marcador molecular

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MARCADORES MARCADORES MOLECULARES. MOLECULARES. Katherine Zuñiga Morales. Katherine Zuñiga Morales. Ingrid Carolina Quintero. Ingrid Carolina Quintero. Leidy Angarita Bautista. Leidy Angarita Bautista. Hingrid Yurley Bautista. Hingrid Yurley Bautista. Edson Eduardo Ortega. Edson Eduardo Ortega.

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Page 1: marcador molecular

MARCADORES MARCADORES MOLECULARES.MOLECULARES.

Katherine Zuñiga Morales.Katherine Zuñiga Morales.Ingrid Carolina Quintero.Ingrid Carolina Quintero.Leidy Angarita Bautista.Leidy Angarita Bautista.Hingrid Yurley Bautista.Hingrid Yurley Bautista.Edson Eduardo Ortega.Edson Eduardo Ortega.

Page 2: marcador molecular

CONTENIDO.CONTENIDO.Marcador Genéticos: DescripciónMarcador Genéticos: Descripción

Marcadores MolecularesMarcadores Moleculares

1.1. Tecnologías basadas en ADN:Tecnologías basadas en ADN: RFLPRFLP

2.2. Tecnologías basadas en PCR:Tecnologías basadas en PCR: AFLPAFLP Microsatélites, SCAR, CAPS, Microsatélites, SCAR, CAPS,

ISSRISSR RAPD, DAF, AP-PCRRAPD, DAF, AP-PCR EST, matrices, DArT, SNPEST, matrices, DArT, SNP

Page 3: marcador molecular

Marcadores Marcadores Geneticos: Geneticos: Descripcion.Descripcion.

Los marcadores genéticos identifican en un Los marcadores genéticos identifican en un individuo las características del fenotipo, del individuo las características del fenotipo, del genotipo o de ambos.genotipo o de ambos.

El seguimiento de la herencia de los marcadores El seguimiento de la herencia de los marcadores puede realizarse de generación en generación.puede realizarse de generación en generación.

Page 4: marcador molecular

Marcadores Marcadores Geneticos:Geneticos:

1.1. Marcadores morfológicos.Marcadores morfológicos.

2.2. Marcadores proteicos (o bioquímicos).Marcadores proteicos (o bioquímicos).

3.3. Marcadores de ADN (o moleculares).Marcadores de ADN (o moleculares).

Tipos:Tipos:

Page 5: marcador molecular

1.1. Marcadores Marcadores Morfologicos.Morfologicos.

1.1. Ventajas:Ventajas:

Fácilmente disponibles.Fácilmente disponibles.

Su evaluación requiere, generalmente, de Su evaluación requiere, generalmente, de equipo sencillo.equipo sencillo.

Constituyen la medida más directa del Constituyen la medida más directa del fenotipo.fenotipo.

2.2. Desventajas:Desventajas:

Requieren un conocimiento práctico del Requieren un conocimiento práctico del cultivo o de la especie vegetal (o de ambos).cultivo o de la especie vegetal (o de ambos).

Están sujetos a influencias ambientales.Están sujetos a influencias ambientales.

Su número es limitado.Su número es limitado.

Page 6: marcador molecular

2.2. Marcadores Marcadores Proteicos Proteicos

(o bioquimicos).(o bioquimicos).Se basan en las propiedades de migración de las proteínas, Se basan en las propiedades de migración de las proteínas, las cuales permiten separarlas mediante electroforesis.las cuales permiten separarlas mediante electroforesis.

Se detectan mediante ensayos histoquímicos específicos.Se detectan mediante ensayos histoquímicos específicos.

1.1. Ventajas:Ventajas:Requieren de un equipo de Requieren de un equipo de laboratorio relativamente sencillo.laboratorio relativamente sencillo.

Son un valioso complemento de la Son un valioso complemento de la evaluación morfológica.evaluación morfológica.

2.2. Desventajas:Desventajas:Están sujetos a influencias Están sujetos a influencias ambientales.ambientales.Su número es limitadoSu número es limitado

Page 7: marcador molecular

2.2.Marcadores Marcadores de ADN de ADN

(o moleculares).(o moleculares).Funcionan como señaladores de diferentes Funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma. regiones del genoma.

Son ampliamente utilizados en genética humana, Son ampliamente utilizados en genética humana, vegetal, animal y microbiana. vegetal, animal y microbiana. Son polimorfismos detectados en la secuencia del Son polimorfismos detectados en la secuencia del ADN del núcleo o de los organelos.ADN del núcleo o de los organelos.

1.1. Ventajas:Ventajas:Su número es, potencialmente, Su número es, potencialmente, ilimitado.ilimitado.No están sujetos a influencias No están sujetos a influencias ambientales.ambientales.Son una medida objetiva de la Son una medida objetiva de la variación.variación.

2.2. DesventajaDesventaja Principal es que necesitan de un Principal es que necesitan de un

equipo equipo técnicamente más técnicamente más complejo.complejo.

Page 8: marcador molecular

Polimorfismo del Polimorfismo del ADN.ADN.

Son Diversos sucesos pueden causar variantes, más Son Diversos sucesos pueden causar variantes, más o menos complejas, en la secuencia de nucleótidos o menos complejas, en la secuencia de nucleótidos del ADN. Tales variantes se conocen como del ADN. Tales variantes se conocen como polimorfismos.polimorfismos.

El polimorfismo se manifiesta en diferencias del El polimorfismo se manifiesta en diferencias del genotipo lo que se demuestra en los diversos genotipo lo que se demuestra en los diversos perfiles de bandas que se detectan con un perfiles de bandas que se detectan con un procedimiento apropiado y quizás del fenotipo.procedimiento apropiado y quizás del fenotipo.

Varios sucesos pueden producir polimorfismos:Varios sucesos pueden producir polimorfismos:1.1. Mutaciones puntualesMutaciones puntuales

2.2. Inserciones o deleciones.Inserciones o deleciones.

3.3. Rearreglos.Rearreglos.

Page 9: marcador molecular

1.1.Mutaciones Mutaciones puntuales.puntuales.

Las mutaciones puntuales ocurren cuando una base Las mutaciones puntuales ocurren cuando una base de la secuencia del ADN es reemplazada por otra. de la secuencia del ADN es reemplazada por otra.

La longitud de la secuencia del ADN no cambia.La longitud de la secuencia del ADN no cambia.

AGTTAGCTGACTGATTTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC

AGTTAGCTGACTAGCCTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC

REEMPLAZO

Page 10: marcador molecular

2.2. Inserciones o Inserciones o delecciones.delecciones.

Son el resultado de la adición o la desaparición de varias Son el resultado de la adición o la desaparición de varias bases en la secuencia del ADN. La longitud de la molécula bases en la secuencia del ADN. La longitud de la molécula cambia.cambia.

AGTTAGCTGACTGATTTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC

AGTTAGCTGACTTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC

AGTTAGCTGACTGATTTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC

AGTTAGCTGACT GATTTCAAGCACTCTAGTTAACCGAGCC

AGCAT

DELECCIÓN

INSERCIÓN

Page 11: marcador molecular

3. Rearreglos.3. Rearreglos. Los reordenamientos cromosómicos ocurren Los reordenamientos cromosómicos ocurren

como resultado de la recombinación genética o como resultado de la recombinación genética o de la inserción de elementos transponibles. de la inserción de elementos transponibles.

La longitud de la molécula puede cambiar o La longitud de la molécula puede cambiar o quedar igual.quedar igual.

Page 12: marcador molecular

MarcadorMarcadores es

MolecularMoleculares.es.

Page 13: marcador molecular

Marcadores Marcadores Moleculares.Moleculares.

1.1. Tecnologias basadas en ADN:Tecnologias basadas en ADN:1.1. Polimorfismo de longitud de fragmentos de Polimorfismo de longitud de fragmentos de

restricción (RFLP).restricción (RFLP).

2.2. Tecnologias basadas en PCR:Tecnologias basadas en PCR:1.1. Polimorfismo de longitud de fragmentos Polimorfismo de longitud de fragmentos

amplificados (AFLP).amplificados (AFLP).2.2. Sitios de secuencia etiquetada Sitios de secuencia etiquetada

(Microsatélites, SCAR, CAPS, ISSR).(Microsatélites, SCAR, CAPS, ISSR).3.3. PCR con cebadores arbitrarios (RAPD, DAF, PCR con cebadores arbitrarios (RAPD, DAF,

AP-PCR).AP-PCR).4.4. Últimas estrategias (EST, matrices, DArT, Últimas estrategias (EST, matrices, DArT,

SNP).SNP).

Page 14: marcador molecular

1.1. PolimorfismPolimorfism

o o De Longitud De Longitud

De De Fragmentos Fragmentos

De De Restriccion.Restriccion.

Page 15: marcador molecular

1. Polimorfismo de 1. Polimorfismo de longitud de longitud de

fragmentos de fragmentos de restriccion (RFLP).restriccion (RFLP).

La detección del RFLP se basa en la posibilidad de La detección del RFLP se basa en la posibilidad de comparar patrones de bandas generados mediante la comparar patrones de bandas generados mediante la digestión con enzimas de restricción del ADN patrón. digestión con enzimas de restricción del ADN patrón.

Las etapas de laboratorio son:Las etapas de laboratorio son:

1. Aislamiento del ADN.1. Aislamiento del ADN. 2. Digestión y electroforesis.2. Digestión y electroforesis. 3. Transferencia del ADN por el método Southern.3. Transferencia del ADN por el método Southern. 4. Hibridación del ADN.4. Hibridación del ADN.

a.a. ProcedimientoProcedimiento

b.b. Sonda de ADNSonda de ADN

c.c. Fuentes de sondasFuentes de sondas

Page 16: marcador molecular

(1) Aislamiento (1) Aislamiento de ADN.de ADN.

1.1. Se extrae ADN total de las células (de la planta).Se extrae ADN total de las células (de la planta).

2.2. Alternativamente, puede usarse el ADN Alternativamente, puede usarse el ADN cloroplástico y el mitocondrial.cloroplástico y el mitocondrial.

3.3. El ADN debe estar limpio y debe tener elevado El ADN debe estar limpio y debe tener elevado peso molecular.peso molecular.

Complicaciones:Complicaciones: Rotura durante el aislamiento.Rotura durante el aislamiento. ADN degradado por las nucleasas.ADN degradado por las nucleasas. Polisacáridos aislados junto con el ADN.Polisacáridos aislados junto con el ADN. Aislamiento de metabolitos secundarios.Aislamiento de metabolitos secundarios.

Page 17: marcador molecular

(2) Digestion de (2) Digestion de Restriccion y Restriccion y

Electroforesis.Electroforesis.

Es necesaria la hibridación para detectar fragmentos específicos

-

+

1.1.

2.2.

3.3.

4.4.

Page 18: marcador molecular

(3) Transferencia (3) Transferencia del ADN X el del ADN X el

Metodo Southern.Metodo Southern.PESOPESO

MEMBRANAMEMBRANA

GELGEL

Page 19: marcador molecular

(4) Hibridacion del (4) Hibridacion del ADN: ADN: a.a. El El

Procedimiento.Procedimiento.ADN adherido a ADN adherido a

la membranala membrana

Hibridado Hibridado con la sondacon la sonda

Se descarta Se descarta el sobrante el sobrante de sondade sonda

Película Película expuesta a expuesta a los Rayos Xlos Rayos X

Sonda Sonda hibrídadahibrídada

1.1.

2.2.

3.3.

4.4.5.5.

Page 20: marcador molecular

Hibridacion del Hibridacion del ADN: ADN:

b. b. La Sonda.La Sonda.ADN total o ADN total o ADNcADNc

ADN digeridoADN digerido

Selección de Selección de fragmentos fragmentos

de ADN según de ADN según su tamañosu tamaño

Fragmento de Fragmento de ADN patrónADN patrón

Vector Vector extraído de extraído de bacterias y bacterias y

abiertoabierto

El fragmento El fragmento de ADN se de ADN se inserta al inserta al

vectorvector

El vector recombinante se El vector recombinante se introduce en las bacterias y se introduce en las bacterias y se

clonaclona

Los clones Los clones se dejan se dejan

crecer en crecer en una placauna placa

Los clones Los clones recombinantrecombinantes se es se seleccionan seleccionan y siguen y siguen creciendocreciendo

-

+

1.1.

2.2.

3.3.

4.4.5.5. 6.6.

7.7.

8.8.

Page 21: marcador molecular

Hibridacion del Hibridacion del ADN: ADN:

c. c. Fuentes de Fuentes de sondas.sondas.

ADN nuclear:ADN nuclear:

Genotecas genómicasGenotecas genómicas ADNcADNc

ADN citoplasmáticoADN citoplasmáticoGenotecas de ADN mitocondrial y Genotecas de ADN mitocondrial y

cloroplástico.cloroplástico.

La especificidad de muchas sondas de copia La especificidad de muchas sondas de copia única requiere que se construyan genotecas única requiere que se construyan genotecas cuando se estudian nuevas especies. cuando se estudian nuevas especies.

Sin embargo, a menudo pueden usarse sondas Sin embargo, a menudo pueden usarse sondas de géneros emparentados.de géneros emparentados.

Page 22: marcador molecular

Hibridacion del Hibridacion del ADN: ADN:

Fuentes de Fuentes de sondas.sondas.Secuencias repetitivas o de tipo minisatélite:Secuencias repetitivas o de tipo minisatélite:

Repetición básica de 10 a 60 pb en tándem.Repetición básica de 10 a 60 pb en tándem. Altamente variables entre individuos del Altamente variables entre individuos del

género humano.género humano. Polimorfismos en el número de unidades Polimorfismos en el número de unidades

repetidas (también llamados VNTR).repetidas (también llamados VNTR).

En las plantas, para detectar secuencias En las plantas, para detectar secuencias minisatélite se han usado sondas minisatélite se han usado sondas provenientes de una repetición interna del provenientes de una repetición interna del gen de la proteína III del bacteriófago M13.gen de la proteína III del bacteriófago M13.

Page 23: marcador molecular

Equipo Equipo (RFLP)(RFLP)..Recursos:Recursos: Agua destilada o desionizada (o ambas).Agua destilada o desionizada (o ambas). Reactivos.Reactivos.

Refrigerador y congelador.Refrigerador y congelador. Campana extractora deCampana extractora de

flujo laminar.flujo laminar. Centrífuga.Centrífuga. Fuente de energía eléctrica.Fuente de energía eléctrica. Hornillo o microondas.Hornillo o microondas.

Medidor de pH.Medidor de pH.

Balanza estándar.Balanza estándar.

Unidades de electroforesis.Unidades de electroforesis.

Cuarto oscuro.Cuarto oscuro.

Transiluminador Transiluminador

ultravioleta.ultravioleta.

Equipo:Equipo:

Page 24: marcador molecular

Imagenes Imagenes RFLP.RFLP.1.1. 2.2.

3.3. 4.4.

Page 25: marcador molecular

Imagenes Imagenes RFLP.RFLP.5.5. 6.6.

7.7. 8.8.

Page 26: marcador molecular

9.9. 1010..

1111..

1212..

Imagenes Imagenes RFLP.RFLP.

Page 27: marcador molecular

Imagenes Imagenes RFLP.RFLP.9.9. 1010

..

1111..

1212..

Page 28: marcador molecular

RFLP en RFLP en imagenes: imagenes: Resumen.Resumen.

A

A

B

B

HIBRIDACIONELECTROFORESIS

TRANSFERENCIA

MUTACION = Un nuevo sitio de restricción

SONDA

SITIO DE RESTRICCIÓN

DIGESTION

Page 29: marcador molecular

Interpretacion Interpretacion de las Bandas de las Bandas

RFLP (1).RFLP (1).

A

B

Nuevo sitio de restricción

SONDA

SITIO DE RESTRICCIÓN

A B

Una mutación crea un nuevo sitio de restricción Una mutación crea un nuevo sitio de restricción dentro de la región de interés. Por consiguiente, dentro de la región de interés. Por consiguiente, se detectan dos bandas más pequeñas en la se detectan dos bandas más pequeñas en la película.película.

Page 30: marcador molecular

Interpretacion Interpretacion de las Bandas de las Bandas

RFLP (2).RFLP (2).

A

B

Nuevo sitio de restricción

SONDA

SITIO DE RESTRICCIÓN

A B

Una mutación crea un nuevo sitio de restricción Una mutación crea un nuevo sitio de restricción entre sitios de restricción contiguos, creando un entre sitios de restricción contiguos, creando un fragmento de restricción más corto.fragmento de restricción más corto.

Page 31: marcador molecular

Interpretacion Interpretacion de las Bandas de las Bandas

RFLP (3).RFLP (3).

A

B

Insercción ocurrida

SONDA

SITIO DE RESTRICCIÓN

A B

Una inserción de una secuencia de ADN entre Una inserción de una secuencia de ADN entre sitios de restricción contiguos crea un fragmento sitios de restricción contiguos crea un fragmento de restricción más largo.de restricción más largo.

Page 32: marcador molecular

Interpretacion Interpretacion de las Bandas de las Bandas

RFLP (4).RFLP (4).

A

B

Delección ocurrida

SONDA

SITIO DE RESTRICCIÓN

A B

Una deleción de una secuencia de ADN entre Una deleción de una secuencia de ADN entre sitios de restricción contiguos crea un sitios de restricción contiguos crea un fragmento de restricción más corto.fragmento de restricción más corto.

Page 33: marcador molecular

Interpretacion Interpretacion de las Bandas de las Bandas

RFLP (5).RFLP (5).

A

B

Sitio perdido

SONDA

SITIO DE RESTRICCIÓN

A B

Uno de los sitios de restricción adyacentes Uno de los sitios de restricción adyacentes cambia o se pierde a causa de una mutación o cambia o se pierde a causa de una mutación o una delección. una delección. En consecuencia, el fragmento de restricción se En consecuencia, el fragmento de restricción se altera.altera.

Page 34: marcador molecular

Ventajas De los Ventajas De los RFLP.RFLP.

Metodología sumamente sólida y muy transferible Metodología sumamente sólida y muy transferible entre laboratorios.entre laboratorios.

No se requiere información acerca de la secuencia del No se requiere información acerca de la secuencia del ADN.ADN.

Muy recomendables para el análisis filogenético de Muy recomendables para el análisis filogenético de especies emparentadas porque se basan en la especies emparentadas porque se basan en la homología de las secuencias.homología de las secuencias.

Adecuado para construir mapas de ligamiento Adecuado para construir mapas de ligamiento genético.genético.

Marcadores específicos del locus que permiten hacer Marcadores específicos del locus que permiten hacer estudios de sintenia.estudios de sintenia.

Page 35: marcador molecular

Desventajas de Desventajas de los RFLP.los RFLP.

Requieren cantidades grandes de ADN.Requieren cantidades grandes de ADN.

No permiten la automatización.No permiten la automatización.

Bajos niveles de polimorfismo en algunas especies.Bajos niveles de polimorfismo en algunas especies.

Pocos loci detectados por ensayo.Pocos loci detectados por ensayo.

Necesitan disponer de una genoteca de sondas Necesitan disponer de una genoteca de sondas apropiadas.apropiadas.

Lentos, especialmente con sondas de copia única.Lentos, especialmente con sondas de copia única.

Costosos.Costosos.

Tienen exigencias técnicas moderadas.Tienen exigencias técnicas moderadas.

Pueden necesitar diferentes combinaciones de Pueden necesitar diferentes combinaciones de sonda/enzima.sonda/enzima.

Page 36: marcador molecular

Ejemplos de Ejemplos de Aplicaciones Aplicaciones

RFLPRFLP....Diversidad genética.Diversidad genética.

Relaciones genéticas.Relaciones genéticas.

Historia de la domesticación.Historia de la domesticación.

Origen y evolución de las especies.Origen y evolución de las especies.

Deriva genética y selección.Deriva genética y selección.

Cartografía de genomas y de tipo Cartografía de genomas y de tipo comparativo.comparativo.

Localización de genes.Localización de genes.

Descubrimiento de genes valiosos de especies Descubrimiento de genes valiosos de especies silvestres.silvestres.

Construcción de genotecas exóticas.Construcción de genotecas exóticas.

Page 37: marcador molecular

Tecnologias Basadas Tecnologias Basadas En PCR:En PCR:

Page 38: marcador molecular

1. (AFLP).1. (AFLP).

Polimorfismo de Polimorfismo de Longitud de Longitud de Fragmentos Fragmentos Amplificados.Amplificados.

Page 39: marcador molecular

Polimorfismo de Polimorfismo de longitud longitud

de fragmentos de fragmentos amplificadosamplificados

(AFLP). (AFLP). Caracteristicas principales:Caracteristicas principales: Es una combinación de las tecnologías de RFLP y Es una combinación de las tecnologías de RFLP y

de PCR.de PCR.

Está basada en la amplificación selectiva de los Está basada en la amplificación selectiva de los fragmentos de restricción mediante la PCR.fragmentos de restricción mediante la PCR.

Es un método muy sensible para caracterizar el Es un método muy sensible para caracterizar el ADN cualquiera que sea su origen y su ADN cualquiera que sea su origen y su complejidad.complejidad.

Se puede aplicar con ADN genómico total o con Se puede aplicar con ADN genómico total o con ADNc (‘perfiles de transcripción’).ADNc (‘perfiles de transcripción’).

Page 40: marcador molecular

Cuatro Cuatro Etapas.Etapas.

1.1. El ADN es digerido con dos enzimas de El ADN es digerido con dos enzimas de restricción diferentes.restricción diferentes.

2.2. Adaptadores oligonucleótidos se ligan a los Adaptadores oligonucleótidos se ligan a los extremos extremos de los fragmentos de ADN.de los fragmentos de ADN.

3.3. Se amplifican subconjuntos específicos de los Se amplifican subconjuntos específicos de los productos de digestión del ADN empleando productos de digestión del ADN empleando combinaciones de cebadores selectivos.combinaciones de cebadores selectivos.

4.4. Se detecta el polimorfismo empleando Se detecta el polimorfismo empleando radioisótopos, colorantes fluorescentes o radioisótopos, colorantes fluorescentes o tinción de plata.tinción de plata.

Page 41: marcador molecular

Digestion Del Digestion Del ADN y Ligacion.ADN y Ligacion.Una de las enzimas de restricción hace Una de las enzimas de restricción hace cortes frecuentes,cortes frecuentes,(su sitio de reconocimiento es de cuatro (su sitio de reconocimiento es de cuatro bases, por ejemplo MseI).bases, por ejemplo MseI).

El segundo enzima de restricción hace El segundo enzima de restricción hace cortes infrecuentes,cortes infrecuentes,(su sitio de reconocimiento es de seis (su sitio de reconocimiento es de seis bases, por ejemplo EcoRI).bases, por ejemplo EcoRI).

Se ligan a los fragmentos de ADN Se ligan a los fragmentos de ADN generados adaptadores sintéticos de doble generados adaptadores sintéticos de doble cadena, que son específicos de cada sitio cadena, que son específicos de cada sitio de restricción.de restricción.

Page 42: marcador molecular

Reacciones de la Reacciones de la PCR y Su PCR y Su Deteccion.Deteccion.

Se realiza una primera PCR (preselectiva), usando cebadores Se realiza una primera PCR (preselectiva), usando cebadores oligonucleótidos complementarios al adaptador y a los sitios oligonucleótidos complementarios al adaptador y a los sitios de restricción. Se añade un nucleótido a los cebadores para de restricción. Se añade un nucleótido a los cebadores para seleccionar sólo un subconjunto de fragmentos.seleccionar sólo un subconjunto de fragmentos.

Los productos de la amplificación preselectiva se someten a Los productos de la amplificación preselectiva se someten a otra PCR, y nuevamente se selecciona un subconjunto de otra PCR, y nuevamente se selecciona un subconjunto de fragmentos. Generalmente, en la segunda amplificación fragmentos. Generalmente, en la segunda amplificación selectiva se agregan dos nucleótidos más a los cebadores.selectiva se agregan dos nucleótidos más a los cebadores.

La separación de los fragmentos de la reacción se realiza La separación de los fragmentos de la reacción se realiza mediante electroforesis en geles de poliacrilamida de tipo mediante electroforesis en geles de poliacrilamida de tipo desnaturalizante (geles de secuenciación) o electroforesis desnaturalizante (geles de secuenciación) o electroforesis capilar.capilar.

Page 43: marcador molecular

AFLP imagenes: AFLP imagenes: Resumen.Resumen.

Perfil de AFPL

Amplificación selectiva:

Cebadores = adaptadores + 1 base + 2 bases

Pre-Amplificación:

Cebadores = adaptadores + 1 base

Empalme de los adaptadores

Digestión con dos enzimas de restricción

ADN genómico

Page 44: marcador molecular

Equipo Del AFLP.Equipo Del AFLP.Recursos:Recursos: Agua destilada o desionizada (o ambas).Agua destilada o desionizada (o ambas). Reactivos.Reactivos.

Refrigerador y congelador.Refrigerador y congelador. Centrífuga.Centrífuga. Termociclador.Termociclador. Hornillo o microondas.Hornillo o microondas. Medidor de pH.Medidor de pH. Campana extractora de Campana extractora de

flujo laminar.flujo laminar.

Balanza estándar.Balanza estándar. Unidades de electroforesis Unidades de electroforesis

vertical.vertical. Transiluminador ultravioleta.Transiluminador ultravioleta. Secuenciador automático.Secuenciador automático. Fuente de energía eléctrica.Fuente de energía eléctrica.

Equipo:Equipo:

Page 45: marcador molecular

Interpretacion De Interpretacion De las Bandas de las Bandas de

AFLP.AFLP.La técnica AFLP detecta polimorfismos generados La técnica AFLP detecta polimorfismos generados por cambios (de presencia o tamaño) en los sitios por cambios (de presencia o tamaño) en los sitios de restricción o en los adyacentes a éstos.de restricción o en los adyacentes a éstos.

Distintas combinaciones de nucleótidos Distintas combinaciones de nucleótidos preselectivos y selectivos aumentarán la preselectivos y selectivos aumentarán la probabilidad de encontrar polimorfismos probabilidad de encontrar polimorfismos útiles.útiles.

A mayor número de bases selectivas, A mayor número de bases selectivas, menor detección de polimorfismo.menor detección de polimorfismo.

Las bandas se registran, generalmente, Las bandas se registran, generalmente, como presentes o ausentes.como presentes o ausentes.

En función del espesor de la banda, se En función del espesor de la banda, se pueden detectar bandas heterocigóticas y pueden detectar bandas heterocigóticas y homocigóticas, aunque no siempre los homocigóticas, aunque no siempre los resultados son confiables.resultados son confiables.

Page 46: marcador molecular

Gel de AFLP Gel de AFLP Procesado Procesado

Con Cebadores Con Cebadores Fluorescentes.Fluorescentes.

Page 47: marcador molecular

AFLP - AFLP - Detectados Con Detectados Con Tincion de Plata.Tincion de Plata.

Page 48: marcador molecular

Ventajas de los Ventajas de los AFLP.AFLP.

AFLP permiten una exploración rápida de los polimorfismos del AFLP permiten una exploración rápida de los polimorfismos del genoma entero.genoma entero.

Puesto que se genera un gran número de bandas, cada marcador da Puesto que se genera un gran número de bandas, cada marcador da una huella identificadora de ADN sumamente informativa.una huella identificadora de ADN sumamente informativa.

Son también altamente reproducibles.Son también altamente reproducibles.

No se necesita información previa de las secuencias ni hay que No se necesita información previa de las secuencias ni hay que generar sondas de hibridación.generar sondas de hibridación.

Es una técnica muy útil para crear mapas genéticos en forma rápida.Es una técnica muy útil para crear mapas genéticos en forma rápida.

Permiten la generación de “perfiles de trascripción”.Permiten la generación de “perfiles de trascripción”.

Page 49: marcador molecular

Desventajas de Desventajas de los AFLP.los AFLP.

AFLP generan cantidades enormes de información, AFLP generan cantidades enormes de información, por lo que pueden requerir un análisis automatizado por lo que pueden requerir un análisis automatizado y, por consiguiente, tecnología de computación y, por consiguiente, tecnología de computación adecuada.adecuada.

Son de tipo dominante.Son de tipo dominante.

En los mapas genéticos, los AFLP se agrupan, con En los mapas genéticos, los AFLP se agrupan, con frecuencia, en los centrómeros y telómeros.frecuencia, en los centrómeros y telómeros.

Requieren bastante técnica en el laboratorio y, Requieren bastante técnica en el laboratorio y, especialmente, en el análisis de los datos.especialmente, en el análisis de los datos.

Page 50: marcador molecular

Ejemplos de Ejemplos de Aplicaciones.Aplicaciones.

Evaluación de diversidad genética.Evaluación de diversidad genética.

Análisis de distancia genética.Análisis de distancia genética.

Huella identificadora de ADN.Huella identificadora de ADN.

Análisis de colecciones de germoplasma.Análisis de colecciones de germoplasma.

Construcción de mapas genéticos.Construcción de mapas genéticos.

Seguimiento de marcadores de Seguimiento de marcadores de diagnóstico.diagnóstico.

Page 51: marcador molecular

2. (Sts).2. (Sts).

Sitios De Sitios De Secuencia Secuencia

Etiquetada.Etiquetada.

Page 52: marcador molecular

Sitios De Sitios De Secuencia Secuencia

Etiquetada (Sts).Etiquetada (Sts).A diferencia de las técnicas basadas en cebadores A diferencia de las técnicas basadas en cebadores arbitrarios, los STS dependen de un cierto arbitrarios, los STS dependen de un cierto conocimiento de las secuencias.conocimiento de las secuencias.

Los marcadores basados en STS son Los marcadores basados en STS son codominantes.codominantes.

Tienden a ser más reproducibles porque se usan Tienden a ser más reproducibles porque se usan secuencias cebadoras más largas.secuencias cebadoras más largas.

Requieren, básicamente, los mismos protocolos de Requieren, básicamente, los mismos protocolos de laboratorio y el mismo equipo que la PCR laboratorio y el mismo equipo que la PCR estándar.estándar.

a.a. Microsatélites (SSR, STMS o SSRP).Microsatélites (SSR, STMS o SSRP).

b.b. SCAR.SCAR.

c.c. CAPS.CAPS.

d.d. ISSR.ISSR.

Page 53: marcador molecular

a.a. Microsatelites Microsatelites (SSR, STMS o (SSR, STMS o

SSRP).SSRP).Los microsatélites son secuencias cortas (1-Los microsatélites son secuencias cortas (1-10 pb) que se repiten en serie.10 pb) que se repiten en serie.

Para poder usarlos como marcadores, debe Para poder usarlos como marcadores, debe identificarse, en primer lugar, su ubicación identificarse, en primer lugar, su ubicación en el genoma de interés.en el genoma de interés.

Los polimorfismos en la región repetida se Los polimorfismos en la región repetida se pueden detectar mediante una PCR con pueden detectar mediante una PCR con cebadores diseñados a partir de la región del cebadores diseñados a partir de la región del ADN adyacente a la repetición.ADN adyacente a la repetición.

Page 54: marcador molecular

Identificacion Identificacion De Regiones De Regiones

Microsatelite.Microsatelite.SECUENCIA DISPONIBLE SECUENCIA DISPONIBLE EN LA BASE DE DATOS.EN LA BASE DE DATOS.

SECUENCIA DISPONIBLE SECUENCIA DISPONIBLE EN LA BASE DE DATOS.EN LA BASE DE DATOS.

IDENTIFICAR LAS IDENTIFICAR LAS SECUENCIAS QUE SECUENCIAS QUE

CONTIENEN CONTIENEN MICROSATELITES.MICROSATELITES.

IDENTIFICAR LAS IDENTIFICAR LAS SECUENCIAS QUE SECUENCIAS QUE

CONTIENEN CONTIENEN MICROSATELITES.MICROSATELITES.

DISEÑAR CEBADORES DISEÑAR CEBADORES ESPECÍFICOS.ESPECÍFICOS.

DISEÑAR CEBADORES DISEÑAR CEBADORES ESPECÍFICOS.ESPECÍFICOS.

DETECTAR EL DETECTAR EL POLIMORFISMO.POLIMORFISMO.

DETECTAR EL DETECTAR EL POLIMORFISMO.POLIMORFISMO.

USAR MICROSATELITES USAR MICROSATELITES CONOCIDOS PARA AISLAR CONOCIDOS PARA AISLAR CLONES CANDIDATOS DE CLONES CANDIDATOS DE

UNA GENOTECA.UNA GENOTECA.

USAR MICROSATELITES USAR MICROSATELITES CONOCIDOS PARA AISLAR CONOCIDOS PARA AISLAR CLONES CANDIDATOS DE CLONES CANDIDATOS DE

UNA GENOTECA.UNA GENOTECA.

USAR SECUENCIAS DE USAR SECUENCIAS DE MICROSATELITE COMO MICROSATELITE COMO SONDA FRENTE AL ADN SONDA FRENTE AL ADN

DIGERIDO.DIGERIDO.

USAR SECUENCIAS DE USAR SECUENCIAS DE MICROSATELITE COMO MICROSATELITE COMO SONDA FRENTE AL ADN SONDA FRENTE AL ADN

DIGERIDO.DIGERIDO.

SECUENCIAR LOS CLONES SECUENCIAR LOS CLONES POSITIVOS.POSITIVOS.

SECUENCIAR LOS CLONES SECUENCIAR LOS CLONES POSITIVOS.POSITIVOS.

DISEÑAR CEBADORES DISEÑAR CEBADORES ESPECÍFICOS.ESPECÍFICOS.

DISEÑAR CEBADORES DISEÑAR CEBADORES ESPECÍFICOS.ESPECÍFICOS.

DETECTAR EL DETECTAR EL POLIMORFISMO.POLIMORFISMO.

DETECTAR EL DETECTAR EL POLIMORFISMO.POLIMORFISMO.

DETECTAR EL DETECTAR EL POLIMORFISMO.POLIMORFISMO.

DETECTAR EL DETECTAR EL POLIMORFISMO.POLIMORFISMO.

1.1.

2.2.

3.3.

1.1.

2.2.

3.3.

4.4.

1.1.

2.2.

NO HAY SECUENCIA DISPONIBLE EN NO HAY SECUENCIA DISPONIBLE EN LA BASE DE DATOS.LA BASE DE DATOS.

NO HAY SECUENCIA DISPONIBLE EN NO HAY SECUENCIA DISPONIBLE EN LA BASE DE DATOS.LA BASE DE DATOS.

Page 55: marcador molecular

Estructura.Estructura.

El número de repeticiones es altamente variable El número de repeticiones es altamente variable entre individuosentre individuos

Regiones adyacentes únicas

Región repetida

Page 56: marcador molecular

Seleccion De Los Seleccion De Los Cebadores.Cebadores.

Diseñar cebadores complementarios ( ) de Diseñar cebadores complementarios ( ) de las regiones adyacenteslas regiones adyacentes

Page 57: marcador molecular

Metodologia y Metodologia y Visualizacion.Visualizacion.

Metodología:Metodología: Extracción del ADN.Extracción del ADN. PCR con cebadores específicos de las regiones PCR con cebadores específicos de las regiones

adyacentes al microsatélite.adyacentes al microsatélite. Separación de fragmentos.Separación de fragmentos.

Visualización:Visualización: Mediante electroforesis en geles de agarosa, Mediante electroforesis en geles de agarosa,

usando tinción con bromuro de etidio y luz usando tinción con bromuro de etidio y luz ultravioleta.ultravioleta.

En geles de acrilamida, tiñendo con nitrato de En geles de acrilamida, tiñendo con nitrato de plata, o empleando radioisótopos.plata, o empleando radioisótopos.

Con secuenciadores automáticos, empleando Con secuenciadores automáticos, empleando cebadores pre-marcados con fluorescencia.cebadores pre-marcados con fluorescencia.

Page 58: marcador molecular

Tincion Con Tincion Con Bromuro De Bromuro De

Etidio.Etidio.

Page 59: marcador molecular

Tincion Con Tincion Con Nitrato De Nitrato De

Plata.Plata.

Page 60: marcador molecular

Equipo Equipo Microsatelites Microsatelites (SSR, STMS o (SSR, STMS o

SSRP).SSRP).Recursos:Recursos: Agua destilada o desionizada (o ambas).Agua destilada o desionizada (o ambas). Reactivos.Reactivos.

Refrigerador y Refrigerador y congelador.congelador.

Campana extractora de Campana extractora de flujo laminar.flujo laminar.

Centrífuga.Centrífuga. Termociclador.Termociclador. Hornillo o microondas.Hornillo o microondas.

Medidor de pH.Medidor de pH. Balanza estándar.Balanza estándar. Unidades de electroforesis Unidades de electroforesis

vertical y horizontal.vertical y horizontal. Transiluminador Transiluminador

ultravioleta.ultravioleta. Secuenciador automático.Secuenciador automático. Fuente de energía eléctrica.Fuente de energía eléctrica.

Equipo:Equipo:

Page 61: marcador molecular

Ventajas y Ventajas y Desventajas.Desventajas.Ventajas:Ventajas:

Requieren muy poco ADN y éste no necesariamente Requieren muy poco ADN y éste no necesariamente de alta calidad.de alta calidad.

Sumamente polimórficos.Sumamente polimórficos. Uniformemente distribuidos en todo el genoma.Uniformemente distribuidos en todo el genoma. Interpretación sencilla de los resultados.Interpretación sencilla de los resultados. Automatizados fácilmente, y permiten la carga Automatizados fácilmente, y permiten la carga

simultánea de productos en el mismo carril.simultánea de productos en el mismo carril. Buena resolución analítica y alta reproducibilidad.Buena resolución analítica y alta reproducibilidad.

Desventajas:Desventajas: Procedimiento de descubrimiento complejo.Procedimiento de descubrimiento complejo. Costo elevado.Costo elevado.

Page 62: marcador molecular

Ejemplos De Ejemplos De Aplicaciones De Aplicaciones De

Los SSR..Los SSR..Genotipificación de individuos.Genotipificación de individuos.

Evaluación de germoplasma.Evaluación de germoplasma.

Diversidad genética.Diversidad genética.

Cartografía de genomas.Cartografía de genomas.

Estudios filogenéticos.Estudios filogenéticos.

Estudios evolutivos.Estudios evolutivos.

Page 63: marcador molecular

b.b. Region Region Amplificada Amplificada

Caracterizada Caracterizada Por UnaPor Una

Secuencia Secuencia (SCAR).(SCAR).Los SCAR aprovechan una banda que ha sido Los SCAR aprovechan una banda que ha sido

generada en un experimento de RAPD.generada en un experimento de RAPD.

Usan cebadores de16 a 24 pb, diseñados a partir de Usan cebadores de16 a 24 pb, diseñados a partir de los extremos de marcadores RAPD clonados.los extremos de marcadores RAPD clonados.

Esta técnica transforma una banda propensa a Esta técnica transforma una banda propensa a dificultades de interpretación o de reproducibilidad dificultades de interpretación o de reproducibilidad en un marcador muy confiable.en un marcador muy confiable.

Page 64: marcador molecular

Pasos Para La Pasos Para La Obtencion De Obtencion De

Polimorfismos De Polimorfismos De SCAR..SCAR..

Se identifica, en un gel de RAPD, una banda Se identifica, en un gel de RAPD, una banda que despierta un interés potencial.que despierta un interés potencial.

La banda se corta y se retira del gel.La banda se corta y se retira del gel.

El fragmento de ADN se clona en un vector y El fragmento de ADN se clona en un vector y se obtiene su secuencia.se obtiene su secuencia.

Se diseñan cebadores específicos (16 a 24 pb Se diseñan cebadores específicos (16 a 24 pb de longitud) para ese fragmento de ADN.de longitud) para ese fragmento de ADN.

La reamplificación del ADN patrón con los La reamplificación del ADN patrón con los nuevos cebadores presentará un patrón de nuevos cebadores presentará un patrón de PCR nuevo y más sencillo.PCR nuevo y más sencillo.

Page 65: marcador molecular

Diagrama Del Diagrama Del Procedimiento Procedimiento Xra Obtener Los Xra Obtener Los

SCAR..SCAR..11 22 33

Gel de RAPD

Banda polimórfica

Clonar la banda polimórfica en un vector

Secuenciar el fragmento y diseñar nuevos cebadores para amplificar únicamente la banda de interés

1 2 3

Después de la amplificación con los nuevos cebadores, el

resultado es un patrón de bandas más fácil de

interpretar

Banda polimórfica

Page 66: marcador molecular

Ventajas y Ventajas y Desventajas.Desventajas.

Ventajas:Ventajas: Patrones más sencillos que los RAPD.Patrones más sencillos que los RAPD.

Ensayo sólido gracias al uso de cebadores largos Ensayo sólido gracias al uso de cebadores largos específicos.específicos.

Herencia mendeliana. A veces convertibles a Herencia mendeliana. A veces convertibles a marcadores codominantes.marcadores codominantes.

Desventajas:Desventajas: Requieren un conocimiento mínimo de las secuencias.Requieren un conocimiento mínimo de las secuencias.

Requieren esfuerzo y gastos para diseñar cebadores Requieren esfuerzo y gastos para diseñar cebadores específicos de cada locus.específicos de cada locus.

Page 67: marcador molecular

c.c. Secuencia de Secuencia de Restriccion Restriccion

Amplificada y Amplificada y Polimorfica (CAPS).Polimorfica (CAPS).

Este método se basa en el diseño de Este método se basa en el diseño de cebadores específicos, en la amplificación cebadores específicos, en la amplificación de fragmentos de ADN, y en la generación de fragmentos de ADN, y en la generación de fragmentos más pequeños, posiblemente de fragmentos más pequeños, posiblemente variables, mediante un enzima de variables, mediante un enzima de restricción.restricción.

El objetivo de esta técnica es convertir una El objetivo de esta técnica es convertir una banda amplificada, que no muestra banda amplificada, que no muestra variación, en una banda polimórfica.variación, en una banda polimórfica.

Page 68: marcador molecular

Pasos Que Pasos Que Requiere la Requiere la

Generacion De Generacion De CAPS.CAPS.Se reconoce la importancia de una banda, de un Se reconoce la importancia de una banda, de un

fragmento de ADN, de una secuencia génica o de otro fragmento de ADN, de una secuencia génica o de otro tipo de marcador.tipo de marcador.

O bien la banda se detecta a través de la PCR (y se corta O bien la banda se detecta a través de la PCR (y se corta del gel y el fragmento se clona y es secuenciado) o la del gel y el fragmento se clona y es secuenciado) o la secuencia del fragmento está ya disponible.secuencia del fragmento está ya disponible.

Se diseñan cebadores específicos partiendo de la Se diseñan cebadores específicos partiendo de la secuencia del fragmento.secuencia del fragmento.

Los cebadores recién diseñados se usan para amplificar Los cebadores recién diseñados se usan para amplificar el ADN patrón.el ADN patrón.

El producto de la PCR se somete a digestión con varios El producto de la PCR se somete a digestión con varios enzimas de restricción.enzimas de restricción.

Se identifica el polimorfismo empleando alguno de los Se identifica el polimorfismo empleando alguno de los enzimas.enzimas.

Page 69: marcador molecular

Generacion De Generacion De CAPS.CAPS.

R R R R R R R R

PCR + digestión con el enzima R + PCR + digestión con el enzima R + electroforesis.electroforesis.

*

*

A/A B/B A/B

Page 70: marcador molecular

Ventajas y Ventajas y Desventajas.Desventajas.Ventajas:Ventajas:

Ensayo sólido, porque se usan cebadores Ensayo sólido, porque se usan cebadores específicos largos.específicos largos.

Marcadores co-dominantes.Marcadores co-dominantes. Favorecido por marcadores que pueden estar ya Favorecido por marcadores que pueden estar ya

localizados en un mapa genético.localizados en un mapa genético. Identifican polimorfismos en marcadores que Identifican polimorfismos en marcadores que

anteriormente no eran informativos.anteriormente no eran informativos.

Desventajas:Desventajas: Requieren, al menos, un mínimo nivel de Requieren, al menos, un mínimo nivel de

conocimiento de las secuencias.conocimiento de las secuencias. El diseño de cebadores específicos para cada locus El diseño de cebadores específicos para cada locus

requiere trabajo adicional y más gastos.requiere trabajo adicional y más gastos.

Page 71: marcador molecular

d.d. Secuencia Secuencia Entre Entre

Repeticiones Repeticiones Simples (ISSR).Simples (ISSR).

Son las regiones situadas entre Son las regiones situadas entre microsatélites.microsatélites.

La técnica se basa en la amplificación, La técnica se basa en la amplificación, mediante la PCR, de las secuencias ubicadas mediante la PCR, de las secuencias ubicadas entre microsatélites.entre microsatélites.

Gracias a la conocida abundancia de Gracias a la conocida abundancia de secuencias repetitivas esparcidas por todo el secuencias repetitivas esparcidas por todo el genoma, identifica múltiples loci.genoma, identifica múltiples loci.

Page 72: marcador molecular

Identificacion De Identificacion De Polimorfismos Polimorfismos

ISSR..ISSR..Se ejecuta una PCR típica en la cual los cebadores Se ejecuta una PCR típica en la cual los cebadores han sido diseñados partiendo de una secuencia han sido diseñados partiendo de una secuencia repetitiva de microsatélite y se han extendido, en repetitiva de microsatélite y se han extendido, en una o varias bases, en la secuencia adyacente a una o varias bases, en la secuencia adyacente a modo de puntos de anclaje. Puede haber varias modo de puntos de anclaje. Puede haber varias opciones:opciones:

Se emplea sólo un cebador.Se emplea sólo un cebador. Se emplean dos cebadores de características Se emplean dos cebadores de características

similares.similares. Se combinan un cebador de secuencia de Se combinan un cebador de secuencia de

microsatélite anclado y un cebador aleatorio microsatélite anclado y un cebador aleatorio (como los usados para RAPD).(como los usados para RAPD).

Page 73: marcador molecular

Diseno de Diseno de Cebadores Para Cebadores Para Polimorfismos Polimorfismos

ISSR..ISSR..NNNNNNNNNNNCACACACACACACACACACACA NNNNNNNNNNNNTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGNNNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT NNNNNNNNNNNNCACACACACACACACACACACACACACACANNNNNNNNNNNNN

ADN GENOMICO

Producto de la PCR cebador anclado en 5’

Producto de la PCR cebador anclado en 3’

(CA)nNN NN(CA)n

REPETICION CA NNNN(CA)n

(CA)nNNNN

REPETICION CA

Page 74: marcador molecular

Ventajas y Ventajas y desventajas.desventajas.

Ventajas:Ventajas: No requieren información previa sobre secuencias.No requieren información previa sobre secuencias. Se puede encontrar variación dentro de regiones Se puede encontrar variación dentro de regiones

únicas del únicas del genoma en varios loci simultáneamente.genoma en varios loci simultáneamente. Tienden a identificar niveles significativos de variaciónTienden a identificar niveles significativos de variación Específicos de secuencias de microsatélites.Específicos de secuencias de microsatélites. Muy útiles para realizar perfiles de ADN, especialmente Muy útiles para realizar perfiles de ADN, especialmente

de especies estrechamente relacionadas.de especies estrechamente relacionadas.

Desventajas:Desventajas: Marcadores dominantes.Marcadores dominantes. Puede ser necesaria la electroforesis en gel de Puede ser necesaria la electroforesis en gel de

poliacrilamida y la detección con tinción de plata o con poliacrilamida y la detección con tinción de plata o con radioisótopos.radioisótopos.

Page 75: marcador molecular

3. PCR con 3. PCR con Cebadores Cebadores Arbitrarios.Arbitrarios.

Page 76: marcador molecular

3. PCR con 3. PCR con Cebadores Cebadores Arbitrarios.Arbitrarios.

MAAP (caracterización con ‘amplicones’ múltiples MAAP (caracterización con ‘amplicones’ múltiples arbitrarios) es la sigla propuesta para incluir las tres arbitrarios) es la sigla propuesta para incluir las tres tecnologías principales que corresponden a esta tecnologías principales que corresponden a esta categoría:categoría:

1.1. Polimorfismo de ADN amplificado al azar (RAPD).Polimorfismo de ADN amplificado al azar (RAPD).

2.2. Amplificación de la huella de ADN (DAF).Amplificación de la huella de ADN (DAF).

3.3. Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar (AP-PCR).azar (AP-PCR).

Page 77: marcador molecular

RAPD.RAPD.Características principales:Características principales:

Emplea un cebador aleatorio corto Emplea un cebador aleatorio corto (generalmente, de 10 bases).(generalmente, de 10 bases).

Amplifica trozos anónimos de ADN.Amplifica trozos anónimos de ADN.

Etapas de laboratorio:Etapas de laboratorio:

1.1. Aislamiento del ADN.Aislamiento del ADN.

2.2. PCR con un cebador.PCR con un cebador.

3.3. Separación de los fragmentos de ADN Separación de los fragmentos de ADN mediante electroforesis.mediante electroforesis.

4.4. Visualización de los fragmentos de ADN con Visualización de los fragmentos de ADN con bromuro de etidio.bromuro de etidio.

Page 78: marcador molecular

Deteccion De Deteccion De Productos RAPD.Productos RAPD.Electroforesis de geles de agarosa o de Electroforesis de geles de agarosa o de acrilamida y visualización con bromuro de etidio.acrilamida y visualización con bromuro de etidio.

Page 79: marcador molecular

Diagrama de Diagrama de Resumen.Resumen.

A D

EG

B

C F

BANDA AMPLIFICADA

GEL

CEBADOR

MOLECULA DE ADN

ECADBF

GEL ECADBF

Page 80: marcador molecular

Equipo RAPD.Equipo RAPD.Recursos:Recursos: Agua destilada o desionizada (o ambas).Agua destilada o desionizada (o ambas). Reactivos.Reactivos.

Refrigerador y congelador.Refrigerador y congelador. Campana extractora de Campana extractora de

flujo laminar.flujo laminar. Centrífuga.Centrífuga. Termociclador.Termociclador. Hornillo o microondas.Hornillo o microondas. Medidor de pH.Medidor de pH.

Balanza estándar.Balanza estándar. Unidades de electroforesis Unidades de electroforesis

vertical y horizontal.vertical y horizontal. Transiluminador Transiluminador

ultravioleta.ultravioleta. Secuenciador automático.Secuenciador automático. Fuente de energía eléctrica.Fuente de energía eléctrica.

Equipo.Equipo.

Page 81: marcador molecular

Interpretacion De Interpretacion De Patrones de Patrones de

Bandas RAPD (1).Bandas RAPD (1).El polimorfismo del ADN en un grupo de El polimorfismo del ADN en un grupo de individuos puede deberse a:individuos puede deberse a:

Ensamblaje frustrado en el sitio del cebadorEnsamblaje frustrado en el sitio del cebador Aparición de un nuevo sitio de Aparición de un nuevo sitio de

reconocimiento del cebadorreconocimiento del cebador Longitud de la región amplificada entre los Longitud de la región amplificada entre los

sitios de reconocimiento del cebadorsitios de reconocimiento del cebador

Page 82: marcador molecular

A causa de la naturaleza de los marcadores RAPD, sólo puede A causa de la naturaleza de los marcadores RAPD, sólo puede evaluarse la presencia o la ausencia de una banda. Los criterios evaluarse la presencia o la ausencia de una banda. Los criterios para seleccionar bandas que califican son:para seleccionar bandas que califican son:

Reproducibilidad:Reproducibilidad: es necesario obtener los mismos es necesario obtener los mismos resultados en experimentos repetidos.resultados en experimentos repetidos.

Espesor (de la banda).Espesor (de la banda). Tamaño.Tamaño. Observación de la segregación esperada enObservación de la segregación esperada en

una población segregante.una población segregante.

Interpretacion Interpretacion De Patrones de De Patrones de

Bandas RAPD (2).Bandas RAPD (2).

Page 83: marcador molecular

Interpretacion de Interpretacion de patrones de patrones de

bandas RAPD:bandas RAPD:Ejemplo de un gel Ejemplo de un gel

RAPD de mala RAPD de mala calidad.calidad.

Page 84: marcador molecular

Interpretacion de Interpretacion de patrones patrones

de bandas RAPD:de bandas RAPD:Ejemplo de un gel Ejemplo de un gel

RAPD de buena RAPD de buena calidad.calidad.

Page 85: marcador molecular

Ventajas de los Ventajas de los RAPDs.RAPDs.

Número alto de fragmentos.Número alto de fragmentos.

Técnica sencilla.Técnica sencilla.

Los cebadores arbitrarios se adquieren Los cebadores arbitrarios se adquieren fácilmente, y no requieren de información inicial fácilmente, y no requieren de información inicial de tipo genético o genómico.de tipo genético o genómico.

Se requieren cantidades diminutas del ADN Se requieren cantidades diminutas del ADN patrón.patrón.

Los costos unitarios por ensayo son bajos.Los costos unitarios por ensayo son bajos.

Page 86: marcador molecular

Desventajas de Desventajas de los RAPDs.los RAPDs.

De herencia dominante.De herencia dominante.

Falta de conocimiento previo de la identidad Falta de conocimiento previo de la identidad de los productos de la amplificación.de los productos de la amplificación.

Problemas de reproducibilidad.Problemas de reproducibilidad.

Problemas por co-migración.Problemas por co-migración.

Page 87: marcador molecular

Ejemplos de Ejemplos de Aplicaciones.Aplicaciones.

Diversidad genética.Diversidad genética.

Caracterización de germoplasma.Caracterización de germoplasma.

Estructura genética de poblaciones.Estructura genética de poblaciones.

Domesticación.Domesticación.

Detección de variación somaclonal.Detección de variación somaclonal.

Identificación de cultivares.Identificación de cultivares.

Pureza híbrida.Pureza híbrida.

Cartografía genética.Cartografía genética.

Page 88: marcador molecular

Diferencias Entre Diferencias Entre las Tecnologias las Tecnologias

DAF y RAPD.DAF y RAPD.Respecto a la DAF:Respecto a la DAF:

Las concentraciones de cebador son más Las concentraciones de cebador son más altas altas

Se usan cebadores más cortos (de 5 a 8 Se usan cebadores más cortos (de 5 a 8 nucleótidos).nucleótidos).

Un ciclo de dos temperaturas en lugar de un Un ciclo de dos temperaturas en lugar de un ciclo de 3 temperaturas (usado en RAPD).ciclo de 3 temperaturas (usado en RAPD).

Obtención de combinaciones de bandas Obtención de combinaciones de bandas sumamente complejas.sumamente complejas.

Page 89: marcador molecular

Diferencias Entre Diferencias Entre las Tecnologias las Tecnologias AP-PCR y RAPD.AP-PCR y RAPD.Respecto a AP-PCR:Respecto a AP-PCR:

La amplificación se realiza en tres partes, La amplificación se realiza en tres partes, cada una con sus propios requisitos y cada una con sus propios requisitos y concentración de elementos constitutivos.concentración de elementos constitutivos.

Se emplean concentraciones altas del Se emplean concentraciones altas del cebador en los primeros ciclos de la PCR.cebador en los primeros ciclos de la PCR.

Se eligen arbitrariamente cebadores de Se eligen arbitrariamente cebadores de longitud variable y diseñados, a veces, para longitud variable y diseñados, a veces, para otros fines (por ejemplo, el cebador otros fines (por ejemplo, el cebador universal de análisis de secuencias M13).universal de análisis de secuencias M13).

Page 90: marcador molecular

En Resumen.En Resumen.

La tecnología RAPD se basa en una PCR sencilla con un La tecnología RAPD se basa en una PCR sencilla con un solo cebador arbitrario y corto.solo cebador arbitrario y corto.

La técnica RAPD produce fácilmente un número notable La técnica RAPD produce fácilmente un número notable de bandas, pero sus marcadores son dominantes y son de bandas, pero sus marcadores son dominantes y son frecuentes los problemas de reproducibilidad.frecuentes los problemas de reproducibilidad.

DAF y AP-PCR son tecnologías alternas respecto a los DAF y AP-PCR son tecnologías alternas respecto a los RAPD, pero más complejas.RAPD, pero más complejas.

Page 91: marcador molecular

Ultimas Ultimas Estrategias.Estrategias.

1.1. Marcador de secuencia expresada (EST).Marcador de secuencia expresada (EST).

2.2. Tecnología de matrices.Tecnología de matrices.

3.3. Tecnología de matrices de diversidad (DArT).Tecnología de matrices de diversidad (DArT).

4.4. Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP).Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP).

Page 92: marcador molecular

1. Marcador de 1. Marcador de Secuencia Secuencia

Expresada (EST).Expresada (EST).Las etiquetas de secuencia expresada son Las etiquetas de secuencia expresada son pedazos pequeños de secuencia del ADN que pedazos pequeños de secuencia del ADN que tienen, generalmente, de 200 a 500 tienen, generalmente, de 200 a 500 nucleótidos de largo.nucleótidos de largo.

Se generan al secuenciar bien sea uno o Se generan al secuenciar bien sea uno o ambos extremos de un gen expresado ambos extremos de un gen expresado proveniente de una genoteca de ADNc.proveniente de una genoteca de ADNc.

Esta estrategia es una forma sumamente Esta estrategia es una forma sumamente eficaz de encontrar genes nuevos.eficaz de encontrar genes nuevos.

Page 93: marcador molecular

Diseno De Diseno De Cebadores Cebadores

De EST.De EST. ARNm

Transcriptasa inversa

}

ARN }

ADNc }Degradación del ARN por ribonucleasas

Síntesis de la segunda cadena del ADN

Cebador Cebador 3´EST 5´EST

ADN de doble cadena

}

A

C

U

G

A

C

U

G

A

C

T

G

T

G

A

C

T

G

A

C

Page 94: marcador molecular

Los EST: Los EST: Ventajas y Ventajas y

Desventajas.Desventajas.Ventajas:Ventajas: Muy buenos como marcadores genéticos.Muy buenos como marcadores genéticos. Codominantes.Codominantes. Las secuencias se pueden generar rápidamente.Las secuencias se pueden generar rápidamente. Fuente eficiente de secuencias para obtener Fuente eficiente de secuencias para obtener

cebadores para SSR.cebadores para SSR.

Desventajas:Desventajas: El aislamiento del ARNm puede ser complicado.El aislamiento del ARNm puede ser complicado.

Los intrones, que pueden contener información Los intrones, que pueden contener información importante, no son parte del ADNc.importante, no son parte del ADNc.

Page 95: marcador molecular

Los EST: Los EST: Ejemplos De Ejemplos De Aplicaciones.Aplicaciones.

Las aplicaciones de los EST se basan en el Las aplicaciones de los EST se basan en el hecho de que se originan a partir de hecho de que se originan a partir de segmentos de secuencias génicas:segmentos de secuencias génicas:

1.1. Comparación de la diversidad génica en Comparación de la diversidad génica en diferentes organismos.diferentes organismos.

2.2. Estudios de evolución génica.Estudios de evolución génica.

3.3. Búsqueda de supuestos ortólogos en Búsqueda de supuestos ortólogos en bases de datos.bases de datos.

4.4. Sondas para estudios de expresión Sondas para estudios de expresión génicagénica

5.5. Detección de SNP*.Detección de SNP*.

Page 96: marcador molecular

2. Tecnologia de 2. Tecnologia de Matrices o Matrices o Arreglos.Arreglos.

Las matrices son ordenamientos de pequeños Las matrices son ordenamientos de pequeños fragmentos de ADN fijados a portaobjetos de fragmentos de ADN fijados a portaobjetos de vidrio o membranas de nylon.vidrio o membranas de nylon.

Esta tecnología permite hacer el seguimiento Esta tecnología permite hacer el seguimiento simultáneo del genoma entero.simultáneo del genoma entero.

El principio fundamental de las matrices es el El principio fundamental de las matrices es el apareamiento de las bases .o la hibridación. de apareamiento de las bases .o la hibridación. de sondas cortas con secuencias complementarias sondas cortas con secuencias complementarias de ADN.de ADN.

Las matrices se construyen con ADNc (matrices Las matrices se construyen con ADNc (matrices de ADNc), con secuencias genómicas o con de ADNc), con secuencias genómicas o con oligonucleótidos sintetizados oligonucleótidos sintetizados in silico in silico (“arreglos de ADN”).(“arreglos de ADN”).

Page 97: marcador molecular

Matrices: Matrices: Ventajas y Ventajas y

Desventajas.Desventajas.Ventajas:Ventajas: Tecnología de alto rendimiento.Tecnología de alto rendimiento. Exploración del genoma entero.Exploración del genoma entero. Permite el descubrimiento de la relación Permite el descubrimiento de la relación

genotipo-fenotipo.genotipo-fenotipo.

Desventajas:Desventajas: Debe estar disponible la información sobre la Debe estar disponible la información sobre la

secuencia de los genes.secuencia de los genes. Costosa.Costosa. La cantidad y el tipo de los datos producidos La cantidad y el tipo de los datos producidos

requiere de un alto nivel de experiencia en requiere de un alto nivel de experiencia en computación y de un equipo avanzado.computación y de un equipo avanzado.

Page 98: marcador molecular

Matrices: Matrices: Ejemplos de Ejemplos de Aplicaciones.Aplicaciones.

Identificación de secuencias (génicas o de mutación Identificación de secuencias (génicas o de mutación génica).génica).

Determinación del nivel de expresión de los genes.Determinación del nivel de expresión de los genes.

Ensayo de la abundancia de secuencias Ensayo de la abundancia de secuencias específicas en el ADN genómico.específicas en el ADN genómico.

Análisis de la expresión de gran número de Análisis de la expresión de gran número de genes (matrices de ADNc) Identificación de gran genes (matrices de ADNc) Identificación de gran número de marcadores específicos de ADN, (por número de marcadores específicos de ADN, (por ejemplo, polimorfismo de un solo nucleótido o ejemplo, polimorfismo de un solo nucleótido o SNP), mediante hibridación molecular (matrices SNP), mediante hibridación molecular (matrices de oligonucleótidos sintéticos).de oligonucleótidos sintéticos).

Page 99: marcador molecular

3. Tecnologia De 3. Tecnologia De Matrices de Matrices de Diversidad Diversidad

(DArT).(DArT).

3. Tecnologia De 3. Tecnologia De Matrices de Matrices de Diversidad Diversidad

(DArT).(DArT).Comprende dos pasos:Comprende dos pasos:

1.1. Generación de la matrizGeneración de la matriz

2.2. Genotipificación de la muestraGenotipificación de la muestra

Page 100: marcador molecular

DArT: (1) DArT: (1) Preparacion De Preparacion De

La Matriz.La Matriz.Se clonan los fragmentos generados por restricción, Se clonan los fragmentos generados por restricción, que representan la diversidad de un acervo genético. que representan la diversidad de un acervo genético. Al resultado se le llama una 'representación' (de 0.1% Al resultado se le llama una 'representación' (de 0.1% a 10% del genoma, comúnmente).a 10% del genoma, comúnmente).

Se identifican los clones polimórficos de la genoteca Se identifican los clones polimórficos de la genoteca obteniendo primero la matriz de fragmentos tomados obteniendo primero la matriz de fragmentos tomados de un conjunto aleatorio de clones e hibridando luego de un conjunto aleatorio de clones e hibridando luego la matriz con diferentes muestras.la matriz con diferentes muestras.

Los fragmentos de los clones polimórficos se Los fragmentos de los clones polimórficos se inmovilizan en una matriz.inmovilizan en una matriz.

Page 101: marcador molecular

DArT: (2) DArT: (2) Preparacion De Preparacion De

La Matriz.La Matriz. Gx Gy Gn

Mezcla de genomas.

Utilizar método de reducción de complejidad, por ejemplo, digestión con enzimas de restricción, ligamiento de adaptadores, amplificación por PCR.

ADN de interés

Productos de la PCR purificados y ordenados.

GenotecaClonar fragmentos de la representación.

Seleccionar clones individuales y amplificar por PCR.

Page 102: marcador molecular

DArT: (1) Obtencion DArT: (1) Obtencion del Genotipo De Una del Genotipo De Una

Muestra.Muestra.Marcar la representación (ADN) de la muestra Marcar la representación (ADN) de la muestra con fluorescencia e hibridarla con la matriz.con fluorescencia e hibridarla con la matriz.

Examinar la matriz y medir, para cada fragmento Examinar la matriz y medir, para cada fragmento de la matriz, la cantidad de señal de hibridación.de la matriz, la cantidad de señal de hibridación.

Empleando marcas múltiples, contrastar la Empleando marcas múltiples, contrastar la representación de una muestra con la representación de una muestra con la representación obtenida de otra o con una sonda representación obtenida de otra o con una sonda testigo.testigo.

Page 103: marcador molecular

DArT: (2) DArT: (2) Obtencion del Obtencion del

Genotipo De Una Genotipo De Una muestra.muestra. Gx Gy

Seleccionar 2 genomas para el análisis

Utilizar el mismo método de reducción de la complejidad que usó para hacer el panel de diversidad

Marcar cada subgrupo genómico: color rojo... Marcar cada subgrupo

genómico: color verde...

Hibridar con la matriz

Page 104: marcador molecular

DArT: Ventajas DArT: Ventajas y Desventajas.y Desventajas.

Ventajas:Ventajas: No requiere información sobre las secuencias y Alto No requiere información sobre las secuencias y Alto

rendimiento.rendimiento. Adquisición rápida de datos y análisis rápido.Adquisición rápida de datos y análisis rápido. Detecta cambios de una sola base así como inserciones o Detecta cambios de una sola base así como inserciones o

deleciones.deleciones. Detecta diferencias en la metilación del ADN, según el Detecta diferencias en la metilación del ADN, según el

enzima usado para generar los fragmentos.enzima usado para generar los fragmentos. Genera clones listos para secuenciar.Genera clones listos para secuenciar. Requiere muestras pequeñas de ADN.Requiere muestras pequeñas de ADN. Buena transferencia de marcadores entre poblaciones de Buena transferencia de marcadores entre poblaciones de

mejoramiento y Puede automatizarse totalmente.mejoramiento y Puede automatizarse totalmente.

Desventajas:Desventajas: Los marcadores son dominantes.Los marcadores son dominantes. Tiene requisitos técnicos considerables.Tiene requisitos técnicos considerables.

Page 105: marcador molecular

DArT: Ejemplos DArT: Ejemplos de Aplicaciones.de Aplicaciones.

Caracterización rápida del germoplasma.Caracterización rápida del germoplasma.

Construcción de mapas genéticos.Construcción de mapas genéticos.

Mejoramiento asistido por marcadores.Mejoramiento asistido por marcadores.

Page 106: marcador molecular

4. Polimorfismo 4. Polimorfismo De Un Solo De Un Solo Nucleotido Nucleotido

(SNP).(SNP).Sustituciones de una sola base entre Sustituciones de una sola base entre secuencias homólogas.secuencias homólogas.

Los SNP se dan con mayor frecuencia que Los SNP se dan con mayor frecuencia que cualquier otro tipo de polimorfismo.cualquier otro tipo de polimorfismo.

Pueden identificarse mediante matrices y el Pueden identificarse mediante matrices y el equipo DHPLC.equipo DHPLC.

Page 107: marcador molecular

(1)(1) Interpretacion Interpretacion De De

Los SNP.Los SNP.GTCATAGCATTATTATTATTATTACAGGACTA

CAGTATCGTAATAATAATAATAAGTCCTGAT

GTCATAGCATTATTATTATTATTACAGGACTA

CAGTATCGTAATAATAATAATAAGTCCTGAT

30151bp

Page 108: marcador molecular

(2) Interpretacion (2) Interpretacion De De

Los SNP.Los SNP.

SNP #1

SNP #2