hidrólisis de la carne de alpaca
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HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA CARNE DE ALPACA MEDIANTE LA PAPAINA
Ing. Abel Foraquita Choque
Mayo 2013
Puno -----o------Perú
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RESÚMEN INTRODUCCIÓN
CAPÍTULO I
GENERALIDADES, OBJETIVOS, JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN............................................................................................1
1.1.- Generalidades.........................................................................................2
1.2.- Objetivos.................................................................................................2
1.2.1.- Objetivos generales..............................................................................3
1.2.2.- Objetivos específicos............................................................................3
1.3.- Justificación de la investigación..............................................................2
1.3.1.- De investigación...................................................................................3
1.3.2.- De tecnología.......................................................................................3
1.3.3.- Ecológico..............................................................................................3
1.4.-Hipótesis de trabajo..................................................................................2
1.4.1.-Consideraciones del problema..............................................................3
1.4.2.-Hipótesis................................................................................................3
1.5.-Diseño de la investigación........................................................................2
1.6.-Algoritmo del trabajo de investigación......................................................2
CAPITULO IIINVESTIGACIÓN BIBLIOGRÁFICA...............................................................7
2.1.- Generalidades........................................................................................8
2.2.- Materias primas.....................................................................................2
2.2.1.- Fuentes de materia prima de enzimas.................................................3
2.2.1.1.- Definición de enzimas.................................................................3
2.2.1.2.- Propiedades de las enzimas.......................................................3
2.2.1.3.- Sitio activo de una enzima...........................................................3
2.2.1.4.- Clasificación del (IEC).................................................................3
2.2.1.5.- Especificidad de las enzimas proteolíticas del grupo de las proteinazas......................................................................................................3
2.2.2.- Papaya.................................................................................................3
2.2.2.1.- Definición.....................................................................................3
2.2.2.2.- Variedades..................................................................................3
2.2.2.3.- Especificaciones..........................................................................3
3
2.2.2.4.- Características físicas.................................................................3
2.2.2.5.-Composición química de la papaya..............................................3
2.2.3.-Papaína.................................................................................................3
2.2.3.1.- Definición ....................................................................................3
2.2.3.2.- Composición................................................................................3
2.2.3.3.- Estructura del sitio activo de la papaína......................................3
2.2.3.4.- Estabilización de la papaína .......................................................3
2.2.3.5.- Características físicas.................................................................3
2.2.3.6.- Características químicas.............................................................3
2.2.3.7.- Activación de la papaína.............................................................3
2.2.3.8.- Métodos de extracción................................................................3
2.2.3.9.- Usos y aplicaciones.....................................................................3
2.2.4.- Materias primas para hidrólisis.............................................................3
2.2.4.1.- La carne fuente de proteínas.......................................................3
2.3.- Hidrólisis de proteínas..........................................................................2
2.3.1.- Hidrólisis enzimática de proteínas........................................................3
2.3.1.1.- Introducción.................................................................................3
2.3.1.2.- Fundamento de la acción enzimática..........................................3
2.3.1.3.- Mecanismos de hidrólisis para la papaína- rotura del enlace.....3
2.3.1.4.- Parámetros..................................................................................3
2.3.1.5.- Equipos........................................................................................3
2.4.- Métodos de determinación...................................................................2
2.4.1.- Métodos de determinación de proteínas..............................................3
2.4.2.- Métodos de determinación de aminoácidos.........................................3
2.4.3.- Velocidad de hidrólisis..........................................................................3
2.4.4.- Equipo para análisis.............................................................................3
CAPÍTULO IIIDESARROLLO EXPERIMENTAL................................................................10
3.1.- Generalidades......................................................................................11
3.2.- Objetivos de la experimentación.........................................................8
3.3.- Metodología...........................................................................................2
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3.4.- Algoritmo de la estrategia experimental.............................................2
3.5.- Trabajo experimental previo.................................................................2
3.5.1.- Extracción de la papaína......................................................................3
3.5.1.1.- De la materia prima.....................................................................3
3.5.1.2.- Del proceso.................................................................................3
3.5.1.3.- De la purificación.........................................................................3
3.5.1.4.- Diagramas de flujo.......................................................................3
3.5.1.5.- Estabilización y activación de la papaína....................................3
3.5.2.- Preparación del sustrato.......................................................................3
3.5.2.1.- Maduración de la carne de alpaca..............................................3
3.5.2.2.- Eliminación del color de la carne.................................................3
3.5.2.3.- Influencia de la temperatura........................................................3
3.6.- Selección de variables a investigar...................................................11
3.7.- Diseño estadístico de la experimentación..........................................8
3.7.1.- Diseño estadístico factorial...................................................................3
3.7.1.1.- Introducción.................................................................................3
3.7.1.2.- Obtención de tablas matriciales para la planificación de experimentos y cálculos de los efectos.........................................................3
3.7.1.3.- Diseño factorial aplicado a nuestra investigación........................3
3.7.1.3.1.- Obtención de la tabla matricial y cálculos de los efectos3
3.8.- Desarrollo experimental........................................................................2
3.8.1.- Selección de la muestra estándar........................................................3
3.8.1.1.- Especificidad de la papaína.........................................................3
3.8.1.2.- Preparación de la solución estándar...........................................3
3.8.1.3.- Determinación colorimétrica de aminoácidos..............................3
3.8.2.- Experimentación de la hidrólisis enzimática de carne de alpaca.........3
3.8.2.1.- Diagrama de flujo general: Hidrólisis de carne de alpaca...........3
3.8.2.2.- Preparación de las ocho muestras..............................................3
3.8.3.- Determinación cuantitativa de la actividad de la papaína.....................3
3.8.3.1.- Determinación espectrofotométrica de aminoácidos...................3
3.8.3.2.- Demostración de la ley de Beer- determinación de la ley de absorbancia.....................................................................................................3
3.8.3.3.- Determinación de las muestras problema...................................3
5
CAPÍTULO IVTRATAMIENTO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS...........................1
4.1.- Generalidades......................................................................................11
4.2.- Estadística de resultados.....................................................................8
4.2.1.- Transformación de variables................................................................3
4.2.2.- Formulación de la tabla factorial para análisis de datos.......................3
4.2.3.- Determinación de los coeficientes de regresión...................................3
4.2.4.- Validación de resultados (Análisis de varianza)...................................3
4.2.4.1.- Análisis de significancia de los coeficientes................................3
4.2.5.- Bondad de ajuste de la ecuación de regresión.....................................3
4.2.6.- Evaluación del efecto curvatura...........................................................3
4.2.7.- Expresión del modelo matemático en escala natural...........................3
4.3.- Análisis de los resultados....................................................................2
4.3.1.- Influencia de la concentración de la papaína......................................3
4.3.2.- Influencia del pH................................................................................3
4.4.- Análisis del diseño factorial.................................................................2
CAPÍTULO VCRONOGRAMA Y COSTOS DE LA INVESTIGACIÓN...............................4
5.1.- Costos generales de la investigación.................................................1
5.1.1.- Generalidades......................................................................................2
5.1.2.- Recursos materiales.............................................................................2
5.1.3.- Costos de los recursos materiales.......................................................2
5.1.4.- Financiamiento.....................................................................................2
5.2.- Cronograma de actividades.................................................................1
5.2.1.- Actividades a desarrollar......................................................................2
5.2.2.- Cuadro de actividades..........................................................................2
CONCLUSIONES............................................................................................1
BIBLIOGRAFÍA...............................................................................................4
ANEXOS.........................................................................................................4
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ÍNDICE DE CUADROS, FIGURAS Y TABLAS
Cuadro 2.1.- Especificaciones de la papaya.................................................10
Cuadro 2.2.- Características físicas de la papaya.........................................10
Cuadro 2.3.- Contenido de 100 gr de parte comestible de carica papaya.....10
Cuadro 2.4.- Composición elemental de la papaína cristalina.......................10
Cuadro 2.5.- Vitaminas de la carne...............................................................10
Cuadro 3.1.- Especificaciones de la papaya.................................................10
Cuadro 3.2.- Características físicas de la papaya.........................................10
Cuadro 3.3.- Contenido de 100 gr de parte comestible de carica papaya.....10
Cuadro 3.4.- Composición elemental de la papaína cristalina.......................10
Cuadro 3.5.- Vitaminas de la carne...............................................................10
Cuadro 3.6.- Especificaciones de la papaya.................................................10
Cuadro 3.7.- Características físicas de la papaya.........................................10
Cuadro 4.1.- Contenido de 100 gr de parte comestible de carica papaya.....10
Cuadro 4.2.- Composición elemental de la papaína cristalina.......................10
Cuadro 4.3.- Vitaminas de la carne...............................................................10
Cuadro 4.4.- Especificaciones de la papaya.................................................10
Tabla 2.1.- Características físicas de la papaya............................................10
Tabla 2.2.- Contenido de 100 gr de parte comestible de carica papaya.......10
Tabla 2.3.- Composición elemental de la papaína cristalina.........................10
Tabla 2.4.- Vitaminas de la carne..................................................................10
Tabla 3.1.- Especificaciones de la papaya....................................................10
Tabla 3.2.- Características físicas de la papaya............................................10
Tabla 3.3.- Contenido de 100 gr de parte comestible de carica papaya.......10
Tabla 3.4.- Composición elemental de la papaína cristalina.........................10
Tabla 3.5.- Vitaminas de la carne..................................................................10
Tabla 3.6.- Especificaciones de la papaya....................................................10
Tabla 3.7.- Especificaciones de la papaya....................................................10
Tabla 4.1.- Especificaciones de la papaya....................................................10
Tabla 3.5.- Vitaminas de la carne..................................................................10
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Tabla 3.6.- Especificaciones de la papaya....................................................10
Tabla 3.7.- Especificaciones de la papaya....................................................10
Tabla 4.1.- Especificaciones de la papaya....................................................10
Figura 2.2.- Vitaminas de la carne.................................................................10
Figura 2.3.- Especificaciones de la papaya...................................................10
Figura 2.4.- Especificaciones de la papaya...................................................10
Figura 2.5.- Vitaminas de la carne.................................................................10
Figura 2.6.- Especificaciones de la papaya...................................................10
Figura 3.1.- Especificaciones de la papaya...................................................10
Figura 3.2.- Especificaciones de la papaya...................................................10
Figura 3.3.- Especificaciones de la papaya...................................................10
Gráficas de superficie....................................................................................10
Graficas de superficie....................................................................................10
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CAPITULO I
INTRODUCCIÓN
1.1. GENERALIDADES:
Las proteínas son sustancias complejas, que constituyen la materia
fundamental de los seres vivos. Estas se hidrolizan en menor o mayor
grado por los ácidos, por los álcalis y por los fermentos, produciendo
aminoácidos.
Es lógico pensar que cuando se pretende utilizar los hidrolizados de
proteínas, por su valor nutritivo en la preparación de dietas elementales
para la alimentación infantil o nutrición enteral, debe respetarse al máximo
la estructura de los componentes separados, no sólo para mantener su
valor biológico, sino también para evitar la contaminación de los
hidrolizados obtenidos por los productos de degradación de estos
componentes, de ahí la necesidad de recurrir a la hidrólisis
enzimática.
El tema de investigación comprende el estudio de la papaína, sus fuentes
naturales (origen vegetal), así como su estabilización posterior.
2
En este trabajo, dedicado a la hidrólisis enzimática de las proteínas de la
carne de alpaca por actividad enzimática de la papaína, tiene como
finalidad conseguir un mayor grado de hidrólisis y demostrar la
importancia de enzimas proteolíticas como la papaína.
1.2. OBJETIVOS.-
1.2.1. OBJETIVO GENERAL
Mejorar la hidrólisis de proteínas mediante la aplicación tecnológica de
biocatalizadores ó enzimas.
1.2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar el grado de hidrólisis óptima de la carne
de alpaca, mediante el uso de la enzima papaína.
2. Determinar las mejores condiciones de las variables
del proceso de hidrólisis a nivel laboratorio y mediante
un diseño experimental que conlleve a un modelo
matemático.
1.3. JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
1.3.1. DE INVESTIGACIÓN
En la actualidad y en el futuro el mejorar el
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Porcentaje de digestibilidad de los alimentos que consumimos es una de
las metas más importante, y más aún si se trata de las proteínas que es el
grupo de alimentos que más carencias tiene la población.
Por eso con esta investigación se quiere contribuir a solucionar en parte
este problema. La papaína es una enzima proteolítica muy activa. Es la
enzima más termoestable conocida. La papaína se encuentra en el fruto,
en las hojas y en el tallo, se extrae del látex coagulado de la papaya. En las
enfermedades digestivas, se utiliza como medicamentos en las
insuficiencias de la segregación estomacal, por sus propiedades similares a
la pepsina pues actúa sobre las proteínas produciendo aminoácidos libres.
1.3.2. DE TECNOLOGÍA
La producción industrial de hidrolizados enzimáticos de alimentos no se ha
desarrollado tecnológicamente hasta este siglo, en el que han sido
favorable dos factores: por una parte, la disponibilidad comercial de las
enzimas adecuadas y, por otra, la demanda en la industria alimentaria de
estos productos.
En cuanto a la disponibilidad comercial de enzimas, cabe destacar que la
producción y el uso industrial no se produjo hasta 1890.
La demanda de hidrolizados enzimáticos en la industria alimentaria ha sido
función de la necesidad de sustituir determinados alimentos, bien por
razones económicas, bien por razones de escasez, o de la necesidad de
obtener alimentos más asimilables por el cuerpo humano.
La hidrólisis enzimática es uno de los procesos que se usa actualmente a
nivel mundial para obtener aminoácidos en EE.UU, México, (Fermax),
Japón (Kyowa Hakko, Suntory) países que usan esta tecnología.
4
Además estos hidrolizados desecados se utilizan en preparados sólidos,
para alimentos pre cocidos de niños.
Laboratorios mundialmente conocidos como Bayer, Parke Davis y otros han
perfeccionado los métodos hidrolítícos. La hidrólisis enzimática,
industrialmente se lleva a cabo en tanques agitados con la enzima en
disolución, aunque parece existir una tendencia creciente hacia la
utilización de reactores de lecho fijo o fluidizado con enzimas
inmovilizadas.
1.3.3. ECOLÓGICO
El presente tema de investigación, está enmarcado dentro de la industria
por mantener el medio ambiente ya que utiliza materias primas naturales
(papaya) dándole un mayor valor agregado y el proceso de hidrólisis
(industria silenciosa, sin humos y sin reactivos tóxicos) revelan que el tema
tiene para seguir investigando sin dañar la naturaleza.
Las precauciones que se deben tomar con respecto al uso de la papaína es
que no debe consumirse sólida, sino diluida y el
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organismo deberá tener previamente un sustrato sólido
principalmente proteínico.
1.4. HIPÓTESIS DE TRABAJO
1.4.1. CONSIDERACIONES DEL PROBLEMA
- Constantes: - Temperatura
- Concentración del Sustrato
(Carne de alpaca)
- Variables: - Concentración del Enzima
- pH
- Tiempo
1.4.2. HIPÓTESIS
Se pretende demostrar experimentalmente que existe una relación entre el
pH y el tiempo y que ambas variables se relacionan en una ecuación
empírica que parametrisa el proceso. Además, la concentración óptima del
enzima está en el intervalo de 2,5 - 5 % con respecto al sustrato.
1.5. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
La presente investigación se lleva a cabo mediante la siguiente estrategia:
a. Esté trabajo se abocará a la investigación de los
parámetros de hidrólisis enzimática de la carne de alpaca por el
enzima del látex de la papaya.
b. Los parámetros que se han mantenido constantes con el
fin de hacer más fácil el sistema de estudio son:
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Concentración del sustrato, temperatura.
c. Las pruebas se realizan tomando como sustrato la carne
de alpaca.
d. El tipo de hidrólisis a llevar a cabo es un método basado
en la acción de enzimas proteóliticas, usando como enzima
papaína.
e. El análisis del hidrolizado obtenido es determinado por
espectrofotometría.
f. Los datos que deben tomarse al respecto son:
-Concentración del sustrato.
-Concentración del enzima papaína.
-pH.
-Temperatura.
-Tiempo de hidrólisis.
-Absorbancia.
g. Analizar y recomendar rangos de los parámetros tomados
para este proceso.
1.6. ALGORITMO DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
INICIO
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA: HIDRÓLISIS DE LA CARNE
7A
SELECCIÓN DEL MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO
¿EL MÉTODO ES
EL MEJOR?
VARIABLES A DETERMINAR pH, Tiempo, (enzima), Absorbancia
FIN
FIJACIÓN DE VARIABLES Y PARÁMETROS FINALES
¿SON LAS CORRECTAS
METODOLOGÍA
OBJETIVOS DE LA EXPERIMENTACIÓN
DESARROLLO EXPERIMENTAL (INVESTIGACIÓN)
EXPERIMENTOS PREVIOS
VALIDACIÓN DE DATOS
CONSISTENCIA DEL MODELO
EXPERIMENTOS FINALES
OBTENCIÓN DE DATOS
¿SON ACEPTABLES?
INTERPRETACIÓN Y ANÁLISIS DE DATOS
NO SI
SINO
NO SI
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CAPITULO II
INVESTIGACIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. GENERALIDADES
Esta revisión bibliográfica incluye la papaína: forma de extracción,
purificación, estabilización, activación, propiedades físicas y
químicas, usos y aplicaciones.
Nos ocuparemos también, de las proteínas, aminoácidos,
propiedades y composición de la carne de alpaca.
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Por otra parte, se ha revisado la hidrólisis enzimática de proteínas, y los
diferentes factores que puedan influir en el complicado proceso, para
poder seleccionar las condiciones de operación.
Por último, los métodos de determinación de proteínas y aminoácidos.
Toda esta bibliografía revisada, nos dará una base bien clara, para poder
comprender el proceso de hidrólisis enzimática de proteínas.
2.2. MATERIAS PRIMAS
2.2.1. FUENTES DE MATERIA PRIMA DE ENZIMAS
2.2.1.1. DEFINICIÓN DE ENZIMAS
Los enzimas son proteínas producidas en las células con la finalidad de
catalizar las reacciones químicas que se dan en los organismos vivos.
Un catalizador es cualquier sustancia que acelera una reacción en ambos
sentidos, sin consumirse en ella, sin formar parte de los productos y que
experimenta solo un cambio físico ó químico transitorio.
Los catalizadores Biológicos son vitalmente necesarios para bajar la
cantidad de energía de activación que requieren las moléculas para
reaccionar en los seres vivos; estos son los Enzimas, y capacitan a la célula
para realizar sus actividades con máxima rapidez y eficacia en las
condiciones que son compatibles con la vida. La sustancia sobre la que
actúa el enzima se llama sustrato.
Existen proteínas no enzimáticas, como los citocromos, que tienen
propiedades catalít icas pero
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actúan como transportadores de electrones, y no activando otra sustancia.
Los enzimas actúan activando a los sustratos.
2.2.1.2. PROPIEDADES DE LOS ENZIMAS
• ESPECIFICIDAD
La gran mayoría de enzimas tiene la capacidad de catalizar reacciones
específicas; es decir, su intervalo de acción se limita a un determinado tipo
de sustrato que debe reunir ciertas características para que pueda ser
utilizado como tal. La especificidad de los enzimas es una propiedad que
los hace muy diferentes a muchos catalizadores no biológicos, y que se ha
dividido en cuatro grandes grupos:
- ESPECIFICIDAD ESTEREOQUÍMICA
Normalmente los enzimas utilizan D o L isómeros como sustrato: Casi
todos los monosacáridos en la naturaleza son D mientras que los
aminoácidos pertenecen a la serie L.
- BAJA ESPECIFICIDAD
Se presenta cuando los enzimas atacan un determinado tipo de enlace
químico sin importar la naturaleza del sustrato.
- ESPECIFICIDAD DE GRUPO
Actúan sobre un sustrato que contiene un determinado enlace y un grupo
químico específico al lado de dicho enlace.
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- ESPECIFICIDAD ABSOLUTA
Es la más común, consiste en que el enzima utiliza una sola y muy
específica sustancia como sustrato.
2.2.1.3. SITIO ACTIVO DE UN ENZIMA
Es aquella porción de aminoácidos de la proteína que participa en el
proceso catalítico; es decir el sitio activo está formado por ciertos
aminoácidos que forman un microambiente catalizador dentro de la propia
molécula del polipéptido.
La participación de los aminoácidos del sitio activo en la reacción
enzimática, implica en algunos casos, la formación de un compuesto
intermediario enzima-sustrato unido covalentemente; no se ha demostrado
que esto suceda con todos los enzimas, pero sí en algunas hidrolasas
como la quimotripsina, la tripsina y la papaína, en las que se forman
intermediarios covalentes que son posteriormente hidrolizados por la acción
nucleófila del agua. En el sitio activo de muchos enzimas hidrolíticas
participan aminoácidos nucleófilos, cuya característica principal es la
tendencia a donar un par de electrones; los grupos más importantes son el
hidróxilo de la serina, el sulfhidrilo de la cisteína, el imidazol de la
histidina y el carboxilo de los ácidos aspártico y glutámico.
Las estructuras conformacionales de los enzimas están estabilizadas por
puentes de hidrógeno, uniones iónicas e hidrófobas, y en algunos casos
enlaces disulfuro.
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La acción de temperaturas extremas (altas o bajas), de disolventes, de
condiciones drásticas de pH y fuerza iónica, y de varios agentes químicos,
produce la desnaturalización del enzima, lo que origina la pérdida de su
actividad; cuando el efecto del agente desnaturalizante no es muy fuerte, el
enzima puede nuevamente regenerar su actividad al adquirir otra vez su
estructura tridimensional de origen.
A temperaturas cercanas a los 30°C y de bajas concentraciones de los
reactivos, catalizan limpiamente con gran eficacia y dan productos
secundarios, reacciones muy específicas que con los métodos de la
química orgánica no se pueden realizar.
Se auto regulan en respuesta a cambios de concentración de los reactivos
o productos y su conformación no es rígida sino flexible.
Ciertas enzimas requieren de ciertos compuestos orgánicos, termoestables
para poder cumplir con su función catalítica, estas moléculas se denominan
coenzimas, generalmente tiene bajo peso molecular y suelen ser claves en
el mecanismo catalítico. La apoenzima unida a la coenzima constituye la
holoenzima. Estas moléculas termoestables generalmente son vitaminas o
metales.
Según el tipo de reacción que catalizan las enzimas se dividen en 6 clases
o grupos:
2.2.1.4. CLASIFICACIÓN DE LA COMISIÓN INTERNACIONAL DE
ENZIMAS:
Cuando el número de enzimas conocidas se hizo mayor, fue necesario
ordenar la nomenclatura y establecer una clasificación. La que se acepta
universalmente es la Comisión Internacional de Enzimas (IEC) que las
agrupa en seis clases según el tipo de reacción que catalizan, cada una de
éstas seis clases se divide en subclases y subsubclases, en donde
indicamos la clase subclase y subsubclase de las Hidrolasas.
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CLASES DE ENZIMAS
1. OXIDORREDUCTASAS
2. TRANSFERASAS
ESTERASAS
CARBOHIDRASASNUCLEASAS
3. HIDROLASAS
3.4. ENZIMAS PROTEOLITICAS (PROTEASAS)
3.4.4. PROTEÍNASAS
ENDOPEPTIDASAS FICINA
3.4.4.10. PAPAÍNA *
BROMELINA
ENDOPEPTIDOSAS
PEPSINA
RENNINA
QUIMOTRIPSINA
CATEPSINA
TRIPSINA
PEPTIDASAS
3. LIASAS
4. ISOMERASAS
5. LIGASAS
* Papaína: Código EC 3.4.4.10
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2.2.1.5. ESPECIFICIDAD DE LOS ENZIMAS PROTEOLITICOS DEL
GRUPO DE LAS PROTEÍNASAS:
a. PROTEÍNASAS ENDOPEPTIDOSAS:
Contienen serina e histidina en el centro activo y son inhibidas por el
diisopropilfluorofosfato. La Catepsina, Tripsina, Pepsina, Rennina y
Quimotripsina son enzimas de origen animal de tanta importancia en la
fisiología humana y animal, ya que éstos producen la autólisis de los tejidos
después de la muerte de los animales y tienen enorme importancia en
bromatología.
b. PROTEÍNASAS ENDOPEPTIDASAS:
Tienen cisteína en el centro activo y son inhibidas por yodoacetato, p-
cloromercuribenzoato y metales pesados, y activadas por el ácido
cianhídrico.
La Papaína, Bromelina y Ficina; estos tres enzimas vegetales son
semejantes en su especificidad y atacan a los enlaces peptídicos en los
que participan aminoácidos básicos, leucina o glicina, así como sus
esteres y amidas, poseyendo por lo tanto un margen de actuación más
amplio que la Tripsina y la Quimotripsina.
2.2.2. PAPAYA
2.2.2.1. DEFINICIÓN
El papayo o "Carica Papaya" pertenece a la familia de las "caricáceas". Su
raíz es de origen embrionario, posee un tallo esbelto y erecto coronado por
un racimo de hojas planas de pedúnculo que van desde medio metro hasta
metro y medio de largo.
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El fruto es de forma esférica u ovoide, su cascara es delgada, lisa, su color
es verde cuando está inmadura y amarilla-anaranjada cuando se encuentra
en estado maduro.
La pulpa tiene un color anaranjado y es de un espesor de 2.5 a 5cm. y
rodea a una cavidad, en cuyas paredes laterales existen membranas a las
que están adheridas las semillas redondas y negras, éste grosor de la
pulpa varía según la variedad.
2.2.2.2. VARIEDADES
Las más importantes son:
a. VARIEDAD SOLO:
Es de color amarillo claro y sabor muy dulce, contiene gran cantidad de
materia carnosa comestible, esta variedad abunda en los trópicos.
b. VARIEDAD TALLO AZUL:
Tiene la forma oblonga, cascara verde oscura y carne espesa y sabor
agradable, esta variedad se produce abundantemente en Florida.
c. CARICA PAPAYA NARA:
Es de fruto muy pequeño y de forma alargada, de color amarillo brillante en
su madurez, esta variedad se produce abundantemente en Chile.
Teniendo en cuenta la inflorescencia y la forma de la fruta se puede
clasificar e identificar dos tipos:
- El dioico o de fruta redonda, y
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- El monoico o de fruta alargada
Dentro de estos tipos fundamentales, hay una serie de variedades que se
caracteriza por diversas formas del fruto, debido tanto a la variabilidad de
los hábitos de esta planta como a su edad, notándose que después del
tercero o cuarto año de crecimiento, comienza a detenerse y las hojas y
frutos disminuyen de tamaño, en nuestro departamento se cultiva las
variedades de papaya común y las denominadas "Colombianas", para el
presente Trabajo de Investigación se utilizará la variedad de "Papaya
Común" que es procedente de la selva puneña.
2.2.2.3. ESPECIFICACIONES CUADRO 2.1.
Reino Vegetal
División Angiospermas
Clase Dicotiledónea
Sub Clase Archiclamydae
Orden Viólales
Familia Caricaceae
Género Carica
Especie Carica papaya L.
FUENTE: Eficacia antioxiurotica de Cucúrbita máxima (Zapalla), Carica
papaya, Portulaca olerácea (verdolaga) en escolares del nivel primario.
Tesis-UNSA, 1997. Pág.25, Biblioteca Biomédicas
En México se le conoce con el nombre de zapote y melón, mamón en
Argentina, mamao en Brasil, papaw en Inglés e higo de mastuerzo en
España.
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2.2.2.4. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS
CUADRO 2.2.
Cascara 7.2 %
Semilla 4.7 %
Pulpa 88.06%
Peso promedio de la papaya 1.2 kg.
Humedad total de la pulpa 90.6%
Dimensiones de la papaya promedio :
- Diámetro longitudinal
- Diámetro transversal
- Espesor de la pulpa
28.0 cm.12.0 cm. 3.4
cm.
FUENTE: Molina Q. "Deshidratación Industrial", 1973.
2.2.1.1. COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA PAPAYA
CUADRO 2.3.Contenido en 100 gr. de parte comestible de carica papaya l.
Humedad 90,8 gr
Cenizas 0,5 grProteínas 0,4 gr.Grasas 0,1 gr.Hidrato de Carbono 8,2 gr.Fibra 0,4 gr.Vitamina C (Ac.Ascórbico) 47,7 mg.Caroteno (Pro-vitamina A) 0,27 mg.
Calcio 23,0 mg.Fósforo 14,0 mg.Hierro 0,00 mg.
Tiamina (Vitamina B-1) 0,02 mg.Rivoflamina (Vitamina B-2) 0,07 mg.Niacina (Vitamina B-5) 0,41 mg.
FUENTE: Folleto Titulado "Composición de los Alimentos Peruanos" del Ministerio de Salud. 1963.
18
2.2.3. PAPAÍNA
2.2.3.1. DEFINICIÓN
El enzima papaína se obtiene del látex del fruto del papayo (Carica papayo
L), bien desarrollado pero aún no maduro, en forma de polvo de color
crema; pudiendo también extraerse de los tallos de dicha planta.
Hidroliza la mayor parte de las proteínas, proteosas y peptosa hasta dar
lugar a los péptidos y los aminoácidos, requiere un pH ligeramente ácido.
2.2.3.2. COMPOSICIÓN
La composición elemental de la papaína cristalina está dada por los
resultados de tres laboratorios diferentes que se muestran a continuación:
CUADRO 2.4.
INVESTIGADORES NITRÓGENO % SULFURO%
Balls y Lineweaver 15.5 1.2
Cióse, Moore, y Bigwood
16.4
Kimmel y Smith 16.1 1.22
FUENTE:Advances in Enzymology. Volumen XIX, 1957. pág. 282;
Biblioteca Biomédicas - UNSA. Cód. SO142800017
El contenido de aminoácidos de la papaína ha sido determinado
independientemente por Cióse, Moore y Biwood y Pousmith, Stockell y
Limmel.
19
Las mediciones cuantitativas en las fracciones de efluente fueron hechas colorimétricamente con ninhidrina, el triptófano y cisteína fueron estimados separadamente. Los datos de ambos laboratorios están dados en la siguiente tabla:
TABLA 2.1. COMPOSICIÓN Y PESO MOLECULAR DE LA PAPAÍNA
AMINO ACID Amino acid. G./100 g. Protein (155)
N as % of total
Amino acid. residue, g./100g protein3
Assumed Number of residue
wt. Cale, mol a
CaleNumereOfresiduesfrom av.mol.wt.of20,289
Aspartie acid 9.90 11.32 7.40 9.79 17 19,992 17.3
Threonine 3.67 3.89 2.84 3.30 7 21,448 6.6
Serine 5.03 5.89 4.89 4.90 11 19,588 11.4
Glutamic acid 11.35 12.89 7.35 10.91 17 20,111 17.2
Proline 4.50 5.89 3.86 4.31 9 20,277 9.0
Glycine 8.32 8.89 9.97 6.54 23 20,079 23.2
Alanine 4.67 6.89 5.94 4.85 13 20,524 12.8
Valine 7.51 8.89 6.26 7.13 15 20,850 14.6
Isoleucine 5.66 6.89 4.01 5.22 9 19,521 9.4
Leucine 5.75 6.89 4.05 5.26 9 19,368 9.4
Tyrosine 12.75 14.89 7.06 13.25 17 20,944 16.5
Fenilalanina 2.67 3.89 1.66 2.82 4 20,880 3.9
Histidine 0.95 0.89 1.43 0.75 1 18,293 1.1
Lysine 5.12 5.89 6.75 4.97 8 20,632 7.9
Ammonia 1.98 1.89 8.19 1.51b 19b 20,140 1 9.1 b
Arginine 7.62 7.89 15.18 6.95 9 20,223 9.0
Triptoftona 4.40 4.89 3.99 4.27 5 21,8°5 4.7
Cisteina 2.14 3.89 2.58 3.01 6 20,532 6.0
Total -- -- 103.71 98.23 180 20,289 --
a Tomado solamente de. los datos de Smith, Stockell, y kimmel (155)
b Omitido total .
FUENTE :Avances in Enzymology. Volumen XIX, 1957, pág. 283. Biblioteca Biomédicas - UNSA. Cód: SO142800017
20
Donde ambos grupos usaron columnas de intercambio iónico debido
a las discrepancias en los casos de estos aminoácidos utilizaron los
factores de corrección para la destrucción durante la hidrólisis.
Las características más notables de la composición de papaína son
el alto contenido de tirosina y glicina, la presencia de un solo residuo
de histidina y la ausencia de metionina.
El contenido de cistina de la papaína es de considerable
importancia debido a la naturaleza tiol del enzima.
No se ha encontrado fósforo o carbohidrato. La papaína contiene
ocho átomos de sulfuro por mol de papaína.
El peso molecular de la papaína calculado de la composición de
aminoácidos es 20,406.
El volumen específico parcial de papaína determinado es 0.724.
Este enzima está compuesto por una cadena polipeptídica sencilla
de 212 aminoácidos. Estudios cinéticos han demostrado que el sitio
activo puede acomodar siete aminoácidos, cuatro en el lado del acilo
del enlace escindido (S4 - S1) y tres en el lado amino (S*1 - S'3).
La papaína es específica para aminoácidos hidrofóbicos en el sitio
S2. Los esteres, y presumiblemente los péptidos, se hidrolizan a
través de un camino con acilenzima, con la excepción de que se acila
la Cys - 25.
Si denotamos la histidina "Im" y la c iste ína "RSH", la forma
iónica [RSH.HIm+] es inactiva a pH bajo, mientras que la forma
iónica [RS-lm] es inactiva a pH elevado. La forma catalíticamente
activa a pH neutro es uno de los tautómeros [RSH.Im] o
[RS".HIm+] : no se puede distinguir entre dos estados iónicos
que son portadores de la misma carga neta examinando la
21
dependencia respecto al pH.
FIGURA 2.1 Mecanismo de reacción ( enzima + sustrato)
5.2.3.3. ESTRUCTURA DEL SITIO ACTIVO
DE LA PAPAÍNA
En la estructura cristalina, la molécula está formada por dos
dominios con una brecha profunda entre ellos. Ahí se observa lo
siguiente:
a. El sitio de fijación para el sustrato se encuentra a horcajadas de
esta brecha, aunque la Cys-25 y la H¡s-15S están en contacto
próximo, se encuentran en lados opuestos de la brecha. La bolsa
relativamente honda de. sitio S2 de los aminoácidos hidrofóbicos
está formada con las cadenas laterales hidrofóbicas de la Tyr-67,
Pro-68 y
SH
E
Im
O O
RCX R-CR
H2O
E RCO2H+
Im
+
SH
E
Im
22
Trp-69 de un dominio y las de la Phe-207, Ala-160, Val-133 y Val-157
del otro.
El bajo pKa de la histidina se debe probablemente a que está
parcialmente enterrada en una región hidrofóbica.
Los residuos D-aminoácidos no se pueden acomodar en los subsitios
debido a interferencia esférica con la masa del enzima.
El enzima no es exopeptidasa porque el carboxilato libre del sustrato
estaría a sólo 3-4 Á del carboxilato del Asp-158 con la consiguiente
repulsión electrostática.
Análogos del sustrato que tienen un grupo estéricamente pequeño en
la posición del grupo saliente se fijan de una forma considerablemente
más fuerte que los que tienen residuos más voluminosos.
La especificidad para restos hidrofóbicos grandes en el subsitio S2 se
manifiesta en valores de Kcat más elevados y no en fijación más
fuerte.
Se encontró un movimiento hacia fuera de las paredes de la hendidura
en la estructura cristalina del enzima inhibida por el derivado
clorometilcetona de la N-benciloxicarbonil-L-fenilalanina-L-alanina.
Esta estructura demuestra que hay un sitio de fijación para el oxígeno
carbonílico del enlace peptídico escindible.
La naturaleza exacta de la catálisis ácido-básica en el sitio activo no
es conocida.
La etapa determinante de velocidad en la hidrólisis de amidas y de
anilinas parece ser la ruptura del intermedio tetraédrico por
catálisis acida general.
23
k. Se ha encontrado que en sistemas químicos sencil los la
combinación de una base B y un tiol RSH reaccionan en forma de
RS- y BH+.
FIGURA 2.2. Etapa de Acilación Estado de Transición
2.2.3.4. ESTABILIZACIÓN DE LA PAPAÍNA
Los componentes proteolíticos del Látex de papaya son inusualmente
estables con relación a los extremos de temperatura y pH. La
papaína resiste a 50°C por 30 minutos sin pérdida significativa de
actividad, encima de 75°C ocurre la inactivación.
El enzima es muy estable a 30°C en el rango de pH 5 a 7, encima de
pH 7 la actividad es lenta y encima de pH 11 la pérdida de actividad
es más rápida, debajo de pH 3 la enzima es rápidamente inactivada.
24
La papaína cristalina es remarcablemente estable en soluciones de urea.
La exposición a al:as concentraciones de urea produce pequeños cambios
configuracionales en la papaína.
2.2.3.5. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS
- La papaína pura es un polvo amorfo, de color blanco grisáceo
(crema) o pardusco.
- Ligeramente higroscópico.
- Poco soluble en agua y en la mayoría de los solventes orgánicos.
- Soluble en alcohol etílico y metílico.
- Su punto isoeléctrico aparente es 8.8.
- La papaína es termoestable.
- La temperatura de inactivación está entre 75° y 83°C.
- Pierde de 3 a 4 % de su actividad por mes a temperaturas
ordinarias.
2.2.3.6. CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS
- Es una enzima proteolítica considerada en la clasificación de los
enzimas como Papainasa, del grupo de las Proteinasas y su
propiedad enzimática está dada por la presencia de SH.
- Ataca a las sustancias proteicas y no a los polipéptidos.
- En la oscuridad puede conservarse por un año.
- La proteólisis es rápida a 40 - 50°C, actuando mejor a un pH
próximo a la neutralidad.
25
La ventaja de la papaína sobre la pepsina es que puede actuar en medio
alcalino o neutro y hasta ligeramente ácido.
Desdobla las proteínas hasta peptonas y aminoácidos.
Está sujeta a activación mediante agentes reductores y es inactivada por
agentes oxidantes.
Pueden emplearse como activadores la cisteína, el glutatión, el cianuro de
sodio, el tioglicolato de sodio y los sulfitos.
En la práctica parece que se añaden bisulfitos durante la preparación del
enzima comercial. Casi todos los agentes oxidantes, incluso el oxígeno
atmosférico inactivan la papaína en solución. Se ha demostrado la
presencia de inhibidores "bioquímicos" en las harinas de soya y de trigo.
La papaína seca con 5-10 % de humedad, es bastante estable.
2.2.3.7. ACTIVACIÓN DE LA PAPAÍNA
El HCN ejerce un efecto activador en la acción proteolítica del látex de la
papaya. El H2S es también efectivo y se sugirió que este agente activante
funciona como coenzima.
Todos los activadores conocidos de la papaína son capaces de reducir los
enlaces disulfuro, la papaína es reversiblemente oxidada con agentes
oxidantes tales como l2, H202 y por exposición al aire la inactivación pudo
ser parcialmente revestida por adición de agentes reductores, se puede
decir que la activación de la papaína es el resultado de una reacción de
reducción.
26
Varios investigadores postularon que la papaína inactiva existía como
disulfuro (PaSSPa) y a la reducción como (PaSH) se hacía activo.
Las investigaciones hechas han demostrado sin embargo que la papaína
no era activada completamente por alguno de los agentes reductores
usuales. Análisis con a-Benzoil-L-Argininamida (BAA) como sustrato se
observaron efectos iónicos específicos marcados en la actividad de la
papaína, cuando la cisterna sola, era el agente activante, la combinación
de Verseno-L-etilendiamino Tetra acetato, con algún reductor simple
facilita la activación producida por este reactivo.
La combinación de la Cisteína y el Verseno dieron una actividad especifica
máxima.
Las observaciones demuestran que un agente reductor es requerido,
presumiblemente para la reducción de enlaces disulfuro a grupos Tiol libres
que son esenciales para la actividad.
Es importante enfatizar que aunque la papaína requiere activación, la
presencia continua del activador no es requerida, esto es la prueba más
conclusiva de que la Cisteína, HCN, etc. no funcionan como coenzimas.
2.2.3.8. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
a. PRECIPITACIÓN FRACCIONADA:
Con alguna sal como S04(NH4)2 la diálisis y la precipitación de más
proteínas mediante calentamiento moderado con algún ácido o con
concentración moderada de alcohol o acetona.
27
POR ADSORCIÓN:
Con sustancias inorgánicas como los hidróxidos férr ico y alumínico
coloidales.
PRECIPITACIÓN DEL EXTRACTO:
Del látex de papaya (papaína cruda) con cloruro de sodio, por
centrifugación en forma directa, seguido por la afinidad cromatográfica del
precipitado redisuelto, para su posterior obtención en polvo.
2.2.3.9. USOS Y APLICACIONES
a. ALIMENTOS:
Se le emplea para ablandar las carnes duras y con este fin se le mezcla
con la sal y demás sazonadores, con este mismo fin se le usa en
inyecciones para colocárseles a los animales vivos antes del sacrificio: Por
su propiedad digestiva puede usarse en recetas de dietas fácilmente
digestibles. Se usa también para reducir la viscosidad de la clara del huevo
y así helarla sin que gelatinice. Los hidrolizados ("lisados") de proteínas
han sido muy utilizados en la práctica médica como reconstituyentes, a la
que esporádicamente retornan de tanto en tanto. Actualmente se
acrecienta su aplicación como aditivos alimentarios, pero si bien en algunos
casos suelen utilizarse enzirnas proteolíticas en su preparación, es mucho
más común que se apele a la hidrólisis clorhídrica. Naturalmente que así se
destruyen algunos aminoácidos (tirosina y especialmente triptofano), por lo
que en los hidrolizados destinados a uso terapéutico o a la elaboración de
peptona (triptona) para ,ensayo microbiológicos se recurre a la hidrólisis
enzimática.
28
b. INDUSTRIA CERVECERA:
Aplicada cuando la malta está hirviendo, impide que en la cerveza se forme
una bruma cuando esté puesta en refrigeración. Las proteínas de alto peso
molecular que se disuelven primero en la cerveza en presencia de oxígeno
forman compuestos insolubles y la papaína hace que estas se
descompongan en unidades más pequeñas, fácilmente solubles y que no
precipiten.
c. INDUSTRIA DE CUEROS:
Otro proceso industrial importante en el que se emplean enzimas
proteolíticas es la manufactura de cueros, ya sea en la etapa previa de
depilación de la piel, como en la posterior del ,."batido", cuyo objetivo es
preparar el cuero para el teñido y que consiste en la remoción de restos de
pelos, glándulas, células epiteliales y tejidos superficiales no separados por
los tratamientos previos. En este caso la más utilizada es la pancreatina,
proteasa de origen animal, pero también se ha ensayado el uso de
papaína,
d. LAVANDERÍA:
Es un detergente blanqueador, además ayuda a preservar la ropa de la
grasa y suciedad.
e. EN MEDICINA:
Apoya la digestión enzimática. El amplio sector de pH en que la papaína
desarrolla su actividad proteolítica ha de considerarse como ventaja,
digiere proteínas provenientes de los alimentos.
f. EN LECHERIA:
Como agente de maduración de quesos.
29
f. EN FOTOGRAFÍA:
Para l a separación de la plata de las películas fotográficas.
g. EN LA INDUSTRIA TEXTIL :
En e l desgomado de la seda y el tratamiento de lanas. Para eliminar el
apresto de la seda, el acetato, cuando aquél está hecho a base de gelatina
o caseína.
h. EN FARMACOPEA :
En los polvos dentífricos, como sustituto de la pepsina diferenciándose de
asta por ser activa en estado neutro o alcalino, por lo que está muy
difundida en terapéutica. La papaína pura se usa como vermífugo
destruyendo los parásitos intestinales al desintegrar su cutícula
queratinosa, que los protege de la acción de los jugos digestivos. Es así
como destruye los oxiuros, áscaris, tricocéfalos y anquilostomas de la
familia de los nematodos.
i. OTROS:
Es usada también como antihelmíntico, , en la industria del tabaco,
bacteriología, cosmetología, radiología, etc.
2.2.4. MATERIAS PRIMAS PARA LA HIDRÓLISIS
a. PROTEÍNAS
Cuando se solubilizan son de dimensiones coloidales tienen propiedades
anfotéricas, su hidrólisis completa produce una mezcla de aminoácidos.
Por su función biológica, se las conoce con el nombre de biopolímeros.
Debido a que están constituidas por aminoácidos, las proteínas desarrollan
una carga neta que depende de la
30
influencia de los diferentes grupos R ionizables y del pH al que se
encuentren:
Es decir, pueden tener una carga positiva y negativa o bien no tener
carga cuando se llega a su punto isoeléctrico
b. AMINOÁCIDOS
Son los monómeros y los principales constituyentes de las proteínas
por lo que su distribución y concentración determinan
fundamentalmente las propiedades de cada proteína. Exceptuando
la hidroxiprolina y la prolina, que son consideradas como a-
iminoácidos, los demás aminoácidos son ácidos a-amino carboxílicos
con carácter anfotérico debido a la presencia de los grupos amino y
carboxilo. Son a-aminoácidos porque los grupos carboxilo y amino se
encuentran en el carbono a de la molécula mientras que en los a-
iminoácidos el nitrógeno del grupo amino interacciona de tal manera
que se forma un anillo heterocíclico de cinco miembros. Con
excepción de la glicina que tiene un átomo de hidrógeno como
radical R, todos los a-aminoácidos presentan un carbono asimétrico
y por lo tanto existen en dos formas ópticamente activas: D y L
isómeros. De acuerdo con la estructura química del gliceraldehído,
los aminoácidos que se encuentran en la naturaleza, y que tienen
actividad biológica son los de configuración L. Las de la serie D se
encuentran en las mezclas racémicas de aminoácidos producidos a
través de distintos procesos químicos y no son aprovechados por el
organismo humano en la síntesis de proteínas, sino que en la
mayoría de los casos sirven únicamente como fuente deenergía.
31
R R
│ │NH2--------------------C-------COOH HOOC ------C-------NH2
│ │
N H
L- Aminoácido D- Aminoácido
FIGURA 2.3. Isómeros de los a-aminoácidos
c. PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS
Solubilidad. Dependen en gran parte del pH, el efecto del medio ácido o
alcalino determinan que el aminoácido esté presente en forma
predominante positiva o negativa, la cual favorece la solubilidad, también
se aumenta ésta subiendo la fuerza iónica de la solución, aunque, cuando
es excesivo el aumento los aminoácidos tienden a precipitarse.
Absorción de Luz Ultravioleta. Los aminoácidos con radicales cíclicos
como la tirosina, absorben luz ultravioleta, con máximo de absorción a 275
milimicras, hecho que permite hacer análisis de proteínas, basándose en
que estos aminoácidos constituyen un índice de la proteína total en vista de
estar presentes de modo constante en las proteínas.
32
Actividad óptica. Los aminoácidos son ópticamente activos y algunos de
ellos desvían la luz polarizada hacia la derecha y otros hacia la izquierda.
Las propiedades químicas más importantes son: Reacción con ácido
nitroso, Titulación con formol, N-arilación, Reacción de la ninhidrina.
2.2.4.1. LA CARNE FUENTE DE
PROTEÍNAS
De acuerdo con su función las proteínas de origen animal se han dividido
en proteínas contráctiles (miofibrilares), sarcoplásmicas y de tejido
conectivo o estroma; el porcentaje de cada fracción depende de la especie
animal que se trate. Por ejemplo, en el ganado vacuno se obtiene una
distribución de aproximadamente 50%, 35% y 15% respectivamente, las
proteínas solubles de los tejidos animales son las miofibrilares y las
sarcoplásmicas, mientras que las del tejido conectivo son muy insolubles,
las principales características de las proteínas solubles son su poder
emulsionante y su capacidad de absorción de agua, por la que evitan
pérdidas de humedad durante el proceso de cocción de los cárnicos y sus
derivados, además tienen la capacidad de coagular formando geles de una
textura que es desecada en varios alimentos.
La carne es uno de los alimentos más ricos en nutrientes y fuente excelente
de proteínas de alto valor biológico, de vitaminas de complejo B y de
sustancias minerales, particularmente hierro.
El valor biológico puede reducirse si la carne contiene cantidades
importantes de tejido conectivo, ya que este, prácticamente no contiene
metionina y tr iptófano.
2.2.4.2. LA CARNE DE ALPACA (Lama pacos).
La carne de alpaca se caracteriza por su bajo nivel de grasa
33
intramuscular y un contenido de minerales, aminoácidos y ácidos grasos
comparables a los encontrados en carne de vacuno y ovino. Sin embargo,
la carne de alpaca muestra un cociente de ácidos grasos n-6/n-3 más
favorable que el de la carne de vacuno u ovino y una baja concentración de
vitamina E. La caracterización de la carne de alpaca en lo que respecta a
los parámetros que determinan su calidad tecnológica también ha sido
reforzada con el presente trabajo. La nueva información aportada por este
estudio ha sido la determinación de los parámetros del color (CIELab) y el
contenido en mioglobina. En relación a los valores de pH, dureza y CRA
fueron coincidentes con los encontrados por otros autores en carne de
alpaca, y en su defecto en carne de otros camélidos u ovinos, de similar
tamaño y/o edad de sacrificio. (Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ
2009)
2.2.4.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA Y VALOR NUTRITIVO DE
LA
CARNE DE ALPACA
La materia prima principal para la investigación presente es la carne de
alpaca. La importancia de este animal radica en su carne, su fibra y su piel.
En la producción de carne se puede estimar que una alpaca pesa unos 50
kg obteniéndose un promedio de carne de unos 25 kg aproximadamente.
Las cualidades de este producto son excelentes: muy magro, alto contenido
proteico, gran suavidad y apta para ser consumida en fresco, seca o
preparada en embutidos.
COMPONENTES QUÍMICOS DE LA CARNE
- Agua
Es el componente de mayor cantidad, variable entre límites muy ostensibles
según la edad y principalmente el estado de nutrición.
La carne físicamente tiene estado sólido, pero presenta la propiedad de
34
tixotropía, esto es que las propiedades sólidas de la estructura desaparecen
con la destrucción de las uniones celulares por trituración fina, la carne
entonces fluye como un líquido viscoso. Este hecho se aprovecha en la
industria, en el relleno de tripas para la fabricación de embutidos.
La anexión de algunas sales, como cloruro de sodio, aumenta la capacidad
fijadora de agua por parte de la carne, ya que se forman enlaces entre el
agua y los iones disueltos. Este hecho es aprovechado para la fabricación
de embutidos escaldados.
-Proteína
Es el componente más importante de la carne, que entra en constitución de
todas las partes del cuerpo y en todas las sustancias que regulan las
funciones del organismo.
La proteína de la carne esta constituida por varias cadenas de aminoácidos,
los cuales se clasifican de acuerdo a su importancia en la nutrición humana
en aminoácidos esenciales, por lo que el valor biológico de las proteínas es
muy alto, solo superado por la leche y los huevos.
-Grasa
Se distinguen tres tipos de grasa: la extracelular, intermuscular e
intramuscular. En el primer grupo se encuentra el tejido adiposo localizado
debajo de la piel y los demás depósitos de grasa del organismo. La grasa
muscular es de constitución constante y específica y su composición
depende de la alimentación.
-Minerales
Los minerales en la carne se encuentran distribuidos irregularmente entre el
jugo muscular, los compuestos celulares y el resto de líquidos
extracelulares. La carne y órganos son buena fuente de potasio y fósforo,
contienen cantidades moderadas de sodio y magnesio, y cantidades bajas
de calcio. También contienen microelementos como: zinc, hierro,
35
manganeso, yodo, flúor, cobalto, estroncio y selenio.
-Carbohidratos
Los carbohidratos contenidos en la carne tienen un rol específico en cuanto
a la acidez y conservación de la carne pero desde el punto de vista nutritivo
carece de importancia.
-Vitaminas
En comparación con los vegetales y las frutas la carne posee poco
contenido en vitaminas.
Las carnes ricas contienen vitaminas liposolubles (A, D y algo de E). Las
carnes no presentan vitamina C.
-Enzimas
Las enzimas son de gran importancia en los procesos de transformación de
las sustancias nutritivas, fundamentales para los fenómenos post morte que
sufre la carne.
COMPONENTES ORGANOLÉPTICAS DE LA CARNE
Los factores que influyen en las características organolépticas son la
especie, edad, tipo de alimentación, actividad del animal y la forma de
beneficio.
-Olor y sabor
El aroma es una sensación compleja que influye en el olor, sabor, textura,
temperatura y pH; de estos los más importantes son el olor y sabor.
Algunas características determinantes del aroma son de naturaleza
hereditaria. Otro factor es el estado bioquímico de los músculos, cuanto
más elevado es el pH final menor es su aroma. La duración y temperatura
36
de cocción influyen en la naturaleza e intensidad de olor y sabor de la
carne; la cocción prolongada determina una intensa degradación de la
proteína y una disminución del aroma.
La presencia de testosterona en machos adultos tiene mucha influencia en
este sentido.
-Color
El aspecto que ofrece la superficie de la carne al consumidor no solo
depende de la cantidad de mioglobina presente, sino también del estado
químico y físico de otros componentes, entre ellos la hemoglobina.
El color normal de la carne es rojo cereza claro que estará dado por la
presencia de pigmentos como hemoglobina (sangre) y mioglobina
(músculo).
Este color puede variar por factores intrínsecos como la cantidad, estado
químico, especie, raza, edad y alimentación; y por factores extrínsecos
como grado de desangrado de la carne, grado de conservación, tipo de
transformación, contaminación, descanso, ayuno, condiciones de beneficio
y estado patológico.
-Textura
La textura es más basta al aumentar el animal de edad, y en los músculos
de los animales machos el tejido es más duro que en las hembras.
COMPARACIÓN ENTRE COMPOSICIONES QUÍMICAS DE DISTINTAS
CARNES
Cuadro N° 1: Comparación entre distintas carnes
EESPECIE HHumedad (gr/100 gr de muestra original)
PProteína (gr/100 gr de muestra original) (Factor: 6,25)
GGrasa (gr/100 gr de muestra original)
AALPACA 68,0 24,2 6,6
37
LLlama 69,2 24,8 3,7
VVacuno 66,0 17,5 22,0
OOvino 72,2 18,9 6,5
PPorcino 42,0 14,5 37,3
PPollo 72,1 18,3 9,3
CCuy 70,6 20,3 7,8
(Fuente: Análisis en el Instituto de Certificación, Inspección y Ensayos de
La Molina, Lima)
La carne de alpaca se caracteriza por ser un alimento apto para el
consumo. Además posee características similares con respecto a otras
carnes rojas. Es una carne de color rojo purpúreo, suave en animales
jóvenes, consistentes y fibrosos al contacto. La carne de los camélidos tiene
mayor nivel proteico en relación a otras especies. La carne de llama y
alpaca no presenta un nivel suficiente de carbohidratos, pero ese déficit se
ve compensado por la grasa animal. Con respecto a esta grasa diferentes
científicos
(Garnica, 1985), han medido el colesterol sérico en alpacas, encontrando
que en cada 100 ml de suero sanguíneo hay entre 20,43 mg a 52,22 mg de
colesterol. Estas cantidades son muy inferiores si las comparamos con las
de ovino y vacuno que van de 200 mg a 300 mg/100 ml.
Las carnes de los camélidos andinos nos proporcionan apreciables
cantidades de vitaminas del complejo B, algo de vitamina A y las restantes
solo en las vísceras. En el charqui de llama o alpaca, que es la forma como
ha sido aceptada mayormente, si fue curada al sol pierde parte de vitamina
A, pero si se enriquece en la vitamina D.
En cuanto a la chalona de alpaca comparada con la de ovino, obtenemos
los siguientes resultados:
- Chalona de alpaca: 57.7 % proteína, 3.6 % grasa.
38
- Chalona de cordero: 50.3 % proteína, 11.7 % grasa.
Con estos análisis se deduce que la carne de alpaca debido al manejo del
animal es ecológica, nutritiva y sana.
(ING: ARANTXA URSÚA ANDRÉS (e)k “ PROYECTO DE PLANTA DE
EMBUTIDOS Y CHALONA, CON CARNE DE ALPACA, EN PILPICHACA,
PERÚ” 2004 Universidad Pública de Navarra)
El conocimiento de la composición química de la carne de alpaca es
importante para el entendimiento de su valor nutritivo, así como también
para interpretar su calidad sensorial y aptitud para el tratamiento industrial.
En la bibliografía internacional solo se ha encontrado un estudio sobre los
componentes mayoritarios de la carne de alpaca (en músculo L. dorsi)
realizado por Cristofanelli et al. (2004) con animales de 25 meses criados
de forma tradicional en Perú. En dicho estudio se manifiesta que la carne de
alpaca es baja en grasa y presenta un contenido de proteínas elevado con
respecto a carne de rumiantes más convencionales y de cerdo. Además
estos autores han observado una composición similar entre carne de alpaca
y llama, a excepción de las cenizas que son mayores para el caso de la
alpaca. Adicionalmente se puede observar la composición química de la
carne proveniente de la pierna (sin considerar la grasa subcutánea) de
alpaca, cerdo y cordero, donde resalta el bajo contenido graso de la carne
de alpaca y mayor contenido de proteínas, con respecto a la carne de las
otras especies. En el estudio de Cristofanelli et al. (2004), anteriormente
mencionado, también se determinó el contenido en colesterol de la carne
(L. dorsi) de las alpacas y las llamas, obteniendo valores de 51 mg/100 g
para las alpacas y de 56 mg/100 g para las llamas. Coates y Ayerza (2004),
también estudiaron en Llamas argentinas el contenido de colesterol en el
músculo L. dorsi y grasa renal, encontrando valores en torno a 52 mg/100g
en el músculo y 93 mg/100g en la grasa renal, estableciendo así la
diferencia en el contenido de colesterol entre ambos tejidos (graso y
muscular), lo que podría ser extrapolable a la alpaca. Los valores de
colesterol de la carne de alpaca y llama (músculo L. dorsi) son al menos
39
10-30 mg/100g inferiores que los valores encontrados en la carne (músculo
L. dorsi) de vacuno u ovino (Badiani et al., 1998; USDA, 2008;) y porcino
(USDA, 2008); sin embargo, tiene valores similares a los encontrados en
pechuga de pollo y pavo sin piel (Chizzolini et al., 1999; USDA, 2008).
En cuanto al perfil de ácidos grasos de la carne de alpaca, no se han
encontrado en la bibliografía trabajos previos al respecto; sin embargo, se
tienen referencias de estudios en carne de llama – animal que presenta
similitudes con la alpaca en cuanto a que también es un camélido
sudamericano y que se cría extensivamente compartiendo lugares de
pastoreo con las alpacas – realizados por Coates y Ayerza (2004) y Polidori
et al. (2007b). Estos autores determinaron el perfil de ácidos grasos en el
músculo Longissi us thoracis y lumborum de llamas argentinas (5-8
años de edad) y peruanas (2 años) y encontraron un porcentaje de ácidos
grasos saturados sobre ácidos grasos totales entre 46 y 50%, de ácidos
grasos monoinsaturados Introducción: Carne de alpaca 17 entre 38 y
42% y de poliinsaturados entre 4,5-7,2%. De acuerdo a esos autores, en
términos generales, la composición de ácidos grasos de la carne de llama
puede ser comparada con datos obtenidos en experimentos previos sobre
vacuno y cordero (Chan, 2004), aunque la carne de llama presentó mayores
cantidades de ácidos grasos poliinsaturados que los hallados en la carne de
dichos rumiantes (4,3 – 5,0 % del total de ácidos grasos). Se puede
observar que los ácidos grasos mayoritarios de la carne de llama fueron el
ácido oleico (C18:1 cis), seguido del palmítico (C16:0) y esteárico (C18:0).
También es importante mencionar que, debido a que el sistema de
explotación de las llamas se basa en el pastoreo, su carne tiene un
contenido importante de ácido linolénico C18:3 n-3 (en torno al 1%),
comparado con los valores promedios encontrados en carne de vacuno y
ovino, aunque similar al hallado en vacunos jóvenes que pastan (Enser et
al., 1998). El contenido en minerales de la carne de alpaca (en el músculo
L. thoracis) ha sido determinado por Polidori et al. (2007a). Estos autores
analizaron la carne de 20 llamas y 30 alpacas machos criadas en Perú y
sacrificadas a los 25 meses de edad. A partir de los resultados se concluye
que los contenidos minerales de la carne de alpaca y llama son
40
comparables al de otras carnes. El contenido aminoacídico de la carne de
alpaca no ha sido encontrado en las referencias bibliográficas revisadas. No
obstante, Bustinza et al. (1993) estudiaron la calidad nutritiva de la
proteína de la carne de alpaca en experimentos con animales de
laboratorio, determinando el índice de digestibilidad (D), el valor biológico
(VB), la utilización neta de proteína (UNP) y la conversión y eficiencia
alimenticia. Las muestras de carne consistieron en una mezcla por partes
iguales de carne de cuello, brazuelo, costillar, lomo y pierna de seis alpacas
Huacaya procedentes del departamento de Puno (Perú). También se
observan los resultados obtenidos en esos ensayos, realizados sobre carne
de alpaca cruda y carne hervida en agua a 100 ºC durante 45 minutos.
Comparando dichos resultados con los obtenidos en carne de vacuno
(Organización para la Agricultura y la Alimentación FAO, 1981), estos
autores afirman que en términos generales, la carne de alpaca tiene
aproximadamente un 10% más de valor biológico, menos de un 10% de
digestibilidad y un UNP similar. Finalmente, en cuanto al contenido de
vitaminas no se han reportado estudios en carne de alpaca.
(Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ 2009)
a. PROTEÍNAS DE LA CARNE
PROTEÍNAS MIOFIBRILARES
Estas proteínas representan, aproximadamente la mitad de todas las
proteínas del músculo y sus componentes más importantes son: La miosina
y la actina, que constituyen a su vez, el 50% y 25% respectivamente, de las
proteínas miofibrilares.
Se caracterizan porque son insolubles en agua y en soluciones salinas muy
diluidas, consiguiéndose su solubilización con soluciones salinas más
concentradas y a pH superiores a 5,5. La miosina es una proteína fibrosa
de estructura helicoidal cuyo peso molecular es del orden de 500,000 la
miosina es rica en glutámico y lisina.
Una caracterización bioquímica especial de la miosina es que cataliza la
hidrólisis de la unión fosfato terminal del ATP, transformando la energía
liberada en trabajo mecánico.
La actina se puede encontrar como actina globular (G-act¡na) y como actina
41
fibrosa (F-actina), la G-actina tiene un peso molecular de aproximadamente
50000 contiene unos 450 aminoácidos. La F-actina es un polímero
consistente en una doble hélice de monómeros de G-actina, en número de
500 a 600 y su peso molecular de muchos millones. La molécula de la
actina es mucho más simple que la miosina y, como otras proteínas
musculares fibrosas, es rica en aminoácidos dicarboxílicos.
Se han aislado cantidades relativamente pequeñas de otras proteínas que
están asociadas a las miofibrillas, entre ellas, Tropomiosinas, Troponinas
y Actininas. Estas proteínas están íntimamente asociadas a los filamentos
de actina y miosina de la contracción-relajación muscular.
42
PROTEÍNAS SARCOPLÁSMICAS:
Las proteínas sarcoplásmicas, también denominadas miogeno, son muy
numerosas y complejas. Principalmente están constituidas por los
sistemas enzimáticos del metabolismo celular.
Representan aproximadamente el 35% de las proteínas musculares y
están constituidos en su mayor parte por albúminas y globulinas. Estas
proteínas se caracterizan porque son solubles en agua y en soluciones
salinas diluidas, en especial el pigmento respiratorio mioglobina que es
responsable del color de la carne.
PROTEÍNAS DEL ESTROMA:
Las proteínas del estroma representan la fracción proteica insoluble de
las proteínas del tejido conectivo y se distribuyen ampliamente por todo el
organismo animal, formando parte del esqueleto y de la estructura de
órganos, tendones y nervios.
El principal componente es el colágeno y en menor proporción, elastina y
reticulina. Estas proteínas son las responsables más directas de la dureza
de la carne.
El colágeno es la proteína más abundante del organismo animal, su
composición en aminoácidos, parece ser muy similar en la mayoría de las
especies de los mamíferos.
El colágeno es muy resistente a la acción hidrolítica de los enzimas del
tubo digestivo.
b. AMINOÁCIDOS DE LA CARNE
43
44
45
C. ESTRUCTURA DE LOS AMINOÁCIDOS
46
47
FUENTE: M. EN C. ISRAEL VELÁZQUEZ MARTÍNEZ
48
D. VITAMINAS DE LAS CARNES
CUADRO 2.5VITAMINA FUENTES
VITAMINA A
Antixeroftálmica
Trazas
VITAMINA B,
Tiamina
En los tejidos animales abunda, más en la carne de cerdo, y en
distintas visceras.
VITAMINA B2
Riboflavina
Carne magra.
Acido Nicotinico Carne de res y cerdo.
Acido
Pantoténico
Carne de res, de cerdo y de aves.
BiotinaLa función más importante en la que participa, aunque el mecanismo
exacto se desconoce, es la de fijación del C02.
Acido Fólico Existe en las visceras de los vacunos y porcinos. Se destruye
parcialmente con la cocción al preparar los alimentos.
VITAMINA B6
Piridoxina
Son fuentes útiles las visceras y las carnes de res y pescado.
VITAMINA B12
Cobalamina
En general, la cantidad de vitamina Cobalamina en los alimentos es
baja; las fuentes más ricas son las visceras, sobre todo el riñon y el
hígado.
VITAMINA C Tejidos animales; en la leche de vaca,
VITAMINA D Las fuentes dietéticas de la vitamina más ricas son los hígados y las
visceras de los peces y de otros animales.
49
e. CARACTERIZACIÓN DE LA CARNE SEGÚN INDECOPI
La presente Norma Técnica establece los requisitos generales que
deben cumplir las carnes para el consumo humano. (Ver Anexo 1)
También existe el Reglamento Tecnológico de Carnes (Decreto
Supremo N° 22-95-AG), el mismo que consta de Ciento Tres
Artículos, Once Títulos, Cuatro Disposiciones Complementarias,
Tres Disposiciones Transitorias y Doce Anexos.
Este Reglamento norma el beneficio de ganado, el proceso de
industrialización y comercialización de las carnes y menudencias
de los animales de abasto, así como las apropiadas condiciones
Técnico - sanitarias de los establecimientos y de otros medios
empleados para tal fin, en provecho del consumidor.
El SENASA (Servicio Nacional de Sanidad Agraria), es el organismo
encargado de hacer cumplir este reglamento.
50
TABLA 2.3.
COMPOSICIÓN EN AMINOÁCIDOS DE LAS CARNES FRESCAS, EN
PORCENTAJE DE LA PROTEINA BRUTA
AMINOÁCIDO CLASE CARNE DE
VACUNO
CARNE DE
CERDO
CARNE DE
CORDERO
Isoleucina Esencial 5,1 4,9 4,8
Leucina Esencial 8,4 7,5 7,4
Lisina Esencial 8,4 7,8 7,6
Metionina Esencial 2,3 2,5 2,3
Cistina Esencial 1,4 1,3 1,3
Fenilalanina Esencial 4,0 4,1 3,9
Treonina Esencial 4,0 5,1 4,9
Triptófano Esencial 1,1 1,4 1,3
Valina Esencial 5,7 5,0 5,0
Arginina Esencial para niño 6,6 6,4 6,9
Histidina
Esencial para niño 2,9 3,2 2,7
Alanina No esencial 6,4 6,3 6,3
Acido aspártico No esencial 8,8 8,9 8,5
Acido glutámico No esencial 14,4 14,5 14,4
Glicina No esencial 7,1 6,1 6,7
Prolina No esencial 5,4 4,6 4,8
Serina No esencial 3,8 4,0 3,9
Tirosina No esencial 3,2 3,0 3,2
FUENTE : SCHWEIGERT y PAYNE, 1956.
51
TABLA 2.3.1.
CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS EN CARNE DE ALPACA COMPARADA CON LA CARNE DE CORDERO Y CAMELLO (Expresados en porcentaje respecto al total de aminoácidos)
MAGRO DE CORDERO USDA (2008)
MAGRO DE
CAMELLO Kadim
et al. (2008)
LT de ALPACA
Äcido glutámico 15,52 16,91 16,61
Äcido aspártico 9,41 9,09 12,06
Isoleucina+ Leucina 13,48 13,64 11,40
Lisina 9,44 8,45 11,05
Histidina + Treonina 7,96 8,73 7,63
Alanina 6,43 6,25 7,30
Arginina 6,35 7,38 6,90
Glicina 5,22 5,95 5,97
Fenilalanina + Triptófano 5,60 4,84 5,17
Serina 3,98 3,63 4,76
Valina 5,77 5,16 3,33
Prolina 4,49 5,39 3,27
Tirosina 3,60 3,23 2,36
Metionina 2,75 2,41 2,19
FUENTE : Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ“CARACTERIZACIÓN DE LA CARNE Y CHARQUI DE ALPACA (Vicugna pacos)”
52
TABLA 2.4. CONTENIDO DE VITAMINAS DE DIVERSAS CARNES CRUDAS
VITAMINA(unidades/100 g
de carne cruda)
CARNE
VACUNACARNE DE
TERNERA
CARNE DE
CERDO"
BACON CARNE DE CORDERO
HÍGADO
(bovino)
A(U.I.) trazas trazas trazas Trazas trazas 20.000
B1 (tiamina) (mg) 0'7 0'10 1'0 0'40 0'15 0'30
B2 (riboflavina) (mg) 0'20 0'25 0'20 0'15 0'25 3'0
Acido nicotínico(mg) 5 7 5 1'5 5 13
Acido pantoténico(mg) 0'4 0'6 0'6 0'3 0'5 8
Biotina (/^g) 3 5 4 7 3 100
Acido fólico( jUg) 10 5 3 0 3 300
B6 (mg) 0'3 0'3 0'5 0'3 0'4 0'7
B12 ( j U g ) 2 0 2 0 2 50
C (ácido ascórbico)
(mg)
0 0 0 0 0 30
D(U.I.) trazas trazas trazas Trazas trazas 45
FUENTE : Mc.CANCE Y Widdowson
53
TABLA 2.4.1CONTENIDOS DE LOS ELEMENTOS MINERALES EN CARNE DE ALPACA (EXPRESADOS EN MG/100G).
Base húmeda (n=20) Base seca (n=20)
Promedio ± SD
Rango Promedio ± SD Rango
Rango
K 419,40 ± 47,85
325,95 485,29
1495,24 ± 128,42 1248,30 - 1711,90
P 295,13 ± 30,09
226,59 341,18
1082,25 ± 91,96 910,38 - 1211,81
Na 88,41 ± 15,25 68,86 126,30
339,80 ± 52,56 266,48 - 443,57
Mg 33,85 ± 4,11 19,94 32,65
105,65 ± 10,94 80,10 - 119,53
Ca 10,72 ± 4,03 5,49 17,24 33,88 ± 13,76 19,72 - 70,00
Zn 4,41 ± 2,14 2,00 8,97 13,80 ± 6,04 8,10 - 31,51
Fe 2,69 ± 0,96 1,10 3,74 8,41 ± 2,90 4,31 - 14,11
Cu <0,10 - - - - -
Mn <0,025 - - - - -
FUENTE : Ing. Mg. Sc. BETTIT KARIM SALVÁ RUIZ“CARACTERIZACIÓN DE LA CARNE Y CHARQUI DE ALPACA (Vicugna pacos)”
2.3. HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS
La acción de los ácidos, álcalis o enzimas hidrolizan las proteínas. Sin
embargo, el método más utilizado para el estudio de la composición en
aminoácidos de las proteínas es la hidrólisis ácida. En este caso, se
somete la proteína a la acción
54
de una solución de ácido clorhídrico al 20.5% durante 17-20 horas a reflujo.
Se puede reducir este tiempo a 8-10 horas aumentando la temperatura
hasta 120°C. Con este tipo de hidrólisis no se provoca la racemización y,
por tanto, se obtiene una solución de L-aminoácidos. No obstante, se corre
el riesgo de que en tratamientos muy prolongados los ácidos minerales
descompongan al triptófano.
Se induce también la formación de ácidos aspártico y glutamico a partir de
asparagina y glutamina y, además, cabe que los aminoácidos sulfurados
experimenten cierta oxidación.
Por otro lado, la hidrólisis alcalina origina, en primer lugar, la
racemización de los aminoácidos y, debido a ello, los alimentos así
elaborados tienen un valor nutritivo menor. Para practicar esta hidrólisis
se suele utilizar una solución 6N de hidróxido de Sodio o de Bario. Este
método ocasiona la destrucción de la argínina y parcialmente de la Usina,
mientras que por el contrario, el triptófano permanece incólume.
Por último, también se logra la hidrólisis completa de las proteínas
mediante la aplicación de métodos basados en la acción de enzimas
proteolíticos. A diferencia de los métodos de hidrólisis acida ó alcalina,
estos no modifican los grupos funcionales de la proteína.
2.3.1. HIDRÓLISIS ENZIMATICADE
PROTEÍNAS
2.3.1.1. INTRODUCCIÓN
Los enzimas, catalizadores
55
biológicos de naturaleza proteica que regulan las muchas reacciones que
tiene lugar en los seres vivos, han sido utilizados desde la antigüedad en
algunos procedimientos alimentarios, si bien de forma empírica e indirecta
utilizando microorganismos enteros o extractos de tejidos vegetales o
animales.
La hidrólisis enzimática presenta indudables ventajas frente a la tradicional
hidrólisis química, acida o alcalina, entre las que cabe mencionar las
siguientes:
a. SELECTIVIDAD:
Las enzimas son específicas para un tipo determinado de enlace y, por
tanto, no es frecuente la aparición de productos de degradación.
b. CONDICIONES MODERADAS DE TEMPERATURA Y PH:
La hidrólisis enzimática transcurre a temperaturas próximas a la ambiente,
generalmente en el intervalo de 40° a 60°C, y pH comprendido entre 4-8.
c. NO SE AÑADEN SUSTANCIAS EXTRAÑAS:
Salvo la enzima.
d. SE MANTIENE EL VALOR NUTRITIVO:
Ya que no se produce degradación de los componentes separados.
56
2.3.1.2. FUNDAMENTO DE LA ACCIÓN ENZIMATICA
La acción catalítica de una enzima se produce por unión de la enzima
con las proteínas que van a reaccionar y que, en el lenguaje bioquímico, se
llaman sustratos, aunque generalmente, son moléculas mucho más
pequeñas que la de la enzima.
La unión se produce en un sitio preciso de la molécula proteica enzimática,
llamado sitio activo. La conformación de la enzima, en el sitio activo,
encaja perfectamente con las moléculas de proteína (sustrato) de modo
que las sitúa, orienta y activa
En el complejo enzima-sustrato (ES) ocurren varias cosas:
ENZIMA
FIGURA.2.4. Acople-enzima-sustrato en el sitio activo
57
1. La concentración (vecindad) de las substancias reaccionantes se
hace muy grande en el sitio activo de la enzima.
2. En los puntos de unión ES, las fuerzas de atracción activan las
moléculas reaccionantes, de tal manera que la energía Térmica
de activación se hace innecesaria o se reduce mucho.
3. En el lugar de la reacción se produce una fuerte disminución de la entropía
(mayor concentración, mayor ordenación, mayor orientación de las
moléculas). Por estas tres razones, las reacciones enzimáticas transcurren
con velocidades altas, a bajas concentraciones y temperaturas bajas, ya
que las moléculas que reaccionan son activadas en un punto con
proximidad y la orientación adecuada y, allí, son activadas.
La reacción enzimática transcurren en tres fases.
E + S ES EP E + P
Siendo el paso ES EP el que exige mayor activación.
58
FIGURA. 2.5. Coordenadas de reacción para una reacción catalizada por
un enzima en comparación con otra no catalizada.
Donde:
1. Energía de Estabilización de E+S -------------► ES
2. Energía de activación de ES
3. Energía desprendida ES —► EP
4. Energía desprendida EP —► E + P
5. Energía desprendida en la reacción enzimática
E + S ---------------------► E + P
6. Energía de activación de la reacción no enzimática.
59
60
2.3.1.4. PARÁMETROS
a. VARIABLES INDEPENDIENTES
- CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA
La unidad usual de actividad enzimática es la cantidad de enzima que
cataliza la transformación de 1 mol de sustancia por minuto en
condiciones preestablecidas. Sin embargo, por lo que respecta a los
enzimas alimentarios comerciales, las unidades de actividad no se
ajustan necesariamente a la definición citada, la mayoría de los
enzimas utilizados en los sistemas alimentarios no son puros y no es
posible medir la cantidad de proteína enzimáticamente activa
responsable de la transformación del sustrato.
- pH
En general, los enzimas son activos en un rango limitado de pH.
Usualmente cada enzima tiene un pH óptimo porque, al igual que otras
proteínas, los enzimas poseen muchos grupos ionizables de forma que
los cambios de pH pueden alterar su conformación, su capacidad de
unión con el sustrato y la actividad catalítica de los grupos que forman
el centro activo. Los efectos pueden deberse a un cambio en la
velocidad de reacción máxima (Vmax.). Un cambio en la afinidad del
enzima por el sustrato (Km) o una alteración en la estabilidad del
enzima. La estabilidad depende del tiempo que el enzima haya sido
mantenido a un pH desfavorable. De forma similar, los grupos
ionizables del sustrato pueden verse afectados por el pH, lo que puede
ser importante a la hora de formar el complejo enzima-sustrato. En
general todos estos efectos tienen lugar simultáneamente, aunque
también se pueden producir de forma aislada.
Cuando se observa una gran amplitud del rango de pH óptimo, por
ejemplo, en la invertasa, se debe usualmente a que el sustrato no
61
puede ionizarse. En muchas reacciones enzimáticas industriales el pH
no es constante sino que cambia a lo largo de la reacción,
dependiendo de la capacidad tamponante de los sustratos y los
productos implicados. El pH también afecta a la estabilidad del enzima
de forma que el pH óptimo de trabajo se calcula estableciendo un
compromiso entre los efectos en la actividad y estabilidad del enzima.
(Ver 2.2.3.4.)
- TIEMPO
(Ver 3.6.)
b. VARIABLE CONTROLABLE
- TEMPERATURA
Cabe señalar que en los puntos de unión enzima-sustrato (ES), las
fuerzas de atracción activan las moléculas reaccionantes, de tal modo
que la energía térmica de activación se reduce mucho, además se
produce una fuerte disminución de la entropía.
Estas son unas de las razones, por las cuales las reacciones
enzimáticas, transcurren con velocidades altas, a bajas
concentraciones y temperaturas bajas. Esto trae como consecuencia la
utilización de condiciones moderadas de temperatura: la hidrólisis
enzimática transcurre a temperaturas próximas a la ambiente.
62
c. VARIABLE DEPENDIENTE (VARIABLE RESPUESTA)
- GRADO DE HIDRÓLISIS
El grado de hidrólisis tiene importancia científica y tecnológica y viene a ser la
formación de productos, en presencia de la enzima, con concentraciones y
condiciones adecuadas y definidas.
2.3.1.5. EQUIPOS
Un reactor enzimático es, básicamente, el recipiente en el cual se lleva a cabo
una reacción catalizada por enzimas o células libres o inmovilizadas, junto con los
mezcladores, equipos de toma de muestra y aparatos de control. El papel que
cumple el reactor es el de obtener un producto específico a una velocidad dada a
partir de unos reactantes concretos y con un costo mínimo. Los reactores
enzimáticos se diferencian de los reactores químicos en que trabajan a
temperaturas y presiones bajas y comparativamente consumen o generan poca
energía durante la reacción. Se diferencian de los fermentadores en que no se
comportan de una forma autocatalítica, ya que en estos últimos las células en
crecimiento se están regenerando continuamente por sí mismas. Al igual que con
los reactores químicos, los reactores enzimáticos se valoran en función de su
productividad y especificidad.
Los reactores se clasifican en homogéneos y heterogéneos, en función de que su
contenido sea homogéneo, con una sola fase, o heterogéneo, si coexisten varias
fases. En los reactores heterogéneos frecuentemente hay un sustrato líquido
continuo y un sólido discontinuo inmovilizado que es la fase catalítica. Los
reactores también se pueden clasificar en función de que la reacción se produzca
de forma continua o discontinua o como reactores abiertos o cerrados, según que
el catalizador salga del reactor durante su uso o no. La clasificación más
importante es la que tiene en cuenta la extensión de la mezcla alcanzada dentro
del reactor, y así se habla idealmente de reactores de mezcla completa o de flujo
pistón. El perfil de concentración de los reactantes dentro de los reactores de
63
distintas formas varía apreciablemente. En los reactores de mezcla completa las
moléculas de reactante se mantienen en un estado de agitación constante,
mientras que en los reactores de flujo pistón los elementos de fluidos previos o
subsecuentes añadidos al reactor. Por tanto, en los reactores discontinuos de
mezcla completa la composición de los reactantes varía a lo largo de la reacción,
aunque permanece constante a través del reactor. En un reactor agitado
continuamente la composición del contenido del reactor del estado estacionario es
uniforme y no varía con el tiempo en ausencia de inactivación enzimática. En los
reactores de flujo pistón la composición de los reactantes es invariable con el
tiempo aunque varía a lo largo de la longitud del reactor. Los perfiles de
concentración pueden influir tanto en la actividad como en la estabilidad de los
enzimas inmovilizados; por ejemplo los inhibidores producidos endógenamente
son constantemente extraídos de los reactores continuos con objeto de no
alcanzar altas concentraciones que pueden resultar críticas. Por tanto, en los
reactores de flujo pistón el factor de eficacia es alto cerca del inicio de éste y
más bajo en la salida del reactor, debido a que la
concentración de sustrato disminuye a medida que los reactantes atraviesan el
reactor. En los reactores discontinuos, el factor de eficacia es uniforme en todo el
reactor. Sin embargo, en la práctica, a pesar del cuidado en el diseño y operación,
los reactores reales sólo se aproximan, en muchos casos estrechamente, a los
sistemas mezclados ideales. En particular, en las columnas empaquetadas el flujo
no ideal es un hecho habitual, especialmente en las que se utilizan a gran escala.
2.4. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN
2.4.1. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNAS
PRINCIPIOS VENTAJAS LIMITACIONES
64
ABSORCIÓN DEL ULTRAVIOLETA(280nm)
La mayoría de las proteínas
absorben en el UV a 280nm, debido
básicamente a grupos cromóforos
de tirosina y triptófano. Si
se considera que la cantidad de
estos dos aminoácidos es
siempre constante, la
absorvancia debe ser proporcional
a la concentración de proteína.
Es el método más rápi do;
requiere muy poca cantidad
de proteína. El sulfato de
amonio no interfiere,
mientras que en la
mayoría de los métodos si
existe inter ferencia. La
muestra no se destruye y
puede ser usada en
otros análisis.
Se puede hacer una co
rrección por presencia de
ácidos nucleicos, ya que
estos tienen absor ción
máxima a 260 nm. Si se
conoce la relación de
absorción de la pro teína a
280/260 nm es fácil
distinguir la interferencia
de ác.Nucleicos. Varía
la cantidad de
aromáticos entre
proteínas.
BIURET
Las sustancias que contienen dos
ó más enlaces peptídicos forman
un complejo púrpura violeta con
sales de cobre en soluciones
alcalinas. Es posi. ble que el color
se desarrolle por la formación de
un ion coordinado tetracúprico
con dos grupos -CO-NH-
adyacentes.
El más simple para medir
proteína total. Muy pocas
interferen cias de otros
compues tos en el desarrollo
de color.
Se requiere de 20-40mg de
proteína. Existen varios
pigmentos que absorben a
540 nm de longitud de onda.
La presencia de NH4 Ínter
fiere con la reacción. El
desarrollo de color es
diferente.
Interfieren lípidos y
carbohidratos por forma ción
de complejos con el ion
coordinado.
65
La intensidad de color es
determinada espectroscopica
mente a 540 nm con una curva
patrón.
LOWRY
Se basa en el desarrollo de un
color azul debido a: 1)Reacción de
Biuret. 2) Re ducción del reactivo
de fosfg molibdeno tungstato por
aminoácidos como tirosina y
triptófano presentes en las
proteínas. Este método ha sido
modificado muchas veces. La
absorbancia se mide a 750nm
(alta sensibilidad) o a 500nm
(baja sensibilidad) para
proteínas concentradas. Se
requiere de una curva patrón que
es recomendable hacer con la
misma proteína. La sens[ bilidad
es desde 0.2 ug. hasta 300 ug.
TURBIDIMETRICO
Las proteínas se pueden
precipitar con ác.Tricloroacé tico,
sulfosalicíl ico o ferro cianida
de potasio en ácido acético. Se
produce turbidez que puede ser
estandarizada a una temperatura,
concentra ción y tiempo de
reacción para medirse a 600 nm.
Se requiere de curva estándar. El
intervalo recomendado va de 0.5
a 1.5 mg de proteína.
KJELDAHL
Es el método más sensible,
100 veces más sensible que el
Biuret. Relativamente rápido (1
hora)
El método mas rápido
(10 - 15)
Requiere de muchos cuidados
en la estandarización ya que:
1) La intensidad de color varía
entre proteínas.
2) El color no es siempre
proporcional a la
concentración. Existe
interferencia de saca rosa,
lípidos, amort igua dores de
pH, monosacáridos y hexosar
-55 .3 que reacciona^ ce- es
reactivos de Lev. E sulfato de
arr.c" : es sulfihidros y ¡os
fos-'a tos también interf ieren
en la determinación.
Tiene muchas limita ciones
ya que no todas las proteínas
precipitan en una misma
forma. Otras sustancias como
los ác. nucleicos tarn bien
precipitan en presencia de
ácidos.
66
Determina nitrógeno total tanto
orgánico (nitrógeno ami no y
amido) como nitrógeno no
proteico (urea, aminoád dos,etc.)
El método consiste en la
digestión de la muestra con -
H2S04 y la formación de NH4OH
que es recibido en ác. para
finalmente titularlo con á lcaüs
de una concentración
Conocida.
DUMASMide nitrógeno total después
de la combustión de la
muestra (700-900°C). La
medición de nitrógeno
elemental desprendido se
hace volumétricamente en un
nitrómetro.
Es el método más común y por
lo tanto permite comparar fácil
mente resultados con otros
laboratorios. De termina todo
el con tenido de nitrógeno del
alimento. El nitrógeno no
proteico puede ser analizado
después de
Precipitar la proteína con acido
tricloro acético
Se puede hacer análisis hasta
diez minutos con los equipos
automatizados que existen en
el mercado
Puede haber pérdidas de
nitrógeno debido a la
temperatura de digestión y al
catan zador. El contenido de
nitrógeno en la proteína puede
variar considerablemente y
por lo tanto el factor usado
para convertir ni t rógeno
a Proteína. El nitrógeno no
proteico se debe
tomar en cuenta ya que éste
se mide junto con el
proteico. Se usan
reactivos y condiciones un
tanto peligrosas. El método
es largo.
Se requiere de equipo muy
costoso.
La presencia de hidrogeno no
proteico interviene en las
determinaciones
67
2.4.2. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS
a. MÉTODOS GRAVIMETRICOS:
Ocasionalmente algunos reactivos precipitan a un aminoácido de manera
específica y cuantitativa. Un caso bien conocido es el de la Determinación
de la arginina por medio de su precipitación en forma de flavianato
insoluble.
68
b. MÉTODOS COLORÍMETRICOS:
Hay reactivos que producen compuestos coloreados específicos con
determinados aminoácidos que pueden utilizarse con fines
cuantitativos.
En estas ocasiones es el radical R del aminoácido el responsable directo
de la reacción, entre los casos más conocidos se encuentran los
siguientes:
-Reacción de Millón
-Reacción de Xantoproteica
-Reacción de Hokins-Cole
-Reacción de Nitroprusiato
-Reacción de la Ninhidrina
- REACCIÓN DE LA NINHIDRINA
Es una de las reacciones del grupo a-amino más características y más
ampliamente utilizada, que puede utilizarse para valorar los aminoácidos
cuantitativamente en cantidades muy pequeñas.
La calefacción de un a-aminoácido con dos equivalentes de ninhidrina da
un producto intensamente coloreado. En la reacción con la ninhidrina
aparece un color azul con todos los aminoácidos y péptidos que poseen
grupos a-amino libres, mientras que la prolina y la hidroxiprolina, en
69
las que el grupo a-amino se haya sustituido, rinde derivados algo
diferentes que poseen un color amarillo característico.
El grupo a-amino de los aminoácidos al reaccionar con la ninhidrina se
oxida, para formar amoníaco, C02 y el aldehido (que se obtiene por
pérdida de un carbono del aminoácido original). En dicha reacción, un
equivalente de ninhidrina actúa como oxidante del aminoácido para
formar los productos mencionados.
α-Aminoácido Ninhidrina (hidrato de Tricetohidrindeno)
ninhidrina reducida
Un segundo equivalente de ninhidrina reacciona entonces con la
ninhidrina reducida y el NH3 que se forma elaborándose un producto muy
coloreado que tiene la siguiente estructura.
70
Ninhidrina oxidada Ninhidrina reducida
Producto Azul
Este compuesto coloreado (azul) que se forma, cuya intensidad es
proporcional a la concentración del aminoácido presente es muy
utilizado en la cuantificación de éstos. Este complejo de color azul,
tiene una absorción de luz de aproximadamente 570 nm - 690 nm.
71
c. MÉTODOS CROMATOGRAFICOS
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN:
Si una serie de compuestos absorbidos en un sólido se desplazan sobre
la superficie de este sólido debido a la acción de un líquido apropiado,
su velocidad de movimiento dependerá de la fuerza con que estén
absorbidos al sólido y del grado en que se disuelven en la fase líquida.
Se tiene con este método, uno de los más sencillos procedimientos para
la separación cuantitativa de compuestos químicos de estructura muy
parecida, los sólidos para absorber la sustancia son de materiales de
distinta naturaleza dentro de los más usados se encuentra el almidón, el
papel, el oxido de aluminio, los geles de sílice, el carbón, etc.
CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL:
Sobre papel ó sobre lámina delgada, que permite identificar los
aminoácidos existentes en la mezcla por comparación con los factores de
retraso (Rf) de los aminoácidos en las mismas condiciones.
ANÁLISIS CROMATOGRAFICOS DE AMINOÁCIDOS EN COLUMNA:
Los aminoácidos son absorbidos primeramente en una columna que
contiene una resina de intercambio catiónico, en forma sódica, que retiene
con más fuerza los aminoácidos más básicos. Fijada la mezcla de
aminoácidos en la cima de la columna, se elude con un
72
tampón de pH y fuerza iónica crecientes. A pH bajos son eluidos los
aminoácidos de punto isoeléctrico más bajo y a pH altos los más
básicos; de este modo, por la base de la columna salen los aminoácidos
separados.
MÉTODOS DE DILUCIÓN CON ISÓTOPOS:
Para el cuanteo de aminoácidos en hidrolizados de proteínas, aunque
requiere un equipo especializado.
SÍNTESIS MICROBIOLOGICA:
Numerosos gérmenes, para manifestar crecimiento óptimo, requieren
medios de cultivo con distintos aminoácidos, vitaminas, etc. Si se quita
del medio de cultivo uno de los aminoácidos necesarios para el
crecimiento del microorganismo, éste deja de desarrollarse, pero al
añadir nuevamente al medio cantidades progresivas del aminoácido en
cuestión, se obtienen crecimientos progresivos y proporcionales a la
cantidad añadida del aminoácido en estudio. De está manera es posible
cuantear en forma rápida y precisa, diversos aminoácidos en hidrolizados
u otros productos.
MÉTODOS ENZIMATICOS:
Algunas enzimas específicas permiten el cuanteo de los aminoácidos,
midiendo indirectamente determinados productos de la reacción. Así, la
enzima arginosa libera urea del aminoácido arginina y de está manera.
determinando urea, se puede conocer la cantidad del aminoácido, a
partir de diversos gérmenes se han purificado descarboxilosas
específicas de ciertos aminoácidos que, al actuar sobre ellas ponen en
libertad CO2 que se suele medir por métodos manométricos.
73
2.4.3. VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS
La actividad de un enzima se determina a partir de la concentración del
enzima, la concentración del sustrato y su disponibilidad, la
concentración de los cofactores y/o los efectores alostéricos, la
presencia, concentración y tipo de inhibidores, y la fuerza iónica, el pH y
la temperatura del medio. La cinética enzimática estudia la forma en
que todos éstos parámetros influyen en la actividad enzimática,
proporcionándonos un conocimiento de la reacción en estudio y
permitiéndonos su control.
Para un único sustrato(S) y un único producto (P) se puede aplicar el
siguiente esquema de reacción:
S+E E+S E+P
Cuando la concentración de sustrato es mucho mayor que la del enzima
(E), la velocidad de reacción es de orden cero respecto a los reactantes,
es decir, depende solamente de la concentración de enzima presente.
Por tanto, la velocidad de reacción es esencialmente constante
hasta que haya reaccionado casi todo el sustrato, momento en que
pasa a depender de la concentración de sustrato existente y es de primer
orden con respecto a la concentración de sustrato.
La mejor forma de describir la cinética enzimática es mediante la
ecuación de Michaelis-Menten, que presupone la formación de un
complejo enzima-sustrato:
V =
Ec. 2.1
K1 K2
K-1
K2 E S
S + Km
K-1 + k2
74
Donde Km =
Y representa la concentración máxima (Constante de Michaelis)
V= Velocidad inicial de la reacción
Por tanto, cuando la concentración de sustrato es diez veces el valor de
Km la reacción se produce a un 91% de la velocidad máxima de reacción
(Vmax ), y si es 100 veces el valor de Kmás la reacción se produce al 99%
de la Vmax , con tal que no tenga lugar la inhibición por el exceso de
sustrato y no se produzcan inhibidores durante la reacción enzimática.
En este caso,
Vmax =K2 [E]
Donde : V max = Velocidad máxima Ec. 2.2
K1
75
La cinética de Michaelis-Menten supone que tanto el sustrato como el
enzima son solubles y están mezclados de forma homogénea, lo que
no siempre ocurre en los procesos industriales donde a menudo se
emplean sustratos muy concentrados y viscosos e incluso a veces
sólidos. En este último caso, el área de las partículas de sustrato es un
término con frecuencia más útil que el de la concentración,
particularmente cuando algunos enzimas, por ejemplo las lipasas parecen
absorberse en su superficie.
2.4.4. EQUIPO PARA ANÁLISIS
2.4.4.1. EL ESPECTROFOTÓMETRO
Cabe recordar que el término espectrofotometría se refiere al uso de la luz
para medir las concentraciones de sustancias químicas. Existen dos
procesos fundamentales: la absorción y la emisión de luz por las
moléculas, estas se utilizan en el análisis cuantitativo.
Cuando una muestra absorbe luz, la potencia radiante del haz de luz
disminuye de manera que P(potencia radiante emergente) < P0 (potencia
radiante incidente).
La transmitancia T, se define como la fracción de la luz incidente que sale
de la muestra
P
T = -------------------------------------------------- Ec. 2.3.
Po
Una magnitud física más útil es la absorbancia (A), que se define como:
A = log 10 = - log T Ec. 2.4
Esta varía de 0-2. La
P
Po
76
importancia de la absorbancia estriba en que es directamente
proporcional a la concentración de especie absorbente en la muestra :
Ec. 2.5.
A α cDonde : A = Absorbancia (adimencional)
C = Concentración
CC = coeficiente de proporcionalidad
La ecuación 2.5. es fundamental para aplicar la espectrofotometría en
química analítica, se denomina ley de Beer - Lambert.
El espectrofotómetro es un equipo para medir la absorción de luz. La luz
de una fuente continua pasa a través de un monocromador, que
selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz incidente.
Esta luz monocromática atraviesa una muestra de espesor b, y se mide la
potencia radiante de la luz que sale.
Para medir la Absorbancia de luz visible en nuestra investigación se ha
utilizado el espectrofotómetro PERKIN ELMER, que se muestra en la Fig.
2.6.
En este instrumento, la fuente de luz es una lámpara de wolframio cuya
emisión cubre el espectro visible completo. La luz es dispersada en las
diferentes longitudes de onda que la componen mediante una rejilla, y
sólo una banda estrecha de longitudes de onda pasa a través de la
muestra.
Es un espectrofotómetro de doble haz, la luz pasa alternadamente por las
celdas de muestra y referencia. Este equipo para investigación está
equipado para realizar el barrido automático de longitud de onda y el
registro de la absorbancia.
77
Fig. 2.6 ESPECTRÓMETRO, ULTRAVIOLETA PERKIN ELMER WALLAC MODELO: LAMBDA BIO
78
CAPITULO III DESARROLLO EXPERIMENTAL
3.1. GENERALIDADES
El trabajo experimental de la presente investigación puede ser muy
amplio, ya que la biotecnología implicada es muy diversa y compleja, por
lo que nos circunscribimos a tres puntos principales:
a. Investigación para obtener la papaína
b. Investigación acerca del sustrato
c. Cuantificación de la hidrólisis enzimática
79
Para la obtención de la papaína se ha utilizado Papaya común procedente
de la selva puneña, y posteriormente se llevó a cabo la limpieza, la
desinfección, extracción y purificación con Sulfato de Amonio y Cloruro de
sodio, observándose un mejor rendimiento con la primera sal. Finalmente
se procedió a centrifugación y desecación. De esta manera se aseguraba
una mejor pureza del enzima.
En la preparación del sustrato se tuvo que tomar en cuenta: la calidad o
valor nutritivo del mismo (lomo de carne), rigidez y pH debido a la
formación del ácido láctico. Cabe destacar la eliminación del color de la
carne. Ensayos preliminares de hidrólisis determinaron los problemas que
ocasionarían durante las determinaciones colorimétricas, es por eso que
la carne se tuvo que lavar con agua fría varias veces hasta la eliminación
total del color rojizo.
La temperatura factor muy importante en un proceso de hidrólisis se fijó
en 32° C para evitar desnaturalización notoria y que la velocidad
transcurra en un tiempo adecuado.
La concentración de la enzima es de 2,5 a 5% con respecto al sustrato (10
gr.)
El pH fue de 5 - 6, teniendo presente el rango de actividad de la enzima.
Se utilizó el diseño factorial para determinar el número mínimo de
experimentos a realizar con todas las combinaciones posibles, resultando
8 pruebas como mínimo.
Posteriormente se realizó la preparación de las soluciones estándar con
los aminoácidos que libera el enzima, considerando las concentraciones
máximas en las que se encuentra en la carne. Estas muestras patrón
tuvieron un peso total de: 1,298 gr.; 1,105896 gr.; 1,0384 gr.; y 0,98648 gr.
80
La preparación de las 8 muestras han sido diseñadas con los parámetros
anteriormente mencionados y aplicando el diseño factorial respectivo.
Luego de transcurrido el tiempo de hidrólisis, se determinó
cuantitativamente la actividad de la papaína, con el método de la
ninhidrina para su posterior lectura en el espectrofotómetro (Longitud de
Onda 680 nm) de la Absorbancia
El potencial de las bioconversiones enzimáticas en la industria de las
carnes, es enorme y se quiere lograr que los nutrientes biodisponibles de
la carne estén al alcance de una mayoría.
3.2. OBJETIVOS DE LA EXPERIMENTACIÓN
1. Obtener la papaína de la papaya y lograr su estabilización.
2. Preparar la carne de alpaca en las condiciones más óptimas para
que sea hidrolizada por las enzimas.
3. Determinar cuantitativamente la actividad enzimática de la
papaína sobre la carne de alpaca.
3.3. METODOLOGÍA
Para llevar a cabo la experimentación principal, el cual es la hidrólisis
enzimática de las proteínas de la carne de alpaca, se ha tenido que
desarrollar experimentos previos, para disponer de la enzima y para
adecuar el sustrato para su consiguiente hidrólisis.
81
3.4 ALGORITMO DE LA ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
¿ HA SIDO MEJORADA?
¿ES BUENO EL MÉTODO?
¿ÉSTE MÉTODO ES EL MÁS CORRECTO PARA EL USO DEL
¿ HA SIDO MEJORADA?
¿CUMPLE NORMA INDECOIPI?
SELECCIÓN DEL MÉTODO
AMINOÁCIDOS DE HIDRÓLISIS
INVESTIGACIÓN
HIDRÓLISIS DE LA CARNE
EXTRACCIÓN DE LA PAPAÍNA COMPRAR CARNE DE ALPACACOMPRAR LOS AMINOÁCIDOS
PRUEBA PRELIMINAR
APLICAR A LA MUESTRA PATRÓN
HIDRÓLISIS PREVIAS
BUSCAR FORMULACIÓN DE LA CARNE
APLICAR FORMUL A LA CARNE DE ALPACA
SELECCIÓN DE LA PAPAYA
MÉTODO DE EXTRACCIÓN
ANÁLISIS DEL HIDROLIZADO
FIN
FIN
DETERMINACIÓN DEL FACTOR DE CALIBRACIÓN
DETERMINACIÓN ESPECTROFOTÓMETRICA (ABSORBANCIA?
DETERMINACIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA
PREPARAR LA MUESTRA PATRÓN
SELECCIÓN DEL MÉTODO DE ANÁLISIS M NINHIDRINA
DETERMINACIÓN DEL # DE
EXPERIENCIAS FINALES
BUSCAR FORMULACIÓN
UTILIZAR SÓLO PARA PRUEBAS PRELIMINARES
EXTRACCIÓN
COMPRAR PAPAYA
PAPAYA DE MAYOR PUREZA
¿LA CANTIDAD ES SUFICIENTE?
FIN ¿ ESTAS COMPRUEBAN LA INFORMACIÓN
SELECCIÓN MEJORES PARÁMETROS
SELECCIÓN DE PARÁMETROS
HIDRÓLISIS MEJORADAS
SELECCIÓN PARÁMETROS FINALES
SN
S
S N
N
S
S
N
N
S
S
N
N
82
A
1
B
FIN
ANALIZAR RESULTADOS Y ESTABLECER MODELO
SELECCIÓN DEL NÚMERO DE EXPERIMENTOS, METODO FACTORIAL CON TRES REPLICAS EN EL PUNTO
¿CORRESPONDE?
¿SON LAS NECESARIAS SEGÚN EL M. FACTORIAL?
CONSISTENCIA DEL MODELO MATEMÁTICO
APLICACIÓN DISEÑO EXPERIMENTAL
HIDRÓLISIS DE PRUEBAS FINALES
DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE NIVELES Y FACTORES
ANÁLISIS DEL HIDROLISADO
DETERMINACIÓN DEL MODELO FACTORIAL
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE LOS HIDROLIZADOS
DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA Y ESPECTROFOTOMÉTRICA DE
B
N
S
N
S
83
3.5. TRABAJO EXPERIMENTAL PREVIO
3.5.1. EXTRACCIÓN DE LA PAPAÍNA
3.5.1.1. DE LA MATERIA PRIMA
La enzima se obtiene del fruto verde de la papaya, pudiendo también
extraerse del tallo de la planta.
Para ello se ha utilizado la variedad de papaya común procedente de la
selva puneña
La limpieza y desinfección se realiza de la siguiente manera:
Se ha utilizado los frutos verdes y de tamaño normal dispuestos en forma
vertical sobre bandejas de vidrio.
Se quita el polvo con paño humedecido y con cuidado.
Se desinfecta con el sulfito de sodio en solución, (Ver Anexo 2) y que a la
vez actúa como preservante y reductor.
3.5.1.2. DEL PROCESO
Extracción del látex: El proceso de obtención se ha empezado temprano
en la mañana en un ambiente fresco, haciendo incisiones poco profundas
(de 2 mm.) en sentido longitudinal en la piel de la papaya.
El líquido lechoso que gotea se recibe en las bandejas de vidrio: Se
continúa en las incisiones, cada vez más profundas y más
cercanas, durante varios días, mientras que el fruto esté todavía
verde y no se descomponga.
El Látex extraído se le seca en aire caliente (no más de 40°C), el
84
contenido en humedad de (a papaína bruta desecada es del 5 - 8 %.
3.5.1.3. DE LA PURIFICACIÓN
Se ha experimentado su purificación ensayando con dos sales: Sulfato
de amonio, y cloruro de sodio en solución 1 M. (ver Anexo
2)
Esta purificación consiste en disolver y precipitar del látex, la proteínasa
como un sólido puro. Para ello al ayudar la precipitación con las dos sales
mencionadas, se ha observado que hay mayor rendimiento de papaína, al
usar el SO4(NH4)2
Luego se ha procedido a la centrifugación y filtración en papel Wathman
N° 40 y posterior desecación; por último se ha envasado en frascos de
vidrio oscuros. De esta manera se ha asegurado la pureza de la papaína.
3.5.1.4. DIAGRAMA DE FLUJOS
PAPAYA
85
H2O
NaHSO3
PAPAÍNA CRUDA
(NH4)2SO4
PAPAÍNA DE PAPAÍNA DE
MAYOR PUREZA MAYOR PUREZA
3.5.1.5. ESTABILIZACIÓN Y ACTIVACIÓN DE LA PAPAÍNA
Como se ha indicado, la papaína como una sulfhidrilproteínasa es una
enzima que tiene cisteína (ácido L-α -amino y β-mercaptopropiónico) en
LIMPIEZA
EXTRACCIÓN DEL LÁTEX
DESINFECCIÓN
SECADO
SECADO
CENTRIFUGACIÓN FILTRACIÓN
PRECIPITACIÓN
SECADO
CENTRIFUGACIÓN FILTRACIÓN
PRECIPITACIÓNNaCl
DE LA MATERIA PRIMA
DEL PROCESO
DE
LA
PURI
F
ICA
Tiempo=varios días
86
el centro activo, y por lo tanto posee un grupo SH reactivo que tanto en
los péptidos como en las proteínas se deshidrogena en forma reversible
formando puentes disulfuro.
La papaína puede ser inhibida por agentes oxidantes como: yodo acetato,
p-cloromercuribenzoato, y metales pesados. Puede ser activada por
agentes reductores como el ácido cianhídrico, la císteina, glutation, etc.
que forman complejos con los metales pesados.
La forma de representar la activación y desactivación
Papaína – SH + HS – Papaína Papaína – S – S - Papaína
Papaína – S¯ + ¯S – Papaína 2(Papaína S¯ )Me+²
ACTIVA INACTIVA
-2H
+Me+²
+2H
-Me ²ˉ
COOˉ COOˉ COOˉ
H3N — C — H H3N — C — H H3N — C —N
87
Por lo tanto los estabilizadores son los que tienen grupo sulfhidrilo o
azufre como es el caso del sulfato de amonio que se le ha agregado para
precipitarla y al mismo tiempo estabilizarla.
3.5.2. PREPARACIÓN DEL SUSTRATO
3.5.2.1. MADUREZ DE LA CARNE DE ALPACA
Para la investigación se ha usado el lomo de la carne de alpaca y lo que
nos interesa es la calidad comestible de este músculo así como su
comportamiento en el procesado, porque se sabe que cuando muere la
alpaca cesa el transporte de oxígeno a sus músculos, lo que ocasiona que
las proteínas filamentosas (miosina, actína) entrecruzadas se tornen
rígidas. Esta rigidez y sus efectos colaterales son muy importantes en la
tecnología de las carnes. Otro cambio importante es el descenso del pH
(de 7 a 5) por la formación de ácido láctico.
La carne en estado de rigidez no solo resulta muy dura sino también
menos jugosa, dado que para la mayor parte de las proteínas del
músculo, el punto isoeléctrico y por lo tanto la mínima capacidad de
hidratación ocurre a pH cercanos a 5.5.
La dureza de la carne es máxima a las 24 horas de sacrificada. Luego
proviene un ablandamiento o enrojecimiento natural debido a la hidrólisis
de las proteínas catalizadas por enzimas proteolíticas presentes
naturalmente en el músculo como son:
Proteasa pH
Proteasa neutra activada
por el calcio 6,5 a 8
88
Proteasa similares a
tripsina (serina) 6,5 a 8
Catepsinas B 3 a 6
Catepsinas H 5 a 7
Pero la acción de estas enzimas solo llega a ablandar ligeramente a las
carnes más no a la hidrólisis hasta aminoácidos.
3.5.2.2. ELIMINACIÓN DEL COLOR DE LA CARNE
En ensayos preliminares de hidrólisis se observó que el color rojo de la
carne iba a ocasionar problemas en determinaciones colorimétricos, se
estudió la manera de eliminarlo. La mioglobina es una proteína conjugada.
Está compuesta por una proteína globular (globulina) y un grupo
prostético (hem) que es un anillo porfirinico con Fe.
C C
│ ││
C — N N —
Fe — H2O
C = N N —
│ │
FIGURA 3.1. Grupo Hemo en la Hemoglobina
89
Esta proteína tiene mucha afinidad por el 02 y oxidantes y para iniciar el
proceso de hidrólisis de la carne es conveniente el menor grado de
oxidación y crecimiento microbiano, por lo que se procedió de la siguiente
manera :
1. Refrigerado a temperaturas de 0°C, para luego manipular con
tranquilidad.
2. Trozado : el tamaño de partícula, también ha sido optimizado
porque si era muy pequeño no se podía observar superficialmente
la hidrólisis.
3. Lavado : con agua helada y en operaciones repetidas hasta
eliminar totalmente el color rojizo.
3.5.2.3. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA
La temperatura en un proceso de hidrólisis enzimática es una propiedad
muy importante, y que puede considerarse como variable a fijar en un
proceso. Pero en este caso, por las referencias bibliográficas que indican
un rango de 20 - 32°C para que actúe la papaína, quedando desactivada
completamente a 70°C.
Para optimizar el proceso de hidrólisis se requiere establecer un menor
rango de temperatura, para lo cual se han hecho experimentos previos
para definir como variable controlable la temperatura (Ver Anexo 3)
90
FIGURA. 3.2. Efecto de la Temperatura en la hidrólisis (Experimental)
En esta experimentación preliminar se observó claramente que la
temperatura óptima está alrededor de 30 - 35°C.
La temperatura de las carnes tiene gran influencia en la estructura física y en
el valor nutritivo de las proteínas de la carne.
Así al aumentar la temperatura se produce la desnaturalización (coagulación)
ocasionando una destrucción de las uniones de valencia secundaria
responsables de su conformación.
En cuanto al valor nutritivo sucede que:
La digestibilidad disminuye porque los compuestos insolubles formados por el
calor, no pueden ser desdoblados por las enzimas digestivas.
Rango de experimentación
Ensayo Ensayo 2
1 +T Temperatura del Proceso -T°
Lenta 20 30 32 35 40 Mal olor 80
91
A temperaturas elevadas se destruye la cadena peptídica y por lo tanto
los aminoácidos se caramelizan y/o se destruyen.
Por lo tanto para evitar una desnaturalización notoria y para que la
velocidad de hidrólisis enzimática transcurra en un tiempo adecuado se
seleccionó la temperatura del sustrato en 32°C.
3.6. SELECCIÓN DE VARIABLES A INVESTIGAR
De las experimentaciones anteriores, cabe señalar que ahora el problema
queda circunscrito a la hidrólisis de las proteínas de la carne de alpaca
por medio de la papaína.
a. VARIABLES INDEPENDIENTES
1. CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA
La cantidad de enzima versus el sustrato es una variable de entrada
independiente, que determinará el rendimiento de hidrólisis, la velocidad
de la reacción enzimática.
El agua como disolvente de los alimentos es uno de los componentes más
importantes. Porque no solo se trata de una mezcla de agua con
sustancias inertes que no interactúan en modo alguno, y es que las
proteínas absorben parte del agua de la solución fuertemente en su
superficie, llamándose a estos "agua ligada". Entonces la disponibilidad
de agua medida como actividad del agua posee una fuerte influencia
sobre la actividad enzimática, al difundir el sustrato sobre el enzima.
Para seleccionar los niveles de variables, se ha tenido referencia
bibliográfica y se observa que no hay un valor fijo, porque en una reacción
enzimática, todas las variables están interrelacionadas. Se ha tomado las
concentraciones de 2.5 a 5 % con respecto al sustrato y el grado de
92
dilución del agua es de 5 a 1. (Ver Anexo 4)
2. INFLUENCIA DEL PH
La acción catalítica de la papaína, tiene lugar dentro de pH estrechos.
Cada reacción enzimática posee un pH óptimo, sin embargo este pH
depende del sustrato, de su concentración y de las condiciones de
reacción. En el caso de la papaína, como su centro activo tiene -SH, el
grado de ionización de este grupo depende del pH. Y resulta que un pH
muy alto o muy bajo por lo general lleva a una desnaturalización
irreversible de la papaína. Por ello que se experimentara entre pH 5 y 6.
(Ver Anexo 5)
3. TIEMPO DE LA REACCIÓN
Esta variable tiene mucho que ver con la temperatura del sustrato.
Para la mayoría de las reacciones enzimáticas, un cambio lineal en la
temperatura provoca un cambio logarítmico a la velocidad de reacción. Se
trata de encontrar un tiempo óptimo aunque no es tan crítico como el pH,
ya que si se le deja más tiempo, a una concentración definida de enzima,
el grado de conversión permanece constante. Para seleccionar el nivel de
esta variable se ha hecho dos ensayos preliminares tomando como
valores fijos la temperatura, la concentración baja; y tomando dos
tiempos: a 12 horas y a 5 horas y se observó que el grado de hidrólisis era
parecido. Por lo que se escogió el rango de 3 a 6 horas. Pero como se ha
dicho este rango depende de los otros y para ello no hay información
bibliográfica definitiva.
b. VARIABLE DEPENDIENTE
1. GRADO DE HIDRÓLISIS DE LA CARNE DE ALPACA
La acción de la papaína, a un pH, a una temperatura, concentración y a
93
un tiempo definido, trae como consecuencia que la energía de activación
de la reacción hidrolítica de proteínas disminuye enormemente. Por ello
es que se ha seleccionado esta variable respuesta y se trata de evaluar
cuantitativamente esta reacción. La papaína descompone a la proteína en
fragmentos peptídicos más pequeños. Ataca principalmente al sistema
miosina-actina hasta en un 38 %, y también llega a hidrolizar al colágeno
y elastina hasta en un 50 % . Este hecho se manifiesta en un
ablandamiento notorio de la carne, que sino es controlado, puede
convertir en un puré de carne al sustrato, con sustancias secundarias que
pueden afectar el sabor de la carne. La papaína es una enzima
proteolítica tan activa que llega a obtener aminoácidos individuales, ya
que ataca a los enlaces peptídicos, a sus esteres, a sus amidas
poseyendo por tanto un margen de acción más amplio que la tripsina y la
quimiotripsina.
94
3.7. DISEÑO ESTADÍSTICO DE LA EXPERIMENTACIÓN
Para llevar a cabo la experimentación principal de esta investigación, se
ha usado el método estadístico, para lograr información total acerca de la
influencia cuantitativa de las tres variables independientes,
interaccionadas con la variable respuesta. La estadística nos proporciona
las armas necesarias para realizar la experimentación de una manera
lógica y ordenada.
3.7.1. DISEÑO ESTADÍSTICO FACTORIAL
3.7.1.1. INTRODUCCIÓN
El diseño factorial es una Técnica estadística de planificación, que permite
al investigador minimizar el esfuerzo experimental a realizar para obtener
una información dada, y al ingeniero aprovechar la información existente
sobre un proceso para analizar la influencia que ejercen los distintos
parámetros y, de esta forma, poder actuar en consecuencia para su
mejora.
En definitiva, la misión del diseño factorial consiste en determinar la
influencia o "efecto" que ejerce cada variable independiente (factor) sobre
la variable dependiente seleccionada (respuesta).
El análisis de la influencia de las distintas variables sobre los resultados
obtenidos en los distintos experimentos realizados mediante planificación
efectuada, según el método de diseño factorial, permite desarrollar un
modelo matemático reduciendo estadísticamente
95
los resultados a una función de regresión de tipo polinómico,
de la forma:
El método factorial simboliza las variables en "niveles", correspondiendo
cada nivel a un valor numérico de la variable en consideración. Por
ejemplo para nuestra investigación, una de las variables es el pH, y son
dos los niveles de ensayo 6 y 5, estos valores se simbolizan como +1 para
el nivel superior (6) y -1 para el nivel inferior (5). Al valor medio 5,5 le
corresponde e! valor simbólico 0 (Nivel "central").
Para la estimación de los coeficientes b0, b¡, b¡j (i*j), solo son necesarios
dos niveles que codificaremos a partir de ahora "+" (+1), y "-" (-1).
Para más de un factor, cada experimento planificado, según un diseño
factorial, está definido como una combinación de los niveles de los
factores. Para el caso de dos factores, el mínimo número de experimentos
a realizar será cuatro. En general, el diseño factorial completo requiere un
número de experimentos N:
Donde: m = número de niveles
n = número de factores a considerar
n n n
2 Y = b○ + Sr² = ∑ (bixi + ∑ ∑ ( bijxixj + ………………….Ec. 3.1
N = mⁿ Ec. 3.2
96
3.7.1.2. OBTENCIÓN DE LAS TABLAS MATRICIALES PARA
LA PLANIFICACIÓN DE EXPERIMENTOS Y CÁLCULOS DE LOS
EFECTOS
Para el caso más simple de dos variables Xi, X2 a dos niveles. En la
notación que emplearemos pondremos la letra correspondiente
cuando la variable esté a su nivel superior, y no la pondremos cuando
esté a su nivel inferior. Por ejemplo, rX1 es el valor de la
respuesta cuando X1 está a su nivel superior (X1+), y X2 a su nivel
inferior (X2-) si ambas están a su nivel inferior, subindicaremos la
respuesta con 1 (n).
TABLA 3.1.X₂₋ X₂₊
X₁₊ rX₁ rX₁X₂ rX₁ + rX₁X₂X₁₋ r₁ rX₂ r₁ + rX₂
rX₁+r₁ rX₁X₂ + rX₂ TOTAL
Por lo tanto, la tabla de indicadores de nivel para la planificación de
experimentos correspondiente a un diseño factorial 22 será la que muestra
la tabla 3.2.
TABLA 3.2 NIVELES
EXP № x₁ x₂ RESPUESTA1 − − r₁2 ⁺ − rX₁3 − ⁺ rX₂4 ⁺ ⁺ rX₁X₂
De la suma de las filas y columnas (tabla 3.1), se obtendría:
97
Efecto del factor x1, cuando x2+: rx1- rx2 Efecto del
factor x1, cuando x2-: rx1- r1
Sumando ambos efectos, obtendremos el efecto principal del factor X1:
EX₁ = ( rX₁X₂ - rX₂) + ( rX₁ - r₁ )= rX₁X₂ + rX₁ - rX₂ - r₁
De igual forma, obtendremos el efecto
principal del factor x2:
EX2 = rX1X2 – rx1 + rx2 – r1,
Interacción entre X1 X2 :
X₁X₂ = (rX₁X₂ - rX₂) – ( rX₁ - r₁ ) = rX₁X₂-rX₁ - rX₂ + r₁
98
Representando en forma matricial, los efectos principales e interacción,
obtenemos la correspondiente tabla matricial para el cálculo de los efectos
de un diseño 22 (Tabla 3.3).
TABLA 3.3.
rx1x2 rX1 rx2 r1
Ex1 +1 +1 -1 -i
Ex2 +1 -1 +1 -1
EX1X2 + 1 -1 -1 +1
3.7.1.3. DISEÑO FACTORIAL APLICADO A NUESTRA
INVESTIGACIÓN
Las variables experimentales son: Concentración, Tiempo de Reacción, pH.
Con estas variables independientes (factores) podremos analizar la
influencia que presenta éstas sobre la concentración de aminoácidos
(Absorbancia) que viene a ser la respuesta.
Para este caso particular de 3 factores, el mínimo número de experimentos a
realizar será:
99
De la ecuación 3.2
Donde: m = 2 (niveles)
n = 3 (factores)
Por lo tanto: el número de experimentos (N):
N = 2³
N = 8
En el cuadro 3.1. Se indica cada variable experimental, con sus respectivos niveles y el nombre que cada variable adopta.
CUADRO 3.1.
VARIABLE 0 FACTOR EXPERIMENTAL
NIVEL DEL FACTOR NOMINACIÓN
Concentración de Enzima 2.5 - 5 X1
Tiempo de Reacción 3 - 6 x2
pH 5 - 6 x3
FUENTE : Elaboración Propia.
N = mⁿ
100
3.7.1.3.1. OBTENCIÓN DE LA TABLA MATRICIAL Y
CÁLCULO DE LOS EFECTOS
Se procede de la misma forma que para el diseño factorial 22
Para 3 factores tenemos: TABLA 3.4.
X3- X3+
x2- x2+ x2- x2+
x1 -
x1 +
r₁ rx1 rx2 rx1x2 rx3
rx1x3
rx2x3
rX1X2X3
En la Tabla 3.5. Se presenta los indicadores de nivel para el diseño 23:
TABLA 3.5.
EXP N° Niveles RESPUESTA
101
X1 x2 x3
1 - - -
r1
2 + - - rx1
3 - + - rx2
4 + + - rx₁x2
5 - - + rx3
6 + - + rX1X3
7 - + + rx2x3
8 + + + rX₁X₂X₃
Los efectos correspondientes son:
EX₁ = r X₁X₂X₃ - rX₂X₃ + rX₁X₃ - rX₃ + rX₁X₂ - rX₂ + rX₁ - r₁EX₂ = r X₁X₂X₃ + rX₂X₃ - rX₁X₃ + rX₃ + rX₁X₂ + rX₂ - rX₁ - r₁EX₃ = r X₁X₂X₃ + rX₂X₃ + rX₁X₃ + rX₃ + rX₁X₂ - rX₂ - rX₁ - r₁EX₁X₂ = r X₁X₂X₃ - rX₂X₃ - rX₁X₃ + rX₃ + rX₁X₂ - rX₂ - rX₁ + r₁EX₁X₃ = r X₁X₂X₃ - rX₂X₃ + rX₁X₃ - rX₃ - rX₁X₂ + rX₂ - rX₁ + r₁EX₂X₃ = r X₁X₂X₃ + rX₂X₃ - rX₁X₃ - rX₃ - rX₁X₂ - rX₂ + rX₁ + r₁EX₁X₂ X₃ = r X₁X₂X₃ - rX₂X₃ - rX₁X₃ + rX₃ - rX₁X₂ + rX₂ + rX₁ - r₁
Expresando los efectos En forma matricial obtenemos la Tabla 3.6.
102
TABLA 3.6.
rX₁X₂X₃ r X₂X₃ r X₁X₃ r X₃ rX₁X₂ r X₂ rX₁ r₁
E X₁ +1 -1 + 1 -1 +1 -1 +1 -1
E X₂ +1 + 1 -1 -1 +1 +1 -1 -1
E X₃ +1 + 1 + 1 +1 -1 -1 -1 -1
EX₁X₂ +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 + 1
E X₁X₃ +1 -1 + 1 -1 -1 +1 -1 + 1
E X₂X₃ +1 + 1 -1 -1 -1 -1 + 1 + 1
EX₁X₂X₃ +1 -1 +1 + 1 -1 + 1 + 1 -1
Finalmente obtenemos la Tabla 3.7. Tomando como respuesta Y en
lugar de r, para hacer sencilla nuestra Tabla.
103
TABLA 3.7. DISEÑO FACTORIAL 23
EXP N° PRUEBA
X0 X₁ x2 x3 X₁x2 X₁X3 X2X3 X₁X2 X₃ Y
1 + 1 -1 -1 -1 +1 +1 + 1 -1 Y,
2 + 1 + 1 -1 -1 -1 -1 + 1 + 1 Y2
3 + 1 -1 + 1 -1 -1 + 1 -1 + 1 Y3
4 + 1 + 1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 Y4
5 + 1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 + 1 Y3
6 + 1 + 1 -1 + 1 -1 + 1 -1 -1 Y6
7 + 1 -1 + 1 + 1 -1 -1 + 1 -1 Y-
8 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 Y8
3.8. DESARROLLO EXPERIMENTAL
3.8.1. SELECCIÓN DE LA MUESTRA STANDARD
3.8.1.1. ESPECIFICIDAD DE LA PAPAÍNA
En cuanto a aminoácidos, la especificidad de la papaína es muy estrecha,
ocasionando el rompimiento de la cadena peptídica en los siguientes
puntos:
COO⁻
|
1. Arginina H₃N — CH — CH₂ — CH₂ — CH₂ NH
104
En estos 5 aminoácidos el ataque es en el grupo carboxilo COO", liberando
de esta manera a los aminoácidos esenciales y no esenciales. De esta
manera al hidrolizar la carne con papaína no solo se está ablandando la
carne, sino que se esta elevando su valor nutritivo al aumentar
disponibilidad de aminoácidos.
COO⁻
|
1. Arginina H₃N — CH — CH₂ — CH₂ — CH₂ NH
105
3.8.1.2. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN ESTÁNDAR
Parte importante del presente trabajo ha sido el de conseguir estos
aminoácidos para hacer la muestra patrón. Para ello se ha considerado
las concentraciones máximas en las que se encuentran en la carne de
alpaca. Se ha preparado 100 ml. de solución.
Tomando en cuenta el cuadro de composición de aminoácidos en la carne
de alpaca (Tabla 2.3.1.) y considerando que se tomará como muestra de
carne 10 gr. se tiene las siguientes masas: (Ver Anexo 6)
CUADRO 3.2.
PARA 25 % DE PROTEÍNA
AMINOÁCIDO LIBERADO PESO (gr)
Acido Glutámico
Argimina
Lisina
Leucina
Glicina
0.415
0.1725
0.27625
0.285
0.14925
Total 1,298
106
CUADRO 3.3. PARA 21,3 % DE
PROTEÍNA
AMINOÁCIDO LIBERADO PESO (gr)
Acido Glutámico
Argimina
Usina
Leucina
Glicina
0.35358 0.14697
0.235365 0.24282
0.127161
Total 1.105896
CUADRO 3.4. PARA 20 % DE
PROTEÍNA
AMINOÁCIDO LIBERADO PESO (gr)
Acido Glutámico
Argimina
Lisina
Leucina
Glicina
0.332 0.138
0.221
0.228
0.1194
Total 1.0384
107
CUADRO 3.5.
PARA 19 % DE PROTEÍNA
AMINOÁCIDO LIBERADO PESO (gr)
Acido Glutámico
Argimina
Lisina
Leucina
Glicina
0.3154 0.1311
0.209950.216
6
0.11343
Total 0.98648
3.8.1.3. DETERMINACIÓN COLORIMÉTR[ CA DE AMINOÁCIDOS
Se ha seleccionado el método de coloración con la ninhidrina. La ninhidrina
es el tricehidridenhidrato que con la mayoría de los aminoácidos da color
violeta en caliente y a pH 5 - 6.
El aminoácido se deshidrogena, se descarboxila y se desamina, con lo que
se forma el C02, el NH3, el aldehido y Ninhidrina reducida. Luego se
condensan el NH3, y la Ninhidrina reducida dando el color violeta.
La determinación cuantitativa es en base a una muestra patrón de
concentración conocida, evaluando la intensidad del color.
108
3.8.2. EXPERIMENTACIÓN DE LA HIDRÓLISIS ENZIMATICA DE
LA CARNE DE ALPACA
109
3.8.2.1. DIAGRAMA DE FLUJO GENERAL HIDRÓLISIS DE LA CARNE DE ALPACA
MUESTRA
ABSORBANCIA (LECTURA)
HIDRÓLISIS
FILTRACIÓN
DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA
ENFRIAMIENTO
REFRIGERACIÓN
DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA
ENFRIAMIENTO 80º C
Carne no hidrolizada
HCL
PAPAÍNA CARNE
Ninhidrina
pH
TºC = 32
PRODUCTO AZUL
0º C
20º C
PRODUCTO AZUL
110
99
3.8.2.2. PREPARACIÓN DE LAS OCHO MUESTRAS
Estas muestras han sido diseñadas en base a lo indicado en 3.7 (Tabla
3.7.)
- Se pesa 10 gr. de carne de alpaca previamente decolorada.
- Se agrega la papaína diluida en agua destilada.
- Según sea el caso de pH 5 ó 6 se agrega gotitas de solución de HCI
0,1 N hasta llegar al pH adecuado y controlando con papel indicador.
- Los depósitos previa agitación y bien tapados se someten a
calentamiento en una cocina con termostato controlado a 32°C.
- Después del tiempo transcurrido, se somete a filtración y se refrigera
hasta la medición respectiva. (Ver Anexo 7)
3.8.3. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD
DE LA PAPAÍNA
Puede hacerse de varias maneras:
1. Determinando la cantidad de proteína precipitable con ácidos
tricloroacético, antes y después de la acción del enzima,
disminuyendo a medida que se hidroliza.
2. Usando el método Kjeldahl al inicio y siguiendo una secuencia de
mediciones. Igualmente irá disminuyendo.
3. Reacciones colorimétricas con biuret o con ninhidrina. *
4. Por titulación directa de los grupos COOH liberados por la hidrólisis
de los enlaces peptídicos, siempre que se elimine previamente el
efecto electrostático de los grupos NH2 liberados simultáneamente.
* Método elegido, debido al uso del espectrofotómetro.
111
:::
3.8.3.1. DETERMINACIÓN ESPECTROFO TOMÉTRICA DE
AMINOÁCIDOS
Se ha utilizado un
espectrofotómetro UV-Visible marca "PERKIN ELMER". (Ver
figura 2.6.)
Para una longitud de onda, previa elección mide absorbancia. (Ver
Anexo 8)
Para medidas de concentración se procede de la siguiente manera :
1. Utilizando el factor de calibración: consiste en hacer una medición de
Absorbancia a una concentración conocida y de allí se determina el
factor :
Donde: F: Factor de calibración
A: Absorbancia
%: Concentración
3.8.3.2. DEMOSTRACIÓN DE LA LEY DE BEER Y
DETERMINACIÓN DEL FACTOR ABSORBANCIA
1. Se selecciona una longitud de onda a la cual la absorbancia del
compuesto coloreado esté dentro de la escala. El valor es de 680nm.
%
F = Ec. 3.3.
112
2. Se calibra el aparato con agua destilada que se coloca en la cubeta de cuarzo.
3. Se añade a la solución patrón, preparada en la sección 3.8.1.2. (2 ml.) de
solución de ninhidrina al 1%.
4. Se procede a calentar por 3 min. en baño María y luego se enfría a 20°C.
5. Se coloca la solución en la cubeta del espectrofotómetro y se procede a la
medición de la absorbancia. (Ver Anexo 8)
El valor de Absorbancia para cada muestra patrón se muestra en el cuadro 3.6.
CUADRO 3.6.
PATRONES DE AMINOÁCIDOS
MUESTRA
PATRÓN
CONCENTRACIÓN
(PORCENTAJE)
ABSORBANCIA (A) VOLUMEN SOLUCIÓN
1 0,649 0,116 5 ml.
2 0,5229 0,100 5 ml.
3 0,5192 0,094 5 ml.
4 0,4932 0,088 5 ml.
113
0,649 0,134 FIG 3.3. CURVA DE CALIBRACIÓN QUE MUESTRA LA VALIDEZ DE LA LEY DE BEER PARA EL0,552 0,115 COMPLEJO AZUL QUE SE USA PARA LA DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS
0,519 0,1080,493 0,101
Xi Yi
f(x) = 0.21 x − 0R² = 0.996568586642448
Series2Linear (Series2)
CONCENTRACIÓN Xi
ABSO
RBAN
CIA
Yi
114
Evaluación de la Incertidumbre
Cálculos para el análisis de Mínimos cuadrados
Yi
Xi
YiXi X²
Xi-pro Xi
Yi - proY
(Xi-proX)(Yi - proY)
(Xi-proX)2 Di Di2
0,134
0,649
0,086966
0,421201
0,09575
0,0195
0,00186713
0,00916806
-0,00043023
0,000000185
0,115
0,552
0,06348
0,304704
-0,00125
0,0005
-6,25E-07
1,5625E-06
0,00044216
0,000000196
0,108
0,519
0,056052
0,269361
-0,03425
-0,0065
0,00022263
0,00117306
0,00020287
0,000000041
0,101
0,493
0,049793
0,243049
-0,06025
-0,0135
0,00081338
0,00363006
-0,00147051
0,000002162
0,458
2,213
0,256291
1,238315
0,0029025
0,01397275
-0,00125571
0,000002584
115
X1 = Concentración (%)
Y1 = Absorbancia
Realizando cálculos se tiene que la pendiente y la ordenada al origen de la mejor recta son:
∑Y 0,458 ∑X 2,213 m 0,2077 pendient ∑XY 0,256291 b -0,000424 constante∑X2 1,238315 Sy 0,0011367 varianza
n 4 Sy20,00000129
2desviacion estándar de y
prom X 0,55325 Sm20,00009247
1
prom Y 0,1145 Sb20,00002862
7d 0,055891 Sm 0,0096162A 0,622 Sb 0,00535044
Por lo tanto la mejor línea recta que pasa por los puntos de la fig. es:
Y=mX+bMejor Ec. De la recta Y=0,2077X-0,000424
Realizando operaciones y combinando resultados para m, σm, b, σb se
puede escribir
m = 0,20772 ± 0,009616205
= 0,208 ± 0,009
b = -0,000424 ± 0,00535043
= -0,0004 ± 0,005
116
Luego para la primera prueba del valor de la Absorbancia A= 0,622
Entonces despejando X en la Ec. de la recta, tenemos que
Luego para la primera prueba del valor de la Absorbancia A= 0,622
Entonces despejando X en la Ec. de la recta, tenemos que Remplazando
datos tenemos como resultado
F = 4.8167 (± 4,33)
Y b
X =
F = 4,86 ± 0, 208
117
3.8.3.3. DETERMINACIÓN DE LAS
MUESTRAS PROBLEMA
Para la lectura en el espectrofotómetro se ha procedido de la misma
manera que la anterior; es decir se toma 2ml. de la solución hidrolizada
con la enzima y se le agrega la solución de ninhidrina, se calienta en baño
maría y se enfría. Los resultados son los siguientes:
CUADRO 3.7. DETERMINACIÓN DE LAS MUESTRAS
PROBLEMA
N°
PRUEBA
CONCENTRA CION
DE ENZIMA
TIEMPO pH ABSOR
BANCIA
CONCENT
RACIÓN
INCERTIDUMBRE
N° X1 x2 x3 A %GR.
1 2.5 3 5 0.622 3,0229 ±0,1308
2 5,0 3 5 0,734 3,5672 ±0,1544
3 2,5 6 5 0,887 4,3108 ±0,1866
4 5,0 6 5 1,060 5,1516 ±0,2230
5 2,5 3 6 0,265 1,2879 ±0,0557
6 5,0 3 6 0,295 1,4337 ±0,0620
7 2,5 6 6 0,418 2,0314 ±0,0879
8 5,0 6 6 0,448 2,1772 ±0,0942
FUENTE : Elaboración Propia
118
CAPITULO IV
TRATAMIENTO E INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS
4.1. GENERALIDADES
En este capítulo realizaremos la interpretación y el tratamiento
estadístico de resultados, estimaremos el modelo matemático,
haremos su análisis de varianza, la evaluación del modelo
matemático y gráficos del diseño.
4.2. ESTADÍSTICAS DE RESULTADOS
Los experimentos factoriales permiten conocer la importancia
relativa de las interacciones de tres variables con respecto a Y.
119
110
Los resultados obtenidos y anotados en 3.8.3.3 serán evaluados
estadísticamente en un Programa Estadístico (statistics). Para ello
se ponen las pruebas en forma factorial:
TABLA 4.1.
C* t* P* A*N° PRUEBA CONCENTRACIÓN
ENZIMA
TIEMPO PH ABSORBANCIA
1 2,5 3 5 0,622
2 5,0 3 5 0,734
3 2,5 6 5 0,887
4 5,0 6 5 1,060
5 2,5 3 6 0,265
6 5,0 3 6 0,295
7 2,5 6 6 0,418
8 5,0 6 6 0,448
9 3,75 4,5 5,5 0,950
10 3,75 4,5 5,5 0,900
11 3,75 4,5 5,5 1,000
FUENTE : Elaboración Propia ^
*Abreviatura de cada variable
120
1114.2.1. TRANSFORMACIÓN DE VARIABLES
A continuación se ejemplifica el procedimiento de transformación. El
procedimiento es el mismo para cada variable.Para C :
Cálculo de promedio Pm = (2,5 + 5,0)/2 = 3,75
Cálculo de diferencia D = (5,0 - 2,5)/2 = 1,25
Cálculo de Variable Xt = (C - 3,75)/1,25 .. Ec4.1.Luego si
C = 2,5 —> X! = -1 C = 5,0 —> X! = +1 C = 3,75 —> Xi
= 0Para t :
Cálculo de promedio Pm = (3 + 6)/2 = 4,5
Cálculo de diferencia D = (6 - 3)/2 = 1,5
Cálculo de Variable X2 = (t - 4,5)/1,5 ... Ec 4.2.
Luego si :
t = 3 —> X2 = -1
t = 6 —> X2 = +1
t = 4,5 —> X2 = 0
Para P:
Cálculo de promedio Pm = (5 + 6)/2 = 5,5
Cálculo de diferencia D = (6 - 5)/2 = 0,5
Cálculo de Variable X3 = (P - 5,5)70,5 ... Ec 4.3.
121
112Luego si:
P = 5 —> X3 = -1
P = 6 —> X3 = +1
P = 5,5 —> X3 = 0
4.2.2. FORMULACIÓN DE TABLA FACTORIAL PARA ANÁLISIS
DE DATOS
Este cuadro será introducido en la computadora (Ver
sección 3.7.1.)CUADRO 4.2.
MUESTRA EFECTO PRINCIPAL EFECTO INTERACTIVOXo X1 x2 x3 X1X2 X1 X3 X2 X3 X1 X2 X3 Y
1 + 1 -1 -1 -1 + 1 +1 +1 -1 0.622
2 + 1 + 1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 0,734
3 + 1 -1 +1 -1 -1 +1 -1 + 1 0,887
4 + 1 + 1 + 1 -1 + 1 -1 -1 -1 1,060
5 + 1 -1 -1 +1 + 1 -1 -1 +1 0,265
6 + 1 + 1 -1 +1 -1 +1 -1 -1 0,295
7 + 1 -1 + 1 +1 -1 -1 +1 -1 0,418
8 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 +1+1
+ 1 0,448
9 0 0 0 0 0 0 0 0 0,950
10 0 0 0 0 0 0 0 0 0,900
11 0 0 0 0 0 0 0 0 1,000
FUENTE: Elaboración Propia.
122
:::-
4.2.3. DETERMINACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE
REGRESIÓN
MODELO MATEMÁTICO
El diseño factorial, permite desarrollar un modelo matemático
reduciendo estadísticamente los resultados a una función de regresión
de tipo polinómico, de la forma :
n n ny = b0 + 2∑ b¡x¡ +....... ∑ ∑b¡j x¡ Xj
i=i i=i j=Í
Ver (3.7.1.) Ec. 3.1.
Por el método matricial, se determina los coeficientes del modelo
matemático. Como se muestra en la Ec. 4.4.
b = (xTx)ֿ 1xTy ........................ Ec. 4.4.
Donde : b = vector de los coeficientes del modulo matemático
x = Matriz de diseño
xT = Traspuesta de la matriz de diseño
Y = Los datos observados (respuestas)
Los coeficientes de regresión se calculan a partir de la ecuación:
bj = 2 ∑xj¡y¡ / ∑ x2j¡ Ec. (4.5.)
Estos se pueden observar en el cuadro que se presenta a
continuación y que son realizados por el programa de computadora.
En el Anexo 9 se puede observar como fueron calculados.
123
Coeficientes Error típico Estadístico t Probabilidad Inferior 95% Superior 95%(Constant) ,592 0,03385016 -10,5612 0,008847 -0,50404548 -0,21275452
X1 ,043 0,01767767 2,4042 0,138066 -0,03271087 0,11941087X2 ,112 0,01767767 6,3640 0,023813 0,03613913 0,18826087X3 -,235 0,01767767 -13,1522 0,005731 -0,31066087 -0,15853913
X1X2 ,008 0,01767767 0,4243 0,712652 -0,06841087 0,08371087X1X3 -,028 0,01767767 -1,5556 0,260060 -0,10411087 0,04801087X2X3 -,036 0,01767767 -2,1213 0,167950 -0,11176087 0,04036087
X1X2X3 -,008 0,01767767 -0,4243 0,712652 -0,08371087 0,06841087
Estadísticas de la regresiónCoeficiente de correlación múltiple
0,99708445
Coeficiente de determinación R^2
0,99417741
R^2 ajustado0,9708870
5Error típico 0,05Observaciones 11
ANÁLISIS DE VARIANZAGrados de
libertadSuma de
cuadradosPromedio de los
cuadrados FValor
crítico de FRegresión 8 0,85372425 0,106715531
42,6862124 0,02308774
Residuos 2 0,005 0,0025Total 10 0,85872425
124
:: =
Así, el modelo matemático para el diseño en escala codificada es el
siguiente :
Y = 0,592+0,043X1+0,112x2-0,235x3 +
0,008x1x2- 0,0028x1x3 -0,36 x1X2- 0,008x1X2x3
4.2.4. VALIDACIÓN DE RESULTADOS (ANÁLISIS DE LA
VARIANZA)
4.2.4.1. ANÁLISIS DE SIGNIFICANCIA DE LOS COEFICIENTES
Para determinar la significancia de cada uno de los coeficientes de la
ecuación de regresión se emplea la prueba t de student definido por :
tj = /bj// Sbj ... Ec. 4.6.
La desviación estándar es :
Sbj = Se/√N ... Ec. 4.7.
Donde : Se2 = varianza estimada N = número de
pruebas
La varianza estimada es :
Se2 = E(y¡0 .Yo)/(C-1) ... Ec. 4.8.
Donde: Y0 = promedio aritmético de los puntos centrales
C = número de repeticiones en el punto central
Finalmente se verifica que : tj>tp
125
:: -f
Donde : tp = estadístico de student obtenido de Tablas para (C-1) grados
de libertad y una probabilidad dada (usualmente del 95 %). En este caso
el coeficiente bj correspondiente tiene significancia estadística.
Aplicando las fórmulas anteriores:
- CÁLCULO DE LA VARIANZA ESTIMADA
Cálculo de promedio : Y0 = (0,95 + 0,90 + 1,00)/3 = 0,95 Cálculo de
desviaciones cuadráticas : SDC = (0,95 - 0,95)2 + (0,90 - 0,95)2 +
(1,00 - 0,95)2 SDC = 0,005
Cálculo de varianza :
Se2 = SDC/ (3-1) = 0,0025
Cálculo de desviaciones estándar : Se = 0,05
Este valor se puede observar en los cuadros A y B realizados por el
computador.
En el Anexo 9 se encuentra como fue calculado: la varianza y los
estadísticos tj
Para la determinación de la significancia se encuentra la t de student de
Tablas para (C-1) = 2 grados de libertad. 95 % de confianza
Donde : tp = 4,303
Finalmente, los valores tj que sean menores a tp no tienen significación y
por lo tanto no participan en la ecuación de regresión. Ver Anexo 9 y
Cuadros A y B.
126
::~
Por lo tanto el Modelo Matemático es:
Y = 0,59 + 0,11X2 + 0,24X3
4.2.5. BONDAD DE AJUSTE DE LA ECUACIÓN DE REGRESIÓN
Este paso verifica que efectivamente la ecuación obtenida represena los
datos que le dieron origen. Para este propósito se utiliza la prueba F de
Fisher.
- Varianza Residual (Sr2). Mide la desviación de los valores calculados
de los experimentales.
Sr2 = ∑(y¡ -Ay¡)2/(N-K) Ec. 4.9
Donde : K = Número de coeficientes significativos
Ay¡ = Valores calculados de y¡
Luego : F = Sr2/Se2 Ec. 4.10
Finalmente se verifica la condición : F < Fp
Donde : Fp = estadístico de Fisher, se encuentra en Tablas, con un nivel
de probabilidad de 95 %, con fi = (N-K) y f2 = (C-1) grados de libertad.
Esto indica que efectivamente existe bondad de ajuste de la ecuación de
regresión generada.
NOTA : Si no hay bondad de ajuste con el modelo lineal es muy probable
que exista efecto curvatura significativa.
127
Aplicando las ecuaciones anteriores se tiene:
Cálculo de las desviaciones cuadráticas entre el valor experimental y el
valor calculado con la ecuación de regresión.SDC
absorbancia valor calculado de la Ec. de regresiondiferencia elevado
0,62 0,70 -0,08 0,006052840,73 0,70 0,03 0,001183360,89 0,92 -0,03 0,001062761,06 0,92 0,14 0,019824640,27 0,24 0,03 0,000635040,30 0,24 0,06 0,003113640,42 0,46 -0,04 0,001747240,45 0,46 -0,01 0,00012544
0,03374496
SDC = 0,03374496
Cálculo de varianza residual Sr2 = SDC/(N-K) =
0.0337 = 0,00624 =0,00674
8-3
Cálculo del estadístico de Fisher
F = Sr2 /Se2 = 0.00674
0,0025 F = 2,699
La determinación de F de Tablas para probabilidad de 95 % con
fi = 5 y f2 = 2 grados de libertad es : Fp (5,2) = 19,30
Por lo tanto existe bondad de ajuste en: 2,699 < 19,30
4.2.6. EVALUACIÓN DEL EFECTO DE CURVATURA
Se determina la diferencia entre el promedio de los puntos centrales Y0 y
el promedio de los puntos factoriales Y¡
128
La significancia estadística de este efecto se determina con la prueba t de
student. El intervalo de confidencia se calcula así :
EC + tSe √1 ∕ N +1 ∕ C Ec. 4.11.
Si el cero se encuentra en este intevalo, significa que el efecto curvatura
no es significativo.
Aplicando lo anterior : Promedio de los experimentos factoriales
4.74 = 0,5925
8
Promedio de los puntos centrales = 0,95
Efecto Curvatura = 0,95 - 0,59 = 0,36
Intervalo de Confidencia =
= 0,36 ± (4,303) (0,05) V1/8 + 1/3 = 0,36±
═0,36 ± 0,14
4.2.7. EXPRESIÓN DEL MODELO MATEMÁTICO EN ESCALA
NATURAL
El modelo matemático se procede a descodificar según las ecuaciones
siguientes :
Para el término independiente
k ka0 = b 0 -∑b¡є¡ +.... ∑ biuє¡єu Ec. 4.12.i=i i,u =1
Donde a0 = Término independiente del modelo matemático en escala
natural.
129
:::Para los términos lineales
a¡ = Coeficiente de los términos lineales del modelo en escala natural
€¡ = Coeficiente de dividir el centro del diseño (Zj0) y el radio del diseño
(Zj)Para los términos de interacción
Aplicando las ecuaciones para el modelo obtenemos la ecuación en
términos de las variables originales.
Esta ecuación de regresión generada representa a los datos
experimentales que le dieron origen y describe el sistema en reacción bajo
estudio.
bi biu€i€u
aizi = ¯ j = u =…. K-1 Ec. 4.13
∆zi ∆zi
bii
Aiizizi = Ec. 4.14
Y = 2,70 + 0,0748t - 0,4692 P
130
131
4.3. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
4.3.1. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE
LA PAPAÍNA
De la experimentación se observa que tiene interacción directa con el
tiempo de hidrolizado, y cualquier exceso no ocasionaría problema
alguno, ya que es inocua. Pero con estas cantidades preliminares de
concentración se puede continuar las investigaciones para determinar la
I.U. (unidad enzimática), es decir, cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1 micromol de sustrato en 1 minuto, en condiciones
óptimas.
Por lo que para las metas propuestas para el presente trabajo se prefiere
la de mayor concentración (5 %).
4.3.2. INFLUENCIA DEL pH
Esta es una variable importantísima que se ha logrado fijar ya que
sabemos por el carácter anfótero de las proteínas, solo hay un pH en el
cual la actividad de la papaína es máxima y es de pH = 5.
Habiéndose distinguido además otro pH: el pH = 6 de estabilidad, por lo
que se ha podido manipular la enzima en condiciones adecuadas.
Lo demuestran los resultados de hidrólisis, donde los rendimientos son
mejores a pH = 5, disminuyendo notoriamente a pH = 6.
132
4.4. ANÁLISIS DEL DISEÑO FACTORIAL
1. La matriz de variable independiente se obtiene agregando un
vector columna 1 que consiste en signos(+), el cual es usado
para estimar la media, los otros vectores columna se
generan a partir de la matriz diseño.
2. Una vez hecho los coeficientes de regresión con un nivel de
significancia de 95% se hace efectos e interacciones.
El rango de las variables ha sido convenientemente elegido, y por
ello las conclusiones pueden extenderse a variaciones del proceso.
133
CAPITULO V
5.1.- COSTOS DE LA INVESTIGACIÓN
5.1.1.- GENERALIDADES:
Este capítulo trata sobre los costos generales que demanda la
investigación (como material y equipo, reactivos, servicios, etc).
5.1.2.- RECURSOS MATERIALESRUBRO CANTIDAD UNIDAD COSTO
UNITARIOSUB TOTAL SI.
MATERIAL DE VIDRIO
Termómetro 1 Unidad 100,20 100,20Vaso precipitado (100 mi)
2 Unidad 16,70 33,40
Matraces 8 Unidad 30,93 247,43
Pipetas 1 Unidad 16,70 16,70
Tubos de Ensayo 8 Unidad 2,01 16,03
Embudos 2 Unidad 15,03 30,06
Bandejas de vidrio 1 Unidad 80,39 80,39
TOTAL 524,21
134
RUBRO CANTIDAD UNIDAD COSTO
UNITARIO
SUB TOTAL SI.
OTROS MATERIALESDE LABORATORIO
Papel filtro 1 Pliegos 2,00 2,00
Bandeja Porcelana 3 Unidad 7,01 21,04
Papel Indicador de 1 Unidad 51,10 51,10
0,5 - 14
TOTAL 74,14
RUBRO CANTIDAD UNIDAD COSTO
UNITARIO
SUB TOTAL SI.
REACTIVOS E INSUMOS
Acido clorhídrico al 33 % 10 mi. 0,835 8,350
Cloruro de Sodio 90% 1 Kg. 4,340 4,340
Sulfato de Amonio 0,10 Kg. 167.000 16,700
Ninhidrina 10 mi. 94,500 94,500
Sulfito de Sodio 0,5 Kg. 4,940 2,470
Acido glutámico 1 gr- 43,700 43,700
Arginina 1 gr. 50,300 50,300
Lisina 1 gr- 50,100 50,100
Leucina 1 gr. 40,800 40,800
Glicina 1 gr. 57,100 57,100
Papaína 10 % 20 gr. 8,031 160,620
Agua Destilada 5 gr. 1,000 5,000
Papaya 10,3 Kg. 1,300 13,390
Carne 1 Kg. 12,000 12,000
TOTAL 559,66
135
5.1.3.- COSTOS DE LOS RECURSOS MATERIALES
RUBRO SUB TOTAL S/.
Análisis Espectrofotométrico
Material de Vidrio
Otros Materiales de Laboratorio
Reactivos e InsumosCostos Indirectos
150,00 (*) 524,21
74,14 559,31651,60
TOTAL 1959,32
(*) Costo no Incluido en la Investigación (Gratuito)
5.1.4.- FINANCIAMIENTO
Los recursos económicos necesarios para llevar a cabo esta investigación son
aporte propio.
5.2.- CRONOGRAMA DE LA INVESTIGACIÓN
RUBRO CANTIDAD UNIDAD COSTO
UNITARIO
SUB TOTAL SI.
COSTOS INDIRECTOS
Información Total 200,00 200,00
Material Escritorio Total 20,00 20,00
Copias y Adquisicig Total 180,16 180,16
nes de libros
Fotografías Total 26,50 26,50
Gastos Generales Total 225,00 225,00
TOTAL 651,66
136
5.2.1.- Actividades a desarrollar:
a) Recolección de la información
b) Evaluación de la información
c) Clasificación de información y obtención de conclusiones
d) Asesoría profesional
e) Formulación de objetivos y planteamiento de hipótesis
f) Planteamiento de las pruebas
g) Disponibilidad de materias primas y equipo de laboratorio
h) Inicio de pruebas de laboratorio
i) Evaluación de las pruebas de laboratorio
j) Elaboración de conclusiones y sugerencias en base de las pruebas
5.2.2.- Actividades a desarrollar:
Act i v idades
Mayo Jun io Ju l io Agos to
Sept iembre
Octubre
Nov iembre
A x x xB x x xC x xD x x xE xF xG x xH xI xJ x
137
BIBLIOGRAFIA
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BARRADO MARCOS, A. Ciencia de la carne. Editorial Acriba Zaragoza, 1977.
BRAVERMAN JBS. Bioquímica de los Alimentos.
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PEARSON D. Técnicas de laboratorio. Editorial Acribia, 1976
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SALVÁ RUIZ, Bettit Karim “CARACTERIZACIÓN DE LA CARNE Y CHARQUI DE ALPACA (Vicugna pacos)”
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138
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ORTIZ NAVARRETE, Alberto Tesis : Estudio sobre la actividad Proteolítica y secado del látex de la papaya (Carica papaya L.) Universidad de Costa Rica.
CHAVERRI ÁLVAREZ, Alejandra Tesis: Comparación de la Actividad Proteolítica de la Papaína Secada por Diferentes Métodos. Universidad de Costa Rica.
RICARDO BENÍTEZ, ALBERT IBARZ , JORDI PAGAN Hidrolizados de proteína, procesos y aplicaciones
SABINO, CARLOS Cómo hacer una tesis Ed. Panapo. Caracas 1994
ECO, UMBERTO Cómo se hace una tesis Ed. Gedisa
BRANDAN, LLANOS, BARRIOS, ESCALANTE, RUÍZ. ENZIMAS Facultad de Medicina UNNE
BUTTAZZONI MARTA S. Y CAFFINI NESTOR O. Panorama actual de las Enzimas Proteolíticas Vegetales. Cátedra de Botánica Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata
GUÍA PARA LA COMPRA DE ENZIMAS Enzyme Development Corporation
139
ANEXOS