sesión 15 fisiopatplogia

7/17/2019 Sesión 15 fisiopatplogia

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Asignatura: ANÁLISIS INSTRUMENTALEscuela: Farmacia y Bioquímica

CURSO: ANÁLISIS INSTRUMENTALPROFESOR: MS QF DAVID RUIDÍAS ROMERO

QUINCEAVA

SEMANA

Fundamentos Instrumentación Optimización de la separación cromatográfica Aplicación de la HPLC



Técnica L columna, cm Diámetro de partícula, µm

LC 50 – 500 150 – 200

HPLC 3 – 30 3 – 10

UPLC Hasta 5 < 2

1. Fundamentos

LC: Liquid Chromatography

HPLC: High Performance Liquid Chromatography orHigh Pressure Liquid Chromatography

UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography

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CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio

LC Reparto Líquido adsorbido sobre unsólido

Distribución entrelíquidos inmiscibles

Reparto con fasesenlazadas

Especies orgánicas enlazadasa una superficie sólida

Distribución entrelíquido y superficieenlazada

Adsorción Sólido Adsorción

Intercambio iónico Resina de Int. Iónico Intercambio iónico

Exclusión por tamaño Líquido en intersticios de unsólido polimérico

Distribución/Exclusión

1. Fundamentos

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1. Fundamentos

LC DE INTERCAMBIO IÓNICO

++

+

++

+

+

F l u j o d e f a s e m ó v i l -

--

---

-

---

+

+ +

+

+

+

+

+

+ Intercambiador iónico (aniónico) - +y : Especies a separar

Las especies con carga negativa se unen a la resina que estácargada positivamente, quedando retenidas.

Las especies con carga positiva son repelidas por la resinasiendo eluídas de la columna.

Intercambiador catiónico:xRSO3

-H+ + Mx+ ↔ (RSO3-)xMx+ + xH+

sólido disolución sólido disolución

Intercambiador aniónico:xRN(CH3)3

+OH- + Ax- ↔ [RN(CH3)3+]xAx- + xOH-

sólido disolución sólido disolución

EQUILIBRIOS DE INTERCAMBIO

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1. Fundamentos

F l u j o d e f a s e m ó v

i l

Bolas de gel: fase estacionaria

y : especies a separarLas moléculas más pequeñas penetranen los intersticios o canales del gel,viajando a menor velocidad

Las moléculas más grandes no pueden penetraren los canales del gel y por tanto viajan a mayorvelocidad.

LC DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS

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2. Instrumentación

COMPONENTES DE LA INSTRUMENTACIÓN

Depósitos de fase móvil

Bomba cromatográfica

Sistema de inyección

Compartimento para la columnacromatográfica: Columna

Detector

Depósito

de residuos

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7

2. Instrumentación

Fase móvil

Columnacromatográfica

Válvula deinyección

Bomba

cromatográfica

Detectorfluorimétrico




2. Instrumentación

SISTEMA DE BOMBEO

• Proporciona presiones superiores

a 6000 psi.• Salida de disolventes libres de

impulsos.• Velocidades de flujo habituales de

0,1 – 5 mL/min.

• Reproducibilidades de flujo de, almenos, 0,5% (Ej. 2 mL min-1: 1,99 –2,01 mL/min)

• Resistencia a la corrosión .

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2. InstrumentaciónSISTEMA DE INYECCIÓN: - Muestreadores automáticos

- Válvulas de bucle de muestreo

Lazo o bucle deinyección (5 – 500 µL)

Orificio para inyección

mediante microjeringa

Palanca paracambio de posición

Entrada de fase móvildesde la bomba

Salida haciala columna

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Microjeringa




2. Instrumentación

Microjeringa Microjeringa

POSICIÓN DECARGA

Hacia lacolumna

Hacia lacolumna

Entrada defase móvil

Entrada defase móvil

Aresiduos

Lazo demuestra

POSICIÓN DEINYECCIÓN

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2. Instrumentación

Bandeja

Brazo deinyección

Lavado

Viales demuestras

MUESTREADOR AUTOMÁTICO




2. Instrumentación COLUMNA CROMATOGRÁFICA

• Columnas: L=10-30 cm. D.I.= 4-10 mm.

Rellenos de tamaño de partícula: 5-10 µm.

N/m= 40000-60000

• Microcolumnas: L=3-7cm. D.I.=1-4 mm.

Rellenos de tamaño de partícula: 3-5 µm.

N/m= 100000

Entrada

Guarda-columna

Carcasa de

alumnioanodizado

Fritas detitanio poroso

Frita de titanioporoso

Salida

Columna principal(plástico)

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Fig.1




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2. InstrumentaciónCOLUMNAS DE LC

PRECOLUMNACOLUMNA

Flujo de fase móvil




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2. InstrumentaciónTERMOSTATIZACIÓN DE LA COLUMNA

Columna

Compartimentode

termostatización




2. InstrumentaciónSISTEMAS DE DETECCIÓN

Algunos de los detectores comerciales más usados

Detector Límite de detecciónaproximado, ng Intervalo de linealidad endecenas

Absorbancia 0,1 – 1 3-4

Fluorescencia 0,001 – 0,01 5

Electroquímico 0,01 - 1 4 - 5

Conductividad 0,5 - 1 5

Índice de refracción 100 - 1000 3

Espectrometría de masas 0,1 - 1 5

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Entradade flujo

2. Instrumentación

Entradade flujo

Salida de flujo

Fuentede luz Detector

ESQUEMAS BÁSICOS DE DETECTORES

ESPECTRÓMETRO DE ABSORCIÓNVISIBLE-ULTRAVIOLETA

Fuente deiones

Analizadorde masas

Detectorde iones

Adquisiciónde datos

ESPECTRÓMETRO DE MASAS

Identificación:Espectros de masas

A b u n d

a n c i a

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Fig.1




3. Optimización de la separación cromatográficaA. SELECCIÓN DEL TIPO DE LC

Parámetros a considerar:- Peso molecular- Solubilidad

- Polaridad- Estructura química

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102

103

104

105

106

P

e s o m o l e c u l a r

Polar no iónicoNo polar Iónico

Insoluble en agua Soluble en agua

Aumento de la polaridad

Exclusión

(En gel permeable) (Filtración en gel)

Adsorción

Reparto

Intercambioiónico

(Repartoen fasereversa)

(Repartoen fasenormal)




3. Optimización de la separación cromatográfica

B. SELECCIÓN DE LA FASE MÓVIL

Descartar los disolventes incompatibles por sus propiedades físicas

Ajuste de la fuerza de los disolventes

Selectividad de los disolventes

Fase móvil óptima

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3. Optimización de la separación cromatográfica

Separación de 8 compuestosFase móvil:Mezclas agua (A)/acetonitrilo (B)

ELUCIÓN ISOCRÁTICA

AJUSTE DE LA FUERZA DE LOS DISOLVENTES

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3. Optimización de la separación cromatográficaAJUSTE DE LA FUERZA DE LOS DISOLVENTES

ELUCIÓN EN GRADIENTE

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3. Optimización de la separación cromatográficaLC DE REPARTO

Técnica Faseestacionaria

Fasemóvil

Fase normal polar apolarFase reversa apolar polar

R e s p u e s t a d e l d e t e c t o r

Tiempo

Inyección

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3 4

Polaridad de los compuestos

1 > 2 > 3 > 44 > 3 > 2 > 1

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4. Aplicaciones al análisis de fármacos

LC DE REPARTO

PAHs, pesticidas, sulfonamidas, vitaminas, drogas y sus metabolitos, antibióticos,esteroides, analgésicos, colorantes, ácidos grasos, nucleótidos ….

Fase reversa.Elución en gradiente con mezclaACN:agua.

Sulfonamidas

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4. Aplicaciones al análisis de compuestos orgánicos

LC DE ADSORCIÓN : Fase estacionaria alúmina y sílice

OlefinasHidrocarburos aromáticosHaluros, sulfurosÉteresNitrocompuestos

Ésteres, aldehídos, cetonasAlcoholes, aminasSulfonasSulfóxidosAmidas

Ácidos carboxílicos

ORDEN EN TIEMPO DE RETENCIÓN DE MAYOR A MENOR

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Obsérvese que los compuestos menos polares presentan mayor afinidad por la fase estacionaria



4. Aplicaciones al análisis de aguas

LC DE INTERCAMBIO IÓNICO

Análisis y control de

calidad de aguas

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A

B

C

D




4. Aplicaciones al análisis de proteínas

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LC DE EXCLUSIÓN MOLECULAR




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