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Tema 1: Mecanismos de Transducción de Señales por receptores de Membrana

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TEMA 1

Mecanismos de Transducción de señalespor receptores de membrana

1.1. Comunicación CelularEl primer punto importante cuando se aborda

el estudio de la transducción señales es lacomunicación celular, la cual es necesaria pararegular y coordinar las distintas funcionesfisiológicas. Las células se comunican por sustanciasquímicas llamadas men-sajeros primarios, los cuales,de forma general, pueden agruparse en cuatro tiposprincipales:- Neurotransmisores.- Moléculas de señalizaciónutilizadas por el Sistema Nervioso para comunicarentre si sus distintas estructuras o comunicarse conlos órganos periféricos.- Hormonas.- Moléculas de señalización, formadaspor las glándulas endocrinas que regulan la casitotalidad de las funciones fisiológicas ejercidas porlos distintos órganos.- Factores de Crecimiento.- Moléculas deseñalización por lo general asociadas al control de laproliferación, diferenciación y la muerte celular.- Citoquinas.- Moléculas de señalizaciónimplicadas en el control de la inmunidad delorganismo frente a agentes extraños (virus,bacterias, parásitos) o propios (cáncer).

Esta agrupación de señales por tipos tienemás un valor formativo que real, ya que las fun-ciones fisiológicas humanas normalmente implican adistintas señales englobadas en los apartados an-teriores. Un ejemplo ilustrativo lo constituye el cicloovulatorio. En la pubertad, el sistema nerviosocentral recoge informaciones del organismo, trans-mitidas por descargas hormonales, de factores decrecimiento y citoquinas, que quedan recogidas porel “Gonadostato”, estructura implicada en laregulación del comienzo y posterior continuidad delciclo ovárico. El acumulo de información en elgonadostato, en un momento dado del desarrollo, estal que provoca la activación de determinadas vías deneurotransmisión que confluyen en el Hipotálamo yactivan la síntesis y secreción de factores estimu-lantes del ciclo (entre ellos, LHRH, HormonaLiberadora de LH). Estas sustancias llegan a laHipófisis, donde activan la secreción de hormonastales como LH (Hormona Luteinizante) y FSH(Hormona Estimulante de Folículos). Las hormonashipofisarias estimularán en el ovario la maduraciónde ciertos folículos, lo cual implica la síntesis deestrógenos y progestágenos, de factores decrecimiento y ciertas citoquinas. Estas sustanciasejercen dos efectos fundamentales. Por un lado,provocan la maduración de un único folículo y laatresia del resto (procesos de proliferación,

diferenciación y muerte), así como la proliferacióndel endometrio para hacerle receptivo al oocito, encaso de fecundación, y, por otro, envían señales alas estructuras anteriores (SNC, hipotálamo ehipófisis), las cuales son integradas en su conjunto,regulando la secreción de las señales implicadas conel fin de asegurarse la culminación perfecta del cicloovárico. Si no hay fecundación, la suma deconcentraciones de neurotransmisores, hormonas,factores de crecimiento y citoquinas, disparan otraserie de procesos como la involución del endometrio(apoptosis) y el comienzo de un nuevo ciclo ovárico.

Los limites que definen a los distintos tiposde señales a veces no están demasiado claros, ya quese conocen ejemplos de sustancias neurotransmi-soras que pueden actuar como hormonas (depen-diendo de la concentración y de la célula diana). Deigual forma, algunas hormonas en ocasiones secomportan como factores de crecimiento.

1.1.1. Tipos de Comunicación Intercelular.Tradicionalmente, basándose en la distancia

que ha de recorrer el mensajero primario para ejercersu efecto en la célula diana, se han distinguido trestipos generales de comunicación:- Señalización endocrina.- Las señales (usualmentehormonas) deben de recorrer distancias conside-rables (hasta más de 1 m) para actuar sobre la céluladiana y normalmente son transportadas por lasangre. Dada la dilución que sufre la hormona en elsistema sanguíneo necesita que las moléculasreceptoras presenten una elevada afinidad por estas.- Señalización paracrina.- Las señales liberadas poruna célula afectan a células en su proximidad (menosde 1 µm). La conducción de un impulso eléctricodesde una neurona a otra neurona o a una célulamuscular es un ejemplo de señalización paracrina.Dada la elevada concentración de neurotransmisorque se consigue en este tipo de señalización, laafinidad de las moléculas receptoras no necesita sermuy elevada.- Señalización autocrina.- En este caso, la célularesponde a sustancias liberadas por ella misma. Lamayoría de los factores de crecimiento actúan de estaforma o de forma paracrina, para estimular elcrecimiento y la proliferación celular. Las célulastumorales en muchos casos producen factores decrecimiento que, de forma descontrolada, promuevenel crecimiento de la masa tumoral.

Además de estos tipos generales decomunicación, las células pueden recibir señales delmedio extracelular por dos tipos más de mecanismos:- Señalización Yuxtacrina o comunicación Célula- Célula . Son mecanismos bastante importantes decomunicación. En general, están mediados porproteínas de membrana plasmática de una célula queson reconocidas por proteínas receptoras de otracélula. La interacción de la proteína ligando con la


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proteína receptora dispara ciertas vías de señalizaciónen la célula diana. Ejemplos de este mecanismo sedan en células del sistema inmune (adhesión deleucocitos, reconocimiento por células T citotóxicasde células infectadas, etc.). Otro mecanismoimportante de resaltar en la comunicación intercelulares la existencia de “Gap Junctions” entre célulasvecinas. La estructura Gap Junction comunica loscitoplasmas de células vecinas, mediante elestablecimiento de “poros”, permitiendo elintercambio de metabolitos de pequeño pesomolecular (usualmente no mayores de 1kd),incluyendo a la mayoría de segundos mensajeros.- Comunicación Célula-Matriz Extracelular . Sonmecanismos de comunicación que permiten laadhesión de las células a las proteínas extracelularesde la matriz extracelular (fibronectina, laminina,colágenos, etc.). Es un mecanismo crucial para elmodelado (desarrollo) o remodelado (tras algún tipode lesión) de los órganos.

Finalmente, en los últimos años, se hanpuesto de manifiesto diversos ejemplos deseñalización que se engloban dentro del término deSeñalización Intracrina. En este caso, un metabolitooriginado en la célula puede disparar vías deseñalización en la propia célula sin necesidad de saliral exterior. Un ejemplo válido lo constituye laregulación de la biosíntesis del colesterol. Cuandolas concentraciones de colesterol endógenas son muyelevadas, esta molécula es capaz de activar unrepresor transcripcional que inhibe la transcripciónde los genes implicados en la biosíntesis de novo delcolesterol.

1.2. Tipos de Receptores.Para que una molécula señal sea reconocida

por la célula diana se necesita de la presencia de unamolécula receptora que pueda modificar su actividadbiológica al interaccionar con la señal. Las moléculasreceptoras o Receptores se clasifican en dos tiposprincipales, dependiendo de la naturaleza química delligando o señal. Así, si la señal o Ligando es denaturaleza liposoluble podrá atravesar la membranaplasmática sin mucha dificultad e interaccionar consus receptores intracelulares. La interacción posibilitala activación del receptor y la posterior regulación dela expresión génica de un grupo determinado degenes. A estos receptores se les denomina Recep-tores Nucleares (ya que muchos presentan dichalocalización) o Receptores Intracelulares, loscuales serán objeto de estudio en el tema 2. Por elcontrario, si la señal es de naturaleza hidrosoluble,dado que no podrá atravesar la membranaplasmática, necesita de la existencia de receptoresasociados a la membrana plasmática. La activacióndel receptor por el ligando promueve, en la mayoríade los casos, la formación de moléculastransductoras de la señal que reciben el nombre de

Segundos Mensajeros. Estas moléculas son lasresponsables de activar los procesos biológicos enlas células diana mediante la activación de rutas detransducción específicas que, en último término,también modificaran la expresión de grupos degenes. A este tipo de receptores se les denominaReceptores de Membrana Plasmática, siendoobjeto de este tema su estudio así como las rutas detransducción generadas por ellos.

Los receptores de membrana se han agrupadoen cuatro tipos generales (Figura 1.1):- Receptores Ionotrópicos.- La unión delligando cambia la conformación del receptor demodo que permite el flujo de un determinado ion através del receptor. El movimiento iónico resultantealtera el potencial eléctrico de la membrana celular.Un ejemplo lo constituye el receptor de acetilcolinaen la placa motora.- Receptores metabotrópicos.- También cono-cidos como receptores asociados a proteínas G oreceptores Serpentínicos. Estos receptores estánasociados a proteínas G. La unión del ligando activaa una proteína G, la cual a su vez activa o inhibe auna determinada enzima que genera un segundomensajero, o bien modula la actividad de un canaliónico, causando un cambio en el potencial demembrana. Ejemplos de señales que actúan a travésde este tipo de receptores son epinefrina, serotoninay glucagón.

Figura 1.1. Tipos de receptores en la señalización celular.

- Receptores con actividad enzimáticaintrínseca.- Como su nombre indica, la activacióndel receptor por el ligando propicia que el receptormuestre una actividad enzimática. Este grupoengloba a receptores con distintas actividadesenzimáticas. Así por ejemplo, el factor natriuréticoatrial al interaccionar con su receptor activa su


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actividad guanilato ciclasa, la activación del receptorde leucocitos CD45 activa su actividad tirosinafosfatasa, la activación de los receptores de insulinay de muchos factores de crecimiento provoca laaparición de actividades tirosina quinasa (insulina,factor de crecimiento epidérmico) o serina/treoninaquinasa (factor de crecimiento transformante tipo ß).- Receptores asociados a tirosin-quinasascitosólicas.- También conocidos comosuperfamilia de receptores de citoquinas. Estosreceptores carecen de actividad catalítica pero seasocian directamente, tras su activación, conproteínas citosólicas que tienen actividad tirosinaquinasa. Ejemplos de señales que interaccionan coneste tipo de receptores son prolactina y hormona delcrecimiento (hormonas), la mayoría de citoquinas einterferones y ciertos factores de crecimiento(eritropoyetina).

1.3 Tiempo de Respuesta de Receptores.Una característica que conviene destacar en

este punto es la rapidez o lentitud de los distintosreceptores en generar una respuesta biológicaprecisa. Los receptores ionotrópicos se activan porligando permitiendo el flujo de iones a favor de ungradiente de concentración. Esta respuesta queprovoca cambios en el potencial de membrana puedeobservarse en ms después de la activación delreceptor. Por otra parte, algunos segundosmensajeros, generados por receptores metabotró-picos, pueden modular canales iónicos. Dado que serequieren varios eventos (activación del receptor,interacción con proteínas G del receptor para suactivación e interacción de la proteína G con el canalque va a modular) el cambio en potencial demembrana tarda más tiempo en producirse, por logeneral varios segundos. La mayoría de receptoresmetabotrópicos y con actividad enzimática intrínsecaa través de sus rutas de transducción modulanpositiva o negativamente las actividades de enzimascitosólicas, pudiéndose observar dichas modula-ciones tras varios minutos (entre 2 y 15) de laadición del factor. Finalmente, las rutas detransducción de la mayoría de los receptores (seande membrana o intracelulares) modifican la actividadtranscripcional de proteínas nucleares implicadas enla síntesis de ARNm específicos, en el primer casode una forma indirecta y en el segundo de una formadirecta.. En estos casos la cadena de eventos es aúnmayor por lo que los efectos biológicos tardan enobservarse varias horas.

1.4. Receptores IonotrópicosComo se han definido anteriormente, la

unión del ligando al receptor (canal) origina uncambio en la estructura de este que permite el flujo afavor de gradiente de iones específicos. La estructuraprototipo de los receptores ionotrópicos queda

esquematizada en la figura 2.1. Estos receptoresestán formados por cinco subunidades proteicas quese disponen integradas en la membrana plasmáticaformando una estructura de anillo, quedando situadoel “poro” iónico en el centro de dicha estructura.

Figura 1.2. Esquema de receptor ionotrópico.

Además del sitio de unión con el ligando,estos receptores, suelen presentar dominios deregulación de la actividad del canal. Dichos dominiospueden presentarse orientados al exterior celular o alinterior citosólico. Los primeros suelen ser reguladospor otras señales químicas que modifican laestructura del canal regulando el flujo iónico. Lossegundos, si bien presentan la misma función deregulación, normalmente, reflejan cambios en elestado de fosforilación del canal, lo cual depende delestado de funcionamiento de otras rutas deseñalización. Por lo tanto, podemos distinguir dosetapas de señalización: la primera donde la unión delneurotransmisor provoca la apertura del canal y lasegunda donde la acción de otras señales (otrosneurotransmisores o rutas de señalización disparadaspor hormonas) modula el flujo iónico a través dedicho canal, siendo un control mucho más fino demodulación.

Es conveniente distinguir en este punto laexistencia de dos tipos generales de canales iónicos:operados por ligando (el caso que nos ocupa) yoperados por voltaje. Estos últimos, a diferenciade los primeros, no necesitan de la unión de unligando para activarse sino que responden a cambiosdel potencial de membrana de la célula. Ejemplos deeste tipo de canales lo constituyen los canales paraNa+ y K+, presentes en los axones de las neuronas yque están implicados en la transmisión del impulsonervioso, o canales de Ca2+ implicados fundamental-mente en procesos de exocitosis. El hecho de queestos canales no necesiten de ligando para su


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activación no implica que no puedan ser moduladospor mecanismos similares a los descritos para losreceptores ionotrópicos.

1.5. Receptores ligados a Proteínas GMuchos receptores en su ruta de transducción

activan a proteínas transductoras denominadasproteínas G, las cuales a su vez modulan positiva onegativamente la actividad de enzimas capaces deoriginar segundos mensajeros. Si bien estosreceptores unen diferentes hormonas y mediandiferentes respuestas celulares, tienen una serie decaracterísticas estructurales y funcionales comunes:a- La secuencia aminoacídica del receptor contienesiete segmentos en α-hélice formados por 22-24residuos hidrofóbicos que están integrados en lamembrana plasmática (figura 3).b- El lazo de residuos aminoacídicos entre las α-hélices 5 y 6 y el extremo C-terminal del receptor,ambos en la parte citosólica del mismo, sonimportantes para las interacciones con las proteínas G.

Figura 1.3. Esquema de receptor acoplado a proteínas G.

c- La proteína G transductora asociada con elreceptor funciona como un interruptor molecular,presentando su estado inactivo cuando se encuentraunida a GDP. La unión del ligando al receptor causala liberación del GDP de la proteína G y suintercambio por GTP, presentando ahora su estadoactivo.d- La proteína G activada (unida a GTP) interaccionay modula (activa o inhibe) a una enzima efectora,la cual cataliza la formación de un segundomensajero, o bien modula la actividad de canalesiónicos.f- La hidrólisis del GTP unido a la proteína Grevierte a la proteína G a su estado inactivo.

Se han caracterizado distintos tipos deenzimas efectoras capaces de ser activadas porproteínas G (figura 1.4):- Adenilato Ciclasa (AC).- enzima generadora deAMPciclico (AMPc), el cual es capaz de activar a la

proteína quinasa A (PKA) en su ruta detransducción.- Fosfolipasa C (PLC).- enzima generadora deInositol trifosfato (IP3) y Diacilglicerol (DAG), loscuales son capaces de activar, respectivamente, a lasproteína quinasa Ca-calmodulina (PK Ca-CaM) y ala proteína quinasa C (PKC) en su ruta detransducción.- Fosfolipasa A2 (PLA2).- enzima generadora deAcido araquidónico (AA), el cual es capaz de activara la proteína quinasa C (PKC) en su ruta detransducción.

Por otra parte, con respecto a la modulaciónde canales iónicos se ha visto que median la aperturade canales de K+ y de Ca2+.

E. ExtracelularAC AMPc PKA

Membrana PLC IP3 PKCaCaMDAG PKC

PLA2 AA PKCCanal

G Iónico

E. Intracelular

Receptor Prot. G Efector

Figura 1.4 Activación de diversos efectores por proteínas G.

1.5.1. Proteínas GComo hemos dicho anteriormente, las

proteínas G actúan como transductores de lainformación generada en la unión del ligando alreceptor y son capaces, dependiendo del tipo celulary del receptor específico) de poder modular laactividad de proteínas efectoras o canales iónicos.Las proteínas G reciben este nombre por sucapacidad de intercambiar los nucleótidosGTP/GDP, modulándose así su actividad biológica.Estas proteínas forman una superfamilia en la que sepueden distinguir dos familias a su vez: la familia delas proteínas G heterotrímericas y la familia deproteínas G pequeñas, cuyo nombre hacealusión a su bajo peso molecular comparado con elde las anteriores. En este punto nos referiremos a lasproteínas G heterotrímericas ya que son las quetienen capacidad de interaccionar con receptoresactivados. Las proteínas G pequeñas también puedenestar implicadas en rutas de transducción de señales,como es el caso de p21-RAS que estudiaremos másadelante. Otros ejemplos de proteínas G pequeñas loconstituyen G-Tu (factor de elongación en la síntesisde proteínas, o rab-3, proteína implicada en losprocesos de exocitosis.

Las proteínas G heterotrímericas, estánformadas por las subunidades α, β y γ. Si bien en


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los últimos años se ha descrito la implicación de lassubunidades β y γ en la transducción de algunasseñales, la mayoría de la acciones descritas implicana la subunidad α. En el caso de las proteínas Gheterotrímericas, la capacidad de interacción con losnucleótidos GTP o GDP reside en la subunidad α,presentando para ello un dominio de interacción connucleótidos, que presenta también una actividadenzimática GTPasa ; es decir, la subunidad α es capazde forma intrínseca de hidrolizar el GTP a GDP,función esencial en el control de las rutas detransducción donde está implicada. Aparte deldominio de interacción con el GTP, puedendistinguirse otros tres dominios: el dominio deinteracción con las subunidades β y γ, situado en elextremo N-terminal, el dominio de interacción con laenzima efectora o el canal, y el dominio deinteracción con el complejo receptor-ligando, en suextremo C-terminal (Figura 1.5).

Figura 1.5. Esquema de los principales dominios de lassubunidades α.

La clasificación de las proteínas Gheterotrímericas se hace en función del tipo desubunidad α que presenten, ya que se conocendiversos tipos de subunidades α. Se considera queproceden de un gen ancestral común y, si bienpresentan una elevada homología de secuencia,existen pequeñas diferencias que son las queoriginan su especificidad. Así, por ejemplo, lassubunidades α de tipo αi y αo presentan delecionesen el extremo N-terminal, lo cual origina variacionesen la interacción con las subunidades β y γ.Las subunidades β y γ (tienen fundamentalmente lafunción de anclaje a la membrana y son de menorpeso molecular, 36 y 10 kd, respectivamente.Como se ha mencionado anteriormente, existenmuchas clases de proteínas G, pudiendo mediarefectos de señalización de algunos neurotransmisores(acetilcolina, norepinefrina, etc.), hormonas(glucagón, adrenalina, TSH, etc.) y ciertascitoquinas; en concreto, las quimoquinas, que soncitoquinas implicadas en la atracción de células delsistema inmune al foco infeccioso, siendo unejemplo la Interleuquina 8. Además de latransducción estas señales, las proteínas G estánimplicadas en la transducción de señales sensitivas,

como lo constituyen los casos de transmisión deimpulsos visuales (αt), olfatorios (αollf) o del gusto(αg).

En la actualidad, las distintas proteínas G sehan agrupado en cuatro familias que se nombran conun subíndice que indica la primera función por la quese caracterizaron. Estudios posteriores han probadoque pueden realizar más de una función,dependiendo del tipo celular donde se expresen.Estas subfamilias son: Gs (estimula adenilatociclasa), Gi (inhibe adenilato ciclasa), Gq (estimulaPLC) y G12, de función desconocida.

Por otra parte, muchas de las subunidades αpueden ser modificadas covalentemente y de formairreversible por toxinas bacterianas, lo cual afecta a laactividad de dichas subunidades. Concretamente, latoxina colérica causa la ADP-ribosilación de un restode Arg del dominio de interacción con el GTP, loque hace que la subunidad alterada pierda lacapacidad de hidrolizar el GTP y, por lo tanto, que lasubunidad αs se encuentre siempre en estado activo(fig. 1.5). Una consecuencia de la activaciónirreversible son las diarreas típicas en personasinfectadas de cólera. La toxina pertussis tambiénproduce la ADP-ribosilación de subunidades α (αi yαo), siendo en este caso la modificación en unresiduo de Cys, en el dominio C-terminal o deinteracción con el receptor. En este caso, lamodificación produce la falta de interacción entre elreceptor y la proteína efectora y la ausencia deseñalización por esta vía. Esto influye en lasensibilidad a la histamina y en la bajada de lasconcentraciones de glucosa que se producen en latosferina.

Figura 1.6. Activación de proteínas G heterotriméricas.

La tabla 1.1 resume las principales familias deproteínas G, destacando sus efectos, su posibilidadde ADP-ribosilación, su distribución por tejidos yalgunos ejemplos de señales implicadas.

1.5.2. Mecanismos de Activación de Proteínas G.Las proteínas G heterotrímericas, en su

estado inactivo, presentan GDP unido a la


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Familia/ Subfamilia

Efecto ADP-ribosilación

Distribución Ejemplos deReceptores

Gs αs

+AC CTX todos los tejidos Adrenalina+ Canal Ca2+ Noradrenalina+ Canal Na+ Histamina

FSH, LH αolf

+AC CTX epitelio neuro-olfatorio

odorantes

Gi αi, αo

-AC PTX cerebro y otrostejidos

Ach

+ Canal K+ Noradrenalina+PLC opiáceos+PLA2 Angiotensina+ Canal Ca2+ Muchos péptidos

αt+Fosfodiesterasasespecíficas de GMPc

CTX,PTX retina fotoreceptores(retinal)

αz+PLC cerebro, adrenes-AC plaquetas

αg+AC PTX papilas gustativas quimoreceptores

Gqαq, α11 , α14

+PLC varios ACh

α15 , α16Noradrenalina

G12 α12 , α13

? ubicuas ?

Tabla 1.1. Principales características de las principales familias de proteínas G.

subunidad α. Cuando la hormona se une al receptor,el complejo interacciona con la proteína G, lo quepermite el intercambio de GDP por GTP. Estaactivación provoca además la disociación de lasubunidad α de las subunidades β y γ La subunidadα-GTP esta preparada para actuar sobre el efector ymodular su actividad. Dado que la subunidad αpresenta una actividad GTPasa intrínseca, lahidrólisis posterior del GTP a GDP posibilita lareasociación de las subunidades α, β y γ, con lo cualobtenemos la configuración de partida (Fig. 1.6).

1.5.3. Ruta de transducción del AMPc.El objetivo de este apartado es resaltar algunas

de las características más sobresalientes de lasproteínas implicadas en esta ruta de transducción; asícomo poner de relieve la importancia del fenómeno deamplificación de señal a través de sucesivas etapas.

La adenilato ciclasa (AC) fue la primeraenzima caracterizada capaz de ser activada porproteínas G. La AC cataliza el ciclamiento del ATP(substrato) para originar AMP cíclico (AMPc), que esla molécula con actividad de segundo mensajero. Enla célula existen enzimas (fosfodiesterasas)

capaces de catabolizar el AMPc, transformándolo en5’-AMP. Experimentos realizados midiendo lasconcentraciones de AMPc intracelulares tras laexposición de las células a una hormona , comoglucagón o adrenalina, demuestran que se alcanza unpico de concentración a los 2 minutos, el cualdesciende rápidamente de tal manera que a los 5-7minutos las concentraciones han vuelto a sus valoresbasales. Este dato nos demuestra que para latransmisión de la señal no se necesita mantenerelevadas las concentraciones por tiempos largos. Laventaja de este mecanismo radica en que la célulapuede responder a un nuevo impulso hormonal en unperiodo relativamente corto de tiempo y, por otraparte, puede integrar al mismo tiempo las señalesrecibidas por otras rutas de transducción, las cualespueden ser de signo contrario.

La AC presenta dos dominios hidrofóbicospor los cuales permanece anclada a la membranacitoplasmática, separados por un dominio citosólicoque es donde radica su actividad enzimática.Finalmente existe un cuarto dominio citosólico que esdonde reside la capacidad de interacción con lasproteínas G específicas.


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En la actualidad, se han caracterizado distintasproteínas con actividad adenilato ciclasa pero quedifieren en sus propiedades, ya que pueden serreguladas por distintas proteínas G, presentarlocalizaciones tisulares diferentes, y pueden serreguladas positivamente por Ca2+ o por subunidadesβ−γ. Atendiendo a que puedan o no puedan seractivadas por el ion Ca2+ se clasifican como de Tipo I(ACI y ACIII) o de Tipo II (ACII y ACIV),respectivamente. A su vez, las AC de tipo I puedenser reguladas o no de forma negativa por lassubunidades β−γ. Así , la AC1, que presenta este tipode regulación negativa, se diferencia de la AC3, queno lo presenta. La potencia de inhibición de lassubunidades β−γ es unas 20 veces menor que lapotencia de activación de la subunidad αs. Siimaginamos un sistema ideal celular con un único tipode receptor acoplado a proteínas G y con unaactividad ACI; en este sistema, dado que la relaciónαs/β−γ es de 1, la célula, tras la activación delreceptor activaría la AC1 sin el menor problema. Sinembargo, en los sistemas celulares reales, coexistendistintos tipos de proteínas G, algunas de las cuales(Gq o G12) si bien no interaccionan de forma directa através de su subunidades α con AC1 si puedenincrementar las concentraciones de las subunidadesβ−γ intracelu-lares, pudiendo llegar a compensar poreste aumento de concentración su menor potenciapara la inhibición.

Figura 1.7 . Modelo de disociación parcial.

Enlazando con lo anterior, es conocido quelos receptores que activan a proteínas Gi son capacesde inhibir la actividad AC. Sin embargo, no se hapodido demostrar la asociación directa AC-subunidadαi, por lo cual se ha postulado que este tipo deproteínas G actuaría inhibiendo a la AC mediante elaumento de las concentraciones de subunidades β−γ,las cuales secuestrarían rápidamente a lassubunidades αs (Fig. 1.7).

Finalmente, las AC de tipo II comparten doscaracterísticas: la ya mencionada de no ser reguladaspor calcio y la se ser positivamente moduladas porsubunidades βγ. Hay que destacar en este punto quesi bien tradicionalmente (los últimos 15 años¡¡) sepensaba que las subunidades βγ presentaban un únicopapel en el anclaje a la membrana, en los últimos añosse están caracterizando diversos subtipos para ambassubunidades, lo cual puede afectar a las AC dediferentes maneras, todavía no identificadas.

El incremento en los niveles de AMPc, comoconsecuencia de la activación de AC, pone en marchael siguiente paso en la transducción de señal, queconsiste en la activación de la protein-quinasa A(PKA). La PKA consta de cuatro subunidades: dosreguladoras y dos catalíticas. En el proceso deactivación se requiere la unión de dos moléculas deAMPc por molécula reguladora. Dicha unión desplazael equilibrio de interacción entre ambos tipos desubunidades de tal forma que las subunidadescatalíticas se liberan de las reguladoras y quedanactivadas pudiendo realizar la fosforilación deproteínas específicas en residuos Ser o Tre, utilizandocomo cosusbtrato el ATP (fig. 1.8). La identificaciónde proteínas substrato de la PKA ha permitidoconocer que dichos substratos son proteínasmodulables por fosforilación y que éstas presentan unamplio rango de actividades biológicas, ya que se hanidentificado proteínas del tipo de canales iónicos( proteínas de membranas ), como canales de K+ queven disminuida su actividad en la salida al exterior dedicho ion, enzimas citosólicas relacionadas con elmetabolismo general (glucógeno fosforilasa, piruvatoquinasa, etc) o factores transcripcionales nucleares ,como es el caso de la proteína CREB (proteína deunión al elemento de respuesta activado por AMPc;ver tema 4), la cual puede modificar la expresióngénica de determinados genes.

Dado que existe una enzima específica(fosfodiesterasa), capaz de inactivar al AMPc, amedida que las concentraciones de AMPc vayandisminuyendo, las subunidades reguladoras de laPKA dejaran de interaccionar con el segundomensajero y empezaran a desplazar el equilibrio haciala forma inactiva. Si midiéramos las concentracionesde PKA activa en sistemas ideales (cultivo de células)observaríamos que la PKA empezaría a activarse a los2 minutos, alcanzaría un pico máximo hacía los 5minutos y prácticamente estaría en estado basal (noactivo) a los 15 minutos.

De igual forma existen enzimas fosfatasasespecíficas para las distintas proteínas substratos de laPKA ( Serin-treonin-fosfatasas ). La medición de lasformas activas de estas proteínas substratos ennuestro sistema ideal nos daría curvas de activaciónsimilares pero retrasadas ligeramente en el tiempo.Así, considerando el caso del factor de transcripciónCREB, veríamos una activación máxima a los 10-15


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minutos (CREB-P) y su vuelta al estado basal (nofosforilado, CREB, y por lo tanto inactivo)aproximadamente a los 30 minutos.

4 AMPc R R R R

C C 4 AMPc

C C

Modulación por fosforilación de:

-Canales iónicos

P-Enzimas citosólicas

-P

-Factores transcripcionales CREB-P

Figura 1.8. Activación de Proteína quinasa A y de sus dianasmoleculares.

A la vista de los datos anteriores podríanplantearse algunas preguntas: ¿Cómo una ruta deseñalización con un tiempo de actuación tanrelativamente corto puede generar cambios tanprofundos en las células? ¿Qué ventaja evolutivasupone tener vías de señalización de corta duración?La respuesta a la primera pregunta se centra en elfenómeno de amplificación en cascada , el cual loexplicaremos con el ejemplo de una ruta activada porAMPc, la hidrólisis del glucógeno hepático paraproducir glucosa plasmática. El organismo respondea la bajada de concentración de glucosa en plasma(tras un periodo de ayuno, por ejemplo)incrementando las concentraciones de glucagón,hormona del páncreas endocrino, sintetizada por lascélulas α, que al interaccionar con su receptor en lacélula hepática, pondrá en marcha la ruta deactivación de la PKA. Esta enzima es capaz defosforilar, y en consecuencia activar, a la enzimacitosólica Fosforilasa b quinasa, la cual a su vezfosforila y activa a la Glucógeno fosforilasa b,enzima que actúa sobre el glucógeno realizando lahidrólisis de enlaces α 1-4 y rindiendo restos deglucosa 1-fosfato, la cual tras sucesivos pasos, setransforma en glucosa que podrá abandonar la célulahepática con el fin de mantener la homeostasis deglucosa en plasma. Si suponemos que la célulahepática presenta 10 receptores de glucagón en susuperficie, lo cual es un número muy conservador (seconocen ejemplos de tipos celulares con 20.000

receptores/célula), y que en cada paso de la ruta cadaenzima es capaz de activar 10 moléculas del pasosiguiente por minuto (número todavía másconservador ya que la actividad enzimática para estasenzimas está en el rango de nmoles-µmoles/min, elresultado sería la liberación de 1millón de moléculasde glucosa por célula y por minuto!!

Para contestar a la segunda pregunta, yutilizando el ejemplo del ayuno, el glucagón tambiéninduce, a través de CREB, la expresión del gen de lafosfoenol-piruvato carboxiquinasa (PEPCK), enzimade la ruta gluconeogénica implicada en la síntesis deglucosa a partir de substratos no glucídicos. Mientrasel organismo siga en ayuno, el hígado podráresponder a las nuevas moléculas de glucagón que,por vía sanguínea, lleguen procedentes del páncreas.Si en un momento dado el organismo ingiere alimentorico en carbohidratos, el páncreas dejara de liberarglucagón y empezará a liberar insulina (hormona conefectos metabólicos opuestos que estudiaremos másadelante en este tema). En este caso, cuando lasconcentraciones crecientes de insulina lleguen alhígado, encontraremos una célula adaptada a unmetabolismo de ayuno (por las anteriores señales deglucagón) que empieza a recibir señales contrarias.En un tiempo de actuación similar al anterior lainsulina revierte el metabolismo del glucógeno(inactivando a la glucógeno fosforilasa b y activandoal mismo tiempo a la glucógeno sintasa, paracompletamente la transcripción del gen de la PEPCK(inhibe la funcionalidad de CREB), reduce la vidamedia de los RNAm de este gen y desestabiliza laproteína ya formada para que sea degradadarápidamente. Así, el organismo, en tiempos inferioresa 1 hora a cambiado su comportamiento metabólicocon respecto a la glucosa. Otro ejemplo de adaptacióntodavía más corto en el tiempo lo constituye lapreparación a una situación de peligro para elorganismo (descarga de adrenalina, que actúa deforma muy similar al glucagón con respecto alsistema AC). Por tanto, la existencia de múltiplespasos en las rutas de señali-zación supone una mejoramplificación de respuesta, la posibilidad de que unamisma ruta module muchos procesos molecularesdistintos y también disponer de más puntos deregulación o control, lo cual proporciona un ajustemucho mas fino o preciso.

1.5..4.- Ruta de transducción del Fosfatidil Inositol.De forma análoga a como las subunidades αs

activan la AC, otras subunidades α (αi, αo o αq ) soncapaces de activar a la enzima efectora Fosfolipasa C(PLC). En este caso el substrato de la enzima que altransformarse origina los segundos mensajeros sonlas moléculas de Fosfatidil Inositoles. Estasmoléculas, además de ser precursoras desegundos mensajeros tienen importancia en el anclajede proteínas extracelulares a la membrana plasmática.


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Figura 1.9. Generación de segundos mensajeros (IP3 e 1,2-diacilglicerol) por Fosfolipasas C (ver texto).

Los fosfatidil inositoles (PI) son fosfolípidos que secaracterizan por poder presentar varios grados defosforilación a través de las funciones alcohol de lamolécula de inositol (ver figura 1.9), siendo elsubstrato de la PLC la molécula de Fosfatidil Inositol4,5 bifosfato (PIP2). La PLC causa la hidrólisis delenlace éster entre el grupo alcohol primario de lamolécula de glicerol y el ácido fosfórico, originandolas moléculas de diacilglicerol (DAG) y de Inositol1,4,5-trifosfato (IP3).

Los productos de la reacción tienen lacaracterística de actuar como segundos mensajeros ensendas rutas de transducción. Así, el DAG, quequeda unido a la membrana, es capaz de activar a laprotein-quinasa C (PKC), la cual, de forma análoga ala descrita para PKA es capaz de modular porprocesos de fosforilación la actividad de muchasproteínas, ya sean de membrana, citosólicas ofactores de transcripción. Por su parte, el IP3, que essoluble en el citoplasma, mediante su interacción concanales de Ca2+ tetraméricos, situados fundamental-mente en el retículo endoplásmico, puede incrementarlas concentraciones de Ca2+ citosólico de 10 a 1000veces. El aumento en las concentraciones de este ionactiva la función de varias proteínas que sondependientes de él. Entre estas proteínas dependientesde Ca2+ destaca la Calmodulina una proteínareguladora de ciertas proteína quinasas (PK Ca-CaM), las cuales, una vez activadas, tienen efectosanálogos a los descritos para otras proteína quinasas.

Se conocen varios subtipos de PLC que, aligual que vimos para la AC, se clasifican en funciónde las moléculas implicadas en su activación. De losdiversos tipos los más importantes son:

-PLC β .- Son las activadas por proteínas G.Dependiendo de la subunidad a implicada en suactivación, los receptores responsables de suactivación se clasifican en Familia Gq y Familia Gi.Son bastantes las moléculas de señalización capacesde activar este tipo de efector: neurotransmisores(Noradrenalina, Acetilcolina o 5-hidróxi-triptamina),neuropéptidos (vasopresina, angiotensina, PéptidoIntestinal Vasoactivo -VIP-, o colecistoquimina) uhormonas (glucagón, GnRH, TRH).-PLC γ .- Son activadas por receptores con actividadtirosin-quinasa intrínseca, tales como receptores deEGF, FGF o PDGF (factores de crecimientoepidérmico, fibroblástico y derivado de plaquetas,respectivamente). Este tipo de activación consiste enla interacción de la PLC γ con estos receptores através de dominios SH2 (ver más adelante en eltema). Dentro de este tipo de PLC también se handescrito algunas que pueden ser activadas por Ca2+.

Al igual que vimos para la ruta activada porAC, la ruta de la PLC es inactivada de formaparecida. El catabolismo (inactivación) de lossegundos mensajeros implica varios pasosenzimáticos (figura 1.10) que finalizan en laformación de Fosfatidil Inositol 4,5 bifosfato; esdecir, el PIP2, que era el substrato de la PLC, se


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recupera a partir de los productos del metabolismo deIP3 y DAG. Por tanto, para la síntesis de amboscompuestos es necesario el correcto funcionamientode la ruta de degradación. El IP3 se defosforila, poracción de fosfatasas, en reacciones sucesivas para darlugar a Inositol. Por su parte, el DAG se fosforila poracción de una quinasa para dar lugar a ácidofosfatídico, el cual mediante una citidil transferasaforma fosfatidil-CMP. El inositol y el fosfatidil-CMPson substratos de una sintasa que origina fosfatidil-Inositol (PI), que por sucesivas fosforilacionesorigina Fosfatidil Inositol 4,5 bifosfato.

Figura 1.10. Metabolismo de IP3 y Diacilgliceroles.

Esta molécula puede servir de substrato parala generación de nuevos segundos mensajeros tras lacorrespondiente activación de la ruta. La inhibiciónfarmacológica de esta ruta de resíntesis por Li+ seutiliza en el tratamiento de enfermos

maniacodepresivos. En concreto se ha podidodemostrar que el Li+ inhibe a las fosfatasas implicadasen la generación de inositol.

Para terminar la transmisión de esta vía debenademás de retirarse las elevadas concentraciones deCa2+. Existen en la célula varios sistemas capaces derealizar esta función (figura 11):- ATPasa Ca2+ dependiente.- expulsa Ca2+ al exteriorde la célula en contra de gradiente y, por lo tanto congasto energético. Presentan Km muy bajas (100-200nM).- ATPasa del retículo endoplásmico. Similares a lasanteriores con la excepción de que no sondependientes de Ca2+.- Intercambiador Na+- Ca2+.- Intercambia 3 Na+- por 1Ca2+ .Sólo interviene si las concentraciones de Ca2+

son muy altas.- Mecanismo mitocondrial.- El funcionamiento de lacadena de transporte electrónico conlleva la salida deH+ al exterior de la mitocondria, creando un potencialde membrana que es aprovechado por la F1-ATPasapara la síntesis de ATP. Cuando las concentracionesde Ca2+ son elevadas este potencial de membranapuede ser aprovechado para la entrada de este ion alinterior mitocondrial por los transportadoresespecíficos.

Figura 1.11 Homeostasis de Ca2+ intracelular.

PKC y PK Ca-CaMComo se ha mencionado anteriormente son las

principales enzimas en la transducción de la señal porla ruta de la PLC. Ambas presentan actividad ser-trequinasa. La PKC en realidad es una familia deproteínas (α, β, γ, δ, ε, µ, ζ) que si bien median lamisma acción catalítica, difieren en sus características.Las conocidas como típicas (α, β, γ) se caracterizanpor ser activadas, además de por DAG que es elverdadero desencadenante de su activación, por Ca2+

y fosfolípidos. La PKC se encuentra en forma


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inactiva en el citosol. La aparición de DAG en lamembrana promueve su asociación con esta y, enpresencia de Ca2+ sufre un cambio conformacional ensu dominio regulador que activa a la enzima (dominiocatalítico).

Con respecto a la PK Ca-CaM, lacalmodulina, el mediador proteíco de muchasreacciones enzimáticas reguladas por Ca2+, contienecuatro centros de unión a Ca2+ de alta afinidad. Launión del Ca2+ induce un cambio conformacional enla calmodulina que le permite interaccionaractivamente con la PK que regula (figura 1.12).

calmodulina

Ca2+

PK inactiva

PK Ca-CaM activa

Figura 1.12. Activación de PK Ca-CaM.

Al igual que vimos para la proteína PKA,tanto la PKC como la PK Ca-CaM son capaces deinducir, mediante procesos de fosforilación, lamodulación de múltiples proteínas que manifiestandiversas activi-dades biológicas (transportadoresiónicos, enzimas de rutas metabólicas, factorestranscripcionales, etc).

1.5.5. Integración de rutas de transducción.En un momento dado de su desarrollo una

célula puede recibir distintas señales, que puedenmodular procesos biológicos comunes. Por lo tanto lacélula debe de disponer de los mecanismosmoleculares precisos mediante los cuales dirigir losefectos metabólicos de estas distintas rutas. Cabedistinguir en este punto dos posibles niveles deregulación:- en las propias rutas de transducción.- en las rutas diana modulables (glucogenolisis, con-tracción muscular, secreción endocrina, etc).

Con respecto a la regulación de vías detransducción por otras vías de transducción haynumerosos ejemplos que demuestran la existencia de

dos tipos generales de regulación : regulación positiva ,donde la activación de una vía coopera en laactivación de otra, y regulación negativa , donde laactivación de una vía conduce a la inhibición de otra.Considerando las dos rutas hasta ahora explicadas(AC y PLC) tenemos un ejemplo de regulaciónpositiva si consideramos que la activación de PLC,vía IP3, aumenta las concen-traciones de Ca2+, el cuales capaz de estimular algunos tipos de AC. En sentidocontrario, la activación de PKA, vía AMPc, reducelos niveles de IP3. De igual forma, la fosfodiesterasacapaz de hidrolizar la estructura cíclica de AMPc esactivada por el complejo Ca-CaM. Estos tipos deregulación que afectan a dos o más vías entre sí, aveces pueden encontrarse en una misma vía. Así, porejemplo, la PKC es capaz de modular porfosforilación bombas de Ca2+ o el antiportadorNa+/Ca2+, contribuyendo por estos efectos a bajar lasconcentraciones de Ca2+ citosólico elevadas, lo cualnecesita para ser activa. En este caso podemos hablarde efectos sinérgicos . En el lado opuesto estarían losefectos de retroalimentación , mediante los cuales unaenzima o metabolitos situado en pasos posteriores dela vía de transducción puede modular negativamentepasos previos de la vía. Así, por ejemplo, la PKCactivada tiende a disminuir las concentraciones deIP3. Todos los sistemas propuestos confluyen en laidea de que las rutas de señalización están altamentereguladas.

1.5.6. Ruta del Acido Araquidónico (AA).El ácido araquidónico es un segundo

mensajero implicado en varias rutas de señalización.Su generación como segundo mensajero puedeprovenir de la activación de dos rutas distintas: laactivación de fosfolipasa A 2 (PLA2), enzima quecataliza la hidrólisis del enlace éster entre el alcoholsecundario del glicerol y el ácido graso de variosfosfolípidos, o por la activación de la DAG lipasa que, catalizando la misma reacción, se distingue de laanterior por utilizar como substrato el DAG. Portanto, el DAG no sólo funciona como segundomensajero en la ruta de los fosfatidil inositoles sinoque además funciona como precursor de otrosmensajeros (Figura 1.13).

Se conocen dos subtipos de PLA2 que sediferencian por su localización celular (membranacitoplasmática o citosol) y por el tipo de proteínasimplicadas en su activación, ya que las asociadas amembranas son activadas por proteínas G mientrasque las citosólicas resultan activadas por otras rutasde señalización (ver más adelante).

Dentro de las funciones desempeñadas por elácido araquidónico pueden distinguirse aquellasejercidas en el interior de la célula donde se hagenerado (movilización de depósitos de Ca2+ internos,activación de PKC de forma análoga al DAG) y las


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ejercidas al salir de la célula y poder funcionar comouna molécula se señalización en células vecinas.

Figura 1.13. Metabolismo del ácido araquidónico.

El metabolismo del AA implica procesos deregulación por retroalimentación , ya que es capaz deinhibir a la PLA2, y procesos de transformación enmetabolitos , ya que es substrato de diversas enzimasque lo transforman en otras moléculas tambiénimplicadas en señalización (leucotrienos, prostaglan-dinas, tromboxanos, epóxidos). Estos compuestosjunto con el AA son conocidos como mensajerosretrógrados; es decir, tienen la capacidad para salir dela célula y unirse a receptores de membranaplasmática de la propia célula (S. autocrina) o decélulas vecinas (S. paracrina).

1.5.7. Ruta del Acido Fosfatídico (PA).Presente en diversos tipos celulares

(neuronas, miocitos, hepatocitos, células endotelialesy del sistema hematopoyético) e implicada en laregulación de múltiples procesos fisiológicos (regula-ción metabólica, secreción, inflamación, prolifera-ción) se encuentra la generación de ácido fosfatídicocomo segundo mensajero. En esta ruta el substratofisiológico es la fosfatidil colina que sufre la hidrólisisdel enlace éster entre el resto de fosfato y la colina,reacción calatizada por la Fosfolipasa D (PLD) paraoriginar PA y colina. El PA además de actuar comosegundo mensajero para la activación de variasproteína quinasas, puede servir como precursor deotros mensajeros como el DAG o el ácidoaraquidónico, mediante sendas reacciones enzimáticascatalizadas por la fosfatidato fosfohidrolasa (DAG) y

la PLA2 (AA). La PLD, a diferencia de otras fosfo-lipasas, se activa por ciertas proteínas G pequeñas(ARF, Rho; ver más adelante) en combinación conPIP2.

1.6. Receptores con actividad enzimática intrínseca.Este grupo de receptores, a diferencia de los

anteriores, no requiere de moléculas intermedias parala activación de enzimas efectoras sino que la unióndel ligando al receptor es capaz de activar la catálisisdel propio receptor. Los receptores de este tipo seclasifican dependiendo de la actividad enzimática quepresenten.

1.6.1. Receptores con actividad Guanilato ciclasa.La unión del factor natriurético atrial a su

receptor, en células colectoras renales, provoca laactivación de la actividad guanilato ciclasa, presenteen el dominio citosólico que cicla la molécula de GTPpara dar GMP cíclico (GMPc). Esta molécula actuacomo segundo mensajero en la activación de laproteína quinasa G (PKG), que catalizafosforilaciones de proteínas similares a las descritaspara PKA o PKC (Figura 1. 14).

Figura 1.14. Activación de receptores con actividad Guanilato ciclasa.

Existe un segundo grupo de proteínas conactividad guanilato ciclasa que se diferencian de lasanteriores por presentarse en el citosol. Las guanilatociclasas solubles son activadas por el óxido nítrico(NO), un gas sintetizado a partir de arginina en unareacción catalizada por oxidasas de función mixta,denominadas óxido nítrico sintasas (NOS) y de lasque se conocen varios subtipos. Las guanilatociclasas presentan en su centro activo un grupo hemonecesario para su actividad y que es donde reside eldominio de interacción con el NO. Esta molécula estaimplicada en la generación de procesos inflamatoriosy se considera un neurotransmisor.

1.6.2 Receptores con actividad Tirosina Quinasa.Los receptores con actividad tirosina quinasa

pueden agruparse, dependiendo de su composición,en receptores monoméricos , que incluye receptorespara varios factores de crecimiento (EGF, NGF,PDGF, etc) o receptores multiméricos , cuyo


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paradigma es el receptor de insulina. Independiente-mente de la composición del receptor, estas proteínaspresentan los dominios típicos de receptores demembrana: extracelular, por donde se une el ligando,transmembrana, por donde permanece anclado a lamembrana, y citosólico, donde reside la actividadtirosina quinasa. En este tipo de receptores, la unióndel ligando al receptor provoca la dimerización deestos. La proximidad física de ambas moléculaspermite la activación de la actividad catalíticaproduciéndose la fosforilación cruzada de ambas enrestos de tirosina; es decir, cada monómero delreceptor activado es capaz de producir la fosforilaciónde algunos restos en la otra molécula, proceso que seconoce como autofosforilación . La fosforilación dedeterminados restos de tirosina produce la apariciónde dominios de reconocimiento para otras proteínas locual es esencial en la ruta de transducción (figura1.15).

Figura 1.15. Activación de receptores con actividad Tirosinaquinasa. Los dominios SH2 aparecen coloreados en azul.

Se han identificado dos tipos de proteínas quepueden interaccionar con los receptores activados:- Proteínas adaptadoras que realizan el acoplamientoentre el receptor activado y otras moléculas deseñalización pero que carecen de actividad intrínsecaen la señalización, como es el caso de GRB2.- Proteínas con actividad enzimática implicadas en lasrutas de señalización, como es el caso de GAP(proteína activadora de la función GTPasa de Ras; vermas adelante), Syp, una proteína con actividadfosfatasa, y enzimas implicadas en la síntesis dederivados del fosfatidil inositol como la fosfatidilinositol-3 quinasa (PI3K) o la PLCγ (figura 1.9).

La interacción entre estas proteínas y losreceptores activados se lleva a cabo por dominios

específicos de las proteínas denominados dominiosSH2 (dominio de homología con Src 2). Pequeñasvariaciones en los dominios SH2 de las proteínasfacilitan su unión a algunos restos fosfo-tirosina delreceptor con mayor afinidad que a otros restos fosfo-tirosina, de tal manera que no todas las proteínas condominios SH2 se unen con idéntica afinidad a undeterminado resto fosfo-tirosina (figura 1.16).

Figura 1.16. Ciclo de activación-inactivación de Ras

Una proteína que juega un papel importante enla transducción de señal por este tipo de receptores esRas, la cual pertenece a la familia de proteínas Gpequeñas y está implicada en la regulación deprocesos tales como la proliferación y la diferen-ciación celular. Como se mencionó anteriormenteestas proteínas son interruptores moleculares quenecesitan del intercambio de moléculas GDP-GTPpara variar su actividad biológica. A diferencia de lasproteínas G heterotriméricas, donde el intercambio deGTP por GDP era inducido por la interacción con losreceptores activados, las proteínas G pequeñasnecesitan de la presencia de otras proteínas, denomi-nadas factores intercambiadores de nucleótidos deGuanina (GEF) que facilitan la disociación del GDP,con lo cual el GTP puede unirse de forma espontánea(figura 1.16). La unión de GTP provoca ladisociación del intercambiador produciendo la formaactiva de Ras. El paso de la forma activa de Ras a laforma inactiva es acelerado enzimáticamente porciertas proteínas que reciben el nombre de GAP(proteína activadora de GTPasa). La existencia deGAP hace que en sistemas celulares la vida media deRas-GTP no supere el minuto.

Dado que Ras carece de dominios SH2necesita para su activación por receptores conactividad tirosina quinasa de proteínas adaptadoras.Además de dominios SH2, existen otros tipos dedominios implicados en el reconocimiento deproteínas, tales como dominios SH3 (reconocen


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secuencias ricas en prolina) o PTB. La proteínaGRB2 es una proteína adaptadora que presentadominios SH2, mediante los cuales puedeinteraccionar con los receptores activados, y dominiosSH3, mediante los cuales puede interaccionar conotras proteínas capaces de reconocerlos. Sos que esuna proteína intercambiadora de nucleótidos deguanina (GEF) tiene la característica de poderreconocer dominios SH3, de tal manera que puedeinteraccionar con el adaptador GRB2 (unido alreceptor activado) a través de los dominios SH3. Elcomplejo Receptor-GRB2-Sos está en condiciones deactivar a Ras que pone en marcha una cascada defosforilación de proteínas que, eventualmente, finalizaen el núcleo modificando la expresión génica. Lafigura 1.17 esquematiza la activación de Ras en latransducción de señal generada por EGF.

Figura 1.17. Papel de proteínas adaptadoras en la activación derutas de transducción por RAS.

La serie de eventos que siguen a la activaciónde Ras presenta una gran convergencia en todas lasespecies estudiadas. Los pasos más relevantes son(figura 1.18):- Ras activado se une al extremo N-terminal de Raf,una serina-treonina quinasa.- El complejo Ras-Raf interacciona y fosforila, através de Raf, a MEK, una quinasa dual, ya que puedefosforilar a otras proteínas en restos serina y tirosina.- MEK fosforila y activa a las MAP quinasas(MAPK- Mitogen Activated Protein Kinase), otraserina-treonina quinasa.

MAPK fosforila a muy diferentes proteínas queestán implicadas en la regulación del ciclo celular y ladiferenciación. Entre dichas proteínas cabe destacarotras proteína quinasas (pp90rsk) y ciertos factorestranscripcionales.

Estudios recientes han confirmado la existencia deotros miembros de la familia de MAPKs. En laactualidad se distinguen tres subfamilias de MAPKs:A) -ERK (Extracellular Regulated Kinases) secorresponden con las mencionadas anteriormentecomo MAPKs, estando por tanto implicadas en losprocesos de proliferación y diferenciación.

Figura 1.18 Activación de quinasas reguladas extracelularmente (ERK).

B) -JNK (Jun N-terminal Kinasas) se denominan asípor identificarse por primera vez su implicación en lafosforilación de la proteína JUN (que junto con FOSforman el factor transcripcional AP-1). Estas quinasasson activadas en respuesta a múltiples señales(citoquinas, hormonas) y están relacionadas con losprocesos infeccioso-inflamatorios, de estrés celular yde supervivencia celular).

C) -p38-MAPKs constituyen el tercer tipo deMAPKs. También pueden ser activadas por múltiplesseñales y se han relacionado con los procesos deestrés celular y de supervivencia/muerte celular.

La finalización de señalización en rutasacopladas a la fosforilación de proteínas es realizadapor proteín-fosfatasas (fosfo-tirosina o fosfo-serina/treonina fosfatasas). Se conocen varias familiasde fosfatasas que difieren en sus especificidades deacción y en su localización celular (citosol, núcleo,etc). Las proteína fosfatasas serán consideradas denuevo en el tema 2.


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Figura 1.19. Activación de IRS-1 por el receptor de insulina.

Activación del receptor de Insulina A diferencia de los otros receptores de esta

familia (por ejemplo EGF), el receptor de insulina unavez activado, no interacciona con proteínas a través dedominios SH2 (con la excepción de Shc), sino quefosforila a ciertas proteínas citosólicas de elevadopeso molecular (aprox. 130 kDa) denominadas IRS(Insulin Receptor Substrates). En la actualidad se handescrito tres proteínas con esta característica (IRS 1,IRS 2 e IRS 3). La fosforilación de IRS por laactividad quinasa del receptor de insulina crea lossitios de reconocimiento para la interacción con otrasproteínas (GRB2, PI3K, Syp) y su consiguienteactivación, a través de dominios SH2 (figura 1.19).Así la actividad PI3K se incrementa 10 veces cuandoesta proteína interacciona con IRS 1, incrementándoseel tráfico de membranas. De forma análoga, Syp, conactividad fosfatasa, se activa al interaccionar con IRS1 de modo que puede desfosforilar a esta proteínaterminando así su señalización. IRS-1 se caracterizapor la presencia de dominios PH, que permiten laestabilización de la interacción con el receptor a travésde su afinidad por fosfolípidos de la membrana.

1.6.3. Receptores con actividad Serina-TreoninaQuinasa.

Son también conocidos como receptores de lafamilia del TGFβ. El TGF-β1 es el prototipo de unafamilia de moléculas de señalización que incluye a losfactores de crecimiento transformantes tipo beta, lasactivinas, las inhibinas, las proteínas morfoge-néticasóseas (BMP) y la hormona Antimülleriana. Losmiembros de esta familia ejercen una gran variedadde efectos biológicos en diversos tipos celulares,

teniendo especial importancia durante el desarrolloembrionario y la formación de tejidos. En el adultoestán implicados en procesos tales como lareparación de tejidos, la modulación del sistemainmune y la regulación del ciclo ovárico.

Estas moléculas de señalización inician susacciones celulares mediante su unión a receptores conactividad intrínseca serina/treonina-quinasa. Lafamilia de receptores consta a su vez de dos tipos:tipo I y tipo II, que son estructuralmente muysimilares, con regiones extracelulares ricas encisteina y regiones intracelulares que consistenprincipalmente de los dominios quinasa. Losreceptores de tipo I, pero no los de tipo II, presentanuna región rica en residuos de glicina y serina(dominio GS) en el dominio yuxtamembranal. Cadamiembro perteneciente a esta familia se une a unacombinación característica de receptores tipo I y tipoII siendo necesaria esta interacción para desencadenarlos procesos de señalización intracelulares (Tabla1.2).

El TGF-β1, como ejemplo, se une en primerlugar al receptor de tipo II, lo cual ocurre en lamembrana celular formando oligómeros quepresentan actividad quinasa. A continuación elreceptor de tipo I (que carece de actividad quinasaintrínseca y no puede unirse al TGF-β en ausencia dereceptor tipo II) es reclutado al complejo; El receptortipo II fosforila al receptor tipo I en el dominio GS ylo activa presentando entonces actividad quinasa.

Figura 1.20. Activación del complejo de receptor para TGF-β.


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Como consecuencia de la activación delreceptor de tipo I, este es capaz de fosforilar aciertas proteínas citosólicas, denominadas SMAD,las cuales una vez activadas tienen la capacidad detranslocarse al núcleo y ejercer sus efectos reguladores(figura 1.20) sobre la expresión génica. Estasproteínas SMAD, de las cuales se han descrito en laactualidad varios tipos, serán tratadas con más detalleen el tema 2._________________________________________________Subfamilia TGF- β Activina BMP_________________________________________________Ejemplo de TGF- β 1 Activina A BMP-2Ligando TGF- β2 BMP-4__________________________________________________Rec. tipo II T β R-II ActR-II BMPR-II

ActR-IIB ActR-II ActRIIB

__________________________________________________Rec. tipo I T β R-I ActR-IB BMPR-IB

ActR-I__________________________________________________SMAD Smad2 Smad2 Smad1específicas Smad3 Smad3 Smad5de vía Smad9?__________________________________________________SMAD Smad4 Smad4 Smad4comunes___________________________________________SMAD Smad6 Smad6 Smad6inhibidora Smad7 Smad7 Smad7__________________________________________________Respuestas Mitogénesis ↓ liber. FSH ↑ Cartílago ↑

matriz extra- Mesodermo Mesodermocelular ↑ dorsal ↑ ventral ↑

Apoptosis↑

Tabla 1.2. Miembros de la Familia del TGF-β, sus receptores,moléculas de señalización y principales respuestas biológicas.

1.7. Receptores asociados a Proteínaquinasas citosólicas.

Un gran número de citoquinas, algunashormonas (prolactina, hormona del crecimiento,leptinas) y ciertos factores de crecimiento(eritropoyetina, G-CSF) se caracterizan por presentarreceptores sin actividad catalítica pero desencadenarprocesos de fosforilación de proteínas en tiempossimilares a los conseguidos por los receptoresconsiderados en el apartado 1.6.

Una característica que comparten muchascitoquinas y algunos factores de crecimiento es laimplicación de una proteína transductora demembrana necesaria para la activación de rutas deseñalización. Estas proteínas transductoras si bienpor sí solas no son capaces de interaccionar con elreceptor en ausencia de ligando (al igual que lodescrito para los receptores tipo I del TGF-β),interaccionan con el receptor activado por ligando,

siendo la formación del complejo ligando-receptor-transductor el desencadenante de las rutas detransducción asociadas. Atendiendo a la homologíaentre los distintos receptores que componen estasuperfamilia, estos se han clasificado en dos tiposgenerales:

a) Receptores de Tipo I Los receptores de tipo I comparten una serie

de motivos conservados en sus dominiosextracelulares que consisten en 4 residuos de cisteinay el motivo WSXWS (Trp-Ser-X-Trp-Ser).

Dentro de esta familia de receptores, lascitoquinas pueden a su vez clasificarse dependiendodel tipo de proteína transductora que presenten. Así,la familia gp130 se caracteriza por la interacción deesta proteína (gp130) con los receptores específicospara IL-6, IL-11, IL-12, LIF (factor inhibidor de laleucemia), OnM (oncostatina M), CNTF (factorneurotrófico ciliar) y G-CSF (factor estimulante decolonias de granulocitos). La familia gp140 engloba a IL-3, IL-5 y GM-CSF (factor estimulantede colonias de granulocitos y macrófagos). Porúltimo, la familia γ -C engloba a las interleuquinas2, 4, 7, 9, 13 y 15. Si bien algunas de estascitoquinas pueden inducir la fosforilación dedeterminadas proteína- quinasas, como Lyn, Lck oFyn (por IL-2) o Lyn, Hck o Fps (por IL-3), lacaracterística común de todas estas citoquinas es sucapacidad de activar a uno o mas miembros de lafamilia de las JAK (Janus Kinase). Se conocencuatro quinasas en esta familia: JAK1, JAK2, JAK3y tyk2 y todas tienen actividad tirosina quinasa.

b) Receptores de Tipo II Integrada por los receptores de interferones.

Los interferones se clasificaron inicialmente por eltipo de célula productora como interferones deleucocitos, de fibroblastos o inmunes. Lanomenclatura actual se basa principalmente en susecuencia; y así designa a los interferones deleucocitos como IFN-α e IFN-ω, a los defibroblastos como IFN-β y a los de tipo inmunescomo IFN-γ . Los IFNs α y β comparten el mismotipo de receptor mientras que los IFN γ presentan unreceptor específico. El último componente de estafamilia lo constituye la IL-10.

Independientemente del tipo de receptor (I oII) y del tipo de ligando, la unión del ligando alreceptor desencadena la siguiente cadena de eventosmoleculares (figura 1.21):1- Dimerización de receptores o de receptores-transductores.2- Activación de JAKs, las cuales producen lafosforilación cruzada de las mismas.3- Las JAK fosforiladas son capaces de fosforilar alos receptores en residuos de tirosina creando sitiosde reconocimiento para dominios SH2.


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4- Estas secuencias fosforiladas son reconocidas pordiversas proteínas con dominios SH2, de entre lascuales destacan las proteínas STAT (signaltransducer and activators of transcription).5- La interacción de proteínas STAT con losreceptores permite la fosforilación de las STAT porlas JAK.6- Dichas fosforilaciones crean a su vez en lasproteínas STAT sitios de reconocimiento paradominios SH2. Dado que cada proteína STATpresenta un sitio de reconocimiento y un dominioSH2, estas proteínas pueden dimerizarse ytranslocarse al núcleo para regular la expresión dejuegos específicos de genes.

Figura 1.21. Cascada de fosforilaciones en la activación de STAT.

La fosforilación del receptor permite ademásla interacción de éste con otras proteínas quecontienen dominios SH2 como Shc, proteínaadaptadora implicada en la activación de Ras, quepuede activar la ruta de las MAPK (ERK). Unejemplo de este tipo de activación múltiple lo suponela fosforilación de STAT3 en células T, donde lainteracción de IL-2 con su receptor controla laprogresión de la fase G1 a S, la expansión clonal y ladiferenciación funcional. La interacción de IL-2 consus receptores supone la activación de JAK1 yJAK3 y la consecuente fosforilación de STAT3 en suresiduo Tyr-705 (Figura 1.22). Por otra parte, lafosforilación del receptor de IL-2 (cadena β) favorecesu interacción con Shc y la consecuente activación deRas, que conduce a la fosforilación de STAT3 en suresiduo Ser-727. Esta segunda ruta que lleva a lafosforilación del residuo de serina también puededesencadenarse por el receptor de la célula T (TCR).

Especificidad de Respuesta Biológica por STATsEn la actualidad se han clonado 4 proteínas de

la familia JAK y siete proteínas de la familia STAT.Por otra parte se conocen más de 35 señalesextracelulares, capaces de activar dicha ruta de trans-ducción, que desencadenan respuestas biológicas de

Figura 1.22. Activación de las rutas asociadas a Ras y JAK por IL-2

lo mas variadas (activación de múltiples respuestasdel sistema inmune, diferenciación del epiteliomamario, de linfocitos T, de eritrocitos, etc). Lapregunta que surge es ¿Como un juego tan pequeñode proteínas puede generar tanta diversidad deefectos biológicos? La respuesta puede estar en parteexplicada considerando la especificidad de lasproteínas STAT en el reconocimiento de losreceptores de esta familia, ya que sólo algunas STATreconocen determinado receptor, por ejemplo, laproteína STAT 2 sólo se ha demostrado suinteracción con el receptor para IFN α/β. La figura1.23 esquematiza algunas de las posiblesinteracciones. Parte de la respuesta se explicará en elpróximo tema cuando se aborde el estudio de laexistencia de programas genéticos específicos paralos distintos tipos celulares.

Figura 1.23. Especificidad de respuesta biológica (ver texto).


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1.8. Receptores de la familia TNF/NGFLos receptores de esta familia están

implicados, con algunas excepciones en laseñalización yuxtacrina; es decir, tanto el ligandocomo el receptor son proteínas de membrana condominios extracelulares a través de los cuales seestablece la señalización.

El TNF-α (Factor de Necrosis Tumoral), quetiene la característica de ser un ligando deseñalización paracrina, es una citoquina pleiotrópicaque funciona como un mediador de la regulacióninmune, la respuesta inflamatoria y la apoptosis enalgunos tipos celulares. Un exceso en la producciónde TNF se ha ligado al desarrollo de ciertasenfermedades tales como el shock séptico y ciertosdesordenes autoinmunes. Las respuestas celularespromovidas por el TNF se inician mediante suinteracción con dos tipos distintos de receptorescelulares, el receptor de tipo I (55 kDa) y el de tipo II(75 kDa). Ambos tipos de receptores forman parte dela familia de receptores del TNF entre cuyosmiembros se incluyen el antígeno Fas (inductor deapoptosis, también llamado Apo-1 o CD95), CD27(antígeno de activación de células T), CD30(marcador del linfoma de Hodgkin) y CD40(antígeno de células B), los cuales comparten lacaracterística de secuencias ricas en cisteina en susdominios extracelulares. Esta familia de citoquinasgeneran respuestas celulares que incluyen ladiferenciación, la proliferación, la activación de NF-κB y la muerte celular, promoviendo la agregación demonómeros de receptores. En general los dominioscitoplasmáticos de esta familia de receptores carecende dominios comunes, lo cual sugiere que puedenutilizar mecanismos distintos. La excepción ocurrecon el receptor tipo I del TNF y el antígeno Fas, yaque ambos presentan en su extremo carboxiloterminal un dominio de aproximadamente 80aminoácidos que se ha denominado "dominio demuerte" (DD= death domain). A los dominioscitoplasmáticos de los receptores pueden asociarsedos familias de proteínas denominadas TRAF(Factores Asociados al Receptor de TNF) y TRADDy que están implicadas en la transducción de la señalal núcleo (figura 1.24).En este caso de señalización podemos hablar delreclutamiento de proteínas al complejo receptor(es)-ligando(s) del tal manera que una proteína transmitela señal a la siguiente proteína en la cascada a travésde interacciones proteina-proteina, sin mediarprocesos de modificación covalente (fosforilaciones)como hemos visto para otros tipos de receptores,mediante interacciones por dominios homólogos .Para el caso del receptor I del TNF las posiblessecuencias de eventos moleculares, tras la formacióndel complejo receptor (trímero)-ligando, serían:- asociación de TRADD (mediante los dominios DD)al complejo.

- asociación de TRAF2 a TRADD. La activación deTRAF2 permite que esta proteína interaccione conotras como NIK (proteína quinasa que al activarsepuede generar una ruta de fosforilaciones; ver tema4) o RIP que puede asociarse con RAID y éstaactivar algunas caspasas que están implicadas en laseñalización de muerte celular.- asociación de MORT1/FAD (mediante dominiosDD) con la consiguiente activación de algunascaspasas.

Figura 1.24 Rutas de transducción asociadas a TNF.

La activación de este tipo de receptores,además de las vías de quinasas consideradas deestrés (Jun quinasa, p38), conlleva la activación dedos procesos contrapuestos en la célula: la activaciónde caspasas, proteasas intracelulares que dirigen elproceso apoptótico, y la activación de los miembrosde la familia del factor nuclear NF-κB que, mediantela activación génica, actua como un factor desupervivencia (ver tema 2). Dependiendo del tipocelular y de la predominancia de unas rutas sobreotras (muerte/supervivencia) el efecto final una vezintegradas las distintas vías de señalización puede serde muerte (apoptosis) o proliferación celular.

1.9. Regulación de Receptores de MembranaEl número y la actividad de receptores

funcionales implicados en señalización sobre lasuperficie de la célula no es constante. El nivel dereceptores para una determinada hormona puedeincrementarse ( up-regulation ) o disminuir ( down- regulation ), permi-tiendo de esta forma a la célularesponder óptimamente a ligeras variaciones en losniveles hormonales. La exposición prolongada deuna célula a elevadas concentraciones de un ligandonormal-mente resulta en una reducción en el númerode sus receptores funcionales, causando porconsiguiente la desensibilización de la célula para eseligando.


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El fenómeno de la down-regulation dereceptores de superficie celular puede ocurrir devarias formas. Los receptores pueden serinternalizados por endocitosis , disminuyendo así sunúmero en la superficie y entonces ser destruidos oalmacenados ( secuestrados ) en vesículasintracelulares. En cualquier caso se finaliza la accióndel ligando. El que la célula elija uno u otromecanismo depende del tiempo de duración delestímulo. Tras tiempos cortos de exposición a laseñal (minutos) la célula secuestra en vesículas a losreceptores: si el estímulo perdura en el tiempo (horas)entonces se activa la vía de degradación de receptorestras la fusión de vesículas lisosomales (figura 1.25).Es conocido que la activación de PI3K juega unimportante papel en el tráfico de vesículas.

Figura 1.25. Regulación de receptores de membrana.

Alternativamente, puede que el número dereceptores no se modifique pero si su actividad, demodo que el receptor sea incapaz de unirse con elligando o si bien puede unirse, el complejo receptor-ligando no induzca la respuesta celular normal. Losejemplos mejor conocidos implican cambios en elestado de fosforilación de los receptores que causanla inactivación de estos ( inactivación por fosforila- ción ). Esta inactivación del receptor puede sergenerada por mecanismos de retroalimentación( desensibilización homóloga ); es decir, pormoléculas diana de la propia vía activada por elcomplejo receptor-ligando (por ejemplo, lasdesensibilizaciones del receptor de EGF por PKC odel receptor ß-adrenérgico por PKA y ßARK, enzimaactivada por subunidades βγ y que solo fosforila areceptores que están acomplejados a ligando) o porotras vías de señalización. En este caso son bienconocidos los efectos de PKA en la inactivación dereceptores, acoplados a proteínas G, activados pordistintos ligandos ( desensibilización heteróloga ).

La desensibilización de receptores tiene unpapel importante en la regulación de la respuestacelular causada por el ligando, ya que permite a la

célula ajustar la sensibilidad del receptor a laconcentración de ligando a la cual es estimulada, demodo que puede mantener una respuesta fisiológicanormal. dado que los receptores fosforilados soncontinuamente desfosforilados por fosfatasasconstitutivas, el número de grupos fosfato pormoléculas de receptor refleja la cantidad de ligandounido en los últimos 1-10 minutos. Si ocurre unincremento en la cantidad de ligando, elcorrespondiente incremento en AMPc conduce a lafosforilación y desensibilización de más receptores,de modo que la producción de AMPc y lasconsiguientes respuestas activadas por éstepermanecen más o menos constantes. Si el ligandodesaparece, el receptor pasará a estar completamentedesfosforilado y a un estado de alta sensibilidad, encuyo caso podrá responder a concentraciones muybajas de ligando. La figura 1.26 esquematiza el buclede retroalimentación que controla la actividad dereceptores acoplados a proteínas G.

Figura 1.26. Control de la actividad de receptores acoplados aproteínas G.

Aby

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