CURSO: BIOQUIMICA

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN: IDENTIFICACION DE ACIDO URICO

DOCENTE: ROXANA

PRESENTADO POR:

TTITO HUAHUACHAMPI ANGÉLICA

28/07/15

AQP- PERÚ

ANALISIS DE ÁCIDO ÚRICO Es un producto de desecho que resulta tras el metabolismo del nitrógeno en el cuerpo humano, que se elimina sobre todo por la orina.

Niveles normales: 2-7 mg/dl

Niveles altos: las principales causas por las que se incrementan las cifras de ácido úrico son: gota, litiasis renal e insuficiencia renal. Aunque también puede ocurrir en casos de diabetes mellitus y alcoholismo. Consumir con frecuencia alimentos ricos en proteínas como el marisco,

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN

FACULTAD DE CIENCIAS

NATURALES Y FORMALES

ESCUELA PROFESIONAL DE QUIMICA

las espinacas, el pescado azul y las carnes rojas también favorece el incremento del nivel de ácido úrico. Incluso puede aparecer un nivel alto después de un ejercicio extenuante.

Niveles bajos: el descenso del ácido úrico aparece en algunas enfermedades en los túbulos renales (síndrome de Fanconi) o en las dietas muy bajas en proteínas

Método para la Determinación de Ácido Úrico en Suero

Fundamento del método de la uricasa

El ácido úrico es oxidado por la Uricasa a Alantína y peróxido de hidrógeno que en presencia de peroxidasa, 4-aminofenazona y 2-4 diclorofenol sulfonato un compuesto rosáceo.La intensidad de quinoamina roja formada es proporcional a la concentración de ácido úrico presente en la muestra ensayada. El ácido úrico y sus sales son el producto final del metaboliso de las purinas. En una insuficiencia renal progresiva hay una retención en sangre de urea, creatinina y ácido úrico. Niveles altos de este último son indicativos de patología renal y generalmente se asocia con la gota.

PRINCIPIO DE LA REACCIÓN:

Material

Suero, plasma u orina (en este caso usamos suero) Baño Maria de 37ºC Timmer -Pipetas y Micropipetas Tubos y Cubetas Fotómetro o Espectrofotómetro. Solución Cloruro de Sodio 0,9%

Reactivos HDBS...........................0,80 mmol/l 4AF..........................250 mmol/l Uricasa........................................................................> 100 U/l Peroxidasa..................................................................>1200 U/l TRIS.............................................................120 mmol/l pH=7.6 Estándar: Solución Ácido Urico 10,0 mg/dl Cubetas de 1 cm de paso de luz Material habitual (pipetas, tubos)

MUESTRA Suero, plasma recogido con EDTA o heparina. Orina recolectada durante 24 horas

Procedimiento

Cálculos

Para el suero:

Método para la Determinación de Ácido Úrico en Suero

Se usarán tres tubos, cada uno de ellos tendrá

Tubo1 (Blanco): 1 mL

RTTubo2 (Patrón): 1 mL RT

+ 25 µL de patrón

Tubo3 (Muestra): 1 mL RT + 25 µL de

muestra

Se medirá con el espectrofotómetro a 520 nm.

Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC en el baño termostático

Leer la absorbancia A 520 nm del patrón y la muestra frente al blanco de reactivo.

Identificación de ácido úrico en gallinaza como en alimento A través de este método es posible determinar el contenido de ácido úrico y sus sales tanto en gallinaza como en alimentos e ingredientes que los constituyen.

Reactivos

Solución de hidróxido de sodio. Disuelva 50 g de NaOH en 50 ml de agua, mezcle bien y almacene la solución en un envase de plástico.

Solución neutra de formaldehido.

1. Mezcle 30 ml de ésta con 50ml de solución de NaOH IN y 25ml de solución de Peróxido de hidrógeno (20 volúmenes). Caliente en baño de vapor hasta que no haya más efervescencia. Enfríe y titule con NaCl IN usando indicador de Fenolftaleína. Realice una titulación de blanco usando 3 ml de agua en lugar del formaldehído y calcule la concentración como sigue:

1ml de la solución de NaOH IN = 0.0300 g de formaldehído.Concentracion de formaldehído (g/100 ml) = ((B-T) × ((0.0300 × 100)/3)

Donde:

B = Titulación del blanco.T = Titulación de la muestra.

2. Prepare una solución neutra que contenga 17.5g de formaldehído con 250ml de agua y 500ml de etanol. Ajuste el pH a 7.0 con una solución de NaOH 0.1N. Diluya a 1000ml con agua, mezcle y ajuste nuevamente el pH de ser necesario.

Solución buffer de Succinato. Disuelva con calentamiento 29.5g de ácido succínico en 750ml de agua y 20ml de la solución de NaOH. Deje enfriar y adicione una cantidad adecuada de solución de formol que contenga 17.5g de formaldehído, mezcle bien y ajuste el pH a 6.0 con la solución de NaOH. Diluya a 1000ml con agua destilada, mezcle y ajuste el pH si es necesario.

Solución de tiosulfato de sodio. Disuelva 25g de Na2S2O3.5H2O en 1000ml de agua destilada.

Solución de lactato de plata. Disuelva con calentamiento 3g de lactato de plata en 50ml de agua destilada y 1ml de ácido láctico. Diluya a 100ml con agua, filtre y almacene en un frasco obscuro. No lo exponga a la luz directa.

Solución de magnesio amoniacal. Disuelva 8.75g de MgSO4.7H2O y 17.5g de NH4CL en 50ml de agua. Agregue 30ml de NH4OH (d = 0.88g/ml), mezcle bien y diluya a 100ml con agua.

Reactivo de Benedict y Hitchcock. Mezcle 35ml de solución de lactato de plata con 15ml de solución de magnesio amoniacal. Adicione 50ml de hidróxido de amonio (d = 0.88 g/ml) mézclese bien. Prepárese inmediatamente antes de usarse.

Solución estándar de ácido úrico. Pese 250mg de ácido úrico con una precisión de 0.1mg y transfiéralo a un matraz de fondo redondo acoplado a un condensador de reflujo. Adicione 100ml de la solución de formaldehído etílico y caliente a reflujo en un baño de vapor por 30min agitando frecuentemente. Enfríe y transfiera a un matraz volumétrico de 250ml, lavando el matraz redondo con sol. de formaldehído etílico, afore con esta solución y mezcle. 1 ml contiene 1 mg de ácido úrico.

Eter de petróleo, punto de ebullición 40 – 60°C.

Materiales y Equipo

Espectrofotómetro con celdas de cuarzo de 10 mm.

Tubos de cristal para percolación, con aproximadamente 240 mm de longitud, 18 mm de diámetro interno, y en la parte inferior aproximadamente 120mm de longitud y 8 mm de diámetro interno.

Extracción del ácido úrico:

1. De la gallinaza: Pese con una aproximación de 0.001 g cerca de 0.4g de gallinaza seca y colóquela en un matraz de fondo redondo de 150ml. Adicione 60ml de solución neutra de formaldehído, conecte a un condensador de reflujo y caliente en baño de vapor por una hora. Enfríe y filtre a través de un crisol (Porosidad 4) a un matraz volumétrico de 100ml. Enjuague el matraz 3 veces consecutivas con porciones de 10ml de solución de formaldehído etílico, pasando cada porción por el crisol de filtración al matraz volumétrico. Afore con la misma solución y agite.

2. De los alimentos: Pese 4 a 5g de muestra con una aproximación de 0.001 g y desengrásela por extracción con éter de petróleo. Transfiera cuantitativamente la muestra desengrasada a un matraz de fondo redondo y remueva el solvente residual con una corriente suave de aire. Continúe el análisis como previamente se señaló, iniciando con la adición de 60 ml de solución de formaldehído etílico.

Determinación

Identificación de Ácido Úrico

Transfiera con una pipeta de 20 ml de extracto de la muestra pre pesado

centrifugar los 50 ml

Adicione 10 ml del reactivo de Benedict y Hitchcock

mezcle bien y déjelos reposar en la oscuridad por una hora

Centrifuge a 2000 rpm por 15 min

Retire el sobrenadante y deje escurrir por 10 min

Adicione 20 ml de solución de tiosulfato de sodio

En un matraz de 200 ml con 40 ml de solución buffer de succinato

Adicionar 5 ml de la solución preparada

Disuelva el precipitado, agitando con una varilla de vidrio delgada (solución preparada)

Afore con agua destilada y mezcle bien

Mida la absorvancia de la solución a 294 nm en celdas de sílice de 10 mm

Cuidadosamente limpie cualquier líquido remanente sin perturbar el precipitado

compararla con una solución preparada mezclando 5 ml de solución de tiosulfato de sodio con 40 ml de solución buffer

de succinato aforada a 200 ml con agua destilada

Curva de Calibración:

Determine la cantidad de ácido úrico mediante una curva de calibración

Expresión de Resultados

El contenido de N del ácido úrico como % de la muestra está dado por la fórmula:

% N = A/(6 × W)

Donde

A = mg de ácido úrico (en la alicuota del extracto de la muestra) determinado por la medición fotométrica.W = peso de la muestra en g.

CURVA DE CALIBRACIÓN

En tubos de centrifuga transfiera con una pipeta 2, 4, 6, 8, 10 y 12 ml de solución estándar de ácido úrico

(equivalentes a una cantidad similar de ácido úrico en mg)

llévelos a 20 ml con la solución de formaldehído etílico

Adicione a cada tubo 10 ml de reactivo de Benedict y Hitchcock

Continúe el método como en la determinación a partir del

centrifugado

mezcle bien y déjelo reposar en la oscuridad por una hora

Mida la absorvancia de la solución

trace la curva de calibración graficando absorvancia (y) contra

la cantidad correspondiente de ácido úrico en mg (x).

IDENTIFICACION DE ACIDO URICO CON El Lector de tiras usando EasyTouch GCU

Es un monitor para medir ácido úrico (la gota) en la sangre mediante la lectura de tiras reactivas. EasyTouch GCU es una herramienta para controlar el azúcar en sangre, ácido úrico y colesterol.

EQUIPO

• RANGO: 3-20mg/dL (179-1190mmol/L

• Los resultados se pueden obtener en el tiempo: 20 segundos (ácido úrico)

• Tiras Automática de Prueba de ácido úrico: 10

• dispositivo perforador / punción

• Lanceta

• Pantalla LCD y Batería

• Memoria disponible para acomodar los datos de ácido úrico: 50

PROCEDIMIENTO

Identificación de Ácido Úrico

Se calibra el equipo hasta el valor de 105.1 mg/dL

Método de Heilmeyer y Krebs En medio alcalino (carbonato de sodio) el ácido úrico es oxidado a alantoína por intermedio del ácido fosfotúngstico, el cual se reduce a azul de tungsteno. El azul de tungsteno formado es directamente proporcional a la concentración de ácido úrico presente en la muestra. El color es leído por espectrofotómetro a 650 a 700 nm de longitud de onda.

Ácido úrico + H3PW12O40 + O2 → Alantoína + CO2 + AZUL DE TUNGSTENO

(ácido fosfotungstico)

Interferentes: proteínas, lo que es un paso obligatorio antes de la determinación del ácido úrico, esto gracia al ácido tricloroacético, túngstico y fosfotúngstico, sulfato de zinc o hidróxido de bario. Interferentes: sustratos reducidos en general (glutatión, ácido ascórbico, salicilatos, fenoles, tirosina, cisteína, etc.

Linealidad:1-12mg/dL El acetato de uranio se emplea clínicamente para cuantificar sodio en suero.

Acetato de uranio precipita proteínas, y se utiliza este y no otro porque es una sal neutra que no modificara el pH de la solución (es radioactivo) y el carbonato de sodio entrega el medio alcalina.

METODO DE HPLC PARA EL ACIDO URICOMATERIALES

El equipamiento HPLC incluyó: Columna Nucleosil ODS RP-C (250 x 40 mm) empaquetada con partículas de 7 mm de

diámetro, precolumna de Nucleosil ODS con partículas de 10 mm de diámetro Bomba de doble pistón (Modelo 2150) unidad controladora (Modelo 2152) monitor UV-VIS (Modelo 2151) e integrador-calculador (Modelo 2220), todos de LKB

Bromma (Suecia).

Las muestras de sangre se toman usando un perforador de lanceta

Introducir la tira en el equipo

Poner en el círculo de la tira la sangre

Los resultados del examen serán leídos en unidades

de mg / dl.

Como fase móvil se utilizó una solución de KH2 PO4 0.05 M (pH de 5.0). El flujo de la fase móvil se ajustó a 1.0 mL/min. El ácido úrico eluido se monitoreó a 280 nm.

REACTIVOS

Los reactivos empleados fueron de calidad analítica:

solución madre de ácido úrico ácido perclórico solución de NaHPO4

Calibración de la aplicación HPLC:

Calibración de la aplicación HPLC

se preparó una solución madre de ácido úrico 5.95 mmol/L

disolviendo 100 mg de ácido úrico p.a. en 100 mL de una solución de Li2CO3 0.01 M

Se construyó una curva de calibración para cada corrida

En volúmenes adecuados de la fase móvil para obtener patrones de 59.5, 119, 238, 297.5, 446.25, 595, 892, y 1190

µmol/L, respectivamente

diluyendo 100 µL de la solución madre de ácido úrico 5.95 mmol/L

Los patrones de calibración, las muestras clínicas frescas, los sueros de control y las muestras de

suficiencia se desproteinizaron con ácido perclórico 0.4 mol/L.4 500 µL del sobrenadante

se mezclaron con 500 µL de una solución de NaHPO4 0.25 mol/L

Construcción de la curva dosis-respuesta: el contenido de ácido úrico en las muestras desconocidas se calculó mediante una línea recta ajustada a la relación altura-del-pico vs concentración de ácido úrico.

Ensayo de detección enzimática del pico de ácido úrico:

Se realizaron incubaciones en paralelo de 100 µL de la solución madre de ácido úrico 5.95 mmol/L en ausencia de uricasa.

También se incubó, en presencia o ausencia de uricasa, suero humano suplementado con un volumen de la solución madre de ácido úrico 5.95 mmol/L para obtener una concentración final de 250 µmol/L.

Ensayo de recuperación: los patrones de calibración se prepararon diluyendo la solución madre de ácido úrico 5.95 mmol/L con volúmenes adecuados de suero humano o equino, en vez de fase móvil. El suero suplementado se desproteinizó y se ensayó por duplicado mediante la aplicación

Estudios de interferencia: varias sustancias que pudieran interferir con la determinación de ácido úrico mediante el método enzimático/espectrofotométrico se ensayaron mediante la

Ensayo de detección enzimática

Poner 100 µL de la solución madre de ácido úrico 5.95 mmol/L

se incubaron con 100 µL (1.7 U) de uricasa

durante 30 minutos a 37ºC.

La mezcla resultante se desproteinizó 4 y 25 µL del sobrenadante se inyectaron en el cromatógrafo.

en 1000 µL de una solución tamponada de fosfato monosódico/disódico 0.15 M (pH de 7.0)

25 µL de la mezcla se inyectaron en el cromatógrafo con una jeringuilla Hamilton.

aplicación HPLC, primero como una solución pura del analito y después como una mezcla v/v con ácido úrico 300 µmol/L.

Las sustancias analizadas en los ensayos de interferencia fueron: hemoglobina 3.5 g/L, urea 25 mmol/L, secobarbital 20 mg/mL, diazepan (valium) 20 mg/mL, amobarbital 20 mg/ mL, ácido acetilsalicílico (aspirina) 10 mg/mL, fenobarbital 20 mg/mL, ácido ascórbico 25 mmol/ L y glucosa 22 mmol/L.

Bibliografía:

file:///C:/Users/Toshiba/Downloads/187447965-Anlisis-Sangre.pdf

http://groupon.co.id/product/promo.php?i=570

http://www.fao.org/docrep/field/003/ab489s/ab489s04.htm

http://www.linear.es/ficheros/archivos/80_1161005C.pdf

http://es.slideshare.net/jeaguas/creatinina-ac-urico-gota

http://www.medigraphic.com/pdfs/patol/pt-2001/pt014d.pdf

https://books.google.com.pe/books?id=Av4IIsyH-qcC&pg=PA659&lpg=PA659&dq=acido+urico+determinacion+con+version+de+azul+tungsteno&source=bl&ots=Vo6ARXPp98&sig=8GOMVR8FnoIed05tn6i7TxTJ-eM&hl=es-419&sa=X&ved=0CBsQ6AEwAGoVChMI1NPA_77-xgIViHs-Ch26XQzD#v=onepage&q=acido%20urico%20determinacion%20con%20version%20de%20azul%20tungsteno&f=false