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Western Blot Introducción y Optimización 10 Abril 2013 Ariana Veiga

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  • Western BlotIntroduccin y Optimizacin 10 Abril 201310 Abril 2013Ariana Veiga

  • Western Blot

    En qu consiste el

    Western Blot?

    Tambin llamado Inmunoblot Tcnica utilizada para identificar una protena en una muestra que contiene

    varias protenas

    Cmo funciona?

    Las protenas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en funcin de su peso molecular

    A continuacin se utiliza un anticuerpo especfico para detectar la protena de inters El resultado aporta informacin sobre el peso molecular de la protena y su cantidad

    relativa en la muestra

    2

    relativa en la muestra

    Calle 1: Anticuerpo anti- Actina (ab8226) diluido 1/1000Calle 2: ab8226 diluido 1/10000

    Calles 3-4: ab8226 diluido 1/500

    Calle 1: Lisado celular HeLa (humano)Calle 2: Lisado celular HeLa (humano)Calle 3: Lisado celular HEK293 (humano)Calle 4: Lisado celular 3T3 (ratn)

  • En qu casos es til utilizar Western Blot?

    Est la protena de inters presente en mi muestra?

    El tratamiento con un determinado agente X, aumenta o reduce el nivel de expresin de mi protena?

    3

    protena?

    Cmo vara el nivel de expresin de la protena en distintos tejidos o lneas celulares?

    Mi muestra es sana o patolgica? El WB permite detectar enfermedades tales como la enfermedad de Lyme, la de las vacas locas, el VIH, etc.

  • Organizacin del Webinar

    Paso 2: Electroforesis en gel

    Paso 3: Transferencia gel - membrana

    Paso 1: Preparacin de la muestra

    4

    Paso 4: Inmunodeteccin

    Controles recomendados en WB

    Seleccin de anticuerpos

    Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.

    Enlaces a otros productos de inters

  • Protocolo de Western Blot

    Paso 2: Electroforesis en gel

    Paso 3: Transferencia gel - membrana

    Paso 1: Preparacin de la muestra

    5

    Paso 4: Inmunodeteccin

    Controles recomendados en WB

    Seleccin de anticuerpos

    Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.

    Enlaces a otros productos de inters

  • Preparacin de las muestras para la electroforesis

    Lisis: Las clulas o los tejidos se tratan con un tampn de lisis y seguidamente se degradan mecnicamente para liberar las protenas

    Clulas: mantenerlas en hielo, lavar con PBS fro y aadir el tampn de lisis (~1ml por cada milln de clulas). Despus agitar durante 30 minutos a 4 C

    Tejido: diseccionar rpidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente

    6

    Tejido: diseccionar rpidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente en nitrgeno lquido y homogeneizar en tampn de lisis (300 l por cada 5 g de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300 l de tampn, y agitar despus durante 2 horas a 4 C

    Centrifugar a 4 C durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo en hielo

  • Lisis

    Mantener las muestras en hielo o a 4C para evitar degradacin de las protenas

    Los tampones deben prepararse en el momento y mantenerse en fro. Antes de realizar la lisis, aadir al tampn un cocktail de inhibidores de proteasasSi la protena de inters est fosforilada, es importante asegurarse de incluir inhibidores de fosfatasas al tampn de lisis

    Elegir un tampn de lisis adecuado en funcin de la localizacin celular de la protena

    7

    Elegir un tampn de lisis adecuado en funcin de la localizacin celular de la protena de inters

    Localizacin de la protena Tampn de lisis recomendadoClula entera NP-40 o RIPACitoplasmtica (soluble) Tris-HClCitoplasmtica (citoesqueleto) Tris-TritonMembranal NP-40 o RIPANuclear RIPAMitocondrial RIPA

  • Preparacin de las muestras para la electroforesis

    Lisis: Las clulas o los tejidos se tratan con un tampn de lisis y seguidamente se degradan mecnicamente para liberar las protenas Clulas: mantenerlas en hielo, lavar con PBS fro y aadir el tampn de lisis

    (~1ml por cada milln de clulas). Despus agitar durante 30 minutos a 4 C Tejido: diseccionar rpidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar

    inmediatamente en nitrgeno lquido y homogeneizar en tampn de lisis (300 l por cada 5 g de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300

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    Determinar la concentracin de protenas

    l de tampn, y agitar despus durante 2 horas a 4 C Centrifugar a 4 C durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo

    en hielo

    Condiciones reductoras y desnaturalizantes: las muestras son normalmente tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las protenas (dmeros, estructuras terciarias) Aadir el tampn de carga a la muestra y calentar 5 minutos a 95-100C o

    durante 5-10 minutos a 70C

  • Condiciones reductoras y desnaturalizantes

    Un tampn de carga estndar contiene SDS (dodecilsulfato sdico) y -mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol) El SDS desnaturaliza la protena en su estructura primaria y la recubre de

    cargas negativas El -mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen los

    puentes disulfuro Todo ello permite que las protenas se separen en funcin del peso molecular

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    Todo ello permite que las protenas se separen en funcin del peso molecular mediante SDS-PAGE

    La reduccin y desnaturalizacin permiten adems la accesibilidad del anticuerpo a su sitio de unin

    SDS y DTT/-mercaptoetanol

    Nota: Algunos anticuerpos solo reconocen las protenas nativas (no reducidas y/o no desnaturalizadas). En este caso SDS y/o -mercaptoetanol o DTT no deben aadirse a los tampones.

  • Protocolo de Western Blot

    Paso 2: Electroforesis en gel

    Paso 3: Transferencia gel - membrana

    Paso 1: Preparacin de la muestra

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    Paso 4: Inmunodeteccin

    Controles recomendados en WB

    Seleccin de anticuerpos

    Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.

    Enlaces a otros productos de inters

  • SDS-PAGE

    Definicin Mtodo que permite separar las protenas bajo un campo elctrico de acuerdo a su movilidad electrofortica

    11

    SDS : Dodecilsulfato Sdico; PAGE : Electroforesis en gel de poliacrilamida

  • Cmo funciona?

    El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el tampn de migracin. Un tampn de migracin suele contener 25mM Tris; 190mM glicina; 0,1% SDS; pH 8,3

    Los lisados proteicos se cargan en las calles del gel, normalmente entre 20 y 40 g por calle

    Se aplica un campo elctrico que provoca el movimiento de las protenas hacia el polo positivo

    Al haberse tratado las protenas con SDS (cargas negativas), las cargas

    SDS-PAGE

    funciona? Al haberse tratado las protenas con SDS (cargas negativas), las cargas

    endgenas de las mismas son despreciables El resultado es que las protenas se separan en funcin de su talla, o

    peso molecular Las protenas de menor tamao quedan menos retenidas en la matriz del

    gel y por tanto migran mas rpidamente

    12

    -

    +

    Corriente elctricaFrente de migracin

  • Geles

    Constituidos de poliacrilamida, N, N-metilenbisacrilamida (Bis), persulfato de amonio (APS) y TEMEDLa estructura del gel puede modificarse alterando la proporcin de acrilamida

    Para protenas pequeas, se usa un gel con un porcentaje elevado de acrilamida, y viceversa para protenas de gran tamao

    13

    Tamao de la protena (kDa) Porcentaje del gel 4-40 20

    12-45 1510-70 12,515-100 1025-200 8

    Los geles en gradiente se recomiendan en aquellos casos en los que el tamao de la protena es desconocida

  • Electroforesis en condiciones no reductoras y/o no desnaturalizantes

    Forma requerida de la protena

    Condiciones electroforesis Tampn de carga

    Tampn de migracin

    Reducida-Desnaturalizada

    Reductor y desnaturalizante

    Con -mercaptoetanol o DTT Con SDS

    Con SDS

    Reducida - Nativa Reductor no Con -mercaptoetanol o Sin SDS

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    Reducida - Nativa Reductor no desnaturalizante

    Con -mercaptoetanol o DTTSin SDS

    Sin SDS

    Oxidada Desnaturalizada

    No reductor y desnaturalizante

    Sin -mercaptoetanol ni DTTCon SDS

    Con SDS

    Oxidada - Nativa No reductor y nativo

    Sin -mercaptoetanol ni DTTSinSDS

    Sin SDS

  • Protocolo de Western Blot

    Paso 2: Electroforesis en gel

    Paso 3: Transferencia gel - membrana

    Paso 1: Preparacin de la muestra

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    Paso 4: Inmunodeteccin

    Controles recomendados en WB

    Seleccin de anticuerpos

    Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.

    Enlaces a otros productos de inters

  • Objetivo de la transferencia

    Una vez realizada la electroforesis, es necesario marcar la protena de inters para poder visualizarla

    16

    El gel no es una superficie adecuada para poder marcar las protenas Los anticuerpos no son retenidos en el gel Los geles son frgiles y difciles de manipular

    Por tanto, es necesario transferir las protenas a un soporte ms adecuado

  • Cmo funciona la transferencia?

    El principio es similar al de PAGE, es decir, las protenas cargadas negativamente migran hacia el polo positivo bajo el efecto de un campo elctricoSe intercala una membrana entre el gel y el electrodo positivo

    Las protenas se adhieren a la membrana siguiendo la misma disposicin que en el gel

    17

    Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF). Estas ltimas requieren un pretratamiento con metanol

    Montaje de la transferencia

  • Transferencia en medio hmedo o semi seco?

    InconvenientesVentajas

    Medio Hmedo

    El gel y la membrana se intercalan y fijan firmemente entre finas esponjas y papel absorbente

    Este montaje sndwich se sumerge en un compartimento que contiene el tampn de transferencia donde se aplica a continuacin la corriente elctrica

    El proceso de transferencia es ms largo

    Adecuado para protenas grandes o difciles de transferir

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    la corriente elctrica Un tampn de transferencia se compone

    normalmente de 25mM Tris, 190mM Glicina y 20% de Metanol

    Semi Seca

    El montaje papel-gel-membrana-papel se humedece con tampn de transferencia

    El montaje se coloca directamente entre el ctodo y el nodo donde se aplica la corriente

    El tampn de transferencia estndar suele contener 48mM Tris, 39mM Glicina, 0,04% SDS, y 20% Metanol

    Ms rpido La membrana puede secarse afectando a la transferencia de las protenas

  • Transferencia de protenas >100 kDa

    Transferencia en medio hmedo durante la noche a 4 C y bajo voltaje

    Aadir 0.1% SDS al tampn de transferencia para reducir la formacin de

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    Aadir 0.1% SDS al tampn de transferencia para reducir la formacin de aglomerados en el gel

    Reducir la cantidad de metanol en el tampn de transferencia a 10% o incluso menos para evitar la dispersin de protenas en el gel

    Si la membrana es de PVDF, el metanol puede retirarse completamente del tampn (sigue siendo necesario sin embargo su pre-tratamiento con metanol)

  • Protocolo de Western Blot

    Paso 2: Electroforesis en gel

    Paso 3: Transferencia gel - membrana

    Paso 1: Preparacin de la muestra

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    Paso 4: Inmunodeteccin

    Controles recomendados en WB

    Seleccin de anticuerpos

    Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.

    Enlaces a otros productos de inters

  • Por qu se utilizan anticuerpos?

    Colorantes como Coomassie pueden usarse para teir las protenas despus de realizar el SDS-PAGE SDS3

    21

    Pero, cul de las bandas corresponde a la protena de inters?

    El uso de anticuerpos especficos soluciona el problema detectando nicamente la protena de inters

    Lisado celular de SDS3 transfectado (ab94303) en SDS-PAGE (izquierda) y en Western Blot con el anticuerpo ab89345 anti-SDS3 (derecha).

  • Inmunodeteccin

    Bloqueo de la membrana Leche, BSA, etc

    Incubacin con el anticuerpo primario Anticuerpo

    Eptopo

    Protena Protena

    22

    Lavado (TBST)

    Lavado (TBST)

    Incubacin con anticuerpo secundario

    conjugado AnticuerpoProtenaProtena

    DeteccinProtena

  • Deteccin

    Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo

    Sustrato (perxido de hidrgeno + luminol)

    Producto (sensible a la luz)

    Los sustratos cromognicos (4-cloronaftol o DAB) tambin pueden utilizarse con las enzimas HRP o AP, dando lugar a un producto coloreado que se deposita en la membrana prximo a la zona del anticuerpo

    Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo secundario conjugado a la enzima HRP, produciendo una seal que se captura en una pelcula fotogrfica

    Los anticuerpos secundarios conjugados a fluorforos tambin pueden usarse siempre y cuando se disponga de un equipo de deteccin especial

    23

    ECL : Enhanced chemiluminescenceHRP : HorseRadish Peroxidase

    DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochlorideAP : Alkaline Phosphatase

  • Protocolo de Western Blot

    Paso 2: Electroforesis en gel

    Paso 3: Transferencia gel - membrana

    Paso 1: Preparacin de la muestra

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    Paso 4: Inmunodeteccin

    Controles recomendados en WB

    Seleccin de anticuerpos

    Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.

    Enlaces a otros productos de inters

  • Controles de carga

    Los controles de carga son anticuerpos usados para asegurar que la carga de protenas en cada calle del gel de SDS PAGE es constante

    Un anticuerpo control de carga detecta una protena altamente conservada y presente en cantidades similares independientemente del tipo de muestra

    Control de carga Tipo de muestra

    Peso molecular (KDa) Precauciones

    Actina Clula entera / Citoplasma

    42 No es vlido para muestras del musculo esqueltico. Cambios en las condiciones de crecimiento celular e interacciones con los componentes de la matriz extracelular pueden alterar la sntesis de

    25

    componentes de la matriz extracelular pueden alterar la sntesis de la protena actina (Farmer et al, 1983)

    GAPDH Clula entera / Citoplasma

    30-40 Algunos factores fisiolgicos, como hipoxia o diabetes, aumentan el nivel de expresin de GAPDH en determinados tipos celulares

    Tubulina Clula entera / Citoplasma

    55 La expresin de tubulina puede variar con la resistencia a sustancias antimicrobianas y antimitticas (Sangrajrang S. et al, 1998, Prasad V et al, 2000)

    VDCA1/Porinas Mitocondria 31COXIV Mitocondria 16 Muchas protenas migran al mismo peso molecular (16KDa) que

    COXIV Lamin B1 Ncleo 66 No es vlido para muestras en las que se ha eliminado la

    membrana nuclear Protena de unin a TATA (TBP)

    Ncleo 38 No es vlido para muestras sin ADN

  • Controles de carga

    Calle 1: Clulas HeLa (humano) a 20 gCalle 2: Clulas 3T3 (ratn) a 20 g

    Todas las calles - anticuerpo anti - Actina control de carga (ab8227) diludo 1/1000

    Nota: la afinidad del anticuerpo puede variar segn la especie o naturaleza de la protena (nativa o recombinante), etc

    26

    Calle 2: Clulas 3T3 (ratn) a 20 gCalle 3: Hgado de pescado a 20 gCalle 4: Hgado de conejo a 20 gCalle 5: Clulas MDCK (perro) a 20 gCalle 6: Clulas EBTr (bovino) a 20 gCalle 7: Clulas SL-29 (pollo) a 20 gCalle 8: Clulas CHO (Hamster chino) a 20 gCalle 9: Embrin de Xenopus a 20 g

  • Controles positivos y negativos

    Realizar en paralelo el ensayo de muestras desconocidas con muestras en las que se ha comprobado el nivel de expresin de la protena de inters Protena recombinante Clulas transfectadas con la protena de inters Tejidos o lneas celulares que expresen la protena Tejidos o lneas celulares que expresen la protena

    Incluir tambin una muestra que no exprese la protena a detectar Muestras knockout o siRNA Tejidos o lneas celulares que no expresen la protena

    27

  • Pptidos de bloqueo

    La pre-incubacin del anticuerpo primario con el pptido inmungeno permite bloquear de manera especfica los sitios de unin del anticuerpo

    Las bandas especficas no sern visibles en el blot ya que el anticuerpo pre-incubado no puede unirse a la protena en la membrana

    til para determinar si las bandas observadas corresponden a isoformas, fragmentos de la protena o protenas no especficas

    28

    protena o protenas no especficas

    Calle 1: Preparado de Histona, clulas HeLa

    Calle 2: Preparado de Histona de clulas HeLa tratadas con colcemida

    Calle 3: Preparacin de histona de clulas HeLa 0,5g con pptido de bloqueo Histona H3 fosfo S10, trimetil K9 (ab15644) a 1 g/ml

    Calle 4: Preparacin de histona de clulas HeLa tratadas con colcemida 0,5g con pptido de bloqueo Histona H3 fosfo S10, tri metil K9 (ab15644) a 1 g/ml

    Todas las calles: Anti-Histona H3 (fosfoS10) [mAbcam 14955] - ChIP Grade (ab14955) a 1 g/ml

  • Protocolo de Western Blot

    Paso 2: Electroforesis en gel

    Paso 3: Transferencia gel - membrana

    Paso 1: Preparacin de la muestra

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    Paso 4: Inmunodeteccin

    Controles recomendados en WB

    Seleccin de anticuerpos

    Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.

    Enlaces a otros productos de inters

  • Adecuado para Western Blot

    Utilizar anticuerpos que hayan sido previamente testados en Western Blot

    Las aplicaciones en las que un anticuerpo ha sido testado se indican en la ficha tcnica del anticuerpo

    30

  • Inmungeno y especificidad

    Inmungeno: protena especfica o secuencia de amino cidos que se inyecta en un animal para provocarle una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos especficos contra ella

    La seleccin del inmungeno permite producir un anticuerpo que reconozca y se fije sobre una regin especfica de la protena (eptopo) Asegurarse que la secuencia del inmungeno est presente en la protena de inters cuando se est estudiando una isoforma concreta de la protena, la forma madura o un

    31

    NERTCRCDKP

    NERTCRCDKP

    cuando se est estudiando una isoforma concreta de la protena, la forma madura o un precursor de la misma si no, el anticuerpo no reconocer la protena

  • Protocolo de Western Blot

    Paso 2: Electroforesis en gel

    Paso 3: Transferencia gel - membrana

    Paso 1: Preparacin de la muestra

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    Paso 4: Inmunodeteccin

    Controles recomendados en WB

    Seleccin de anticuerpos

    Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.

    Enlaces a otros productos de inters

  • Ausencia de bandas, o bandas muy dbiles

    Origen del problema SolucinIncompatibilidad con el anticuerpo secundario

    Seleccionar un anticuerpo secundario que sea compatible con la especie y el isotipo del anticuerpo primario (ej. Anticuerpo secundario anti-IgM de ratn con anticuerpo primario IgM hecho en ratn)

    No hay suficiente protena o anticuerpo para producir una seal

    Aumentar la cantidad de lisado, de anticuerpo primario o de anticuerpo secundario (incluso una combinacin de los tres)

    Tiempo de incubacin insuficiente para producir una seal

    Incubar la membrana con el anticuerpo primario durante la noche a 4C

    33

    para producir una seal durante la noche a 4CLa membrana no se ha bloqueado correctamente

    Bloquear durante menos tiempo o usando un agente de bloqueo diferente. La adicin de Tween 20 al tampn de bloqueo reduce la fijacin del anticuerpo al agente de bloqueo

    La protena no se ha transferido correctamente del gel a la membrana

    Comprobar que se ha producido la transferencia usando un colorante como rojo de Ponceau. Es posible que sea necesario aumentar o disminuir el tiempo de transferencia

    Las protenas hidrfobas son ms difciles de transferir

    Para este tipo de protenas usar membranas de PVDF

    La muestra no expresa la protena de inters

    Revisar literatura y bases de datos sobre la protena de inters

    El anticuerpo no reconoce la protena de inters

    Verificar que la secuencia del inmungeno est presente en la protena a estudiar

  • Ruido de fondo

    Origen del problema Solucin

    Exceso de lisado celular, anticuerpo primario o secundario que provocan uniones no especficas

    Reducir la carga de protena en el gel y/o diluir ms los anticuerpos

    Temperatura de incubacin del anticuerpo primario muy elevada

    Incubar durante la noche a 4C

    La membrana no se ha bloqueado correctamente

    Aumentar el tiempo de lavado, y aadir un detergente, como Tween 20, al tampn de lavado. Probar otro agente de bloqueo

    34

    Probar otro agente de bloqueo

    Uso de una membrana no adecuada

    Las membranas de nitrocelulosa suelen dar menos ruido de fondo que las membranas de PVDF

    Degradacin de la protena Optimizar la preparacin de la muestra. Mantener las muestras en hielo y aadir una solucin recin preparada de inhibidores de proteasas. Almacenamiento de muestras a largo plazo puede daar las protenas

    Presencia de isoformas o fragmentos de la protena de inters

    Consultar la literatura y SwissProt

    Presencia de polmeros Hervir las muestras durante 10 minutos antes de realizar la electroforesis

  • Exceso de protena y/o anticuerpo

    35

    Dilucin de la muestra y anticuerpo primario

  • Optimizacin del tampn de bloqueo

    5% leche 5% BSA

    36

    A cada anticuerpo le corresponder una solucin de bloqueo ptima

    Anti-GAPDH [mAbcam 9484] - Loading Control (ab9484) a una dilucin 1/1000

    5% leche5% BSA

  • Burbujas de aire, lavados insuficientes, transferencia incompleta

    Durante la transferencia, contacto insuficiente entre el gel y la membrana

    37

    Burbujas de aire entre el gel y la membrana durante la transferencia

    Lavados insuficientes

  • Protenas en estado nativo

    Algunos anticuerpos presentan mayor afinidad por las estructuras nativas de las protenas que por las formas desnaturalizadas y/o reducidas

    La imagen muestra un Western Blot de colgeno III humano purificado, en la forma reducida y desnaturalizada a la izquierda, y en su forma nativa a la derecha

    La estructura tridimensional del sitio de unin del anticuerpo al antgeno se pierde al desnaturalizar y reducir la protena pierde al desnaturalizar y reducir la protena

    Forma reducida y desnaturalizada

    Forma nativa

    Calle 1: Protena en su forma reducida y desnaturalizada

    Calle 2: Protena nativa (son reducir ni desnaturalizar)

    Colgeno humano purificado (ab7535) a 5 g por calle con el anticuerpo anti-colgeno III(ab6310)

    Imagen cortesa de un Abreview enviado por Michaela Leyh

    38

  • Conocer la protena de inters

    Las protenas no siempre muestran una nica banda al peso molecular esperadoPosibles motivos: fragmentacin de la protena, modificaciones post -traduccionales, expresin de isoformas, propiedades isoelctricas

    39

    Se aconseja consultar siempre SwissProt y la literatura

    -traduccionales, expresin de isoformas, propiedades isoelctricas Una diferencia del 10-15% respecto al tamao esperado se considera aceptable y dentro de la normalidad

  • Protocolo de Western Blot

    Paso 2: Electroforesis en gel

    Paso 3: Transferencia gel - membrana

    Paso 1: Preparacin de la muestra

    40

    Paso 4: Inmunodeteccin

    Controles recomendados en WB

    Seleccin de anticuerpos

    Problemas tcnicos y optimizacin. Ejemplos.

    Enlaces a otros productos de inters

  • Protocolos y material de inters

    Protocolos detallados de WBwww.abcam.com/protocols

    SwissProt www.uniprot.org

    41

    Gua sobre controles de carga:http://www.abcam.com/loadingcontrolguide

    Vdeo detallado sobre WB: http://www.abcam.com/westernblotguide

    Gua de trucos para WB

    Descarga tu gua de trucos para WB en nuestra pgina de protocolosO pide tu copia por e-mail: [email protected]

  • Reactivos para Western Blot

    Geles prefabricados y soluciones tampn optimizadas para WB Otros reactivos (tincin de gel, Bradford, etc ) www.abcam.com/Optiblot

    Optiblot

    Marcadores de peso molecular pre coloreados y listos para usarMarcadores de peso

    42

    www.abcam.com/prismproteinladdersde peso molecular Prism

    Anticuerpos secondarios AbExcel

    Anticuerpos secundarios validados para WB Conjugados a fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa (HRP) www.abcam.com/abexcel

    Kits ECL Sustratos ECL de alta sensibilidad para WB www.abcam.com/ecl

  • Optiblot reactivos para WB

    Fciles de usar pocillos coloreados para facilitar la carga de la muestra

    Pocillos de alta capacidad y sin peine que remover

    Hasta 10 veces msfuertes que los geles convencionales

    Larga duracin 1-2 aos de caducidad

    43

    Todos los reactivos necesarios para tus experimentos: Tampones optimizados Optiblot Blue (ab119211) tincin tipo Coomassie del gel en tan slo 15 minuots Reactivo Bradford y ensayo BCA compatible con detergentes en la muestra Otros productos membranas PVDF de baja fluorescencia, etc

    Fciles de abrir, sin esptulas o cuchillos

    Geles compatibles con la mayora de tanques

    Ms informacin: www.abcam.com/Optiblot

  • Histona H3 (fosfoT3) RabMAb

    Anticuerpos monoclonales de conejo( ), ptimos para WB

    RabMAb: ventajas para WB Alta afinidad mayor factor de dilucin (hasta

    1:500.000 en algunos RabMAbs) Alta especificidad seal especfica, sin o

    con muy poco ruido de fondo Reconocen eptopos diversos ideal para la

    deteccin de modificaciones post-

    Anticuerpo histona H3 (fosfoT3) (ab78351), dilucin 1/500,000 en HeLa.

    1) Sin tratar, 2) Tratadas con FBS + Caliculina A.

    44

    deteccin de modificaciones post-traduccionales (ej. fosforilacin, metilacin, acetilacin)

    Cada RabMAb has sido testado en WB en muestras humanas, de ratn y rata para determinar la reactividad

    Ms de 4000 RabMAbs disponibles

    Ms informacin: www.abcam.com/rabmabs

  • AbExcel anticuerpos secundarios

    5 razones para usar secundarios AbExcel Altamente testados AbExcel conjugados a AP se pueden usar en

    diluciones de 1/5000 a 1/50000

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    Ms informacin:AbExcel: http://www.abcam.com/AbExcel

    diluciones de 1/5000 a 1/50000 Con 1 vial de AbExcel conjugado a AP, se

    pueden conseguir hasta 1.500 blots (usando dilucin 1/5000 en 3ml leche/BSA)

    AbExcel conjugados a HRP se pueden usar en diluciones de 1/2000 a 1/20000

    Con 1 vial de AbExcel conjugado a HRP, se pueden conseguir hasta 600 blots (usando dilucin 1/2000 en 3ml leche/BSA)

  • Bolgrafo Luminol para membrana (ab166858)La forma ms fcil y segura de calcular el peso molecular de la protena de inters. Una vez las protenas han sido transferidas a la membrana:

    Marca los estndares de PM con el boli Lumimol en la membrana

    Contina con la hibridacin de la membrana segn tu procedimiento habitual (bloqueo, etc)Revela la membrana por quimioluminiscencia o colorimetra

    Visualiza y localiza las bandas del estndar con pelcula o procesador CCD

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  • Contctanos

    [email protected]

    Espaa: Telfono: 91 114 65 54, email: [email protected]

    Argentina: Tecnolab; Telfono: +54-11-4555-0010, email: [email protected]

    Chile: Biosonda; Telfono: +56-2-209-6770, email: [email protected]

    47

    Chile: Biosonda; Telfono: +56-2-209-6770, email: [email protected]

    Mjico: CTR Scientific; Telfono: +52-81-8158-0600, email: [email protected]

    Otros paises: Abcam; Telfono: +1-617-577-4200, email: [email protected]

  • Promocin especial para participantes

    20% descuento en los siguientes productos: (hasta el 31 de mayo 2013)

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    Gama Optiblot RAbMAbs Gama AbExcel

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  • Preguntas?

    49