revisiÓn bibliografica sobre los microorganismos

REVISIÓN BIBLIOGRAFICA SOBRE LOS MICROORGANISMOS BIODEGRADADORES DE POLIETILENO DE BAJA DENSIDAD Y SUS

EFECTOS EN EL MATERIAL

Nelson Ricardo Acuña Molina

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACION PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA

BOGOTA D.C. 2017

I

REVISIÓN BIBLIOGRAFICA SOBRE LOS MICROORGANISMOS BIODEGRADADORES DE POLIETILENO DE BAJA DENSIDAD Y SUS

EFECTOS EN EL MATERIAL

Nelson Ricardo Acuña Molina

TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE LICENCIADO EN QUÍMICA

Directores: Jorge Alonso Leyva Rojas Dr.rer.nat

Josué Anselmo García Ortiz MSc. Codirector:

Mario Sánchez Rodríguez PhD.

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACION

PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BOGOTA D.C.

2017

II

Nota de Aceptación

Presidente del Jurado

Jurado

Jurado

Bogotá D.C. (01, marzo, 2017)

III

Dedicatoria

A mi madre y a todos los

maestros que incentivaron, y

potenciaron mi curiosidad y

amor a la ciencia, asi como

también a aquellos que me

guiaron y ayudaron para adquirir

mis conocimientos y habilidades

científicas.

IV

AGRADECIMIENTOS Le agradezco a mi madre por su apoyo constante, a mis profesores por todas sus enseñanzas en especial a mis directores y codirector Jorge, Josué y Mario por su esfuerzo y apoyo, a todos mis amigos que con sus consejos y sugerencias contribuyeron de alguna manera en la realización de este trabajo, en especial a David Leonardo Castilla y a Néstor Alexander Zambrano que amablemente aportaron por medio de sus revisiones y sugerencias.

V

CONTENIDO

Pág.

Lista de tablas X Lista de Figuras XI Lista de Gráficas XIII

Lista de Anexos XIV Abreviaturas XV Glosario XVI 1. RESUMEN 1 2. INTRODUCCIÓN 2 3 OBJETIVOS 2 3.1 Objetivos general 2 3.2 Objetivos específicos 3 4. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN 3 4.1. Definición del problema 3 4.2. Reseña histórica 4 4.3 Alternativas para el control del LDPE 5 4.3.1 Enterramiento en rellenos sanitarios del LDPE 5 4.3.2 La incineración del LDPE 5 4.3.3 La Pirólisis del LDPE 6 4.4. Políticas de reciclaje 6 4.4.1 Problema ambiental causado por el LDPE 7 5 MARCO TEÓRICO 7 5.1 Polímeros 8 5.1.1 Plásticos 8 5.1.2 Poli olefinas 8 5.1.2.1.1 El polietileno (PE) 8 5.1.2.1.2 Clasificación del PE 8 5.1.2.1.2.1 Polietileno de baja densidad (LDPE) 9 5.1.2.1.2.2 Polietileno lineal de baja densidad o (LLDPE) 9 5.1.2.1.2.3 Polietileno de alta densidad (HDPE) 9 5.1.2.1.2.4 Causas de la Inercia química del polietileno 10 5.2 Biopolímeros sustitutos del LDPE 10 5.2.1 Biopolímeros naturales 10 5.2.2 Biopolímeros sintéticos 10 5.2.3 Bioplásticos 11 5.2.3.1 Bioplásticos totalmente biodegradables 11 5.2.3.2 Bioplásticos biofragmentables 11 5.3 Biorremediación 11 5.3.1 Biodegradación de polietileno de baja densidad

(LDPE) 11

5.3.1.1 Biodeterioración 12 5.3.1.2 Asimilación 12

VI

5.3.2 Factores a tener en cuenta en la biodegradación del LDPE

12

5.3.2.1 Ruta de la biodegradación del LDPE 13 5.3.2.2 Iniciadores y aceleradores del proceso de

biodegradación, degradación abiótica 15

5.3.2.2.1 Fotólisis 15 5.3.2.2.2 Oxidación térmica 16 5.3.2.2.3 Oxidación mecano química 16 5.3.2.2.4 Mecanismos de despolimerización 16 5.3.2.2.4.1 Iniciación 16 5.3.2.2.4.2 Propagación 17 5.3.2.2.4.3 Terminación 17 5.3.3 Microorganismos reportados que degradan el

polietileno 17

5.3.3.1 Hongos como agentes degradadores de LDPE 21 5.3.3.2 Bacterias como agentes degradadores de LDPE 21 5.3.3.3 Consorcios microbianos 21 5.3.3.4 Enzimas reportadas 22 5.3.3.5 Biodegradación aerobia y anaerobia 23 5.3.3.5.1 Reacción básica de biodegradación de tipo

aeróbico 23

5.3.3.5.2 Reacción básica de biodegradación de tipo anaeróbico

23

5.3.3.6 Efecto en la biodegradación en la humedad del medio

23

5.3.3.7 Efecto del pH en el medio 24 5.3.3.8 Efecto de la temperatura 24 5.3.4 Aditivos utilizados para potenciar la degradación

del LDPE 25

5.3.4.1 El polietileno de baja densidad LDPE con almidón 25 5.3.4.2 Aditivos pro-oxidantes 26 5.3.4.3 Aditivos comerciales 29 5.3.4.4 Biosurfactantes vinculados en la biodegradación

del LDPE 33

5.3.4.5 Sustitutos biodegradables del LDPE 34

5.3.4.5.1 Los polihidroxi alcanoatos PHA 34 5.3.4.5.2 Almidón termoplástico 35 5.4 Técnicas y métodos utilizados en el estudio de la

biodegradación del LDPE 36

5.4.1 Técnicas instrumentales utilizadas para estudiar la biodegradación del LDPE

38

5.4.1.1 Técnicas espectrofotométricas, microscópicas y espectrométricas para el estudio de la degradación del LDPE

40

VII

5.4.1.1.1 Microscopia electrónica de barrido SEM 41 5.4.1.1.2 Microscopia de fuerza atómica 41 5.4.1.1.3

Espectroscopia UV – visible 41

5.4.1.1.4 Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)

42

5.4.1.1.5

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear NMR

42

5.4.1.1.6 Desorción láser asistida por la matriz con detección de masas por tiempo de vuelo MALDI-TOF MS

42

5.4.1.1.7 Espectrometría de plasma inductivamente acoplada a Emisión Óptica ICP-OES

43

5.4.1.1.8

Espectroscopia de difracción de rayos x (XRD) 44

5.4.1.1.9 Espectrometría fluorescencia de rayos x (XRF) 44 5.4.1.1.10 Espectroscopia de resonancia paramagnética

electrónica EPR 44

5.4.1.1.11 La espectroscopia de absorción atómica (AAS) 45 5.4.1.2 Técnicas cromatográficas para el estudio de la

degradación del polietileno de baja densidad LDPE 45

5.4.1.2.1 Cromatografía de gases acoplado a masas GCMS 45 5.4.1.2.2 Cromatografía de líquidos de alta eficiencia HPLC 46 5.4.1.2.3 Cromatografía de exclusión por tamaño o de

permeación en gel 46

5.4.1.3 Técnicas de análisis de sus propiedades mecánicas: Pruebas de tensión tensile test

47

5.4.1.3.1 Resistencia a la tensión 47 5.4.1.3.2 Módulo de tensión y la elongación hasta la ruptura 47 5.4.1.4 Técnicas de análisis térmico 47 5.4.1.4.1 Calorimetría diferencial de barrido DSC 48 5.4.1.4.2 Análisis térmico mecánico y dinámico DMTA 48 5.4.1.4.2.1 Análisis termo gravimétrico TGA 49 5.4.2 Métodos y pruebas utilizados en los estudios de

biodegradación del polietileno de baja densidad LDPE

49

5.4.2.1

Métodos principales de cultivo de microorganismos degradadores de LDPE

52

5.4.2.2 Medios para la realización de las pruebas 53 5.4.2.2.1 Pruebas de campo (In situ o in vivo) con medios

naturales 53

5.4.2.2.2 Pruebas de simulación con medios seminaturales 53 5.4.2.2.3 Pruebas de laboratorio (In vitro) 53 5.4.2.3 Los inóculos 53 5.4.2.3.1 Cultivos con inóculos amplios o de consorcios 53 5.4.2.3.2 Cultivos microbianos axénicos 53

VIII

5.4.2.3.3 Medios líquidos 53 5.4.2.3.4 Medios sólidos 54

5.4.2.4 Pretratamientos del LDPE 54 5.4.2.4.1 Aclimatación natural 55 5.4.2.4.2 Aclimatación artificial / pruebas de laboratorio 55 5.4.2.4.2.1 Ruptura por hidrólisis 55 5.4.2.4.2.2 Oxidación térmica 55 5.4.2.4.2.3 Procedimiento de foto degradación 55 5.4.2.4.2.4 Procedimiento de termo degradación 55

5.4.2.5 Pruebas de biodegradación 55

5.4.2.5.1 Prueba de enterramiento en suelo 55

5.4.2.5.2 Prueba de compostaje 56

5.4.2.5.3 Prueba de biodegradación en cajas Petri 56

5.4.2.5.3.1 Formación de zonas claras 56

5.4.2.5.4 Prueba de platos con hongos 56

5.4.2.5.4.1 Método de inoculación 56

5.4.2.5.5 Prueba de biodegradación In-vitro 57

5.4.2.5.5.1 Prueba de cultivo líquido 57

5.4.2.5.5.2 Prueba de toxicidad 57

5.4.2.5.6 Pruebas de hidrofobicidad 57

5.4.2.5.6.1 La prueba BATH (Bacterial Adhesion to Hidrocarbons)

57

5.4.2.5.6.2 Prueba de salado SOT (por sus siglas en inglés: salting out test)

58

5.4.2.5.6.3 Estudios de absorción de agua 58

5.4.2.5.6.1 Prueba del ángulo de contacto con agua 58

5.4.2.5.7 Pruebas de enzimas 58

5.4.2.5.8 Pruebas de evolución de gas (CO2 or CH4) 58

5.4.2.5.8.1 La prueba Sturm 59

5.4.2.5.8.2 Radiomarcación 59

5.4.2.5.8.3 Prueba de respiración 59

5.4.2.5.9 Prueba de la pérdida de masa 59

5.4.2.5.9.1 Porcentajes de degradación del LDPE reportados por algunos estudios

60

5.4.2.5.10 Pruebas físicas de la biodegradación 61

5.4.2.5.10.1

Índice de fluidez 61

5.4.2.6 Pruebas de identificación microbiana 62

IX

5.4.2.6.1 Viabilidad del biofilm microbiano 62

5.4.2.6.2 Pruebas de caracterización preliminar 62

5.4.2.6.3 Pruebas de identificación especifica 62

5.4.2.7 Productos de la biodegradación 62

5.5 Metodología propuesta 63

5.5.1 Test de viabilidad cuenta de microorganismos viables por dilución en placa

64

5.5.1.1 Obtención de muestra y selección de los microorganismos degradadores de LDPE en medio líquido SM

65

5.5.1.2 Identificación preliminar 65

5.5.1.3 Pruebas preliminares de identificación de hongos 66

5.5.1.4 Ensayo de biodegradación in vitro 67

5.5.2 Prueba de pérdida de masa 67 5.5.3 Identificación específica 67

5.5.3.1 Técnica polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)

69

5.5.4 Pruebas instrumentales 69

5.5.4.1 Aplicación del FTIR al estudio de la biodegradación del LDPE

69

5.5.4.1.1 Variantes de la técnica 69

5.5.4.1.1.1 La espectroscopia FT-IR ATR 69

5.5.4.1.1.2 FT-IR reflectancia difusa (DRIFT) 70

5.5.4.1.2

Índices de cuantificación de la oxidación 70

5.5.4.1.2.1 Índice de carbonilo (CI) 70 5.5.4.1.2.2 Índice vinilo (𝐼V) 70

5.5.4.1.2.3 Porcentaje (%) de cristalinidad del LDPE 70

5.5.4.2

Cromatografía de gases acoplada a espectroscopia de masas GCMS

71

5.5.4.2.1 Cuantificación de la producción de CO2 71

6 ANÁLISIS 72

7. CONCLUSIONES 77

8. RECOMENDACIONES 78

9. BIBLIOGRAFÍA 79

X

LISTA DE TABLAS No Pág.

Tabla 1 Microorganismos biodegradadores de LDPE 18 Tabla 2 Enzimas involucradas en la biodegradación del

polietileno 22

Tabla 3 Clasificación esquemática de los diferentes medios ambientes en que ocurre la biodegradación del LDPE

24

Tabla 4 Estudio sobre la biodegradación del LDPE con prooxidantes

26

Tabla 5 Aditivos del polietileno de baja densidad (LDPE) 26

Tabla 6 Algunos aditivos comerciales reportados 29

Tabla 7 Susceptibilidad del polietileno modificado con bionolle

32

Tabla 8 Biosurfactantes producidos por distintos microorganismos

33

Tabla 9 Sustitutos del Polietileno de baja densidad (LDPE) 35

Tabla 10 Técnicas utilizadas para estudiar la degradación del Polietileno de baja densidad (LDPE)

38

Tabla 11 Principales técnicas de análisis térmico 48

Tabla 12. Test y métodos de cultivo usados para evaluar la biodegradación del LDPE

49

Tabla 13 Revisión de los métodos para el estudio de la degradación del LDPE

54

Tabla 14 Posibles residuos de la biodegradación 62

Tabla 15 Resultados en cifras de los elementos estudiados 73

Tabla 16 Reactivos requeridos con sus respectvas concentraciones

105

Tabla 17 Listado de sustancias para los medios y pruebas 111

Tabla 18 Procedimientos sugeridos para la siembra 114

Tabla 19 Relación entre género y resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas

115

Tabla 20 Algunas características preliminares bacterianas 116

Tabla 21 Algunas características preliminares bacterianas 117

Tabla 22 Técnicas de muestreo para espectrometría FT-IR para el análisis del LDPE

119

Tabla 23 Condiciones óptimas de corrida cromatográfica 120

XI

LISTA DE FIGURAS Pag.

Figura 1 a Polietileno lineal de baja densidad (LLDPE) 9

Figura 1 b Polietileno de baja densidad (LDPE) 9

Figura 1 c Polietileno de alta densidad HDPE 9

Figura 2 Factores que afectan la biodegradación del LDPE 13

Figura 3 Rutas hipotéticas de transformación del polietileno hasta su total mineralización

14

Figura 4. Biodegradación del PE por β -oxidación 14

Figura 5 Iniciadores de la oxidación del PE 15

Figura 6 Mecanismo de ruptura hemolítica o fotólisis 16

Figura 7 Iniciación a partir de un agente metálico 16

Figura 8 Propagación de la foto oxidación 17

Figura 9 a Mecanismos de oxidación siguiendo las reacciones Norrish tipo 1 y 2

17

Figura 9 b Oxidación para la formación de ácidos grasos o esteres

17

Figura 10 Técnicas y métodos disponibles para el estudio de la degradación del LDPE

37

Figura 11 Esquema metodológico básico propuesto 64

Figura 12 Métodos preliminares de identificación metabólica 66

Figura 13 Metodología a realizar para la identificacion específica 68

Figura 14 Procedimiento para el aislamiento de los microorganismos biodegradadores de LDPE

100

Figura 15 Procedimiento para el cultivo, el aislamiento y la identificación de los microorganismos degradadores de LDPE

101

XII

Figura 16 Procedimiento para aislar los microorganismos degradadores de LDPE y su posterior propagación para realizar la extracción del DNA

102

Figura 17 Ensayo de biodegradación in vitro 103

Figura 18 Método propuesto es el registrado por Mahaku 104

Figura 19 Método tomado para extraer ADN es la registrada por El centro internacional de agricultura tropical-CIAT

105

Figura 20 Cuantificación del DNA microbiano 105

Figura 21 Propuesta metodológica para realizar la técnica RFLP 106

Figura 22 Identificación bacteriana utilizando, prueba de agar LIA, Kligler, tioglicolato y triptófano

107

Figura 23 Pruebas de identificación microbiana, pruebas de almidon, TCI, catalasa oxidasa

108

Figura 24 Pruebas de descarboxilación de lisina ornitina, fenilalanina deaminasa

109

Figura 25 Pruebas RM VP, OF y fermentación de glucosa 110

Figura 26 Medidas a tener en cuenta para la preparación de la muestra cuenta una muestra blanco, de PE no tratado en las pruebas, y un control negativo

118

Figura 27 Método propuesto para analizar el PE degradado 119

Figura 28 Metodología para el análisis de la evolución de CO2 usando GCMS

121

Figura 29 Cromatograma donde se muestran los gases que pueden ser cuantificados por CG-DCT

120

Figura 30 Metodología para el análisis de metabolitos usando GCMS

121

XIII

LISTA DE GRÁFICAS Pág.

Gráfica 1. A Variación de la producción de mundial de plásticos desde 1950 hasta 2010

4

Gráfica 1. B Variación de la producción de mundial de plásticos desde 1950 hasta 2013

4

Gráfica 2. Proporción de géneros reportados que se encuentran vinculados con la biodegradación de (LDPE)

75

Gráfica 3. Técnicas más utilizadas para estudiar la biodegradación del LDPE

76

XIV

LISTA DE ANEXOS

Pág.

ANEXO A1. Aislamiento y cuenta de los microorganismos biodegradadores de LDPE

100

ANEXO A2. Cultivo de microorganismos biodegradadores de LDPE

101

ANEXO B. Purificación de microorganismos biodegradadores de LDPE

102

ANEXO C Prueba de biodegradación de LDPE 103

ANEXO D Extracción de DNA de hongos 104

ANEXO E. Extracción de DNA de bacterias 105

ANEXO F. Discriminación entre grupos microbianos utilizando RFLP

106

ANEXO G1. Pruebas de identificación bacteriana 107




ANEXO H Listado de sustancias para los medios y pruebas 111

ANEXO I Procedimiento sugeridos para la siembra 114

ANEXO J1 Tabla de características preliminares bacteriana 115

ANEXO J2 Características preliminares bacterianas 116

ANEXO J3 Características preliminares bacterianas 117

ANEXO K1 Procedimiento para el análisis del polietileno usando FTIR

118

ANEXO K2 Procedimiento para el análisis del polietileno usando FTIR

119

ANEXO L1 Cuantificación de la producción de CO2 e identificación de metabolitos

120

ANEXO L2 Cuantificación de la producción de CO2 e identificación de metabolitos

121

XV

ABREVIATURAS AFM: Microscopio de fuerza atómica. (del inglés Atomic Force

Microscopy) CI: Carbonyl Index CL: Chimio Luminicence DSC: Diferential Scaning Calorimetry EA: Elemental Analizer ESR: Electron spectroscopy resonance FTIR-ATR: free time infrared Attenued total refractance FTIR: Free time infrared GCMS: Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry HPLC: High Phase Liquid Cromatography HDPE: High density polyethylene IV: Vinyl Index ICP-OES: inductively coupled plasma-optical emission

spectroscopy LDPE: low density polyethylene LLDPE: Linear low density polyethylene MALDI-TOF: Matrix assisted Laser Desorption time of flight NMR: Nuclear Magnetic Resonance OM: Optical microscopy PBS: Polybutylene succinate PBSA: Poly Butylen Succinate Adipate PCL: Polycaprolactone PC: Polycarbonate PCR: Polymerase Chain Reaction PE: Polyethylene PES: Polyethylene Succinate PET: Poly ethylene tereftalate PHB: Polihidroxibutirato PHBV: Poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato PMMA: Poly methyl metacrilate PP: Polypropylene PS: Polyestyrene PVC: Polyvinylchloride RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphisms SEC: size exclusion chromatography SEM: Scanning electron microscopy TGA: Thermogravimetric analysis TLC: Thin lawyer chromatography UVS: Ultraviolet Spectroscopy

XRD: X-Ray Difraction

XVI

GLOSARIO

BIODEGRADACIÓN: es un proceso gradual de descomposición o acumulación causado por seres vivos, los cuales llevan a un cambio químico y estructural de las sustancias o materiales orgánicos e inorgánicos contaminantes. BIOCOMPATIBILIDAD: En 1987, la sociedad europea de biomateriales definió la biocompatibilidad como la habilidad de un material de actuar con una adecuada respuesta al huésped en una aplicación específica. BIOFILM: Es una formación celular junto a los productos metabólicos de tales células que crecen en la superficie de un material o sustancia. BIOREMEDIACIÓN: Es un tipo de biotecnología denominada biotecnología verde caracterizada por el uso de seres vivos o sus productos metabólicos para el control de contaminantes. BIOSURFACTANTES: son un grupo heterogéneo de metabolitos secundarios, producidos por seres vivos, principalmente por hongos y bacterias. Estas moléculas tienen propiedades emulsificantes y dispersantes, disminuyen la tensión superficial del agua de 72 a 25 mN/m aproximadamente. BIOTECNOLOGÍA: La biotecnología se define como: "Cualquier aplicación técnica que usa sistemas biológicos, organismos vivos o sus derivados, para fabricar o modificar productos o procesos para un uso específico” [1]. La biotecnología ha existido desde que la raza humana utilizó por primera vez la fermentación para hacer pan, queso y vino [1]. POLÍMERO BIODEGRADABLE: no especifica el tiempo y las condiciones bajo las cuales el polímero se degrada, solo indica que es degradable. CLONACIÓN: obtención de una población homogénea de células por el aislamiento de colonias individuales repetidas. De esto también se obtienen en forma pura cualquier número moléculas de DNA recombinante portadas por tal célula, el término es también usado en este contexto (frecuentemente como clonación de genes) y por una mayor extensión (con menor justificación) para las reacciones usadas en estas construcciones de tales recombinantes [2]. CROMÓFOROS: son los grupos funcionales que absorben ciertas longitudes de onda del espectro visible y refleja otras. COMPOSTABLE: material que se degrada en condiciones de compost, y cuyo nivel de biodegradación debe ser de al menos un 90% y debe ser logrado en menos de seis meses de acuerdo a la European standard on compostable packaging materials, EN13432. ENLACE COVALENTE: es una unión de dos o más átomos de elementos distintos, que se caracteriza por que los electrones externos de enlace son compartidos de forma simétrica.

XVII

FOTOLISIS: ruptura de un enlace mediante la energía transferida por fotones (luz) altamente energética, ejemplo UV. FUENTE DE CARBONO: es el material o sustancia que provee a los microorganismos de carbono, ejemplo: el polietileno. METABOLITO: producto bioquímico generado en el metabolismo celular. MINERALIZACIÓN: acción natural de transformación de compuestos químicamente complejos a otros de poca o ninguna complejidad. MONÓMERO: una estructura mínima o básica que se puede unir para formar una cadena o macro estructura. OLEFINA: compuestos químicos a base de carbono y que poseen enlaces dobles. POLÍMERO: es una macromolécula o aglomeración de muchos monómeros los cuales están unidos por enlace covalente. PROOXIDANTES: sustancias químicas que en virtud de su naturaleza química generan reacciones de oxidación. RADICALES LIBRES: son especies que contienen electrones de valencia desapareados los cuales son bastante reactivos. RELAJACIÓN: procesos de pérdida de viscoelasticidad, son fenómenos cinéticos, también denominado dispersiones. Cuando un material polímero se desplaza de su equilibrio por efecto de solicitaciones externas, el sistema tiende a volver a su estado inicial al cesar éstas. TERMOPLÁSTICOS: son plásticos que son reformables o remoldeables cuando se les aplica una temperatura y presión. TRANSICIÓN VÍTREA: se define como la temperatura a la cual un polímero amorfo (o la región amorfa de un polímero parcialmente cristalino) cambia de una situación de ser duro y relativamente quebradizo a una condición viscosa y gomosa. VISCOELASTICIDAD: cuando los materiales poliméricos disipan (calentándose o deformándose) una parte de la energía con que se les excita. XENOBIÓTICO: sustancia de origen antropogénico y que puede afectar negativamente a los seres vivos.

1

1. RESUMEN

El uso irracional y la resistencia a la degradación ambiental son las causas de que el polietileno de baja densidad (LDPE del ingles low density polyethylene) se acumule, lo que genera un grave problema medioambiental [3], debido a esto se han hecho investigaciones en la búsqueda de soluciones al problema, siendo las más importantes el sustituir completamente el LDPE o acelerar su proceso de biodegradación. El presente trabajo es un estudio bibliográfico en el cual se recopilan, comparan y organizan amplia y sistemáticamente los aspectos más relevantes reportados sobre la biodegradación del polietileno de baja densidad (LDPE) en los cuales están incluidos: los microorganismos capaces de utilizarlo como fuente de carbono; las enzimas utilizadas y la comparación de sus eficiencias a partir de la pérdida de masa, considerando las condiciones en las que se realizaron dichas pruebas; todas las técnicas de análisis disponibles, los aditivos o sustitutos existentes; Finalmente se propone una estrategia metodológica de identificación de los microorganismos y cuantificación de la biodegradación que sea adecuada para su implementación local. Palabras clave: Polietileno de baja densidad, biodegradación, microorganismos, pruebas espectroscópicas y microscópicas. ABSTRACT Irrational use and resistance to environmental degradation are the causes of Low Density Polyethylene (LDPE) accumulating, which generates a serious environmental problem [3], due to this research has been done in the search for solutions to the problem, the most important being to completely replace the LDPE or accelerate its biodegradation process. The present work is a bibliographical study in which the most relevant aspects reported on the biodegradation of low density polyethylene (LDPE) are collected, compared and organized in a broad and systematic way, including: microorganisms capable of being used as a source of carbon ; The enzymes used and the comparison of their efficiencies from the loss of mass, considering the conditions under which the tests were performed; All available analytical techniques, existing additives or substitutes; Finally, a methodological strategy for the identification of microorganisms and the quantification of biodegradation that is adequate for their local implementation is proposed. Keywords: Low density polyethylene, biodegradation, microorganisms, spectroscopic and microscopic proofs.

2

2 INTRODUCCIÓN

Globalmente se desechan 57 millones de toneladas anuales de polietileno de baja densidad LDPE, (por lo menos para el año 2005) [4]. Tan solo en Bogotá se desecha un estimado de 428 toneladas anuales, y este material puede tardar entre 100 y 1000 años para degradarse, por lo que su acumulación genera graves problemas [5]. Como forma de afrontar este desafío los investigadores han tomado dos enfoques principales: la búsqueda de posibles sustitutos o aditivos y el desarrollo de tecnologías y/o biotecnologías que permitan la biodegradación acelerada del polímero. Como posibles sustitutos se encuentran los biopolímeros alternativos como el polihidroxibutirato (PHB), sin embargo aún poseen altos costos de producción que los hacen poco competitivos [6, 7], actualmente, los esfuerzos se dirigen a la búsqueda de sustratos de menor costo [6, 7]. Otro biopolímero muy utilizado es el almidón, debido a que es altamente biodegradable, no obstante también tiene limitaciones como su baja resistencia a la humedad, baja procesabilidad e incompatibilidad con algunos polímeros hidrofóbicos [8]. Entre las tecnologías desarrolladas se encuentra la pirólisis pero es muy cara y consume mucha energía y la incorporación de aditivos estimulantes del proceso de biodegradación al LDPE, como ejemplos están el almidón, la celulosa, los prooxidantes y surfactantes los cuales contrarrestan su inercia y resistencia al ataque microbiano [9, 10, 11] sus inconvenientes esta en que aumentan los costos y generan residuos potencialmente contaminantes, a diferencia de las antes mencionadas la biotecnología es una alternativa popular por sus bajos costos y su relativo bajo impacto ambiental, su único inconveniente es el largo tiempo que aún se toma en degradar el LDPE. Los investigadores que han estudiado la biodegradación del LDPE en todas sus etapas y condiciones, se han apoyado en técnicas físico-químicas e instrumentales, tales como: propiedades mecánicas, microscopia de fluorescencia, espectroscopia infrarroja (FTIR), o cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GCMS), entre muchas otras, ya sea para identificar los microorganismos degradadores y sus enzimas, los productos intermedios o finales y la velocidad de la biodegradación.

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Realizar una revisión bibliográfica sobre la biodegradación del polietileno,

en el cual se analicen las técnicas actuales en el estudio de la biodegradación del polietileno de baja densidad, además de aquellos microorganismos que naturalmente lo degradan, y a partir de los resultados proponer una metodología viable, que permita identificar los microorganismos biodegradadores del LDPE y su eficiencia.

3

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar una revisión bibliográfica sobre los estudios de la

biodegradación del LDPE. Aportar una propuesta metodológica que permita identificar los

microorganismos que degradan el LDPE, aislados en los rellenos sanitarios y humedales ubicados en la sabana de Bogotá, incluyendo su posible eficiencia degradadora, que sea viable, rápida y eficiente teniendo en cuenta las condiciones de los centros de estudio de Colombia.

4 ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN

4.1 DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

En el mundo la producción de plásticos para el año 2014 alcanzó la cifra de 311 millones de toneladas, entre estos los polímeros más utilizados están el: polietileno (PE), polipropileno (PP), poli cloruro de vinilo (PVC), polietileno-tereftalato (PET), poli estireno (PS), policarbonato (PC), y poli metil metacrilato (PMMA) (Plexiglás) [12]. (Ver Grafica 1) Estos siete polímeros componen cerca del 98% de todos los polímeros y plásticos encontrados en la vida diaria [12], de los cuales el 39,5% se utiliza en empaques desechables [13, 14]. De la producción total, el polietileno y el polipropileno componen el 48%. [15]. Y de acuerdo estimaciones son desechadas aproximadamente 57 millones de toneladas anuales de polietileno [16, 17]. El polietileno (PE) al igual que todos los demás plásticos posee una vida de alrededor de 1000 años y debido a que su velocidad de degradación o porcentaje de reciclaje es mucho menor que su producción y eventual desecho se genera su acumulación en ríos, mares y suelos, amenazando la diversidad biológica global, ya gravemente afectada. Para conocer los efectos de su acumulación (ver problema Ambiental causado por el polietileno PE no reciclado). América latina produjo en el 2014 el 5 % de la producción total [14], siendo el polietileno el de mayor demanda con un 37%, y el 9% corresponde al LDPE [5], gran parte será desechado y terminara en los ecosistemas naturales, y considerando que América Latina cuenta con el mayor número de países más ricos en biodiversidad [18], se puede entender la magnitud del problema. En Colombia el 14% de todos los residuos que se arrojan corresponde a desechos plásticos [19]. El polietileno de baja densidad al ser un xenobiótico representa una amenaza para los ecosistemas colombianos los cuales poseen el segundo lugar en biodiversidad con 56.343 especies [20], por lo que es crucial que se tomen medidas pertinentes para que esta no se vea afectada. En Bogotá en el 2005 la unidad ejecutiva de servicios públicos-UESP (actualmente unidad administrativa especial de servicios públicos-UAESP) juntó a la universidad de los Andes estimó que para ese año llegaron 950 toneladas de materias primas reutilizables MPR, de los cuales el 45% (428) correspondían a residuos

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plásticos, de éstos la mayor cantidad correspondía al polietileno de alta densidad HDPE (por sus siglas en ingles High density polyethylene) [5, 21] y para el año 2011 entre los residuos sólidos residenciales el polietileno correspondía al 62% [5].

Gráfica 1 a Variación de la producción de mundial de plásticos desde 1950 hasta 2010, tomada de [22]; 1. b Variación de la producción de mundial de plásticos desde 1950 hasta 2013. Basada en los datos de PlasticsEurope del 2010 y 2013 [23, 14].

4.2 Reseña histórica

Durante 60 años, desde la primera mitad del siglo XX el crecimiento de la producción ha sido exponencial como lo muestran las Gráficas 1a y 1b. Actualmente presenta un crecimiento anual del 1,5% de acuerdo a Plastic Europe [14]. Comúnmente se había pensado que los plásticos no eran tóxicos para el medio ambiente y no se consideraban xenobióticos, por lo que no se hacían estudios o campañas para su minimización y control, se desmintió en estudios hechos en la década de los setenta, en los que se demostró la presencia de partículas pequeñas de plástico en la superficie del mar Sargasso en 1971, que causaban la muerte a muchos seres vivos que las ingerían [24, 25], en los ochentas y noventas se había demostrado concluyentemente que los plásticos estaban muy lejos de ser inofensivos. Los primeros estudios sobre la biodegradación del polietileno se remontan al año 1980 por los investigadores AC Albertsson [9] y ZG banhidi, los cuales muestran la realización de estudios sobre la producción de 14CO2 por los hongos Fusarium rodolens. Acremonium kiliense, Aspergillus versicolor y Verticillium lecanii que eran alimentados con láminas de polietileno de alta densidad HDPE marcadas con 14C, con lo cual confirmaban que el plástico era la fuente de carbono. Posteriormente en 1991 se encontró que las especies Streptomyces badius 252, Streptomyces, setonii 75Vi2, y viridosporus de Streptomyces T7A producían una enzima extracelular degradadora de

5

polietileno puro o con aditivos, como almidón, pro oxidantes, también se descubrió que eran enzimas degradadoras de lignocelulosa [26] [27]. En 1998 Iiyoshi y colaboradores [28] demuestran la biodegradación del PE por los enzimas lignina peroxidasa, manganeso peroxidasa y la fenol oxidasa o lacasa, basados en varios estudios hechos sobre biodegradación de lignina entre los cuales se podrían nombrar los hechos por Kirk TK, Farrell RL en 1987 [29]. Los bioplásticos no son nada nuevo, los primeros producidos datan de 1845, cuando se produjo por primera vez el ácido poli láctico (PLA), un poliéster termoplástico, hecho a partir de la fermentación de productos agrícolas como almidón de maíz, La Dow químicos revivió la producción de PLA en 1950, pero los altos costos de producción detuvieron su uso masificado [30]. En 1980, la British chemical industries (ICI) desarrolló Biopol, un bioplástico a partir de los polímeros poli hidroxialcanoatos PHA que son producidos por muchas especies de bacterias a partir de azucares de plantas o aceites, pero una vez más, la ICI fue incapaz de producir biopol de forma económica como para competir con plásticos convencionales [30]. Monsanto compró Biopol a ICI en 1996 [30]. En 1998. Monsanto descontinuo la operación de producción de bioplasticos debido a los altos costos y las limitadas oportunidades comerciales [30]. Monsanto vendió sus acciones a la U.S. bioscience company, Metabolix que inició investigaciones y desarrollo de procesos de manufactura de plásticos a base de PHB a bajos costos [30]. En el 2006, metabolix se unió a la gigante agricultora Archer Daniels Midland para comercializar un bioplásticos denominado Mirel compañía que lidera la producción y venta de bioplásticos para productos de uso diario, tanto de larga vida como desechables [30], claro está, a precios más caros que los producidos con plásticos a partir de materias petroquímicas. Por otro lado otros autores afirman que los siguientes PHA el Poli (butileno Succinato) (PBS), poli (etileno Succinato) (PESu), o el copolímero poli (butileno Succinato -co-butilen adipato (PBSA), son miembros de un grupo denominado comercialmente como ‘Bionolle’ inventados por Showa Denko (Japón) in 1990. [31, 32, 33, 34, 35, 36]. Durante el presente siglo veintiuno, ha habido toda una explosión de investigaciones en torno a éste tipo de materiales, de los cuales se ha basado parte de esta investigación.

4.3 Alternativas para el control del LDPE

4.3.1 Enterramiento en rellenos sanitarios del LDPE

El enterramiento tiene asociadas sus propias limitaciones, como que la tierra permanece inutilizable por un largo periodo de tiempo, de no ser por eso la tierra se podía utilizar para la agricultura y otras actividades relacionadas [37]. La tasa de degradación del polietileno es muy lenta en los rellenos, debido a que es un ambiente anaerobio, siendo degradado en alrededor de 500 años [38, 39].

4.3.2 La incineración del LDPE

Es común en países en desarrollo, hacer esto libera gases como: CO, CO2, PAHs, CCl4, dioxinas y furanos, etc. causantes de enfermedades como el

6

cáncer de pulmón, ataques cardiacos y desordenes respiratorios como el asma. [40, 41, 42], Los productos finales de la incineración son cenizas y gases. Se estima que la huella de carbono del LDPE o polietileno es cercana a 6 kg CO2 por kg de plástico [43].

4.3.3 La pirólisis del LDPE

Una forma de eliminación de los residuos plásticos es a través de la pirolisis, muchos investigadores han estudiado la pirolisis del polietileno [44, 45]. La pirólisis con plasma es un método efectivo para destruir el polietileno de una manera ambientalmente amigable. El método usa una antorcha de plasma en un ambiente carente de oxígeno. El método tiene lugar a muy altas temperaturas (usualmente entre 325°C - 850°C). Las variaciones en temperatura durante la pirólisis causan la producción diferentes gases. Por lo tanto, a baja temperatura, usualmente los gases que se producen son: dióxido carbono, etileno, propileno, monóxido de carbono, butadieno y metano, mientras que, a altas temperaturas se producen adicionalmente: dióxido de carbono, monóxido de carbono y etileno, benceno, metano e hidrógeno [38, 46]. Sus inconvenientes son los altos costos por el elevado consumo energético y las tecnologías.

4.3.4 Políticas de reciclaje

El reciclaje como hábito, debe ser parte de las buenas costumbres de toda

nación, desafortunadamente se estima que solo el 1% del plástico desechado a

nivel mundial se recicla [14], aunque existen ejemplos alentadores de que si es

posible su máxima recuperación mediante el reciclaje, por ejemplo en el 2012

en el continente europeo la recuperación de energía alcanzó el 62% a través

del reciclaje, siendo uno de los mejores índices de reciclaje [14].

En la actualidad el reciclaje disminuye los impactos negativos y la demanda de

materias primas vírgenes. Aunque cabe mencionar que existen múltiples

restricciones, por lo que no es una solución íntegra para la problemática

ambiental y entre estos inconvenientes están:

Los termoplásticos pueden no ser reciclados si están tan contaminados que es más costoso limpiarlos que botarlos [5].

Los plásticos pierden sus buenas cualidades a medida que son reciclados, debido a las reacciones químicas, por lo que en la práctica el reciclaje se limita a unas cuantas veces.

El reciclaje no deja mucha ganancia y a veces es nula, por lo que solo es viable cuando hay mucha ganancia de por medio.

La separación de los plásticos no es tan fácil, debido a que no todos los plásticos son iguales se requiere personal capacitado, lo cual no es barato [5].

7

4.4 Problema ambiental causado por el LDPE

Se ha informado la muerte de animales terrestres y acuáticos debido al consumo o atrapamiento en bolsas de polietileno [32]. El polietileno bloquea su tracto digestivo, también se sabe que los restos del polietileno no digerido después de la muerte de los animales son de nuevo ingeridos por algún otro animal lo que le ocasiona la muerte, y el ciclo continúa [47]. El polietileno no digerido es responsable de varios problemas en animales entre los que se podría mencionar:

Dificulta el proceso digestivo, el proceso de fermentación y el correcto mezclado de los alimentos en el estómago [47].

El polietileno ingerido bloquea la apertura entre el omaso y retículo que llevan a la muerte del animal si el polietileno no se retira [47].

La impacción: debido a la acumulación de una gran cantidad de rumen las bolsas de polietileno conducen a una ruminotomía [47].

El timpanismo: debido al bloqueo del retículo y omaso con el polietileno, la acumulación de gases del rumen llevan a la muerte del animal si no se quita apropiadamente [47].

La inmunosupresión: la acumulación de polietileno en el estómago de los animales (la vaca) lleva a una sensibilidad aumentada a las infecciones como el septicemia hemorrágica [47].

Debido a la polución “blanca” en el medio ambiente marino, mínimo 267 especies están siendo afectadas en las que se incluyen todos los mamíferos, tortugas marinas (86%) y aves marinas [48]. Quizá como material no sea químicamente tóxico, pero en los productos plásticos pueden existir monómeros residuales no unidos químicamente, agentes polimerizántes, productos de degradación, los cuales se podrían filtrar en los alimentos, podrían ser los ftalatos que son plastificantes usados para hacer a los plásticos suaves y flexibles como por ejemplo el bisfenol A, el Di-2-Etil Hexil ftalato (DEHP), di-n-butil ftalato (DBP)y el butil bencil ftalato (BBP), los cuales están asociados a anormalidades reproductivas, tal como un bajo conteo de esperma, cambios hormonales, engrandecimiento de las glándulas de la próstata, anormalidades en el número de cromosomas en los óvulos y cambios precancerosos en el seno y la próstata, obesidad y resistencia a la insulina [49]. El enterramiento de las bolsas y láminas de polietileno en el suelo provoca fenómenos como la obstrucción del agua, provocando la pérdida de fertilidad y devastación del suelo para el cultivo agrícola [32, 11].

5 MARCO TEORICO

A continuación se presentarán brevemente los conceptos más importantes en

este estudio.

8

5.1 Polímeros

Son sustancias macromoleculares, lo que significa que tienen un alto peso

molecular y que se forman por la unión de unidades moleculares discretas

denominadas monómeros, las cuales están unidos entre sí mediante enlace

covalente.

5.1.1 Plásticos

Son polímeros sintéticos generalmente de naturaleza química hidrófoba, que

normalmente poseen una alta durabilidad y resistencia, suelen no tener un

punto de fusión fijo y poseen en determinado intervalo de temperaturas

características flexibles y moldeables. Se calcula que pueden tardar entre 100 y

1000 años para degradarse dependiendo del tipo de plástico [42, 40, 50]. La

american Society for testing materials (ASTM) define plástico como:

“Cualquier material de un extenso y variado grupo que contiene como elemento

esencial una sustancia orgánica de gran peso molecular, siendo sólida en su

estado final; ha tenido o puede haber tenido en alguna etapa de su manufactura

(fundido, cilindrado, prensado, estirado moldeado, etc.) diferentes formas de

fluidificación, junta o separada, de presión o calor”.

5.1.2 Poli olefinas

Las poli olefinas son polímeros saturados compuestos exclusivamente por

carbono e hidrogeno y tienen un amplio rango de aplicaciones. Son ejemplos el

polipropileno PP y el polietileno PE, cuya fórmula general es CnH2n donde “n”

es el número de átomos de carbono, estos son los más usados por la

versatilidad que presentan y además son producidos a partir de materias

primas petroquímicas baratas [29].

5.1.2.1.1 El polietileno (PE)

El polietileno es un termoplástico compuesto exclusivamente por carbono e

hidrogeno, cuya formula general es [CH2CH2CH2]n que es un tipo común de

plástico, debido a muchas de sus cualidades y propiedades [51]. Algunas de las

cuales son: cristalinidad 50 a 60%, temperatura de fusión entre el rango de 110-

115 °C. Aunque existen múltiples tipos de PE pueden ser clasificados por un

rango de densidad 0.910-0.940 [g/cm3] [52].

5.1.2.1.2 Clasificación del PE

El polietileno al igual que cualquier polímero no posee un único grado de

cristalinidad, e incluso una sola muestra puede poseer varios grados de

cristalinidad agregados, sin embargo el polietileno tradicionalmente y por

cuestiones mecánicas, de apariencia y practicidad se puede clasificar en tres

tipos básicos de acuerdo a su grado de polimerización:

9

5.1.2.1.2.1 Polietileno de baja densidad LDPE

Su estructura es muy ramificada (en cerca de 2% de los átomos de carbón)

[51]. Su peso molecular es de 100.000-300.000 [g/gmol] y su densidad es de

0,90-0,91 [gr/cm3] siendo el de menor densidad y esto se ve reflejado en sus

cualidades reológicas, se usa en la fabricación de bolsas desechables.

5.1.2.1.2.2 Polietileno lineal de baja densidad o (LLDPE)

El cual es una variante poco ramificada, se podría clasificar como de

cristalinidad intermedia, con un valor de 0,915 g/cm3 siendo relativamente

compacto.

5.1.2.1.2.3 Polietileno de alta densidad (HDPE)

Su estructura presenta el mayor grado de linealidad, su peso molecular es de

200.000-400.000, [g/gmol] y su densidad es de 0,94-0,97 0,91-0,94[gr/cm3],

debido a esto es un material muy rígido y fuerte siendo usado en la fabricación

de canecas plásticas.

4000

a)

b)

c)

1000

1000 Figura 1 estructuras del polietileno, a) polietileno lineal de baja densidad (LLDPE); b) polietileno de baja densidad (LDPE);c) pol ietileno de alta densidad HDPE.

10

5.1.2.1.2.4 Causas de la Inercia química del polietileno

De acuerdo a Arutchelvi [53], el polietileno pero también las poliolefinas en

general son materiales inertes no susceptibles a la biodegradación por las

siguientes razones:

Por los esqueletos hidrofóbos, que consisten en largas cadenas de carbono, los cuales poseen una gran resistencia frente a la hidrólisis.

En algunos casos por la adición de antioxidantes y estabilizantes durante su manufactura.

Alto peso molecular. Alta densidad de empacamiento. Su presencia reciente en el planeta es causa de que las enzimas de los

microorganismos no hayan evolucionado completamente para degradar el material sintético [54, 32]. Sin embargo la evolución en la especificidad de las oxidoreductasas secretadas por los microorganismos es relativamente rápida [55, 31].

5.2 Biopolímeros sustitutos del LDPE

Los biopolímeros son materiales totalmente degradables, que dependiendo de

su origen pueden ser denominados biopolímeros naturales o sintéticos.

5.2.1 Biopolímeros naturales

Los biopolímeros naturales son materiales macromoleculares sintetizados por

las plantas, los animales, los hongos o bacterias, los naturales son comúnmente

utilizados como fuente de energía o como andamiaje estructural, son

rápidamente degradados, entre estos están: los ácidos nucléicos, las proteínas,

la celulosa, los ácidos murámicos, la amilosa, la amilopectina y muchos más.

5.2.2 Biopolímeros sintéticos

Los biopolímeros sintéticos son materiales macromoleculares sintetizados por

el hombre, los biopolímeros antropogénicos tienen la cualidad de ser

biocompatibles y biodegradables.

11

5.2.3 Bioplásticos

Son materiales plásticos sintéticos, semisintéticos o naturales con

características similares a los plásticos tradicionales, pero con la ventaja de ser

degradables, pueden ser mezclas de polímeros sintéticos con naturales, o

pueden ser plásticos totalmente sintéticos, pero degradables, por ejemplo

están: el polietileno de baja densidad y el almidón termo plástico LDPE + TS

(del inglés: thermoplastic starch) o el poliácido glicólico (PGA) (del inglés poly

glycolic acid), el poliácido láctico PLA (del inglés poly lactic acid) y el

polihidroxibutirato PHB, los tres últimos mencionados son poliésteres y por lo

tanto son susceptibles a la hidrólisis de sus enlaces éster, de acuerdo a su

composición y velocidad de degradación pueden ser agrupados en dos grandes

clases [56].

5.2.3.1 Bioplásticos totalmente biodegradables

La sociedad americana para las pruebas y materiales (ASTM) (del inglés

American Society for Testing and Materials) y la organización internacional de

estándares (ISO) (del inglés International Standards Organization) define

plásticos degradables como:

“Aquellos que sufren un cambio significativo en la estructura química bajo

condiciones ambientales específicas. Estos cambios resultan en una pérdida de

propiedades físicas y mecánicas, medidos por métodos estándar. Los plásticos

biodegradables sufren degradación por la acción de microorganismos naturales

tales como bacterias, hongos, y algas” [12].

5.2.3.2 Bioplásticos biofragmentables

Los biopolímeros biofragmentables son mezclas de materiales, no son

completamente biodegradables, están compuestos de un componente

completamente degradable y un componente capaz de ser biodegradado,

ejemplo: polietileno y almidón, aunque estos tipos de mezclas de polímeros no

son completamente biodegradables, son efectivos para la reducción del

volumen de residuos de plásticos por fragmentación [57].

5.3 Biorremediación

Comprende la aplicación de agentes biológicos, principalmente microorganismos como catalizadores biológicos para degradar, desintoxicar o acumular productos químicos contaminantes.

5.3.1 Biodegradación de polietileno de baja densidad (LDPE)

El término “biodegradabilidad de polietileno” condujo a una confusión entre los científicos de polímeros y los microbiólogos, originados por el hecho de que

12

para los científicos de polímeros, la degradación significa la perdida de las propiedades físicas, mientras que para los microbiólogos es la completa mineralización del material [55]. De acuerdo a una nueva definición el término biodegradación incluye los factores bióticos y abióticos los cuales actúan sinérgicamente para descomponerlo en materia orgánica [31]. En un sentido estricto el LDPE se degrada por lo tanto es biodegradable, pero de acuerdo a Ohtake et al 1998 [58] una lámina de LDPE de 60µm se tarda completamente en degradar 300 años, y de acuerdo a muchas publicaciones esta estimación implica una tasa constante de biodegradación que es poco realista [31], por lo que se puede considerar prácticamente no biodegradable, sin embargo si se modifica su estructura, o se dan las condiciones óptimas, utilizando microorganismos aptos para su degradación es posible disminuir su tiempo de vida drásticamente. La biodegradación es un proceso complejo por lo que en su actual concepción esta dividida en dos etapas:

5.3.1.1 Biodeterioración

Es una etapa extracelular, caracterizada por la acción en conjunto de los

microorganismos y los factores abióticos que en conjunto dan como resultado

una fragmentación del LDPE en oligómeros y en el cambio químico del

polímero (oxidación) [31]. (Ver mecanismos de despolimerización.)

5.3.1.2 Asimilación

Posteriormente cuando estos oligómeros tienen el tamaño suficiente para ser

trasportados al citoplasma, los microorganismos los integran a las rutas

metabólicas donde son mineralizados [31].

5.3.2 Factores a tener en cuenta en la biodegradación del LDPE

Muchos microrganismos pueden degradar el LDPE, y para entender como lo

hacen hay que analizar: las enzimas liberadas, la hidrofobicidad, tanto de las

mismas enzimas como de las paredes celulares de las células microbianas y las

sustancias potenciadoras que liberan, como biosurfactantes, sin embargo

cuando se investiga la biodegradabilidad del LDPE, el efecto del ambiente no se

puede ignorar, para sobrevivir y prosperar se requieren que existan ciertas

condiciones o variables que afectan la actividad microbiana y por lo tanto la

biodegradación del LDPE, tales como: la disponibilidad de oxígeno, la cantidad

disponible de agua, la temperatura, el ambiente químico (pH, electrolitos, etc.)

[59], también hay que adicionar las características físicas químicas del LDPE, lo

cual se puede esquematizar en el siguiente mapa conceptual:

13

Figura 2 Factores que afectan la biodegradación del LDPE adaptada de [60, 61]

5.3.2.1 Ruta de la biodegradación del LDPE

Como tal no hay un solo mecanismo o una sola ruta, debido a que el proceso de la biodegradación es complejo y puede iniciarse de múltiples maneras, puede recorrer múltiples procesos o reacciones, de hecho en un principio la comunidad de investigadores estaba dividía por la condición en que debería estar el polímero para que pudieran actuar los microorganismos, algunos creían que era necesario la reducción del peso molecular y otros que atacaban sin importar el peso molecular [11, 62], posteriormente se comprobó que no es necesario bajos pesos moleculares para que inicien la degradación pero si lo facilita, además la mayoría de estudios lo hacen con cepas puras, lo cual es improbable que ocurra naturalmente [63], (como se puede ver en la tabla 1), son consorcios enteros los que participan en la biodegradación, y la biodiversidad de éstos varía de acuerdo al tipo de ambiente, por ejemplo: el suelo, mar, composta, lodo activado, etc. [64]. El mecanismo exacto es difícil de reconstruir, sin embargo se puede simplificar o esquematizar. La biodegradación del LDPE ocurre por dos mecanismos básicos: la hidro biodegradación y la oxobiodegradación [47], esos mecanismos dependen del

14

grado de oxidación del material y del tipo de aditivo adicionado, el cual puede ser almidón o pro oxidantes. Como resultado de los trabajos reportados se realizó un mecanismo de biodegradación hipotético el cual se muestra a

continuación.

Figura 4 Biodegradación del PE por β -oxidación Fuente [65]

Figura 3 Rutas hipotéticas de transformación del polietileno hasta su total mineralización basada en los artículos de [63, 45, 68].

15

5.3.2.2 Iniciadores y aceleradores del proceso de biodegradación, la

degradación abiótica

La mineralización del polietileno inicia con una degradación abiótica u oxidación (ver Figura 5 ), que es causada por el medio ambiente, principalmente por la luz y las condiciones del entorno, tales como el pH, la salinidad, la disponibilidad de oxígeno, el estrés físico, la humedad, la temperatura, etc [42]. Facilitando el posterior ataque microbiano, a continuación se mencionara brevemente los más importantes.

Figura 5 iniciadores de la oxidación del PE

5.3.2.2.1 Fotólisis El LDPE es un polímero de baja degradabilidad porque esta principalmente

compuesto de enlaces C–C and C–H (𝜎 enlaces) cuya energía de enlace es del orden de 300–600 kJ/mol [66]. El principio de degradación establece que la cantidad de energía absorbida por una molécula debe exceder la energía de enlace. La energía de la radiación UV-A no es suficiente para romper los enlaces químicos del LDPE y causar la degradación del polímero [66]. La radiación UV-B (320-280) es particularmente eficiente en causar foto daño al LDPE y polímeros sintéticos [66]. La radiación UV-C tiene energía suficiente para

romper los enlaces 𝜎, pero la que es emitida por el sol es absorbida por la atmosfera y no alcanza la Superficie de la tierra [67]. De acuerdo a Baljit Singh, Nisha Sharma, la radiación UV-B cercana de la luz solar (290nm) posee la energía suficiente para romper los enlaces C-C 375 kJ/mol y C-H 420 kJ/mol del LDPE los cuales son equivalentes a una radiación UV-B de 320nm y 290nm respectivamente, el proceso conduce a la formación de radicales libres [68]. (Ver Figura 6).

16

5.3.2.2.2 Oxidación térmica Al igual que en la fotólisis, la termo degradación produce radicales libres que atacan el polímero, pero en la oxidación térmica el ataque ocurre al azar y no en los extremos terminales tal como ocurre durante la fotólisis, por ello la termo degradación puede empezar tanto en el interior como en la superficie, haciendo que el proceso sea más rápido [68], debido a que el LDPE es un polímero de adición (por radicales libres), el mecanismo de despolimerización corresponde al inverso de la polimerización y ocurre rápidamente a temperaturas de 200°C o mayores.

5.3.2.2.3 Oxidación mecano química Los agentes oxidantes como el ozono, el oxígeno o con ácido nítrico atacan las cadenas generando radicales libres, comprobado por Yamada-Onodera [69], hay estudios que indican que cuando el material es sujeto a estrés mecánico como: rotura, molido, rasgado y estirado se generan radicales libres y para demostrarlo se utilizó la espectroscopia de espín electrónico [70, 68].

5.3.2.2.4 Mecanismos de despolimerización

5.3.2.2.4.1 Iniciación

La fotólisis o termólisis inicia el proceso de formación de radicales como se verá a continuación:

Figura 6 mecanismo de ruptura hemolítica o fotolisis imagen tomada de [68].

Las reacciones se facilitan con la adición de catalizadores como metales de transición, por ejemplo: el hierro (Fe), cobalto (Co), manganeso (Mn) y titanio (Ti) entre otros, muchos polietilenos comerciales contienen compuestos metálicos como impurezas, a continuación se muestra el mecanismo que ocurre. [68].

Figura 7 Iniciación a partir de un agente metálico, imagen tomada de [68].

17

Figura 9a. Mecanismos de oxidación, reacciones Norrish tipo 1 y 2, imagen basada de [68]; 6 b. Oxidación para la formación de ácidos grasos o esteres, adaptado de [96]

5.3.2.2.4.2 Propagación

El proceso se propaga cuando los radicales C* reaccionan con oxígeno formando el radical peróxido, el cual a su vez ataca cualquier compuesto que ofrezca electrones y posiblemente protones formándose un ácido o un éster en el proceso y un nuevo radical. (Como se muestra en la Figura 8).

Figura 8 Propagación de la foto oxidación. Adaptado de [68].

5.3.2.2.4.3 Terminación

Los grupos carbonilo actúan como cromóforos que permiten una iniciación de más radicales debido a que absorben en el UV cercano [68]. Posteriormente ocurre una ruptura de las cadenas por medio de las reacciones tipo Norrish 1 y 2 (Ver Figura 9a), finalmente terminan con la formación de fragmentos que contienen grupos funcionales como alquenos, alcoholes, esteres y ácidos carboxílicos, estos son utilizados por enzimas microbianas para su metabolización y final mineralización.

Actualmente muchos fabricantes de polietileno PE realizan un tratamiento posterior al proceso de fabricación induciendo la formación de alquenos y carbonilos en las cadenas para acelerar su degradación, replicando lo que ocurre cuando se expone al medio ambiente.

5.3.3 Microorganismos reportados que degradan el polietileno

Muchos microorganismos degradan el LDPE cuando las condiciones ambientales favorecen esta acción [51]. Se han publicado muchos estudios

18

sobre biodegradación del polietileno, a continuación se presenta una recopilación de todos los microorganismos reportados o/y utilizados en los estudios de biodegradación del LDPE: Tabla 1 microorganismos capaces de degradar el LDPE reportados en la literatura. Tabla adaptada de [19, 71, 53, 42, 29, 63]

Dominio Genero Especie Referencias

1 bacteria

Acinetobacter baumannii [72, 73, 74]

ursingii [75]

sp [76]

2 Bacteria Acanthopleurobacter

pedís [77]

3 Fungi Acremonium kiliense [78, 79]

4 Bacteria Achromobacter denitrificans [80]

5 Fungi Alternaria alternata [81, 82]

6 Bacteria Arthrobacter, sp [83, 84]

paraffineus [65, 85]

defluvii [86]

viscosus [72]

koreensis [32]

7 Fungi Aspergillus: versicolor [78, 40, 79, 87, 88]

brasiliensis [89]

sp [90, 87, 67, 91, 50, 92, 93, 51]

flavus [76, 11, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 40] [101, 89, 102]

fumigatus 0 [99, 103, 89]

glaucus [11, 104, 76, 105]

niger [76, 106, 11, 107, 104, 108, 95, 109, 110, 111] [112, 97, 99, 105, 100, 101, 89, 102, 31, 113] [91, 114, 115, 116, 33]

nidulance [76, 11, 50]

terreus [103, 101, 102, 31, 88, 41, 115]

cremeus [11]

candidus [11]

ornatus [89, 11]

japonicus [97, 101, 102]

awamori [72]

tamarii [101]

oryzae [117, 95, 94]

8 Fungi Aureobasidium pullulans [31, 115, 118]

9 Bacteria Bacillus sp [11, 93, 89, 16, 119]

aerius [77]

pumilus [120, 72, 84]

brevies [121]

cereus [122, 123, 84, 71, 124, 99, 125, 105, 77]

circulans [126, 121]

halodenitrificans

[120]

amyloliquefaiens

[72, 127, 128, 129, 130]

amylolyticus [86]

megaterium [122]

mycoides [72, 131, 132]

sphaericus [71]

licheniformis [133]

subtilis [122, 76, 107, 86, 99, 134, 132]

thuringiensis [72]

19

weihenstephanensis

[135]

10 Bacteria Bacterium te68R [77]

11 Bacteria Brevibacillus borstelensis [122, 126, 136]

parabrevis [73]

sp [137, 138]

12 Bacteria Burkholderia cepacia [135]

13 Fungi Candida sp [99]

14 Fungi Cephalosporium

sp [100]

15 Fungi Chaetomium

globosum, [124, 106]

sp [98]

16 Fungi Cladosporium cladosporioides

[47, 139, 96]

cladosporioides

[47, 96, 140]

17 Fungi Curvularia sp [141]

senegalensis [118]

lunata [82]

18 Bacteria Delftia acidovorans [142]

19 Bacteria Desulfotomaculum

nigrificans [48]

20 Bacteria Diplococcus sp [11, 89]

21 Bacteria Escherichia coli BL21 [32, 135, 134, 136]

22 Bacteria Enterobacter asburiae [119]

23 Bacteria Flavobacterium sp [142]

24 Fungi Fusarium sp [100, 97, 90, 99, 143, 91, 82]

solani [103, 118]

25 Fungi Geotrichum sp

26 Fungi Glioclodium virens [111, 72, 106]

27 Fungi Helminthosporium

sp [100]

28 Fungi Humicola sp. [144]

29 Fungi Hyalodendron sp [145]

30 Bacteria Listeria sp [16]

31 Bacteria Lysinibacillus. sp [92]

32 Bacteria Microbacterium paraoxydans [146]

MK3 (DQ31 8884),

[147]

sp [147, 77]

33 Bacteria Micrococcus luteus [76, 72]

sp [16, 11, 99]

lylae B-429 [72, 105]

34 Fungi Moraxella sp [11, 104, 89]

35 Fungi Mortierella alpina [96]

subtilissima [72]

36 Fungi Mucor ruxii [94]

sp. [97, 99, 102]

circinelloides [40]

37 Fungi Nigrospora sp [100]

38

Fungi Nocardia steroids GK 911

[47]

asteroides [47, 96, 139]

39 Fungi Paecilomyces variotti [112, 31, 148, 115]

40 Bacteria Paenibacillus macerans [72]

41 Fungi Penicillium sp [97, 67, 99, 76, 100, 93, 144]

simplicimus [69, 149, 82]

frequentans [131]

20

pinophilum [109, 111]

ochrochloron [31, 115]

funiculosum [112, 106, 31, 115, 33]

implicatum [100]

42 Fungi Phanerochaete chrysosporium

[150, 13, 151, 13, 111, 152, 105, 153, 154]

chrysosporium ME-446

[28]

43 Fungi Pleurotus ostretus IZU-15413 [155, 105]

44 Bacteria Proteus vulgaris [76]

45 Bacteria Pseudomonas: aeruginosa [107, 142, 146, 99, 156, 105, 128, 157] [147, 77, 75]

citronellolis [73, 158]

chlororaphis [159]

sp [83, 137, 32, 160, 158, 50, 104, 137, 125, 76] [93, 138, 89, 99, 161, 11]

putida (KT2440 ATCC 47054) S3A MK4 (DQ31 8885) & PW1 (EU741 798),

[156, 107, 128, 162] [147, 77]

syringae DC3000 ATCC 10862

[156]

stutzeri [163]

fluorescens [72, 113, 75]

alcaligenes [48]

otitidis [77]

redolens [78, 9, 164, 165, 79]

46 Fungi Pullularia pullulans [106]

47 Fungi Pycnoporus sanguineus [166]

48 Bacteria Rahnella aquatilis [72]

49 Bacteria Ralstonia sp [142, 137]

50

Bacteria Rhodococcus: ruber C208, [167, 168, 169]

rhodochrous [170, 47, 96, 139]

erythropolis [142, 171]

sp [142, 138]

51 Fungi Rhodotorula sp [145]

52 Fungi Scopulariopsis brevicaulis [31, 115]

53 Bacteria Serretia marscence [172, 105]

54 bacteria Shewanella putrefaciens [32]

55 Fungi Sporotricum pullverulentum [173]

56

bacteria Staphylococcus aureus [76, 99, 113]

epidermidis [174]

xylosus [72]

sp [16, 11, 104, 89, 175]

piogens [99]

cohnii [72]

57 bacteria Stenotrophomonas

sp [142]

58

bacteria Streptococcus lactis, [76]

sp [11, 104, 89]

aureus B-324 [105]

59 bacteria Streptomyces: viridosporus T7A [151, 176, 112, 153]

setonii 75Vi2 [151, 176, 112, 153]

sp [94, 104, 50, 89]

coelicoflavus [177]

badius 252 [151, 176, 112, 153]

21

Se han reportado muchos microorganismos, los cuales pertenecen a bacterias, actinomicetos y hongos filamentosos, de los cuales muchos aún son especies desconocidas, pero aun así, son estudios relativamente nuevos e insuficientes para dar conclusiones finales, por lo que no hay razón para creer que sean todos los microorganismos degradadores existentes de LDPE, seguramente aún existen muchos por descubrir.

5.3.3.1 Hongos como agentes degradadores de LDPE

De acuerdo a Volke-Sepulveda los hongos producen algunos polisacáridos que ayudan a colonizar el material [109]. Los autores Kim y Rhee [34]. Seneviratne [131], Kershaw y Talbot [180], Shah [181, 182] han encontrado que los hongos liberan proteínas hidrófobas que se ligan a la superficie del LDPE, producen mayor cantidad de biomasa, sobreviven a condiciones de baja disponibilidad de nutrientes, bajo pH y humedad [69], también es una ventaja la distribución y habilidad de penetración de las hifas, la ubicuidad de los mismos, lo cual se comprueba en el gran número de géneros encontrados, además de la altísima frecuencia con que se encuentran.

5.3.3.2 Bacterias como agentes degradadores de LDPE

Algunos investigadores han visto buenos resultados en la biodegradación de LDPE usando bacterias, por ejemplo se ha aislado Rhodococcus ruber (C208) capaces de degradar 0,86% por semana [183], cuya habilidad es atribuida a la hidrofobicidad de su superficie o membrana [167] [106]. Merina Paul Das y Santosh Kumar encontraron una alta hidrofobicidad (37-42) % en bacillus Amyloliquefaciens, y posteriormente probaron su capacidad para degradar LDPE realizando la prueba de variación de la pérdida de masa [129], encontrando porcentajes del 11 al 16 % en dos meses lo que significa que perdía un 2% por semana [127]. En algunas especies de Pseudomonas lograban una pérdida de peso por encima del 20% en LDPE durante 120 días, por lo tanto se degradaba a un ritmo de 1,25% por semana. [156, 158]. Por ejemplo Shah [181] encontró que las P. aeruginosa biodegradaron LDPE a un nivel de 35%.

5.3.3.3 Consorcios microbianos

Muchos investigadores concuerdan en que ya sean bacterias u hongos, la utilización de consorcios microbianos ofrece considerables ventajas sobre el uso de cultivos puros en la degradación de LDPE [120, 82]. Probablemente debido a la habilidad multifuncional y su mayor robusteza a las fluctuaciones ambientales [120, 82].

60 Fungi Trametes

versicolor IFO7043 [28]

versicolor ISU15413 [28]

61

Fungi Trichoderma viride [178, 31, 115]

hamatum [130]

62 Fungi Verticilium lecanii [78, 79]

63 bacteria Vibrio sp [16, 179]

22

Algunos autores definen las comunidades microbianas o consorcios como asociaciones de múltiples especies que coexisten en un mismo nicho. En los consorcios microbianos los microrganismos trabajan en forma multidisciplinar sobre el LDPE degradandolo en sus monómeros. De aquí que la actividad de los consorcios permite incrementar la degradación del polietileno [82].

5.3.3.4 Enzimas reportadas

Las enzimas son causantes directas e indirectas de la oxidación biótica del polietileno de baja densidad LDPE y otros plásticos, todas son enzimas extracelulares o también conocidas como exoenzimas, son secretadas por las células microbianas (ver tabla 2) las cuales catalizan la formación de una o varias reacciones en la superficie del LDPE, tales como son: la oxidación, la reducción, hidrólisis y esterificación. Los autores Seneviratne [131], Kershaw y Talbot [180], Shah [181, 184] demostraron que los hongos liberan enzimas hidrófobas que se ligan a la superficie también hidrófoba del LDPE, igualmente para las bacterias, como un resultado de esta investigación se presenta un listado de las enzimas reportadas en los estudios realizados sobre la biodegradación del polietileno. Tabla 2 Enzimas involucradas en la biodegradación del polietileno.

Enzimas Características y organismo fuente Referencias

Alcano hidrolasa (EC 1.14.15.3)

Fue encontrada en bacterias G. thermodenitrificans y P. aeruginosa que degradan el petróleo y el PE.

[32]

Celulasa Obtenida de Pleurotus ostreatus PLO6 y probada en PE oxodegradables.

[155]

Gelatinasa Rompe las estructuras poliméricas hidrófilas. [16]

Lacasa (EC 1.10.3.2)

Probada en PE oxodegradables, encontrada en: Rhodococcus ruber, Trametes versicolor, Curvularia lunata, Alternaria alternata, Penicillium simplicissimum Sporotrichum pullvurulentum y Fusarium sp.

[169, 124, 155, 173, 82, 29]

Lignina peroxidasa

Rompe enlaces C-C, encontrado en Sporotrichum pullvurulentum

[28, 81, 173, 29]

Lipasa Rompe los ácidos grasos producidos por otras enzimas.

[16, 185]

manganeso peroxidasa (MnP)

Fueron purificadas de los hongos Phanerochaete Chrysosporium, Bjerkandera adusta, Curvularia lunata, Alternaria alternata, Penicillium simplicissimum, Sporotrichum pullvurulentum y Fusarium sp. Usando DSC, EM se demostró que degradan PE,

[28, 186, 124, 155, 173, 82, 29]

Xilanasa Probada en PE oxodegradables [155]

Amilasa Ataca la matriz de almidón [134, 16]

Todas son exoenzimas, algunas usan oxígeno o peróxido para generar grupos carbonilo o hidroxilo en la superficie del material, otras hidrolizan los copolímeros almidón polietileno y otras rompen enlaces C-C, o C-C=O.

23

Cabe mencionar que hasta la fecha ningún trabajo ha realizado un estudio enfocado y detallado sobre las enzimas, su clasificación, la identificación de las estructuras primarias, secundarias y terciarias, formas de interacción con el sustrato, tiempo de acción, condiciones de acción, genes codificadores, etc., por lo que aún hay importantes vacíos por llenar..

5.3.3.5 Biodegradación aerobia y anaerobia

Los ambientes en donde ocurren las rutas metabólicas de biodegradación durante el proceso de asimilación, se pueden clasificar básicamente por la disponibilidad de oxígeno en el medio, el cual puede ser:

5.3.3.5.1 Reacción básica de biodegradación de tipo aeróbico

La reacción aerobica requiere como sumidero de electrones al oxígeno, el cual

se reduce a agua, es teóricamente la más exotérmica, y probablemente es la

mejor y más común para acelerar el proceso de biodegradación del LDPE.

La ecuación que representa el proceso de oxidación es la siguiente:

𝑂𝑙𝑖𝑔𝑜𝑚𝑒𝑟𝑜𝑠 + 𝑂2 → 𝐶𝑂2 + 𝐻2𝑂 + 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 + 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜(𝑠)

5.3.3.5.2 Reacción básica de biodegradación de tipo anaeróbico

Es una reacción que ocurre sin la necesidad de oxígeno, suele liberar metano

como producto final, el proceso ocurre básicamente como se presenta en la

siguiente ecuación:

𝑂𝑙𝑖𝑔𝑜𝑚𝑒𝑟𝑜𝑠 → 𝐶𝑂 2 + 𝐶𝐻4 + 𝐻2𝑂 + 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 + 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜(𝑠) En el caso de los géneros Pseudomonas sp y Brevibacillus sp, Ambika Devi ha sugerido que la biodegradación anaeróbica es mucho más importante, debido a que veinticinco géneros de bacterias que degradan hidrocarburos se aislaron en el medio ambiente marino aislado del oxígeno atmosférico [80].

5.3.3.6 Efecto en la biodegradación en la humedad del medio

A su vez estos dos tipos de ambientes pueden ser subdivididos de acuerdo a la cantidad de humedad existente dando las siguientes categorías:

Ambientes acuáticos: ríos, mares, lagos, reservas subterráneas etc [187, 188].

Ambientes sólidos o secos: zonas de compost, reservas forestales, botaderos, etc.

El contenido de humedad en el sustrato tiene un efecto directo sobre el crecimiento de los microorganismos, por ejemplo un estudio en el que se usó el hongo Pycnoporus sanguineus para degradar LDPE pudo crecer más rápido y

24

de forma más intensa en el sustrato compuesto por 67% de polímero y 33% de sorgo a 22°C [189], que era el de mayor humedad. Tabla 3 clasificación esquemática de los diferentes medios ambientes en que ocurre la biodegradación del LDPE, tomada de [59]

Acuático Seco

Aeróbico Plantas aeróbicas de tratamiento de aguas residuales. Aguas de superficie : ríos y lagos, ambientes marinos

Suelos de superficie Residuos orgánicos en platas de compostaje Residuos en botaderos a cielo abierto

Anaeróbico Plantas anaerobias de tratamiento de aguas residuales Rumen de herbívoros

Sedimentos en lo profundo del océano Rellenos sanitarios Biogasificacion Digestión anaeróbica Lodos anaerobios

5.3.3.7 Efecto del pH en el medio

El valor del pH es un factor clave para la supervivencia y actividad de los

microorganismos, generalmente esta entre 6 y 8 de acuerdo a ASTM D 5988

[177].

En un estudio se encontró que un género de actinomicetos, las bacterias termófilas streptomyces coelicoflavus NBRC 15299 presentan un amplio rango de tolerancia al cambio del pH que va de 5 a 10 [177]. Lo interesante es que durante la actividad biodegradadora disminuye el pH a un valor de 5,6 en 24 días por lo que el microorganismo debe ser altamente tolerante a pH bajos. Para la Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter ursingii, todas bacterias mesófilas cuando se cultivaron en un medio con pH de 7,2 después de 7 días a 30°C, lo acidificaron a 6.41, 6.45, 6.52, las demás cepas sin identificar también acidificaron los medios, en un estudio en el que se usaron las bacterias Pseudomona putida S3A se encontró que el pH óptimo estaba en 6,5 en el cual alcanzó el mayor crecimiento en siete días [162]. Los hongos son naturalmente más resistentes a medios ácidos y por lo tanto a pH bajos degradan más rápidamente el LDPE, como lo presentan Nanda S, Sahu S, Abraham J [137], en donde exponen a los hongos Phanerochaete chrysosporium y a las bacterias Pseudomonas aeruginosa a medios en condiciones de pH: 4 y a temperatura ambiente, con agitación regular por ocho meses [137], el porcentaje de degradación fue de 50% para los hongos Phanerochaete chrysosporium y 35% para las Pseudomonas aeruginosa, los hongos se desarrollan rápidamente en los medios con LDPE, y las bacterias que logran degradarlo soportando tales condiciones probablemente sean acidófilas o al menos tolerantes a pH bajos.

5.3.3.8 Efecto de la temperatura

La temperatura óptima para la degradación parece distinta para cada especie

microbiana, sin embargo es común que sean temperaturas relativamente altas,

25

en varios artículos revisados las temperaturas óptimas correspondieron a

valores desde los 28 a 55°C.

Las bacterias termófilas Streptomyces coelicoflavus NBRC 15299 soportan

variaciones de temperatura desde los 12°a los 42°C, sin embargo su

temperatura para la degradación óptima fue de 28±2°C [177].

Para las bacterias Pseudomonas putida S3A se encontró que la temperatura

óptima estaba en 37°C [162].

En un estudio en el que se usó el hongo Pycnoporus sanguineus para degradar

LDPE el crecimiento se midió por porcentaje de invasión del sustrato,

encontrando que a 22°C, el porcentaje de invasión superó el 90% en un lapso

de 21 días, mientras que cuando la temperatura de crecimiento fue de 10°C, el

máximo crecimiento llegó apenas a un 32% [189]. En un estudio con tres

muestras de hojuelas de LDPE pre tratadas con radiación ultravioleta durante

68h, fueron incubadas por separado a 37°C, 46°C y 55ºC durante un mes, en

presencia de Bacillus borstelensis, la temperatura en la que se presentó el

mayor grado de biodegradación (14,2%) fue a 55°C [136].

5.3.4 Aditivos utilizados para potenciar la degradación del LDPE

Existen múltiples productos variantes del PE que contienen pro-oxidantes o aditivos biodegradables a continuación se mencionaran algunos.

5.3.4.1 El polietileno de baja densidad LDPE con almidón

El almidón es un polímero con alto valor como aditivo, en los estudios de biodegradación del LDPE la reducción de su alta hidrofobicidad mediante la inyección de almidón para la producción de LDPE biodegradable es una alternativa muy popular debido a que el almidón es natural y económico. La mezcla del almidón y el LDPE al ser hidrófila los microorganismos fácilmente acceden a su matriz y la degradan con enzimas como amilasas las cuales realizan un mecanismo tipo hidrodegradación [190, 191, 192]. El almidón está compuesto de amilosa y amilopectina, la cantidad de estos componentes es diferente entre varias fuentes de almidón, la proporción de estos dos tiene un efecto en el comportamiento del producto [115], entre mayor contenido de amilosa aumenta la elongación y la fuerza de la mezcla [193], probablemente debido a que es un almidón de menor ramificación, permite una mayor cristalinidad de la mezcla, Sin embargo, su uso tiene limitaciones debido a que ésta mezcla posee baja resistencia a la humedad, baja procesabilidad e incompatibilidad [6]. También se ha probado mezclas de otros polímeros naturales con el LDPE, tal es el caso del yute [194], el inconveniente de usar tales aditivos corresponde al de disminuir sus propiedades mecánicas, siendo probado por autores como Lee y Obasi [190] [195]. Causando una disminución de la resistencia a la tensión y reducción de la elongación, con lo cual se torna quebradizo y frágil

26

debido a la pobre adherencia a la matriz del aditivo y la aglomeración de sus partículas.

5.3.4.2 Aditivos pro-oxidantes

Los pro-oxidantes incluyen compuestos poliinsaturados, iones de metales de transición y complejos tales como tiocarbamatos [196]. Los aditivos que contienen pro oxidante sufren reacciones tipo foto degradación, termo degradación y quimio degradación, entre los compuestos fotos sensibilizadoras están: sales de metales, quinonas, benzofenol, benzofenonas etc.) se forman radicales que posteriormente generan grupos carbonilo que pueden ser utilizados por los microorganismos [9], (ver mecanismos de despolimerización) si el pro oxidante es un metal de transición como los esteres de metales como el Hierro, Cromo, Manganeso, entre otros la oxidación es secuencial [117], incrementan la ruptura del LDPE en un proceso que se denomina degradación oxidativa, tornando el material quebradizo y fragmentado, además el proceso es dependiente de las condiciones medioambientales como la cantidad de luz solar, humedad, pH, etc. Y también sus altos costos y sus propiedades limitadas restringen su uso [197]. Tabla 4 estudio sobre la biodegradación del LDPE con prooxidantes, adaptado de [117]

En el estudio denominado efecto de los prooxidantes en la biodegradation del polietileno (LDPE) por el aislamiento de hongos endogenos, Aspergillus oryzae. En el cual realizan pruebas de degradación de LDPE tratado con estearato de Fe, Co, Mn, y Ti, además se irradia con UV y se usa como sustrato para cultivar el hongo A. oryzae, a 27°C a 120 rpm, por los resultados arrojados no hay duda de que el uso de proxidantes acelera el proceso de biodegradación, pero adicionalmente para ver los buenos resultados es necesario exponer el material a algún agente físico como la radiación UV. Tabla 5 Aditivos del Polietileno de baja densidad (LDPE).

Aditivos composición del material

Ventajas Desventajas Referencias

Anhidrido Maleico

PE-g-MA Compatibilizante Costoso aun [115, 198]

Alcohol Polivinilo

LLDPE/PVA Es el único polímero con un esqueleto carbono -

Costoso aun [179]

Título Condiciones Tiempo (Meses)

Ensayo Porcentaje degradado

Referencias

Effect of prooxidants On biodegradation of polyethylene (LDPE) by indigenous fungal isolate, Aspergillus Oryzae

Tratado con estearato de Fe, Co, Mn, y Ti, UV y A. oryzae 27°C a 120 rpm

3 Control 0 [117] 3 UV 18

3 Estearato Mn + UV 47.2

3 Estearato Ti + UV 41.6

3 Estearato Fe + UV 36.1

3 Estearato Co + UV 34

3 Sin UV 5

27

carbono que es biodegradable bajo ambas condiciones aeróbica y anaeróbica

Policaprolactona Policaprolactona y LDPE

alta biodegradabilidad Su estructura cristalina es similar a la del polietileno.

Ninguna [64, 193]

Oxido de polietileno- poli hidroxibutirato

OP/ PHB Por su baja resistencia al impacto se mezcla y de esa manera se potencia sus cualidades y además potencia la biodegradación

Homopolímero puro es muy quebradizo tiene pobres propiedades mecánicas y es Costoso

[199, 200]

P H B V ( p o l i ( 3 - h id r o x i b u t i r a t o - c o-hidroxivalerato)

LDPE/PHBV Polímero Natural biodegradable (Producido por microrganismos) es menos quebradizo que su homopolímero el PHB y sus propiedades físicas y térmicas dependen el grado de contenido de HV

puro es muy quebradizo pero menos que el PHB tiene pobres propiedades mecánicas y es Costoso

[148, 193]

Colágeno hidrolizado

El colágeno hidrolizado y el polietileno de baja densidad

En un porcentaje del 20-30% permite obtener laminas transparentes, cohesivas y flexibles que son caracterizadas por tener respuestas térmicas y mecánicas satisfactorias

Porcentajes mayores tienen efectos adversos a las cualidades reológicas del material, la extracción de la sal es compleja y afecta la mezcla PE-HC

[57]

Trazas de metales de transición : Fe, Mn, Co, Ti

estearatos de Fe3+, Mn2+ estearato de Co2+ acetilacetonato de Co2+, 11-9Z, 12Z-Octadeca-9, 12-dihidroxi-10,13 dihidroxiactadecaneato Cobalto (II) nano-TiO2 foto

Los cuales pueden Aumentar la velocidad de oxidación por el oxígeno del aire y la escisión de las cadenas de PE bajo la influencia de la luz y / o calor. Partículas de Titanio foto catalíticas.

El tipo de metal y su concentración puede variar de acuerdo al proveedor comercial, requiere exposición lumínica, efectos de toxicidad para los microbios (Partículas de Titanio). [157]

[112, 201, 65, 85, 122, 117, 202, 170, 155, 133] [157, 203]

28

catalizador

Aditivos multifuncionales o en inglés (Multi functional aditives)

Fe, Co, Ni, contiene grupos: alcohol, alcano, enlaces dobles, ácido carboxílico.

Contiene múltiples grupos funcionales que hacen que sea fotosensible, posee efectos lubricantes y plastificantes, potencia la biodegradación sin afectar los parámetros de procesabilidad.

Experimental [197]

Almidón termoplástico TPS (del ingles Thermoplastic Starch)

Las proporciones pueden variar pero por lo general se encuentran en un 12% de almidón y 88% de LDPE

Aceleración de la biodegradación, Mejora de alguna de sus propiedades mecánicas.

Baja: resistencia a la humedad, y Procesabilidad, incompatibilidad con el PE Hidrofóbicos.

[204, 94, 8, 65, 191, 13, 205, 206, 207, 153] [106, 176, 137, 188, 190, 208, 209, 115, 116]

Aceite mineral LDPE + aceite mineral.

Se obtiene una colonización más la pérdida de peso a una concentración de 0,05%.

A concentraciones mayores a 0,05 tiene un menor efecto en la degradación del rápida incrementa en un 50% PE.

[106]

Aceite vegetal Triacil Gliceroles Los Triglicéridos contienen ácidos insaturados que son más susceptibles a la autoxidación.

[179]

Celulosa LDPE/celulosa Se usó Yute, madera

Potencia la biodegradación por facilitar el ataque de celulasas.

No presenta las mismas cualidades reológicas.

[210] [194]

Glicerol El glicerol/LDPE/ Almidón.

Facilita la biodegradación y cumple la función de plastificante.

Costo [211, 208, 115, 179]

Maleato o MAPE

Maleato/LDPE/ biopolímero

Se usa como compatibilizante.

Aumenta los costos

[190, 211, 208, 198]

PP PP/HDPE Mezcla de polipropileno y po Ietileno de alta densidad

Los dos son muy resistentes al ataque bacteriano por lo que no potencia la biodegradación.

Bajo condiciones de enterramiento se alteran las propiedades mecánicas.

[201]

poliol-glucósidos

modificación química del almidón por glucosilación y posterior transesterificación con el aceite de higuerilla

Es mucho más compatible con el LDPE y favorece la biodegradación.

Aumenta los costlas s

[8]

Cera de abeja, Cera

PE/Cera de abeja La cera de abeja

Es natural, hidrofóbica, y biodegradable.

Genera problemas en

[79, 211, 198]

29

es 14% hidrocarburos, 35% mono ésteres, 3% di esteres, y 12% ácidos grasos libres.

grandes cantidades (10%) cuando se realiza la plastificación por su bajo punto de fusión

Parafina PE/parafina Parafina comercial. Mezcla de alcanos entre los 20 a 40 carbonos

Proporciona Gran estabilidad térmica y potencia la hidrofobicidad.

Pierde parte de sus buenas cualidades reológicas y fisicoquímicas.

[211]

Pectina Pectina/PE [208]

HP Polietileno e hidrolizado de proteína PE/HP 20% y 40%.

Biodegradación de 35% con una aceptable resistencia a la tensión

Biodegradación de 50% con una pobre resistencia a la tensión

[94]

Ricinoleico linoleato de Cobalto

LDPE/RLCD Acelera la biodegradación de LDPE

No son conocidas las cantidades exactas que se obtuvieron para las pruebas.

[133]

Ácido poli láctico

LDPE/PLA Potencia la biodegradación Solo se han hecho estudios en escala de laboratorio y probablemente aumente los costos.

[12]

Los microorganismos inicialmente atacan los polímeros biodegradables, que contiene El LDPE, incrementando la porosidad y el área superficial, lo que acelera su subsecuente biodegradación [132].

5.3.4.3 Aditivos comerciales

En el mercado existe un gran número de aditivos comerciales, con marca registrada que aseguran acelerar la degradación del polietileno, a continuación se enlistaran algunos encontrados: Tabla 6 algunos aditivos comerciales reportados

Aditivos comerciales

Características o composición del material


Biopol PHB Biodegradable Caro [53]

Nature grad Plus, NP

Películas de polietileno que contiene 9 % de almidón y pro-oxidante comercial (éster de ácido graso autooxidables, agentes catalíticos y de metales de transición).

Perdida peso: NP=36% LDPE≈2,004% HDPE≈1.0% (36 semanas)

Perdida de resistencia a la tracción: NP=82.76%, LDPE=13.04% HDPE=5.33%

[62]

30

TDPATM. TDPA®.

Metal estearatos (Fe, Ce, Co) Y ácido cítrico (típicamente Co) y almidón la degradación ocurre debido a la reacción del plástico con el oxígeno del aire (oxodegradación), también se inicia por exposición a los rayos ultravioleta (UV degradable), altas temperaturas y/o esfuerzos mecánicos. Fabricante: EPI

Han demostrado biodegradarse en materiales no tóxicos en un rango de tiempo comprendido desde unos pocos meses a algunos años, dependiendo de la formulación del aditivo En 2 años será degradado

Requiere que el material reciba luz solar para poder ocurrir el proceso de degradación.

[212] [47, 213, 139, 202, 196, 203]

Renatura hierro estearato y combinación de estabilizantes/antioxidantes fabricante Nor-X Industries

Sus características lo hacen ideal para ser adicionado al PE

De acuerdo a un estudio su biodegradación posiblemente no requiere que ocurra en condiciones anaerobias

[214]

Reverte paquete de foto- inhibición No revelado, paquete de ión prodegrable metálico y promotores de biodegradación (celulosa micronizada )Fabricante Wells Plastics Limited

Altamente amplía la gama de plásticos a la que puede servir como aditivo PP, PE, PS, PET, ABS De acuerdo a un estudio su biodegradación posiblemente no requiere condiciones anaerobias

Requiere que el material reciba luz solar para poder ocurrir el proceso de degradación

[214]

D2W® Contiene estearatos de Metales (típicamente Mn) y estabilizantes Fabricante Symphony Environmental

Paquete de aditivos que activan la oxo-degradación del polietileno luego de un periodo de tiempo preseleccionado. Los aditivos son incluidos durante el proceso de extrusión

De acuerdo a un estudio su biodegradación no ocurre en condiciones anaerobias

[215, 214]

Addiflex® PE oxodegradables hechos a partir de carboxilato de Metales como (Fe, Mn, Cu, Co, Ni),almidón, CaCO3; estearato, manganeso es identificado como AddiFlex HE Fabricante Add-X Biotech

aseguran producir la oxo-degradación del material hasta en un 90% su biodegradación posiblemente no requiere condiciones anaerobias

Requiere que el material reciba luz solar para poder ocurrir el proceso de degradación

[216]

Biopack el material se degradará posiblemente no requiere que [217]

31

debido a compuestos bioactivos que atraen a colonias de microorganismos

requiere condiciones anaerobias

el material reciba luz solar para poder ocurrir el proceso de degradación,

EcoSafe plásticos oxodegradables y biodegradables de composición no disponible

Paquete de aditivos que activan la oxo-degradación del polietileno luego de un periodo de tiempo preseleccionado.

Elevan el costo de producción y venta y requiere condiciones aerobias

[218]

Ecoflex Aliphatic/aromatic polyester

5-95% completamente biodegradable

Elevan el costo de producción y venta

[53]

Mater-Bi PCL/Starch (60:40w/w) La biodegradación con Mater-Bi fue del 75-88% en todas las pruebas.


Master Batch

20% de MB La degradación fue de 26% después de 20 meses

Es una velocidad de degradación poco satisfactoria aun.

[188]

Actimais (SMS Trioplast)

PE+ aditivos prooxidantes Acelera la biodegradación

Elevan el costo de producción y venta y requiere condiciones aerobias

ECM Biofilms Composición no disponible Permiten a los microorganismos producir las enzimas y ácidos que atacan las moléculas de hidrocarburos de cadena larga y los mineralizan.

Aumenta los costos de producción y venta

[219]

POLYCLEAN Masterbatch y contiene 6% almidón, (Fe, Zn, Ni, y/o Mn), aceite de soya y maíz.

Acelera la biodegradación


[176, 151]

DPE Polietilenos degradables Estearatos de metales de transición fabricante Willow Ridge Plastics, USA)

degradable por UV y oxidación, PDQTM6,

su biodegradación posiblemente no ocurre en condiciones anaerobias

[220]

Oxobiodegradable aditive

LDPE y BPE 10 (10 % aditivo oxobiodegradable ) fabricados por KK Polycolor India Ltd,

Cambia su fuerza tensil en un 17.036% y reducción en el

su biodegradación posiblement

[123][131, 221]

32

Muchos de estos aditivos se han puesto a prueba en trabajos como los que realizaron S. Łabużek, B. Nowak, J. Pająk [33], sobre la adición de Bionolle a las láminas de polietileno, las cuales fueron preparadas con 60% (wt/wt) de Bionolle grado 3001 [33], reportando los siguientes resultados: Tabla 7 susceptibilidad del polietileno modificado con bionolle, tomado de [33]

Ángulo de Contacto. 17.4º

e no ocurre en condiciones anaerobias

biodegradable polyethylene (PE-BIO), oxodegradable polyethylene (PE-OXO)

Composición desconocida Probablemente contenga, metales de transición y algunos compuestos orgánicos pros oxidantes.

PE-OXO no sufre reacciones de fotoxidación durante los primeros 30 días de exposición al UV-B, debido al contenido de agentes pro oxidantes, metales de transición, los cuales causan Inhibición de la descomposición de los hidroperóxidos bajo el efecto de radiación UV-B.

[66]

[Tween 60, 80 or 85 (Sigma)

Polysorbato Permite una mejor interacción entre los microorganismos y sus enzimas y el material

No tiene un efecto biodegradador si no se dan las condiciones

[106, 136]

L0235 Desconocido UV fotosensibilizador


[126]

Bionolle Poli (butileno Succinato) (PBS), poli (etileno Succinato) (PESu), o el copolímero poli (butileno Succinato -co-butilen adipato (PBSA)

Son totalmente biodegradables compatibles con el PE y PP posiblemente no requiere condiciones anaerobias ni luz


[31, 32, 33]

Scott–Gilead Technology

Metal ditiodicarbamato De acuerdo a un estudio su biodegradación posiblemente no requiere condiciones anaerobias ni luz


[214]

Titulo

Condiciones (Mes)

Aspergillus niger Penicillium funiculosum

The Las láminas Peso perdido

33

Se puede notar claramente en la Tabla 7 que el polietileno modificado con bionolle es degradado rapidamente por ambas especies de hongos, lo cual demuestra la eficacia de este tipo de productos. En el artículo denominado Biodegradación de polietileno por las Bacterias termófilas Brevibacillus borstelensis con LDPE con y sin pro-oxidante (L0235) e irradiado con Ultravioleta por 60 h antes de la incubación a 50°C [222]. Los cuales después de un mes presentaron los siguientes resultados: LDPE sin aditivo y con UV obtuvo un 6,2 ± 0,3% de degradación, LDPE con L0235 y con UV presentó un 7,8 ± 0,8% de degradación, LDPE sin aditivo y sin UV presentó un 2,5 ± 0,3% de degradación, y finalmente LDPE con L0235 y sin UV presentó un 5,6 ± 0,5% de degradación, demostrando la importancia de la adición de estas sustancias en el proceso de degradación. Probablemente sigan apareciendo cada día nuevas marcas y productos, de esa forma se impulse la caída de sus precios y la mejora de los aditivos.

5.3.4.4 Biosurfactantes vinculados en la biodegradación del polietileno

Al ser el polietileno apolar o Hidrofóbico no puede ser fácilmente atacado por los microorganismos [223]. Y de acuerdo a Yutaka T, la adherencia de los microorganismos a la superficie del LDPE, seguida por la colonización de la superficie expuesta es el mayor mecanismo involucrado en la degradación microbiana del plástico LDPE [64]. La adición de Biosurfactantes potencia la biodegradación, por ser éste un tenso activo que disminuye la tensión superficial entre la membrana celular y el LDPE, además se ha descubierto que ciertos microorganismos producen tales compuestos, por ejemplo las Pseudomonas auroginosa. producen ramnolípidos, (ver Tabla 8) sin embargo se ha demostrado que si se quiere potenciar la biodegradación se puede adicionar surfactantes artificiales tales como Tweed 60/80 [106, 136]. Los surfactantes biológicos poseen múltiples ventajas sobre sus contrapartes manufacturadas químicamente, incluyendo baja toxicidad, efectividad a temperaturas extremas, pH y salinidad [224]. Tabla 8 Biosurfactantes producidos por distintos microorganismos, adaptado de [223]

Susceptibility of Polyethylene Modified with

Bionolle to Biodegradation by Filamentous

Fungi

de polietileno fueron preparada con 60% (wt/wt) de Bionolle grado 3001.

LDPE

LDPE modificado

LDPE LDPE modificado

[33]

0.33 0 1.04 0 6.08

0.66 0.09 1.14 0.13 30.28

1 0.14 2.26 0.14 49.22

1.33 0.29 3.49 0.23 75.06

2 0.33 6.12 0.27 93.44

3 0.81 7.53 0.35 100

Tipos de surfactantes producidos Microorganismos

Glucolípidos Pseudomona aeuroginosa, Rhodoccocus erythrópolis, Nocardia erithropolis

Ramnolípidos, lípidos Manosil eritritoles (MEL), Celobiolípidos, Soforolípidos, etc.

Micobacterium sp, Pseudomona aeuroginosa

Lipopeptidos, lipoproteínas, Surfofactin, Bacillus licheniformis, Serratia marcescen,

34

5.3.4.5 Sustitutos biodegradables del LDPE

Se han descubierto y comercializado múltiples sustitutos biodegradables del polietileno de baja densidad, estos son polímeros biológicamente degradables (biopolímeros), con características similares, inferiores o mejores en ciertos aspectos, que las del LDPE [192], estos biopolímeros ofrecen beneficios ambientales tales como biodegradabilidad, contribuye a disminuir los gases de efecto invernadero y renovabilidad del material base [194, 225]. Además se han descubierto microorganismos como el Bacillus megaterium, capaces de sintetizar polímeros biodegradables como el PHB [145, 226].

5.3.4.5.1 Los polihidroxialcanoatos PHA

En la actualidad se han hecho polímeros biodegradables muy estudiados como el Poli (butileno Succinato) (PBS), poli (etileno Succinato) (PESu), o el copolímero poli (butileno Succinato -co-butilen adipato (PBSA), los cuales son miembros de un grupo denominado comercialmente como ‘Bionolle’ [31, 32, 33]. y a su vez éstos y muchos más hacen parte de la familia de polímeros denominada los polihidroxialcanoatos (PHAs), que en la actualidad están compuestos por más de 150 tipos, todos son poliésteres alifáticos

biodegradables con fórmula general monomérica de −[O-CH(R)-CH2-CO]−, donde las propiedades varían de acuerdo al sustituyente alquilo (R), por ejemplo el polímero alternativo polihidroxibutirato PHB, que en virtud a que su sustituyente (R) es el grupo metilo posee una alta cristalinidad, cuyo valor es superior al 50%, cobrando gran importancia en el campo de la industria durante los últimos años, por sus propiedades físico-químicas y ha sido considerado como un posible sustituto de plásticos derivados del petróleo como el polietileno de baja densidad LDPE, sin embargo es posible que existan otros con mejores cualidades, por ejemplo los estudios de H-S. Kim revelaron que el PBSA se degrada mucho más rápido que el PBS [35]. Otros candidatos para sustituir al LDPE o ser buenos aditivos son la policaprolactona (PCL), el ácido poli láctico (PLA) y el ácido poliglicólico (PGA). Algunos estudios han demostrado que la mezcla de biopolímeros como P (HB-3)/ poli (propiolactona), P (HB-3)/poli (etilen adipato), y P (HB-3)/poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV) aceleran la biodegradación comparadas con cada polímero puro, lo cual puede ser atribuido a el proceso de separación de fases de los componentes de la mezcla [148].

Artrofactina, Ptisolvina, viscosinamida, etc. Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Bacillus polymixa.

Acidos grasos, fosfolípidos, lípidos Neutros

Corynebacterium lepus, Nocardia erythropolis, Thiobacillus thiooxidans

Surfactantes poliméricos Acinetobacter calcoaceticus, Candida tropicalis, Candida lipolytica, Pseudomonas fluorescens, Pseudomona aeuroginosa

Surfactante Particulado Acinetobacter calcoaceticus.

35

5.3.4.5.2 Almidón termoplástico

El almidón puro posee un punto de fusión superior a su punto de descomposición por lo que no se puede moldear, pero cuando se mezcla con un plastificante como el glicerol o los polioles, puede ser procesado bajo alta presión y temperatura, y este se denomina almidón termoplástico (TPS) [208], pero la cantidad de plastificante es importante, la interacción es débil cuando está en un porcentaje inferior al 10% por lo que se torna frágil pero cuando es superior al 20% se mejora su flexibilidad y elongación. Cuando es expuesto a bajas temperaturas o a plastificantes poliólicos sufre retrogradación que es la restructuración de los enlaces. Se ha utilizado almidón de muchas fuentes entre las cuales están: papa, frijol mung, cascara de maní, tapioca, maíz etc. [190, 208, 116, 115, 198, 182]. A continuación se presenta como resultado de esta revisión un listado de los posibles sustitutos que han sido probados en múltiples estudios sobre biomateriales y su biodegradación. Tabla 9 sustitutos del Polietileno de baja densidad (LDPE)

Sustitutos Características o composición


Policaprolactona (PCL)

Se comporta de forma similar a plásticos como polietileno y polipropileno, transición vítrea -60°C, resistencia mecánica 23MPa, punto de fusión (PF) (60-65) °C.

Biodegradabilidad Su estructura cristalina es similar a la del polietileno. Relativamente barato alto porcentaje de elongación:700%

Es muy soluble en muchos solventes orgánicos, transición vítrea baja, baja resistencia mecánica.

[193]

Poli ácido glicólico (PGA) (del inglés polyglicolic acid)

Es el poliéster más simple, es altamente cristalino, con una valor de 45-55%, prácticamente insoluble en compuestos orgánicos, tiene un alto punto de fusión PF (220-225°C), transición vítrea (tv) de 35-40°C

Tiene excelentes propiedades mecánicas

De aplicaciones médicas limitadas por su baja solubilidad y su elevada tasa de degradabilidad cediendo productos ácidos, sus copolímeros tienen más usos.

[193]

Ácido poli láctico (PLA) (del inglés polylactide acid)

Hidrofóbico por el grupo radical lateral CH3 transición vítrea de 63.8°C, resistencia a la tensión de 32.22MPa

Es más resistente a la hidrólisis que el PGA, buenas propiedades mecánicas.

Es quebradizo y de pobre resistencia a la temperatura

[30]

Polihidroxibutirato (PHB)

similar al polietileno y polipropileno,PF:180°C tv: 55°C cristalinidad mayor a 50%

Insoluble en agua no tóxico, Natural biodegradable biocompatible piezoeléctrico termoplástico

Caro de producir y pobres propiedades mecánicas comparables al PLA, puro es quebradizo, susceptible a la

[227, 199, 200, 228, 193]

36

elastómerico

termodegradación a temperaturas cercanas al punto de fusión

Poli hidroxibutirato co valerato (PHBV)

Copolimero, pf: 108°C, tv: -5°C a 20°C

Altamente cristalino

El copolímero puro es quebradizo pero menos que PHB

[193]

Plastarch thermoplastic starch (TPS)

Almidón, los enlaces glucosídicos rompen a 150°C y a 250°C los gránulos colapsan

Biodegradable resistente al calor, barato

Inferiores cualidades mecánicas, quebradizo, higroscópico, amorfo

[53, 211, 208, 193]

Poli(Butileno Succinato) (PBS)

Poliéster de ácido succínico y etilenglicol, PF:(90-120)°C, tv:-45°C a -10°C entre el PE y PP, porcentaje de elongación 330%, Resistencia a la tensión de 330kg/cm

2

Características mecánicas comparables a las del polipropileno PP el polietileno baja densidad LDPE, buena procesabilidad mejor que PLA y PGA

Los microorganismos que lo degradan tienen una distribución limitada, depende fuertemente de los factores ambientales, insuficiente biocompatibiliad y bioactividad.

[53, 229]

Poli (Etileno Succinato) (PES)

Poli (p-dioxanona)(PPDO)

Poliéster de p-dioxanona (tv): -10°C-0°C

Buenas propiedades mecánicas, muchos microorganismo lo degradan.

Es más caro que el PBS

[193]

Si bien el polietileno puro es muy buen material y sus cualidades son difíciles de igualar, en la actualidad existen cuantiosas opciones de aditivos comerciales y no comerciales, todas novedosas y que poco alteran sus cualidades originales, acelerando su proceso de biodegradación, siendo positivo para el ambiente y la economía de las empresas basadas en estas poli olefinas, además es posible encontrar una gran cantidad de muy buenos sustitutos altamente biodegradables y biocompatibles, pero existen aún los siguientes inconvenientes: Casi todos los aditivos del polietileno de baja densidad LDPE y los biopolímeros alternativos en desarrollo son de 2.5 a 10 veces más caros, lo que implica que los esfuerzos se dirijan a la búsqueda de sustratos de menor costo [6, 67]. Las propiedades físico químicas de los biopolímeros alternativos frecuentemente restringen su uso [67], siendo necesario una mejora aún en éstos.

5.4 Técnicas y métodos utilizados en el estudio de la

biodegradación del LDPE

Existe una gran variedad de técnicas que permiten analizar la biodegradación

del polietileno de baja densidad LDPE, desde múltiples perspectivas, todas se

basan en principios fisicoquímicos y permiten estudiar variables específicas,

37

que en conjunto proporcionan un amplio y profundo panorama sobre su

degradación a través del tiempo.

Todas las técnicas están adaptadas en métodos específicos, mucho de los

cuales están estandarizados, facilitando de esa manera determinar la validez y

la reproducibilidad de los experimentos. Muchas de las técnicas permiten

analizar los cambios ocurridos en el material, por efecto de los

microorganismos o los factores abióticos, en estos últimos se incluyen los pre

tratamientos y los aditivos, el rango de posibilidades de estudio es muy amplio,

abarcando desde: el daño superficial, el cambio químico, la variación del peso

molecular y de sus propiedades físicas, etc. la selección de las técnicas

depende de factores como: costos, sensibilidad, necesidades, tiempo, etc. A

continuación en la Figura 10 se dividen de acuerdo al tipo de cambio, principio

y propiedades estudiadas.

Figura 10 tecnicas y métodos disponibles para el estudio de la degradación del LDPE, adaptado de [230, 42]

Alternativamente se han desarrollado métodos que se enfocan en el estudio de

los microorganismos, muchos de las cuales se basan en múltiples técnicas

tales como la microscopia de fluorescencia, la electroforesis, la PCR y la

microscopía óptica tradicional, la cromatografía de gases etc., siendo muy útiles

38

para conocer: los microorganismos que pueden utilizar el polietileno de baja

densidad (LDPE) como fuente de carbono y de energía, también los cambios

que ocurren en las poblaciones microbianas a través del tiempo, por ejemplo:

las enzimas liberadas, los metabolitos producidos, los cambios en la biomasa a

través de todas las etapas de crecimiento, etc.

5.4.1 Técnicas instrumentales utilizadas para estudiar la biodegradación

del (LDPE)

En la siguiente tabla se enlistan muchas de las técnicas que se han utilizado en

el estudio de la biodegradación del polietileno de baja densidad LDPE y las

otras variantes del polietileno.

Tabla 10 Técnicas utilizadas para estudiar la biodegradación del Polietileno de baja densidad LDPE

Técnica Nombre permite obtener Referencia

AAS Espectroscopia de absorción atómica (del inglés: Atomic absortion spectroscopy)

Permite determinar la concentración de un elemento las de las impurezas de los catalizadores o aditivos, se basa en la ley de Lambert beer.

[203]

AFM Microscopia de fuerza atómica, (del inglés: Atomic Force Microscopy)

El efecto de la biodegradación en la superficie del PE

[71, 160, 231, 119]

DMTA o DMA análisis Dinámico térmica mecánica

Fuerza mecánica, elongación a falla y módulo del polímero

[154, 57]

DSC Calorimetría por escaneo diferencial (del inglés: Differential Scanning calorimetry)

Temperatura de fusión y de Transición vítrea

[106, 168, 16, 147, 110, 85, 65, 109, 111, 71] [169, 112, 65, 201, 205, 232, 233, 126, 234, 235] [67, 189, 197, 115, 198, 57, 179]

EFM Microscopia de epifluorescencia (Epifluorescence microscopy)

Crecimiento de la biomasa

[117, 139, 41] [96, 47, 160, 119]

Electroforesis Electroforesis Determinación de la especie de microorganismo y sus proteínas, también para el aislamiento de plásmidos.

[132, 32, 80, 130]

EA Analizador elemental(Elemental Analyzer)

Permite determinar el contenido de carbono

[67, 196, 80, 197]

EDS Espectroscopía de dispersión de electrones (Electron dispersion Spectroscopy)

Permite encontrar la composición elemental (aditivos) de una muestra de polímeros

[157]

ESR o EPR Espectroscopia de resonancia paramangenetica electrónica (Electron spin resonance)

Estructura de los metabolitos y reactividad de los intermedios

[70]

ESI-MS Electron Spray Ionization ion trap Mass Spectroscopy

identificación de macromoléculas como proteínas y metabolitos

[80, 119]

FTIR-ATR o FTIR

Espectroscopia infra roja con transformada de Fourier

Cambios químicos, Cristalinidad.

(Fourier Transformed infra-red spectroscopy with Atenued refractance)

[156, 168, 65, 111, 236, 109, 122, 96, 231, 208] [127, 126, 106, 120, 16, 174, 83, 67, 62, 90] [232, 110, 233, 207, 235, 188, 170, 117, 47, 105]

39

[95, 149, 139, 135, 93, 145, 166, 237, 92, 202] [124, 132, 31, 196, 238, 84, 189, 155, 69, 211] [41, 119, 11, 158, 123, 133, 148, 221, 197, 116] [198, 66, 173, 82, 162, 57, 74, 179, 157, 33]

GCMS

Cromatografía de gases acoplada a espectroscopia de masas (Gas Chromatography coupled with mass spectroscopy)

CO2 evolución y Caracterización de los subproductos de la biodegradación. Y también la degradación Tanto térmica como foto lítica.

[65, 131, 143, 90, 87, 65, 111, 109, 236, 47] [79, 165, 51, 156, 122, 28, 131, 93, 80, 41] [74]

HT-GPC o SEC HT-SEC

Cromatografía de permeación en gel (gel permeation chromatography, size exclusion chromatography)

Distribución del Peso molecular Densidad, ángulo de contacto, viscosidad, distribución del peso molecular.

[67, 176, 85, 65, 69, 47, 239, 169, 112, 154] [149, 79, 96, 153, 170, 196, 119] [104, 149, 151, 69]

HPLC Cromatografía líquida de alto desempeño (High performance liquid chromatography)

Peso molecular y poli dispersidad, metabolitos como lípidos

[196, 155]

Instron universal test machine u otro

Tensiómetro, Extensómetro

cambios mecánicos, elongación tensión

[163, 67, 176, 71, 72, 160, 13, 240, 191, 155] [205, 232, 233, 206, 207, 94, 125, 188, 156, 151] [117, 11, 123, 28, 95, 190, 92, 62, 31, 196] [197, 116, 198, 57, 179, 33]

ICP-OES Espectroscopia de emisión dual de plasma y óptica (inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy)

Para determinar la existencia de otros elementos traza como metales.

[67]

MALDI-TOF MS Espectroscopia de masas con Matriz asistida por desorción laser con tiempo de vuelo (Matrix assisted Laser Desorption time of flight)

Técnica de espectroscopia de masas que permite identificar Metabolitos generados y las proteínas para la identificación microbiológica

[65]

OM Microscopia óptica

Visualización de los microorganismos para una identificación preliminar

[154, 131, 102, 87, 132, 241, 91, 148, 81, 33]

NMR

Resonancia magnética Nuclear

Determina los aditivos [170, 96, 196, 80]

PCR Reacción en Cadena de la polimerasa (Polimerase chain reaction)

Clonación de los genes vinculados con la biodegradación, ejemplo: alcano hydroxylase gene alkb

[32, 84, 80, 155, 242, 158, 123, 128, 130]

SEM Microscpia electronica de escaneo Scanning electron microscopy

Erosión superficial(morfología)

[32, 106, 40, 117, 174, 67, 90, 147, 65, 109] [47, 239, 111, 96, 143, 155, 112, 65, 191, 167] [205, 139, 232, 233, 206, 234, 125, 188, 51, 156] [168, 127, 93, 101, 166, 237, 92, 102, 202, 124] [31, 196, 238, 170, 211, 208, 41, 119, 158, 123] [133, 148, 81, 209, 77, 116, 129, 82, 57, 179] [157, 33]

TGA Análisis Temperatura de [106, 168, 196, 238, 84, 80, 211, 208, 119, 158]

40

Termo gravimétrico

fusión y de Transición vítrea, también de descomposición térmica o degradación.

[197, 57]

TLC Cromatografía de capa fina (Thin lawyer chromatography)

Caracterización de los subproductos de la degradación.

[65, 105]

UVS Espectroscopia de ultravioleta y visible (UV-visible spectrophotometry)

Determinación de la concentración de biomasa o de la actividad de una enzima y la pureza del DNA

[117, 65, 160, 134, 124, 126, 238, 231, 73, 163] [128, 197, 127, 129, 75, 82]

XRD XSP WAXS SAXS (EDXA) (EDXMA) (EDAX)

Difracción de rayos x(X- Ray difracción) (Estructura cristalina y amorfa) del polímero y sus aditivos

[111, 152, 109, 65, 92, 80, 155, 179, 157] [119] [65] [65] [93]

X- RAY Photoelectron Spectroscopy

Wide angle X-ray scattering

Espectroscopia de rayos x en ángulo pequeño Small angle X-ray spectroscopy9+

energy dispersive X-ray analysis (or energy dispersive X-ray microanalysis)

XRF Fluorescencia de Rayos X, es un analizador de elementos para determinar aditivos

[170]

5.4.1.1 Técnicas espectrofotométricas, microscópicas y espectrométricas

para el estudio de la degradación del LDPE

De todas las técnicas encontradas, gran parte son técnicas espectrofotométricas microscópicas y espectrométricas, las cuales se basan en la interacción entre la materia (el polietileno de baja densidad LDPE) y la energía, cada uno de los sus átomos, absorbe, difracta o refleja la energía que se emite por las distintas fuentes, como son: los fotones de las distintas radiaciones electromagnéticas, (microondas, infrarrojas, visibles, ultravioletas, rayos X, etc.,) flamas (energía térmica), los electrones acelerados, etc., las cuales excitan sus electrones emitiendo señales que son registradas por detectores y procesados en ordenadores para ser finalmente analizados, de esta manera proporcionan datos relevantes sobre el material, como son: la composición química, cristalinidad, morfología superficial, análisis de los aditivos proporcionados, formación de radicales u otras especies y en la observación de los microrganismos que atacan el polietileno de baja densidad LDPE etc., todas estas técnicas son no destructivas, exceptuando las espectrométricas, todas son versátiles y muy sensibles, y todos los grandes avances en los estudios sobre biodegradación de LDPE no serían posibles sin la utilización de las técnicas espectrofotométricas, espectrométricas y microscópicas, a continuación se mencionara algunas.

41

5.4.1.1.1 Microscopia electrónica de barrido (SEM)

El microscopio electrónico de barrido, conocido por sus siglas en ingles SEM,

utiliza electrones en lugar de luz para formar una imagen. Para lograrlo, el

quipo cuenta con un dispositivo (filamento) que genera un haz de electrones

para iluminar la muestra, después los electrones que interactuan con la

superficie de la misma se capturan con detectores que transforman esas

señales en información valiosa como las formas, textura y composición química

de sus constituyentes [243].

La microscopia electrónica de barrido (SEM) tiene diversas aplicaciones en los

estudios de la biodegradación del polietileno de baja densidad. Porque permite

apreciar la morfología superficial de las capas del polímero, de esa manera se

pueden ver los pequeños cambios superficiales y la colonización microbiana,

las pequeñas imperfecciones estructurales, las separaciones entre diferentes

polímeros, etc. Las muestras son generalmente cubiertas con polvo de oro o

algunos iones metálicos antes de la examinación con SEM. La técnica de

presión variable SEM es útil en la observación directa sin ningún tipo de

metalización de la superficie a una adecuada magnificación [244].

5.4.1.1.2 Microscopia de fuerza atómica

La microscopía de fuerza atómica o AFM es un método para ver una superficie en su integridad. El método se aplica a materiales sintéticos, suaves y duros también a estructuras biológicas (tejidos, células, biomoléculas) [245].

5.4.1.1.3 Espectroscopia UV - visible

Todas las moléculas orgánicas e inorgánicas absorben en el ultravioleta y el visible, cuyas longitudes de onda medida en nanómetros, van desde los (200nm a los 800nm), siendo ésta la energía necesaria para excitar sus electrones, cuando se registra su absorbancia en todas las longitudes de onda pertenecientes al UV-visible se genera una huella única para cada molécula (espectro), además la intensidad de la absorbancia es directamente proporcional a la concentración, de acuerdo a la ecuación de Lambert Bourger Beer, el espectrómetro UV- visible permite observar tanto el espectro como su intensidad de esa manera puede identificar las moléculas y cuantificarlas. La espectroscopia UV- Visible es una técnica muy poderosa, por su increíble versatilidad, puesto que unida a otras técnicas como la quimioluminicencia CL y la cromatografía de capa fina TLC, permite un sin número de usos, entre los cuales están: la identificación de microorganismos por medio de la quimio taxonomía, análisis de viabilidad o crecimiento de biomasa, análisis de la actividad enzimática, actividad metabólica, cuantificación de proteínas y ácidos nucleicos, permite evaluar la hidrofobicidad de la superficie celular de acuerdo a la turbidez (prueba BATH), etc.

42

5.4.1.1.4 Espectroscopia Infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)

La espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR) utiliza el hecho

de que las moléculas orgánicas absorben determinadas frecuencias en el

infrarrojo que son características de su estructura. Dichas absorciones son

frecuencias de resonancia, es decir, la frecuencia de la radiación absorbida

coincide con la frecuencia del enlace o del grupo que vibra.

La espectroscopia infrarroja con transformada de fourier FTIR permite

incontables aplicaciones entre las que están: La elucidación de estructuras

químicas y físicas, la observación de puentes de hidrógeno, la detección de

grupos terminales, el análisis de las reacciones de degradación, el análisis del

comportamiento de entrecruzamiento de las moléculas y el análisis de la

composición de copolímeros en forma líquida y sólida etc [244].

5.4.1.1.5 Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR)

El fenómeno de la resonancia magnética es consecuencia de que existen

sistemas físicos (átomos, iones, núcleos, etc.) que poseen momento

magnético permanente. En presencia de un campo magnético, ese momento

interactúa con el campo y se produce desdoblamiento en los niveles

energéticos del sistema (efecto zeeman) [246].

La NMR Permite determinar la fracción soluble, la fuerza de tensión y los

cambios en el peso molecular, es un método indirecto de evaluación porque no

da ninguna idea de los cambios químicos del polímero. La espectroscopia NMR

(1H and 13C NMR) es el método más versátil que se puede usar como

herramienta analítica para muchos estudios de biodegradación del polietileno

de baja densidad LDPE [184, 244].

5.4.1.1.6 Desorción láser asistida por la matriz con detección de masas por

tiempo de vuelo MALDI-TOF MS

En la técnica de análisis (MALDI) (matrix-assisted laser desorption/ionization), el

analíto es primero cristalizado en una matriz con un gran exceso de un

compuesto, usualmente un ácido orgánico débil absorbente de ultravioleta (UV),

después del cual se le dispara radiación laser a la mezcla analíto matriz,

resultando en la vaporización de la matriz la cual porta el analíto.

Subsecuentemente la matriz absorbe la energía del láser y ioniza la muestra

puesto que le quita o dona electrones, por lo que la ionización es indirecta [247],

el analizador es de tipo de tiempo de vuelo o TOF (del inglés time of flight).

La MALDI permite una vaporización no destructiva y una ionización de

pequeñas y grandes biomoléculas, proporcionando una caracterización del

peso molecular y la distribución de las masas moleculares de los distintos

productos de la degradación del polietileno.

43

Permite la identificación de microorganismos biodegradadores de LDPE,

mediante el análisis de proteínas, principalmente ribosomales, a partir de

colonias o directamente de muestras a través de la creación de un espectro de

masas el que es específico para cada especie [248]. La implementación de

MALDI-TOF MS es sencilla, necesitando sólo un par de días para la

capacitación del personal, la identificación es rápida y el costo por cada muestra

es inferior al costo de otros métodos diagnósticos [248]. Esta tecnología ha

demostrado ser confiable, específica y rápida para la identificación de distintas

bacterias aeróbicas y anaeróbicas [248].

5.4.1.1.7 Espectrometría con Plasma Inductivamente acoplada a Emisión

Óptica ICP-OES

La espectroscopia con plasma inductivamente acoplada (ICP/OES) es una

herramienta poderosa para la determinación de metales en una variedad de

diferentes matrices de muestras [249]. La técnica se basa en la emisión

espontanea de fotones de los átomos y iones que han sido excitados en una

descarga de radiofrecuencia RF [249]. Presenta la mayor sensibilidad al

detectar hasta ultra trazas (ppq-ppb) [250].

En esta técnica una muestra liquida es inyectada bajo una fuente de plasma de

argón inducido por radiofrecuencia, usando una variedad de nebulizadores o

alguna técnica de introducción de muestras [249].

La ICP/OES puede ser acoplada a la cromatografía de gases (GC) o a la

cromatografía liquida de alto-desempeño (HPLC), lo que potencia el

desempeño de las técnicas cromatográficas y aumenta su sensibilidad, por lo

tanto es útil para la determinación de los metales presentes en el polietileno,

pertenecientes a impurezas, aditivos o catalizadores [249].

5.4.1.1.8 Espectroscopia de difracción de rayos x, XRD

La espectroscopia de difracción de rayos x (XRD) se fundamenta en que

cuando un haz monocromático de rayos x se enfoca en un cristal, éste forma

patrones de difracción y estos patrones reflejan las características

fisicoquímicas de las estructuras del cristal [251].

La espectroscopia de difracción de rayos x permite identificar, la

microestructura, el tamaño de los cristales y la orientación de las cadenas de

polietileno, también permite cuantificar el grado de cristalinidad del polietileno,

pues ningún polietileno es 100% cristalino (polimorfismo), siendo esto

importante porque la biodegradación se facilita en las regiones amorfas, y

también la cristalinidad misma varia en virtud del proceso de deterioro, de esta

manera se siguen los pasos del proceso de biodegradación [252].

44

5.4.1.1.9 Espectrometría Fluorescencia de rayos X, XRF

La microscopia de fluorescencia se involucra la emisión de un fotón de rayos X

después de la ionización del átomo por un haz primario de rayos X, el fotón de

rayos X del tubo impacta la muestra donde interactuara con un electrón de las

capas internas del átomo, sacando el electrón del orbital, este espacio vacío se

llena prontamente por un electrón de las capa superior, este electrón tiene una

mayor energía que el electrón que lo remplaza, esta energía en exceso se

expulsa en forma de rayos x con una longitud de onda específica para el átomo

[250].

La técnica XRF permite encontrar elementos que van desde el Sodio al Uranio,

en estado sólido o líquido, en forma de capas delgadas o bulbosas, con un

amplio y dinámico porcentaje, requiere mínima preparación, es no destructiva,

permite un análisis rápido y multi elemento, es transportable a el campo de

análisis, bajos costos de mantenimiento y operación. Permite el estudio de

metales traza en el polietileno de baja densidad LDPE con muy buena

sensibilidad y un costo relativamente bajo [250].

5.4.1.1.10 Espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica

EPR

La espectroscopia paramagnética electrónica EPR es una forma de

espectroscopia de absorción de microondas, en la cual las transiciones se

inducen entre los niveles de energía de zeeman de electrones no apareados

[253].

Mientras que la NMR es una técnica espectroscópica estándar para la

determinación estructural de las moléculas, la estrechamente relacionada

espectroscopia EPR es aun escasamente conocida por muchos científicos

[254].

Esta discrepancia es originada por la carencia de sistemas naturales

paramagnéticos debido a el hecho de que la formación de enlaces químicos es

inherentemente acoplado al emparejamiento de dos electrones y como

resultado general un espín electrónico de cero, S= 0 [254].

El método está restringido a unos pocos sistemas paramagnéticos como son,

los complejos de metales de transición y los radicales libres, únicos que

poseen un electrón residual, siendo esto ventajoso por la selectividad que

presenta [254].

Cuando hay una ruptura de los enlaces covalentes en una molécula de

polietileno de baja densidad LDPE, se forman radicales libres inestables cuyo

carácter paramagnético los hace fácil de detectar e identificar con la EPR,

siempre y cuando la concentración de radicales este en los límites de

sensibilidad (̴1012 radicales) [253].

45

5.4.1.1.11 La espectroscopia de absorción atómica (AAS)

La espectroscopia de absorción atómica AAS por sus siglas en inglés Atomic

absortion spectroscopy, es una técnica analítica que mide la concentración de

los elementos. La absorción atómica es tan sensible que puede medir valores

menores a partes por mil millones de gramo (µg dm-3) en una muestra. La

técnica utiliza las longitudes de onda de luz absorbidas específicamente

absorbidas por un elemento. Las que corresponden a las energías necesitadas

para promover electrones de un nivel de energía a otro de mayor energía [255].

Se aplica en el análisis de los elementos traza presentes en el polímero.

5.4.1.2 Técnicas cromatográficas para el estudio de la degradación del

polietileno de baja densidad LDPE

La definición de la IUPAC (unión internacional de química pura y aplicada) de

cromatografía es:

“Un método físico de separación, en el que los componentes a separar se

distribuyen en dos fases, una estacionaria y otra que se mueve en una dirección

definida” [256].

Estos compuestos químicos, pueden ser compuestos orgánicos de moderada

masa molecular tales como ácidos grasos y muchos otros metabolitos, también

polímeros tales como ácidos nucleicos, proteínas o cadenas

macromoleculares, como las que componen el polietileno de baja densidad, por

lo tanto son muy utilizadas en los estudios sobre la degradación del polietileno

de baja densidad LDPE, porque permiten estudiar el cambio en la longitud de

las cadenas del polietileno de baja densidad LDPE, identificar microorganismos

solamente observando su perfil de ácidos grasos, analizar sus enzimas y el

material genético y hasta cuantificar la mineralización del polietileno, la

cromatografía se clasifica en cromatografía de partición y adsorción, siendo la

de partición en fase estacionaria líquida y la de adsorción en fase estacionara

sólida, aunque este trabajo no pretende un estudio de tallado de estas técnicas,

se mencionaran brevemente algunas de estas.

5.4.1.2.1 Cromatografía de gases acoplada a masas GCMS

La cromatografía de gases GC es un método cromatográfico común que se

basa en las diferencias en comportamiento de partición entre un flujo de fase

móvil y una fase estacionaria en orden de separar compuestos orgánicos o

inorgánicos volátiles o semivolatiles [244]. Es una de las técnicas más versátiles

y ubicuas en los laboratorios por ser sencilla, rápida, eficiente y sin lugar a duda

su aporte en el estudio de la biodegradación del LDPE es excepcional, por que

con esta técnica se pueden separar mezclas muy complejas, [257].

La GC técnica se usa para la identificación y cuantificación de monómeros o

solventes residuales en el LDPE, para el análisis de componentes volátiles o

impurezas, para la verificación de los niveles de aditivos en el LDPE, para la

46

cuantificación de contaminantes traza, para el análisis de los productos finales

de la biodegradación como el CO2, CH4, para el análisis de otros metabolitos

generados por los microorganismos, etc., un numero de detectores

especializados están disponibles, incluyendo ionización en flama FID (del inglés

flame ionization), emisión atómica AED (del inglés atomic emission), flama

fotométrica FPD (del inglés flame photometric) y conductividad térmica TCD (del

inglés thermal conductivity). Adicionalmente está disponible la espectrometría

de masas (MS), que permite una gran flexibilidad en evaluaciones cualitativas y

cuantitativas del polietileno [258], cuando se acopla con la espectroscopia de

masas como sistema de detección, es posible la identificación de virtualmente

todos los eluados con una muy alta sensibilidad, creando un sistema analítico

muy poderoso [257].

5.4.1.2.2 Cromatografía de líquidos de alta eficiencia HPLC

La técnica HPLC es el análogo de la cromatografía de gases pero, en fase

liquida, el secreto de su éxito son las partículas pequeñas y uniformes que

producen poca difusión arremolinante y su máxima transferencia de masa,

además permite analizar compuestos poco volátiles o estables [257].

La cromatografía liquida de alta presión (HPLC) es ampliamente usada para

separar moléculas en base a su tamaño. El principio de la técnica es que las

moléculas mayores eluirán primero, a medida que estas pasan a través de los

espacios en la columna, mientras más pequeñas sean estas eluiran

posteriormente porque estas tomaran mayor tiempo en pasar atravesar los

poros in el gel. La HPLC se usa para analizar los productos de la degradación

metabólica de los xenobióticos. Pudiéndose observar los productos de

biotransformación como son: el estireno, epoxistireno, fenilacetaldehido, y 2-

feniletanol etc. Los cuales fueron detectados por la cromatografía líquida de

alta presión en fase reversa [244].

5.4.1.2.3 Cromatografía de exclusión por tamaño o de permeación en gel

Es un método en el que la fase estacionaria es una malla o criba molecular, se

usa en columnas abiertas con alimentación por gravedad para separaciones

de preparación, y para separaciones de alta eficiencia [257]. Estas mallas son

carbohidratos poliméricos y acrilamidas que tienen una red abierta formada por

el entrecruzamiento de cadenas poliméricas, son hidrófilas, por lo que son

capaces de absorber agua e hincharse, causando la abertura de su estructura

[257]. El grado de entrecruzamiento determina el tamaño de los poros [257].

Las moléculas más grandes no penetraran en los poros por lo que eluirán más

rápido, y solo las más pequeñas quedaran atrapadas en los poros

permaneciendo en la malla.

La cromatografía de permeación en Gel (GPC) o cromatografía exclusión por

tamaño (SEC) se usa en la determinación de la distribución de las masas

47

moleculares del polietileno de baja densidad para determinar los cambios en el

peso molecular después de la biodegradación [244].

5.4.1.3 Técnicas de análisis de sus propiedades mecánicas: Pruebas de

tensión tensile test

También conocida como test de tensión, son probablemente los tipos de pruebas más fundamentales que se pueden realizar en cualquier material, las pruebas de tensión son simples, relativamente baratas, y completamente estandarizadas, mediante la tensión a cualquier material se puede determinar como el material reacciona ante las fuerzas aplicadas, se analiza la resistencia a la tensión, conociendo que tanto se estira [30]. Las propiedades mecánicas son medidas con el módulo de elasticidad, la resistencia a la tensión y la elongación del material, obtenidas a partir de los ensayos de tracción en la maquina universal de ensayos Instron. La cual ha sido estandarizada en la norma ASTM D638 “método test estándar para las propiedades de los plásticos”. El deterioro del polietileno de baja densidad LDPE se puede evaluar por el cambio en sus propiedades reológicas, estas propiedades dependen directamente en el peso molecular del polímero, su cristalinidad y la presencia de las ramificaciones y los efectos de cruzamiento, etc., [259].

5.4.1.3.1 Resistencia a la Tensión

Se mide como la fuerza medida por la celda de carga al tiempo de ruptura

dividido por la sección del área cruzada original de la muestra al punto de

sección cruzada mínimo.

5.4.1.3.2 Módulo de Tensión y la elongación hasta la ruptura

El Módulo de Tensión es la pendiente de la porción lineal de la curva estrés –

tensión, y la elongación de él espécimen hasta la ruptura se mide en términos

de su longitud inicial (L0) y longitud final

(L1), y es dado como:

𝐸𝑙𝑜𝑛𝑔𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ℎ𝑎𝑠𝑡𝑎 𝑙𝑎 𝑟𝑢𝑝𝑡𝑢𝑟𝑎

= (𝐿1 − 𝐿0)

𝐿0∗ 100

5.4.1.4 Técnicas de análisis térmico

El análisis térmico comprende el estudio de la evolución de las propiedades de

una muestra o compuesto cuando es sometida a un calentamiento a altas

temperaturas.

Es una familia de técnicas denominadas análisis térmico, los miembros usados

en los estudios de biodegradación del LDPE son: la calorimetría de escaneo

diferencial DSC (del inglés differential scanning calorimetry), el análisis termo

gravimétrico TGA (del inglés thermo gravimetric analysis), y el análisis térmico

mecánico y dinámico DMTA (del inglés dynamic mechanical analysis). Sin

48

embargo existen muchas técnicas más, a continuación se en listan algunas

técnicas de análisis térmico.

Tabla 11 principales técnicas de análisis térmico, tomada de [260]

Propiedad Técnica Abreviación

Masa Termo gravimetría TG

Temperatura Análisis Térmico diferencial DTA

Entalpia Calorimetría diferencial de barrido DSC

Propiedades mecánicas Análisis termo mecánico TMA

Propiedades ópticas Termo microscopia TM

Propiedades magnéticas Termo magnetometría

Propiedades eléctricas Termo electrometría

Propiedades acústicas Termo sonometría TS

Evolución de gas radioactivo

Análisis térmico de emanación ETA

Evolución de partículas Análisis de termo partículas TPA

Todas las técnicas de análisis térmico son usadas para caracterizar una amplia

variedad de materiales, entre los que se encuentran los polímeros

termoplásticos como el LDPE.

5.4.1.4.1 Calorimetría diferencial de barrido DSC

La calorimetría diferencial de barrido DSC (del inglés Diferential Scanning

Calorimetry) permite el estudio de aquellos procesos en los que se produce una

variación de entalpia, por ejemplo determinación de calores específicos, puntos

de ebullición y de fusión, pureza de compuestos cristalinos, entalpías de

reacción y determinación de otras transiciones de primer y segundo orden [261].

La DSC puede trabajar desde la temperatura del nitrógeno líquido hasta unos

600°C [261].

El polietileno presenta precisamente todas sus transiciones térmicas en ese

intervalo. Por esta razón se emplea en la caracterización del LDPE, para

estudiar: la temperatura de transición vítrea Tg, la temperatura de fusión, las

reacciones de polimerización, los procesos de curado, el análisis de

polimorfismos, la cinéticas de reacción, el tiempo e inducción a la oxidación y

descomposición, también se pueden hacer estudios de compatibilidad de

mezclas del LDPE con otros polímeros [261].

5.4.1.4.2 Análisis térmico mecánico y dinámico DMTA

Es una técnica empleada en el estudio de las propiedades viscoelasticas de un

material, basada en la aplicación de energía mecánica mediante perturbaciones

sinusoidales en la zona elástico lineal de los ensayos esfuerzo- deformación

con el fin de determinar sus propiedades dinámicas [262].

El análisis térmico mecánico dinámico DMTA (del inglés Dynamic Mechanical

Analysis), permite estudiar la respuesta del polímero a las solicitaciones

49

exteriores en un amplio intervalo de tiempos y temperaturas, y también permite

observar propiedades como: la transición vítrea, relajaciones secundarias,

copolímeros, compatibilidad de mezclas, orientación, resistencia al impacto,

presencia de agua, polímeros naturales, peso molecular, irradiación, reacciones

de curado, envejecimiento físico, adhesión y fricción, aislamiento acústico,

fluorescencia [262].

5.4.1.4.2.1 Análisis Termo Gravimétrico TGA

El análisis termo gravimétrico TGA (del inglés Thermogravimetric analysis)

provee una información de caracterización complementaria y suplementaria

para la técnica térmica más comúnmente usada, la DSC [263].

La TGA mide la cantidad y tasa (velocidad) de cambio en la masa de una

muestra de polietileno como una función de la temperatura o el tiempo en una

atmosfera controlada [263].

Las medidas son usadas primeramente para determinar las estabilidades

térmicas y/o oxidativas del material (polietileno de baja densidad), también sus

propiedades composicionales. La técnica puede analizar muestras de

polietileno de baja densidad LDPE que exhiban tanto pérdida de masa como

ganancia debido a la descomposición, oxidación o pérdida de compuestos

volátiles (tal como la humedad). La técnica permite distinguir sutiles pero

importantes diferencias entre varias muestras de polietilenos como: la cantidad

de aditivos, grado de cristalinidad, el análisis composicional de mezclas de

polietilenos, cinética de la descomposición, bajos niveles de volatiles etc [263].

5.4.2 Métodos y pruebas utilizados en los estudios de biodegradación del

polietileno de baja densidad LDPE

Existen muchos métodos que permiten estudiar la biodegradación del

polietileno, algunos han sido diseñados y estandarizados por organizaciones

como la: organización internacional de estándares o ISO (del inglés

International Standard Organization) y la sociedad americana de pruebas y

materiales o ASTM (del inglés American Society for Testing and Materials), los

métodos tienen múltiples propósitos, pueden interesarse en las condiciones de

la biodegradación, en los productos, en los microorganismos, etc.

A continuación se presentaran todos los métodos que se encontraron en los

artículos publicados sobre biodegradación de polietileno de baja densidad.

Tabla 12 Test y métodos de cultivo usados para evaluar la biodegradación del LDPE. Adaptado de [264]

Nombre del Test Características Referencias

Prueba de biodegradación

Stürm test (OCDE 301B, ISO 14852, ASTM D5988–03 KS

[51, 127, 101, 92, 62, 196, 32, 73, 201, 128] [40, 81, 209, 197]

50

respirometrica Stürm (del inglés respirometric biodegradation tests.)

M3100-1:2002;MOD ISO 14855:1999, prEN 14046) o variantes para obtener la evolución de CO2.

Prueba de adherencia a hidrocarburos BATH (por sus sigla en inglés bacterial adhesion to hidrocarbons)

Adhesión bacteriana a hidrocarburos, para la evaluación de la hidrofobicidad de la superficie celular bacteriana.

[160, 237, 126, 73, 106, 127, 129]

Prueba de salado SAT (por sus siglas en inglés: salting out test)

El Test de agregación de sal para medir la hidrofobicidad de la superficie celular.

[106]

Demanda biológica de oxigeno BOD (del inglés Biological oxigen demand)

Test sobre la demanda de oxígeno en medio líquido o en medio solido es (ISO 14851) recomendado por 117 días

[238, 73, 163, 158, 128]

Prueba de composta CP (del inglés Compost test)

Test Compost bajo condiciones de laboratorio (ISO/DIS 20200, EN 261085, ISO 14855 y ASTM D5958, ASTM 5338-98. ) recomendado por 50 días

[104, 67, 92, 202, 11, 239, 194, 133, 197]

Condiciones Anaeróbico (ASTM D5210) por 58 días pruebas

anaeróbicas [214]

Prueba de degradación Headsp 25°C (Biodegradation Assays).

En un Erlenmeyer cerrado a 25°C (OCDE 301D, ASTM D5988-96 o modificado 30°C o 37°C ) recomendado por 48 días

[96, 237, 88, 238, 161, 84, 117, 41, 119, 128] [162, 74, 179]

Prueba de degradación (Headsp 50°C)

En un Erlenmeyer cerrada a 50°C (OCDE 301D, ASTM D5988-96 modificado) recomendado por 48 días

[48, 104, 126, 158]

Compost a escala piloto Test Piloto de compost (EN 14045) o KS método estandar para determinar biodegradación aeróbica bajo condiciones compostaje controladas ASTM D M3100-1:2002; MOD ISO 14855:1999. por 84

días

[104, 67, 92, 202, 99, 135, 196, 32, 214, 194] [209]

Prueba de enterramiento en suelo SOT (del inglés Soil burial test ) (lab)

Test en suelo reconstruido en el laboratorio (DIN 53739) ISO 846/2000, ASTM D 5988 (ASTM D 5988-09) ASTM D 5338-98. En un suelo de jardín ASTM D 5247–92.

[15, 190, 92, 62, 202, 265, 201, 113, 9, 196] [164, 78, 72, 194, 133, 209, 115, 179]

Prueba de suelo de Agricultura (en inglés agriculture soil test)

Test de muestra enterrada en suelo real para agricultura

[16, 104, 132, 208]

Prueba de zona de color o clara(en inglés Color zone assay) o clear zone test

La eficiencia se determina por el color de la zona formada en los platos solidos emulsificados con LDPE-. Indicador Purpura de Bromocresol para detectar algún cambio en el pH of el medio.

[75, 144]

Pruebas de enzimas (en inglés Enzime test)

Test Enzima, lacasa test con laccase screening médium, LSM.

[134, 124, 174, 155, 16, 82]

Estudio de absorción de agua (WAS del inglés Water Absorption Study)

De acuerdo a las normas ASTM D1037 -99, ASTM D-570.immersion de una muestra15xl5x3mm en agua destilada a temperatura ambiente se mide el peso ganado. Para biopolímeros hidrófilos como el almidón plastificado.

[190, 211, 208, 116, 179]

Valoración cuantitativa De acuerdo a la norma ASTM G21-90 se [198]

51

del crecimiento de hongos( en inglés Quantitative assessment)

cuantifica el crecimiento de biocapas de hongos en cajas petri sobre el polietileno

Prueba de viabilidad metodo de conteo de platos (viability tests) (plate counting method or others )

Número más probable en orden de examinar el cambio de la actividad de las bacterias en el suelo durante la prueba, conteo microbiano por el estudio de las UFC, también las Pruebas Redox, CTC- Fluorescente y TTC (2, 3, 5- cloruro trifeniltetrazólio) como indicadores de viabilidad.

[62, 92, 156, 132, 238, 84, 163, 16, 119, 242] [209, 77, 116, 127, 157]

Prueba de cultivo liquido (Liquid culture test)

La degradación se cuantifica por la estimación de carbón orgánico total soluble en agua (TOC) y pH de los medios de cultivo

[144]

Condiciones de exposición marina (Marine exposure conditions)

Se sumerge a 3 m conectados a un flotador, y se deja desde varios meses a un año, se analiza las condiciones del mar, pH, OD, salinidad, etc.

[188, 231, 240, 266]

Índice de flujo fundido MFI (del inglés Melt flow index,

De acuerdo a la norma ASTM D1238, ASTM D3418. Con probador MFI para el análisis de la temperatura de fusión del polímero.

[208, 221, 198, 179]

Cultivo en cajas Petri con PE (en inglés polymer containing agar (MSM) plates)

Se siembra en medios selectivos con PE como fuente de carbón Método de conteo de plato, método de zona clara, ASTM G21.

[32, 161, 80, 16, 119, 123, 69, 91, 128, 114] [51, 116, 82, 179, 175, 157, 144]

Pruebas de tinción pruebas bioquímicas y microscópicas (en inglés Gram staining Biochemical test Macroscopic test)

Características, Identificación y Caracterización de los Microorganismo

[76, 134, 237, 145, 135, 48, 124, 132, 99, 267] [73, 16, 11, 123, 241, 91, 128, 75, 175, 157]

Quimioluminiscencia de ATP

La Quimioluminiscencia de ATP permite el estudio de la Biomasa.(actividad metabólica de la célula)

[96, 122, 84]

Secuenciación molecular o en inglés (Molecular level (16S rRNA, or 18S rRNA gene sequencing) test

Secuenciación del 16s rRNA o 28S rRNA que Permite identificar las especies de hongos o bacterias que degradan el LDPE.

[122, 168, 95, 126, 32, 73, 106, 84, 80, 63] [41, 119, 242, 158, 123, 128, 81, 127, 129, 130] [157]

Análisis de PCR (en inglés (RAPD)-PCR Analysis)

Random Amplified Polymorphic DNA para realizar un perfil del DNA

[242]

Viscosidad y peso molecular V MW (del inglés viscosity molecular weight)

Viscosidad y Peso Molecular promedio es la correlación entre la viscosidad intrínseca del polietileno y su peso molecular fue usado para estimar la reducción en el número promedio del peso molecular (Mn)

[126]

Actividad metabólica, cuantificación de proteína

Análisis de Biomasa. (actividad metabólica de la célula) Fluoresceína di acetato FDA, TTC reducción test, ATP test, método Lowry para cuantificar la proteína celular total.

[96, 106, 160, 126, 170, 123, 241, 127, 129, 82]

Prueba de acidos grasos FAME (del inglés Fatty acid methyl ester

Análisis de los productos de la degradación e identificación de los microorganismos

[80]

52

Todos los métodos desarrollados y realizados por los autores se enfocan en múltiples aspectos de interés, tales como son: las condiciones, tanto previas y como durante los experimentos, tiempos, variables a analizar, el tipo de material, microorganismos utilizados, entre muchas otras. A continuación se explicaran brevemente algunos métodos de acuerdo a la variable a estudiar.

5.4.2.1 Métodos principales de cultivo de microorganismos degradadores

de LDPE

En la biodegradación del LDPE, sin importar el tipo de medio de cultivo a utilizar, se debe tener en cuenta las siguientes variables: el tipo o tipos microorganismos, la disponibilidad de oxígeno, la cantidad disponible de agua, la temperatura, el ambiente químico, pH, electrolitos, etc. A continuación se presentan las aproximaciones generales a los métodos de cultivo utilizados en los experimentos de biodegradación del LDPE y las demás variantes.

analysis test

Pérdida de peso WL (del inglés Weight loss test)

Disminución del peso del LDPE, el cual esta estandarizado de

acuerdo a la norma ASTMD 5338 en un periodo de 90 días. [161, 126, 76, 125, 156, 16, 117, 83, 11, 90] [167, 71, 160, 231, 137, 99, 191, 234, 131] [207, 153, 106, 168, 16, 178, 172, 107, 94, 104] [50, 105, 127, 190, 138, 145, 166, 134, 89, 237] [202, 48, 124, 88, 238, 80, 158, 194, 241, 128] [114, 115, 82, 179]

Prueba mecánicas Mechanical tests

Estandarizados por las normas ASTM D882 ASTM D638, ASTM D638-99, ASTM A370. Se mide la resistencia a la tensión y % de elongación.

[117, 119, 123, 197, 116, 115, 208, 198, 57, 74]

Aclimatación natural en ingles Natural weathering

De acuerdo a la norma ASTM D 1435-99 se monta el PE en una plataforma

[179]

Prueba de Angulo de contacto del agua WCA (del inglés water contact angle test)

Angulo de Contacto con agua y Energía superficial, deposición de la gota. Grado de oxidación de la superficie del material

[120, 71, 266, 231, 119, 123]

Prueba de dureza HT (del inglés Hardness Test)

De acuerdo a la norma ASTM D2240 en modelo Durometer

[116]

53

5.4.2.2 Medios para la realización de las pruebas

De acuerdo al sitio o lugar que proporciona el tipo de medio de cultivo se puede dividir en tres modalidades básicas:

5.4.2.2.1 Pruebas de campo (In situ o in vivo) con medios naturales

De ubicación natural, tales como: compost, rellenos, botaderos, etc., son medios naturales conocidos pero no controlados, lo que implica una irreproducibilidad en otros sitios y una aleatoriedad de las variables [259].

5.4.2.2.2 Pruebas de simulación con medios seminaturales

Son pruebas de biodegradación que se realizan a escala de laboratorio con medios seminaturales, con condiciones parcialmente controladas, los medios son conocidos y se pueden controlar en un nivel medio.

5.4.2.2.3 Pruebas de laboratorio (In vitro)

Son pruebas cuyas variables son casi completamente controladas, y se ubican en el laboratorio, los medios son conocidos y controlados con gran precisión, dando la posibilidad de comparar experimentos de diferentes laboratorios.

5.4.2.3 Los inóculos

Los inóculos que presentan los cultivos se pueden clasificar en dos categorías

básicas.

5.4.2.3.1 Cultivos con inóculos amplios o de consorcios

Son comunidades microbianas naturales, que contienen los microorganismos

que actuarían como una comunidad, como realmente lo hacen, sin embargo

hay que tener en cuenta que existe una fracción de microorganismos no

cultivable y que constituye el 90% de la biodiversidad real [268]. Generalmente

es lo primero que se aísla.

5.4.2.3.2 Cultivos microbianos axénicos

Los cultivos axénicos son cultivos con cepas microbianas puras, definidas con

medios simples y permiten deducir información concerniente al efecto

degradador y el mecanismo de biodegradación del LDPE que realizan los

determinados microorganismos [161].

5.4.2.3.3 De acuerdo a la composición de los medios se pueden clasificar

como:

5.4.2.3.4 Medios líquidos

Son medios libres de agar, contienen nutrientes minerales y suelen ser preparados en Erlenmeyer, son útiles como medios iniciadores o de enriquecimiento. Tienen la condición de permitir una competencia libre entre especies por los recursos, lo que genera selectividad.

54

5.4.2.3.5 Medios sólidos

Con una concentración de 1,5 al 2 % de agar, son útiles porque permiten hacer los análisis preliminares y no generan competencia por los recursos entre los microorganismos, excepto por la fuente de carbono que es la que genera la selectividad, por lo que sirven para identificar las colonias una vez estas sean pre seleccionadas para degradar LDPE.

A continuación se presenta una exposición de las ventajas y desventajas de las variaciones en los métodos de estudio de la biodegradación del polietileno de baja densidad y otras variantes. Tabla 13 Revisión de los métodos para el estudio de la degradación del LDPE, Adaptado de [42]

Todos los diferentes tipos de métodos de biodegradación son útiles e

importantes, por los datos que aportan, siendo todos complementarios, se

pueden centrar en: el entorno, los pretratamientos, los microorganismos y sus

eficiencias, etc.

5.4.2.4 Pretratamientos del LDPE

Los pretratamientos son opcionales, permiten simular y/o acelerar el proceso de

biodegradación natural, los siguientes fueron tomados de los trabajos de Nowak

[31].

Campo (In vivo)

Simulación Laboratorio (In vitro)

Proceso a. enterramiento de los muestras de plásticos en el suelo. b. ubicándolos en un lago o rio.

Enterramiento de las muestras de plásticos en compost, suelo o agua de mar ubicados en condiciones controladas (temperatura, pH, humedad).

Medios inoculados definidos con poblaciones microbianas definidas (ejemplo: .lixiviados,) o cepas microbianas individuales o enzimas las cuales podrían haber sido especialmente seleccionadas para el PE

ventajas Más fáciles y ampliamente usados, son más realistas en simular el proceso de biodegradación natural.

Prácticamente es lo más sugerido;

Mejores herramientas analíticas disponibles que serían usadas para las pruebas de campo.

1. hay una tasa más rápida de degradación que bajo condiciones naturales. 2. Preferido para muchas investigaciones sistemáticas.

Desventajas a. estas condiciones no pueden ser bien controladas. b. las oportunidades Analíticas para monitorear el proceso de degradación son limitadas.

Carencia de reproducibilidad debido a variada población microbiana

Este método no puede ser usado para probar la biodegradación en términos de metabolismo por un microorganismo

55

5.4.2.4.1 Aclimatación natural

La exposición al aire libre se realiza con muestras montadas en plataformas de prueba, orientadas bajo condiciones estándar para exponer el material al espectro completo de radiación junto a la temperatura y humedad de la lugar [179].

5.4.2.4.2 Aclimatación artificial / pruebas de laboratorio

Las pruebas de laboratorio comprenden el uso de cámaras ambientales y luces artificiales para aproximadamente replicar las condiciones exteriores pero con un tiempo reducido y mayores controles en las condiciones [179].

5.4.2.4.2.1 Ruptura por hidrólisis

La hidrólisis de las capas se lleva a cabo con buffer fosfato (pH 7.4) con azida de sodio para prevenir el crecimiento de microrganismos por 84 días [31].

5.4.2.4.2.2 Oxidación térmica

La foto- y /o termo degradación del LDPE se logra por la ubicación de las muestras en un horno adaptado para 16 días. Cada 24 horas, se cambia la locación de las muestras en una dirección en sentido de las manecillas del reloj [31].

5.4.2.4.2.3 Procedimiento de fotodegradación

Las láminas se ubican a 15 cm de la lámpara, entonces se irradian con UV usando lámpara de vapor a baja presión que genera energía entre los 280 nm and 370 nm, en atmosfera aire y a temperatura ambiente [31].

5.4.2.4.2.4 Procedimiento de termodegradación

La muestra se sujeta a calentamiento a 50°C a oscuras, y es expuesta al aire libre [31].

5.4.2.5 Pruebas de biodegradación

Las pruebas que estudian la biodegradación del LDPE pueden ser directas o

indirectas, lo cual significa que hay pruebas que permiten cuantificar el grado de

mineralización, (efecto final o directo) causado por los agentes abióticos y

bióticos al LDPE expuesto, y también hay pruebas que analizan los efectos

intermedios que ocurren antes del proceso de mineralización, estos podrían ser

por ejemplo: los metabolitos que se producen, la perdida de sus cualidades

fisicoquímicas, la alteración de su morfología, la formación de biocapas, entre

muchos otros cambios .

5.4.2.5.1 Prueba de enterramiento en suelo

El método de enterramiento en Suelo es uno de los métodos frecuentemente usados para la determinación de la biodegradabilidad del polietileno. En este método, la prueba de biodegradación se realiza bajo condiciones naturales o de laboratorio. Las muestras con un peso y dimensiones definidas se entierran a

56

una profundidad específica en el suelo, por diferentes intervalos de tiempo [269, 179].

5.4.2.5.2 Prueba de compostaje

Las condiciones ambientales de la prueba de compostaje son las siguientes: altas temperaturas (58 °C); condiciones aeróbicas; propio contenido de agua (cerca del 50%). compost maduro se usa como matriz sólida, como una fuente de microrganismos termófilos (inóculo), y como una fuente de nutrientes. El método se basa en la determinación de la evolución neta de CO2, i.e. el CO2 liberado de la mezcla de polímero en el compost menos el CO2 liberado del compost sin polietileno (blanco) probado en un reactor diferente [184].

5.4.2.5.3 Prueba de biodegradación en cajas petri

La prueba en cajas petri ha sido inicialmente desarrollada para valorar la resistencia a la degradación microbiana. Varios métodos han sido estandarizados por organizaciones de estandarización tales como la ASTM y la ISO. Estas ahora también se usan para ver si un material polimérico permitirá el crecimiento de microorganismos. El principio del método requiere ubicar el LDPE en la superficie de un agar de sales minerales en una caja petri que no contiene ninguna fuente adicional de carbono. El materia de prueba y la superficie del agar se esparce con una mezcla estandarizada de inoculo de las bacterias conocidas y/o hongos. El material de prueba (LDPE) se examina después de un periodo predeterminado de incubación a temperatura constante por la cantidad de crecido en su superficie y finalmente se limpia el material y se vuelve a pesar o examinar y se compara [59].

5.4.2.5.3.1 Formación de zonas claras

Es un método simple y semi-cuantitativo. Es una prueba en platos de agar en la cual el polímero se dispersa como partículas muy finas dentro del medio de agar sintético, este resulta en un agar de apariencia opaca, después de ser inoculado con microrganismos, la formación de un halo claro alrededor de la colonia indica que los organismos están son al menos capaces de des polimerizar el polímero, el cual es el primer paso a la biodegradación [269].

5.4.2.5.4 Prueba de platos con hongos

Para probar la habilidad de las cepas de hongos para atacar las capas de polietileno, las cepas se cultivan en medio agar mineral básico MBA (del inglés

mineral base agar) el cual se describe en la norma ASTM G21-90. El medio libre de carbono que no sea el LDPE suele ser suplementado con 0.02 % de extracto de levadura y el pH se ajusta a 6.5 [144].

5.4.2.5.4.1 Método de Inoculación

La incubación en el medio con hongos en la lámina polímero puede ser

realizado de acuerdo con la método standard BS EN ISO 846:1997, que

57

contiene la fuente de carbono (el LDPE), la cual se requiere para que ocurra el

crecimiento estos [148].

Al polímero se le realiza un análisis por FTIR, se pesa y esteriliza con

radiación UV por 15 minutos, se ubica en la superficie de un medio sólido en

cajas petri, y entonces se esparcen 0.1 ml de las suspensión de esporas.

Después de estos procedimientos, las placas se incuban en una incubadora

bacteriológica (SOLAB) a una temperatura de 28 °C [148].

5.4.2.5.5 Prueba de biodegradación In-vitro

La habilidad de las bacterias aisladas para degradar LDPE se estudia con la prueba de biodegradabilidad in vitro. Las bacterias aisladas se mantienen en caldos nutritivos o agar medio nutritivo. Los cultivos líquidos de 50 ml se incuban en erlenmeyer de (250 ml) con un agitador rotatorio (150 rpm) a 30° C por 30 días [237].

5.4.2.5.5.1 Prueba de cultivo Líquido

La cuantificación de la degradación se estudia analizando la biocapa o biofilm desarrollada en la lámina de polietileno, por medio de la estimación del carbón orgánico total soluble en agua (TOC) y el pH de los medios de cultivo [144].

5.4.2.5.5.2 Prueba de toxicidad

El caldo de cultivo generado durante treinta días, se le adiciona a la planta V.

radiata, en un matero se depositan 10g de suelo de jardín y se siembran las

semillas de V radiata, las cuales se humedecen regularmente con 5 ml del caldo

de cultivo [74].

5.4.2.5.6 Pruebas de hidrofobicidad

Con éste tipo de pruebas se puede estudiar tanto el material, como los microorganismos que se adhieren al mismo, la hidrofobicidad del polietileno de baja densidad es propia a su naturaleza, sin embargo, cuando se forman grupos funcionales por acción biótica o abiótica disminuye un poco esta propiedad, facilitando la acción de los microorganismos que actúan en su superficie y probando que esté se está mineralizando, existen múltiples métodos que permiten determinar la hidrofobicidad del material, por ejemplo: el ángulo de contacto con el agua, la energía superficial, la deposición o caída de la gota y el diámetro que genera, ahora, también el grado de hidrofobicidad de los microorganismos y sus enzimas mejora la adhesión al polietileno de baja densidad, por lo que se pueden utilizar las pruebas (BATH) y (SOT), debido a que éste trabajo se enfatiza en los microorganismos, a continuación se presentaran brevemente estas últimas pruebas mencionadas.

5.4.2.5.6.1 La prueba BATH (Bacterial Adhesion to Hidrocarbons)

Está basada en la afinidad de las bacterias por un hidrocarburo tal como el hexadecano. A mayor hidrofobicidad de las células bacterianas mayor su

58

afinidad por el hidrocarburo, resultando en la transferencia de las células de la suspensión acuosa a la fase orgánica y una consecuente reducción de la turbidez del cultivo [237].

5.4.2.5.6.2 Prueba de salado (SOT) (por sus siglas en inglés: salting out test)

El Test de agregación de sal consiste en que a mayor es la hidrofobicidad de la superficie celular es más baja la concentración de sal requerida para inducir agregación celular y precipitación.

5.4.2.5.6.3 Estudios de absorción de agua

Los estudios de absorción de agua se pueden llevar a cabo según la norma ASTM D 570. Esta prueba cubre la determinación de la tasa relativa de absorción de agua por el LDPE cuando se sumerge en agua [179].

𝑊% =𝑊1 − 𝑊0

𝑊𝑜∗ 100

W0 es peso inicial, antes de sumerjirlo en agua y W1 es el peso final despues de sumerjido en agua. Cuando el LDPE se oxida producto de la biodegradación se incrementa la presencia de grupos hidroxilos en la superficie del LDPE, lo que aumenta la afinidad por el agua [179].

5.4.2.5.6.1 Prueba del ángulo de contacto con agua

La hidrofobicidad se determina usualmente por medio del ángulo de contacto de

la superficie con el agua, entre más hidrófila la superficie es más pequeño el

ángulo de contacto [71, 120].

5.4.2.5.7 Pruebas de enzimas

En las pruebas de enzimas al LDPE se le adiciona un sistema buffer, que contiene una o varios tipos de enzimas purificados. Estos ensayos son muy útiles en el examen de la cinética de despolimerización. El método es muy rápido (de minutos a horas) y puede dar información cuantitativa [59].

.

5.4.2.5.8 Pruebas de Evolución de Gas (CO2 or CH4)

La evolución de dióxido de carbono o metano de un substrato representa un

parámetro directo de la mineralización. Por lo tanto, la evolución de pruebas

de gas es una herramienta importante en la determinación de la

biodegradabilidad del LDPE. Un número de métodos bien conocidos se han

estandarizado para la biodegradación aeróbica, tal como la (modificada) prueba

Sturm y la prueba controlada de compostaje en laboratorio [59].

También para biodegradaciones anaeróbicas, tales como la prueba de lodos

anaeróbicos, y la prueba de digestión anaeróbica. Aunque los principios de

estas pruebas son las mismas, estas podrían diferir en la composición de los

59

medios, inoculo, la forma de los sustratos que son introducidos, en la técnica

para medir la evolución de gas [59].

5.4.2.5.8.1 La prueba Sturm

Consiste en la cuantificación de la evolución de dióxido de carbono (CO2), la cual es una indicadora de la velocidad de crecimiento celular y el consumo del material durante la biodegradación, la prueba se basa en la captura del CO2 en

una solución de hidróxido de potasio (KOH) 1M para formar HCO3⁻ posteriormente titularlo con cloruro de bario (BaCl) [51].

5.4.2.5.8.2 Radiomarcación

En contraste al análisis de residuos, la medida simple de la evolución total de

CO2 y 14CO2, es no destructiva y puede medir la biodegradación final. Si

apropiadamente la prueba de material 14C está disponible, la medida y sus

interpretaciones son relativamente directas. Los materiales que contienen una

distribución aleatoria del marcador 14C el cual se expone a un ambiente

microbiano seleccionado. La cantidad de carbono 14C en el dióxido

evolucionado se estima usando un contador de cintilaciones [184].

5.4.2.5.8.3 Prueba de Respiración

La actividad aeróbica microbiana se caracteriza por utilizar oxígeno, la

biodegradación aeróbica requiere de oxígeno para la oxidación de sus

compuestos a sus minerales constituyentes tales como CO2, H2O, SO2, P2O5,

etc. El oxígeno utilizado durante la incubación se llama (demanda de oxigeno

bioquímico o biológico) (BOD del ingles biological oxigen demand), es por lo

tanto una medida del grado de la biodegradación. Varios métodos se basan en

la medición del BOD, frecuentemente expresados como un porcentaje de la

demanda teórica de oxígeno (TOD) de los compuestos. El TOD, el cual es la

cantidad teórico de oxigeno necesaria para la oxidación completa del sustrato

en sus constituyentes minerales, puede ser calculada considerando las

composiciones elementales y la estequiometria de la oxidación o basada en

determinaciones experimentales de la demanda química de oxígeno (COD del

ingles chemical oxigen demand) [59].

5.4.2.5.9 Prueba de la Pérdida de masa

Como su nombre lo indica esta prueba determina la variación directa de la masa del polietileno de baja densidad que ha sido expuesto a las condiciones de biodegradación. El principio básico de la perdida de la masa es la adherencia y biodegradación de los microorganismos al LDPE, los cuales se han preseleccionado por su capacidad de utilizarlo como fuente de carbono. Su procedimiento consiste en pesar con un micro balanza el material antes y después de realizar una prueba de cultivo.

60

5.4.2.5.9.1 Porcentajes de degradación del LDPE reportados

Se ha escogido esta prueba por ser fácil de realizar, entender, fácil de replicar y relativamente confiable, además de ser la prueba más directa indicadora de la biodegradación, por tanto a continuación se presenta una recopilación de los resultados reportados por algunos de los trabajos en los que se realizó esta prueba, considerando las condiciones de su realización y unificando la unidad de medida temporal a meses con el objetivo de entender a mayor profundidad tales resultados y hacer más fácil su comparación. En estos estudios teniendo en cuenta los resultados se puede conocer quiénes son mejores degradadores de polietileno los hongos o las bacterias, o específicamente cuales especies son mejores En el estudio realizado por Nayak Priyanka, Tiwari Archana [76], donde se incubaron hongos y bacterias durante un mes, en medio agar almidón, incubados a 35°C y se realizó un subcultivo cada 15 días y se determinó el peso perdido [76], se encontró que los hongos presentan más eficiencia degradando, y la diferencia era significativa, sin embargo tanto los hongos Aspergillium niger como los Proteus vulgaris presentaron el mayor porcentaje de biodegradación (12,5%), lo que significa que por lo menos durante el primer mes los hongos suelen degradar más rápido el LDPE que las bacterias. En un estudio realizado por Chatterjee, Suman Mukherjee y Shamba [135], se cultivó en un periodo de incubación a 25-30ºC el hongo (aspergillus niger) y las bacterias Bacillus weihenstephanensis, Bkholderia cepacia, Escherichia coli, durante 6 meses para probar sus respectivas habilidades para degradar el LDPE, se usó el análisis de pérdida de masa como prueba directa de la biodegradación, se encontró que todos lograron degradarlo, incluso las bacterias Escherichia coli, en los primeros dos y hasta los cuatro meses los hongos eran más rápidos, pero cuando pasaron los seis meses las bacterias Bkholderia cepacia eran las más rápidas, aunque no existía gran diferencia con los Bacillus weihenstephanensis, lo que significaría que las bacterias pueden ser a corto plazo más lentas degradando LDPE, mientras se adaptan a las condiciones y al uso del LDPE, pero durante largos periodos de tiempo pueden llegar a ser mejores o iguales degradando el LDPE como fuente de carbono.

En un trabajo hecho por Sonil Nanda, y Smiti Snigdha Sahu, titulado

Biodegradabilidad de polietileno por Brevibacillus, Pseudomonas, y Rhodococcus sp [138], en el cual estos microorganismos fueron Incubados a

dos temperaturas distintas por 21 días (0.75 meses), 50°C para los Brevibacillus, y 40°C para las Pseudomonas sp y los Rhodococcos sp, como única fuente de carbono se les proporciono LDPE finamente pulverizado (como pretratamiento) y con agitación a 150 rpm, los resultados arrojados fueron: Brevibacilus sp 37.5%, Pseudomonas sp 40.5% y Rhodococcos sp 33.0%, los tres valores son altos lo cual es obviamente explicado por el estado del LDPE, pero la temperatura debió influir de manera importante, por la degradación

61

térmica y porque la temperatura era óptima para las tres, como encontró [162] 37°C para las Pseudomonas sp y 55°C para los Brevibacilus borstelensis [136], por lo tanto estaban a sus temperaturas optimas, lo que podemos concluir es que la variable decisiva fue la habilidad intrínseca para degradar LDPE de las Pseudomonas sp. Las Pseudomonas sp., como degradadoras de LDPE, son reconocidas y muy

estudiadas por sus buenos resultados, siendo entre las bacterias con mayores

reportes obtenidos por su habilidad para degradar el LDPE. Por ejemplo el

trabajo titulado: Biodegradación de polietileno de baja densidad LDPE por

Pseudomonas sp, con un medio simple o basal, sin ningún pretratamiento, en

tubos incubados en un agitador rotatorio (120 rpm) a 37°C, la tapa fue

ligeramente abierta para permitir su aireación, durante un periodo de cuatro

meses las especies de pseudomonas aeruginosa ATCC 1569 lograron degradar

un 20%, habiendo degradado alrededor del primer mes un 18% [156],

Sin embargo no son las mejores en todos los casos, al menos eso es lo que encontraron Madhuri, Deepika S y Jaya, en un estudio denominado Biodegradación de polietileno de baja densidad por microrganismos de suelo de basurero, en este estudio se realizaron pruebas de biodegradación con Pseudomonas sps, Streptomyces sps A. flavus A. niger con medios de sales minerales a 30°C con agitación a 120rpm y con LDPE puro [270], durante un periodo de 6 meses, arrojando como resultados, que los Streptomices sp fueron los claros vencedores degradando LDPE con porcentajes a un nivel del 46.7%, degradando cerca del 6% cada mes, mientras que hongos como los aspergillus Niger lograron 26.17±0.05%, y las bacterias Pseudomonas sp consiguieron “solamente” degradar un 24.22±0.01% todos en condiciones iguales, sin tratamientos previos ni condiciones especiales [270].

5.4.2.5.10 Pruebas físicas de la biodegradación Existen también las pruebas indirectas de la biodegradación del polietileno, las cuales pueden ser: el cambio de la distribución del peso molecular, el cambio de la estructura cristalina y la modificación de sus propiedades mecánicas, la viabilidad, el crecimiento y la actividad de la biomasa.

5.4.2.5.10.1 Índice de fluidez

El Índice de fluidez MFI determina la temperatura de fusión del polímero, también indica indirectamente la viscosidad [208]. El índice de fluidez es un indicador de la longitud de las cadenas poliméricas del LDPE, debido a que mayor sean las cadenas poliméricas y menos ramificadas, por lo tanto más cristalizadas presentaran un mayor punto de fusión y una mayor viscosidad.

62

5.4.2.6 Pruebas de identificación microbiana

Las pruebas de dentificación microbiana son el proceso inicial y clave para conocer cuales microorganismos degradan el LDPE y que potencialidades presentan para usos biotecnológicos.

5.4.2.6.1 Viabilidad del biofilm microbiano

Se puede medir la actividad metabólica de las células del cultivo, con métodos como la hidrolisis con acetato fluoresceína FDA usado por [106], el cual es indirecto y mide la cantidad de proteína, la prueba con naranja de acridina o el kit de viabilidad bacteriana o BacLight [167], además del ensayo de ATP [96], también se ha reportado la prueba redox con el uso del cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio el directo monitoreo de la respiración directa de los microorganismos [177].

5.4.2.6.2 Pruebas de caracterización preliminar

Las bacterias aisladas seleccionadas se pueden identificar por una caracterización bioquímica y morfológica En una caracterización morfológica, se estudian las características macroscópicas como forma, tamaño, estructura, textura, apariencia, elevación y colores. características fenotípicas tales como caracterización microscópica de la reacción Gram, motilidad y pruebas bioquímicas incluyendo catalasa, oxidasa, indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer, triple azúcar hierro, utilización de citrato, ureasa, reducción nitrato y la fermentación de carbohidratos y se realiza con protocolos estandarizados [48].

5.4.2.6.3 Pruebas de identificación especifica

Para identificar los microorganismos biodegradadores de LDPE se pueden utilizar las herramientas de ingeniería genética, en las que se incluyen: secuenciación de DNA de los genes ribosomales 16s o 18s, la secuenciación de proteínas, o la más rápida y avanzada la espectrometría MALDI ToF para análisis de proteínas [244].

5.4.2.7 Productos de la biodegradación

Algunos estudios demuestran que los microorganismos toman el LDPE y lo reducen a micro moléculas más fáciles de metabolizar y mineralizar los cuales se enlistan a continuación. Tabla 14 Posibles residuos de la biodegradación, tomados de [156, 29, 41, 80, 74]

Compuestos Compuestos

Benceno Ácido undecanóico

Metilo benceno Ácido docosanóico

Docosanoato de metilo propilo 1,3-dimetiloctadecano

Di-tert-butil-1-oxaspiro(4,5)deca-6,9-dieno 2,6,10,16 tetrametil heptadecano

Ácido hexadecanóico 2,3,6 trimetil decano

Hexadecanoáto de etilo 2,6,7 trimetil decano

63

Diisoostilo eicosano 6-etil ,2-metil decano

Ácido octadecanóico Dodecanol

Undecano Dodecanal

Octano Heneicosano

Eicosanol Heptacano

Docosano Heptacosano

Acido 3-cloropropiónico Heptadecano

7,9-Di-tert-butil-1-oxaspiro(4,5) deca-6,9-dieno-2,8-diona 2,6,10,14 tetrametil heptadecano

Octadecanoato de butilo 2,3,5,8 tetrametil decano

1- Nonadeceno 9 Hexil heptadecano

Tetracosano Hexadecano

Pentacosano 5-butil hexadecano

Acido 1,2-Benceno di carboxílico 2-fenil,etil,hexanoato

Ácido Oxano dodecanóico 3-metil,5-(2-teilbutil) octadecano

Hexacosano 3-etil (2-etilbutil) octadecano

Ciclo propano 6-metil octadecano

2-buteno,2-metil- tricloro eteno

Acetona Hexanal

Eteno, 1,2-dicloro-, Eteno 1,1-dicloro

Dicloro Metano Acetato de etilo

Ácido butanóico Ácido oleico

1- Tetradeceno Acido oxálico

Ácido acético Ácido octadecatrienóico

Tricosano Pentadecano

Ácido tetradecanóico Acido ftálico

Ergosta-5,22-dien-3-ol, acetato(3,22E) Acetato de Betametasona

1-Monanalinoeoglicerol trimetil silil éter Azafrin

2,3-bis [(trimetilsilil oxi] propil ester ácido 9,10,15-octadecatrienóico

5.5 METODOLOGÍA PROPUESTA

Se decidió proponer una metodología a partir de una revisión exhaustiva de la biodegradación del PE por el interés de impulsar a los investigadores colombianos a estudiar los microorganismos que habitan en las grandes ciudades del país o regiones naturales apartadas y contaminadas, también por la posibilidad de su utilización en compost o en lugares especializados en el tratamiento del material LDPE. El propósito específico de esta metodología es determinar la identidad y la eficiencia de los microorganismos que degradan el LDPE, tanto hongos como bacterias y determinar por métodos estadísticos si hay alguna diferencia significativa entre ambos.

64

El autor es consiente lo dispendioso y costoso que puede resultar hacer tantas pruebas, tanto las de identificación preliminar junto a la identificación especifica podrían durar meses enteros o quizá años. La estructura metodológica básica será la siguiente:

Figura 11 Esquema metodológico básico propuesto

5.5.1 Test de viabilidad cuenta de microorganismos viables por dilución

en placa

Se propone la prueba de viabilidad o dilución en placa y conteo de unidades formadoras de colonia por ser fácil y rápida además permite separar e individualizar las especies de microorganismos hidrocarbonoclastas (al menos los que pueden sobre vivir in vitro). (Ver ANEXO L2) Cálculos 1) Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias. 2) Con la siguiente ecuación calcular las UFC/g s.s.

𝑈𝐹𝐶/𝑔 𝑝𝑒. = (𝑁𝐶 ∗ 1/𝐹𝐷 ∗ 1/ 𝑉) / (𝑃 ∗ 𝐹𝐻). Donde: UFC/ g pe. = unidades formadoras de colonias / g de PE. NC= número de colonias en una caja. FD = factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó la muestra con la que se inocula la caja (10-2 a 10-10). V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml. P = peso de la muestra húmeda = 1 g. FH = factor de corrección de humedad (1 − (%ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑/100)).

65

5.5.1.1 Obtención de muestra y selección de los microorganismos

degradadores de LDPE en medio líquido SM

Se propone la realización de un medio líquido SM selectivo por ser ideal para el desarrollo de los microorganismos biodegradadores de LDPE, además ha sido probado en múltiples estudios de biodegradación, lo cual genera confiabilidad. Recolección de la muestra Pre tratamiento de la muestra Adición al medio de cultivo líquido Incubación (ver ANEXO A 2).

5.5.1.2 Identificación preliminar

Para identificar los generos bacterianos se pueden realizar las siguientes pruebas bioquímicas y microbiologícas tales como catalasa, para bacterias (Ver ANEXO G1).

a. Caldo de Tioglicolato OF; b. Prueba de la oxidasa c. Prueba de la catalasa d. Prueba de malonato e. Prueba de citrato

f. Prueba de hipurato g. Prueba de Kligler h. Tsi hierro tres azucares i. Prueba de RM/VP

j. Prueba de fermentación, 2,3-butanodiol y acido mixta.

k. Agar lisina hierro l. Fenilalanina desminanasa agar

m. Moeller n. Descarboxilación de aminoácidos

66

Figura 12 Métodos preliminares de identificación metabólica

5.5.1.3 Pruebas preliminares de identificación de hongos

Para hongos se realizaran las siguientes pruebas: Para el aislamiento y cuenta de hongos degradadores de PE se utilizó la misma técnica y medio que para bacterias, con la diferencia de que al medio se le adiciona rosa de Bengala y estreptomicina y se ajusta el pH a 4.9 [187]. Para cultivarlos se puede usar Agar sabouraud, PDA, algodón azul de Lactofenol (LPCB) y para su identificación se utiliza la observación microscópica y macroscópica.

67

5.5.1.4 Ensayo de biodegradación in vitro

Se debe cultivar las bacterias y hongos aislados en medio agar nutritivo

5.5.2 Prueba de pérdida de masa

Se propone la prueba de la pérdida de masa en medios de cultivo selectivo en Erlenmeyer (medio líquido) y en cajas Petri (medio solido) debido a que permiten unas condiciones controladas de pH y temperatura que aceleran el proceso de biodegradación y unifica las condiciones de crecimiento de tal manera que se puedan comparar sus respectivas eficiencias. Para conocer la metodología en detalle (ver ANEXO C). El cálculo de la pérdida de masa se puede realizar usando la siguiente ecuaciónEl tiempo de variación del porcentaje de peso ganado W t puede ser medido como:

(𝑊𝑡 =𝑊𝑜 − 𝑊(𝑡)

𝑊) ∗ 100; 𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 =

𝑊𝑡

𝑡(𝑚𝑒𝑠𝑒𝑠)

Donde Wt es el peso total después del tiempo t, W0 es el peso de referencia seco antes de la prueba. Para determinar si no hay diferencia significativa en la eficiencia entre hongos y bacterias Ho se propone usar la prueba de significación t. Y la prueba ANOVA en dos vías considerando el tipo de medio y de microorganismo.

5.5.3 Identificación especifica

Se propone la realización de la prueba genética de amplificación y secuenciación del gen 16S o 5,8S rRNA (para hongos) vía PCR de diferentes bacterias y hongos el porqué de la selección de ésta técnica es por ser capaz de detectar bacterias viables pero no cultivables, permite una identificación especifica del organismo objetivo. Principio: existen porciones de las secuencias génicas 16S rRNA o 5,8S rRNA dentro de las bacterias y hongos que son idénticas y entre estas regiones hay secuencias únicas de DNA asociadas con hongos y bacterias específicas [271]. Los llamados primers “universales” han sido diseñados para anillar con las secuencias conservadas de 16S rRNA permitiendo la amplificación de la secuencia única dentro de la región conservada [271]. Para conocer la metodología en detalle (ver ANEXO F).

68

Las alícuotas del gen amplificado que resultan de la PCR con estos primers universales pueden ser secuenciadas económicamente en los laboratorios comerciales o en muchos casos en laboratorios universitarios. Una vez se conoce la secuencia del gen rRNA, se pueden usar para identificar los microorganismos originales al nivel de género y especie [271]. Se han computarizado en bases de datos las secuencias de un vasto número de especies bacterianas [271]. Esto permite la comparación de una secuencia desconocida de rRNA con una secuencia bacteriana conocida [271]. Muchos programas de análisis de secuencias están disponibles para ayudar a identificar las secuencias. Uno de tales bases de datos es la BLAST (son las siglas en ingles de Basic local alignment search tool) que significa herramienta de búsqueda de alineaciones básicas locales, la cual la provee la (NCBI) National center for biotechnology information que está disponible en la web [271]. Primers universales 16S rRNA tomados de [271]. 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R TACGGY*TACCTTGTTACGACTT

*Y puede ser C o T una posición de base degenerada.

Figura 13 Metodología a realizar para la identificacion específica

69

5.5.3.1 Técnica longitud de polimorfismos de los fragmentos de restricción

(RFLP)

También se propone realizar la prueba de identificación de microorganismos amplificando regiones que se conservan entre especies (genes), longitud de polimorfismos de los fragmentos de restricción (RFLP del ingles Restriction Fragment Lenght Polymorphisms) donde se amplifican regiones específicas y se cortan con endonucleasas para observar el patrón de bandas en una gel, por lo que se podría utilizar el gen 16S rRNA o 5,8S rRNA (para hongos) amplificado para correrlo en una electroforesis. Para conocer la metodología a seguir (ver ANEXO F).

5.5.4 Pruebas instrumentales

Se proponen solamente dos técnicas FTIR y GCMS por ubiquidad y costo pero obviamente también es recomendable usar otras técnicas como SEM y TGA, etc. esa decisión la tomaran los propios investigadores.

5.5.4.1 Aplicación del FTIR al estudio de la biodegradación del LDPE

La exposición prolongada al aire libre de los plásticos afecta la apariencia y las propiedades físicas de estos materiales, con algunos efectos comunes como descoloramiento y quebramiento, también los factores biológicos pueden afectar las características de los plásticos, la espectroscopia infrarroja podría usarse para elucidar los mecanismos de degradación de polímeros identificando y cuantificando los productos de degradación [272]. La espectroscopia infrarroja es una técnica sencilla y fiable utilizada ampliamente en la química orgánica e inorgánica, en la investigación y la industria [272]. Durante el proceso de la oxidación microbiológica del PE, se forma una gran proporción de compuestos que contienen carbonilo, lo cual es debido a la oxidación enzimática, (ver mecanismos de despolimerización) tales mecanismos generan productos carbonilados y carboxilados que se pueden estudiar mediante la espectroscopia FTIR.

5.5.4.1.1 Variantes de la técnica

5.5.4.1.1.1 La espectroscopia FT-IR (ATR)

Fue validada en los últimos años por brindar un análisis rápido y competitivo, En la técnica ATR, la muestra se presiona contra un diamante, un cristal de seleniuro de zinc o un cristal de germanio y se mide la absorción de la onda evanescente [272].

70

5.5.4.1.1.2 FT-IR Reflectancia Difusa (DRIFT)

Ha sido utilizada ampliamente en el pasado para el estudio de polímeros y permanece como una técnica muy útil en casos donde la muestra es muy grande para ser medida con ATR [272]. El Polietileno tiene una estructura molecular simple, semicristalina y alto peso molecular pero no se degrada por que no absorbe radiación UV [66, 55]; sin embargo, la presencia de impurezas como catalizadores remanentes, plastificantes, y antioxidantes induce la absorción radiación UV-B [66].

5.5.4.1.2 Índices de cuantificación de la oxidación

5.5.4.1.2.1 Índice de carbonilo (CI)

El índice de carbonilo es un indicador del grado de oxidación el PE, el cual mide las bandas de absorción del grupo carbonilo C=O a 1740 cm−1 ((1740)), producto de su estiramiento.

𝐼𝑐𝑜 = (𝐴1740 − 𝐴1835)

0,008 ∗ 𝑡

Donde t es igual al grosor de la muestra medido en mm, y la absorción a 1835 cm-1 es el valor de referencia [66]. Aunque también existen algunas otras variantes

𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝐶𝑒𝑡𝑜 − 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛𝑖𝑙 (𝐾𝐶𝐵𝐼) =𝐼1715

𝐼1465

𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟 − 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛𝑖𝑙 (𝐸𝐶𝐵𝐼) =𝐼1740

𝐼1465

5.5.4.1.2.2 Índice vinilo (𝐼V)

Índice vinilo (𝐼V) se calcula usando la razón de la absorbancia de la banda en 909

cm−1 (𝐴 (909)), vibración estiramiento del grupo vinilo (CH2=CH), y la absorbancia a 2020 cm−1 [27]:

𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑣𝑖𝑛𝑖𝑙𝑜 (𝐼𝑉) =𝐼909

𝐼2020

𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒 (𝑇𝐷𝐵𝐼)

=𝐼1650

𝐼1465

𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑛𝑜 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒 (𝐼𝐷𝐵𝐼)

=𝐼908

𝐼1465.

5.5.4.1.2.3 Porcentaje (%) de cristalinidad Del PE

% 𝑜𝑓 𝑐𝑟𝑖𝑠𝑡𝑎𝑙𝑖𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 =

71

𝑎 100 − [{1 −(

𝐼𝑎

1.233𝐼𝑏)

1+ (

𝐼𝑎

𝐼𝑏)} × 100]

Donde Ia y Ib son los valores de la absorbancia de las bandas a 1,474 y 1,464 cm−1 o a 730 y 720 cm−1, respectivamente.

5.5.4.2 Cromatografía de gases acoplada con espectroscopia de masas

GCMS

Se propone la utilización de esta técnica por ser muy versátil y rápida Se puede utilizar para analizar los ácidos grasos (AG) y obtener el perfil de AG de los microorganismos y así identificarlos. También para analizar otros metabolitos producidos en la biodegradación. Para detallar la metodología (ver ANEXO L).

5.5.4.2.1 Para cuantificar la producción de CO2

En esta técnica se podría medir el CO2 producido por los microorganismos durante la incubación del cultivo degradador del polietileno en un sistema cerrado y a determinadas condiciones, se cuantifica por cromatografía de gases con head space y/o con un detector de conductividad térmica. Para detallar la metodología (ver ANEXO K). Para calcular la concentración de CO2 se emplea la ecuación de los gases ideales:

𝑃𝑉 = 𝑛𝑅𝑇.

Despejando 𝑛 = ( 𝑃𝑉 )

( 𝑅𝑇)

El resultado en mol CO2 / g del PE en el sistema, se calcula de la siguiente forma: 𝑀𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐶𝑂2

𝑔 𝑝𝑒 =

𝑃 𝑉 ∗ (%𝐶𝑂2

100))

𝑅𝑇 ∗ 𝑔 𝑝𝑒 Dónde: %CO2 = área del pico de CO2 en porcentaje. P = presión atmosférica (atm). V = volumen de la atmósfera de los sistemas a medir (L). R = constante de los gases (0.082205 L * atm / mol * K). T = temperatura del sistema (° K). g pe. = gramos de PE. La gráfica de CO2 vs el tiempo deberá construirse de forma acumulativa (Sumando las producciones de CO2). Para conocer la metodología (ver ANEXO L).

72

Nota: Con este mismo método o cuantificación se puede determinar al mismo tiempo el O2 y N2 del sistema. Esto permite conocer la cantidad de oxígeno consumido en los sistemas, dato que se utiliza para calcular su coeficiente respiratorio (QR). Este parámetro biológico determina la actividad biológica (estado fisiológico) que ocurre en un sistema y refleja la relación entre el CO2 producido y el O2 consumido [273].

𝑄𝑅 = 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝐶𝑂2 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜

𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑂2 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜

6 ANÁLISIS

La biorremediacion ha cambiado su concepción, de ser un simple uso de seres vivos como agentes de limpieza, (lo cual no es nada nuevo y en la realidad no es necesaria la intervención humana para que cumplan estas funciones), a otra en la que implica la degradación de contaminantes mediante el uso de seres vivos que están inmersos en un medio físico con determinadas condiciones, y dependiendo de éstas la biodegradación se relentiza e incluso se detiene o se acelera, tales como la temperatura, la luz, la humedad, etc,. Por lo tanto la biodegradación actualmente es vista como una acción conjunta de factores abióticos y bióticos, en este caso microorganismos, demostrando la amplitud de aspectos que los investigadores ambientalistas deben tener en cuenta al momento del control de estos xenobióticos. Tambien nos ayuda a entender como los cambios físicos como temperatura, pH, luz, etc que ocasionamos al planeta, pueden afectar tanto negativa como positivamente esta labor, y su control o estudio es de vital importancia. Como producto de esta investigación se encontró que el LDPE es degradado por lo menos por un total 63 géneros de microorganismos entre hongos y bacterias (ver Tabla 15), de éstos como mínimo existen 148 especies, lo que no es un numero sorprendente considerando la diversidad de climas, hábitats y organismos que hay en el planeta, adicionalmente es muy probable que en poco tiempo este listado quede incompleto o inclusive ya lo esté, cabe mencionar que Amal Hussein y colaboradores afirman que hay 90 géneros entre hongos y bacterias que degradan todo tipo de plásticos [274], lo que significaría que por lo menos dos tercios de todos los géneros de microrganismos degradadores de plásticos, degradarían el polietileno de baja densidad LDPE, algo entendible considerando lo simple de la estructura del polímero, de tal forma que solo se requerirían unas pocas enzimas como: lipasas, lignina peroxidasas, para degradarlo, además es impulsado por su gran ubicuidad y su gran riqueza energética, que lo hacen muy valioso como fuente de energía y de carbono, todo esto finalmente conduciría a una intensa presión evolutiva o selección artificial para degradarlo.

73

En ciertas condiciones extremas y propicias ”óptimas”, un elevado número de géneros de microrganismos puede lograr degradar el polietileno de baja densidad, por las características antes mensionadas, sin embargo el interés está en conocer cuáles de éstas biológicamente han logrado obtener los mejores atributos para realizar el proceso al máximo ritmo posible, se encontró que las bacterias que presentan el mayor grado de eficiencia biodegradadora son los Streptomyces sp, seguidos por las Pseudomonas sp, y entre los hongos están los Aspergillus sp, especialmente los Aspergillus níger. Estos resultados no pretenden ser definitivos en lo absoluto, quizá existan mejores o quizá el orden mencionado no sea el correcto. ¿Cuáles son las condiciones que permiten una mejor biodegradación del LDPE? Un estudio realizado por Nayak Priyanka y Tiwari Archana comparó [76], la biodegradación del polietileno por la pérdida de peso considerando el tipo de disposición del material que fue de tres formas distintas, enterrada, expuesta al aire libre y en medios de cultivo a condiciones del laboratorio encontrando que las condiciones de laboratorio fueron las que arrojaron una mayor pérdida de peso. En cuanto a la cantidad de aditivo pro-degradable Obasi [190], encontró que la pérdida de peso era mayor cuanto mas biopolímero se le adicione. Los estudios demuestran que los microorganismos pueden iniciar la degradación del LDPE, aun cuando no haya sufrido una degradación físico química previa, o sea de elevado peso molecular, sin embargo cuando sufre una degradación ambiental que oxida el material y le disminuye su peso molecular la biodegradación se acelera, también si el LDPE a estudiar posee un bajo peso molecular como lo demostró Tsuchii [275]. ¿Qué microorganismos son mejores degradando polietileno de baja densidad los hongos o las bacterias?: Los hongos en principio pueden ser mejores degradando el LDPE, probablemente por su mayor tolerancia a las condiciones extremas de pH, temperatura y humedad, pero las bacterias pueden llegar a mejorar los niveles de degradación de LDPE a largo plazo, cuando se adaptan bien a las condiciones del entorno y llegan a su máximo nivel de crecimiento o son las bacterias más evolucionadas o adaptadas para degradar este tipo de materiales. De acuerdo al número de géneros de hongos y bacterias obtenido en este estudio, lo que se puede concluir es que son numéricamente iguales, (por lo menos con los trabajos revisados), ¿coincidencia o algo razonable?, podría significar que el LDPE es un material nutritivo para ambos reinos. Tabla 15 resultados en cifras de los elementos estudiados

Elementos estudiados N° reportados

Géneros Hongos 32

Bacterias 31

Numero de especies >148 especies

Especies mayormente Aspergillius sp 81

Penicillium

74

Los géneros de microorganismos más utilizados o reportados corresponden a las Pseudomonas sp como degradadoras de LDPE, son las bacterias con mayores reportes y cantidad de trabajos obtenidos por su habilidad para degradar el LDPE con 47 trabajos, seguidas por los Bacillus sp con 43 trabajos y streptomices 17. Puede significar que estos organismos tienen condiciones adecuadas para esta labor, por lo que un estudio molecular y bioquímico sobre estos microorganismos podrían arrojar luces sobre estas capacidades especiales, aun poco conocidas y podrían ser los perfectos candidatos para ser mejorados genéticamente. Finalmente ya sean bacterias o hongos, la utilización de consorcios microbianos

ofrece considerables ventajas sobre el uso de cultivos puros en la degradación de

LDPE, como ocurre naturalmente, donde todos hacen parte de una cadena en la

cual existen funciones interdependientes y cooperativas, lo cual ofrece una

habilidad multifuncional y su mayor robusteza a las fluctuaciones ambientales.

Las consecuencias de la utilización del material LDPE y todos sus aditivos y sustitutos: vale mencionar que la inercia del polietileno de baja densidad LDPE puro es una cualidad que per se que no lo hace axiológicamente malo o peligroso, de hecho, muchas de sus cualidades son muy utiles, y que han contribuido con el progreso de la humanidad, por lo que sería un error no darle la importancia y valor que merece, el verdadero problema es el de abusar de su “servicios”, de forma desorganizada y descontrolada, y tambien no tener en cuenta su impacto ambiental, sus efectos a escala local y global, en esencia la solución real es utilizarlo de forma sabia y responsable, lo cual exige una educación ambiental masificada, una conciencia colectiva y todos los esfuerzos estatales y empresariales para su minimización y control hasta que llegue el dia de su competa sustitución, por otro lado aunque es un material que por sus cualidades es difícil de igualar, en la actualidad existen cuantiosas opciones de aditivos comerciales y no comerciales,que permiten acelerar su mineralización, todas novedosas y que poco alteran sus cualidades originales, acelerando su proceso de biodegradación, siendo positivo para el ambiente y la economía de las empresas basadas en estas poli olefinas, además es posible encontrar una gran cantidad de muy buenos sustitutos altamente biodegradables y biocompatibles, que son un impulso para el avance de la humanidad sin agredir al planeta, pero como se ha mencionado antes existen aún inconvenientes por solucionar: Casi todos los aditivos del polietileno de baja densidad LDPE y los biopolímeros alternativos en desarrollo son 2.5–10 veces más caros, lo que implica que los esfuerzos se dirijan a la búsqueda de sustratos de menor costo [6, 67]. Las propiedades físico químicas de los biopolímeros alternativos frecuentemente

encontradas

(numero de artículos que los

reportaron)

21

Pseudomonas sp 17

Streptomyces 17

Bacillus 13

Rhodococcus sp 11

75

restringen su uso [67] siendo necesario una mejora aun en éstos. Cuando se logren superar todas estas barreras, seguamente pronto, quizá se solucione el problema definitivamente, o quizá surjan otros problemas nuevos, esto solo el tiempo lo dirá, pero el abuso la irresponsabilidad y la inconciencia de nuestros actos como sociedad aún serán y deben ser los problemas a erradicar de las mentes de la sociedad. Lo cierto es que a pesar de que sean los más reportados no implica que sean los mejores realizando esta labor, simplemente que son los más ubicuos hasta la

fecha. Sin lugar a dudas los

Aspergillus sp. Son los

microrganismos

degradadores de

polietileno más

ubicuos encontrados

hasta la fecha,

estando muy lejos de

los demás géneros

con 81 especies, lo

que demuestra que

los hongos son muy

versátiles y poco

exigentes con el

entorno, los alimentos

y las condiciones,

además de ser muy

populares entre los

investigadores.

Gráfica 2 número de referencias obtenidas por genero de hongos y bacterias que están vinculadas con la biodegradación de (LDPE).

76

Gráfica 3 tecnicas más utilizadas para estudiar la biodegradación de LDPE.

En lo que respecta a las técnicas actuales que permiten analizar la biodegradación del LDPE se encontraron entre 34 técnicas y 28 métodos o pruebas, desarrolladas y utilizadas, lo que demuestra el ingénio de los investigadores, el esfuerzo y el interés al respecto, la amplitud de aspectos que abarcan estos estudios y la gran importancia para la ciencia y para la humanidad, en fin para toda la vida del planeta, aunque todavía no ha sido ni suficiente ni lo necesario, porque el problema sigue tan fuerte como antes o incluso mucho más, se requiere que se continúe investigando y con mas intensidad, desde todas las áreas (incluyendo las ciencias humanas), este problema requiere el esfuerzo de múltiples disciplinas científicas, para solucionar la tragedia ambiental que acontece, todos los investigadores son pertenecientes a las más diversas y remotas partes del mundo, lo cual no es de extrañar considerando que el problema de la contaminación con LDPE es igual de global. Como criterios de selección de las técnicas para el estudio de la biodegradación del LDPE, se eligieron las siguientes virtudes: tienen que ser razonablemente económicas, sencillas de utilizar, y de resultados confiables, alta versatilidad y gran ubicuidad. Todos estos requisitos perfectamente son cumplidos por las técnicas siguientes: La espectroscopia infrarrojo o FTIR, la cromatografía de gases GCMS o liquida HPLC, la micro balanza, por lo que su uso es más que recomendado.

77

Sin lugar a duda, la técnica más utilizada en el estudio de la degradación del LDPE es la espectroscopia Infrarroja con transformada de fourier FTIR, la cual ha sido usada en por lo menos en 70 trabajos, la siguiente técnica de análisis más utilizada es la microscopia SEM o microscopía electrónica. Seguramente existen múltiples técnicas que escapan de mención muy interesantes también, que proporcionan información muy valiosa sobre el material, y que cumplan algunas o quizá todas las condiciones de selección, sin embargo solo se proponen por cuestiones de interes las anteriores técnicas, los investigadores tendrán sus propios intereses que harán otros criterios de selección y por ende la selección de otras técnicas, también es seguro es que no todas las técnicas son adsequibles por todas las universidades, por lo tanto estas seran poco o remotamente utilizadas.

7 CONCLUSIONES

La biorremediacion es una alternativa para el control de la catástrofe ambiental

ocasionada por nuestros actos, no puede verse como una solución integral y

definitiva, cuando la causa es la irresponsabilidad e inconciencia humana. Debe verse la biorremediacion como una interrelacion entre lo vivo y las condiciones del entorno o factores abióticos, por lo tanto deben tenerse en cuenta los efectos o cambios en el entorno causados por la acción humana en todos los estudios sobre la biodegradación del LDPE y otros tipos de PE. La investigación sobre la biodegradación del polietileno ha avanzado a pasos agigantados, lo cual se refleja en la multitud de trabajos publicados, en los cuales los investigadores han utilizado una gran cantidad de técnicas con sus respectivos métodos específicos, son (34 técnicas y 28 métodos o pruebas), seguramente aún hay muchas más desarrolladas y utilizadas que faltaron mencionar, estos estudios sobre la biodegradación se enfocan en múltiples e importantes aspectos, lo cual demuestran el ingenio de los investigadores, el esfuerzo y el interés al respecto, y en la actualidad es un progreso que escapa de la esfera netamente ambiental, por toda su potencialidad como fuente de desarrollo industrial y económico. Lo que es natural considerando su gran importancia para la ciencia y para la humanidad. Sin embargo deben continuarse las investigaciones sobre la biodegradación del LDPE por su condición actual de inconcluso, (y aun muy lejos de serlo), además teniendo encuenta que deben ser aislados e identificados todos los microorganismos responsables de la degradación del polietileno de baja densidad o LDPE, incluyendose aquellos que no pueden ser cultivados in vitro, por lo que todos los microorganismos eficaces deben ser caracterizados a nivel molecular, y debe determinase su eficiencia degradadora en todos los entornos aun no estudiados que han sido afectados por estos contaminantes, con todas sus condiciones, variables o factores ambientales, teniendo encuenta que estas actitudes tienen que ver con características fenotipicas clave, como su

78

hidofobicidad, capacidad de producion de multiples y especializadas enzimas capaces de atacar el LDPE, etc. Los estudios posteriores deben ser sobre las enzimas extracelulares microbianas que son responsables de la biodegradación del polietileno y la formación de los ácidos orgánicos presentes. Estas enzimas necesitan ser caracterizadas y los genes responsables de esas enzimas deberían ser trabajados. Una vez los genes responsables de la degradación del polietileno se conozcan, se podrían usar para reforzar la capacidad degradadora de aquellos microbios que demuestran capacidades excepcionales, en la cual los atributos naturales se potencien, claro está que también cumplan estrictamente con todos los criterios bioéticos relacionados con este tipo de organismos, e incluso podría pensarse en el desarrollo de tratamientos enzimáticos a escala industrial o comercial para su degradacion, y finalmente se deben esclarecer completamente los posibles mecanismos de biodegradación, si aún no han sido esclarecidos. Y no siendo menos importante deben desarrollarse aditivos o sustitutos económicamente rentables, que aceleren su proceso de biodegradación y cuyas propiedades físico químicas sean lo más cercanamente parecidas al LDPE puro, además que se pueda masificar universalmente y que no demuestren ningún efecto adverso a el medio ambiente o al ser humano. Las técnicas que permiten cumplir el objetivo metodológico propuesto son la espectroscopia infrarrojo o FTIR, la cromatografía de gases GCMS y la balanza analítica, siendo su uso recomendado. Por último la metodología prospuesta se puede concluir que es viable, relativamente fácil y rápida, puede servir como primer un paso a posteriores estudios más profundos.

8. RECOMENDACIONES

Se recomienda a los investigadores locales o de cualquier parte del mundo que utilicen esta revisión como una ayuda conceptual o metodológica, que prueben los métodos propuestos y lo califiquen constructivamente, que tengan en cuenta que la intencion original era ralizarlo o ponerlo aprueba pero por dificultades no se logró, y que su objetivo va mas haya de ser un simple estudio de unos meses en el laboratorio en los que se prueben o no los métodos, lo que busca principalmente es que aumenten los estudios relacionados o enfocados a este tema, también que todos los trabajos venideros tengan en cuenta las necesidades aún faltantes, y que se interesen en el desarrollo de nuevos materiales como bioplasticos, ya sean Biofragmentables o totalmente bioegradables, o también nuevas aplicaciones.

79

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100

ANEXO A1 Aislamiento y cuenta de microorganismos degradadores de LDPE

Figura 14 procedimiento para el aislamiento de los microorganismos biodegradadores de LDPE adaptados de [187, 94] Para el aislamiento y cuenta de hongos degradadores de PE se utilizó la misma técnica y medio que para bacterias, con la diferencia de que al medio se le adiciona rosa de Bengala y estreptomicina y se ajusta el pH a 4.9.

101

ANEXO A2

Aislamiento e identificación de Microorganismos degradadores de LDPE

Figura 15 procedimiento para el cultivo, el aislamiento y la identificación de los microorganismos degradadores de LDPE.

102

Figura 16 Procedimiento para aislar los microorganismos degradadores de LDPE y su posterior propagación para realizar la extracción del DNA. Para extraer el ADN fúngico no se debe sembrar en agar porque el raspado deja trazas de medio los cuales interfieren en la extracción de DNA, el método propuesto es el registrado por Rojas Triviño [276]

ANEXO B Purificación y aislamiento de microorganismos degradadores LDPE

103

ANEXO C Prueba de biodegradación de LDPE

Figura 17 Ensayo de biodegradación in vitro adaptado de [237, 126]

104

ANEXO D Extracción de DNA de hongos

Figura 18 Método propuesto es el registrado por Mahaku modificado por [203].

105

ANEXO E Extracción de DNA de bacterias

Figura 19 Método para extraer ADN es la registrada por El centro internacional de agricultura Tropical-CIAT usando buffer de extracción (CTAB)

Tabla 16 reactivos requeridos con sus respectvas concentraciones, tomadas de [276]

Reactivo Concentración Cantidad

NaCl 5M 14mL

EDTA pH 8,0 0,5M 2,0 mL

Tris-HCl pH8,0 1M 5mL

SDS - 0,5g

Agua destilada esteril Aforar a 50mL

Figura 20 Cuantificación del DNA microbiano

Reactivo Concentración Cantidad

NaCl 1,4M 8,18mL

EDTA pH 8,0 20mM 4,0 mL

Tris-HCl pH8,0 100mM 10mL

CTAB 2% 2g

PVP 40 1% 1g

106

ANEXO F

PCR Discriminación entre grupos microbianos utilizando Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Figura 21 propuesta metodológica realizar técnica RFLP tomada y adaptada de [277].

107

ANEXO G1 Pruebas de identificación bacteriana

Figura 22 identificacion bacteriana utilizando, prueba de agar LIA, Kligler, tioglicolato y triptófano.

108

ANEXO G2.

Pruebas de identificación bacteriana

Figura 23 pruebas de identificación microbiana, bruebas de almidon, TCI, catalasa oxidasa

109

ANEXO G3 Pruebas de identificación bacteriana

Figura 24 pruebas de descarboxilacion de lisina ornitina, fenilalanina deaminasa

110

ANEXO G4

Figura 25 pruebas RM VP, OF y fermentación de glucosa

111

ANEXO H Tabla 17 Listado de sustancias para los medios y pruebas

Dilución agua destilada L Cajas de Petri.

M M B Fosfato de potasio monobasico 0,4g Matraces

Fosfato de potasio dibasico 1,6g Espátula.

Cloruro de amonio 1,5g Balanza analítica.

Cloruro de magnesio sexta hidratado 0,17g Agitador magnético.

Sulfato de sodio Hepta hidratado 1,5g Varilla para muestra.

Cloruro de calcio Di hidratado 0,045 Papel filtro estéril.

Agar noble (libre de impurezas). 15g Autoclave.

solución salina 0.85% esteril 99mL Campana de flujo laminar.

etanol tubos de vidrio de 15mL

polietileno esteril vórtex

streptomicina 1ml Varilla de vidrio

SM Cloruro de calcio monohidratado 5,11g papel aluminio esteril

Cloruro de Manganeso monohidratado 0,66g potenciómetro

Cloruro de sodio 1g

Cloruro ferrico sexta hidratado 1g

Cloruro de calcio Di hidratado 0,1g

Cloruro de cobre 0,01g

Cloruro de zinc 0,08g

Cloruro de aluminio 0,05g

Ácido Bórico 0,01g

Molibdato de sodio di hidratado 0,04g

Ácido láctico 10% 10mL

catalasa, Peróxido de hidrogeno 3% 1mL

oxidasa Dimetil-p- Fenilendiamina 1% 1mL Papel filtro estéril.

(OF) peptona 2g

Hugh-leifson Glucosa 10g

NaCL 5g

fosfato ácido de sodio 0.3g

agar-agar 3g

Azul de bromotimol 0,03g

fermentación proteasa de peptona 10g

glucosa Glucosa 10g

caldo glucosa púrpura de bromocresol 0,015

NaCl 5g

agua destilada 1L

agar TSI extracto de carne 3g

112

Extracto de levadura 3g

peptona 10g

sulfato ferroso 0,2g

Tiosulfato de sodio

agar agar

NaCL 5g

Glucosa 1g

proteasa de peptona 5g

rojo fenol 0,024g

agua destilada 1L

lactosa 10g

sacarosa 10g

tioglicolato Tripteína 17g Mechero bunsen


resazurina 0,001g

Peptona de soya 3g Asas de platino

Glucosa 6g Cotonetes

Cloruro de sodio 2,5g tubo eppendorf

Tioglicolato de sodio 0,5g

Agar 0,75g

L-cistina 0,25g

Sulfito de sodio 0,1g

rojo de metilo, Gradilla

RM-VP a-naftol 5% 0.6 ml tubos de cultivo

KOH 40% 0.2 ml

peptona 7g

Glucosa 5g

agua destilada 200mL

etanol 95%

Fosfato dipotásico 5g

UREASA Urea 20

Fosfato monopotásico 9,1

Fosfato disódico 9,5

Extracto de levadura 0,1

p- Dimetilbenzaldehido 0,1mL

agua destiada 1L

agar agar

Rojo fenol 0,01g

l SIM Triptofano 20mg

Peptona 6,1g

Sulfato de hierro y amonio 0,2g

Tiosulfato de sodio 0,2g

Agar 3,5g

113

reactivo de Erlich

Kligler Peptona de carne 13g

Cloruro de sodio 5g

Lactosa 10g

Triptona 10g

Glucosa 1g

Citrato de hierro y amonio 0,5g

Tiosulfato de sodio 0,3g

Rojo de fenol 0,025

Agar 15g

Moeller Peptona de carne 5g

Extracto de carne 5g

Glucosa 0,5g

Piridoxal 0,005g

Rojo de cresol 0,005g

Púrpura de bromocresol 0,01g

simmons Citrato de sodio 2g

Cloruro de sodio 5g

Fosfato dipotásico 1g

Fosfato monoamónico 1g

Sulfato de magnesio 0,2g

Azul de bromotimol 0,08g

Agar 15g

fenilalanina Extracto de levadura 3g

DL-Fenilalanina 2g

Fosfato disódico 1g

Cloruro de sodio 5g

Agar 12g

LIA peptona 5g


Glucosa 1g

L-lisina HCl 10g

citrato ferrico amónico 0,5g

tiosulfato de sodio 0,04g

agar agar 15g

purpura de bromocresol 0,02g

agar almidon extracto de carne 3g

almidón 10g

agar 12g

tinción Cristal violeta. 0,05 Microscopio óptico

Lugol de Gram. 0,005 Portaobjetos

Alcohol-acetona. 0,005 Asa de platino

Safranina. Agar macconkey 0,005 mechero

114

ANEXO I Tabla 18 Procedimiento sugeridos para la siembra tomada de [276]. Prueba medio /reactivo Procedimiento para la siembra

producción de sulfúro

Agar SIM siembra por punción

producción de indol


movilidad (motilidad)


fermentacion de carbohidratos

Agar TSI + caldo rojo de fenol y carbohidrato

siembra mixta, inoculación del medio con asa de argolla

Citrato Agar citrato de Simmons

siembra mixta

Rojo de metilo-Voges Proskauer

Caldo RM-VP inoculación del medio con asa de argolla

Ureasa Caldo urea inoculación del medio con asa de argolla

Descarboxilación de lisina

Agar LIA Siembra Mixta

Reducción de Nitratos

Caldo Nitrato inoculación del medio con asa de argolla

Catalasa Peróxido de Hidrogeno, 3%

Sobre un portaobjetos limpio realice el frotis de una colónia del microorganismo adicione 2 gotas del reactivo

Oxidasa tiras prueba de oxidasa Frote una colonia del microorganismo sobre el reactivo y realice las observaciones

Hidrólisis de Gelatina

Gelatina siembra por punción

Coagulasa Caldo BHI plasma de conejo

inocule el microorganismo en 0,5mL de caldo BHI e inocule a 37°C/24h concluída la incubación, adicione 0,5mL de plasma e incube a 37°C /4h (observe hasta las 1824h)

Hidrólisis del Almidón

Agar almidón o lugol de Gram

Realice una siembra por agotamiento e incube a 37° C /2h, Concluida la incubación, inunde las cajas con lugol de gram

Hemólisis Agar sangre Siembre el microorganismo por Agotamiento e incube a 37°C/24h

Caseína Agar nutritivo adicionado con skin milk

Realice una siembra por agotamiento e incube a 37° C /2h,

Desóxiribonucleasa

Agar DNAsa Realice una siembra por agotamiento e incube a 37° C /2h, Concluida la incubación, inunde las cajas con HCl 1M

Antibiograma Agar Moeller Hinton sensidiscos antibiótico

Siembre masivamente con hisopo estéril el microorganismo. Impregne cada sensidisco con un antibiotico diferente y repartalos equitativamente en la superficie de la caja, señalando en la parte posterior el antibiótico utilizado incube a 37°C /24h

115

ANEXO J1 Características preliminares bacterianas

Tabla 19 relación entre género y resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas tomada de [276].

reacción de Gram (cultivo fresco)

₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₋

Forma Coco Coco Coco Coco Bacilo

Bacilo

Bacilo

Bacilo

Bacilo

Bacilo

Bacilo

Bacilo

coco

Agrupación Racimos

Racimos

Cadenas

Tetradas

pares

Crecimiento aerobio ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊

Crecimiento anaerobio

₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₋

Esporas ₋ ₋ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₋

Movilidad ₋ ₋ ₋ ₋ ₋ ± ± ± ± ± ± ₊ ₋

Catalasa ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊

Oxidasa ₊ ₊ ₋ ₊ ₊

fermentar glucosa a ácido y gas

₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ± ₊ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₋

O/F ₋ O F F O

Micrococcus X

Staphylococcus X

Streptococcus X

Lactococcus X

Enterococcus X

Leuconostoc X

Pediococcus X X

Aerococcus X

Lactobacillus X

Clostridium X

Bacillum X X

Alcaligenes X

Pseudomonas X

Enterobacterias X

Aeromonas X

Chromobacterium X

Neisseria X

116

ANEXO J2 Tabla 20 algunas características preliminares bacterianas, +positivo, -negativo.

Genero Especie forma Gram Catalas Oxidas Movi aerobi Estrict/Facul espor

Achromobacte denitrificans Bacilo - + + Si Si F no

Acinetobacter baumannii Bacilo - + - No Si E No

Actinomicetes spp Bacilo + - - Si/no si F Si

Arthrobacter paraffineus Bacilo + + - Si/no Si E Si

Arthrobacter viscosus Bacilo + + - Si/no Si E No

Bacillus amyloliquefa Bacilo + + - Si Si F Si

Bacillus subtilis Bacilo + + - Si Si F Si

Bacillus megaterium Bacilo + + - Si Si F Si

Bacillus sphericus Bacilo + + - Si Si F Si

Bacillus pumilus Bacilo + + - Si Si F Si

Bacillus mycoides Bacilo + + - Si Si F Si

Bacillus thuringiensis Bacilo + + - Si Si F Si

Bacillus Circulans Bacilo + + - Si Si F Si

Bacillus brevies Bacilo + + - Si Si F Si

Bacillus cereus Bacilo + + - Si Si F Si

Bacillus halodenitrific Bacilo + + - Si Si F Si

Brevibacillus borstelensis Bacilo + + - Si Si F Si

Delftia acidovorans Bacilo - + + Si Si F No

Microbacteriu paraoxydans Bacilo + + - No Si F No

Micrococcus lylae Cocos + + - No Si F No

Micrococcus luteu Cocos + + - No Si F No

Moraxella rouxii Cocos - + + No Si F No

Nocardia steroids Bacilo + + + Si Si E No

Paenibacillus macerans Bacilo -/+ + - Si No F Si

Proteus vulgaris Bacilo - + - Si No F No

117

ANEXO J3 Tabla 21 algunas características preliminares bacterianas

Genero Especie form Gram Catalas Oxidas Mó Aerobi Estri/Fac espor

Pseudomonas aeruginosa Bacilo - + + Si Si E No

Pseudomonas putida Bacilo - + + Si Si E No

Pseudomonas syringae Bacilo - + + Si Si E No

Pseudomonas stutzeri Bacilo - + + Si Si E No

Pseudomonas mycoides Bacilo - + + Si Si E No

Pseudomonas fluorescens Bacilo - + + Si Si E No

Rahnella aquatilis Bacilo - + - Si No F No

Ralstonia eutropha Bacilo - + + Si Si F No

Rhodococcus ruber C208 Coco + + - Si Si E No

Rhodococcus erythropolis Coco + + - Si Si E No

Rhodococcus rhodochrous Coco + + - Si Si E No

Serratia marcescen Bacilo - + - Si No F No

Staphylococcu epidermidis Coco + + - No No F No

Staphylococcu aureus Coco + + - No No F No

Staphylococcu epidermidis Coco + + - No No F No

Stenotrophom

onas

spp Bacilo + - - Si Si F No

Streptococcus lactis Coco + - - No No F No

Streptococcus aureus Coco + - - No No F No

Streptomyces setonii Bacilo + - - No No F No

Streptomyces viridosporus Bacilo + - - No No F No

118

Figura 26 medidas a tener en cuenta para la preparación de la muestra cuenta una muestra blanco, de PE no tratado en las pruebas, y un control

negativo adaptado de [287].

ANEXO K1

Procedimiento para el análisis del polietileno usando FTIR

Preparación de las muestras

Para obtener una alta calidad en los espectros infrarrojos, el método apropiado para la preparación de la prueba debería ser seleccionado según las características de la muestra.Las siguientes observaciones deberían ser tenidas en cuenta a la hora de la preparación de la muestra:

119

Figura 27 Método propuesto para analizar el PE degradado

ANEXO K2

Procedimiento para el análisis del polietileno usando FTIR

Tabla 22 Técnicas de muestreo de FT-IR para el análisis del LDPE tomada de [272]

Forma de la muestra técnicas sugeridas

polvo fino (< 2 μm) ATR; DRIFT; Transmission (KBr)

Forma Irregular, pelets

ATR, DRIFT (abrasive sampling)

Flat, reflective surfaces

ATR, DRIFT (abrasive sampling); Specular reflectance

Single fibers ATR (diamond); FT-IR microscope

Polymer soluble in volatile solvents

Transmission (cast film)

Capas finas (< 25 μm) Transmission Large items DRIFT (abrasive sampling)

120

Figura 28 metodología para el análisis dde la evolución de CO2 usando GCMS

ANEXO L Cuantificación de la producción de CO2 y metabolitos

Tabla 23 condiciones óptimas de corrida cromatográfica

Figura 29 Cromatograma donde se muestran los gases cuantificados por CG-DCT.

Condición

Columna

control 1

Temperatura ambiente

25°C

Inyector 40°C

Detector 100°C

Gas acarreador Helio Flujo 55ml/min

Corriente 125mAmp

Tiempo de

corrida

5 min

121

ANEXO L2

Cuantificación de la producción de co2

E Identificación de metabolitos

El primer pico que sale es de inyección, el segundo corresponde a CO2, el tercero a O2, el cuarto a N2 y el quinto a CH4 (Fig. 4.3). Cuando se hace la integración de los datos, eliminar el primer pico de dicha integración, porque el resultado del área de cada pico se toma en porcentaje. Tomar la lectura del área del pico de CO2 en porcentaje.

Figura 30 metodología Adaptada de Bhone Myint kyaw [156]. Para ver los metabolitos reportados en la literatura (Ver la tabla 11)

revisiÓn bibliografica sobre los microorganismos

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