BACTERIAS Y LEVADURAS COMO SISTEMAS HETERÓLOGOS DE

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS DE INTERÉS EN MICROBIOLOGÍA

Guillermo Hernán SguazzaCátedra de Virología

Facultad de Ciencias Veterinarias - UNLP

Proteínas Recombinantes

Organismos difíciles de cultivar.

Bajo rendimiento.

Poco reproducibles.

Métodos costosos.

Alto riesgo biológico.

Organismo original

Organismo recombinanteGen de Interés

Fáciles de cultivar.

Alto rendimiento.

Muy reproducibles.

Económicos.

Bajo riesgo.

También pueden producirse proteínas recombinantes que no existen en la naturaleza.

Métodos ExtractivosMétodos Extractivos

Proteínas de origen natural

Uso de las proteínas recombinantes

Agropecuarias: InoculantesSanidad animalBiopesticidas y bioherbicidas

Industriales:Alimentos (quimosinas, amilasas)Textil (amilasas, pectinasas,etc)Papel (xilanasas; celulasas)

Salud humana:Diagnóstico Terapéuticas Vacunas Actualmente más de 254 fármacos

biotecnológicos han sido aprobados para más de 392 indicaciones terapéuticas

INSULINA (1982)(Diabetes mellitus)Páncreas porcino (Ala30→Thr) → Distinta farmacocinética

SOMATOTROPINA (1985) (Enanismo congénito)Hipófisis humana → Algunos casos de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

HBsAg (1986)(Vacuna VHB)Plasma sanguíneo de enfermos crónicos (~20L/dosis).

ERITROPOYETINA (1989)(Pacientes anémicos con insuficiencia renal crónica)2550 litros de orina para obtener 10 mg EPO

Ejemplos

Obtención del gen de interés

Selección de las colonias productoras

Clonación del vector

Cultivo a baja escala

Pruebas piloto

Escalado

Extracción

Purificación

Formulación

Sistemas de expresión

Bacterias.Levaduras.Baculovirus - Células de Insecto.Células de mamífero.Plantas transgénicas.Animales transgénicos.

La elección del organismo depende de:

Las propiedades de la proteína – Modificaciones post-traduccionales.

El grado de pureza requerida.

Demanda del producto – Escala de producción.

Capacidad de expresión del sistema.

Costo de producción.

Equipamiento requerido.

Posibles sistemas:

Bacterias Levaduras C. insecto C. mamíferoPlantas Animales

Costo Dificultad Tiempo Expresión Versatilidad

Costo Escalado Purificación Riesgos

Producción

Desarrollo

BacteriasEscherichia coli Bacillus subtilisCaulobacter crescentusPseudomonas sp.Streptomyces lividansLactobacillus lactis

VentajasBuen conocimiento sobre su fisiología y genética.Fácil manipulación.Cultivos baratos con altas densidades celulares.

DesventajasNo poseen un sistema eficiente para realizar modificaciones post-traduccionales.Baja secreción de la proteína al medio de cultivo.Formación de cuerpos de inclusión insolubles en el citoplasma celular.Generan endotoxinas.

LevadurasSaccharomyces cerevisiaeHansenula polymorphaPichia pastorisYarrowia lipolyticaKluyveromyces lactis

VentajasSon capaces de glicosilar proteínas de manera similar a los eucariotas superiores.Muchos son organismos GRAS.Manipulación sencilla a nivel de laboratorio e industrial.Medios de cultivos baratos.Secreción eficiente de la proteína heteróloga.Libres de toxinas y pirógenos.

DesventajasActividad proteolítica.Presentan fenómenos de hiperglicosilación. Algunas proteínas no se producen de forma eficiente.

TerapeuticosInsulina E. coli (Diabetes mellitus)Activador de plasminógeno E.coli (Anticoagulante)Hormona de Crecimiento E.coli (Ciertos defectos en el crecimiento)Antagonista HCH E. coli (Acromegalia)Calcitonina E. coli (Osteoporosis postmenopáusica)Glucagon S. cerevisiae (Hipoglucemia)Hirudina S. cerevisiae (Anticoagulante)INF alfa E. coli (Hepatitis B y C)Interleukina – 1 E. coli (Artritis reumatoidea)Interleukina – 2 E. coli (Carcinoma renal)INFγ 1b E. coli (Anti viral)

VacunasPapiloma Humano S. cerevisiae Hepatitis B S. cerevisiaeBorrelia burgdorferi E. coli

Anticuerpos monoclonalesAsma, psoriasis, artritis reumatoidea, esclerosis múltiple y algunos tipos de cáncerDiagnóstico.