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Aislamiento, identificación y evaluación de hongos
entomopatógenos como posibles agentes de
control de trips (Thysanoptera: Thripidae)
asociados a cultivos de aguacate (Persea
americana Miller)
Tatiana Inés Restrepo Quiroz
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias
Medellín, Colombia
2015
Aislamiento, identificación y evaluación de hongos
entomopatógenos como posibles agentes de
control de trips (Thysanoptera: Thripidae)
asociados a cultivos de aguacate (Persea
americana Miller)
Tatiana Inés Restrepo Quiroz
Tesis de grado presentada como requisito parcial para optar el título de:
Magíster en Ciencias – Biotecnología
Director:
Rafael Eduardo Arango Isaza, Ph.D. Biología Molecular
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias
Medellín, Colombia
2015
(Dedicatoria)
A Dios por darme la fortaleza para terminar
mis estudios y por brindarme el entusiasmo y
la sabiduría necesaria para concluir y alcanzar
esta meta profesional, la cual es un gran
peldaño en el largo camino del saber.
A mis padres por su incondicional y profundo
apoyo. Por alentarme a seguir adelante, por
ser los mejores modelos a seguir y porque han
sido los primeros en educarme laboral y
espiritualmente. Ellos son la razón más grande
por la que he alcanzado mis sueños y espero
retribuirles todo lo que han hecho para
brindarme siempre lo mejor… Los amo!
Para mis hermanas, sobrinos y novio quienes
son una gran bendición y porque en alguna
etapa de mi vida han estado presentes
conmigo viviendo momentos difíciles y hoy
están celebrando junto a mí este gran logro
como profesional.
Agradecimientos
Un agradecimiento especial a mi director de tesis, Dr. Rafael Arango Isaza, por la
orientación, el seguimiento y la supervisión continúa de esta investigación, además, por
brindarme todos sus conocimientos para que yo desarrollara y culminara este proyecto.
Al Dr. Antoni Rueda Lorza por confiar en mí, por permitirme ser parte de los
investigadores del proyecto y sobre todo por darme la oportunidad de desarrollar mi tesis
durante la ejecución del mismo. Igualmente, a la entomóloga Martha Jazmín Sánchez
Roncancio por la identificación taxonómica de los trips.
A la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) por facilitarme sus instalaciones
donde pude desarrollar todos mis ensayos de laboratorio. Igualmente, un agradecimiento
de todo corazón a mis compañeros de la Corporación por su valiosa amistad y gran
colaboración.
Mis más sinceros agradecimientos al profesor Guillermo Correa Londoño de la
Universidad Nacional de Colombia y a mis amigos Madelen Giraldo y Carlos Lopera por
todo su apoyo, paciencia y porque fueron personas fundamentales en la finalización de mi
tesis.
A la Universidad Nacional de Colombia (Sede-Medellín) por su formación académica y por
ayudarme a crecer profesionalmente.
A los productores aguacateros ya que sin el aporte de ellos no hubiera sido posible
desarrollar esta investigación y a Colciencias por ser el ente financiador del proyecto.
Lista de contenido
Resumen ....................................................................................................................... VII
Abstract ........................................................................................................................ VIII
Lista de figuras .............................................................................................................. IX
Lista de tablas ................................................................................................................ XI
1 Introducción .............................................................................................................. 1
1.1 Hipótesis .............................................................................................................. 3
1.2 Objetivo general .................................................................................................. 3
1.3 Objetivos específicos ........................................................................................... 4
2 Marco teórico ............................................................................................................ 5
2.1 Generalidades del Orden Thysanoptera .............................................................. 5
2.1.1 Morfología, ciclo de vida y hábitos alimenticios ................................................ 5
2.2 Daños causados por trips .................................................................................... 7
2.3 Pérdidas causadas por trips ................................................................................ 9
2.4 Control ............................................................................................................... 10
2.4.1 Químico.......................................................................................................... 10
2.4.2 Mecánico ........................................................................................................ 11
2.4.3 Cultural .......................................................................................................... 11
2.4.4 Control biológico ............................................................................................ 12
2.5 Generalidades de los hongos entomopatógenos ............................................... 13
2.5.1 Ventajas de los hongos entomopatógenos ..................................................... 14
2.6 Modo de acción de los hongos entomopatógenos ............................................. 14
2.7 Hongos entomopatógenos como agentes potenciales de control de trips .......... 16
3 Metodología ............................................................................................................ 17
3.1 Colecta de trips .................................................................................................. 17
3.2 Clasificación taxonómica de trips ....................................................................... 18
3.3 Aislamiento de hongos a partir de trips .............................................................. 18
3.4 Identificación taxonómica de aislamientos ......................................................... 18
3.5 Pruebas de patogenicidad ................................................................................. 19
3.5.1 Preparación de solución madre de Lecanicillium sp y Metarhizium sp. .......... 19
3.5.2 Ensayo de sobrevida de adultos de Frankliniella spp bajo condiciones de
laboratorio................................................................................................................. 19
3.5.3 Bioensayos .................................................................................................... 20
3.6 Diseño experimental .......................................................................................... 22
3.6.1 Lecanicillium sp .............................................................................................. 22
3.6.2 Metarhizium sp ............................................................................................... 22
3.7 Análisis de los datos .......................................................................................... 23
3.8 Identificación molecular de hongos entomopatógenos ....................................... 23
4 Resultados .............................................................................................................. 26
4.1 Clasificación taxonómica de trips ....................................................................... 26
4.2 Identificación taxonómica de aislamientos ......................................................... 27
4.3 Pruebas de patogenicidad ................................................................................. 30
4.3.1 Patogenicidad de Lecanicillium sp sobre adultos de Frankliniella spp ............ 30
4.3.2 Patogenicidad de Metarhizium sp sobre adultos de Frankliniella spp ............. 32
4.3.3 Concentración Letal 50 y Tiempo Letal 50 ..................................................... 34
4.3.4 Capacidad de esporulación de Lecanicillium sp y Metarhizium sp ................. 36
4.4 Identificación molecular de aislamientos con capacidad entomopatógena ......... 38
5 Discusión ................................................................................................................ 41
6 Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 48
6.1 Conclusiones ..................................................................................................... 48
6.2 Recomendaciones ............................................................................................. 48
Referencias citadas ....................................................................................................... 53
VII
Resumen
Los problemas fitosanitarios del sistema productivo del aguacate, como el ataque de insectos
plaga, particularmente los trips, afectan la competitividad de este cultivo considerado como una de
las apuestas exportadoras del país. Esto hace indispensable la búsqueda de soluciones que
respondan al reto de la competitividad y exigencias del mercado. Los trips son insectos difíciles de
controlar debido su carácter polífago, su alta tasa reproductiva y hábito críptico. La principal
medida de manejo es el control químico, sin embargo, dada la tendencia de este insecto para
desarrollar resistencia y las crecientes restricciones que se imponen al uso de pesticidas, es poco
acertado depender solo de esta estrategia de control. En este sentido, se propuso la búsqueda de
hongos entomopatógenos a partir de trips asociados a cultivos de aguacate del Oriente antioqueño
como una alternativa viable para su manejo debido a que tienen poco impacto ambiental, son
persistentes y no inducen resistencia. Los hongos fueron aislados a partir de trips colectados en
cultivos de aguacate, los aislamientos fueron identificados y evaluados en laboratorio con el fin de
establecer su potencial como una herramienta de control efectiva en campo. Dos aislamientos
clasificados dentro de los géneros Lecanicillium sp y Metarhizium sp fueron identificados por
características taxonómicas y por métodos moleculares, los cuales han sido ampliamente
reportados como hongos entomopatógenos de plagas agrícolas de importancia económica. Se
realizaron pruebas de patogenicidad en condiciones de laboratorio sobre adultos de Frankliniella
spp colectados en campo y se determinó el potencial patogénico de los aislamientos suministrando
concentraciones de 104
a 108 conidios/ml usando el método de inoculación tópica indirecta. Los
resultados obtenidos permiten concluir que Lecanicillium sp y Metarhizium sp causan
patogenicidad sobre adultos de Frankliniella spp y se evidenció que la mortalidad fue directamente
proporcional a la concentración de conidias suministrada, destacándose los tratamientos de 108
conidios/ml con porcentajes de mortalidad del 100%, además, los bajos valores de las CL50 (104-
105 conidios/ml) y los TL50 sugieren la eficacia de estos aislamientos. Estos resultados son una
primera aproximación a la utilización de hongos entomopatógenos para el control de trips en
cultivos de aguacate del Oriente antioqueño y representan un recurso potencial para desarrollar
productos biológicos, que puedan ser articulados a programas de Manejo Integrado de Plagas.
Palabras claves: Control biológico, trips, Manejo Integrado de Plagas, patogenicidad.
VIII
Abstract
Phytosanitary problems of avocado production system such as the attack of insect pests,
particularly thrips, affect the competitiveness of this crop, which is considered an important
option of exporting for the country. This makes it essential to find solutions that address the
challenge of competitiveness and market demands. Thrips are insects difficult to control
because of its high reproductive rate, cryptic habits and resistance to insecticides. Chemical
control has been the main management strategy. However, relying solely on this strategy it is
not recommended because of the tendency of these insects to develop resistance and
restrictions on the pesticide use. In this way, it was proposed to search native
entomopathogenic fungi from thrips associated to avocado crops of Eastern Antioquia as a
viable alternative for its management because don‟t induce resistance, are persistent and have
little environmental impact. The fungi were isolated from thrips that were collected in avocado
crops. Isolates obtained were identified and evaluated in the laboratory in order to establish
their potential as an effective control method in the field. Two isolates classified as
Lecanicillium sp y Metarhizium sp were identified by taxonomic characteristics and molecular
methods. Both genera have been widely reported as entomopathogenic for agricultural pests of
economic importance. Pathogenicity tests were performed under laboratory conditions on adult
of Frankliniella spp collected in the field and the pathogenic potential of isolates was
determined by supplying concentrations of 104
- 108 conidia/ml using indirect topical
inoculation. The results obtained indicate that both the Lecanicillium sp and Metarhizium sp
found were pathogenic on adult of Frankliniella spp. Mortality was directly proportional to the
concentration of conidia supplied, reaching mortality rates of 100% at 108 conidia/ml.
Additionally, low LC50 values (104-10
5 conidia/ml) and the LT50 suggest the effectiveness of
these isolates. Results shown in this work are a first approach to the use of entomopathogenic
fungi for the control of thrips in avocado crops in Eastern Antioquia and represents a potential
resource to develop biological products that can be articulated in programs of Integrated Pest
Management.
Key words: Biological control, thrips, Integrated Pest Management, pathogenicity.
IX
Lista de figuras
Figura 2-1: Ciclo de vida de Heliothrips haemorrhoidales (Ripa & Droguett, 2008). .......... 6
Figura 2-2: Daño de Heliothrips haemorrhoidalis en (A) frutos y (B) hojas y comparación
con estructura sana. (C) Ninfa de H. haemorrhoidalis con gota de fecha en el extremo del
abdomen (Ripa & Droguett, 2008). .................................................................................... 8
Figura 2-3: Modo de acción de los hongos entomopatógenos (Thomas & Read, 2007) .. 15
Figura 3-1: Ubicación geográfica del área de estudio (Oriente antioqueño). (Fuente:
www.alternativaregional.com) .......................................................................................... 17
Figura 3-2. Ensayo de sobrevida de adultos de Frankliniella spp bajo condiciones de
laboratorio ........................................................................................................................ 20
Figura 3-3. Bioensayos con Lecanicillium sp y Metarhizium sp ....................................... 22
Figura 4-1: (A) Frankliniella spp (4X), (B) Heliothrips spp (10X), (C) Scirtothrips spp, (4X)
........................................................................................................................................ 26
Figura 4-2: Porcentaje de incidencia de los géneros aislados a partir de trips colectados
en cultivos de aguacate del Oriente antioqueño. .............................................................. 29
Figura 4-3: Hongos entomopatógenos aislados a partir de trips. (A) Colonia de
Lecanicillium sp, (B) Conidióforo de Lecanicillium sp (100x), (C) Colonia de Metarhizium
sp, (D) Conidióforo de Metarhizium sp (100x) .................................................................. 30
Figura 4-4: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp ocho días después de la
inoculación con diferentes concentraciones de Lecanicillium sp. Valores con la misma
letra no presentan diferencias significativas según la prueba Duncan (P ≤ 0.05). Las
barras representan el error estándar. ............................................................................... 31
Figura 4-5: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp ocho días después de la
inoculación con diferentes concentraciones de Metarhizium sp. Valores con la misma letra
no presentan diferencias significativas según la prueba Duncan (P ≤ 0.05). Las barras
representan el error estándar. .......................................................................................... 33
Figura 4-6: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp después de la inoculación con
diferentes concentraciones de Lecanicillium sp según el método Próbit. (A) Bioensayo 1,
(B) Bioensayo 2 ............................................................................................................... 34
X
Figura 4-7: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp después de la inoculación con
diferentes concentraciones de Metarhizium sp según el método Próbit. (A) Bioensayo 1,
(B) Bioensayo 2 ............................................................................................................... 35
Figura 4-8: Finalización del ciclo infeccioso de Lecanicillium sp sobre adultos de
Frankliniella spp ............................................................................................................... 37
Figura 4-9: Finalización del ciclo infeccioso de Metarhizium sp sobre adultos de
Frankliniella spp ............................................................................................................... 37
Figura 4-10: Amplificación de productos de PCR del gen ITS (550-650 pb). MP: Marcador
de Peso Molecular. 1: Lecanicillium sp aislado a partir de trips colectados en campo. 2:
Aislamiento recuperado a partir de los bioensayos con Lecanicillium sp. 3: Metarhizium sp
aislado a partir de trips colectados en campo. 4: Aislamiento recuperado a partir de los
bioensayos con Metarhizium sp. C+: Colletotrichum sp. C-: Control Negativo. ................ 38
Figura 4-11: Alineamiento de Lecanicillium sp aislado a partir de trips con la accesión del
GenBank: KC007329.1. ................................................................................................... 39
Figura 4-12: Alineamiento de Metarhizium sp aislado a partir de trips con la accesión del
GenBank: FJ545279.1. .................................................................................................... 39
XI
Lista de tablas
Tabla 2-1: Duración del ciclo de vida de F. occidentalis a diferentes temperaturas. .......... 7
Tabla 4-1: Características morfológicas de los géneros asociados a trips ....................... 27
Tabla 4-2: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp causado por diferentes
concentraciones de Lecanicillium sp, ocho días después de la inoculación ..................... 32
Tabla 4-3: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp causado por diferentes
concentraciones de Metarhizium sp, ocho días después de la inoculación ...................... 33
Tabla 4-4: Identidad de los aislamientos obtenidos a partir de trips basado en la
amplificación del espacio interno ITS de la región del DNA ribosomal, según BLAST en
NCBI ................................................................................................................................ 40
1
1 Introducción
Colombia registra más de 30.000 hectáreas sembradas de aguacate, es decir, el 6% de la
producción mundial, lo cual lo posiciona como el quinto país con mayor producción
superado solo por México, Indonesia, República Dominicana y Estados Unidos (FAO,
2013). Este sistema productivo es considerado el de mayor potencial a nivel internacional
teniendo ventajas estratégicas para la exportación, sin embargo, existen factores que
limitan su competitividad con respecto a los demás países productores. En cuanto a la
producción del cultivo de aguacate en Colombia, se destaca el departamento de Antioquia
con 4.819 hectáreas sembradas, representando el 15% del total nacional. Gracias a sus
condiciones de clima y altura, este departamento ha experimentado las mayores tasas de
crecimiento anual promedio, desarrollando el cultivo de la variedad Hass, siendo esta la
de mayor potencial exportador (Agronet, 2013). Sin embargo, para lograr la aceptación del
producto en el mercado de exportación es necesario adelantar un intenso trabajo en el
mejoramiento de la calidad del fruto, la reducción del uso de agroquímicos y vencer las
barreras sanitarias por plagas cuarentenarias.
Se sabe que el aguacate es afectado por problemas de tipo sanitario donde se destacan
los trips (Thysanoptera: Thripidae) como insecto plaga, esto se ha convertido en una
amenaza ya que los trips están catalogados como una plaga de interés cuarentenario en
los Estados Unidos y en este momento están presentes en los cultivos Colombianos,
adicionalmente, la principal medida para su manejo es el control químico. Este insecto
causa daños en hojas, flores y frutos como resultado de su alimentación, generando
lesiones en los frutos que permiten la entrada de microorganismos patógenos (Marroquín-
Pimentel, 1998) y causando deformaciones que disminuyen la calidad y reducen su valor
en el mercado (González et al., 2000; Hoddle, 1998). Además, es una plaga difícil de
controlar, debido a la diversidad de hospedantes que ataca, su alta tasa reproductiva, la
capacidad de adquirir resistencia a insecticidas y su número limitado de enemigos
naturales. En este sentido, se hace necesario buscar soluciones para el control de trips en
2
cultivos comerciales de aguacate con el fin de responder al reto de la competitividad y
exigencias del mercado internacional.
En Colombia se han reportado daños ocasionados por trips en frutos de aguacate donde
se observan formaciones de manchas necróticas, halos blanquecinos y protuberancias en
el pericarpio, también partenocarpia o formación del llamado fruto "pepino", estos daños
son atribuidos a la especie Heliothrips haemorroidalis (Benavides, 1992). En el
departamento del Tolima los daños ocasionados por trips registran que las pérdidas
ocasionadas en cultivos de aguacate alcanzaron el 6.34% y la fluctuación poblacional de
este insecto mostró la presencia del Orden Thysanoptera durante todo el año (Bernal,
Barragán, Moreira, & Lozano, 2009). Además, se afirma que la principal causa de
pérdidas económicas se atribuye al raspado de los frutos inmaduros causado por la
alimentación de Scirtothrips perseae y que daños por raspados mayores o iguales al 5%
de la superficie del fruto da como resultado pérdidas económicas a los productores
(Phillips, 1997). En México, se conocen alrededor de 33 especies de trips fitófagas
asociadas al cultivo de aguacate, que pueden ocasionar daños al follaje y frutos, siendo
los principales géneros Scirtotrips sp, Neohydatotrips sp y Flankliniella sp (Téliz & Mora,
2000). En Costa Rica se ha encontrado un complejo variable de trips como plaga
asociados al cultivo de aguacate. Estudios recientes realizados por Martínez et al., (2011)
en la zona de Los Santos, informaron mediante el uso de trampas por golpeo de las
inflorescencias y las hojas, tres géneros de trips fitófagos en orden de abundancia
Scirtothrips sp, Frankiniella sp y Neohydatothrips sp, coincidiendo con los principales
géneros presentes en México.
El manejo tradicional que se le ha dado a los trips comprende la aplicación de insecticidas
químicos, sin embargo, dada la tendencia de este insecto para desarrollar resistencia y
las crecientes restricciones que se imponen al uso de pesticidas, es poco acertado
depender solo de esta estrategia de control (Parrella & Nicholls, 1996). El uso de hongos
entomopatógenos para el control de plagas en cultivos de importancia económica es una
alternativa viable para el control de este insecto, no obstante, se tiene poca información
especialmente en lo que respecta al control biológico de trips en cultivos de aguacate,
adicionalmente, para el uso de este tipo de microorganismos se requiere un mayor
entendimiento de su genética, aspectos fisiológicos, enzimas, metabolitos intra y
extracelulares, etc, que permitirá su manipulación para la obtención de cepas
3
ambientalmente seguras, caracterización de ceparios y producción de biopreparados
(Rivera, Bridge, & Bustillo, 1997).
Debido a que la investigación sobre hongos entomopatógenos se ha limitado a la
entomología aplicada y a las consideraciones ecológicas relacionadas con el Manejo
Integrado de Plagas, recientemente se han hecho esfuerzos para estudiar la genética y la
fisiología de estos hongos, ya que es muy importante identificar las cepas con exactitud.
La identificación de hongos entomopatógenos se realiza usualmente por caracterización
morfológica, por lo que ha sido necesario emplear otros métodos rápidos, confiables y
sensibles, que con sus aplicaciones específicas y ventajas, permitan la diferenciación de
hongos entomopatógenos y puedan ser útiles en la implementación de medidas
apropiadas de control biológico (Ayra, Cabrera, Gómez, & Hernández, 2001). En
consecuencia, este trabajo planteó la búsqueda de hongos controladores que afectaran
de forma natural la fauna de trips presentes en cultivos de aguacate del Oriente
antioqueño, con el fin de ser identificados y evaluados a nivel de laboratorio como
fundamento para la obtención de una herramienta de control biológico para el manejo de
poblaciones de trips de importancia económica presentes en el sistema productivo del
aguacate, con el propósito de contar con alternativas que se puedan articular dentro de
programas de Manejo Integrado de Plagas bajo condiciones de campo.
1.1 Hipótesis
En cultivos comerciales de aguacate (Persea americana Miller) del Oriente antioqueño es
posible encontrar hongos entomopatógenos asociados a trips (Thysanoptera: Thripidae),
los cuales pueden ser identificados y evaluados a nivel de laboratorio como posibles
agentes de control biológico de este insecto.
1.2 Objetivo general
Identificar hongos entomopatógenos obtenidos a partir de trips (Thysanoptera: Thripidae)
asociados a cultivos de aguacate (Persea americana Miller) del Oriente antioqueño y
evaluar su potencial como posibles agentes controladores de este insecto.
4
1.3 Objetivos específicos
Identificar taxonómicamente a nivel de género hongos procedentes de poblaciones de
trips asociadas a cultivos de aguacate del Oriente antioqueño.
Evaluar el potencial biocontrolador de los hongos entomopatógenos aislados a partir de
poblaciones de trips asociadas a cultivos de aguacate empleando pruebas de
patogenicidad.
Caracterizar los hongos que presenten mejor actividad entomopatógena sobre
poblaciones de trips mediante el uso de técnicas moleculares.
5
2 Marco teórico
2.1 Generalidades del Orden Thysanoptera
2.1.1 Morfología, ciclo de vida y hábitos alimenticios Los Thysanopteros pertenecen a un grupo relativamente antiguo entre los insectos, se
piensa que poseen un ancestro común con los órdenes Hemíptera, Psocoptera y
Phthiraptera (Mound & Lewis, 1997). El orden Thysanoptera está dividido en dos
subórdenes: Terebrantia y Tubulífera, los cuales difieren en la forma del último segmento
abdominal y el desarrollo del ovipositor. Los Terebrantia tienen el último segmento
abdominal más o menos cónico o redondeado, y las hembras usualmente tienen un
ovipositor bien desarrollado. Los Tubulífera tiene el último segmento abdominal en forma
tubular y las hembras carecen de un ovipositor (Stannard, 1968). En los Terebrantia, las
hembras depositan los huevos en el interior de los tejidos vegetales y en los Tubulífera los
huevos son depositados en grietas, agallas o expuestos en la superficie foliar (Borror,
Triplehorn, & Johnson, 1989; Daly, Doyen, & Ehrlich, 1978). Se estima que existen
alrededor de 5000 especies de trips clasificadas dentro de 8 familias, de las cuales hay
cerca de 30 especies de importancia económica, sin embargo, la mayoría de estas
permanecen sin describir, incluyendo algunas que son plagas en la agricultura (Heming,
1991).
Los trips son insectos de cuerpo alargado, cilíndrico y de tamaño diminuto (0,5 - 5 mm).
Generalmente muy activos, saltan y vuelan con agilidad. Las cuatro alas son largas,
angostas, con pocas o ninguna vena y con flecos formados por pelos largos. La cabeza
es cuadrada, más estrecha que el tórax, sus antenas son filiformes o moniliformes y
constan de cuatro a nueve segmentos. Los ojos compuestos son grandes, con facetas
conspicuas, las cuales tienen formas circulares, ovales o reniformes en el contorno. El
tórax tiene el primer segmento grande y el segundo y el tercero se encuentran fusionados
(Borror et al., 1989). Tradicionalmente se ha considerado que su aparato bucal es
6
“raspador-chupador”, teniendo presente que el estilete perfora en lugar de raspar el tejido
vegetal (Borror et al., 1989; Daly et al., 1978). Estudios más recientes y gracias a los
avances de la microscopía electrónica, otros investigadores han optado por denominarlo
“picador-chupador” (Kirk & Lewis, 1997).
El ciclo de vida de los trips comprende huevo, ninfa I, ninfa II, prepupa, pupa y adulto. El
período de incubación dura de 3 a 5 días, al cabo del cual sale el primer instar ninfal (de
cuerpo transparente y ojos rojos) que dura de 4 a 6 días. El segundo instar ninfal tiene
una duración similar y su coloración es blanca opaca. Al final de este estado se observan
los cojines alares, denominándose estado de prepupa, allí se deja caer al suelo, se
entierra un poco y pasa al estado de pupa. Según Seal (1996), la duración total de los
estados inmaduros es de 10 a 12 días. Cermeli et al., (1993), anotan que los instares
ninfales duran 5 días y los periodos de prepupa y pupa de 5 a 6 días, para un total de 12
días. Bernardo (1991) encontró que para el desarrollo del insecto se requiere un período
de 13 días en promedio y que la duración de los adultos varía entre 2 y 18 días.
Figura 2-1: Ciclo de vida de Heliothrips haemorrhoidales (Ripa & Droguett, 2008).
Algunos autores afirman que la disponibilidad de alimento y su valor nutricional son
elementos importantes en la tasa de crecimiento de las poblaciones de trips (Kirk & Lewis,
1997). Higgins (1992), señala que la disponibilidad de polen afecta la fecundidad, la tasa
de oviposición, la tasa de desarrollo y el crecimiento ninfal en varias especies de trips, de
igual manera, se conoce que la duración del ciclo biológico de los trips depende de la
7
temperatura y se considera que su potencial biótico óptimo se sitúa alrededor de 25°C y
sobre los 10°C la mínima de desarrollo (Lewis, 1997) (Tabla 2-1).
Tabla 2-1: Duración del ciclo de vida de F. occidentalis a diferentes temperaturas.
Temperatura (°C)
Duración ciclo (días)
Longevidad (días)
Fecundidad (huevos/hembra)
15 39 46 50 20 26 75 126 25 13 31 135 27 10 34 229 30 9 12 40 35 10 10 5
Daly et al., (1978) afirman que los trips poseen variados hábitos alimenticios,
encontrándose fitófagos, entomófagos que se alimentan de áfidos u otros pequeños
insectos de cuerpo blando, de huevos de ácaros o de mariposas y micófagos que se
alimentan de esporas de hongos. Según Kirk & Lewis (1997), se cree que la evolución
alimenticia de los trips fue avanzando desde los micófagos hacia los depredadores,
pasando por los que se alimentan de flores y hojas. Mound (1997) señala que la mayoría
de las especies de trips de los géneros más avanzados incluyendo a Thrips y a
Frankliniella se alimentan tanto de flores como de tejido foliar.
2.2 Daños causados por trips En aguacate la calidad del fruto se ve severamente afectada por problemas fitosanitarios
y específicamente por estos insectos fitófagos, los cuales con su aparato bucal picador-
chupador se alimentan de los pétalos de las flores o frutos en desarrollo, causando
deformaciones y otro tipo de daños sobre la fruta (Johansen & Mojica, 1997). En general,
los efectos causados por la alimentación de los trips sobre los árboles frutales
comprenden varios tipos de alteraciones como el enanismo, manchado de la cáscara,
arrosetamientos, coloraciones plateadas, frutos agrietados o partidos, además de la caída
de frutos pequeños (Childers & Lewis, 1997).
La superficie de los tejidos afectada por la alimentación de los trips desarrolla una
tonalidad plateada a causa del aire que ocupan las cavidades vacías de las células. El
daño de las células del mesófilo muestra una tonalidad verdosa oscura o amarilla. Las
hojas afectadas por altas poblaciones de trips muestran áreas cloróticas, las cuales se
8
colapsan, ocasionando que las hojas se sequen y caigan prematuramente (Lewis, 1973).
Los trips son especies reconocidas como plagas de importancia económica en cítricos
(Childers & Lewis, 1997), limitan la calidad de la producción en frutales de la familia
Rosaceae y además causan graves pérdidas en aguacate (Bernal et al., 2009). El trips del
aguacate, Heliothrips haemorrhoidalis (Bouché), causa graves daños en la producción
debido al "cuerudo" o "russet" que provoca su alimentación en la fruta, adicionalmente,
esta plaga produce una excreción negruzca que mancha hojas y frutos, esta excreción la
utilizan las ninfas como defensa contra sus enemigos naturales al mantener la gota
adherida al extremo del abdomen (Ripa & Droguett, 2008) (Figura 2-2).
Figura 2-2: Daño de Heliothrips haemorrhoidalis en (A) frutos y (B) hojas y comparación
con estructura sana. (C) Ninfa de H. haemorrhoidalis con gota de fecha en el extremo del
abdomen (Ripa & Droguett, 2008).
Heliothrips haemorrhoidalis es una especie originaria de Brasil y se encuentra presente
en Chile hace más de 90 años (Artigas, 1994). En aguacate H. haemorrhoidalis se
localiza y daña preferentemente las áreas entre frutas que están en contacto (Dennill &
Erasmus, 1992). Bernal et al., (2008) afirman que la superficie o cáscara del fruto de
aguacate atacada por trips se torna de color café y adquiere una consistencia áspera,
con agrietamientos que reducen su valor comercial siendo más grave el daño en frutos
(A) (B)
(C)
9
recién cuajados, en los cuales provoca atrofia y aborto de los mismos sin que haya
producción. En frutos jóvenes causa deformaciones en la superficie del pericarpio en
forma de protuberancias o crestas, las heridas provocadas a los frutos por este daño
pueden favorecer la entrada de enfermedades como la roña del fruto (Sphaceloma
perseae). En Chile, se acepta para la exportación un daño aproximado de hasta 1 cm2
en los frutos (Ripa & Droguett, 2008).
El daño físico causado por trips, se produce cuando los frutos son muy pequeños y las
lesiones se ven notablemente agrandadas conforme el fruto adquiere su tamaño
comercial (Ascención, Bravo, González, Johansen, & Becerril, 1999), las etapas
fenológicas del fruto más afectadas por los trips son las iniciales del 1 al 2 y aunque las
lesiones causadas por este insecto no afecta la calidad de la pulpa de la fruta, el daño
estético puede motivar al descarte en el proceso de exportación (Avila et al., 2002).
2.3 Pérdidas causadas por trips En las áreas aguacateras de Michoacán Estado de México el daño ocasionado por el
ataque de trips llega a manifestarse en el 25% de los frutos, que además de ser
rechazados en los mercados de exportación, el precio pagado por el mercado nacional es
50% menos que su valor comercial al precio corriente. Por otra parte se estima que al
menos el 23% de los insumos requeridos por el frutal se destinan a programas de control
químico de plagas y enfermedades, principalmente de aquellas que impactan la calidad
de los frutos como son los trips (Coria, 1993).
En los condados de Ventura y San Diego (EEUU) se recomienda a los agricultores
aguacateros aplicar contra Scirtothrips perseae tres productos dentro de los cuales el más
comúnmente usado es la Abamectina, seguido por el Spinosad y la Sabadilla, estas
aplicaciones aumentaron los costos de producción en un 1.5%. (Morse et al., sf).
En Colombia, se han reportado pérdidas ocasionadas por Thrips palmi Karny hasta por
$6.000 millones en los municipios del Santuario y Marinilla, con una disminución en la
producción en cultivos de fríjol (Phaseolus vulgaris) y papa (Solanum tuberosum) del 60 y
70%; en pimiento del 55%, en tomate (Lycopersicum esculentum) del 45% (Agudelo &
Vergara, 1998) y Bernal et al., (2009) registran que en aguacate las pérdidas ocasionadas
por trips en el Norte del Tolima ascendieron al 6.34%. Sin embargo, la importancia no solo
10
radica en el daño que causa directamente a los cultivos sino que también en varios países
se le asocia con la transmisión de enfermedades virales estrechamente relacionadas con
el virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV) que es adquirido únicamente en
estado ninfal, pero los adultos lo transmiten. Las especies más importantes son: Thrips
tabaci, Frankliniella fusca, F. schultezei y F. occidentalis (Robles, González, Gill, Pérez &
López, 2010).
2.4 Control
Las características biológicas y ecológicas de este insecto hacen difícil su control, sea
cual sea el método empleado. Como los huevos se depositan dentro del tejido de la hoja,
quedan relativamente protegidos de los factores naturales de mortalidad y de los
productos químicos. Además, los estados inmaduros se alimentan activamente por pocos
días y las fases de prepupa y pupa pasan en el suelo sin alimentarse (Durán, 1999). Los
métodos de control de este y otros insectos considerados como plagas de interés
agrícola, pueden ser de tipo químico, mecánico, cultural y biológico (Vergara, 1996).
2.4.1 Químico
En la mayoría de los cultivos, el uso de insecticidas sintéticos es la opción más común
para controlar los trips, el hábito encapsulado y la rápida reproducción de estos insectos
hacen necesaria la frecuente aplicación de tratamientos químicos. Estos tratamientos
causan residualidad y problemas de resistencia con altos costos y riesgo para los
operarios y los organismos benéficos. Algunos autores señalan que el control de trips
mediante el uso de insecticidas es difícil ya que muchas especies pueden sobrevivir en
plantas hospederas cultivadas o silvestres, las cuales pueden servir como fuente de
infestación y reinfestación. Los estadios más susceptibles a los productos se presentan
solamente durante un tercio del ciclo total de vida y adicionalmente es muy difícil alcanzar
a los trips en el interior de las plantas y en los capullos florales donde se esconden
(Powell, Lindquist, & Martens, 1994).
Cermeli et al., (1993) determinaron que en Venezuela, los productos que demostraron ser
más promisorios en el control de trips en diferentes cultivos fueron Flufenoxuron,
Imidacloprid, Clorfluazuron y Oxamyl, con eficacias variables entre el 40 y 80%, aplicados
11
a intervalos de 5 días. En Colombia, Varela & Huertas (1998) encontraron que
aplicaciones de Imidacloprid y Abamectina en dosis de 180 c.c. y de 300 c.c. por 200 litros
de agua respectivamente, con intervalos semanales, dan excelentes resultados para el
control de Thrips palmi Karny.
En Japón, ha sido demostrada la tolerancia de Thrips palmi a la mayoría de los productos
organofosforados usados para su control (Hata, Hara, & Hansen, 1991; Johnson, 1995).
Los problemas de las altas infestaciones y de la resurgencia de la plaga, se relacionan
con el uso inadecuado de estos productos químicos (Hirose, 1990), además, Kontsedalov
et al., (1998) señalan que el uso constante de insecticidas incrementa el potencial de
aparición de resistencias.
2.4.2 Mecánico Un método de control exitoso del insecto en cultivos bajo invernadero ha sido cubrir las
camas de siembra con plástico, lo que dificulta el empupado de la plaga, sin embargo,
este método trae consigo un aumento en la temperatura y una mayor dificultad para la
realización de otras prácticas de manejo como la fertilización, por lo tanto no es un
método muy empleado (Nasu, Kimura, & Tsuji, sf).
Sastrosiswojo (1991) y Talekar (1991) señalan que el riego por inundación se puede usar
para destruir en el suelo el estado de pupa debido al ahogamiento, no obstante, los
árboles de aguacate son relativamente sensibles a la inundación comparados con otros
frutales (Duque, 2011). Adicionalmente, un drenaje pobre o inundación de los suelos
causa daños más serios y rápidos, o la muerte de la planta, que en suelos con falta de
humedad; un pobre drenaje produce perdida de vigor de las plantas, marchitamiento y un
color de hojas verde pálido a amarilloso (Agrios, 2005).
2.4.3 Cultural Para un programa exitoso de control de trips es necesario implementar un sistema de
monitoreo usando trampas pegajosas de color. Según Powell et al., (1994), las trampas
azules o blancas son mejores y las amarillas son aceptables, mientras que Huang (1989)
afirma que el mejor color es el blanco. El uso conjunto de trampas y monitoreo de las
plantas, permite la rápida detección de los puntos de alta infestación de trips (Higgins,
12
1992). En aguacate, se debe monitorear al menos una vez al mes hojas y frutos durante
todo el año, considerando presencia/ausencia de la plaga, a través de esta labor se
identifican y marcan los sectores de la finca afectados por la plaga. Se monitorea
aproximadamente el 1% de los árboles, indicando en una planilla de registro el número de
estructuras con presencia del insecto, en el caso de frutos se debe indicar también la
presencia de daño (Ripa & Droguett, 2008).
2.4.4 Control biológico El control biológico de plagas es definido por DeBach & Castaños (1982) como “la acción
de parasitoides, predadores, o patógenos para mantener la densidad de la población de
otro organismo a un promedio más bajo que el que existiría en su ausencia” (Madrigal,
2001). Los primeros son aquellos que completan su ciclo de vida dentro o sobre el cuerpo
de su hospedero, los patógenos son aquellos microorganismos (nemátodos, protozoarios,
hongos, bacterias y virus) que se reproducen y desarrollan dentro de su hospedero
causándole la muerte si el ataque es invasivo (Hanson, 1993) y los depredadores son
organismos que atacan y se alimentan de otros organismos (Huffaker, 1974). Estos
“controladores” (hongos, bacterias, nematodos, insectos, etc.) se encuentran en el mismo
hábitat de las plagas, o incluso pueden estar dispersos a miles de kilómetros de sus
hospederos si no presentan alta especificidad. Sin embargo, en su afán de encontrar
soluciones que sean menos dañinas para el entorno y que permitan obtener el equilibrio
natural, el hombre ha identificado, multiplicado y dispersado estos controladores.
Un componente importante del Manejo Integrado de Plagas es el uso de agentes de
control biológico, los cuales son una alternativa para reducir la dependencia de los
métodos de control químico, desafortunadamente no hay mucha información disponible
sobre el uso de hongos entomopatógenos para manejo de trips (Maniania et al., 2003).
Los pocos registros de hongos entomopatógenos sobre trips incluyen a Neozygites
parvispora (Macleod and Carl), Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Paecilomyces
fumosoroseus (Wize) y Verticillium lecanii (Zimm), como también una especie sin
identificar del género Hirsutella sp, que fue hallada en Trinidad infectando
aproximadamente el 80% de Thrips palmi en poblaciones de campo (Castineiras, Peña,
Duncan, & Osborne, 1996).
13
2.5 Generalidades de los hongos entomopatógenos Hace ya varias décadas se plantean investigaciones en control biológico que buscan
disminuir los estragos causados por el uso excesivo de agroquímicos. Gracias a dichas
investigaciones se han podido plantear premisas que permiten estandarizar la calidad de
los ensayos realizados y facilitan llegar a conclusiones sobre control biológico luego de
obtener ciertos resultados. Son más de 130 años de uso de hongos entomopatógenos en
programas de control biológico (Zimmermann, 2007a, 2007b). Según Alves (1998) y
Tanada & Kaya (2012) las características de un buen entomopatógeno son:
- Debe ser resistente a condiciones físicas (radiación UV, altas temperaturas y
desecación) y compatible con otros microorganismos.
- Debe ser persistente, esto es, debe tener habilidad para formar estructuras que resistan
condiciones adversas.
- Su DL50 debe ser baja para que garantice una alta patogenicidad.
- Debe poseer la habilidad de causar epizootias.
- Es importante que sea inocuo por modo de acción o nicho, a organismos no blancos.
No obstante se sigue investigando sobre la acción biocida de estos hongos, ya que cada
hospedero tiene una relación particular con el patógeno, además de que la efectividad de
su ataque puede ser afectada por diversos factores (Tanada & Kaya, 2012), tales como:
1. El patógeno: Su patogenicidad, virulencia, dispersión y persistencia son determinantes
ya que no es lo mismo aplicar cierta cantidad de un hongo en un lote en el que la plaga ya
ha alcanzado el umbral económico, a aplicarlo en un lote donde apenas se distinguen los
focos de infestación.
2. El hospedero: Se debe tener en cuenta su susceptibilidad, densidad, distribución y
comportamiento para atacarlo razonable y eficazmente.
3. Medio ambiente: La existencia de factores abióticos (temperatura, humedad, viento,
lluvias) y bióticos (parásitos, depredadores, planta huésped) predisponen al hospedero
tanto como al entomopatógeno para el momento de la infección y juegan un papel
decisivo para el éxito de la relación patógeno-hospedero.
Como existe dependencia de diversos factores del hongo entomopatógeno para la
infección, pueden cambiar las formas de aplicación del hongo al hospedero, lo que
14
permite optimizar su acción cuando se conocen las características del medio en que va a
ser aplicado y a su hospedero. Los hongos entomopatógenos pueden manejarse por
medio de tres estrategias a saber y que son consideradas por Alves (1998) en programas
de MIP:
1. Inundación: Liberación de grandes cantidades del agente biológico sobre poblaciones
del insecto plaga.
2. Inoculación: Del patógeno en cantidades mínimas de insectos capturados y
dispersándolos para contaminar la población residente.
3. Conservación: Manteniendo las poblaciones naturales del entomopatógeno.
2.5.1 Ventajas de los hongos entomopatógenos
1. Selectividad: Las cepas son especializadas para cada plaga y su patogenicidad
aumenta cada vez que ataca otros individuos de la misma especie.
2. Persistencia: En el suelo o en insectos muertos.
3. Poco impacto ambiental.
4. Poca toxicidad para el hombre y otros animales.
5. No inducen resistencia.
La investigación sobre control biológico con hongos entomopatógenos está generando
constantemente ideas sobre su uso en campo. Lo anterior permite optimizar las prácticas
de aplicación para aumentar la probabilidad del cumplimiento de su ciclo infectivo,
teniendo en cuenta factores como las condiciones ambientales más favorables al
momento de la aplicación. También se han generado avances en la producción y
almacenamiento, aspectos que se tornaban, hace tiempo, en desventajas en el uso de
estos microorganismos (Madrigal, 2001).
2.6 Modo de acción de los hongos entomopatógenos Los hongos patógenos de insectos se encuentran representados en el Reino Fungi y
ubicados en los Filo: Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota. Las
clases de mayor importancia desde el punto de vista del control de plagas agrícolas son la
clase forma Hyphomycetes y la clase Zygomycetes (Tanada & Kaya, 2012). El Orden
Entomophthorales (Zygomycota: Zygomycetes) incluye unas 200 especies patógenas de
insectos y ácaros (Lacey, 1997). Estos hongos son particularmente interesantes debido a
15
que producen epizootias en las poblaciones de insectos, afectando principalmente a
especies incluidas en los órdenes Hemíptera, Lepidóptera, Orthoptera y Díptera (López &
Scorsetti, 2007).
Los hongos entomopatógenos tienen un gran potencial como agentes de control, ya que
constituyen un grupo con más de 750 especies que al dispersarse en el ambiente
provocan infecciones fúngicas en las poblaciones de insectos. Estos hongos inician su
proceso infectivo cuando las esporas son retenidas en la superficie del integumento,
donde se inicia la formación del tubo germinativo, comenzando el hongo a excretar
enzimas como las proteasa, quitinasas, quitobiasaslipasas y lipooxigenasas. Estas
enzimas degradan la cutícula del insecto y ayudan con el proceso de penetración por
presión mecánica iniciado por el apresorio, que es una estructura especializada formada
en el tubo germinativo. Una vez dentro del insecto, el hongo se desarrolla con cuerpos
hifales que se van desarrollando a través del hemocele e invaden diversos tejidos
ocasionando la muerte del insecto después de 3 a 4 días de iniciada la infección, una vez
muerto el insecto y ya agotados muchos de los nutrientes, el hongo inicia un crecimiento
micelial e invade todos los órganos del hospedero. Finalmente las hifas penetran la
cutícula desde el interior del insecto y emergen a la superficie, donde en condiciones
ambientales apropiadas inician la formación de nuevas esporas (Díaz, Macías, Navarro, &
De La Torre, 2006) (Figura 2-3).
Figura 2-3: Modo de acción de los hongos entomopatógenos (Thomas & Read, 2007)
16
2.7 Hongos entomopatógenos como agentes potenciales
de control de trips
El control biológico de plagas mediante el uso de hongos entomopatógenos es una
alternativa ecológicamente aceptable pero poco conocida especialmente en lo que
respecta al control biológico de trips en cultivos de aguacate. Los hongos patógenos de
trips son agentes de control biológico prometedores, y aunque se han encontrado pocas
infecciones naturales, se han aislado varios hongos a partir de este insecto, uno de ellos
es Verticillium lecanii, aislado de Thrips palmi generando una mortalidad del 20% de los
insectos evaluados (Visalakshy, Kumar, & Krishnamoorthy, 2004). Algunas cepas de
hongos entomopatógenos se han desarrollado en el mundo como agentes de control
biológico de plagas agrícolas donde se incluyen varias especies de trips, este es el caso
de Beauveria bassiana que es considerado uno de los hongos más eficaces contra trips y
en China, por ejemplo, se han descrito varias cepas altamente virulentas para Frankliniella
occidentalis y desarrolladas como agentes de control biológico. Sin embargo, el éxito de
los hongos entomopatógenos como agentes de control biológico no sólo depende de su
eficacia contra las plagas, sino también de la baja virulencia contra los insectos no diana
que pueden ser enemigos naturales de trips y esta es una de las preocupaciones con B.
bassiana ya que afecta una amplia gama de huéspedes. Por esta razón varios
investigadores han desarrollado y evaluado cepas de este hongo que no afectan a
especies de insectos depredadores (Stuart, Gao, & Lei, 2011). Además, recientemente se
han encontrado cepas más eficaces de B. bassiana como B. bassiana-CYT5, que es más
infecciosa y letal, causando una mortalidad del 90% en F. occidentalis seis días después
de su aplicación (Wang & Zheng, 2012). Otro hongo que ha resultado eficiente en el
control de trips es Metarhizium anisopliae que afecta las pupas de F. occidentalis incluso
más que insecticidas químicos convencionales (Imidacloprid y fipronil con70-90%, frente
al 20-50%) (Ansari, Shah, Whittaker, Prasad, & Butt, 2007).
17
3 Metodología
3.1 Colecta de trips
La colecta de trips se realizó en once cultivos comerciales de aguacate pertenecientes a
los municipios de Marinilla, Rionegro, La Ceja, El Carmen de Viboral y El Retiro, zona
conocida como el Oriente antioqueño, que está situada por encima de los 1500 msnm con
temperaturas que oscilan entre 0-21°C y humedades relativas entre 75-89%. Los insectos
se colectaron de las variedades Hass, Reed y Fuerte sacudiendo las inflorescencias de la
planta sobre una tabla de acrílico blanca y usando un aspirador bucal. Los trips se
depositaron en tubos Falcon de 50 ml y se transportaron en neveras de poliestireno con
refrigerante para mantener una temperatura de 16 ± 1°C. Las muestras se trasladaron al
laboratorio de Fitosanidad y Control Biológico de la Corporación para Investigaciones
Biológicas (CIB) donde fueron procesadas (Medellín, Colombia).
Figura 3-1: Ubicación geográfica del área de estudio (Oriente antioqueño). (Fuente:
www.alternativaregional.com)
18
3.2 Clasificación taxonómica de trips
Para una mayor nitidez en la observación de las características taxonómicas, los trips se
sometieron a un proceso de deshidratación gradual que consistió en colocarlos por
espacios de 5 minutos en diferentes gradientes de concentración de alcohol (80%, 90%
alcohol absoluto y Xileno). Posteriormente sobre un portaobjeto se colocó una gota de
Bálsamo de Canadá y sobre esta se dejó caer ventralmente un trips al cual se le
extendieron suavemente las alas y las extremidades, procediendo después a dejarlo en
forma dorsal y cubrirlo con una laminilla cubreobjeto. Para completar su secado y
estiramiento se dejó en una estufa a 45°C por 4 días.
Siguiendo las claves taxonómicas de Mound & Kibby (1998) se clasificaron los insectos
colectados a nivel de género, midiendo y observando características como: quetotaxia,
número de artejos antenales, presencia de conos sensoriales, posición de sedas en el
pronoto, distribución de sedas en las alas anteriores, posición de sedas abdominales,
diseño de las alas, posición de sedas interocelares, entre otras.
3.3 Aislamiento de hongos a partir de trips
Los hongos se aislaron de trips muertos (Tm) y trips vivos (Tv) colocados vivos
directamente sobre cajas de Petri que contenían medio de cultivo Agar Papa Dextrosa
(PDA-MERCK®). Los cadáveres de adultos de trips se sumergieron en hipoclorito de
sodio al 0,5% durante 5 minutos, posteriormente se lavaron cuatro veces con agua
destilada estéril y se sometieron a cámara húmeda depositándolos sobre cajas de Petri
estériles, utilizando papel filtro húmedo con agua destilada estéril para favorecer la
aparición de micelio sobre los insectos. Las cajas se incubaron a temperatura ambiente
(22-26°C) durante ocho días y en los casos en los que el insecto presentó signos de
micosis, parte de este micelio se transfirió a cajas de Petri con medio de cultivo PDA con
el fin de aislar, purificar e identificar los aislamientos obtenidos (Cañedo & Ames, 2004).
3.4 Identificación taxonómica de aislamientos
De los hongos obtenidos a partir de los trips se hicieron aislamientos puros y se
estudiaron las características tanto macroscópicas como microscópicas. Los hongos se
identificaron a nivel de género según criterios de cultivo y morfológicos siguiendo la clave
19
taxonómica de Carmichael et al., (1980), la cual se basa en la descripción de las
estructuras microscópicas del hongo (Tipo de conidia, arreglo de las conidias, coloración
de las conidias y tipo de célula conidiogénica). Estos hongos se conservan en el
laboratorio de Fitosanidad y Control Biológico de la Corporación para Investigaciones
Biológicas (CIB) y los que fueron identificados taxonómicamente como entomopatógenos
se usaron para los ensayos de patogenicidad sobre trips.
3.5 Pruebas de patogenicidad
Las pruebas de patogenicidad se realizaron con dos aislamientos obtenidos a partir de
trips e identificados taxonómicamente como Lecanicillium sp y Metarhizium sp, los cuales
han sido ampliamente reportados como hongos con capacidad entomopatógena.
3.5.1 Preparación de solución madre de Lecanicillium sp
y Metarhizium sp.
Se preparó una suspensión de conidios de cada aislamiento a partir de un cultivo con 12
días de crecimiento, se agregaron 20 ml de agua estéril y dos gotas de Tween 80 a la caja
de Petri, se raspó y se filtró el contenido con una gasa estéril y se vertió en un beaker de
200 ml. La concentración de las suspensiones se determinó por conteo en cámara de
Neubauer (Goettel & Inglis, 1997): 2,18x108 conidios/ml para Lecanicillium sp y 2,20x108
conidios/ml para Metarhizium sp.
A partir de las soluciones madre se hicieron diluciones seriadas y se ajustaron a
concentraciones de: 2,18x104; 2,18x105; 2,18x106; 2,18x107 para Lecanicillium sp y
2,20x104; 2,20x105; 2,20x106; 2,20x107 para Metarhizium sp, con el fin de evaluar el
efecto de los tratamientos, sobre adultos de Frankliniella spp colectados en campo, en
relación a su tasa de mortalidad.
3.5.2 Ensayo de sobrevida de adultos de Frankliniella
spp bajo condiciones de laboratorio
Antes de realizar los bioensayos se determinó el tiempo de sobrevida de adultos de
Frankliniella spp bajo las condiciones del laboratorio de Fitosanidad y Control Biológico
20
(16 ± 2°C y HR 75 – 85%) de la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) ya que
para las pruebas de patogenicidad con Lecanicillium sp y Metarhizium sp se usarían
insectos colectados en campo.
Se depositaron 10 adultos de Frankliniella spp (tomados al azar entre los individuos de las
fincas donde se colectaron) en tubos Falcon de 50 ml con vainas de habichuela
desinfectadas como alimento y papel filtro humedecido con agua estéril. Se hicieron cinco
ensayos independientes con cinco repeticiones cada uno.
Se tomaron datos de mortalidad diarios hasta que se observó una mortalidad del 100%,
se determinó el tiempo de sobrevida de los adultos bajo las condiciones del laboratorio
(16 ± 1 días) y con estos datos se estableció que los ensayos de patogenicidad se
evaluarían hasta 8 días después de la inoculación para garantizar que la mortalidad de los
trips se diera por el efecto patogénico de los hongos y no por condiciones externas.
Figura 3-2. Ensayo de sobrevida de adultos de Frankliniella spp bajo condiciones de
laboratorio
3.5.3 Bioensayos
Se evaluó la actividad patogénica de Lecanicillium sp y Metarhizium sp sobre adultos de
Frankliniella spp colectados en campo que tuvieran comportamiento y características
morfológicas similares. Para cada aislamiento se realizaron dos bioensayos
21
independientes en el tiempo con el fin de abarcar las dos épocas de floración que
presenta el cultivo de aguacate en el año, ya que en este estado fenológico el cultivo se
ve altamente afectado debido a que el ataque de ninfas y adultos de trips ocasiona el
aborto de flores y esto da lugar a una reducción en la producción.
Bioensayo 1: Los trips usados para este ensayo fueron colectados en la primera época
de floración del cultivo de aguacate que se da en el mes de enero y se realizó para
Lecanicillium sp y Metarhizium sp a las concentraciones mencionadas anteriormente (Lec
1 y Met 1).
Bioensayo 2: Los trips usados para este ensayo se colectaron en el mes de junio
(segunda época de floración) e igualmente se realizó para ambos aislamientos a las
mismas concentraciones del bioensayo 1 (Lec 2 y Met 2).
Los bioensayos se desarrollaron de la siguiente manera:
Los ensayos de patogenicidad se desarrollaron bajo las mismas condiciones del
ensayo de sobrevida de adultos de Frankliniella spp bajo condiciones de
laboratorio. Los diferentes tratamientos se colocaron en contacto con los trips
impregnando un algodón con la suspensión respectiva (método de inoculación
tópica indirecta) (Gutiérrez, 2005) y el control se trató con agua destilada estéril.
Se experimentó sobre 10 adultos de trips por cinco repeticiones para los
bioensayos 1 y 2 (Figura 3-3).
Luego de la aplicación de los tratamientos, las unidades experimentales se dejaron
a temperatura ambiente con humedad y alimentación constante. Se hicieron
observaciones a partir de las 24 horas y se registraron datos de mortalidad diarios
hasta ocho días después de la inoculación.
Los adultos muertos en el intervalo de 8 días de observación fueron sumergidos
durante cinco minutos en hipoclorito de sodio al 0,5% y lavados cuatro veces con
agua destilada estéril, el exceso de agua se retiró colocando los adultos en papel
filtro estéril.
Los individuos se colocaron en cámara húmeda y allí permanecieron hasta cuando
se observó crecimiento micelial. De los adultos que presentaron micelio se
tomaron cinco al azar con el fin de aislar el hongo, estos se transfirieron a medio
22
de cultivo PDA y cuando se obtuvieron colonias el hongo fue identificado para
confirmar su identidad.
Figura 3-3. Bioensayos con Lecanicillium sp y Metarhizium sp
3.6 Diseño experimental
3.6.1 Lecanicillium sp
Se utilizó un diseño completamente al azar, en el que los tratamientos fueron las
diferentes concentraciones (2,18x104; 2,18x105; 2,18x106; 2,18x107 y 2,18x108
conidios/ml) y el testigo se trató con agua destilada estéril. Los individuos escogidos para
cada ensayo se encontraban en condiciones similares, es decir, presentaban
comportamiento y características morfológicas similares. Se realizaron cinco repeticiones
para cada tratamiento y las unidades experimentales fueron 10 adultos de trips para cada
una.
3.6.2 Metarhizium sp
El mismo diseño se empleó para Metarhizium sp y los tratamientos fueron las diferentes
concentraciones: 2,20x104; 2,20x105; 2,20x106; 2,20x107 y 2,20x108 conidios/ml.
Bioensayo 1 Bioensayo 2
23
3.7 Análisis de los datos
Se realizó un análisis de varianza para evaluar el efecto de los tratamientos en la
mortalidad y la prueba de Duncan para realizar las comparaciones múltiples entre los
tratamientos (P ≤ 0.05). Previamente, se verificó la distribución normal de los residuales y
la homogeneidad de varianzas de los datos a través de las pruebas de Shapiro-Wilk y
Levene, respectivamente. Para éstos análisis se usó el paquete estadístico SAS versión
9.1 y los datos de mortalidad fueron manejados como proporciones.
Se usó el software STATGRAPHICS Centrurion XVI (versión 16.1.15) para calcular el
tiempo letal medio (TL50) y la concentración letal media (CL50) por el método Próbit, este
método genera un ajuste de la línea de mortalidad obtenida a una línea recta, con ayuda
de una regresión lineal. Adicionalmente, el porcentaje de mortalidad fue corregido con el
uso de la fórmula de Abbott (Pérez et al., 2010):
3.8 Identificación molecular de hongos entomopatógenos
Los aislamientos obtenidos a partir de trips e identificados taxonómicamente como
Lecanicillium sp y Metarhizium sp se identificaron molecularmente con el fin de corroborar
su identidad. Además, dos de los aislamientos obtenidos a partir de adultos de
Frankliniella spp infectados en las pruebas de patogenicidad también fueron identificados
por métodos moleculares para confirmar la veracidad de las pruebas (uno para la prueba
con Lecanicillium sp y otro para la prueba con Metarhizium sp). Se extrajo el DNA a partir
de micelio y se sometió a reacciones de PCR para amplificar las secuencias de
transcripción interna de los genes ribosomales. Se realizó la secuenciación de productos
de PCR amplificados para confirmar los patrones obtenidos y la homología con otras
secuencias reportadas en el banco de genes del Centro Nacional de Información
Biotecnológica (NCBI).
Se realizó la amplificación del espaciador interno ITS de la región del DNA ribosomal
utilizando los primers universales ITS1 (5‟TCCGTAGGTGAACCTGCGG3') e ITS4
(5‟TCCTCCGCTTATTGATATGC3'). Los hongos se sembraron en caldo Sabouraud
24
(MERCK®) por 12 días a temperatura ambiente (22-26°C), se filtró el contenido y el
micelio colectado se maceró en nitrógeno líquido. La extracción de DNA se hizo por el
método CTAB (Weising et al., 1991) siguiendo el protocolo descrito a continuación:
1. Los hongos sembrados en medio líquido se filtraron para separar el medio de cultivo
del micelio.
2. Los micelios se sumergieron en nitrógeno líquido, luego se llevaron a un mortero y se
maceraron igualmente con nitrógeno líquido.
3. Se adicionaron 700 µl de CTAB 2X (caliente) y 4 µl de β-mercaptoetanol por muestra
en cámara de extracción.
4. Las muestras se incubaron a 65°C por 45 minutos y se agitó periódicamente.
5. Se adicionaron 700 µl de Cloroformo Alcohol Isoamílico 24:1, se homogenizó y se
centrifugó a 12.000 rpm durante 20 minutos.
6. El sobrenadante se recuperó y se pasó a un tubo nuevo, luego, se adicionó un
volumen de cloroformo (700 µl) y se centrifugó a 12.000 rpm por 20 minutos.
7. Se recuperó el sobrenadante y se pasó a un tubo nuevo. NOTA: este paso se puede
repetir según la pureza del sobrenadante (en caso de estar muy turbio y pegajoso).
8. Se adicionó un volumen de Isopropanol (precipita el DNA) y se llevó por 1 hora a -
20°C.
9. Se centrifugó a 12.000 rpm durante 20 minutos. (se observó el pellet) y se eliminó el
sobrenadante.
10. Se lavó el pellet con 200 µl de etanol al 70% y se centrifugó a 12.000 rpm por 10
minutos y se eliminó el sobrenadante.
11. Se repitió el paso anterior pero con etanol al 90%.
12. Se adicionaron 50µ de agua MilliQ
13. Se agregó 1µl RNasa/ 100µ muestra y se incubó por 1 hora a 37°C.
14. Después de transcurrido este tiempo las muestras se almacenaron a -20°C hasta el
corrido en el gel de electroforesis.
El ADN ribosomal se amplificó mediante una PCR en 30 µl de mezcla de reacción que
contenía 3 µl de buffer de Taq polimerasa (10X) (Thermo Scientific), 1.8 µl de MgCl2 (25
mM) (Thermo Scientific), 0.6 µl de dNTPs (10 µM) (Thermo Scientific), 0.6 µl de cada
primer (10 µM), 0.6 µl del primer ITS4 (5‟TCCTCCGCTTATTGATATGC3') (10 µM)
25
(Biodiagnóstica Ltda), 0.6 µl de Taq ADN polimerasa (Thermo Scientific), 21.3 µl de agua
MilliQ y 1.5 µl de ADN (50-100 ng/ µl).
Las condiciones de PCR fueron las descritas por Rueda et al., (2013) donde se realizó un
ciclo inicial de 94°C por 5 minutos, seguido de 30 ciclos a 94°C por 1 minuto, 50°C por 1
minuto y 72°C por un minuto, y un ciclo de extensión final de 72°C por 5 minutos. Los
productos de amplificación se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se
visualizaron con con GelRed™ (Biotium) en un transiluminador UV. Posteriormente, se
realizó la secuenciación de amplicones a través de la empresa Macrogen (Seoul, Korea) y
las secuencias obtenidas fueron sometidas a BLAST (National Centre for Biotechnology
Information) con el fin de confirmar la identidad de los aislamientos.
26
4 Resultados
4.1 Clasificación taxonómica de trips
Se identificaron 192 trips colectados en cultivos comerciales de aguacate del Oriente
antioqueño de las variedades Hass, Reed y Fuerte. Siguiendo las claves taxonómicas de
Mound & Kibby (1998) estos insectos se clasificaron dentro de tres géneros: Scirtothrips
spp, Frankliniella spp y Heliothrips spp (Figura 4-1).
El género más frecuente fue Frankliniella spp con un porcentaje de 63.54%, seguido del
género Scirtothrips spp con 35.94% y el género Heliothrips spp con 0.52%,
adicionalmente, del total de la población de trips identificada 188 eran hembras y solo 4
eran machos, representando el 97.92% y el 2.08%, respectivamente.
Figura 4-1: (A): Frankliniella spp (4X), (B): Heliothrips spp (10X), (C): Scirtothrips spp,
(4X)
(A) (B)
(C)
27
El género Frankliniella spp tiene algunas especies catalogadas como cuarentenarias y
otras especies se conocen como fitófagas asociadas al cultivo de aguacate, las cuales
pueden ocasionar daños al follaje y frutos. Frankliniella spp fue el género más frecuente
en este estudio y se encontró asociado a las tres variedades de aguacate (Hass, Reed y
Fuerte), por lo que para las pruebas de patogenicidad con Lecanicillium sp y Metarhizium
sp se usaron adultos de trips pertenecientes a este género. Los adultos de Frankliniella
spp pueden ser de color amarillo, café o ambos. Tienen ocho segmentos antenales, el
segmento III y IV tiene sensorio bifurcado. La cabeza es más ancha que larga, tiene tres
ocelos presentes y tres pares de setas ocelares. Pronoto con un par de setas antero-
angular, un par de setas antero-medial, dos pares de setas largas en postero-angular, con
usualmente cinco pares de setas postero-marginal. Ala anterior con dos filas de setas
venales regularmente distribuidas. Tarso con dos segmentos. Terguito VIII postero-
marginal con peine completo y ctenidia localizada antero-lateralmente al espiráculo
(Hoddle, Mound, & Paris, 2012).
4.2 Identificación taxonómica de aislamientos
Se obtuvieron 207 aislamientos fúngicos a partir de trips colectados en cultivos de
aguacate del Oriente antioqueño de las variedades Hass, Reed y Fuerte. Siguiendo las
claves taxonómicas de Carmichael et al., (1980) estos aislamientos se identificaron y
clasificaron dentro de ocho géneros: Cladosporium sp, Fusarium sp, Penicillium sp, Mucor
sp, Cylindrocarpon sp, Botrytis sp, Metarhizium sp y Lecanicillium sp (Tabla 4-1).
Tabla 4-1: Características morfológicas de los géneros asociados a trips
Género Características morfológica
Cladosporium sp
Las colonias son planas, aterciopeladas, de color carmelita
oscuro un poco más clara hacia la periferia, formadas por micelio
de hifas gruesas septadas y oscuras. Presentan conidióforos con
conidios ovoides sobre las cuales se ven dos sitios donde se
encuentran dos conidios (Guzmán, 1977).
Fusarium sp
Crece dando una colonia blanca la cual produce un pigmento
color vino que gradualmente se difunde en el medio. El micelio
está formado por hifas septadas y los conidióforos presentan
racimos de macroconidios. Se observan también clamidosporas y
microconidios (Guzmán, 1977).
Penicillium sp
De crecimiento rápido dando colonias blancas aterciopeladas
inicialmente, las cuales se cubren con los esporos y van tomando
diferentes colores según la especie; al final quedan
28
completamente cubiertas de esporos con un aspecto
pulverulento. La colonia está constituida por micelio de hifas
delgadas septadas. El verticillum es fundamental en la
clasificación del hongo, así pueden clasificarse en cuatro grandes
grupos: monoverticilata, asimétrica, biverticilata-simétrica y
poliverticillata (Guzmán, 1977).
Mucor sp
Las colonias son de color crema grisáceo a amarillo café pálido,
de tipo algodonoso, alcanzan un diámetro de 6-9 cm en 7 días a
25°C. Crecimiento aéreo abundante compuesto de largos y
cortos esporangioforos. Reverso incoloro, no presenta exudación.
Esporangióforos hialinos-café, de paredes con finas
incrustaciones. Tallos largos sin ramificar y tallos largos
ramificados de forma simpodial que en ocasiones se curvan hacia
abajo (Arias & Piñeros, 2008).
Cylindrocarpon sp
Micelio flocoso de aspecto aterciopelado, inicialmente de color
beige para posteriormente adquirir una coloración café rojiza. Al
reverso de las colonias con tonalidades desde el beige al café
oscuro. Células conidiógenas abundantes cilíndricas, derechas,
que se adelgazan hacia el ápice, monofialídicas, en verticilios o
dispuestas en forma irregular. Microconidios lisos, elipsoides a
cilíndricos. Macroconidios en esporodoquios, lisos, rectos a
levemente curvos, cilíndricos, con ápices obtusos y una base de
inserción ligeramente protuberante (Besoain & Piontelli, 1999).
Botrytis sp
Colonias con micelio blanco, denso, piloso que posteriormente se
torna gris. Hifas septadas, hialinas y ramificadas de manera
irregular o dicotómica. Conidióforos septados, macronematosos
que nacen del micelio sin formar una estructura especializada. El
ápice de cada conidióforo finaliza en una ampolla donde se
desarrollan conidios, solitarios, unicelulares, lisos, globosos,
sobre cortas lenticelas (Farrera, Zambrano, & Ortiz, 2007).
Metarhizium sp
Colonias blancas y algodonosas al inicio que se tornan amarillo
verdoso y finalmente verde olivo oscuro y costroso con zonas con
micelio aéreo abundante blanquecino. Reverso amarillo intenso.
Conidióforo con verticilos de 2-3 ramas cada uno, con tonos
verde olivo oscuro que aclara al ápice. Conidios subhialinos a
verdes, cilíndricos a elipsoidales (Claro, Ramos, & Pérez, 2006).
Lecanicillium sp
Presenta colonias ramificadas blancas a amarillo pálido,
algodonosas, algo incoloras en el reverso de las placas, con el
micelio más bien rastrero. Las hifas son finas, septadas e
hialinas. Los conidióforos son sencillos o verticilados que
terminan portando los conidios incoloros o blancos cuando están
en masas, cilíndricas a algo elipsoidales, las que se agrupan en
cabezuelas en forma de globos (Cabrera, Hernández, López,
González, & Domínguez, 2012).
29
Los géneros encontrados con mayor frecuencia fueron Cladosporium sp, Fusarium sp y
Penicillium sp y aunque menos frecuentes se identificaron dos aislamientos como
Metarhizium sp y Lecanicillium sp y merecen especial consideración ya que han sido
ampliamente reportados en la literatura como hongos con capacidad entomopatógena
(Figura 4-2).
Figura 4-2: Porcentaje de incidencia de los géneros aislados a partir de trips colectados
en cultivos de aguacate del Oriente antioqueño.
En el presente estudio se identificaron hongos saprófitos, patógenos y entomopatógenos.
Los hongos pertenecientes a los géneros Cladosporium sp, Penicillium sp y Mucor sp se
conocen como saprófitos sobre vegetación o sobre el suelo y representaron el 28.99,
20.29 y el 10.63% del total de aislamientos obtenidos a partir de trips, respectivamente.
Por su parte, la mayoría de los hongos dentro de los géneros Fusarium sp,
Cylindrocarpon sp y Botrytis sp, se encuentran comúnmente en plantas vivas o muertas
como patógenos y correspondieron al 25.60, 7.25 y 6.28% de los aislamientos obtenidos,
respectivamente.
Finalmente, se identificaron dos aislamientos asociados a trips colectados en aguacate cv.
Hass, que se clasificaron dentro de los géneros Metarhizium sp y Lecanicillium sp (Figura
4-3), los cuales son hongos entomopatógenos que se han reportado por diversos autores,
quienes señalan algunas especies dentro de estos géneros como agentes biológicos con
30
buena capacidad para controlar eficientemente una gran variedad de plagas de interés
agrícola (Charnley & Collins, 2007; Gouli et al., 2008; Hall, 1981; Shahid, Rao, Bakhsh, &
Husnain, 2012), estos géneros representaron solo el 0.96% del total de aislamientos
obtenidos, sin embargo, al ser aislados a partir de este insecto, se convierten en
candidatos potenciales para ser usados como agentes de control biológico en cultivos de
aguacate, en especial para el control de trips de aguacate cv Hass, sugiriendo la
especificidad de estos aislamientos hacia el insecto.
Figura 4-3: Hongos entomopatógenos aislados a partir de trips. (A) Colonia de
Lecanicillium sp, (B) Conidióforo de Lecanicillium sp (100x), (C) Colonia de Metarhizium
sp, (D) Conidióforo de Metarhizium sp (100x)
4.3 Pruebas de patogenicidad
4.3.1 Patogenicidad de Lecanicillium sp sobre adultos de
Frankliniella spp
La patogenicidad obtenida con las diferentes concentraciones de Lecanicillium sp se
evaluó con base en el porcentaje de mortalidad ocho días después de la inoculación, el
tiempo letal medio (TL50) y la concentración letal media (CL50). Los análisis de varianza
(ANAVA) muestran que el aislamiento identificado como Lecanicillium sp tiene efecto
(C)
(A) (B)
(D)
31
patogénico sobre adultos de Frankliniella spp a las concentraciones evaluadas (2,18x104;
2,18x105; 2,18x106; 2,18x107; 2,18x108 conidios/ml) con valores P = <0.0001 para los
ensayos 1 y 2 (Anexo A).
Una vez realizada la prueba Duncan se encontró que las medias de los tratamientos
fueron significativamente diferentes en ambos bioensayos, excepto, entre el control y la
concentración más baja evaluada (2,18x104 conidios/ml) en el bioensayo uno y entre las
concentraciones de 2,18x107 y 2,18x108 conidios/ml en los dos bioensayos (Anexo B).
Esto confirma que Lecanicillium sp causa patogenicidad sobre adultos de Frankliniella spp
a las diferentes concentraciones suministradas y se evidencia una relación directa entre la
concentración del inóculo y el porcentaje de mortalidad (Figura 4-4).
Figura 4-4: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp ocho días después de la inoculación con
diferentes concentraciones de Lecanicillium sp. Valores con la misma letra no presentan
diferencias significativas según la prueba Duncan (P ≤ 0.05). Las barras representan el error
estándar.
La mortalidad corregida para las diferentes concentraciones de Lecanicillium sp fluctuó de
10.81 a 100% para el bioensayo uno y entre 16.22 - 100% para el bioensayo dos.
Adicionalmente, para ambos ensayos el porcentaje de mortalidad en los controles fue del
26% y la concentración de 2,18x108 conidios/ml causó porcentajes de mortalidad del
100% (Tabla 4-2).
32
Tabla 4-2: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp causado por diferentes
concentraciones de Lecanicillium sp, ocho días después de la inoculación
Concentración (conidios/ml)
No. de insectos tratados
No. de insectos muertos
Mortalidad (%)
Mortalidad corregida (%)
Lec 1 y Lec 2 Lec 1 y Lec 2 Lec 1 Lec 2 Lec 1 Lec 2 Lec 1 Lec 2
Control 50 13 13 26 26 0 0
2,18X104 50 17 19 34 38 10.81 16.22
2,18X105 50 24 27 48 54 29.73 37.84
2,18X106 50 37 39 74 78 64.86 70.27
2,18X107 50 44 46 88 92 83.78 89.19
2,18X108 50 50 50 100 100 100 100
* Lec 1. Bioensayo 1 para Lecanicillium sp. ** Lec 2. Bioensayo 2 para Lecanicillium sp.
4.3.2 Patogenicidad de Metarhizium sp sobre adultos de
Frankliniella spp
La patogenicidad obtenida con las diferentes concentraciones de Metarhizium sp se
evaluó con base en el porcentaje de mortalidad ocho días después de la inoculación, el
tiempo letal medio (TL50) y la concentración letal media (CL50). Como se puede observar
en los análisis de varianza, Metarhizium sp causa patogenicidad sobre adultos de
Frankliniella spp en los bioensayos uno y dos (P1=<0.0001 y P2=<0.0001) a las diferentes
concentraciones evaluadas (2,20x104; 2,20x105; 2,20x106; 2,20x107; 2,20x108
conidios/ml) (Anexo C).
La diferencia entre las medias en los dos bioensayos (p1=<0.0001 y p2=<0.0001) mostró
diferencias significativas entre todas las concentraciones, excepto para las
concentraciones de 2,20x107 y 2,20x108 conidios/ml, destacándose el tratamiento
2,20x108 conidios/ml con una media de mortalidad más alta que los otros (Anexo D). La
concentración de 2,20x108 conidios/ml causó una mortalidad del 100% en ambos
bioensayos y no se observaron diferencias significativas con la concentración de 2,20x107
conidios/ml que causó una mortalidad del 92 y 96% en los bioensayos uno y dos,
respectivamente. Adicionalmente, se observa que la mortalidad en los tratamientos fue
directamente proporcional a la concentración de conidias suministrada (Figura 4-5).
33
Figura 4-5: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp ocho días después de la inoculación con
diferentes concentraciones de Metarhizium sp. Valores con la misma letra no presentan diferencias
significativas según la prueba Duncan (P ≤ 0.05). Las barras representan el error estándar.
Para las diferentes concentraciones evaluadas de Metarhizium sp, la mortalidad corregida
fluctuó de 27.03 a 100% para el bioensayo uno y entre 30.56 - 100% para el bioensayo
dos. Adicionalmente, para ambos ensayos la concentración de 2,20x108 conidios/ml
causó una mortalidad del 100% y el porcentaje de mortalidad en los controles estuvo por
debajo del 28% (Tabla 4-3).
Tabla 4-3: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp causado por diferentes
concentraciones de Metarhizium sp, ocho días después de la inoculación
Concentración (conidios/ml)
No. de insectos tratados
No. de insectos muertos
Mortalidad (%)
Mortalidad corregida (%)
Met 1 y Met 2 Met 1 y Met 2 Met 1 Met 2 Met 1 Met 2 Met 1 Met 2
Control 50 13 14 26 28 0 0
2,20X104 50 23 25 46 50 27.03 30.56
2,20X105 50 34 31 68 62 56.76 47.22
2,20X106 50 39 40 78 80 70.27 72.22
2,20X107 50 46 48 92 96 89.19 94.44
2,20X108 50 50 50 100 100 100 100
* Met 1. Bioensayo 1 para Metarhizium sp. ** Met 2. Bioensayo 1 para Metarhizium sp.
34
4.3.3 Concentración Letal 50 y Tiempo Letal 50
La estimación de la CL50 para Lecanicillium sp sobre adultos de Frankliniella spp permitió
determinar que a concentraciones de 1.69x105 y 1.02x105 conidios/ml muere el 50% de la
población evaluada en los bioensayos uno y dos, respectivamente. El tiempo letal (TL50)
de Lecanicillium sp para el bioensayo uno fue de 2.4 días y en el bioensayo dos este
disminuyó a 2 días, para la concentración de 2,18x108 conidios/ml (Figura 4-6).
Figura 4-6: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp después de la inoculación con diferentes concentraciones de Lecanicillium sp según el método Próbit. (A) Bioensayo 1, (B) Bioensayo 2
(A)
(B)
35
Para los ensayos de inoculación de adultos con Metarhizium sp se determinó la CL50 y se
encontró que concentraciones 3.91x104 y 3.92x104 conidios/ml pueden matar el 50% de la
población analizada bajo condiciones de laboratorio (Bioensayos 1 y 2). El tiempo letal
(TL50) fue de 2.8 días y 2.6 días para la concentración más alta (2,20x108 conidios/ml) en
los bioensayos uno y dos, respectivamente (Figura 4-7).
Figura 4-7: Porcentaje de mortalidad de Frankliniella spp después de la inoculación con diferentes concentraciones de Metarhizium sp según el método Próbit. (A) Bioensayo 1, (B) Bioensayo 2
(A)
(B)
36
El aislamiento identificado como Lecanicillium sp presentó valores de TL50 (2 - 2.4 días)
menores en comparación a los obtenidos con Metarhizium sp (2.6 - 2.8 días), además, al
determinar la CL50 se observó que concentraciones entre 1.02x105 y 1.69x105 conidios/ml
causaron la muerte del 50% de la población de trips evaluada, estos valores sugieren que
Lecanicillium sp es patogénico y altamente promisorio para el control de adultos de
Frankliniella spp en campo. Si se comparan estos resultados con los de autores como
Ekesi et al., (1998) y Zahn & Morse (2013), quienes mencionaron que aislamientos de
Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae evaluados sobre adultos de Megalurothrips
sjostedti y Scirtothrips perseae tuvieron un rango de CL50 que varió entre 1.3x106 y
1.1x107 conidios/ml y valores de TL50 de 2.4 a 8.4 días, podría sugerirse la especificidad
de Lecanicillium sp hacia adultos de Frankliniella spp de aguacate al ser aislamientos
obtenidos a partir del mismo insecto.
4.3.4 Capacidad de esporulación de Lecanicillium sp y
Metarhizium sp
Los cadáveres de Frankliniella spp tratados con Lecanicillium sp se sometieron a cámara
húmeda y dos días después se registró producción de micelio. Las hifas del hongo
terminaron su etapa de colonización y extrusión, perforando las partes intersegmentales
del exoesqueleto de los trips, la salida del hongo se observó especialmente por las
antenas, cabeza y pronoto; y a medida que las hifas fúngicas siguieron creciendo en el
cuerpo de los trips se dio la momificación y posteriormente apareció una esporulación
blanquecina sobre los insectos. Sin embargo, a diferencia de Metarhizium sp, el micelio
emergió en pocas cantidades y el proceso de infección total del insecto por parte del
hongo, se dio en mayor tiempo, con menor producción de esporas (Figura 4-8).
37
Figura 4-8: Finalización del ciclo infeccioso de Lecanicillium sp sobre adultos de
Frankliniella spp
Para los ensayos realizados con las diferentes concentraciones de Metarhizium sp y una
vez los cadáveres se sometieron a cámara húmeda, el hongo tardó hasta 4 días en
emerger, sin embargo, se dio salida mínima del micelio a partir del segundo día. Las hifas
del hongo salieron, al igual que para Lecanicillium sp, perforando las partes
intersegmentales del exoesqueleto de los trips y la salida del hongo se observó
específicamente por las antenas, cabeza y pronoto. En todas las cámaras húmedas
donde se registró presencia del hongo sobre el insecto se observó un crecimiento micelial
blanco sobre el cuerpo, seguido por una esporulación abundante de color verde aceituna
(Figura 4-9).
|
Figura 4-9: Finalización del ciclo infeccioso de Metarhizium sp sobre adultos de
Frankliniella spp
38
4.4 Identificación molecular de aislamientos con
capacidad entomopatógena
La visualización de los amplicones y el éxito de la PCR se verificaron con una
electroforesis en gel de agarosa al 1% (Figura 4-10) donde se generaron fragmentos del
tamaño esperado de aproximadamente 550-650 pares de bases (pb). Luego de revelar el
gel de electroforesis se realizó la secuenciación de los productos de PCR a través de un
servicio proporcionado por la empresa Macrogen (Seoul, Korea).
Figura 4-10: Amplificación de productos de PCR del gen ITS (550-650 pb). MP: Marcador de Peso Molecular. 1: Lecanicillium sp aislado a partir de trips colectados en campo. 2: Aislamiento recuperado a partir de los bioensayos con Lecanicillium sp. 3: Metarhizium sp aislado a partir de trips colectados en campo. 4: Aislamiento recuperado a partir de los bioensayos con Metarhizium sp. C+: Colletotrichum sp. C-: Control Negativo.
Una vez obtenidas las secuencias completas, fueron depuradas cortando los segmentos
de mala calidad usando el programa Geneious versión 5.4 (Drummond, 2011), seguido
por el ensamble de los reads, obteniendo las secuencias consenso para cada muestra
(Anexo E). Por último, dichas secuencias fueron sometidas a BLAST (NCBI) el cual
mostró un porcentaje de identidad del 100% y un E value de 0.0 con la accesión No.
KC007329.1 (Bonito, Hameed, Krishnan, & Schadt, 2012) que corresponde a
Lecanicillium sp (Figura 4-11). Igualmente, se obtuvo un porcentaje de identidad del 100%
y un E value de 0.0 con la accesión No. FJ545279.1 (Freed & Jin, 2011) que corresponde
a Metarhizium anisopliae (Figura 4-12). Adicionalmente, los hongos recuperados de los
bioensayos fueron así mismo identificados por métodos moleculares, arrojando los
mismos resultados (Tabla 4-4).
39
Figura 4-11: Alineamiento de Lecanicillium sp aislado a partir de trips con la accesión del
GenBank: KC007329.1.
Figura 4-12: Alineamiento de Metarhizium sp aislado a partir de trips con la accesión del
GenBank: FJ545279.1.
40
Tabla 4-4: Identidad de los aislamientos obtenidos a partir de trips basado en la
amplificación del espacio interno ITS de la región del DNA ribosomal, según BLAST en
NCBI
Muestra Tamaño de
fragmento (pb) BLAST
Número de
accesión
Porcentaje de
identidad E value
1 550-650 Lecanicillium sp KC007329.1 100 0.0
2 550-650 Lecanicillium sp AB378528.1 100 0.0
3 550-650 Metarhizium
anisopliae FJ545279.1 100 0.0
4 550-650 Metarhizium
anisopliae FJ545279.1 99 0.0
41
5 Discusión
El aguacate Persea americana Miller pertenece a la familia de las Lauraceas, su
composición genética ha determinado la formación de tres razas: la Mexicana, la
Guatemalteca y la Antillana, de estas tres razas se derivan variedades adaptadas a cada
condición de cultivo, dando frutos con sabores, texturas, colores y olores variados (Bernal
et al., 2008). El aguacate es un producto de gran interés en el mercado mundial,
especialmente la variedad Hass, debido a los diversos atributos nutracéuticos y
sensoriales que posee, especialmente los relacionados con el alto contenido de aceite y
por la presencia de nutrimentos como vitaminas, ácido fólico, biotina, etc, que le confieren
propiedades benéficas para la salud humana, principalmente en la prevención de
enfermedades del sistema circulatorio (Gómez, 2014).
Colombia tiene posibilidades de participar en el escenario internacional del mercado del
aguacate. La producción mundial de aguacate está estimada en 4 millones de toneladas
al año, provenientes de 407.000 hectáreas sembradas. El mercado mundial requiere de 8
millones de toneladas aproximadamente, déficit que se constituye en una oportunidad
para que Colombia pueda entrar con oferta de esta fruta al mercado externo. En el año
2013, Colombia contaba con más de 30.000 hectáreas de aguacate, con una producción
de aproximadamente 203.958 toneladas, que lo ubica como el quinto mayor productor a
nivel mundial (FAO, 2013). Dadas las inmensas posibilidades en el mercado mundial, se
ha dado un gran impulso al sistema de producción tipo exportación, el cual está dirigido al
aguacate Hass, con aproximadamente 8.800 hectáreas en producción en el país, de las
cuales se estima que 3.000 hectáreas, están cultivadas en el departamento de Antioquia
(Gómez, 2014).
Pese a este promisorio panorama y a las postuladas ventajas estratégicas que tiene
Colombia para la exportación de aguacate por oferta ambiental, existen factores que
limitan la competitividad del cultivo con respecto a los demás países productores. Los
problemas de tipo sanitario, entre los que sobresalen las enfermedades ocasionadas por
42
hongos patógenos y el ataque de insectos plaga, particularmente los trips, hacen
indispensable la búsqueda de soluciones para responder al reto de la competitividad y
exigencias del mercado. Los trips hacen parte del 10% de los insectos que son
considerados plagas dentro de los 2.5 millones existentes y han sido reconocidos como
plagas de importancia económica en cítricos (Lewis, 1997) y causan graves pérdidas en
aguacate (Bernal et al., 2009).
En el mundo hay descritas alrededor de 5.500 especies de trips en aproximadamente 750
géneros y 9 familias. El suborden Terebrantia comprende ocho de las nueve familias,
incluyendo la familia Thripidae; mientras que el suborden Tubulífera comprende una única
familia, Phlaeothripidae. De todas las especies de trips descritas, el 1% es considerado
perjudicial (Porres, 2008). La familia Thripidae pertenece al orden Thysanoptera y es la de
mayor importancia económica en el cultivo de aguacate ya que en ella se encuentran las
principales especies de trips que causan las lesiones en el fruto. De esta familia es
posible encontrar 1.700 especies en 260 géneros (Mound & Marullo, 1994) y dentro de los
géneros asociados al cultivo de aguacate como perjudiciales cabe mencionar a
Frankliniella spp, Scirtothrips spp, Neohydatothrips spp y Trips spp (Nolasco, 2004).
En México, se conocen alrededor de 33 especies de trips fitófagas asociadas al cultivo de
aguacate, que pueden ocasionar daños al follaje y frutos, siendo los principales géneros
Scirtotrips spp, Neohydatotrips spp y Flankliniella spp (Téliz & Mora, 2000). En Costa Rica
se ha encontrado un complejo variable de trips como plaga asociados al cultivo de
aguacate y en estudios realizados por Martínez et al., (2011) en la zona de Los Santos, se
encontraron tres géneros de trips fitófagos en orden de abundancia Scirtothrips spp,
Frankiniella spp y Neohydatothrips spp. Estos reportes coinciden con los resultados
obtenidos en este estudio, donde se encontraron dos de los géneros que han sido
reportados en México y Costa Rica como fitófagos asociados a trips colectados en
cultivos de aguacate del Oriente antioqueño, siendo Frankliniella spp el de mayor
incidencia con un porcentaje de 63.54%, seguido del género Scirtothrips spp con un
35.94%.
El manejo tradicional que se le ha dado a los trips comprende la aplicación de insecticidas
químicos, sin embargo, dada la tendencia de este insecto para desarrollar resistencia y
las crecientes restricciones que se imponen al uso de pesticidas, es poco acertado
43
depender solo de esta estrategia de control (Parrella & Nicholls, 1996). El uso de hongos
entomopatógenos para el control de plagas ha sido conocido durante mucho tiempo
(Charnley & Collins, 2007; Gouli et al., 2008; Hall, 1981; Shahid et al., 2012), estos
enemigos naturales son considerados como los patógenos más promisorios contra
diversos insectos ya que los pueden infectar directamente a través de la penetración de la
cutícula (Hajek & Leger, 1994), además, reducen el riesgo de causar efectos negativos en
el ambiente y en los seres humanos (Cañedo & Ames, 2004). A nivel mundial, los dos
hongos más estudiados como biocontroladores de insectos son: Beauveria bassiana y
Metarhizium anisopliae, debido a su eficiencia y facilidad de multiplicación (Lagos, 2007),
sin embargo, hay aún mucho trabajo por hacer para tener bioplaguicidas eficientes
basados en hongos, siendo el primer paso el aislamiento, caracterización y multiplicación
de estos microorganismos.
En el presente estudio se aislaron hongos a partir de trips colectados en cultivos
comerciales de aguacate del Oriente antioqueño, los cuales se identificaron y se
clasificaron dentro de ocho géneros: Cladosporium sp, Fusarium sp, Penicillium sp, Mucor
sp, Cylindrocarpon sp, Botrytis sp, Metarhizium sp y Lecanicillium sp. Se dice que algunas
especies del género Cladosporium sp son saprófitos de plantas en descomposición,
textiles, cuero, caucho y madera, además, este hongo es parásito de plantas,
especialmente de gramíneas y sus conidios se encuentran frecuentemente en el aire
haciendo que sus esporas se dispersen por el ambiente con mucha facilidad (Reyes,
2015). Las especies de Mucor sp y Penicillium sp, se encuentran en el suelo, plantas,
frutas y vegetales en descomposición. Son los hongos más ubicuos en la naturaleza y son
contaminantes comunes de laboratorio, asimismo, en algunas ocasiones se ha dicho que
Mucor sp puede causar infecciones en el hombre y animales. (Cooper & Haycocks, 2000;
Hernández et al., 2003; Pérez & Carrasco, 2000).
Los hongos pertenecientes a los géneros Fusarium sp, Cylindrocarpon sp y Botrytis sp,
son considerados patógenos de plantas. El género Cylindrocarpon sp contiene
aproximadamente 125 especies descritas, tiene una amplia gama de huéspedes y es
patógeno de raíces de muchas plantas herbáceas, leñosas, agrícolas y plantas de vivero.
Este género es de gran importancia ya que ha sido reportado como agente causal de la
enfermedad “black-foot” en vid (Vitis labrusca) (Halleen, Crous, & Petrin, 2003). Las
enfermedades causadas por las especies del género Botrytis sp aparecen de forma
44
primaria como una plaga de las flores y podredumbre de los frutos, además, de manchas
en las hojas y bulbos podridos en el campo y en productos almacenados, este hongo
induce muerte celular del hospedero y un decaimiento progresivo del tejido infectado de la
planta. Dentro del género Botrytis sp, la especie más importante es B. cinerea ya que es
patógeno de muchas especies vegetales, animales y bacterias, aunque su hospedador
económicamente más importante es la vid (Choquer et al., 2007).
Dentro del género Fusarium sp existen algunas especies de interés agrícola como
Fusarium oxysporum, causante de la marchitez en algodón, el mal de Panamá en el
banano y de la podredumbre basal en fríjol, asimismo, Fusarium solani es responsable de
la pudrición radicular de la yuca y de los tubérculos de la papa (Finch, sf). De igual
manera, Fusarium sp ha sido reportado como hongo entomopatógeno infectando broca
del café Hypothenemus hampei (Pérez, Posada & González, 1996) y se ha registrado
como patógeno de la termita subterránea Coptotermes formosanus (Chai, 1995). De
acuerdo a estos hallazgos, valdría la pena realizar pruebas para evaluar la patogenicidad
de los aislamientos de Fusarium sp sobre trips, sin embargo, ya que estos hongos se
consideran patógenos oportunistas al igual que Cylindrocarpon sp y Botrytis sp, no se
tuvieron en cuenta para los bioensayos realizados en esta investigación, igualmente, los
aislamientos dentro de los géneros Cladosporium sp, Mucor sp y Penicillium sp, los cuales
se aíslan con frecuencia al ser microorganismos saprofitos y la mayoría habitan de forma
natural en el suelo (Pfenning & de Abreu, sf).
Aunque se han encontrado pocas infecciones naturales de hongos entomopatógenos
sobre trips, en el presente estudio se obtuvieron dos aislamientos que fueron clasificados
dentro de los géneros Lecanicillium sp y Metarhizium sp los cuales son hongos
entomopatógenos que han sido reportados por diversos autores, quienes señalan algunas
especies como agentes biológicos con buena capacidad para controlar eficientemente
una gran variedad de plagas de interés agrícola (Charnley & Collins, 2007; Gouli et al.,
2008; Hall, 1981; Shahid et al., 2012). Estos géneros representaron solo el 0.96% del total
de aislamientos obtenidos a partir de trips colectados en cultivos de aguacate del Oriente
antioqueño, sin embargo, al ser aislados a partir de este insecto, se convierten en
candidatos potenciales para ser usados como agentes de control biológico en cultivos de
aguacate, en especial para el control de trips de aguacate cv Hass, sugiriendo la
especificidad de estos aislamientos hacia el insecto.
45
Algunos registros de hongos aislados a partir de trips incluyen a Neozygites parvispora
infectando Thrips palmi Karny en melones cultivados bajo invernadero (Tsutomu, Kubota,
& Shimazu, 1989). Igualmente, Verticillium lecanii que se aisló a partir de Thrips palmi
infestando pepinos (Visalakshy et al., 2004) y una especie no identificada del género
Hirsutella sp Patouillard fue encontrada en Trinidad, infectando aproximadamente el 80%
de poblaciones de Thrips palmi en campo (Hall, 1992). Otro hongo que ha resultado
eficiente en el control de trips es B. bassiana, considerado como uno de los hongos más
eficaces contra este insecto, en estudios realizados por Wang & Zheng (2012) se
encontró un nuevo aislamiento (B. bassiana-CYT5) que fue más infeccioso y letal en
comparación con otros aislamientos de B. bassiana, causando una mortalidad del 90% en
F. occidentalis seis días después de la inoculación.
Tanto Lecanicillium sp como Metarhizium sp han sido encontrados previamente en
condiciones naturales o de laboratorio asociados a trips. En trabajos realizados por
Gillespie (1986) se encontró que Thrips tabaci fue susceptible a M. anisopliae, B.
bassiana, Paecilomyces fumosoroseus y V. lecanii en estudios de laboratorio. Otros
reportes incluyen la presencia de V. lecanii (Zimm) Viégas infectando T. palmi en melones
bajo invernadero en Japón, donde la densidad de la población de la plaga se mantuvo en
niveles bajos, en comparación con los rápidos aumentos observados en un invernadero
sin tratar (Saito, sf). Además, en investigaciones realizadas por Vestergaard (1995) se
evaluó la patogenicidad de varios aislamientos de V. lecanii y M. anisopliae sobre
Frankliniella occidentalis encontrando que M. anisopliae fue más agresivo en comparación
con V. lecanii y en estudios más recientes, Ansari et al., (2007) reportaron que M.
anisopliae que fue más eficaz en matar pupas del Western Flower Thrips (F. occidentalis)
comparado con insecticidas químicos convencionales (Imidacloprid y fipronil) con
porcentajes de mortalidad del 70-90% frente al 20-50%.
Los porcentajes de mortalidad obtenidos en esta investigación cuando se evaluó
Metarhizium sp (2.20x108 conidios/ml) y Lecanicillium sp (2.18x108 conidios/ml) sobre
adultos de Frankliniella spp colectados en cultivos de aguacate, fueron del 100% en todos
los ensayos. El aislamiento identificado como Lecanicillium sp presentó valores de TL50 (2
- 2.4 días) menores en comparación a los obtenidos con Metarhizium sp (2.6 - 2.8 días),
además, al determinar la CL50 se observó que concentraciones entre 1.02x105 y 1.69x105
conidios/ml causaron la muerte del 50% de la población de trips evaluada, estos valores
46
sugieren que Lecanicillium sp es patogénico y altamente promisorio para el control de
adultos de Frankliniella spp en campo. Si se comparan estos resultados con los de
autores como Ekesi et al., (1998) y Zahn & Morse (2013), quienes mencionaron que
aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae evaluados sobre adultos de Megalurothrips
sjostedti y Scirtothrips perseae tuvieron un rango de CL50 que varió entre 1.3x106 y
1.1x107 conidios/ml y valores de TL50 de 2.4 a 8.4 días, podría sugerirse la especificidad
de Lecanicillium sp hacia adultos de Frankliniella spp de aguacate ya que el hecho de que
obtener aislamientos nativos puede tener un beneficio adicional si se compara con cepas
provenientes de muestras de suelo o de otros hospederos, puesto que estos aislamientos
han crecido y se han aislado a partir del insecto blanco y no son aislamientos que pueden
ser saprófitos o patógenos oportunistas, garantizando de esta manera su efecto
patogénico.
Del mismo modo, vale la pena mencionar el reporte de Orozco (2011) quien evaluó una
cepa comercial del hongo B. bassiana sobre adultos de Compsus n. sp. y luego inoculó
nuevos adultos con el hongo aislado a partir de individuos infectados en ese ensayo
(reinoculación), observando que el TL50 fue de 11.5 días y disminuyó a 8 días en el
ensayo de reinoculación. De acuerdo con esto se puede observar como la patogenicidad
está claramente relacionada con las cepas aisladas, ya que no todas poseen la misma
capacidad de llevar a cabo su ciclo infeccioso en un mismo hospedero generando
diferentes niveles de mortalidad e incluso disminuyendo su tiempo acción. Estos
resultados dan paso a nuevos estudios donde se pueda establecer si la pérdida de
patogenicidad está relacionada con el origen del aislamiento cuando se evalúa en otro
insecto diferente del que fue aislado y determinar si las relaciones de compatibilidad entre
el hospedero y el patógeno dependen de esto o están cambiando por otros factores.
Aunque la taxonomía clásica se utiliza extensivamente en la identificación de hongos, a
menudo es insuficiente para determinar las especies cuando se utiliza solo esta
herramienta, por lo que recientemente la secuenciación de genes ha sido usada para
complementar las descripciones morfológicas e identificar las cepas con mayor exactitud
(Petit & Gubler, 2005). En este caso se hizo la amplificación del espaciador interno ITS de
la región del DNA ribosomal con el fin de confirmar la identificación de Lecanicillium sp y
Metarhizium sp obtenida por taxonomía clásica. Cuando se amplificó la región ITS se
identificaron estos dos asilamientos con bandas ADN entre 550-650 pb, los alineamientos
47
con las secuencias obtenidas permitieron determinar un 100% de homología con la
accesión No. KC007329.1 (Bonito et al., 2012) que corresponde a Lecanicillium sp y con
la accesión No. FJ545279.1 (Freed & Jin, 2011) que corresponde a Metarhizium
anisopliae, estos estudios en conjunto con los obtenidos en las pruebas de patogenicidad,
fueron concluyentes para estos aislamientos, indicando el gran potencial que tienen para
cumplir su ciclo infectivo sobre el hospedero.
Los programas de Manejo Integrado de Plagas en los que se incluyen hongos
entomopatógenos comienzan con la selección de la cepa de fácil reproducción y alta
patogenicidad (Gongora, 2008), no obstante, en nuestro país a veces se toman medidas
apresuradas y se realizan planes de choque contra los insectos, que evitan conocer
realmente la viabilidad de los patógenos utilizados. Es por esto que este trabajo,
Lecanicillium sp y Metarhizium sp se estudiaron a rigor, se determinó su potencial para el
control de trips y se estableció que podrían ser incluidos en los planes de Manejo
Integrado de Plagas, lo que es consecuente con otras investigaciones sobre
patogenicidad que se han realizado con estos hongos en las cuales se ha comprobado su
efecto patogénico sobre poblaciones de trips, no obstante, es necesario investigar más
sobre su utilidad a nivel de campo, esperando obtener resultados satisfactorios en la
disminución de la plaga.
48
6 Conclusiones y recomendaciones
6.1 Conclusiones
Se resalta la importancia de haber identificado trips asociados a cultivos de aguacate del
Oriente antioqueño que pertenecen a los géneros Frankliniella spp y Scirtothrips spp,
dentro de los cuales se conocen especies fitófagas asociadas al cultivo de aguacate que
pueden ocasionar daños al follaje y frutos.
Se destaca el hallazgo de dos aislamientos identificados por características taxonómicas y
por métodos moleculares como Lecanicillium sp y Metarhizium anisopliae, los cuales han
sido ampliamente reportados como hongos entomopatógenos de plagas agrícolas de
importancia económica.
Las pruebas de patogenicidad con Lecanicillium sp y M. anisopliae realizadas bajo
condiciones de laboratorio sobre adultos de Frankliniella spp colectados en campo,
permitieron comprobar de manera confiable el potencial patogénico de ambos
aislamientos, evidenciando su eficacia y sugiriendo su especificidad hacia el insecto.
Estos resultados son una primera aproximación a la utilización de hongos
entomopatógenos para el control de trips en cultivos de aguacate del Oriente antioqueño y
representan un recurso potencial para desarrollar productos biológicos que puedan ser
articulados a programas de Manejo Integrado de Plagas específicamente para el control
de trips en el sistema productivo del aguacate.
6.2 Recomendaciones
Aunque las pruebas de laboratorio se hicieron sobre trips colectados en campo y esto
puede dar una aproximación a lo que sería el control de la plaga en condiciones naturales,
es necesario realizar ensayos a nivel de campo para comprobar el potencial de estos
49
aislamientos sobre este mismo insecto bajo diferentes factores bióticos y abióticos. Estas
aplicaciones podrían hacerse en el follaje para el control de adultos y ninfas, así como
aplicaciones al suelo que estén dirigidas a la interrupción del ciclo de vida del insecto ya
que allí se desarrollan los estados de pupa y prepupa de los trips.
El papel que desempeñan los depredadores dentro de los programas de control biológico
ha sido subestimado, sin embargo, en especies que tienen pocos enemigos naturales
como es el caso de los trips, se ha considerado a los depredadores como responsables
de regular las poblaciones de este tipo de insectos (DeBach & Castaños, 1982). En este
sentido, sería interesante realizar estudios donde se evalué la compatibilidad de los
aislamientos obtenidos en este estudio con los depredadores que se emplean para el
control de trips en campo.
Los trips son insectos que deben ser estudiados con más rigor a nivel de campo y
laboratorio, estos estudios permitirán establecer estrategias de manejo que faciliten al
agricultor la reducción de sus poblaciones a nivel de campo sin que se ocasionen
pérdidas económicas. Adicionalmente, existe la necesidad de realizar labores de
transferencia con los agricultores, de manera que estos puedan entender de una manera
sencilla las dinámicas con las que los profesionales trabajan y hacen sus
recomendaciones, además de entender su entorno agrícola como un ecosistema en el
que las relaciones entre sus componentes pueden ser grandes herramientas.
50
Anexos
Anexo A. Análisis de varianza para los tratamientos con Lecanicillium sp sobre
adultos de trips, incluyendo control (n=5). Datos manejados como proporciones.
SC CM F0 Pr>F
FV GL Lec 1 Lec 2 Lec 1 Lec 2 Lec 1 Lec 2 Lec 1 Lec 2
MODELO 5 2.270 2.247 0.454 0.449 46.96 99.85 <.0001 <.0001
ERROR 24 0.232 0.108 0.010 0.005
TOTAL 29 2.502 2.355
* Lec 1. Bioensayo 1 para Lecanicillium sp.
** Lec 2. Bioensayo 2 para Lecanicillium sp.
Anexo B. Comparaciones múltiples entre los tratamientos (P ≤ 0.05) mediante la
prueba Duncan para el hongo Lecanicillium sp sobre adultos de trips. n=5 para cada
tratamiento (P1=<0.0001 ; P2= <0.0001). Datos manejados como proporciones.
Tratamientos Lec 1 Lec 2
Control 0.26d 0.26
e
2,18X104 0.34
d 0.38
d
2,18X105 0.48
c 0.54
c
2,18X106 0.74
b 0.78
b
2,18X107 0.88
a 0.92
a
2,18X108 1.00
a 1.00
a
51
Anexo C. Análisis de varianza para los tratamientos con Metarhizium sp sobre
adultos de trips, incluyendo control (n=5). Datos manejados como proporciones.
SC CM F0 Pr>F
FV GL Met 1 Met 2 Met 1 Met 2 Met 1 Met 2 Met 1 Met 2
MODELO 5 1.974 1.951 0.395 0.390 87.72 137.69 <.0001 <.0001
ERROR 24 0.108 0.068 0.005 0.003
TOTAL 29 2.082 2.019
* Met 1. Bioensayo 1 para Metarhizium sp.
** Met 2. Bioensayo 1 para Metarhizium sp.
Anexo D. Comparaciones múltiples entre los tratamientos (P ≤ 0.05) mediante la
prueba Duncan para el hongo Metarhizium sp sobre adultos de trips. n=5 para cada
tratamiento (P1=<0.0001 ; P2= <0.0001). Datos manejados como proporciones.
Tratamientos Met 1 Met 2
Control 0.26e 0.28
e
2,20X104 0.46
d 0.50
d
2,20X105 0.68
c 0.62
c
2,20X106 0.78
b 0.80
b
2,20X107 0.92
a 0.96
a
2,20X108 1.00
a 1.00
a
52
Anexo E. Secuencias consenso obtenidas a partir de la amplificación del espaciador
interno ITS de la región del DNA ribosomal
MUESTRA SECUENCIA CONSENSO
1
TGTGAACATACCTACTGTTGCTTCGGCGTGCTCGCCCCGGCGTCCGGCTGGCCTCGTGCTGGTCGCGGCCCGGAACCAGGTGGCCGCCGGAGAAAACCAAAACTCTTTGTATTATCAGCTTCTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGGGAGCATTCTCCCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGATTTCCCTTTGGGGAAGTCGGCCGTTGGAGATCGGCAGCACTGCCGGCTCCCAAATACAGTGGCGACCCGCCGCGGGGACCCCTGCGTAGTAACTTACACTCGCA
CCGGAAACCAGACGTGTCACGCCGTAAAACCCCCAAC
2
GCGGAGGGATCATTACAGAGTTTACAACTCCCAAACCCAAATGTGAACATACCTACTGTTGCTTCGGCGTGCTCGCCCCGGCGTCCGGCTGGCCTCGTGCTGGTCGCGGCCCGGAACCAGGTGGCCGCCGGAGAAAACCAAAACTCTTTGTATTATCAGCTTCTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGGGAGCATTCTCCCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGATTTCCCTTTGGGGAAGTCGGCCGTTGGAGATCGGCAGCACTGCCGGCTCCCAAATACAGTGGCGACCCGCCGCGGGGACCCCTGCGTAGTAACTTACACTCGCACCGGAAACCAGACGTGTCACGCCGTAAAACCCCCAACTTTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAAT
ACCCGCTGAACTTAAGCATA
3
CCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTGAATTATACCTTTAATTGTTGCTTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTTCTGAGTGGTTAAAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGCCCCTCAAGTCCCCTGTGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTTTCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCCTCTGCGCAGTAGTAAAACACT
CGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGCCGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATAT
4
CGGAGGGATCATTACCGAGTTATCCAACTCCCAAACCCCTGTGAATTATACCTTTAATTGTTGCTTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTTCTGAGTGGTTAAAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGCCCCTCAAGTCCCCTGTGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTTTCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCCTCTGCGCAGTAGTAAAACACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGCCGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAGTTG
ACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCA
53
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