determinación de la actividad biologica de flavonoides e

INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA

MODALIDAD DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE FLAVONOIDES Y SU IDENTIFICACIÓN POR

ELECTROFORESIS CAPILAR EN PLANTAS MEDICINALES

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

INGENIERO FARMACÉUTICO

PRESENTA:

LÓPEZ GARFIAS MARCO ANTONIO

México, D.F. Noviembre 2010

ASESOR INTERNO: QFB María Esther Bautista Ramírez

EVALUADOR: MC Yolanda de las Mercedes Gómez y Gómez

Determinación de la actividad biológica de flavonoides y su identificación por electroforesis capilar en plantas medicinales

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Agradecimientos:

Primero quiero dar gracias a Dios por estar conmigo en todo momento y darme la capacidad de haber concluido

mis estudios.

A mi familia, ya que sin ellos no habría logrado este objetivo. A mi mamá Cleotilde por su gran esfuerzo, cariño

y apoyo en situaciones difíciles, a mi papá Mario, porque siempre ha encontrado una respuesta a todas mis

preguntas y a mis hermanos Adrián y Juan Daniel por su alegría y compañía que siempre me alienta a seguir

adelante.

También agradecer a las personas que me ayudaron a la conclusión de mis estudios, profesores, amigos y

compañeros así como a la profesora Esther y mi amigo Moisés que en especial me apoyaron en la realización de

este proyecto.


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*López Garfias Marco Antonio, María Esther Bautista Ramírez. Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología, Departamento de Bioprocesos, IPN. Tel 57296000 ext 56390, [email protected]

Palabras clave: Flavonoides, actividad antioxidante, actividad antimicrobiana, electroforesis capilar, Caléndula Officinalis, Casimiroa edulis, Ocimum basilicum, Bixa orellana. Introducción: Los flavonoides son metabolitos secundarios de las plantas que han demostrado tener una gran cantidad de propiedades biológicas, entre ellas, antioxidantes, antibacterianas y antivirales además son los responsables de muchas de las actividades terapéuticas que tienen las plantas medicinales1, por lo que es necesaria su evaluación, cuantificación e identificación en especies vegetales utilizadas en la medicina tradicional mexicana. Por otro lado, la electroforesis capilar micelar es una técnica de separación, identificación y cuantificación de compuestos biológicos que ofrece una gran cantidad de ventajas ya que su mínimo uso de muestra y solventes orgánicos así como su amplia variedad de modos de separación para diferentes analitos la hacen ideal para la identificación de flavonoides. Objetivo: Evaluar la actividad antioxidante y antimicrobiana de flavonoides de extractos de Caléndula Officinalis (caléndula), Casimiroa edulis (zapote), Ocimum basilicum (albahaca) y Bixa orellana (achiote) e identificarlos por medio de electroforesis capilar micelar Metodología: La extracción de flavonoides se realizó con 1 g de diferentes partes de Caléndula Officinalis (caléndula), Casimiroa edulis (zapote), Ocimum basilicum (albahaca) y Bixa orellana (achiote) en acetona al 70% y sonicando 20 min, se determinó la concentración de fenoles totales por el método de Folin-Ciocalteu determinando la absorbancia a 760 nm usando acido cafeico como estándar2. Los flavonoides se cuantificaron utilizando AlCl3 para oxidarlos y formar un compuesto colorido detectado a 510 nm usando rutina como referencia3. La actividad antimicrobiana se determinó realizando un bioensayo in vitro con cefalosporina C y nistatina como estándares. La actividad antioxidante se determinó utilizando el radical 2,2-azinobis-3-benzotiazolin-6-ácido sulfónico (ABTS+)4. Las condiciones de separación por electroforesis capilar utilizadas fueron buffer de boratos 40 mM pH 9.0 adicionando SDS 40 mM, utilizando un capilar de 60 cm, 15 KV, inyectando 5 seg 5 psi, y detectando a 214 nm. Resultados y discusión. En general podemos resumir la actividad biológica presentada por cada una de las muestras en la tabla 1. Podemos decir que Caléndula officinalis fue la especie vegetal analizada con mayor concentración de fenoles y su flor presentó la mayor concentración de flavonoides. Así mismo, las hojas de todas las plantas presentaron en general mayor capacidad antioxidante. Por otro lado la semilla de Bixa orellana y la flor de Ocimum basilicum presentaron la mayor actividad antimicrobiana sobre Salmonella typhi y Candida Albicans. Sin embargo la hoja y flor de Calendula oficinalis así como la semilla de achiote tuvieron

actividad sobre Bacillus subtilis. Además la flor y hoja de

Calendula oficinalis inhibieron el crecimiento del microorganismo Staphylococcus aureus. Se utilizó el electroferograma de estándares (fig.1) para poderlos comparar con el de las muestras lográndose identificar los flavonoides rutina y quercetina en Caléndula officinalis, rutina, catequina, naringenina y luteolina en la hoja de Casimiroa edulis y epigallocatequina y luteolina en Bixa orellana.

Tabla 1. Resumen de la actividad biológica de las muestras

(-) No presentó actividad antimicrobiana VCEAC* Capacidad antioxidante equivalente a la de vitamina C

Figura 1 Electroferograma de estándares

Conclusiones y recomendaciones Se determinó la concentración de fenoles y flavonoides presentes en los extractos cetónicos de diversas plantas medicinales. Se evaluó la capacidad antioxidante de las plantas medicinales por el método ABTS+. Se determinó el efecto antimicrobiano de varias partes de plantas medicinales sobre Salmonella typhi, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida Albicans Se identificaron los flavonoides rutina y quercetina en Caléndula officinalis, rutina, catequina, naringenina y luteolina en la hoja de Casimiroa edulis y epigallocatequina y Luteolina en Bixa orellana por medio de electroforesis capilar micelar. Referencias 1 Álvarez Castro E., Orallo Cambeiro F. 2003. “Actividad biológica de los flavonoides, Acción frente al cáncer”. OFFARM. Revista de la Oficina de Farmacia, Vol. 22 No.10. pp.131-133 2 Dimitris P., Nikolaosk G.B., “Recovery of antioxidant phenolics from white vinification solid by products employing wáter/etanol mixtures”. Bioresource technology 78, 584-587. 3 Bengro L., Yongy Z.2007.”Extraction of flavonoids from flavonoid-roch parts in tartarí buckwheat and identification of the main flavonoids” J of food eng 78, 584-587. 4. Choy Y., Jeong HS., Lee J.(2007).Antioxidant activity of methanolic extracts from some grains consumed in Korea. Food Chemistry (103):130-138

ACTIVIDAD BIOLÓGICA

Actividad antimicrobiana Actividad

antioxidante

Microorganismo

VCEAC*

C.albicans S.typhi S.aureus E.coli B.subtilis

Unidades Muestra

U/ml eq de Nistatina g/ml eq de Cefalosporina C

Achiote (cáscara) 245,87 134,01 - - - 298,56

Achiote (semilla) 347,71 107,93 - - 463,87 482,82

Caléndula (hoja) 173,85 86,94 86,94 - 70,02 282,11

Albahaca (flor) 292,38 70,02 - - - 305,59

Albahaca (hoja) 122,93 118,20 - - - 386,50

Albahaca (tallo) 146,19 206,56 - - - 217,65

Zapote (hoja) 122,93 70,02 - - - 628,74

Caléndula (flor) - - 70,02 - 138,30 472,89


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ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1

II. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................. 9

III. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 10

IV. METODOLOGÍA. ............................................................................................................. 11

V. DESARROLLO EXPERIMENTAL .............................................................................. 13

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 16

VIII. RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS ........................................................... 26

IX. REFERENCIAS ................................................................................................................ 27

X. ANEXOS ............................................................................................................................. 29


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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clases de surfactantes y algunas propiedades .................................................................. 13 Tabla 2. Actividad antimicrobiana del extracto de la flor de Cálendula sobre Staphylococcus

aureus ....................................................................................................................................... 20 Tabla 3 Resumen de la actividad biológica de las muestras ............................................................ 21 Tabla 4 Curvas tipo para cefalosporina C y nistatina de inhibición sobre los microorganismos de

prueba: ...................................................................................................................................... 32


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ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Tipos de flavonoides. ..................................................................................................................... 1 Figura 2 Sistema general del equipo de electroforesis capilar. ................................................................ 4 Figura 3 Representación de una separación empleando micelas ........................................................... 6 Figura 4. Frutos de Bixa orellana ................................................................................................................. 7 Figura 5 Calendula oficinalis .......................................................................................................................... 7 Figura 6 Hojas de Casimiroa edulis .............................................................................................................. 8 Figura 7 Ocimum basilicum ............................................................................................................................ 8 Figura 8 Reacción de Folin-Ciocalteu para la cuantificación de fenoles ............................................... 11 Figura 9 Reacción de los flavonoides con AlCl3 para su cuantificación ................................................ 11 Figura 10 Formación del radical ABTS

+ usando persulfato de potasio y su degradación con el

antioxidante ........................................................................................................................................... 12 Figura 11 .Principio de electroforesis capilar micelar. .............................................................................. 13 Figura 12. Curva tipo para cuantificación de fenoles. .............................................................................. 16 Figura 13 Curva tipo para cuantificación de flavonoides. ........................................................................ 16 Figura 14 .Resultados obtenidos de la cuantificación de fenoles totales utilizando ácido cafeico

como referencia. ................................................................................................................................... 17 Figura 15. Resultados obtenidos de la cuantificación de flavonoides totales utilizando rutina como

referencia ............................................................................................................................................... 17 Figura 16.Capacidad antioxidante de las muestras utilizando vitamina C como referencia. ............... 18 Figura 17. Actividad antimicrobiana de las muestras sobre Salmonella thypi ....................................... 19 Figura 18 Actividad antimicrobiana de las muestras sobre Bacillus subtilis ........................................... 19 Figura 19 Actividad antimicrobiana de las muestras sobre Candida albicans ..................................... 20 Figura 20. Electroferograma de la mezcla de los estándares de flavonoides ..................................... 22 Figura 21 a) Electroferograma de la flor de Calendula oficinalis, b) Electroferograma de la mezcla

de los estándares de flavonoides ...................................................................................................... 22 Figura 22 a) Electroferograma de la hoja de Calendula oficinalis b) Electroferograma de la mezcla

de los estándares de flavonoides ...................................................................................................... 23 Figura 23 a) Electroferograma de Casimiroa edulis, b) Electroferograma de la mezcla de los

estándares de flavonoides .................................................................................................................. 23 Figura 24 a) Electroferograma de la semilla de Bixa orellana b) Electroferograma de la mezcla de

los estándares de flavonoides ............................................................................................................ 24 Figura 25 a) Electroferograma de la cáscara de Bixa orellana b) Electroferograma de la mezcla de

los estándares de flavonoides. ........................................................................................................... 24


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ÍNDICE DE ANEXOS

1. Secuencia detallada para la cuantificación de fenoles totales………………….29

2. Secuencia detallada para la cuantificación de flavonoides……………………....30

3 . Secuencia detallada para el cálculo de la capacidad antioxidante de las muestras………………………………………………………………………………….31 4. Secuencia detallada para el cálculo de la actividad antimicrobiana de las muestras………………………………………………………………………………….32

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i. INTRODUCCIÓN

1. Flavonoides: importancia y clasificación

Los flavonoides son compuestos fenólicos, metabolitos secundarios producidos por las plantas. Se encuentran en vegetales, semillas, frutas y en bebidas como vino y cerveza. Se han identificado más de 5,000 flavonoides diferentes, están presentes en los vegetales y protegen al organismo del daño producido por agentes oxidantes, como los rayos ultravioletas, la contaminación ambiental, sustancias químicas presentes en los alimentos, entre otros. El organismo humano no puede producir estas sustancias químicas protectoras, por lo que deben obtenerse mediante la alimentación o en forma de suplementos.1

Contienen en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo fenólicos, son compuestos de bajo peso molecular que comparten un esqueleto común de difenilpiranos (C6-C3-C6). Las distintas clases de flavonoides se diferencian en los sustituyentes del anillo C (Figura 1), mientras que los compuestos individuales, dentro de cada uno de estos grupos, se distinguen por la diferente sustitución de los anillos A y B.2

Estructura básica

O

O

1

2

3

45

6

7

81'

2'

3'

4'

5'

6'A C

B

Isoflavonas O

O

Flavanoles

OH

O

Flavonas

O

O

Flavonoles

OH

O

O

Antocianidinas

OH

O+

Cl-

Flavanonas

O

O

Flavanonoles

OH

O

O

Figura 1. Tipos de flavonoides. Los flavonoides se diferencian en los sustituyentes del anillo C, mientras que los compuestos individuales, dentro de cada uno de estos grupos, se distinguen por la diferente sustitución de los anillos A y B2.

Se han descrito para los flavonoides propiedades antioxidantes, antinflamatorias, antiagregantes, antihemorrágicas, vasodilatadoras, antineoplásicas, antivirales, antibacterianas, antialérgicas y hepatoprotectoras. A partir de esto, los flavonoides han


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ido ganando interés como potenciales agentes terapéuticos frente a una amplia variedad de enfermedades. Además, los efectos curativos de muchos remedios de la medicina natural tradicional pueden ser atribuidos a la presencia de estas moléculas. Los flavonoides constituyen una de las subfamilias de polifenoles naturales a los que se les ha dedicado más atención en los últimos años, en el ámbito de la investigación. Sus múltiples propiedades biológicas observadas experimentalmente y su abundancia en la dieta, junto con su presencia en numerosos remedios de la medicina tradicional mexicana, los convierten en posibles candidatos a explicar la relación encontrada entre el consumo de determinados productos de origen vegetal y la disminución del riesgo de presentar determinadas enfermedades2, aunque hasta ahora no hay una evidencia clara de esta actividad biológica, además de que no existen técnicas experimentales para su extracción, cuantificación e identificación que estén completamente garantizados. 2. Los flavonoides como agentes antimicrobianos.

2.1. Historia

La actividad antimicrobiana de los flavonoides cada vez llama más la atención de diversos grupos de investigación, previamente algunos de estos, han realizado estudios in vitro utilizando extractos de plantas medicinales. Por ejemplo, extractos de Hypericum, Capsella y Chromolaena han resultado tener actividad antibacteriana. Otro claro ejemplo es el própoleo, el cual ha sido analizado varias veces y ha mostrado tener una elevada concentración de flavonoides y frecuentemente manifestado una fuerte actividad antimicrobiana.3 2.2 Mecanismo de acción antimicrobiano de los flavonoides

a) Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos.

En uno de sus estudios Mori y col. mostraron que la síntesis de ADN de Proteus vulgaris y la síntesis de ARN en S.aureus fueron inhibidas por los flavonoides robinetina, miricetina y epigallocatequina. Los autores sugieren que el anillo B de los flavonoides puede jugar un papel en importante intercalándose con las bases de los ácidos nucleicos lo que inhibiría la síntesis de ADN y ARN.3 Ohemeng y col. analizaron 14 flavonoides que variaban en su estructura en E. coli y encontraron que 7 de estos compuestos inhibían la enzima ADN girasa. Entre estos compuestos se encontraban: quercetina, apigenina y 3,6,7,3’,4’-pentahidroxiflavona, los cuales contienen una hidroxilación en el anillo B. Los autores proponen que la actividad antibacteriana es debida a la inhibición de la enzima ADN girasa, enzima que actúa durante la replicación del ADN bacteriano para reducir la tensión molecular causada por el superenrollamiento.3

b) Inhibición de la función de la membrana citoplasmática.

Un equipo de investigación que previamente encontró una fuerte actividad antibacteriana de sophoraflavona G contra Staphylococcus aureus resistente a


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meticilina (MRSA) estudió el efecto de la sophoraflavona G sobre la fluidez de la membrana usando liposomas como modelos de membranas y comparándola con una flavona menos activa, naringenina. A concentraciones que corresponden a la concentración mínima inhibitoria (CIM) la sophoraflavona G mostró incremento en la polarización de los liposomas significativamente. Este incremento indica una alteración de la fluidez membranal en la región hidrofílica e hidrofóbica. La naringenina también exhibió un efecto en la membrana pero a altas concentraciones. Esta correlación entre la actividad antibacteriana y la alteración de la membrana apoya la teoría que la actividad antibacteriana de la sophoraflavona G se debe a la alteración de la fluidez de la membrana de la células bacterianas.3

3. Actividad antioxidante de los flavonoides.

3.1. Historia

El flavonoide quercetina es el que mejor reúne los requisitos para ejercer una efectiva función antioxidante. Su capacidad antioxidante medida como Trolox es de 4,7 mM, lo que resulta mayor al demostrado por las vitaminas E y C además de que tiene una hidrosolubilidad similar a la de la vitamina E. Los flavonoides retiran oxígeno reactivo especialmente en forma de aniones superóxidos, radicales hidroxilos, peróxidos lipídicos o hidroperóxidos. De esta manera bloquean la acción deletérea de dichas sustancias sobre las células. 1 3.2 Criterios químicos para establecer la capacidad antioxidante de los flavonoides

Presencia de estructura O-dihidroxi en el anillo B; que confiere una mayor

estabilidad a la forma radical y participa en la deslocalización de los electrones.

Doble ligadura, en conjunción con la función 4-oxo del anillo C.

Grupos 3- y 5-OH con función 4-oxo en los anillos A y C necesarios para ejercer el

máximo potencial antioxidante.1

4. Identificación de flavonoides: electroforesis capilar micelar

En cuanto a su identificación existen varias técnicas que se han ido ajustando a través de los años, aunque no existen aún, protocolos completamente desarrollados para este tipo de compuestos, es por ello que se pretende identificarlos por medio de electroforesis capilar, una técnica que se basa en la migración diferencial (en sentido y velocidad) de partículas cargadas (analitos) en un campo eléctrico establecido al efecto, es decir, en un gradiente de potencial (Landers, 1997) que ha mostrado buenos resultados en la separación de productos biológicos. La electroforesis capilar consiste en introducir en un capilar una mezcla de especies (cargadas o neutras), que se separan en función de su movilidad electroforética bajo la influencia de un campo eléctrico y consta básicamente de las siguientes partes básicas


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(figura 2): Dos electrodos (ánodo y cátodo), fuente de poder, deposito (viales) donde se colocan los electrodos y el electrolito soporte respectivamente, capilar (compartimento donde se lleva a cabo la separación), un sistema de enfriamiento del capilar (típicamente en la forma de convección de aire forzado o de liquido), un sistema que introduce la muestra y un detector14.

Figura 2 Sistema general del equipo de electroforesis capilar.14

4.1. Ventajas de la electroforesis capilar. Esta técnica de separación ofrece muchas ventajas en comparación con otros métodos, por ejemplo:

Cuando se aplica el campo eléctrico al capilar, el flujo electro-osmótico mueve a

la fase móvil a través del capilar con una velocidad uniforme y esto minimiza la

dispersión de las bandas. Como consecuencia, se producen buenas separaciones. Esto

es importante cuando se analizan compuestos con estructura similar.

Los tiempos de análisis son cortos y se pueden analizar una gran cantidad de

muestras en poco tiempo.


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El tamaño de las muestras usadas es del orden de pocos microlitros, lo que hace

mas fácil de procesar muestras cuyas concentraciones sean muy bajas o se cuente con

una cantidad de muestra limitada.

La cantidad de fase móvil a utilizar también es del orden de microlitros por lo que

se ahorran solventes y reactivos.

El uso de disolventes orgánicos es limitado y las concentraciones usadas no son

grandes, esto también representa un ahorro además de tener un ambiente mas seguro.

En separaciones difíciles en otros métodos como en HPLC se tiene que hacer

uso de gradientes de solventes mientras que en estas técnicas la composición de la

fase móvil es constante.

4.2 Electroforesis capilar micelar

También llamada cromatografía capilar electrocinética micelar (CCEM) es un híbrido de

la electroforesis y la cromatografía que permite la separación por la adición de

surfactantes o tensoactivos al electrolito soporte, en concentraciones tales que se

forman micelas, las cuales ayudan a la separación de especies neutras y especies

cargadas. Las micelas se forman usualmente en disoluciones acuosas cuando la

concentración de una especie iónica que tiene una cola de hidrocarburo de cadena

larga, es mayor a su concentración micelar critica (CMC). En la electroforesis capilar

micelar se añaden al buffer cantidades de surfactante o tensoactivo que exceden la

CMC a fin de obtener las respectivas micelas. La superficie de las micelas aniónicas

tiene una carga negativa, lo que les confiere una movilidad electroforética hacia el

electrodo positivo, sin embargo, dado que la mayor parte de las disoluciones

reguladoras utilizadas presentan un flujo electro-osmótico (FEO) alto hacia el electrodo

negativo, esto provoca que las micelas aniónicas sean arrastradas hacia dicho

electrodo. De este modo, durante el proceso, la mezcla reguladora esta formada por

una fase acuosa que se mueve rápidamente y una fase micelar que lo hace con más

lentitud. Cuando se introduce una muestra en el sistema los componentes se

distribuyen entre la fase acuosa y el interior hidrófobo de las micelas (figura 3).La

distribución de los analitos y los equilibrios que resultan dependen de la polaridad de los

analitos. Con los analitos polares se favorece la permanencia en la disolución acuosa

mientras que los compuestos no polares prefieren el medio constituido por las cadenas

de hidrocarburo de las micelas14.


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Figura 3 Representación de una separación empleando micelas14

5. Plantas medicinales de estudio

En México existen especies vegetales muy importantes que son utilizadas en la medicina tradicional, las cuales tienen una enorme cantidad de propiedades terapéuticas, es decir, son utilizadas para un gran numero y variedad de enfermedades pero también se desconoce si podrían ser usadas para otra afección, así como la gran variedad de compuestos que intervienen en las propiedades farmacológicas que estas presentan. a) Bixa orellana (achiote) es un arbusto o árbol de 2 a 5 m de altura con la corteza

café y lisa. Sus hojas son delgadas y están sostenidas por largos soportes, sin pelos

por arriba y verde pálidas por abajo, es originario de México, Centro y Suramérica, se le

emplea para tratar la lepra, el salpullido, para evitar cicatrices y curar torceduras y

heridas. En algunos de estos casos, se hace una infusión ya sea con la hoja para

aplicar baños, o con la semilla administrada vía oral como té, también es utilizada en

algunas enfermedades digestivas como dolor estomacal, empacho, diarrea, indigestión

y como antidisentérica. En las hojas de B.orellana se han identificado los

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sesquiterpenos bixagaeno e ishawarano y en la semilla se encuentran los carotenos

bixina, bixinato de sodio, metil bixina, norbixina, beta-caroteno; laxantina, criptoxantina;

leaxantina, luteína; los diterpenos farnesil-acetona, geranil-geranilo, geranil-

geranilformato, geranil-geraniloctadecanoato y geranil-geraniol; y el triterpeno delta-

tocotrienol. 4

Figura 4. Frutos de Bixa orellana

a) Calendula oficinalis (caléndula) es una planta anual o perenne (dura más de un

año) de 50 a 70cm de alto, cuyo uso medicinal que con mayor frecuencia se da a esta

planta es para las anginas, nombre popular que se da a la amigdalitis, otros

padecimientos para los que se menciona su uso son: paperas, tos, y tos ferina. El

órgano que más se ha estudiado en esta planta es la flor, contiene un aceite esencial

en el que se han identificado los monoterpenos carvona y geranil-acetona, y los

sesquiterpenos dihidro-actinidiólido, epóxido de trans-carió-fileno, alfa y beta-ionona y el

epóxido de este último componente, loliólido, oplopanona y penduculatina. Otros

componentes de la flor son los triterpenos alfa y beta-amirín y sus ésteres, arnidenediol

y arnidiol.4

Figura 5 Calendula oficinalis

b) Casimiroa edulis (zapote), es un árbol de 2 a l0m de altura que se emplea en el

tratamiento de la hipertensión arterial, se aconseja administrar el cocimiento de las

hojas, vía oral, para tratar la diabetes; por vía local, para dar baños en la quemazón o

baños de mujer después del parto, otros padecimientos en los que se usa el zapote

blanco son: reumas, dolores de riñón, afecciones del corazón, nervios, dolor de cabeza

y de muelas, fiebre, mareos. Incluso se le emplea como diurético. En la semilla se han

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identificado principalmente alcaloides, edulina, histamina, los derivados metil y

dimetilados, palmitamida y zapotidina; alcaloides quinolínicos, casimiroidina, casimiroina

y edulitina, y el alcaloide isoquinolínico N-benzoil-tiramina; cumarinas, 9- hidroxi-4-

metoxi-furano-benzopiranona, felopterín, el 5 y el 8 geraniol-oxi-psoralén, además del

derivado metoxilado; flavonoides, zapotin y zapotinin; triterpenos, obacunona y

zapoterin, y los esteroles, daucosterol y beta-sitosterol.4

Figura 6 Hojas de Casimiroa edulis

c) Ocimum basilicum (albahaca). El más amplio uso medicinal que se hace de esta

planta es para el dolor de estómago, se utiliza en procesos inflamatorios como

inflamación vaginal, de matriz, de anginas, inflamaciones intestinales y estomacales.

También en enfermedades respiratorias como bronconeumonía, catarro, irritación

pulmonar y de garganta, pulmonía, sofocación de pecho y tos. La albahaca se emplea

además en infecciones bucales y de la piel, afecciones de la vejiga, de los riñones y del

cuero cabelludo, para granos, clavillos de la piel y caída del cabello contra áscaris y

picadura de alacrán, várices y corazón. Las partes aéreas de la planta contienen un

aceite esencial constituido principalmente de mono y sesquiterpenos, derivados de

fenilpropano y ácidos orgánicos sencillos. Alrededor de 27 monoterpenos, han sido

identificados en el aceite, entre los que destaca el linalol por encontrarse en altas

concentraciones, el 1,8 cineol, además del citral, citronelol, geraniol, alfa-terpineol,

acetato de borneol, alfa-pineno timol. Los sesquiterpenos alfa-bisabolol, alfa-

bergamoteno, gama-cadineno, beta-cariofileno, alfa-cedreno, humuleno y su alfa-

isómero, nerolidol y alfa y beta-santaleno también están presentes.4

Figura 7 Ocimum basilicum

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http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=tos

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=granos

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=ca�da%20del%20cabello

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=picadura%20de%20alacr�n

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ii. JUSTIFICACIÓN

Los flavonoides han demostrado tener una gran cantidad de propiedades biológicas, entre ellas, antioxidantes, antinflamatorias, antiagregantes, antihemorrágicas, vasodilatadoras, antineoplásicas, antivirales, antibacterianas, antialérgicas y hepatoprotectoras, además son los responsables de muchas de las actividades terapéuticas que tienen las plantas medicinales, por lo que es necesaria su evaluación, cuantificación e identificación en especies vegetales utilizadas en la medicina tradicional mexicana. También en recientes años, se ha ido incrementando el uso de productos de consumo humano de origen natural, de los cuales se desconoce gran parte de los compuestos que contienen, así como las concentraciones y actividad biológica de estos componentes. Por otro lado, la electroforesis capilar micelar es una técnica de separación, identificación y cuantificación de compuestos biológicos que ofrece una gran cantidad de ventajas en comparación con otros métodos convencionales.


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iii. OBJETIVOS

General

Evaluar la actividad biológica de flavonoides de extractos de Caléndula Officinalis,

Casimiroa edulis, Ocimum basilicum y Bixa orellana e identificarlos por medio de

electroforesis capilar micelar.

Específicos

Realizar la extracción y cuantificación de flavonoides de extractos de Caléndula

officinalis, Casimiroa edulis, Ocimum basilicum y Bixa orellana.

Medir la capacidad antimicrobiana de los flavonoides de Caléndula officinalis,

Casimiroa edulis, Ocimum basilicum y Bixa orellana.

Cuantificar el potencial antioxidante de flavonoides obtenidos de Caléndula officinalis,

Casimiroa edulis, Ocimum basilicum y Bixa orellana.

Identificar los flavonoides extraídos de Caléndula officinalis, Casimiroa edulis, Ocimum

basilicum y Bixa orellana mediante el uso de electroforesis capilar micelar.


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iv. METODOLOGÍA.

1. Extracción de flavonoides mediante sonicación.

La sonicación consiste en la aplicación de ultrasonidos a las células de las plantas. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Esta ruptura permitirá que los metabolitos secundarios que nos interesan (flavonoides) sean liberados y se solubilicen en acetona al 70%.5

2. Cuantificación de fenoles.

Esta técnica consiste en el uso del reactivo Folin-Ciocalteu que reacciona con los fenoles presentes en el extracto cetónico formando una sustancia colorida que puede ser detectada espectrofotométricamente a 765 nm. El color se debe a la transferencia de electrones a pH básico para reducir la mezcla de complejos ácidos de fosfomolibdeno y fosfotungsteno a cromógenos en los cuales los metales tienen una menor valencia. La formación de estos cromógenos será proporcional al número de grupos hidroxilo fenólicos presentes en la muestra.6

+

OH O

+

Reactivo Folin-

Ciocalteu (W+6,Mo+6

Color amarillo)

Reactivo Folin-

Ciocalteu (W+5,Mo+5

Color azul)

Figura 8 Reacción de Folin-Ciocalteu para la cuantificación de fenoles

3. Cuantificación de flavonoides.

La técnica consiste en la formación de un compuesto colorido debido a la oxidación de los flavonoides en la muestra en presencia de AlCl3 ,lográndose determinar la absorbancia del compuesto a 510 nm, siendo ésta, proporcional a la concentración de los metabolitos secundarios de interés.7

O

O

OH

OH

+

Flavonoide

AlCl3

AlO

O

O

O

Cl

Complejo Color Amarillo Figura 9 Reacción de los flavonoides con AlCl3 para su cuantificación

4. Método de medición para capacidad antioxidante ABTS+.


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El ensayo ABTS+ se basa, primero en la generación progresiva de un catión radical estable, ABTS+, cuya aparición se detecta por un incremento en la absorbancia del sistema a 756 nm, longitud de onda a la que dicho catión radical presenta uno de sus máximos de absorbancia. Segundo, en la degradación o secuestramiento de dicho catión radical por interacción con la sustancia antioxidante, que se añade una vez transcurrido un tiempo estándar al sistema de producción de ABTS+, dicha degradación o secuestramiento se detecta por la desaparición de la absorbancia a 756 nm.8

SO3

-

O3

-S

N

S

CH3

NN

N

S

CH3

ABTS

1e-

1e-

Persulfato de Potasio

Antioxidante

SO3

-

O3

-S

N

S

CH3

N-

N

N

S

CH3

ABTS+

Figura 10 Formación del radical ABTS+ usando persulfato de potasio y su degradación con el antioxidante

5. Determinación de actividad antimicrobiana.

En este método, conocido como método de Kirby-Bauer, se incuba el microorganismo en una placa petri con medio de cultivo solidificado sobre la que se añaden discos de papel impregnados con una cantidad conocida de extracto el cual se pretende evaluar como antimicrobiano. Después de la incubación se observan en la placa la presencia de zonas claras alrededor de los discos llamadas halos de inhibición debida a la difusión del extracto y su respectiva actividad sobre el microorganismo. La ausencia de un halo significa que el microorganismo es resistente al antimicrobiano. Por el contrario y por regla general, cuanto mayor es el halo más efectivo es el antibiótico. 6. Identificación de los flavonoides por medio de electroforesis capilar micelar.

La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que se ha desarrollado gracias a los avances de la cromatografía líquida de alta eficacia junto con los procedimientos más tradicionales de electroforesis. Esta técnica permite separar bastante bien biomoléculas, donde la cromatografía líquida se muestra menos eficaz, y compuestos de pequeña masa molecular, difíciles de estudiar por los procedimientos clásicos de electromigración en soporte. La electroforesis capilar constituye una adaptación particular de la técnica de electroforesis. Esta técnica separativa se basa en la migración de las especies de la muestra en disolución, portadoras de una carga eléctrica global, bajo el efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte (medio de desplazamiento) adecuado. En electroforesis capilar la tira se reemplaza por un tubo capilar abierto en sus extremos, fabricado con un diámetro pequeño (15 a 150μm). El capilar oscila entre 20 y 80cm, y está lleno de una solución buffer. Un detector se encuentra ubicado en un extremo del capilar, cerca del compartimiento catódico. La señal obtenida es la base de la obtención del electroferograma, que


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muestra el registro de la composición de la muestra. Solo las especies que se dirigen hacia el cátodo serán detectadas.9 En el presente trabajo se utilizó una variante de la electroforesis capilar, la electroforesis capilar micelar, en esta variante del procedimiento anterior se añade a la fase móvil un compuesto catiónico o aniónico (surfactante) para formar micelas cargadas. Estas pequeñísimas gotitas inmiscibles con la disolución retienen a los compuestos neutros de un modo más o menos eficaz, por afinidad hidrófila-hidrófoba. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas que tienen tendencia a migrar sin separación.

Figura 11 .Principio de electroforesis capilar micelar. Las micelas formadas por la adición de un compuesto catiónico o aniónico mejoran la separación de las moléculas.10

Existen 4 clases de surfactantes aniónicos, catiónicos, dipolares y no iónicos. En la tabla 1 observamos algunos surfactantes, en el que se muestra el SDS (dodecil sulfato de sodio) utilizado en el presente trabajo, así como algunas propiedades como la concentración micelar critica (CMC) y el numero de agregados.10. Tabla 1. Clases de surfactantes y algunas propiedades

Surfactante Tipo CMC No. de agregados

SDS Aniónico 8.1x10-3 62

CTAB Catiónico 9.2x10-4 170

Brij-35 No iónico 1.0x10-4 40

Sufobetaína Dipolar 3.3x10-3 55

CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio), Brij-35 (Polioxietileno-23-lauril-eter),

Sufobetaína (N-dodecil-N,N-dimetilamonio-3-propano-1-ácido sulfónico).

v. DESARROLLO EXPERIMENTAL


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1. REACTIVOS Y EQUIPOS UTILIZADOS

Equipos.

Espectrofotómetro GBC UV/Vis.

Equipo de Electroforesis Capilar Beckman Coulter P/ACE MDQ

Campana de flujo laminar

Autoclave

Disolventes. Agua destilada, acetona, alcohol etílico y alcohol metílico.

Reactivos. Reactivo Folin-Ciocalteu, reactivo de cloruro de aluminio (AlCl3), radical 2,2-azinobis-3-

etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico (ABTS+), persulfato de potasio (K2S2O8), carbonato

de sodio (NaCO3), nitrito de sodio (NaNO2), dodecil sulfato de sodio (SDS) y ácido

bórico (H3BO3), Medio de cultivo para antibióticos No.1, Medio de cultivo para

antibióticos No.2 y Medio de cultivo para antibióticos No.19 para Nistatina.

Estándares. Ácido Caféico, Rutina, Vitamina C, Cefalosporina C, Nistatina, Quercetina, Catequina,

Naringenina, Miricetina, Luteolina, Epigallocatequina y Apigenina

2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

2.1 Preparación de Muestras. Las especies utilizadas para la obtención de muestras fueron: hoja y flor de Caléndula officinalis (caléndula), hoja de Casimiroa edulis (zapote), hoja, flor y tallo de Ocimum basilicum (albahaca) y la cáscara del fruto y semilla de Bixa orellana (achiote) las cuales se colocaron a secar durante 3 días a temperatura ambiente. 2.2 Extracción de flavonoides. Se colocó 1 gramo de la muestra en 50 ml de acetona al 70% y se sonicó durante 30 minutos, posteriormente se destiló para extraer el solvente. 2.3 Cuantificación de fenoles. Se disolvió el extracto (1:100) en metanol agua (8:2), se

tomaron 200 l de la muestra y se añadieron 50 l de Folin-Ciocalteu y 1 ml de carbonato de sodio al 7.5%. Se mezclaron y agitaron durante 30 minutos. Finalmente se determinó la absorbancia a 765 nm, los resultados se compararon a partir de la realización de una curva tipo utilizando ácido cafeico como referencia.

2.4 Cuantificación de flavonoides. Se tomaron 100 l del extracto y se diluyeron en 10

ml de H20 destilada, después se tomaron 2 ml de la dilución y se mezclaron con 30 l

de NaNO2 (5%), se dejó reaccionar por 5 minutos. Posteriormente se agregaron 20 l

de AlCl3 y nuevamente se esperó 5 minutos. Finalmente se añadieron 200 l de


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Na2CO3 1M y 250 l de agua destilada. Se leyó la absorbancia a 510 nm y se comparó la con una curva tipo usando rutina como referencia. 2.5 Determinación de la capacidad antioxidante por el método ABTS+. Se preparó una solución de ABTS+ 7 mM con agua destilada y se mezcló 1:1 con una solución de persulfato potásico 2.45 mM y se dejó reposar de 14 a 16 hrs en la oscuridad. Posteriormente se diluyó con alcohol hasta una absorbancia de 0.7 (±0.01) a una

longitud de onda de 756 nm. Se tomaron 980 l del radical ABTS+ y 20 l de la muestra y se determinó su absorbancia. Se realizó una curva tipo con Vitamina C y finalmente los resultados se expresan como: mg equivalentes de Vitamina C /100 g de hojas de la muestra (VCEAC). 2.6 Determinación de actividad antimicrobiana. Se realizó un bioensayo in vitro, utilizando el método de difusión en agar, con discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro y 0.6 mm de espesor. Se utilizaron los extractos cetónicos, impregnando los

discos con 100 l. Se incubó a 37 ºC por 24 horas y se midió el halo de inhibición. Los microorganismos utilizados fueron: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella typhi, Escherichia coli y Candida albicans, previamente se realizó una curva tipo con cefalosporina C para las bacterias y nistatina (antimicótico) para Candida albicans, para así comparar el diámetro de inhibición mostrado por los extractos. Los resultados se expresaron como mg/ml equivalente de antimicrobiano. 2.7 Identificación de los flavonoides por medio de electroforesis capilar micelar. Se realizó la determinación utilizando un equipo de electroforesis capilar Beckman P/ACE MDQ, con un detector de arreglo de diodos. Se utilizó un capilar de sílica fundida de 60 cm de longitud y un diámetro interior de 75 µm. Se inyectaron las muestras a 0.5 psi por 5 s, el voltaje de separación a usar fue de 15 KV y la detección a 214 nm. El buffer de corrida utilizado fue de boratos 40 mM con SDS 40 mM y un pH de 9.


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vi. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Cuantificación de fenoles y flavonoides Se realizó la curva tipo para cuantificar los fenoles totales utilizando ácido cafeico como referencia (Figura 7) obteniéndose un coeficiente de correlación de 0.9984.

.

Figura 12. Curva tipo para cuantificación de fenoles.

En el caso de la curva tipo para cuantificar flavonoides (Figura 8) se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.9832.

Figura 13 Curva tipo para cuantificación de flavonoides.

Los resultados obtenidos a partir de la curva tipo de la cuantificación de fenoles y flavonoides de las plantas estudiadas se pueden observar en la figura 13 y 14, el

y = 0,0225x - 0,005R² = 0,9984

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Absorbancia765 nm

Concentración ácido caféico (g/ml)

y = 0,0042x - 0,0038R² = 0,9832

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 20 40 60 80 100

Absorbancia 510 nm

Concentración rutina (g/ml)


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estándar utilizado en la cuantificación de fenoles fue ácido cafeico y en la cuantificación de flavonoides fue rutina. Cabe resaltar que los extractos con mayor concentración de fenoles fueron la hoja y flor de caléndula, mientras que esta ultima también mostró la mayor concentración de flavonoides.

Figura 14 .Resultados obtenidos de la cuantificación de fenoles totales utilizando ácido cafeico como referencia.

Figura 15. Resultados obtenidos de la cuantificación de flavonoides totales utilizando rutina como referencia

0

10

20

30

40

50

60

Concentración mg eq ácido cafeico/ g

de muestra

Cuantificacion de fenoles

0

20

40

60

80

100

120

Concentración mg rutina/g de

muestra

Cuantificación de flavonoides


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2. Actividad antioxidante utilizando el método del radical ABTS+ En cuanto a la determinación de la capacidad antioxidante, en la elaboración de la curva tipo, el reactivo utilizado como referencia fue la vitamina C. Para las muestras se realizó una dilución de 1:100 en H2O destilada, y a partir de estas se cuantificó la capacidad antioxidante expresada como VCEAC (Capacidad antioxidante equivalente a la de Vitamina C), los resultados pueden observarse en la figura 15. En general, la capacidad antioxidante de las muestras obtenidas de las hojas y de la semilla de achiote es mayor que para las otras partes de las plantas.

Figura 16.Capacidad antioxidante de las muestras utilizando vitamina C como referencia.

3. Actividad antimicrobiana

En cuanto a la actividad antimicrobiana observamos que, solo hubo actividad antimicrobiana de los diferentes extractos sobre Bacillus subtilis, Salmonella typhi y Candida albicans, en la figura 16 observamos que la semilla de achiote y la flor de albahaca presentan la mayor actividad sobre Salmonella typhi, mientras que esta misma semilla y la hoja y flor de caléndula inhibieron el crecimiento de Bacillus subtilis (figura 17). Por otro lado los extractos de la semilla de achiote y flor de albahaca también tuvieron la mayor capacidad antimicrobiana sobre Candida albicans (figura 16).

0

100

200

300

400

500

600

700

VCEAC

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf020071c


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Figura 17. Actividad antimicrobiana de las muestras sobre Salmonella thypi

Figura 18 Actividad antimicrobiana de las muestras sobre Bacillus subtilis

0

50

100

150

200

250

Concentración

eq [g/ml] de Cefalosporina C

Actividad antimicrobiana sobre Salmonella typhi

0

100

200

300

400

500

Concentración

eq [g/ml] de Cefalosporina C

Actividad antimicrobiana sobre Bacillus subtilis


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Figura 19 Actividad antimicrobiana de las muestras sobre Candida albicans

Cabe mencionar que solo la flor y hoja de Caléndula inhibieron el crecimiento del microorganismo Staphylococcus aureus cuyos resultados los podemos observar en la tabla 2. Mientras tanto ningún microorganismo inhibió el crecimiento de Escherichia coli, bacteria que mostro resistencia a la concentración de extracto utilizado. Tabla 2. Actividad antimicrobiana del extracto de la flor de Cálendula sobre Staphylococcus aureus

Diámetro de inhibición (mm)

Concentración eq [g/ml] de Cefalosporina C

Caléndula (hoja) 7 86,94

Caléndula (flor) 6 70,02

0

50

100

150

200

250

300

350

Concentración eq U /ml de

Nistatina

Actividad antimicrobiana sobre Candida albicans


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En general podemos resumir la actividad biológica presentada por cada una de las muestras en la tabla Tabla 3 Resumen de la actividad biológica de las muestras

(-) No presentó actividad antimicrobiana * VCEAC Capacidad antioxidante equivalente a la de vitamina C

4. Identificación de los flavonoides por medio de electroforesis capilar micelar

El electroferograma que se utilizó para identificar los flavonoides de las muestras consta de una mezcla de estándares donde podemos observar los diferentes picos y el tiempo de aparición para cada uno de estos estándares (figura 19). El orden de aparición de los picos, fue de Rutina en el minuto 7.8 + 0.2, Catequina en el minuto 8.7 + 0.2, Quercetina en el minuto 9.5 + 0.3, Naringenina en el minuto 10.2 + 0.2, Miricetina en el minuto 10.9 + 0.2, Luteolina en el minuto 11.2 + 0.2, Epigallocatequina en el minuto 11.6 + 0.2, Kaempferol en el minuto 15.4 + 0.2 y Apigenina en el minuto 16 + 0.1. Una vez obtenido este electroferograma se obtuvieron cada uno de los electroferogramas de las muestras que en general mostraron tener la mayor actividad biológica para así identificar sus flavonoides, añadiendo los estándares para comprobar la presencia de los compuestos añadidos. En este sentido, se presenta el electroferograma de cada muestra y el de los estándares para poder observar claramente los flavonoides identificados.

ACTIVIDAD BIOLÓGICA

Actividad antimicrobiana Actividad antioxidante

Microorganismo

VCEAC*

C.albicans S.typhi S.aureus E.coli B.subtilis

Unidades Muestra

U/ml eq de Nistatina g/ml eq de Cefalosporina C

Achiote (cáscara) 245,87 134,01 - - - 298,56

Achiote (semilla) 347,71 107,93 - - 463,87 482,82

Caléndula (hoja) 173,85 86,94 86,94 - 70,02 282,11

Albahaca (flor) 292,38 70,02 - - - 305,59

Albahaca (hoja) 122,93 118,20 - -

- 386,50

Albahaca (tallo) 146,19 206,56 - -

- 217,65

Zapote (hoja) 122,93 70,02 - -

- 628,74

Caléndula (flor) - - 70,02 -

138,30 472,89


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Figura 20. Electroferograma de la mezcla de los estándares de flavonoides

En el caso de Caléndula officinalis podemos observar en la figura 20 que en la flor existe la presencia de los flavonoides rutina y quercetina ya que los tiempos en los que aparecieron los picos de los estándares y los de las muestras coinciden, mientras que en la hoja de la misma planta no se distingue claramente la presencia de algún flavonoide de los utilizados como referencia, aunque de los 7.8 a los 10 minutos se tiene una mezcla de compuestos donde se podría definir algún pico característico de un flavonoide diluyendo el extracto. en

Figura 21 a) Electroferograma de la flor de Calendula oficinalis, b) Electroferograma de la mezcla de los estándares de flavonoides

a)

b)


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Figura 22 a) Electroferograma de la hoja de Calendula oficinalis b) Electroferograma de la mezcla de los estándares de flavonoides

Por otro lado se identificaron los flavonoides rutina, catequina, naringenina y luteolina en la hoja de Casimiroa edulis (zapote) como se observa en la figura 22.

Figura 23 a) Electroferograma de Casimiroa edulis, b) Electroferograma de la mezcla de los estándares de flavonoides

a)

b)

a)

b)


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Además en Bixa orellana se encontraron los flavonoides epigallocatequina y luteolina en la semilla (figura 23) y epigallocatequina en la cascara del fruto (figura 24).

Figura 24 a) Electroferograma de la semilla de Bixa orellana b) Electroferograma de la mezcla de los estándares de flavonoides

Figura 25 a) Electroferograma de la cáscara de Bixa orellana b) Electroferograma de la mezcla de los estándares de flavonoides.

a)

b)

a)

b)


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vii. CONCLUSIONES

Se estableció la concentración de fenoles y flavonoides presentes en extractos cetónicos de diversas plantas medicinales.

Caléndula officinalis fue la especie vegetal analizada con mayor concentración de fenoles.

El extracto de la flor de Caléndula officinalis presentó la mayor concentración de flavonoides Se evaluó la capacidad antioxidante de las plantas medicinales por el método ABTS+

Las hojas presentaron en general mayor capacidad antioxidante.

Se determinó el efecto antimicrobiano de varias partes de plantas medicinales sobre Salmonella typhi, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida Albicans.

La semilla de Bixa orellana y la flor de Ocimum basilicum presentaron la mayor actividad antimicrobiana sobre Salmonella typhi y Candida Albicans. La hoja y flor de Calendula oficinalis así como la semilla de achiote inhibieron el crecimiento de Bacillus subtilis. La flor y hoja de Calendula oficinalis inhibieron el crecimiento del microorganismo Staphylococcus aureus. Se identificaron los flavonoides rutina y quercetina en Caléndula officinalis, rutina, catequina, naringenina y luteolina en la hoja de Casimiroa edulis y epigallocatequina y Luteolina en Bixa orellana por medio de electroforesis capilar micelar.


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viii. RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS

Llevar a cabo la separación y purificación de los flavonoides identificados por electroforesis capilar micelar Realizar las pruebas de actividad antioxidante y antimicrobiana a cada flavonoide por separado. Probar actividades biológicas como: antinflamatoria, hipoglucemiante u otras.


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ix. REFERENCIAS

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flavonoids”, Elsevier B.V. and the International Society of Chemotherapy,

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tradicional mexicana. México. Disponible en:

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/index.php. (Consulta 12 de abril de

2010).

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España. Disponible en http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/fraccionamiento.htm.

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Annona diversifolia”, Universidad Tecnológica de la Mixteca, pp.27.

8. Zen Bio. ABTS Antioxidant Assay Kit. INSTRUCTION MANUAL.USA. Disponible en:

http://www.zen-bio.com/pdf/ZBM0034.00ABTSAOXmanual.pdf. (Consulta 12 de abril de

2010).

9. Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Química. Electroforesis

México. Disponible en:

http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/Exposicion_electroforesis_5087.pdf.

(Consulta 12 de abril de 2010).

10. Beckman Coulter. Introduction to Capillary Electrophoresis.USA. Disponible en:

http://www.beckmancoulter.com/literature/Bioresearch/360643-CEPrimer1.pdf.

(Consulta 26 de octubre de 2010)


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12. Dimitris P., Nikolaosk G.B., “Recovery of antioxidant phenolics from white

vinification solid by products employing wáter/etanol mixtures”. Bioresource

technology 78, 584-587.

13. Ozlem Y.C., Pinar N., 2007. “Determination of phenolic content and antioxidant

activity of extracts obtained from Rosmarinus officinalis calli ” J. of plant phys,

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14. Castillo Rodríguez M.A., Revilla Vázquez A.L., 2005.”Fundamentos de

electroforesis capilar”. Universidad Nacional Autónoma de México, FES Cuautitlán

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15. Choy Y., Jeong HS., Lee J.(2007).Antioxidant activity of methanolic extracts from

some grains consumed in Korea. Food Chemistry(103):130-138


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x. ANEXOS

1. Secuencia detallada para la cuantificación de fenoles totales.

a) Curva tipo

Se elaboraron 100 ml de una solución de ácido cafeico a una concentración de 100

g/ml y partir de esta se realizaron las siguientes diluciones 10,20 30, 40,50 y 75 g/ml.

Se determinó la absorbancia de las soluciones, se realizó la gráfica concentración de

ácido cafeico g/ml vs absorbancia y se obtuvo la regresión lineal por el método de

mínimos cuadrados.

Se encontró que:

Absorbancia = 0,0225 (Concentración de ácido cafeico en g/ml) - 0,005

Coeficiente de correlación de R² = 0,9984

b) Tratamiento de las muestras.

Al obtener los datos de absorbancia a las muestras según el punto 2.3 del

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL, del presente trabajo se realizó lo siguiente.

De la fórmula:


Deseamos conocer la concentración, por lo tanto despejamos:

Concentración de ácido cafeico en g/ml= Absorbancia+ 0,005

0,0225

Y si agregamos a la ecuación el factor de dilución y el volumen total del extracto para

poder expresar los resultados como mg equivalentes de ácido cafeico/ 1 g de muestra,

nos queda:

1000

**0225,0

005,0VD

A

C


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Donde: C= Concentración de fenoles en mg equivalentes de ácido cafeico/ 1 g de muestra A=Absorbancia de la muestra D=Factor de dilución (100) V=Volumen de extracto obtenido por 1 g de muestra (15 ml) 2. Secuencia detallada para la cuantificación de flavonoides

a) Curva tipo

Se elaboraron 100 ml de una solución de rutina a una concentración de 100 g/ml y

partir de esta se realizaron las siguientes diluciones 10,20 30, 40,50 y 75 g/ml.

Se determinó la absorbancia de las soluciones, se realizó la gráfica concentración de

rutina g/ml vs absorbancia y se obtuvo la regresión lineal por el método de mínimos

cuadrados.

Se encontró que:


Coeficiente de correlación de R²= 0,9832


Al obtener los datos de absorbancia a las muestras según el punto 2.4 del

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL, del presente trabajo se realizó lo siguiente.

De la fórmula:


Deseamos conocer la concentración, por lo tanto despejamos:

Concentración de rutina en g/ml= Absorbancia+ 0,0038

0,0042

Y si agregamos a la ecuación el factor de dilución y el volumen total del extracto para

poder expresar los resultados como mg equivalentes de rutina/ 1 g de muestra, nos

queda:


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1000

**0,0042

0,0038VD

A

C

Donde: C= Concentración de flavonoides en mg equivalentes de rutina/ 1 g de muestra A=Absorbancia de la muestra D=Factor de dilución (100) V=Volumen de extracto obtenido por g de muestra (15 ml). 3. Secuencia detallada para el cálculo de la capacidad antioxidante de las muestras.

a) Curva tipo.

Se elaboró la curva tipo de capacidad antioxidante de vitamina C , midiendo el porcentaje de inhibición del radical ABTS+, a las concentraciones 0.04,0.08,0.12,0.16 y 0.2, obteniendo la siguiente relación: %De inhibición del radical= 410,03(Concentración de Vitamina C en mg/ml)+ 2,693


Una vez realizado el punto 2.6 del PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL, es posible calcular el % de inhibición del radical ABTS+, a partir de las absorbancias de la siguiente manera: % de inhibición= (Absorbancia del radical- Absorbancia de la muestra)*100 Absorbancia del radical Y para poder expresar los resultados como mg equivalentes de vitamina C por 100 gramos de muestra (VCEAC), utilizamos la curva tipo y agregamos el factor de dilución y el volumen de extracto:

Donde:

VCEAC =Capacidad antioxidante equivalente a la de Vitamina C

D=Factor de dilución (100) V=Volumen de extracto obtenido por g de muestra (15 ml).

100***03..410

693.2%VD

ónDeinhibiciVCEAC

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf020071c


32

UPIBI-IPN

4. Secuencia detallada para el cálculo de la actividad antimicrobiana de las muestras.

a) Curvas tipo

Para este caso se realizaron 2 curvas tipo: La primera a partir de una solución de cefalosporina C, un antibiótico utilizado para comparar la actividad de los extractos sobre las bacterias: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella thypi y Escherichia coli y la segunda utilizando un estándar de nistatina, un antimicótico que inhibe el crecimiento del hongo Candida albicans para establecer la capacidad de los extractos para inhibirlo. Los resultados de las curvas tipo se muestran en la tabla 3: Tabla 4 Curvas tipo para cefalosporina C y nistatina de inhibición sobre los microorganismos de prueba:

Cefalosporina C Di= 4.622 (ln X)-13.638

Nistatina Di = 5,7708ln (N) - 21,767

Di=Diámetro de inhibición (mm), X=Concentración del estándar de cefalosporina C

(g/ml), Concentración del estándar de nistatina (U/ml), ln (logaritmo natural)


Una vez obtenido el diámetro de inhibición de los extractos para las bacterias según el punto 2.6 del PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL, del presente trabajo, se realizó lo

siguiente para expresar los datos de actividad antimicrobiana como g/ml equivalentes de cefalosporina C.

De la curva tipo para cefalosporina C:

Di= 4.622 (ln C)-13.638

Deseamos conocer la concentración, por lo tanto despejamos X:

622.4

638.13

Die

X

Donde:

X= Actividad antimicrobiana g/ml equivalentes de cefalosporina C Di=Diámetro de inhibición (mm)


33

UPIBI-IPN

Por otra parte, obtenido el diámetro en los extractos que inhibieron Candida Albicans, se procedió a compararlo con la curva tipo de nistatina. De la curva tipo de nistatina

Di = 5,7708ln (N) - 21,767

Deseamos conocer la concentración, por lo tanto despejamos N:

7708.5

767.21

Die

N

Donde: N= Actividad antimicrobiana U/ml equivalentes de cefalosporina C Di=Diámetro de inhibición (mm)

determinación de la actividad biologica de flavonoides e

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