g.mm.m-2.h-1.kPa-1; Δm es la variación
del peso de la sílica gel en g; t es la variación del tiempo en h; A es el área expuesta de las
películas en m2 y Po es la presión parcial de vapor de agua a 20°C (Šuput Z. et al., 2016).
3.4.5. Color
La colorimetría fue realizada según el método CIELAB. Fueron obtenidos los parámetros
de color de las películas para las 6 formulaciones usando un colorímetro MINOLTA
CR300® procedente de Japón. Se realizaron 3 mediciones por cada zona y se compararon
los parámetros de color así como la luminosidad. Adicional a las coordenadas CIE L*a*b*,
los parámetros de croma fue calculado en la ecuación 2
𝐶𝑎𝑏 = [(𝑎∗2 ∗ 𝑏∗2)]1/2 Ecuación 2.
C*ab = croma o índice de saturación, es un atributo cuantitativo del color y es proporcional
a su intensidad.
El tono fue calculado de acuerdo a la ecuación 3.
ℎ𝑎𝑏 = tan−1 (𝑏 ⁄𝑎∗) Ecuación 3.
h*ab ángulo del tono, que es un indicador cualitativo de la naturaleza cromática del color y
es expresada en grados (0° o 360° para rojo, 90° para amarillo, 180°para verde y 270°
para azul) (Pastor et al., 2013).
3.4.6. Evaluación de la morfología por Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
La microestructura del micro encapsulado fue observada usando microscopía electrónica
de barrido (SEM). En las muestras analizadas fue aplicado recubrimiento metálico de oro-
paladio con la ayuda de un metalizador Q150R ES (Quorum). Posteriormente fueron
observados en microscopio electrónico de barrido Quanta 200 (FEI, USA), las condiciones
de operación fueron 2*10-2 torr y 25.0 Kv, y se emplearon electrones secundarios (Sánchez,
2016).
3.4.7. Análisis Estadístico
Para cada variable se obtuvo el promedio y la desviación estándar, se realizó un análisis
estadístico de varianzas ANOVA o Kruskall Wallis dependiendo de la normalidad y la
Capitulo 63
homocedasiticidad de los datos el cual permitió determinar la similitud y/o diferencia de los
valores obtenidos (p< 0,05). También se efectuó análisis de componentes principales
(PCA). Utilizando el programa Matlab versión 7.12.0.635.
3.5. Resultados y discusión
En la Tabla 3.2 se presentan los resultados de contenido de humedad de las películas (%)
de las películas de quitosano y microencapsulado de propóleos y maltodextrina. El
contenido de humedad de las películas va disminuyendo a medida que va aumentando la
concentración del bioactivo como la concentración del material de pared. La adición de
extracto etanólico de propóleos encapsulado causa la formación de enlaces covalentes
entre los grupos funcionales de las cadenas de quitosano y los compuestos polifenólicos,
dando lugar a una disminución en la disponibilidad de los grupos hidroxilo y amino y
limitando las interacciones del agua por enlaces de hidrógeno, lo cual resulta en una
disminución del valor de contenido de humedad de las películas comestibles (Seyed et al.,
2010). Se pensaría que con la adición de maltodextrina a la película habría un mayor
número de grupos funcionales disponibles para interaccionar con el agua. No obstante esto
no fue posible debido a la alta concentración de flavonoides y polifenoles del encapsulado
utilizado. Este comportamiento no solo sucede con películas ricas en propóleos, también
sucede con toda película comestible que sea sometida a la agregación de un bioactivo polar
o con grupos hidroxilo y amino, diversos autores reportan que la adición de aceites
esenciales, ácidos grasos u otros compuestos bactericidas disminuyen la humedad (Bodini
et al., 2013; Bonilla et al., 2016), los resultados obtenidos en el presente estudio son
positivos ya que a un menor porcentaje de humedad se puede tener matrices que permitan
un menor desarrollo de bacterias patógenas, también a menor humedad las barreras son
mucho más selectivas contra el vapor de agua del medio
Capitulo 64
Tabla 3.2. Contenido de humedad de las películas (%) de las películas de quitosano y
microencapsulado de propóleos y maltodextrina. Letras a y b señalan la existencia de
una diferencia significativa (P<0,05) entre formulaciones con el mismo porcentaje de
quitosano pero con diferente concentración del microencapsulado a base de extracto
etanólico de propóleos.
Formulación
% Microencapsulado
(p/v )
% Quitosano
(p/v)
% Humedad
1 0 1 6,72±0,07a
2 0,5 1 5,86±0,08a
3 1 1 5,07±0,08a
4 1,5 1 4,21±0,06a
5 0 2 5,02±0,11b
6 0,5 2 4,23±0,06b
7 1 2 3,39±0,08b
8 1,5 2 3,06±0,05b
En la Tabla 3.3 son presentados los resultados de espesor (mm) de las películas de
quitosano y microencapsulado de propóleos y maltodextrina. La compactación de las
películas comestibles no solo intervino en la disminución de la humedad de las películas,
a su vez tuvo un efecto muy marcado en el espesor las matrices en cuestión. Al adicionar
el extracto etanólico de propóleos se dieron interacciones entre el quitosano y la
maltodextrina, como consecuencia se formó una estructura mucho más estable con
respecto al tratamiento control. Aquellas películas con un menor contenido de humedad
presentaron un mayor grosor, esto debido a que a una menor presencia del agua se dan
una mayor cantidad de interacciones y entrecruzamientos entre el quitosano y la
maltodextrina. También se pudo observar que el grosor fue mayor en comparación a
investigaciones realizadas por otros autores en películas de quitosano con otros bioactivos
agregados como aceites esenciales, mientras que para las películas de quitosano y aceites
de limón y naranja el espesor osciló entre 0,058-0,145 mm (Rodríguez et al., 2014), para
las películas elaboradas con el extracto microencapsulado se obtuvieron grosores entre
0,145 y 0,182 mm. Por último se vio una relación directamente proporcional entre la
concentración del material de pared y el grosor lo cual coincide con lo reportado en otros
trabajos que establecen una relación directamente proporcional entre el biopolímero y el
espesor (Singh et al., 2015).
Capitulo 65
Tabla 3.3. Espesor (mm) de las películas de quitosano y microencapsulado de propóleos
Letras a y b señalan la existencia de una diferencia significativa (P<0,05) entre
formulaciones con el mismo porcentaje de quitosano pero con diferente concentración del
microencapsulado a base de extracto etanólico de propóleos.
Formulación
% Microencapsulado
(p/v )
% Quitosano
(p/v)
Espesor ( mm)
1 0 1 0,133±0,003a
2 0,5 1 0,145±0,001a
3 1 1 0,1537±0,004a
4 1,5 1 0,1647±0,06a
5 0 2 0,147±0,002a
6 0,5 2 0,1643±0,004b
7 1 2 0,1703±0,003b
8 1,5 2 0,1827±0,002b
En la Tabla 3.4 son presentados los resultados de permeabilidad al vapor de agua de las
películas de quitosano y microencapsulado de propóleos y maltodextrina. Al observar los
resultados de la permeabilidad de vapor de agua se pudo ver que la adición del
microencapsulado de propóleos disminuyó la permeabilidad al vapor de agua en
comparación con el tratamiento control, a mayor concentración del bioactivo menor es la
permeabilidad. Algunos investigadores (Češek et al., 2014) afirman que existe una relación
directamente proporcional entre la permeabilidad y el espesor, no obstante esta propuesta
no concuerda con los datos obtenidos en la presente investigación. Una explicación de
este fenómeno radica en la naturaleza química de los flavonoides contenidos en el extracto
de propóleos encapsulados, la composición del bioactivo tiene un impacto marcado en la
permeabilidad, el encapsulado altera las interacciones entre las moléculas del polisacárido
que actúa como material de pared y el agua, pese a que el encapsulado se compone en
gran medida de polifenoles los cuales son polares también posee una considerable
cantidad de compuestos apolares comunes en los propóleos como terpenos e
hidrocarburos alifáticos. Los compuestos previamente mencionados reducen la capacidad
del polímero para unirse al agua, por lo tanto se ve un claro aumento de la hidrofobicidad.
Autores como Bodini et al., (2013) y Pastor et al., (2010) demuestran que la reducción de
la permeabilidad se presenta tanto en películas de materiales proteicos, como gelatina así
como en matrices donde el material de pared es un polisacárido como el caso de
hidroxipropilmetilcelulosa. En la literatura se ha reportado que la interacción entre
quitosano y otros polisacáridos como la maltodextrina disminuye la cantidad de grupos
funcionales polares disponibles y por consiguiente reducen los puentes de hidrogeno
Capitulo 66
presentes y la velocidad de transmisión del vapor de agua, como consecuencia se forma
red polimérica más hidrofóbica lo cual se traduce en una mayor impermeabilidad
(Vásconez et al., 2009).
Tabla 3.4. Permeabilidad al vapor de agua (g*mm /h*m2 *kPa) de las películas de
quitosano y microencapsulado de propóleos y maltodextrina, Letras a y b señalan la
existencia de diferencias significativas (P<0,05) entre formulaciones con el mismo
porcentaje de quitosano pero con diferente concentración del microencapsulado a base
de extracto etanólico de propóleos.
Formulación
% Microencapsulado
(p/v )
% Quitosano
(p/v)
Permeabilidad al
vapor de agua
(g*mm /h*m2
*kPa)
1 0 1 6,04±0,06a
2 0,5 1 5,10±0,09a
3 1 1 4,36±0,10a
4 1,5 1 3,74±0,06a
5 0 2 5±0,20b
6 0,5 2 4,16±0,04b
7 1 2 3,46±0,15b
8 1,5 2 3,06±0,11b
La Figura 3.1. Presenta los resultados de análisis de colorimetría y Luminosidad. Al
observar los valores obtenidos para las propiedades ópticas, es posible visualizar que con
un aumento de la concentración del bioactivo las películas pierden luminosidad, el valor se
mantuvo alto en las formulaciones con menor contenido de propóleos encapsulado debido
a la coloración del quitosano y la maltodextrina, aun así el extracto etanólico de propóleos
era de color rojo oscuro lo cual incidió en el brillo, aumentando su opacidad a medida que
aumentaba la presencia del bioactivo en la matriz biopolimérica. Las películas comestibles
se encontraron ubicados en el primer cuadrante de la escala CIELAB (+a*, +b*) indicando
una tendencia hacia coloración roja y amarilla, debido a la magnitud positiva de ambos
valores. La coordenada a* muestra en las formulaciones una tonalidad rojiza muy marcada,
tanto en el tratamiento control como en otros estudios es observado que el parámetro a*
es muy bajo y en algunos casos como en la elaboración de películas de quitosano con
aceites esenciales (Pereda et al., 2011) tiende a valores negativos, por lo cual se puede
inferir que existe influencia del extracto etanólico de propóleos, el cual era de coloración
rojo oscuro previo su proceso de encapsulación. El parámetro b* fue producto de los 2
polisacáridos que actuaron como agente encapsulante. Reportes de otros autores indican
que tanto quitosano como la maltodextrina tienen una coloración muy clara y eso influyo
Capitulo 67
en la tendencia de las películas que presentaron algunas coordenadas propias de matrices
de color amarillo (Jridi et al., 2014). Las películas presentaron valores entre 48,48–78,39
para L*, 15,20 –26,30 para a* y 1,56–3,03 para b*. La adición del bioactivo tuvo un efecto
notable sobre sobre todo en el brillo y en la tonalidad de las muestras, en este caso no solo
el bioactivo influyó en el color sino también se evidenció una marcada influencia de los
materiales de pared. Lo anterior puede afectar considerablemente la aplicación del
recubrimiento en la industria alimenticia ya que el color de estas muestras es bastante
oscuro y la película dista de ser transparente, esto puede afectar la percepción sensorial
del consumidor. El ángulo del tono de los encapsulados osciló entre 1,46 y 1,47 °, estos
valores estuvieron cercanos al 0 y muestran una marcada tendencia al rojo de las películas,
para ninguna de las 6 formulaciones hubo variaciones. Caso contrario, sucedió con los
parámetros de croma, la saturación de color entre las formulaciones presentó diferencias
significativas (p<0.05), mostrando mayor saturación en las películas con una mayor
proporción del material de pared y del extracto etanólico de propóleos encapsulado.
Capitulo 68
(a)
(b)
(c)
(d)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
0 0,5 1 1,5
L*
% Microencapsulado
1 %Quitosano
2%Quitosano
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
0 0,5 1 1,5
a*
% Microencapsulado
1% Quitosano
2% Quitosano
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
0 0,5 1 1,5
b*
%Microencapsulado
1%Quitosano
aa ab ab ab
ab ab ab ab
ab ab ab ab
Capitulo 69
(e)
Figura 3.1. Comparación de los datos obtenidos por colorimetría, (a) Luminosidad, (b)
parámetro a*(c) parámetro b*(d) C*ab (e) h*ab. Letras diferentes entre columnas significan
diferencia significativa (P<0,05) entre formulaciones con una misma concentración del
microencapsulado
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C*a
b%Microencapsulado
1%Quitosano
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
h*a
b
%Microencapsulado
1%Quitosano
2%Quitosano
ab ab ab ab
aa aa aa aa
Capitulo 70
La Figura 3.2 presenta los resultados de la comparación de las propiedades mecánicas,
esfuerzo de corte, elongación y módulo elástico. Se puede ver claramente una relación
inversamente proporcional entre el esfuerzo de corte y el módulo elástico, mientras que la
elongación de ruptura sufrió un aumento en formulaciones con una mayor concentración
de bioactivos. Este comportamiento es muy normal en películas con varios materiales de
pared y bioactivos cuya composición suele ser variada (Mali et al., 2006), pese a que la
red de biopolímeros desarrollada es muy estable, algunos compuestos del extracto
etanólico no son completamente miscibles, como consecuencia disminuye la cohesión de
la estructura polimérica, lo cual conduce a la aparición de discontinuidades en la matriz; el
fenómeno previamente mencionado se evidencia en la presencia de poros de las películas
(Chang-Bravo et al.,2014). La consecuencia de este fenómeno es que las películas serán
menos resistentes a los daños mecánicos que los tratamientos control. Aun así los valores
de las propiedades mecánicas son mayores en comparación a otras películas de quitosano
reportadas en la literatura, Bonilla et al (2013) mostraron varios estudios acerca de
películas a base de quitosano, almidón celulosa y gelatina y aceites esenciales cuyo
valores de esfuerzo de corte oscilaron entre 33 y 57 MPa, a su vez estas películas
presentaron porcentaje de elongación inferiores al 20 % y valores de modulo elástico que
oscilaron entre los 10 y 30 MPa respectivamente, Por ultimo cabe destacar que entre las
formulaciones con 1% y 2 % p/v de quitosano se presentaron diferencias significativas más
que todo en los tratamientos control y en las muestras con una mayor concentración de
propóleos encapsulado.
(a)
95 aa aa aa aa
90
85
80
75
70
65
60
1% Quitosano
2% Quitosano
0 0,5 1 1,5 % microencapsulado
Esfu
erzo
al c
ort
e d
e la
s p
elíc
ula
s (M
Pa)
Capitulo 71
1 3 5 7 9 11
1 3 5 7 9 11
1%
2%
(b)
ab aa aa ab
35
25
15 Quitosano
5 Quitosano
-5
%Microencapsulado
(c)
35 aa aa aa aa
30
25
20
15
10
5
0
%Microencapsulado
1%Quitosa no
2%Quitosa no
Elo
nga
ció
n (
%)
Mo
du
lo e
last
ico
(M
Pa)
Capitulo 72
Figura 3.2. Comparación de las propiedades mecánicas entre las películas con el
encapsulado y el tratamiento control, (a) esfuerzo de corte (b) elongación (c) módulo
elástico (MPa), Letras a y b señalan la existencia de una diferencia significativa (P<0,05)
entre formulaciones con el mismo porcentaje de quitosano pero con diferente
concentración del microencapsulado a base de extracto etanólico de propóleos.
La Figuras 3.3 y 3.4 presentan los resultados para las películas analizadas por medio de
microscopia electrónica de barrido (SEM) obtenidas a partir de diferentes concentraciones
de quitosano y EEP. La morfología de las películas comestibles obtenidas varían de
acuerdo a la formulación empleada, en general las películas de quitosano y propóleos
encapsulado fueron mucho más uniformes y presentaron menos fracturas en comparación
con otras formulaciones de películas comestibles que involucran diversos bioactivos
reportados por otros autores (Abugoch et al., 2011), cabe destacar que a menor
concentración de quitosano se vieron un número mayor tanto de poros como de fracturas
en las formulaciones , mientras que las formulaciones de concentración de quitosano
mayor, presentaron una superficie más limpia y homogénea, lo anterior se pudo deber a
varios factores: El primero fue que las películas con una menor concentración del
polisacárido poseen una red mucho más débil que aquellas cuya concentración del
material de pared es más elevada debido a un menor entrecruzamiento (Bodini et al.,
2013), el segundo factor fue que estas películas presentan un menor grosor, por ende
estas matrices son más propensas a sufrir cambios en su morfología por acción de las
elevadas temperaturas aplicadas luego del proceso de secado y aquellas alteraciones son
más visibles a nivel superficial, coincidiendo con otros autores (Rodriguez et al., 2014). A
su vez se observa que la porosidad y el número de fracturas, va incrementando a medida
que se agrega una mayor cantidad del bioactivo. Las ceras, polifenoles y otros compuestos
no miscibles al distribuirse por toda la matriz son capaces de romper la continuidad de la
red polimérica y son capaces de conferir una estructura mucho más rugosa a la película,
esto vuelve a solidificar el análisis efectuado a los datos obtenidos de las propiedades
mecánicas en donde el decrecimiento de la fuerza tensil y del módulo elástico se deben a
la distribución de sustancias a lo largo de la matriz. Por último los cortes transversales de
las películas muestran varias laminas apiladas, lo cual corrobora la afirmación efectuada
en la parte inicial del análisis en donde se planteaba la posibilidad que se hubiese dado
múltiples entrecruzamientos entre el quitosano y maltodextrina, trayendo como
consecuencia la aparición de multicapas, coincidiendo con lo expuesto por López et al,
(2011).
Capitulo 73
Figura 3.3. Películas analizadas por medio de microscopia electrónica de barrido (SEM)
obtenidas a partir de diferentes concentraciones de CH y EEP encapsulado a) quitosano:
1%p/v, microencapsulado EEP: 1% b) quitosano: 1%p/v, microencapsulado EEP: 1,5% c)
quitosano: 2%p/v, microencapsulado EEP: 0,5% d) quitosano: 2%p/v, microencapsulado
EEP: 1,5%
(a) 100 µm 500µm
(b) 100 µm 500µm
(c) 100 µm 500µm
(d) 100 µm 500µm
Capitulo 74
Figura 3.4. Películas analizadas por medio de microscopia electrónica de barrido (SEM)
obtenidas a partir de diferentes concentraciones de CH y EEP encapsulado a) quitosano:
1%p/v, microencapsulado EEP: 0,5% b) quitosano: 2%p/v, microencapsulado EEP: 1%
Las figuras 3.5 y 3.6 muestran los resultados del score plot y el loading plot obtenidos luego
de efectuar el análisis de componentes principales para las películas comestibles
conteniendo bioactivos de EEP y quitosano. Se puede observar que existe reproducibilidad
de los datos tanto para las películas con el encapsulado como para los 2 controles
(películas a base quitosano sin el microencapsulado con quitosano al 1 y 2 %) debido a la
cercanía que existe entre las 3 réplicas para cada muestra. Es posible ver que para las
muestras con una concentración de quitosano igual al 2 % p/v se encuentran en la parte
superior, mientras que aquellas con una cantidad de quitosano equivalente al 1 %p/v está
en la parte inferior del Score Plot. No hubo presencia de outliers y se observa influencia de
gran parte de los parámetros a la hora de diferenciar los tratamientos, concordando con
Petterson et al., (2005). Tanto la concentración de bioactivo y el material de pared, así
como el espesor y los parámetros de croma a* y Cab se ubican en la parte derecha del
“loading plot”, por ende fueron las variables que permitieron una diferenciación mucho más
clara de las muestras. Las propiedades mecánicas, fisicoquímicas y ópticas se ubicaron
en la parte izquierda del loading plot y no tuvieron un impacto tan considerable en la
selección de una matriz adecuada. Lo anterior se debe a que estos valores dependen
directamente de las concentraciones, el espesor y el parámetro de croma, además los
análisis estadísticos mostraron que no existe diferencia significativa (p>0.05) entre estos
(a) 100 µm 150µm
(b) 100 µm 200µm
Capitulo 75
valores. Por último se dedujo que la mejor formulación para elaborar los recubrimientos
comestibles fue aquella donde la concentración de quitosano fue del 2% p/v y 1,5 % p/v de
EEP encapsulado y presenta mejores valores para humedad, espesor y permeabilidad
además las propiedades mecánicas y morfológicas son óptimas pese a la acción negativa
de algunos compuestos del extracto de propóleos encapsulado sobre la red de quitosano.
Figura 3.5. Score plot obtenido del análisis de componentes principales (PCA) para
comparar las películas comestibles de acuerdo a los valores arrojados por los descriptores,
CH: Quitosano, PE: Propóleos encapsulado. CH 1%: Película con quitosano al 1 % p/v,
CH 2%: Película con quitosano al 2 % p/v, CH 1% PE 0,5%: Película con quitosano al 1 %
p/v y microencapsulado al 0,5 % p/v , CH 1% PE 1%: Película con quitosano al 1 % p/v y
microencapsulado al 1% p/v , CH 1% PE 1,5 %: Película con quitosano al 1 % p/v y
microencapsulado al 1,5 % p/v, CH 2% PE 0,5%: Película con quitosano al 2 % p/v y
microencapsulado al 0,5 % p/v , CH 2% PE 1%: Película con quitosano al 2 % p/v y
microencapsulado al 1% p/v , CH 2% PE 1,5 %: Película con quitosano al 2 % p/v y
microencapsulado al 1,5 % p/v
Capitulo 76
Figura 3.6. Loading plot de la variables fisicoquímicas y de las propiedades mecánicas
de las películas comestibles de quitosano y extracto etanólico de propóleos
encapsulado en maltodextrina obtenido del análisis de componentes principales (PCA)
Conclusiones
Las películas elaboradas a partir de quitosano y extracto etanólico de propóleos
encapsulado en maltodextrina presentaron una baja permeabilidad, una baja humedad, así
como un notable grosor. Con respecto a otras películas de quitosano reportadas en la
literatura, las películas presentaron propiedades mecánicas muy notables y una
uniformidad en su superficie bastante considerable, sin embargo la acción de compuestos
no miscibles rompe la continuidad de la red polimérica, disminuye la permeabilidad al agua
y hace que la película sea más propensa a la ruptura por fuerzas mecánicas que el
tratamiento control. También se ve que la intensidad del color el extracto etanólico de
propóleos encapsulados condiciona la coloración de la película comestible. Teniendo en
cuenta todos estos factores se puede concluir que el encapsulado incide
considerablemente en las propiedades fisicoquímicas de las películas comestibles de
quitosano. La película con un 2% de p/v de quitosano y 1,5 % p/v de extracto etanólico de
propóleos encapsulado fue seleccionada para efectuar estudios futuros de conservación
debido a que fue la membrana con mayor grosor, menor humedad, mayor impermeabilidad
y un mayor porcentaje de elongación así como un menor número de poros y fracturas.
Capitulo 77
Agradecimientos
Los autores agradecen al Jardín Botánico de Bogotá por parte de la financiación y al
Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos-ICTA.
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Capitulo 4 79
4. CAPITULO 4. DETERMINACION DE LA VIDA UTIL DE FILETES DE CACHAMA BLANCA (Piaractus brachypomus) UTILIZANDO RECUBRIMIENTO COMESTIBLE CONTENIENDO BIOACTIVOS
Resumen
Existe la necesidad de conservar filetes de especies acuícolas debido a su corto tiempo de
vida útil, valor nutricional y amplio consumo, entre ellas se encuentra la cachama blanca
(Piaractus brachypomus) nativa de la Orinoquia y Amazonia Colombiana. El objetivo de
este trabajo fue estudiar el efecto de conservación de un recubrimiento comestible
conteniendo quitosano y extracto etanólico de propóleos (EEP) encapsulado en
maltodextrina, sobre filetes del pescado cachama. El recubrimiento se aplicó por inmersión y
fue evaluada la vida útil por medio de análisis fisicoquímicos como pH, bases volátiles totales
de nitrógeno (BVT- N), prueba de ácido tiobarbitúrico e índice de peróxidos. Por ultimo cabe
destacar que se efectuó un análisis microbiológico que incluyó la determinación de
mesofilos, coliformes, Staphylococcus y Salmonella. Los resultados indican que fueron
encontradas diferencias significativas (p<0.05) para los análisis fisicoquímicos entre los
filetes sin recubrimiento comestible y aquellas que si lo tenían, a su vez se estimó que el
recubrimiento tuvo incidencia en la proliferación de microorganismo. El recubrimiento
comestible prolongó la vida útil debido a que los bioactivos del recubrimiento y el quitosano
controlaron la acción de los procesos de oxidación y la incidencia de los patógenos.
Palabras Clave Oxidación lipídica, Prueba del ácido 2-Tiobarbiturico (TBA), Índice de
peróxidos (PV), Bases Nitrogenadas Volátiles Totales (BNVT), Actividad Antimicrobiana,
Prueba de textura (TPA), Análisis Sensorial
Capitulo 4 80
Abstract
There is a need to preserve aquaculture matrices due to their high nutritional value and its
broad consumption, one of those species is the white cachama (Piaractus brachypomus),
this fish is located in the rivers of eastern Colombia and the previously mentioned species
needs more study. Therefore, in a paper the effects of an alternative method of preservation
of shell life were investigated, the method used is the application of an edible coating made
from chitosan and ethanolic extract of propolis (EEP) encapsulated in maltodextrin. The
coating was applied by immersion and after that, we investigated the post mortem quality
changes of the fish performing physicochemical and microbiological analysis. pH, volatile
bases, test thiobarbituric acid and peroxide value were tested; finally, we studied the effect
of the coating on mesophilic strains, coliforms and other microorganisms such as
Staphylococcus, and Salmonella. Finally, we concluded that the coating prolongs the shelf
life, because it acts as a barrier to oxygen and moisture, the bioactive compounds trap free
radicals and the coatings changes the metabolism and cause the cell lysis of the
microorganisms. It was determined that the concentration of malonaldehyde, the volatile
basic nitrogen content and pH are the variables that distinguish more clearly between the
samples with the treatment and the control samples.
Keyword: Lipid Oxidation, TBA test, Peroxide Value, Total Volatile Basic Nitrogen (TVB-
N), TPA test, Sensorial analysis, Antimicrobial Activity
Introducción
Los productos acuícolas son bien conocidos por proveer una amplia gama de
constituyentes beneficiosos para la dieta humana, son ricos en proteínas nutricionales
fáciles de digerir, vitaminas liposolubles (A, D, E y K), micro elementos (I, Fe, Ca, Cu, Zn) y
ácidos grasos poliinsaturados. No obstante los filetes de especies acuícolas tienden a sufrir
deterioro debido a la acción microbiana, enzimática, por el pH cercano a 7, y por la facilidad
para presentar reacciones de oxidación lipídica y proteica. Factores que han sido
recientemente prioritarios como control en diversos trabajos de conservación, puesto que
se ha visto la alta susceptibilidad de los ácidos grasos a los procesos oxidativos, que afectan
las propiedades organolépticas y el valor nutricional (Pérez-Alonso, et al., 2003).
La cachama blanca (Piaractus brachypomus) es un pez originario de las cuencas
hidrográficas de la Orinoquia y Amazonia de Colombiana. Es una especie importante para
Capitulo 4 81
la economía y la industria acuícola de la región y el país, puesto que este pescado
representa la segunda mayor producción, después de la tilapia (Oreochromis sp). De otra
parte, las películas y recubrimientos comestibles presentan una interesante opción para
conservación de productos acuícolas. Diversas sustancias pueden ser adicionadas en las
películas comestibles como conservantes, saborizantes, vitaminas, minerales, entre otros.
En este sentido la adición de extractos etanólicos de propóleos (EEP) y quitosano al
recubrimiento comestible podría actuar como conservante. Los propóleos son sustancias
de carácter resinoso, elaborado por las abejas Apis mellifera proveniente de los exudados
de las plantas. Tienen como función la protección de la colmena contra la acción de fuerzas
mecánicas y agentes patógenos. La composición es variable dependiendo de la ubicación
geográfica, la especie de abeja y la flora circundante (Ferreira et al., 2014). Han sido
encontrados más de 200 compuestos en diversas muestras de propóleos siendo los
flavonoides como la quercetina y el Kaempferol, ácidos fenólicos como ácido p-cumárico y
terpenóides, sustancias que tienen mayor incidencia en la bioactividad sobre
microorganismos patógenos. Las sustancias previamente mencionadas han sido
reportadas en la literatura como agentes antioxidantes, bactericidas, viricidas y
antiinflamatorios, siendo usadas ampliamente en la industria de alimentos y la industria
farmacéutica (Thirugnanasampandan et al., 2012). No obstante la utilización de los
propóleos está limitada debido a la composición de compuestos volátiles, los cuales inciden
negativamente en las características organolépticas, además la naturaleza adhesiva
dificulta la manipulación. Por ultimo cabe agregar que la composición química de los
propóleos es muy compleja y en algunos casos pueden contener hasta un 85 % de ceras,
bálsamos resinas, polen y otro tipo de impurezas. Estas sustancias junto con los
compuestos bioactivos pueden interaccionar con otros componentes presentes en
fármacos y matrices alimenticias produciendo así sustancias no deseadas (Da Silva et al.,
2011). De otra parte el quitosano es obtenido del exoesqueleto de insectos y crustáceos y
es reconocido en diversas investigaciones por sus propiedades antimicrobianas,
farmacológicas y medicinales (Zargar et al., 2015). Además es un excelente polisacárido
que posee numerosas ventajas sobre otros materiales de pared para la elaboración de
películas y recubrimientos comestibles. El objetivo de este trabajo fue evaluar la utilización
de películas comestibles conteniendo extractos etanólicos de propóleos y quitosano en
filetes de cachama, por medio de análisis fisicoquímicos y microbiológicos para conocer el
impacto de los recubrimientos en la conservación del producto.
Capitulo 4 82
4.4. Materiales Y Métodos
4.4.1Obtención de filetes de cachama
Las muestras de cachama fueron obtenidas en un establecimiento comercial, 30 peces de
500g fueron comprados y conducidos bajo refrigeración al laboratorio de procesamiento. Al
pescado se le extrajeron las vísceras, las escamas fueron removidas y obtenidos los filetes.
El filete fue empacado al vacío hasta el momento del análisis, fue picado en pequeños
trozos, se pesaron 100 g de carne picada en una caja de Petri y se dejó la muestra en la
estufa a 104 °C por 24 horas, finalmente se retiraron las muestras y se colocan en el
desecador. Para cada muestra se obtiene la masa luego de las 24 horas con el fin de
conocer el contenido de humedad presente en la matriz alimenticia
4.4.2. Proceso de micro encapsulación
Fue utilizada la metodología propuesta por Da Silva et al., (2011), modificando los rangos
de temperatura y concentraciones. Se elaboraron 8 muestras del microencapsulado de
acuerdo a los valores mencionados en la Tabla 4.1, en cada muestra había una mezcla
cuya relación maltodextrina: agua fue 1:5. Se agregó una cantidad variable de EEP y cada
muestra sometida a diferentes temperaturas de secado (Tabla 1). Las mezclas previamente
mencionadas fueron sometidas a homogenización realizada en Ultra-Turrax T25; IKA,
Germany, a 15000 rpm por 2 minutos, posteriormente se microencapsuló con ayuda del
equipo Büchi B-191 Mini Spray Dryer. Las condiciones de operación del spray drying fueron:
% aspiración = 85 %; % bomba= 10 %; flujo de aire y de alimentación: 0.60 m3/min y diámetro
de la boquilla o inyector igual a 1,3 mm.
Capítulo 83
Tabla 4. 1. Composición de las condiciones de los micro encapsulados a elaborar vía
Spray-Drying
Muestra Relación
extracto/encapsulante
Volumen del extracto etanólico de
propóleos(mL)
Temperatura
( °C)
1 1:2 22,5 90
2 1:2 22,5 100
3 1:2 22,5 120
4 1:2 22,5 140
5 1:4 45 90
6 1:4 45 100
7 1:4 45 120
8 1:4 45 140
4.4.3. Elaboración de los recubrimientos comestibles
Fue elaborado el recubrimiento comestible a partir de quitosano 2%p/v; extracto etanólico
de propóleos encapsulado 1,5 %p/v. En primer lugar se preparó una mezcla de 800 mL de
láctico al 1 % v/v, esta mezcla se calentó a 40 °C, posteriormente fueron disueltos 16 g de
quitosano en la solución, se dejó con agitación constante durante 2 horas para luego ser
sometido a un proceso de filtración, se adicionaron con agitación 16 mL de glicerol y 8 mL
de tween 80 seguido de 12 g del microencapsulado, una vez adicionado todo se empleó el
ultraturrax a 8000 rpm por 3 min, se desgasificó la solución a 25 °C y se ajustó el pH de la
solución a 3,5.
Muestras de filete de cachama de 50g fueron utilizadas para los ensayos del recubrimiento
comestible, la inmersión se efectuó durante 5 minutos a temperatura ambiente y se dejó
secar y escurrir por un periodo de 30 minutos para eliminar el exceso. Posteriormente cada
muestra fue empacada al vacío en un empaque multilaminado (Alico® Bogotá, Colombia)
y almacenados en un refrigerador a at 4 ±1°C para realizar los análisis en los días 0, 4, 8,
12,16 y 20. Igual número de muestras fueron procesadas para el tratamiento control. Las
muestras empacadas se almacenaron en cava de refrigeración a 4°C±2 y se retiraron
según se fuesen adicionando, a su vez se elaboraron recubrimientos comestibles con
Capítulo 84
quitosano y extracto etanólico de propóleos sin encapsular, esto se efectuó con el fin de
estudiar el impacto de la encapsulación sobre la textura y las propiedades sensoriales y se
siguió el proceso anterior, la única diferencia radicó en que se empleó el extracto de
propóleos puro en vez de las micro cápsulas con maltodextrina (Rodríguez, 2015).
4.4.4. Extracción de compuestos lipídicos vía Soxhlet
Luego de la remoción de agua, se pesaron 12 g de muestra en un filtro de soxhlet y se usó
150 mL de éter de petróleo como disolvente. La extracción se efectuó por un tiempo
aproximado de 4h, posteriormente somete a un proceso de rota evaporación y una vez
concluido es almacenada en refrigeración hasta el momento del análisis. Posteriormente
fue obtenida la masa inicial y la masa final del balón con el extracto para poder calcular el
contenido total de grasa de la muestra (Horwitz, 2000).
4.4.5 Prueba del ácido 2-Tiobarbiturico (TBA)
La prueba del ácido 2-Tiobarbiturico permitió establecer el impacto de los procesos de
oxidación secundaria en las muestras de cachama con y sin recubrimiento, el principal
objetivo de este análisis es medir la concentración de malonaldehído presente en las
muestras en los días 0, 4, 8, 12,16 y 20 respectivamente. Finalmente cabe mencionar que
el ensayo consistió en un experimento de espectrofotometría UV/VIS en donde primero se
elaboró una curva de calibración a partir de disoluciones de 1, 1, 3,3-tetrametoxipropano y
posteriormente se midieron las absorbancias de las muestras para así obtener la cantidad
del volátil en cuestión para cada muestra
4.4.5.1. Curva De Calibración
Inicialmente fue preparada una solución 10-3 M de 1,1,3,3-tetrametoxipropano agregando
0.1710 ml de este compuesto en un balón aforado de 1 L, después se prepararon
diluciones de entre 1*10-8 M hasta 1,4*10-7 M utilizando alícuotas de ,0.2,0.4,0.6,0.8,1, 1.2
y 1.4 ml respectivamente y colocándolas en balones aforados de 50 ml. Posteriormente se
llevó a cabo la reacción del TBA con el malonaldehído haciendo reaccionar 5 ml de las
diluciones previamente preparadas y 5 ml de una solución 0,02 M de TBA en tubos de
ensayo, se llevaron los tubos a baño maría a temperatura de ebullición por 35 minutos,
luego se efectuaron las lecturas de absorbancia a 532 nm y se obtuvo el valor de TBA.
Capítulo 85
4.4.5.2. Prueba de TBA por el método de extracción
Fue pesado un tubo de centrifuga 1 g de la muestra de grasa de cachama blanca obtenida
en la extracción soxhlet, luego se adicionó 5 ml de solución de ácido tricloroacético al 10
%, se homogenizó por 5 minutos y a su vez se agregó 5 ml de solución 0,02 M de TBA. La
muestra se centrifuga a 3500 rpm por 5 minutos y se somete a una filtración con el fin de
separar los sólidos. El líquido es transvasado a tubos de ensayo, los cuales fueron puestos
en baño maría a temperatura de ebullición por 35 minutos, Finalmente se efectuaron las
lecturas de absorbancia a 532 nm teniendo así el valor de TBA. El ensayo se efectuó 3
veces por muestra, se calculó el promedio y la desviación estándar, el resultado se expresa
en mg malonaldehído (MDA)/kg muestra y se calcula de acuerdo a la ecuación 1
mg MDA
Kg 𝑝𝑒𝑠𝑐𝑎𝑑𝑜=
(𝐴𝑏𝑠 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜) ∗ 72,03 𝑔/𝑚𝑜𝑙 ∗ 𝑚𝑙 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 ∗ 𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑢𝑟𝑣𝑎 ∗ 1000
En la ecuación previamente señalada mg MDA/Kg de solvente es la concentración del
malonaldehído, el peso molecular (PM) de MDA es igual a 72.03 g/mol, mL totales
corresponde a la suma del volumen, para terminar la pendiente y el intercepto se obtiene
de la curva de calibración mencionada con anterioridad (Tironi et al.,2007).
4.4.6. Prueba del índice de peróxidos por el método yodo métrico
Fueron pesados 2 g de la muestra de grasa obtenida en la extracción soxhlet en un
Erlenmeyer de 250 mL al cual fue agregado 12 ml de cloroformo y 18 ml de ácido acético.
Posteriormente se preparó una solución saturada de KI diluyendo 15 g de la sal en 20 mL
de agua y se agregó 1 mL de la sal anteriormente mencionada, se dejó reposar 5 min
garantizando la formación del Iodo (I2). Una vez transcurrido el tiempo se adicionaron 30
mL de agua destilada y 1 mL de una solución indicadora de almidón la cual produce una
coloración violeta. Finalmente se tituló la solución con tiosulfato de sodio 0,01 N y se
observó el cambio de coloración, pasando de un purpura oscuro a una tonalidad lechosa.
El ensayo se efectuó a 3 muestras de 0, 4, 8,12, 16 y 20 días de almacenamiento
(Bhavbhuti et al., 2015) y el índice se calculó según la ecuación 2.
Ecuación 1
Capítulo 86
𝐼 =0.01 𝑁 ∗ 𝑉𝑡𝑖𝑜𝑐𝑖𝑎𝑛𝑎𝑡𝑜
2 ∗ 1000
En donde I es el índice de peróxidos, 0,01 N es la concentración del tiocianato y 2
corresponde a la masa de grasa en gramos usada para el análisis.
4.4.7. Determinación del contenido de nitrógeno volátil total (BVNT)
Con el fin de conocer el contenido de nitrógeno total se empleó el método según Goulas y
Kontominas (2005) modificado, donde no fue adicionado MgO. Fueron homogenizados 10
g de carne picada de pescado, con 90 mL de la disolución ácido perclórico (6% p/v) durante
1 min y el homogeneizado obtenido se centrifugó a 3000 rpm durante 5 min y el
sobrenadante filtrado con papel filtro. En un tubo de destilación tipo Kjeldahl se introducen
50 mL del filtrado y se adicionaron unas gotas de fenolftaleína, se verificó que la coloración
fuese purpura garantizando así la alcalinidad. Los tubos se llevaron a la unidad de
destilación, donde se adicionan 6,5 mL de una disolución acuosa de NaOH (20% p/v) y se
efectuó una destilación durante 10 min. El destilado se recogió sobre 100 mL de la
disolución acuosa de ácido bórico (3% p/v). Finalmente, la disolución recogida se tituló con
ácido clorhídrico 0,01 N, utilizando el indicador de Tashiro. Se efectuó un blanco siguiendo
el mismo procedimiento sin adición de la muestra de carne picada de pescado. Por último
se empleó la ecuación 3 para saber la cantidad de nitrógeno volátil.
𝑚𝑔 𝑁
100 𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=
(𝑉𝑚 − 𝑉𝑏 ) ∗ 0,14 ∗ 2 ∗ 100
𝑀
En donde mg N/100 g muestra es la concentración de nitrógeno volátil, Vm es volumen de
ácido clorhídrico empleado en la valoración de la muestra en mililitros, Vb es el volumen del
blanco y M masa de la muestra en gramos
4.4.8. Determinación microbiológica de las muestras de cachama
Los análisis microbiológicos fueron realizados los días 0, 4, 8, 12,16 y 20 de
almacenamiento. Fue empleada una cantidad de 10 g de muestra, de al menos 3 paquetes
diferentes por cada lote sin recubrimiento (SR) y con recubrimiento (CR). Cada muestra
fue almacenada en bolsas de plástico estériles (Whirl-Pack®) con 90 mL de agua peptona
Ecuación 2
Ecuación 3
Capítulo 87
estéril (0,1%) (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) y homogenizado en mezclador Stomacher
(modelo Stomacher® 400 circulator) durante 2 min. Partiendo de ahí fueron realizadas
diluciones seriadas de 10-2 hasta 10-6 utilizando agua peptonada estéril. El procedimiento
de recuento para E. Coli. (NTC 4899., 2001) se realizó con siembra de diluciones seriadas
10 -2 hasta 10-6 en superficie usando agar MacConkey (Oxoid), que posteriormente se llevó
a incubación con una temperatura de 37°C durante 24 h. Las colonias típicas fueron
aisladas en agar tripticasa de soya (TSA) y la confirmación se realizó mediante la prueba
de confirmación bioquímica en tubo. El recuento de Staphylococcus coagulasa positiva
(NTC 4779., 2007) fue realizado mediante siembra de diluciones seriadas de 10-2 hasta 10-
6 en superficie utilizando agar Baird Parker (Merck), incubado a 37°C durante 48 h,
posteriormente fue realizada la prueba de coagulasa para las colonias sospechosas. Todos
los recuentos microbiológicos se expresaron como el registro de las unidades formadoras
de colonias por gramo (UFC/g) de muestra. Para determinar la presencia de Salmonella
sp (NTC 4574., 2007) fueron empleados 25 g de cada muestra en 225 mL de agua
peptonada, las muestras fueron incubadas a 37°C durante 18 h aprox.
4.4.9. Determinación de valores de pH en las muestras de cachama
Los valores de pH para carne de cachama blanca se determinaron usando un pHmetro
Jenway® 3510, con inserción directa en la muestra, se efectuaron 3 medidas en 3
regiones diferentes del filete.
4.4.10. Análisis de perfil de textura (TPA) para la carne de cachama
Para los ensayos fue empleado un texturómetro TA-XT y fue usada una sonda P75. Los
parámetros de las pruebas fueron los siguientes: Velocidad pre test=1.0 mm/s; velocidad
del test = 2.0 m/s; velocidad post test=5.0 mm/s; distancia= 5 mm; tiempo=15 s. La
cachama blanca mide 87 cm y se dividió en 3 regiones, se efectuaron 2 mediciones por
cada región para las muestras de cada día. Posteriormente se analizaron los resultados
tanto de firmeza, adhesividad, cohesividad, masticabilidad, gomosidad y resistencia para
los 3 tipos de tratamientos, el primero es el tratamiento control, el segundo es un
tratamiento con un recubrimiento de propóleos sin encapsular y el ultimo es el
recubrimiento comestible elaborado con quitosano y propóleos encapsulado, se
compararon los datos de las muestras recubrimiento y se determinó el impacto del método
de conservación sobre la red polimérica (Szczepanik et al., 2010).
Capítulo 88
4.4.11. Análisis Sensorial
La aceptación del producto se evaluó basándose en las características de olor, color, sabor
y textura, utilizando una prueba sensorial con panel de consumo compuesto de 20
personas no entrenados, miembros de diferentes departamentos; mediante una escala
hedónica de 5 puntos, con los siguientes descriptores: Me disgusta mucho= 1, me
disgusta= 2, ni me disgusta, ni me gusta= 3, me gusta = 4 y me gusta mucho=5. Mediante
un formato de evaluación Las muestras fueron tajadas y cortadas en porciones de 2,0 cm
(10 g aprox.) e identificadas con números aleatorios de tres cifras, puestas en bandejas
blancas individuales para cada panelista. La evaluación fue realizada en un área ventilada,
de buena iluminación, libre de olores extraños y el orden de las muestras servidas para los
panelistas fue al azar a través de las sesiones. Se compararon 3 clases de tratamientos,
el primero es el de la cachama sin recubrimiento, el segundo es el de la cachama con un
recubrimiento de propóleos sin encapsular, finalmente se comparó el tratamiento de la
película de quitosano con el extracto de propóleos encapsulado (Rodríguez Triviño, 2015).
4.4.12. Análisis Estadístico
Para cada variable se obtuvo el promedio y la desviación estándar, se realizó un análisis
estadístico de varianzas ANOVA o Kruskall Wallis dependiendo de la normalidad y la
homocedasiticidad de los datos el cual permitió determinar la similitud y/o diferencia de los
valores obtenidos (p< 0,05). También se efectuó un análisis de componentes principales
(PCA). Utilizando el programa Matlab versión 7.12.0.635. El cual se usó para efectuar una
exploración de los datos y así poder determinar las similitudes existentes entre las
muestras de 0, 4, 8, 12,16 y 20 días.
Capítulo 89
4.5. Resultados y discusión
En las figuras 4.1, 4.2, 4.3 y 4.4 son presentados los resultados del análisis TBA, peróxidos,
pH y BVT-N respectivamente, para filetes de cachama con y sin recubrimiento comestible
durante el periodo de almacenamiento. La Figura 4.1 muestra que el valor más alto de
malonaldehído para la prueba de TBA se obtuvo a los 12 días de almacenamiento,
mientras que los resultados de la gráfica 2 indican que el valor más alto de índice de
peróxidos se presentó en aquellas muestras almacenadas durante 8 días, a partir de ahí
el contenido de peróxidos disminuyó de manera considerable. Los valores más altos de
índice de peróxidos para la cachama pudieron ser consecuencia de la acción de
compuestos bioinorgánicos como es el caso de la hemina, la mioglobina y la hemoglobina,
estas heteroproteínas actúa como un agente pro oxidante transformando los ácidos grasos
en derivados hidroxiperóxidos (Richards et al., 2002). Los productos de la oxidación
primaria como los hidroxiperóxidos y los radicales peróxido y superoxo son susceptibles a
descomponerse en derivados volátiles y no volátiles, lo cual explica que el valor de índice
de peróxidos (Intarasirisawat et al., 2014). El índice de peróxidos máximo admisible es de
10meq O2/Kg, para todas las muestras los niveles está por debajo del máximo permitido
de la reglamentación, esto se puede deber al contenido reducido de ácidos grasos
polinsaturados de la matriz, lo que hace de esta matriz menos susceptible a los procesos
de rancidez que otras especies acuícolas reportadas en la literatura. Con respecto a la
curva de TBA obtenida para filetes de cachama, podemos observar que los valores de
malonaldehído son altos, esto se puede deber a la inestabilidad de los hidroxiperóxidos
resultantes de la oxidación lipídica del pescado, resultando en la formación de compuestos
volátiles entre los que se incluyen el malonaldehído reactivo. A partir de los 12 días de
almacenamiento, la concentración de malonaldehído empieza a disminuir debido a que
este compuesto empieza a reaccionar con azucares, amino ácidos, glucosa y otros
constituyentes del pescado durante el almacenamiento, los niveles de malonaldehído son
mayores a 1 mg MDA/Kg, donde para pescado fresco el valor aceptado oscila entre 0.7 y
1 mg MDA/Kg. Esto indica que desde ese periodo empieza la formación de olores
desagradables y otros compuestos volátiles, coincidiendo con otros estudios (Jouki et al.,
2014). Las gráficas 4.1, 4.2, 4.3 y 4.4 muestran que no hay diferencias significativas entre
los valores de la prueba de TBA, Índice de peróxidos, pH y bases volátiles en los primeros
4 días, no obstante los análisis estadísticos demostraron que hay diferencias significativas
Capítulo 90
entre los datos recolectados para las muestras con y sin recubrimiento a los 8, 12, 16 y 20
días (p<0.05) y que la reducción de las magnitudes para las muestras tratadas con el
recubrimiento comestible es considerable, por ende al existir una disminución de estos
valores se puede considerar que los recubrimientos comestibles a base de quitosano y
extracto etanólico de propóleos previamente encapsulado con maltodextrina son capaces
de detener procesos degenerativos como la oxidación lipídica, reducir la formación de
aminas y mitigar la proliferación de microorganismos, no obstante para esto se deben tener
en cuenta los resultados del análisis microbiológico. En las gráficas 4.3 y 4. 4, se pueden
ver que los valores de pH y de bases volátiles totales propios del pescado sin el
recubrimiento empiezan a superar los límites permitidos (NTC 5443) pasados los 12 días,
caso contrario presentan las muestras con recubrimiento, donde los valores de pH no
superan el valor de 6,8, y tampoco presentan un contenido de nitrógeno total superior a 30
mg N/100 g. A partir de 16 días de almacenamiento estos valores comienzan a superar las
magnitudes previamente mencionadas por lo cual se puede afirmar que el recubrimiento
comestible con extracto de propóleos encapsulado amplía la vida útil del producto por 4
días, coincidiendo con otras investigaciones (Cespedes et al., 2015). Se puede ver que no
hay diferencia significativa entre el recubrimiento con propóleos encapsulado y sin
encapsular, no se observaron cambios fisicoquímicas a lo largo del periodo de
almacenamiento. Este comportamiento es debido a la naturaleza de la maltodextrina, no
hubo un incremento en los valores de oxidación lipídica, bases volátiles y pH debido a que
la maltodextrina actuó como un biopolímero el cual es capaz de proteger a los compuestos
polifenólicos del extracto de propóleos durante los procesos de elaboración del
recubrimiento, inmersión y durante el almacenamiento de las muestras, demostrando que
la maltodextrina no solo ayuda a facilitar su manipulación y enmascarar propiedades
sensoriales indeseables sino que además protege a los bioactivos de posibles cambios
químicos que puedan alterar su bioactividad, reportado igualmente por otros autores
(Velasco et al., 2003).
La razón principal por la cual los tratamientos con el recubrimiento de quitosano y
propóleos encapsulados en maltodextrina presentan una vida útil más extensa se debe al
sinergismo entre los polisacáridos estructurales y los polifenoles contenidos en el extracto
etanólico. El quitosano reduce la penetración agentes como vapor de agua y oxígeno, esto
mitiga las reacciones de hidrolisis, permite el decrecimiento de la capacidad de las
Capítulo 91
bacterias para llevar a cabo reacción de deaminación oxidativa de las proteínas y los
compuestos nitrogenados, así como retrasan los procesos de oxidación primaria y
secundaria en la matriz acuícola, el quitosano puede interaccionar con la maltodextrina lo
cual confiere estabilidad a la red polimérica en cuestión (Weinjao et al., 2013).Los
compuestos fenólicos en particular los flavonoides presentan sinergismos con el quitosano
lo cual potencia la acción del biopolímero previamente mencionado, su rol es mucho más
pronunciado en procesos de oxidación primaría debido a la efectividad de los flavonoides
como la quercetina de inactivar los radicales libres, estos polifenoles actúan de 2 maneras,
la primera las partículas de núcleo dispersas en la parte exterior de la matriz migran de la
barrera al alimento y la otra consiste en un arrastre de radicales libres que tienen contacto
con el recubrimiento comestible, estos resultados concuerdan con estudios donde
bioactivos antioxidantes mitigan la descomposición (Gallego et al,.2016).
Figura 4.1. Evolución y comparación de la concentración de malonaldehído en mg
MDA/Kg muestra respecto al tiempo en las muestras de cachama con y sin el
recubrimiento comestible. Letras a y b señalan la existencia de diferencias significativas
(P<0,05) entre muestras de cachama almacenadas por un mismo periodo de tiempo y
tratadas con diferentes formulaciones de recubrimientos comestibles
Capítulo 92
Indice peroxidos sin recubrimiento( meq O2/Kg)
Indice peroxidos con recubrimiento ( meq O2/Kg)
Indice de peroxidos propoleo sin encapsular (meq O2/Kg)
0 5 10 15 20
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
dias
Figura 4.2. Evolución y comparación del valor de la concentración de meq O2/Kg respecto
al tiempo de los filetes de cachama con y sin recubrimiento comestible. Letras a y b
señalan la existencia de diferencias significativas (P<0,05) entre muestras de cachama
almacenadas por un mismo periodo de tiempo y tratadas con diferentes formulaciones de
recubrimientos comestibles
8,5
8
7,5
7
6,5
6
5,5
5 0 4 8 12 16 20
Días
Figura 4.3. Evolución y comparación de los valores de pH respecto al tiempo de los filetes
de cachama con y sin recubrimiento comestible Letras a y b indican señalan la existencia
de diferencias significativas (P<0,05) entre muestras de cachama almacenadas por un
mismo periodo de tiempo y tratadas con diferentes formulaciones de recubrimientos
comestibles
a b a
pH propoleo encapsulado a b a
pH sin recubrimiento a b a
pH propoleo sin encapsular
a b a
a a a
a a
Val
ore
s p
H
(meq
O2
/Kg)
Capítulo 93
a b b
45,00
40,00
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00 0 4 8
Dias
12 16 20
Figura 4.4.Evolución del contenido de bases volátiles de nitrógeno total respecto al tiempo
de los filetes de cachama con y sin recubrimiento comestible. Letras a y b indican señalan
la existencia de diferencias significativas (P<0,05) entre muestras de cachama
almacenadas por un mismo periodo de tiempo y tratadas con diferentes formulaciones de
recubrimientos comestibles
Los resultados de análisis microbiológicos son presentados en la tabla 4.2 y 4.3. Fue
comprobado que no hubo presencia de microorganismos patógenos transmitidos por la
manipulación.
Tabla 4.2. Análisis microbiológico para filetes de cachama (Piaractus brachypomus) sin
recubrimiento comestible.
( Días) Tiempo de almacenamiento
Microorganismo 0 4 8 12 16 20 Referencia
Mesofilos (log UFC/g) 3 3,2 3,96 5,47 4,98 5,47 /
Coliformes Totales (UFC/g) 300 380 340 489 892 1100 100-400
Coliformes Fecales (UFC/g) 89 64 43 44 18 4 100-400
Staphylococcus coagulasa positiva (UFC/g)
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
100-1000
Salmonella /25g N N N N N N N
Clostridium (UFC/g) A A A A A A /
Sulfito reductores ( UFC/g) < 10 < 10 < 10 < 10 < 14 < 10 /
mg N/100 g muestra sin recubrimiento
mg N/100 g muestra propoleo encapsulado
mg N/100 g muestra propoleo
a b b
a b b
sin encapsular a b b
a a
a a a mg
N/1
00
g m
ues
tra
Capítulo 94
Tabla 4.3. Análisis microbiológico para filetes de cachama (Piaractus brachypomus) con
recubrimiento comestible.
( Días) Tiempo de almacenamiento
Microorganismo 0 4 8 12 16 20 Referencia
Mesofilos (log UFC/g) 3 3,2 3,46 4,43 4,87 5,47 /
Coliformes Totales (UFC/g) 240 330 310 341 798 1100 100-400
Coliformes Fecales (UFC/g) 89 59 40 38 12 3 100-400
Staphylococcus coagulasa positiva (UFC/g)
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
100-1000
Salmonella /25g N N N N N N N
Clostridium (UFC/g) A A A A A A /
Sulfito reductores ( UFC/g) < 10 < 10 < 10 < 10 < 14 < 10 /
Los valores de Staphylococcus no sobrepasaron los 100 UFC/g y no hubo presencia de
Salmonella, lo cual indica la utilización de buenas prácticas en la manipulación. Los
conteos para coliformes totales y fecales que se presentaron en las muestras con o sin
recubrimiento, se deben a la contaminación cruzada que se da en el medio de cultivo de
los peces y a la presencia de la piel en el filete, y al hecho que parte de las bacterias
presentes en branquias, intestinos y piel no se pueden remover por completo de la muestra.
El contenido de coliformes está dentro del valor límite solamente para los primeros días,
establecido por la resolución colombiana del Ministerio de Salud y Protección Social 122
del 2012. Posteriormente los tratamientos con y sin recubrimiento no cumple con lo
establecido por la norma la cual establece un límite no mayor a 240 UFC/g de coliformes.
También se puede observar que la cantidad de organismos mesofilos se encuentra dentro
de la norma así como la presencia de organismos sulfito reductor. Por último los resultados
indican que ninguno de los tratamientos hubo presencia de Clostridium. Tanto las muestras
almacenadas a los 0, 16 y 20 días con y sin el recubrimiento comestible presentaron
resultados muy similares en el análisis microbiológico lo cual se debió a los siguientes
factores. A los 0 días las muestras estaban todavía frescas y tanto para los filetes de
cachama con y sin recubrimiento no se habían visto significativamente deterioradas por la
proliferación de patógenos y los procesos de oxidación lipídica, por otro lado a los 16 y 20
días los filetes de cachama con y sin recubrimiento ya han sufrido un deterioro muy
marcado, el recubrimiento a partir de los 12 días no pudo mitigar el impacto de la formación
de volátiles y la incidencia de gases provenientes del entorno, esto favoreció el aumento de
las unidades formadoras de colonia lo cual facilitó la descomposición del alimento. Se puede
apreciar una brecha mayor entre las muestras con y sin recubrimiento en aquellas muestras
Capítulo 95
Du
reza
(N
)
almacenadas durante 4,8 y 12 días respectivamente, esto se debe a que durante este
tiempo los bioactivos del recubrimiento pueden mitigar el impacto de los procesos
oxidativos lo cual reduce el número de unidades formadoras de colonia. No obstante para
Staphylococcus coagulasa y sulfito reductores los resultados fueron muy similares debido
a que ambos organismos son Gram positivos y con condiciones óptimas de refrigeración y
manipulación se puede controlar la incidencia de ambos patógenos. En cuanto a coliformes
fecales y mesofilos, la presencias de estos patógenos fueron menor en aquellas muestras
con el recubrimiento de quitosano y extracto etanólico de propóleos encapsulado. El
recubrimiento fue efectivo para contrarrestar tanto bacterias Gram positivas como Gram
negativos, donde el quitosano no solo actúa como una barrera (Sabaghi et al., 2015), sino
que además posee una considerable bioactividad la cual aumenta debido al
entrecruzamiento de las cadenas laterales, valores de pH favorables para algunos
bioactivos con los cuales pueden darse sinergismos como los flavonoides presentes en los
propóleos (Pillai et al., 2009). El sinergismo que existe entre el polisacárido modificado y
los polifenoles permite atravesar tanto la membrana interna que es hidrofóbica (Grosvenor
et al., 1995), como la capa de peptidoglicano la cual es de carácter hidrofílico. En la figura
4.5 son presentados los resultados del análisis de perfil de textura para filetes de cachama
con y sin recubrimiento comestible.
(a)
abb
5
4
abb
abb
abb
Sin recubrimiento
Extracto etanólico de propóleos Propóleos encapsulado
3
2 aab
1
0
abb
0 5 10 15 20 Dias
Capítulo 96
Co
hes
ivid
ad
Elas
tici
dad
(m
m)
0,3
(b)
aaa
aaa
aaa
0,25
0,2
0,15
0,1
aaa
aaa
aaa
Sin recubrimiento
Extracto etanolico de propoleos Propoleo encpasulado
0 5 10 15 20 Dias
aaa aab
3,4
3,2
3
2,8
2,6
2,4
2,2
2
abb
(c)
abb
abb
abb
Sin recubrmiento
Extracto etanolico de propoleos
0 10 20 Dias
(d)
0,55
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25 0 5 10 15 20
Dias
aaa Sin recubrimiento
aaa
aaa
Extracto etanolico de propoleos
Propoleo encapsulado
aaa aaa
aaa
Ad
he
sivi
dad
(Kg*
m2
/s2
)
Capítulo 97
Res
ilen
cia
aaa 10,5
aab
8,5
6,5
4,5
aab
(e)
Sin recubrimiento
Extracto etanolico de propoleo Propoleo encapsulado
aab aab
2,5
0,5
-1,5 0
aab
5 10 15 20
Dias
(f)
0,4 aaa aab
0,35
abb Sin recubrimiento
Extracto etanolico de propoleos
0,3 Propoleo encapsulado
0,25 aab
0,2
0,15
0,1
aab
aab
0 5 10 15 20 Dias
Figura 4.5. Evolución de los datos de perfil de textura a)Dureza, b)Adhesividad
c)Elasticidad d)Cohesividad e)Masticabilidad, f) Resilencia. Letras a y b señalan la
existencia de diferencias significativas (P<0,05) entre muestras de cachama almacenadas
por un mismo periodo de tiempo y tratadas con diferentes formulaciones de recubrimientos
comestibles
Los resultados indican que a lo largo de tiempo las propiedades texturales van presentando
decrecimiento a excepción de la adhesividad que presentó un aumento a lo largo del
tiempo de almacenamiento, el parámetro que se redujo en mayor cantidad fue la dureza
cuya pendiente tuvo una caída más pronunciada, mientras que la cohesividad y la
resistencia apenas sufrieron pequeños cambios. La alteración de las propiedades
texturales fue mucho mayor en los primeros 8 días del estudio, mientras que entre 12 y 20
Mas
tica
bili
dad
(Kg)
Capítulo 98
Días la pendiente fue mucho menos pronunciada coincidiendo con otros autores (Mohan
et al., 2012). En las muestras con recubrimientos comestibles, se observa que el cambio
del perfil de textura es mucho menor a lo largo del tiempo de almacenamiento, también se
puede apreciar que las propiedades texturales para la cachama recubierta con EEP
encapsulado es ligeramente mayor, no obstante no se presentaron diferencias
significativas (p>0.05) entre las películas con el extracto de propóleos con y sin encapsular.
Los resultados obtenidos del análisis de perfil de textura se pueden deber a varios factores.
El primero es debido a la degradación de la proteína miofibrilar las cuales constituyen el
musculo del pescado (Li et al., 2016), su descomposición y o alteración de su estructura
química conlleva a que el pescado exhiba una menor resistencia a las sondas utilizadas
en el texturómetro, en las muestras con recubrimientos hay una menor producción de
hidroxiperóxidos y otros radicales libres, así como reacciones entre las especies oxidantes
y los polímeros que producen compuestos estables y detienen la propagación de la
cadena, por lo tanto la degradación es menor. El recubrimiento comestible mitiga el
contacto de patógenos con la carne y dificulta la supervivencia de las bacterias por la
acción de los bioactivos (Fatemeh et al., 2016). Por último se sabe que el quitosano tiene
capacidad para formar puentes de hidrogeno con el agua y puede quelar iones metálicos
presentes en las enzimas encargadas de la degradación, por lo tanto se mitiga la acción
del agua y se controla la actividad enzimática de la cachama (Chamanara et al., 2012).
Capítulo 99
score plot
1.5
1
0.5
0
-0.5
-1
-1.5
-2
-2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5
PC 1 - EV = 68.62%
Figura 4.6. Score plot obtenido del análisis de componentes principales (PCA) para
comparar las muestras de cachama con y sin recubrimientos comestibles de acuerdo a los
valores arrojados por los descriptores. 4 días SR: Muestra almacenada por 4 días sin
recubrimiento, 8 días SR: Muestra almacenada por 8 días sin recubrimiento, 12 días SR:
Muestra almacenada por 12 días sin recubrimiento, 16 días SR: Muestra almacenada por
16 días sin recubrimiento, 20 días SR: Muestra almacenada por 20 días sin recubrimiento),
4 días CR: Muestra almacenada por 4 días con recubrimiento a base de quitosano y
extracto etanólico de propóleos encapsulado, 8 días CR: Muestra almacenada por 8 días
con recubrimiento a base de quitosano y extracto etanólico de propóleos encapsulado, 12
días CR: Muestra almacenada por 12 días con recubrimiento a base de quitosano y
extracto etanólico de propóleos encapsulado, 16 días CR: Muestra almacenada por 16 días
con recubrimiento a base de quitosano y extracto etanólico de propóleos encapsulado, 20
días CR: Muestra almacenada por 20 días con recubrimiento a base de quitosano y
extracto etanólico de propóleos encapsulado.
4 dias SR
8 dias SR
12 dias SR
16 dias SR
20 dias SR
4 dias CR
8 dias CR
12 dias CR
16 dias CR
20 dias CR
PC
2 -
EV
= 2
5%
Capítulo 4 100
loading plot
1
0.5
0
stra
-0.5
-1
-1 -0.5 0 0.5 1
PC 1 - EV = 68.62%
Figura 4.7. Loading plot de los descriptores de los indicadores de oxidación lipídica y de
deterioro del alimento obtenido del análisis de componentes principales (PCA)
Las Figuras 4.6 y 4.7 muestran los resultados del score plot y el loading plot obtenidos
luego de efectuar el análisis de componentes principales sobre las variables fisicoquímicas.
Los valores indican la diferencia entre las muestras con recubrimiento y el tratamiento
control (Šimat et al., 2011). Las muestras con el pescado tratado con los recubrimientos se
caracterizaron por encontrarse al lado izquierdo del grafico mientras que las muestras
control se ubicaron al lado derecho, se puede ver que las muestras sin el tratamiento tienen
una mayor basicidad, así como un contenido mayor de nitrógeno libre mientras que los
valores de TBA fueron muy pronunciados en las muestras correspondientes a 12 días.
Tanto el pH como las bases volátiles nitrogenadas totales y la cantidad de malonaldehído
se ubican en la parte derecha del “loading plot”, por ende fueron las variables que aportaron
una mayor contribución a la diferenciación de muestras de acuerdo a su calidad y por
consiguiente son las que tienen impacto mayor en la vida útil. Por el contrario el índice de
peróxidos no muestra un impacto tan significativo en la diferenciación de analítos, este
mismo resultado se observó en los análisis de anjova y kruskall wallis los cuales mostraron
que los valores de índice de peróxidos no poseen diferencias significativas y por lo tanto
hacen parte de un mismo grupo (Simat et al.,2011). Por último los resultados del PCA
PC
2 -
EV
= 2
5%
meq O2/Kg
pH
m
mg N/100 g mue
g MDA/Kg
Capítulo 4 100
sumados a los análisis de vida útil corroboran la efectividad del recubrimiento comestible
de quitosano y propóleos encapsulado como una alternativa para conservar productos
acuícolas en adición a los métodos de conservación tradicionales como el uso de
empaques y cadenas de frio.
En la figura 4.8 son presentados los resultados del análisis sensorial para filetes de
cachama sin recubrimiento, con extracto de propóleos sin encapsular y con propóleos
encapsulado.
a)
Aspecto 4,5
3,5
Textura
Aroma
2,5
1,5
Sabor
Color 0 dias
4 dias
8 dias
12 dias
16 dias
20 dias
(b)
Textura
Aroma
Aspecto 4,5
4 3,5
3 2,5
2 1,5
Sabor
Color
0 Dias 4 Dias 8 Dias 12 Dias 16 dias 20 Dias
Capítulo 4 100
(c)
Textura
Aspecto 4,5
4 3,5
3 2,5
2 1,5
Color
0 dias
4 dias
8 dias
12 dias
Aroma
Sabor
16 dias
20 dias
Figura 4.8. Valores obtenidos de las características sensoriales de(a) Cachama sin
recubrimiento (b) Cachama con extracto de propóleos puro (c) Cachama recubierta con
propóleos encapsulado.
La prueba hedónica efectuada muestra que existieron diferencias significativas entre las
muestras de acuerdo al tiempo de almacenamiento. En los 3 tratamientos fue observado
que los valores decrecieron a lo largo del tiempo indicando una notoria pérdida de los
atributos sensoriales del producto, esto demuestra la imposibilidad de los recubrimientos
de detener por completo los procesos degenerativos. No obstante es posible observar que
los propóleos pueden mitigar considerablemente el impacto de los procesos degenerativos
significativamente ya que características organolépticas como el sabor, textura y el color
sufren un decrecimiento menos pronunciado, el aspecto de los filetes con los
recubrimientos fue ligeramente mejor que el de la muestra control, pero aun así no se
encontraron diferencias significativas (p>0.05), la única característica que fue afectada
negativamente fue el color, la coloración de las películas y el recubrimiento preparadas con
la formulación fue opaca y con el pasar de los días la muestra fue perdiendo brillo y la
tonalidad adquirida por el pescado fue menos agradable para los panelistas, frente a la
muestra control, mientras que para la cachama con propóleos el valor mínimo de color fue
de 2,8 para la muestra control el valor para el último día de almacenamiento fue de 3.El
recubrimiento con quitosano y propóleos encapsulado en maltodextrina tuvo una mayor
preferencia por los panelistas en comparación al recubrimiento con propóleos sin
encapsular, se destaca una mejora de los parámetros de sabor, aroma y textura, el sabor
Capítulo 4 100
tuvo valores entre 2,5-4,4 para la muestra con propóleos encapsulado mientras que para
la muestra con propóleos sin encapsular el sabor osciló entre 2,2 y 4,2 respectivamente.
Para el aroma el valor mínimo con EEP encapsulado fue de 2,4 mientras que para la
muestra sin micropartículas fue de 2. Se pudo observar que las apreciaciones de los
panelistas en la parte textural coincidieron con los resultados obtenidos para la prueba de
TPA. Igualmente se pudo observar que el recubrimiento con propóleos encapsulados es
capaz de proteger la muestra con la misma eficiencia que una matriz con extracto sin
encapsular mejorando las propiedades sensoriales del producto acuícola, la acción de la
maltodextrina a la hora de controlar la liberación de los compuestos fenólicos, proteger los
bioactivos y de crear una red polimérica más resistente se vio reflejada tanto en las
propiedades mecánicas, así como en las variables fisicoquímicas y en la percepción
organoléptica coincidiendo con Suarez et al., (2014).
Conclusiones
Los recubrimientos comestibles elaborados a base de quitosano y de extracto etanólico de
propóleos microencapsulado permitieron alargar la vida útil de la cachama blanca por 4
días más de lo esperado, a su vez estos permiten mitigar el impacto de bacterias Gram
positivas y Gram negativas. Debido a su efecto barrera contra la humedad y el oxígeno del
medio pueden mitigar los procesos oxidativos y regulan la entrada de agentes externos a
la matriz. Por ultimo cabe destacar que el recubrimiento con propóleos encapsulados es
capaz de proteger la muestra con la misma eficiencia que una matriz con extracto sin
encapsular mejorando el “flavor” y las propiedades texturales del producto acuícola en
comparación al tratamiento control y al recubrimiento con propóleos sin encapsular debido
a la acción de la maltodextrina
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Capítulo 4 100
5. Conclusiones Y Recomendaciones
5.1. Conclusiones
• Los extractos etanólicos de propóleos de las abejas Apis Mellifera y Meliponini
destacaron por su alto contenido fenólico y su marcada actividad antiradicalaria en
comparación con extractos obtenidos de otras regiones tropicales.
• Los encapsulados extractos etanólicos de propóleos del municipio del Socorro se
caracterizaron por el potencial antioxidante, actividad antimicrobiana que impide la
proliferación de bacterias y contenido fenólico.
• El extracto etanólico elegido para la elaboración de los micro encapsulados fue
aquel obtenido de los propóleos del municipio de Socorro el cual se caracterizó por
un mayor contenido fenólico, una actividad antioxidante más pronunciada y una
gama de bioactividades más amplia que con el resto de muestras
• Los procesos de microencapsulación realizados vía Spray Drying permitieron la
elaboración de micropartículas esféricas y simples, con un marcado contenido de
fenoles totales y una notable acción frente a radicales libre pese a que una parte
de los bioactivos sufrieron reacciones químicas que condujeron a la reducción de
polifenoles disponibles
• La variable que más incidió la naturaleza de los micro encapsulados fue la
concentración de extracto etanólico de propóleos en cada formulación y no la
temperatura de secado
• Las películas elaboradas a partir de quitosano y extracto etanólico de propóleos
encapsulado en maltodextrina presentaron una baja permeabilidad, una baja
humedad, así como un notable grosor
Capítulo 4 100
• Las películas a base de quitosano y extracto etanólico de propóleos encapsulado
presentaron una mayor uniformidad y mejores propiedades mecánicas que otras
películas elaboradas a partir del mismo polisacárido y que tenían como bioactivo
diversos aceites esenciales.
• El encapsulado incide considerablemente en las propiedades fisicoquímicas,
mecánicas y ópticas de las películas comestibles de quitosano debido a la polaridad
de los polifenoles y a la maltodextrina que interacciona con el quitosano.
• La formulación con un 2% de p/v de quitosano y 1,5 % p/v de extracto etanólico de
propóleos encapsulado fue seleccionada para efectuar estudios futuros de
conservación debido a que fue la película con mayor grosor, menor humedad,
mayor porcentaje de elongación y un menor número de poros y fracturas..
• Los recubrimientos comestibles elaborados a base de quitosano y de extracto
etanólico de propóleos microencapsulado permitieron alargar la vida útil de la
cachama blanca por 4 días más de lo esperado
• A su vez Los recubrimientos elaborados permiten mitigar el impacto de bacterias
Gram positivas y Gram negativas.
• Debido a su efecto barrera contra la humedad y el oxígeno del medio los
recubrimientos pueden mitigar los procesos oxidativos y regulan la entrada de
agentes externos a la matriz
• El recubrimiento con propóleos encapsulados es capaz de proteger la muestra con
la misma eficiencia que una matriz con extracto sin encapsular mejorando el “flavor”
y las propiedades texturales del producto acuícola
Capítulo 4 100
5.2. Recomendaciones
• Se recomienda a futuro efectuar la obtención de los extractos etanólicos de
propóleos de otras zonas de Colombia, se recomienda recolectar propóleos de
regiones con vegetación y clima constante como es el caso de las zonas cafeteras
• Se recomienda extraer aceites esenciales de los propóleos con el fin de aprovechar
una matriz como los propóleos caracterizada por ser fuente importante de múltiples
compuestos funcionales
• Se recomienda obtener realizar estudios de metabolómica a los propóleos
colombianos con el fin de obtener un metaboloma completo de los propóleos a nivel
nacional. Esto permitiría a futuro identificar los polifenoles y flavonoides más
importantes de los propóleos, comparar las composiciones de las muestras de
acuerdo a su región y agruparlas de acuerdo a su procedencia y bioactividad.
• Para los encapsulados se recomienda a futuro adicionar otro material de pared para
complementar la protección otorgada por la maltodextrina y potenciar la
bioactividad de los compuestos polifenólicos.
• Se recomienda probar la acción biocida de los extractos, micro encapsulados y
recubrimientos no solo contra bacterias, es recomendable probarlo frente a hongos,
virus, patógenos, parásitos, insectos, inflamaciones y células cancerosas.
• A futuro se recomienda añadir una cantidad mayor de agente plastificante para
contrarrestar el efecto de los polifenoles y otros metabolitos sobre la película
comestible, así la estructura sería más uniforme y la película será mucho más
resistente debido a la mejora de las propiedades mecánicas.
• Se recomienda aplicar el recubrimiento a un mayor número de matrices alimenticias
y comparar su efecto con respecto a los resultados anteriores.
Capítulo 4 100
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