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Western BlotIntroducción y Optimización

10 Abril 201310 Abril 2013

Ariana Veiga

Western Blot

¿En qué consiste el

Western Blot?

• También llamado Inmunoblot • Técnica utilizada para identificar una proteína en una muestra que contiene

varias proteínas

¿Cómo funciona?

• Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en función de su peso molecular

• A continuación se utiliza un anticuerpo específico para detectar la proteína de interés • El resultado aporta información sobre el peso molecular de la proteína y su cantidad

relativa en la muestra

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relativa en la muestra

Calle 1: Anticuerpo anti- β Actina (ab8226) diluido 1/1000

Calle 2: ab8226 diluido 1/10000

Calles 3-4: ab8226 diluido 1/500

Calle 1: Lisado celular HeLa (humano)

Calle 2: Lisado celular HeLa (humano)

Calle 3: Lisado celular HEK293 (humano)

Calle 4: Lisado celular 3T3 (ratón)

¿En qué casos es útil utilizar Western Blot?

¿Está la proteína de interés presente en mi muestra?

El tratamiento con un determinado agente “X”, ¿aumenta o reduce el nivel de expresión de mi proteína?

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proteína?

¿Cómo varía el nivel de expresión de la proteína en distintos tejidos o líneas celulares?

¿Mi muestra es sana o patológica? El WB permite detectar enfermedades tales como la enfermedad de Lyme, la de las vacas locas, el VIH, etc.…

Organización del Webinar

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 1: Preparación de la muestra

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Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y optimización. Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

Protocolo de Western Blot




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Preparación de las muestras para la electroforesis

Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se degradan mecánicamente para liberar las proteínas

• Células: mantenerlas en hielo, lavar con PBS frío y añadir el tampón de lisis (~1ml por cada millón de células). Después agitar durante 30 minutos a 4 ºC

• Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente

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• Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido y homogeneizar en tampón de lisis (300 µl por cada 5 µg de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300 µl de tampón, y agitar después durante 2 horas a 4 ºC

• Centrifugar a 4 ºC durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo en hielo

Lisis

Mantener las muestras en hielo o a 4ºC para evitar degradación de las proteínas

Los tampones deben prepararse en el momento y mantenerse en frío. Antes de realizar la lisis, añadir al tampón un cocktail de inhibidores de proteasas

Si la proteína de interés está fosforilada, es importante asegurarse de incluir inhibidores de fosfatasas al tampón de lisis

Elegir un tampón de lisis adecuado en función de la localización celular de la proteína

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Elegir un tampón de lisis adecuado en función de la localización celular de la proteína de interés

Localización de la proteína Tampón de lisis recomendado

Célula entera NP-40 o RIPA

Citoplasmática (soluble) Tris-HCl

Citoplasmática (citoesqueleto) Tris-Triton

Membranal NP-40 o RIPA

Nuclear RIPA

Mitocondrial RIPA

Preparación de las muestras para la electroforesis

Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se degradan mecánicamente para liberar las proteínas

• Células: mantenerlas en hielo, lavar con PBS frío y añadir el tampón de lisis (~1ml por cada millón de células). Después agitar durante 30 minutos a 4 ºC

• Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido y homogeneizar en tampón de lisis (300 µl por cada 5 µg de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300

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Determinar la concentración de proteínas

µl de tampón, y agitar después durante 2 horas a 4 ºC

• Centrifugar a 4 ºC durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo en hielo

Condiciones reductoras y desnaturalizantes: las muestras son normalmente tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las proteínas (dímeros, estructuras terciarias)

• Añadir el tampón de carga a la muestra y calentar 5 minutos a 95-100ºC o durante 5-10 minutos a 70ºC

Condiciones reductoras y desnaturalizantes

Un tampón de carga estándar contiene SDS (dodecilsulfato sódico) y β-mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol)

• El SDS desnaturaliza la proteína en su estructura primaria y la recubre de cargas negativas

• El β-mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen los puentes disulfuro

• Todo ello permite que las proteínas se separen en función del peso molecular

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• Todo ello permite que las proteínas se separen en función del peso molecular mediante SDS-PAGE

• La reducción y desnaturalización permiten además la accesibilidad del anticuerpo a su sitio de unión

SDS y DTT/β-mercaptoetanol

Nota: Algunos anticuerpos solo reconocen las proteínas nativas (no reducidas y/o no desnaturalizadas). En este caso SDS y/o β-mercaptoetanol o DTT no deben añadirse a los tampones.





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SDS-PAGE

DefiniciónMétodo que permite separar las proteínas bajo un campo eléctrico de acuerdo a su movilidad electroforética

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SDS : Dodecilsulfato Sódico; PAGE : Electroforesis en gel de poliacrilamida

¿Cómo funciona?

• El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el tampón de migración. Un tampón de migración suele contener 25mM Tris; 190mM glicina; 0,1% SDS; pH 8,3

• Los lisados proteicos se cargan en las calles del gel, normalmente entre 20 y 40 µg por calle

• Se aplica un campo eléctrico que provoca el movimiento de las proteínas hacia el polo positivo

• Al haberse tratado las proteínas con SDS (cargas negativas), las cargas

SDS-PAGE

funciona? • Al haberse tratado las proteínas con SDS (cargas negativas), las cargas endógenas de las mismas son despreciables

• El resultado es que las proteínas se separan en función de su talla, o peso molecular

• Las proteínas de menor tamaño quedan menos retenidas en la matriz del gel y por tanto migran mas rápidamente

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-

+

Corriente eléctricaFrente de migración

Geles

Constituidos de poliacrilamida, N, N-metilenbisacrilamida (Bis), persulfato de amonio (APS) y TEMED

La estructura del gel puede modificarse alterando la proporción de acrilamida

Para proteínas pequeñas, se usa un gel con un porcentaje elevado de acrilamida, y viceversa para proteínas de gran tamaño

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Tamaño de la proteína (kDa) Porcentaje del gel

4-40 20

12-45 15

10-70 12,5

15-100 10

25-200 8

Los geles en gradiente se recomiendan en aquellos casos en los que el tamaño de la proteína es desconocida

Electroforesis en condiciones no reductoras y/o no desnaturalizantes

Forma requerida de la proteína

Condiciones electroforesis Tampón de carga

Tampón de migración

Reducida-Desnaturalizada

Reductor y desnaturalizante

Con ß-mercaptoetanol o DTT Con SDS

Con SDS

Reducida - Nativa Reductor no Con ß-mercaptoetanol o Sin SDS

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Reducida - Nativa Reductor no desnaturalizante

Con ß-mercaptoetanol o DTTSin SDS

Sin SDS

Oxidada –Desnaturalizada

No reductor y desnaturalizante

Sin ß-mercaptoetanol ni DTTCon SDS

Con SDS

Oxidada - Nativa No reductor y nativo

Sin ß-mercaptoetanol ni DTTSinSDS

Sin SDS





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Objetivo de la transferencia

Una vez realizada la electroforesis, es necesario marcar la proteína de interés para poder visualizarla

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El gel no es una superficie adecuada para poder marcar las proteínas

• Los anticuerpos no son retenidos en el gel

• Los geles son frágiles y difíciles de manipular

Por tanto, es necesario transferir las proteínas a un soporte más adecuado

¿Cómo funciona la transferencia?

El principio es similar al de PAGE, es decir, las proteínas cargadas negativamente migran hacia el polo positivo bajo el efecto de un campo eléctrico

Se intercala una membrana entre el gel y el electrodo positivo

Las proteínas se adhieren a la membrana siguiendo la misma disposición que en el gel

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Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF). Estas últimas requieren un pretratamiento con metanol

Montaje de la transferencia

¿Transferencia en medio húmedo o semi seco?

InconvenientesVentajas

Medio Húmedo

• El gel y la membrana se intercalan y fijan firmemente entre finas esponjas y papel absorbente

• Este montaje “sándwich” se sumerge en un compartimento que contiene el tampón de transferencia donde se aplica a continuación la corriente eléctrica

El proceso de transferencia es más largo

Adecuado para proteínas grandes o difíciles de transferir

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la corriente eléctrica• Un tampón de transferencia se compone

normalmente de 25mM Tris, 190mM Glicina y 20% de Metanol

Semi Seca

• El montaje papel-gel-membrana-papel se humedece con tampón de transferencia

• El montaje se coloca directamente entre el cátodo y el ánodo donde se aplica la corriente

• El tampón de transferencia estándar suele contener 48mM Tris, 39mM Glicina, 0,04% SDS, y 20% Metanol

Más rápido La membrana puede secarse afectando a la transferencia de las proteínas

Transferencia de proteínas >100 kDa

Transferencia en medio húmedo durante la noche a 4 ºC y bajo voltaje

Añadir 0.1% SDS al tampón de transferencia para reducir la formación de

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Añadir 0.1% SDS al tampón de transferencia para reducir la formación de aglomerados en el gel

Reducir la cantidad de metanol en el tampón de transferencia a 10% o incluso menos para evitar la dispersión de proteínas en el gel

Si la membrana es de PVDF, el metanol puede retirarse completamente del tampón (sigue siendo necesario sin embargo su pre-tratamiento con metanol)





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¿Por qué se utilizan anticuerpos?

Colorantes como Coomassie pueden usarse para teñir las proteínas después de realizar el SDS-PAGE SDS3

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Pero, ¿cuál de las bandas corresponde a la proteína de interés?

El uso de anticuerpos específicos soluciona el problema detectando únicamente la proteína de interés

Lisado celular de SDS3 transfectado (ab94303) en SDS-PAGE (izquierda) y en Western Blot con el anticuerpo ab89345 anti-SDS3 (derecha).

Inmunodetección

Bloqueo de la membrana Leche, BSA, etc…

Incubación con el anticuerpo primario Anticuerpo

Epítopo

Proteína Proteína

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Lavado (TBST)

Lavado (TBST)

Incubación con anticuerpo secundario

conjugado Anticuerpo

ProteínaProteína

Detección

Proteína

Detección

Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo

Sustrato (peróxido de hidrógeno + luminol)

Producto (sensible a la luz)

Los sustratos cromogénicos (4-cloronaftol o DAB) también pueden utilizarse con las enzimas HRP o AP, dando lugar a un producto coloreado que se deposita en la membrana próximo a la zona del anticuerpo

Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo secundario conjugado a la enzima HRP, produciendo una señal que se captura en una película fotográfica

Los anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos también pueden usarse siempre y cuando se disponga de un equipo de detección especial

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ECL : Enhanced chemiluminescence

HRP : HorseRadish Peroxidase

DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride

AP : Alkaline Phosphatase





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Controles de carga

Los controles de carga son anticuerpos usados para asegurar que la carga de proteínas en cada calle del gel de SDS PAGE es constante

Un anticuerpo control de carga detecta una proteína altamente conservada y presente en cantidades similares independientemente del tipo de muestra

Control de carga Tipo de muestra

Peso molecular (KDa) Precauciones

β Actina Célula entera / Citoplasma

42 No es válido para muestras del musculo esquelético. Cambios en las condiciones de crecimiento celular e interacciones con los componentes de la matriz extracelular pueden alterar la síntesis de

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componentes de la matriz extracelular pueden alterar la síntesis de la proteína actina (Farmer et al, 1983)

GAPDH Célula entera / Citoplasma

30-40 Algunos factores fisiológicos, como hipoxia o diabetes, aumentan el nivel de expresión de GAPDH en determinados tipos celulares

Tubulina Célula entera / Citoplasma

55 La expresión de tubulina puede variar con la resistencia a sustancias antimicrobianas y antimitóticas (Sangrajrang S. et al, 1998, Prasad V et al, 2000)

VDCA1/Porinas Mitocondria 31

COXIV Mitocondria 16 Muchas proteínas migran al mismo peso molecular (16KDa) que COXIV

Lamin B1 Núcleo 66 No es válido para muestras en las que se ha eliminado la membrana nuclear

Proteína de unión a TATA (TBP)

Núcleo 38 No es válido para muestras sin ADN

Controles de carga

Calle 1: Células HeLa (humano) a 20 µg

Calle 2: Células 3T3 (ratón) a 20 µg

Todas las calles - anticuerpo anti - Actina – control de carga (ab8227) diluído 1/1000

Nota: la afinidad del anticuerpo puede variar según la especie o naturaleza de la proteína (nativa o recombinante), etc…

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Calle 2: Células 3T3 (ratón) a 20 µg

Calle 3: Hígado de pescado a 20 µg

Calle 4: Hígado de conejo a 20 µg

Calle 5: Células MDCK (perro) a 20 µg

Calle 6: Células EBTr (bovino) a 20 µg

Calle 7: Células SL-29 (pollo) a 20 µg

Calle 8: Células CHO (Hamster chino) a 20 µg

Calle 9: Embrión de Xenopus a 20 µg

Controles positivos y negativos

Realizar en paralelo el ensayo de muestras desconocidas con muestras en las que se ha comprobado el nivel de expresión de la proteína de interés

• Proteína recombinante

• Células transfectadas con la proteína de interés

• Tejidos o líneas celulares que expresen la proteína • Tejidos o líneas celulares que expresen la proteína

Incluir también una muestra que no exprese la proteína a detectar

• Muestras knockout o siRNA

• Tejidos o líneas celulares que no expresen la proteína

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Péptidos de bloqueo

La pre-incubación del anticuerpo primario con el péptido inmunógeno permite bloquear de manera específica los sitios de unión del anticuerpo

Las bandas específicas no serán visibles en el blot ya que el anticuerpo pre-incubado no puede unirse a la proteína en la membrana

Útil para determinar si las bandas observadas corresponden a isoformas, fragmentos de la proteína o proteínas no específicas

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proteína o proteínas no específicas

Calle 1: Preparado de Histona, células HeLa

Calle 2: Preparado de Histona de células HeLa tratadas con colcemida

Calle 3: Preparación de histona de células HeLa 0,5µg con péptido de bloqueo Histona H3 – fosfo S10, trimetil K9 (ab15644) a 1 µg/ml

Calle 4: Preparación de histona de células HeLa tratadas con colcemida 0,5µg con péptido de bloqueo Histona H3 – fosfo S10, tri metil K9 (ab15644) a 1 µg/ml

Todas las calles:

Anti-Histona H3 (fosfoS10) [mAbcam 14955] - ChIP Grade (ab14955) a 1 µg/ml





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Adecuado para Western Blot

Utilizar anticuerpos que hayan sido previamente testados en Western Blot

Las aplicaciones en las que un anticuerpo ha sido testado se indican en la ficha técnica del anticuerpo

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Inmunógeno y especificidad

Inmunógeno: proteína específica o secuencia de amino ácidos que se inyecta en un animal para provocarle una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos específicos contra ella

La selección del inmunógeno permite producir un anticuerpo que reconozca y se fije sobre una región específica de la proteína (epítopo)

Asegurarse que la secuencia del inmunógeno está presente en la proteína de interés cuando se esté estudiando una isoforma concreta de la proteína, la forma madura o un

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NERTCRCDKP

NERTCRCDKP

cuando se esté estudiando una isoforma concreta de la proteína, la forma madura o un precursor de la misma – si no, el anticuerpo no reconocerá la proteína





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Ausencia de bandas, o bandas muy débiles

Origen del problema Solución

Incompatibilidad con el anticuerpo secundario

Seleccionar un anticuerpo secundario que sea compatible con la especie y el isotipo del anticuerpo primario (ej. Anticuerpo secundario anti-IgM de ratón con anticuerpo primario IgM hecho en ratón)

No hay suficiente proteína o anticuerpo para producir una señal

Aumentar la cantidad de lisado, de anticuerpo primario o de anticuerpo secundario (incluso una combinación de los tres)

Tiempo de incubación insuficiente para producir una señal

Incubar la membrana con el anticuerpo primario durante la noche a 4ºC

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para producir una señal durante la noche a 4ºC

La membrana no se ha bloqueado correctamente

Bloquear durante menos tiempo o usando un agente de bloqueo diferente. La adición de Tween 20 al tampón de bloqueo reduce la fijación del anticuerpo al agente de bloqueo

La proteína no se ha transferido correctamente del gel a la membrana

Comprobar que se ha producido la transferencia usando un colorante como rojo de Ponceau. Es posible que sea necesario aumentar o disminuir el tiempo de transferencia

Las proteínas hidrófobas son más difíciles de transferir

Para este tipo de proteínas usar membranas de PVDF

La muestra no expresa la proteína de interés

Revisar literatura y bases de datos sobre la proteína de interés

El anticuerpo no reconoce la proteína de interés

Verificar que la secuencia del inmunógeno está presente en la proteína a estudiar

Ruido de fondo

Origen del problema Solución

Exceso de lisado celular, anticuerpo primario o secundario que provocan uniones no específicas

Reducir la carga de proteína en el gel y/o diluir más los anticuerpos

Temperatura de incubación del anticuerpo primario muy elevada

Incubar durante la noche a 4ºC

La membrana no se ha bloqueado correctamente

Aumentar el tiempo de lavado, y añadir un detergente, como Tween 20, al tampón de lavado. Probar otro agente de bloqueo

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Probar otro agente de bloqueo

Uso de una membrana no adecuada

Las membranas de nitrocelulosa suelen dar menos ruido de fondo que las membranas de PVDF

Degradación de la proteína Optimizar la preparación de la muestra. Mantener las muestras en hielo y añadir una solución recién preparada de inhibidores de proteasas. Almacenamiento de muestras a largo plazo puede dañar las proteínas

Presencia de isoformas o fragmentos de la proteína de interés

Consultar la literatura y SwissProt

Presencia de polímeros Hervir las muestras durante 10 minutos antes de realizar la electroforesis

Exceso de proteína y/o anticuerpo

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Dilución de la muestra y anticuerpo primario

Optimización del tampón de bloqueo

5% leche 5% BSA

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A cada anticuerpo le corresponderá una solución de bloqueo óptima

Anti-GAPDH [mAbcam 9484] - Loading Control (ab9484) a una dilución 1/1000

5% leche5% BSA

Burbujas de aire, lavados insuficientes, transferencia incompleta

Durante la transferencia, contacto insuficiente entre el gel y la membrana

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Burbujas de aire entre el gel y la membrana durante la transferencia

Lavados insuficientes

Proteínas en estado nativo

Algunos anticuerpos presentan mayor afinidad por las estructuras nativas de las proteínas que por las formas desnaturalizadas y/o reducidas

La imagen muestra un Western Blot de colágeno III humano purificado, en la forma reducida y desnaturalizada a la izquierda, y en su forma nativa a la derecha

La estructura tridimensional del sitio de unión del anticuerpo al antígeno se pierde al desnaturalizar y reducir la proteína pierde al desnaturalizar y reducir la proteína

Forma reducida y desnaturalizada

Forma nativa

Calle 1: Proteína en su forma reducida y desnaturalizada

Calle 2: Proteína nativa (son reducir ni desnaturalizar)

Colágeno humano purificado (ab7535) a 5 µg por calle con el anticuerpo anti-colágeno III(ab6310)

Imagen cortesía de un Abreview enviado por Michaela Leyh

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Conocer la proteína de interés

Las proteínas no siempre muestran una única banda al peso molecular esperado

Posibles motivos: fragmentación de la proteína, modificaciones post -traduccionales, expresión de isoformas, propiedades isoeléctricas

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Se aconseja consultar siempre SwissProt y la literatura

-traduccionales, expresión de isoformas, propiedades isoeléctricas

Una diferencia del 10-15% respecto al tamaño esperado se considera aceptable y dentro de la normalidad





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Protocolos y material de interés

• Protocolos detallados de WBwww.abcam.com/protocols

SwissProt – www.uniprot.org

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• Guía sobre controles de carga:http://www.abcam.com/loadingcontrolguide

• Vídeo detallado sobre WB: http://www.abcam.com/westernblotguide

Guía de trucos para WB

Descarga tu guía de trucos para WB en nuestra página de protocolosO pide tu copia por e-mail: [email protected]

Reactivos para Western Blot

• Geles prefabricados y soluciones tampón optimizadas para WB

• Otros reactivos (tinción de gel, Bradford, etc …)

• www.abcam.com/Optiblot

Optiblot

• Marcadores de peso molecular pre coloreados y listos para usarMarcadores de peso

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• www.abcam.com/prismproteinladdersde peso molecular Prism

Anticuerpos secondarios AbExcel

• Anticuerpos secundarios validados para WB

• Conjugados a fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa (HRP)

• www.abcam.com/abexcel

Kits ECL• Sustratos ECL de alta sensibilidad para WB

• www.abcam.com/ecl

Optiblot – reactivos para WB

Fáciles de usar – pocillos coloreados para facilitar la carga de la muestra

Pocillos de alta capacidad y sin peine que remover

Hasta 10 veces másfuertes que los geles convencionales

Larga duración – 1-2 años de caducidad

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Todos los reactivos necesarios para tus experimentos:

• Tampones optimizados

• Optiblot Blue (ab119211) – tinción tipo Coomassie del gel en tan sólo 15 minuots

• Reactivo Bradford y ensayo BCA – compatible con detergentes en la muestra

• Otros productos – membranas PVDF de baja fluorescencia, etc …

Fáciles de abrir, sin espátulas o cuchillos

Geles compatibles con la mayoría de tanques

Más información: www.abcam.com/Optiblot

Histona H3 (fosfoT3) RabMAb

Anticuerpos monoclonales de conejo( ), óptimos para WB

RabMAb: ventajas para WB

• Alta afinidad – mayor factor de dilución (hasta 1:500.000 en algunos RabMAbs)

• Alta especificidad – señal específica, sin o con muy poco ruido de fondo

• Reconocen epítopos diversos – ideal para la detección de modificaciones post-

Anticuerpo histona H3 (fosfoT3) (ab78351), dilución 1/500,000 en HeLa.

1) Sin tratar, 2) Tratadas con FBS + Caliculina A.

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detección de modificaciones post-traduccionales (ej. fosforilación, metilación, acetilación)

• Cada RabMAb has sido testado en WB en muestras humanas, de ratón y rata para determinar la reactividad

• Más de 4000 RabMAbs disponibles

Más información: www.abcam.com/rabmabs

AbExcel anticuerpos secundarios

5 razones para usar secundarios AbExcel

• Altamente testados

• AbExcel conjugados a AP se pueden usar en diluciones de 1/5000 a 1/50000

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Más información:

AbExcel: http://www.abcam.com/AbExcel

diluciones de 1/5000 a 1/50000

• Con 1 vial de AbExcel conjugado a AP, se pueden conseguir hasta 1.500 blots (usando dilución 1/5000 en 3ml leche/BSA)

• AbExcel conjugados a HRP se pueden usar en diluciones de 1/2000 a 1/20000

• Con 1 vial de AbExcel conjugado a HRP, se pueden conseguir hasta 600 blots (usando dilución 1/2000 en 3ml leche/BSA)

Bolígrafo Luminol para membrana (ab166858)

La forma más fácil y segura de calcular el peso molecular de la proteína de interés. Una vez las proteínas han sido transferidas a la membrana:

Marca los estándares de PM con el boli Lumimol en la membrana

Continúa con la hibridación de la membrana según tu procedimiento habitual (bloqueo, etc…)

Revela la membrana por quimioluminiscencia o colorimetría

Visualiza y localiza las bandas del estándar con película o procesador CCD

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Contáctanos

[email protected]

España: Teléfono: 91 114 65 54, email: [email protected]

Argentina: Tecnolab; Teléfono: +54-11-4555-0010, email: [email protected]

Chile: Biosonda; Teléfono: +56-2-209-6770, email: [email protected]

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Chile: Biosonda; Teléfono: +56-2-209-6770, email: [email protected]

Méjico: CTR Scientific; Teléfono: +52-81-8158-0600, email: [email protected]

Otros paises: Abcam; Teléfono: +1-617-577-4200, email: [email protected]

Promoción especial para participantes

20% descuento en los siguientes productos:

(hasta el 31 de mayo 2013)

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• Gama Optiblot

• RAbMAbs

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Código : SPWEB-XBIS1

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