reporte final
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INTRODUCCIÓN
La industria bananera en nuestro país produce grandes cantidades de residuos ya
que de la planta solamente se aprovecha el fruto que constituye el 12 % en peso
siendo desechado el resto (Zuluaga y col., 2007). La producción de banano en
México es de aproximadamente 2 millones de toneladas métricas por año, la
especie Musa cavendish representa el 75% del total, de ahí que existe un gran
volumen de residuos de la industria platanera que podrían ser aprovechados si se
los transforma para darles un valor agregado.
El proceso de producción de proteína unicelular es una vía biotecnológica
adecuada para el aprovechamiento de desechos industriales ricos en
carbohidratos. De hecho, el principal factor limitante en la generación de proteína
unicelular es el alto costo de las fuentes de carbono, por lo que el uso de
subproductos es ideal (Durán 1989).
El interés por producir proteína unicelular fue estimulado por agencias
internacionales relacionadas con la salud, alimentación y agricultura ante la
evidencia de una escasez de proteína a nivel mundial (Bu-Lock y Kristiansen
1991), es por esto que la búsqueda de fuentes proteicas es vital (Chacón 2004).
Para la generación de biomasa a partir del banano de rechazo también es posible
el empleo de levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae, cuyo crecimiento
se logra si el banano de rechazo es hidrolizado previamente en glucosa y otras
sales, por medio de preparados que se vierten dentro de un sistema de
fermentación a nivel laboratorio (Mittal.1992). Esta especie de levadura presenta
una amplia utilización y aceptación en la industria para la alimentación animal y
humana, lo que podría resultar en una ventaja para su utilización (Liti et al. 2001).
La biomasa de origen unicelular tiene aplicaciones como suplemento proteico en
alimentación animal, además, se ha investigado su utilización en la fabricación de
ingredientes funcionales, suplementos proteicos, para resaltar el sabor de
alimentos procesados, entre otros (Lee 1996). Para su aplicación en la
alimentación humana, requiere el empleo de métodos para la reducción del nivel
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de ácidos nucleicos, ya que si son consumidos en altas proporciones podrían
causar la formación de cálculos renales u otras enfermedades. A diferencia de los
humanos, el ganado tolera altos niveles de ácidos nucleicos, por lo que la proteína
unicelular podría utilizarse inicialmente en alimentación animal sin requerir ningún
tratamiento (Lee 1996).
El estado de Tabasco produce una gran cantidad de musáceas. Exporta el 80%
del total de la producción. El 20% es utilizado para el consumo interno, consumo
animal y la industria, pero existe un significativo volumen de biomasa considerada
como desperdicio, con potenciales características para la obtención de alcohol.
Los componentes del banano de rechazo que tienen mayor importancia para ser
utilizados como sustrato son carbohidratos, proteínas y minerales (Quintero et al.
2001). Con el fin de lograr una utilización eficiente de estas sustancias, fue
importante elegir una levadura con adecuadas características fisiológicas como lo
fue Saccharomyces cerevisiae, adecuando al mosto a un proceso fermentativo
realizado en un biorreactor.
Se controlaron parámetros en cada corrida como: Potencial de hidrógeno (pH),
grados Brix, temperatura y contenido de azúcares totales. Se estandarizo el
proceso y se efectuaron las pruebas determinando así la efectividad del rechazo
de banano con una fuente de carbono importante para el crecimiento de levaduras
y la producción de biomasa, teniendo un significado importante dentro de esta
investigación.
JUSTIFICACIÓN
El aprovechamiento de los residuos orgánicos, como puede ser el banano de
rechazo, que por su grado de madurez o defectos en su apariencia, puede perder
su valor comercial, cobran especial importancia en la medida al generarse
alternativas de uso, recupera su valor como materia prima a la vez de reducir la
generación de residuos orgánicos que en su caso son fuente de contaminación de
suelos, aire y agua. Por ello en este proyecto se pretenden aplicar diversas
alternativas biotecnológicas que permitan su bioproceso y la generación de
productos diversos.
El uso de la biotecnología dentro del sistema de fermentaciones estudia el
crecimiento de levaduras del genero Saccharomyces cerevisiae, a nivel de matraz
y a nivel de fermentador, utilizando como fuente de carbono, la pulpa de banano.
El cultivo de las levaduras, tiene importancia comercial, ya que se pueden utilizar
en la elaboración de productos diversos como son: levadura para la elaboración
de pan, vinos, complementos alimenticios, enzimas, alimento para animales,
saborizantes, entre otros.
Con la utilización de este sustrato, se pretende minimizar los costos de producción
a mayor escala y hacer buen uso de subproductos de los procesos de la industria
del banano, los cuales son actualmente utilizados únicamente para uso
alimenticio sin aprovecharlo en su totalidad.
Los estudios de todo proceso de fermentación, llevan diversas etapas, desde lo
que corresponde a la optimización de requerimientos nutricionales y condiciones
fisicoquímicas a nivel de matraz, para pasar a la etapa a nivel de fermentador, en
los que se pueden estudiar además de los anteriores otros como son el efecto del
tipo de impulsor, la velocidad de este y los vvm`s, entre otros.
En el laboratorio de microbiología, se cuenta con un fermentador, sin embargo no
había sido posible dedicar el tiempo necesario para aprovechar el uso potencial de
este aparato, por ello se consideró en este trabajo permitiendo así su operación.
Partiendo en este proyecto desde, la traducción del manual, el establecimiento de
las condiciones de crecimiento a nivel de matraz y las pruebas a diferentes
condiciones de operación del fermentador, para evaluar las posibilidades que
ofrece el equipo.
El estudio de la variación de los componentes del medio, de los factores
fisicoquímicos como el pH (con control y sin control de pH) así como de la
alimentación de aire y velocidad del impulsor, son importantes, como etapa previa
al escalamiento de un proceso de fermentación a nivel piloto; estos estudios, solo
son posibles cuando se cuenta con un fermentador con las características
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adecuadas que aseguren la esterilidad del medio, así como la medición y control
de otros parámetros. El fermentador que fue adquirido para el laboratorio del
ITVH, tiene estas condiciones por lo que es importante su operación, para que a
futuro, se puedan proponer otro tipo de procesos.
El equipo cuenta con sistemas de medición y control, se pretende que de forma
complementaria a la parte de uso y operación del fermentador, se desarrolle un
software que permita su automatización y control, esta parte será llevada a cabo
por un estudiante de sistemas computaciones, dirigido por un profesor de esa
carrera.
Como etapa posterior a este proyecto, se pretende que se desarrollen otro tipo de
tecnologías, para procesos alternativos que permita la obtención de otros
productos.
OBJETIVOS
Objetivo general
• Aplicación de la biotecnología en el aprovechamiento de banano.
• Cultivo de levaduras por proceso de fermentación aerobia a nivel fermentador utilizando banano de rechazo.
Objetivos específicos• Establecer condiciones óptimas a nivel laboratorio para el cultivo de una cepa de
levadura y comparativo con los resultados a nivel fermentador.• Arranque y puesta en marcha de un fermentador de laboratorio y elaboración de
un instructivo de operación del fermentador.• Determinar el efecto de la variación de las condiciones de operación del
fermentador sobre el crecimiento de la levadura.
CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA DE TRABAJO
El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Microbiología del Instituto
Tecnológico de Villahermosa; ubicado en la carretera Villahermosa-Frontera Km.
3.5, Cd. Industrial de la Ciudad de Villahermosa, Tabasco.
El Instituto Tecnológico de Villahermosa junto con otros 78 institutos localizados a
lo largo y ancho del territorio nacional constituyen el Sistema Nacional de Institutos
Tecnológicos, que desarrollan actividades de educación en Ingeniería,
Arquitectura, Relaciones Comerciales y Administración.
Actualmente el Instituto Tecnológico de Villahermosa ofrece 8 carreras a nivel
ingeniería como son: Sistemas Computacionales, Química, Bioquímica, Industrial,
Civil, Ambiental, Gestión empresarial y Tecnologías de la información y las
comunicaciones y una a nivel licenciatura: Administración; así como 2 programas
de Postgrado entre ellos: la Maestría en Ciencias en Ingeniería Bioquímica y
Maestría en Planificación de empresas y Desarrollo Regional.
El Instituto Tecnológico de Villahermosa se encuentra certificado bajo la Norma
ISO 9001:2008 IMNC - RSGC – 544 y bajo esta norma su misión es formar
profesionistas competitivos, íntegros y con alto sentido de responsabilidad social y
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visión es ser una Institución líder en Educación Superior Tecnológica reconocida
nacional e internacionalmente.
El Laboratorio de Microbiología donde se llevaron a cabo las actividades de
investigación experimental está ubicado en el edificio H. del Instituto Tecnológico
de Villahermosa. El laboratorio cuenta con mesas de trabajo, todas equipadas con
servicio de gas, agua y electricidad, la iluminación es proporcionada por lámparas
de luz blanca, cuenta con ventiladores de techo, clima, refrigeradores, estufas
bacteriológicas, autoclaves, fermentadores, tarjas para el lavado de material,
cuenta con centrifugas y material de cristalería. Las instalaciones se mantienen
libres de a conglomerado de personas y los horarios para las actividades están
claramente definidos, cuenta además con los señalamientos adecuados,
extintores y botiquín de primeros auxilios.
PROBLEMAS A RESOLVER
El estado de Tabasco es catalogado como uno de los mayores productores de
banano a nivel nacional, ya que basándose en las estadísticas el 92 % del banano
que se produce en las diferentes regiones se utiliza para el consumo alimenticio,
generando un 8% de banano de desecho. La descomposición de una parte de
este ocasiona una contaminación ambiental debido a los gases generados por la
putrefacción, como el metano (CH4) y otros gases que se emanan directamente a
la atmósfera, causando daño al medio ambiente que en la actualidad es una
problemática mundial y de pérdidas económicas (INEGI, 2007).
El banano de rechazo también se ha sido utilizado como piensos de animales
(porcinos, ovinos caprinos entre otros), ya que es rico en almidón y puede ser
utilizado como sustrato para procesos fermentativos que permitan el máximo
aprovechamiento energético a través de la generación de otros productos que
maximicen le economía de nuestro estado y ponga en marcha el uso de la
biotecnología aprovechando los recursos naturales.
En el presente trabajo el problema a resolver es determinar el uso de banano de
rechazo como medio de cultivo para la producción de biomasa o proteína
unicelular a través de la levadura Saccharomyces cerevisiae utilizando un
biorreactor de tipo tanque agitado, ubicado dentro del laboratorio de microbiología
del Instituto Tecnológico de Villahermosa, cumpliendo con las especificaciones
necesarias requeridas y determinando así que el banano de rechazo puede ser
utilizado industrialmente como uso de medio de cultivo.
ALCANCES Y LIMITACIONES
Alcances
Con la ejecución de este proyecto de investigación se beneficiará a los alumnos
de la carrera de Ingeniería bioquímica ya que se pone en marcha el uso de un
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fermentador que no había sido utilizado desde su adquisición, obteniendo un
manual traducido al español que proporcionara la facilidad de su uso y con el cual
se pondrán generar diversas pruebas a nivel laboratorio para la obtención de
algún producto a partir de materiales biológicos.
De igual forma, también se conocerá y describirá el uso y aprovechamiento de
residuos orgánicos de un fruto como lo es el rechazo de banano y que es
producido en nuestro estado en grandes volúmenes y comercializado en
diferentes partes de nuestro país, que puede ser utilizado para otros fines como la
producción a gran escala de proteína unicelular, que conlleva beneficios a la
sociedad en cuanto a la rama de alimentos.
Limitaciones
Todo proyecto está sujeto a limitantes u obstáculos que se dan más que todo en
la fase de campo, en este caso los recursos financieros fueron las principales
limitaciones ya que era necesario requerir de un nuevo sensor de DO2, debido a
que el sensor original trae un defecto de fábrica en cuanto a la membrana y que al
momento de su calibración y uso presentaba ciertos errores de medición, limitando
de tal forma su uso.
CAPÍTULO 1
FUNDAMENTOS TEÓRICOS
1.1 El banano
El Banano o Plátano es el nombre común que se le da a la fruta comestible
producida por varios tipos de plantas herbáceas grandes con flores del género
Musa.
El fruto es variable en tamaño, color y firmeza, pero generalmente alargado y
curvado, de carne blanda rica en almidón cubierto con una corteza que puede ser
de color amarillo, púrpura o rojo cuando está maduro (figura 1).
Figura 1. Fruto de Banano
El plátano o banano es considerado como uno de los cultivos más importantes en
la agricultura. En frutas tropicales ocupa el primer lugar y es considerado como
una fruta básica en la alimentación mexicana, debido a su bajo precio, rico sabor,
disponibilidad en todas las épocas del año y su valor nutritivo en potasio, hierro y
vitamina k entre otros.
Las especies Musa son nativas de las regiones tropicales del sur y sureste de
Asia, su cultivo se ha extendido en por lo menos 107 países en las regiones de
Centroamérica y Sudamérica, así como de África subtropical; es el cuarto cultivo
más importante del mundo, después del arroz, el trigo y el maíz. Además de ser
considerado un producto básico y de exportación, constituyendo una importante
fuente de empleo e ingresos en numerosos países en desarrollo.
1.1.2 Producción y usos
De acuerdo a la información de la FAO (Organización de las Naciones Unidas para
la Agricultura y la Alimentación), en el año 2008 la superficie sembrada de plátano
y banano a nivel mundial fue de 10.21 millones de hectáreas. México ocupa el
lugar 23 en cuanto a superficie se refiere, el primer lugar lo ocupa Uganda con el
17.8% de las hectáreas totales sembradas, seguido de Tanzania con el 7.7%.
En el año 2008 se produjo un total de 125.05 millones de toneladas de plátano y
banano en el mundo ocupando México el 14º lugar como productor con el 1.73%,
seguido de Tailandia (1.59%), Costa Rica (1.57%) y Costa de Marfil (1.57%).
En el 2009 el plátano represento el 1.41% del valor total del PIB agrícola en el país
con un lugar de producción 4.514.29 millones de pesos. El régimen de producción
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nacional es equitativo pues 50% es de temporal y de riego el otro 50% de la
superficie cosechada (SIAP, 2009).
El número de productores a nivel nacional es de 5000 distribuidos en los estados
de Tabasco, Chiapas, Veracruz, Colima, Michoacán, Jalisco, Oaxaca, Nayarit,
Puebla y Guerrero con 800 mil jornales en producción y 88 mil jornales en
empaque respectivamente. Los principales estados en México por producción en
toneladas de plátano se muestran en la tabla 1 (SAGARPA, 2010).
TABLA 1. PRODUCCIÓN EN TONELADAS DE PLÁTANO POR ESTADOS EN LA REPÚBLICA MEXICANA.
Fuente: (SAGARPA, 2010)
Desde el año 2007 el estado de Tabasco ha sido el mayor productor de banano
en México y su producción ha venido creciendo desmesuradamente.
El municipio de Teapa en el estado de Tabasco ha sido el principal productor de
plátano en el país en los últimos siete años y representa el 95% del valor de la
producción agrícola del municipio. Dicha fruta se comercializa en el centro del país
y el excedente se exporta a países de Europa y Asia.
Los municipios de Centro y Cunduacán, Tabasco son productores en menor
proporción, pero representan un lugar importante dentro de la economía de
estado.
Del plátano que se produce en el estado de Tabasco, el 60% se destina para
procesos en la industrialización para usos comerciales como son:
Las frituras: para la cual se utiliza plátano maduro o plátano verde (Figura
2).
Los precocidos: patacón prefrito congelado, los tostones.
Los semiprocesados: plátano pelado y empacado al vacío, tajada madura
congelada y aborrajado.
La producción de harina, jugos entre otros completos en la alimentación.
Figura 1.2 Plátano frito en rodajas
1.1.3 Principales variedades de banano que se generan en el estado de
Tabasco
La variedad de plátanos que se cultivan en el estado de Tabasco es amplia, entre
las cuales destacan el plátano Tabasco o Roatán, dentro de los clasificados
encontramos las variedades como enano gigante, macho y Tabasco, sin clasificar
encontramos al criollo, valery, dominico, pera, manzano y morado; aunque sólo el
Tabasco en mayor medida, así como, el dominico y macho en menor medida, son
los que satisfacen el mercado externo, las variedades restantes se destinan
exclusivamente a cubrir el consumo interno.
El nombre de plátano se ha generalizado en toda la población, sin embargo, de
acuerdo a los especialistas, la mayoría de las variedades comerciales son
bananos, con excepción del plátano macho. Así, las distintas especies y
variedades de plátano se diferencian por su tamaño, la disposición y dimensiones
de las hojas, la forma y tamaño de los frutos, pero principalmente por la
conformación del racimo (SAGARPA, 2009).
1.1.4 Composición química y valor nutricional
El plátano maduro es un alimento muy digestivo, pues favorece la secreción de
jugos gástricos, por tanto es empleada en las dietas de personas afectadas por
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trastornos intestinales y en la de niños de corta edad. Tiene un elevado valor
energético (1.1-2.7 kcal/100 g), siendo una importante fuente de vitaminas B y C,
tanto como el tomate o la naranja. En las tablas siguientes, podemos observar la
composición nutricional del Plátano por cada 100 gramos de producto comestible.
Tabla 1.1 Nutrientes
Nutriente Por cada 100gAgua 6 5 . 2 8 g
Proteínas 1 . 3 gLípidos 0. 3 7 gCeniza 1 . 1 7 g
Hidratos de Carbono 3 1 . 8 9 g
Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon
Tabla 1.2 Hidratos de Carbono
Nutriente Por cada 100gFibra 2 . 3 g
Azúcares 1 5 g
Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon
Tabla 1.3 Minerales
Nutriente Por cada 100gCalcio 3 m gHierro 0. 6 m g
Magnesio 3 7 m gFósforo 3 4 m gPotasio 4 9 9 m gSodio 4 m gZinc 0. 1 4 m g
Cobre 0. 0 8 1 m gManganeso 0 m g
Selenio 0. 0 0 1 5 m g
Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon
Tabla 1.4 Vitaminas
Vitamina Por cada 100gVitamina C 1 8 . 4 m gVitamina B1 0. 0 5 2 m gVitamina B2 0. 0 5 4 m gVitamina B3 0. 6 8 6 m gVitamina B5 0. 2 6 m gVitamina B6 0. 2 9 9 m g
Vitamina B12 0 m gVitamina B9 0. 0 2 2 m gVitamina B7 1 3 . 5 m gVitamina E 0. 1 4 m gVitamina D 0 m gVitamina K 0. 0 0 0 7 m g
Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon
Tabla 1.5 Vitamina A (Antioxidantes Carotenoides)
Nutriente Por cada 100gAlfa Caroteno 4 3 8 gμBeta Caroteno 4 5 7 gμ
Beta Criptoxantina 0 gμLicopeno 0 gμ
Luteina y Zeaxantina 3 0 gμ
Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon
Tabla 1.6 Ácidos grasos
Nutriente Por cada 100gÁcidos grasos saturados 0. 1 4 3 g
Ácidos grasos monoinsaturados 0. 0 3 2 gÁcidos grasos poliinsaturados 0. 0 6 9 g
Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon
1.1.5 Etapas de madurez del banano
Los bananos se cosechan en estado verde-maduro (piel completamente verde
pero fisiológicamente maduros) y después, a su arribo a los mercados de destino,
se les aplica el tratamiento para inducir la maduración de consumo debido a que
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las frutas maduras en la planta a menudo se abren y resultan de una textura muy
pobre.
Se conoce como grado óptimo de corta o de cosecha, el estado de madurez
fisiológica de la fruta que permite un máximo aprovechamiento del racimo, sin que
exista maduración durante el transporte o almacenamiento, manteniendo la
lozanía y calidad, propicias de una fruta fresca para mesa. La madurez fisiológica
se correlaciona con el diámetro interno de los dedos y esta a su vez con la edad
de la fruta, por lo que es posible medirla y aplicarla a la cosecha para un buen
aprovechamiento de la fruta, la caracterización fisicoquímica del banano
dependiendo del grado de madurez la podemos observar en la tabla 2.
TABLA 1.7 CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DEL BANANO SEGÚN EL
GRADO DE MADUREZ.
G ra d o d e m a d u r e z1 2 3 4 5 6 7C o lo r d e c á s c a ra V e rd eV e rd e t ra z a sM á s v e rd e M á s a m a rri l l oA m a r i l l o c o n T o ta l m e n te T o ta l m e n te
a m a r i l l oq u e a m a rri l l oq u e v e rd ee x tre m o s v e rd e sa m a ri l lo sa m a ri l l o c o n p e c a s *C a ra c te rí s t i c a s% A lm i d ó n 1 7 . 7 3 1 3 .6 8 8 .7 6 4 . 9 6 2 .6 5 1 .7 3 0 . 8 2% A z ú c a re s to ta l e s 1 .3 2 3 .2 1 6 .5 7 1 1 .2 6 1 6 . 1 8 1 9 .5 1 9 .7 1% A z ú c a re s re d u c t o re s0 .5 7 1 .5 3 .2 7 5 . 8 6 8 . 6 1 0 .4 1 0 .3 2% S ó l i d o s s o l u b l e s , ° B ri x4 .6 9 7 .2 8 1 2 .4 8 1 7 .7 8 2 0 . 8 1 2 2 .1 2 2 .6 1p H 5 .2 4 5 .0 2 4 .8 7 4 . 7 7 4 .7 5 4 .7 8 4 . 8 8A c i d e z ( % á c id o m á l i c o )0 .4 1 0 .5 4 0 .6 3 0 . 6 7 0 .6 7 0 .6 2 0 . 5 2R a z ó n p u l p a / c á s c a ra1 .3 7 1 .4 5 1 .5 3 1 . 6 1 1 .6 9 1 .7 8 1 . 9 6% H u m e d a d 7 2 7 2 .3 2 7 2 .6 4 7 2 .9 7 7 3 . 2 8 7 3 . 6 1 7 3 .9 2* P u n to s c á f e s
Fuente: Sonia I. Chacón, F. V. (s.f.). Caracterización Fisicoquímica del Banano según el grado de
madurez. Costa Rica,América Central: Universidad de Costa Rica.
A medida que los bananos entran a la fase de maduración de consumo, el almidón
se convierte en azúcares, aumentando con ello su dulzura. Los ácidos orgánicos y
los aromas son también componentes importantes del sabor.
El banano en su etapa 7 de maduración pocas veces es aprovechado, más sin
embargo en muchos países ofrece una gran variedad de elaboración de
productos, transformados e industrializados, en forma cremas, pastas, pulpas,
puré, compotas, mermeladas en conserva, harinas, hojuelas, frutas en jarabe,
confitadas y congeladas, alimento para ganado y otros animales; Los
subproductos o abonos orgánicos procedentes del vástago que incorporan a la
plantación y los residuos que se generan en la cosecha, fibras y papel a base de
los pseudotallos, alcohol, aguardiente, vino, cerveza, vinagre de la fermentación
de la fruta.
1.2 Proteína Unicelular
La proteína unicelular está definido como concentrados proteicos obtenidos a
partir de algas, bacterias, levaduras y hongos filamentosos, cultivados en
condiciones fermentativas apropiadas y controladas que garantizan una adecuada
tasa de crecimiento, por medio del aprovechamiento de sustratos económicos,
enriquecidos con carbono, nitrógeno y fósforo (Jaimez, 1996; Molk et al., 2002;
FAO, 2003; Bustamante et al., 2003; Israelidis, 2003; Pelizer et al., 2003).
La proteína unicelular ha sido utilizada como concentrado proteico en la
formulación de alimentos balanceados principalmente aves y cerdos, y como
sustituto de leche para becerros. Existe gran cantidad de información disponible
en relación con la composición de células microbiana, incluyendo proteínas,
aminoácidos, vitaminas (especialmente de complejo B) y minerales.
Puesto que el valor nutricional y la seguridad desde el punto de vista toxicológico
depende factores complejos como tipo de microorganismos empleado,
condiciones de cultivo, presencia de contaminantes en las materias primas y otros,
la evaluación final de la calidad de estas proteínas debe de establecerse en
pruebas de alimentación animal, para determinar su conversión alimenticia,
digestibilidad y valor biológico (BV). Por sus características nutricionales, la
proteína unicelular puede jugar un papel importante en la producción pecuaria,
pero su producción ha sido limitada; la restricción para su producción son de tipo
económico más que tecnológico.
Por lo que se refiere al empleo de la proteína unicelular en la alimentación
humana, los autorizados y extractos de levadura tienen actualmente una
aplicación industrial y un mercado establecido, siendo un mercado potencial
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activo, debido a la tendencia para sustituir los productos químicos por productos
naturales.
La biomasa de levadura se cultiva en una variedad de compuestos energía-
rendimiento de carbono y fosfato y fuentes de nitrógeno en lote aeróbico y
sistemas continuos de cultivo. Durante el crecimiento de la levadura en el proceso
fed-batch, la adición de azucares que contiene el medio, usualmente son melazas
diluidas medibles que incrementan o minimizan la acumulación de etanol.
Esto es un sistema flexible, adecuados para pequeños y grandes fermentadores
[arriba de 60,000 galones (225m3)] y permite fácilmente la conmutación para
alternar con los sustratos y cultivos de levadura. La Biomasa por lo tanto es la
materia orgánica que puede usarse como una fuente de energía por sus
componentes químicos.
1.2.1 Importancia
Los microorganismos tales como algas, bacterias, levaduras y hongos han sido
considerados como fuentes de proteínas. El cultivo de microorganismos por su
valor nutricional se inició a finales de la Primera Guerra Mundial. Los alemanes
desarrollaron un cultivo de levaduras para su uso en los animales y las dietas
humanas. El término "levadura forrajera" fue acuñado (Braude, 1942; Weitzel y
Winchel, 1932; Schulein, 1937).
Después de la Segunda Guerra Mundial, su producción con las pentosas en licor
de sulfito se desarrolló en los EE.UU., y así mismo otros procesos de sustratos de
carbono se han venido desarrollando en el Reino Unido y se han venido utilizando
en la actualidad, tales como la melaza, pulpa de café, semilla de la palma y
Palmira, entre otros.
El interés en la producción de biomasa microbiana como alimento y forraje se
intensificó después de la década de 1950 y alcanzó su punto máximo hacia 1977.
El término "proteína unicelular (SCP)" fue inventado, y mucha información sobre
estos procesos se han publicado en un gran número de revistas (cf. Bibliografía).
Las características más importantes resultantes de la investigación de CPS se han
referido a los siguientes temas:
La diversidad de los sustratos utilizados y de su catabolismo (sustrato
renovable, masa fósil);
Selección y mejora genética de una gran variedad de microorganismos.
Los diversos microorganismos utilizados para la producción de biomasa y las vías
metabólicas implicados en el catabolismo de sustrato se han ido describiendo en
artículos citados; así como también aspectos fisiológicos, parámetros de
crecimiento, requerimientos nutricionales y la influencia de los parámetros
fisicoquímicos en diferentes procesos de distintos tipos de cultivo microbiano.
1.2.2 Microorganismos usados para la producción de biomasa.
La biomasa microbiana es el componente más activo del suelo, forma parte del
“pool” de la materia orgánica y cumple una función muy importante en el humus,
ya que interviene en los procesos de mineralización de nutrientes (Duchaufour,
1984), una vez muertos ponen a disposición de otros microorganismos y de las
plantas los nutrientes contenidos en los restos microbianos (Jenkinson y Ladd,
1981) y, por otro lado, también participan en la inmovilización. Así, los ciclos de
algunos nutrientes mayoritarios, como el carbono, demuestran que la biomasa
microbiana es clave en la dinámica de los nutrientes esenciales en el sistema
edáfico; por ello, algunos autores afirman que la biomasa microbiana y su
actividad en el suelo puede ser empleada como índice de comparación entre
sistemas naturales o como indicador de las variaciones sufridas en el equilibrio de
un suelo debido a la presencia de agentes nocivos o su manejo productivo (Doran
et al., 1994).
Los parámetros microbiológicos, y por lo tanto bioquímicos, sirven para indicar
posibles cambios netos en el equilibrio del suelo que no podrían detectarse con
métodos tradicionales (Brookes, 1985; Doran et al., 1994; García y Hernández,
2000). Algunos autores (Nannipieri, 1984; Brookes, 1985; Doran et al., 1994)
recomiendan indicadores sencillos de medir y de interpretar. Los más comunes
que se utilizan son, entre otros, la biomasa microbiana, la respiración del suelo y
las relaciones con la materia orgánica y el estado fisiológico del suelo, donde se
ve involucrada la energía en los procesos orgánicos.
17
Tabla 1.8 .Contenido de aminoácidos esenciales de microorganismos de interés
para la producción de biomasa (Litchfield, 1979; Bose et al, 1992).
Algunas fuentes de proteínas importantes involucradas por algunos
microorganismos para la producción de biomasa son las levaduras que utilizan
diversos tipos de sustratos para producir altas concentraciones que sirven para
producir una serie de materiales orgánicos consumidos por los seres vivos,
algunos otros se mencionan en la tabla 1.8
1.3 Levaduras
Las levaduras son microorganismos eucariotas clasificados en el reino fungi, con
1,500 especies descritas actualmente, son unicelulares y algunas especies con
formas de levadura pueden llegar a ser multicelulares mediante la formación de
una cadena de conexiones de células conocidas como pseudohifas, o hifas
falsas, como se observa en la mayoría de los moldes.
El tamaño de una levadura puede variar mucho dependiendo de la especie,
típicamente la medición es de 3 a 4 micras en diámetro, aunque algunas de ellas
pueden alcanzar más de 40 micras. La mayoría de las levaduras se reproducen
asexualmente mediante mitosis, y muchos lo hacen por un proceso de división
asimétrica llamado gemación.
Por fermentación, la especie de la levadura Saccharomyces cerevisiae convierte
los carbohidratos a dióxido de carbono y alcoholes. Durante miles de años el
dióxido de carbono se ha utilizado en la cocción y el alcohol en las bebidas
alcohólicas. También es un organismo modelo centralmente importante en la
investigación moderna de la biología celular, y es uno de los microorganismos
eucariotas más investigados a fondo. Los investigadores la han utilizado para
recopilar información sobre la biología de la célula eucariota y la biología humana
en última instancia. Otras especies de levaduras, tales como Candida albicans,
son patógenos oportunistas y pueden causar infecciones en seres humanos.
Las levaduras se han utilizado recientemente para la producción de etanol como
biocombustible industrial, a pesar de ser utilizadas también para la obtención de
otros productos importantes manufacturados en todo el mundo. Las levaduras no
forman una sola agrupación taxonómica o filogenética y su término se toma a
menudo como sinónimo para Saccharomyces cerevisiae, pero la diversidad
filogenética de estas se muestra por su colocación en dos filos separados:
Ascomycota y Basidiomycota. Las levaduras en ciernes o levaduras ("verdaderas")
se clasifican en las órdenes Saccharomycetales.
1.3.1 Principales levaduras industriales y su uso
De las 349 especies de levaduras descritas por taxonomistas solo un grupo (tabla
1.9) son de importancia económica (Loder, 1970). En este grupo de levaduras
destacan las cepas versátiles de Saccharomyces cerevisiae usados
universalmente en alimentos, relacionadas en la producción de fermentaciones y
bebidas. Para la biosíntesis de proteínas, sin embargo, la producción de Candida
utilis está creciendo relativamente, principalmente proporcionando biomasa seca
19
(no fermentada) como grandes suplementos para la formulación de alimento de
ganado.
Tabla 1.9 Especies de levaduras comúnmente usadas a nivel industrial
1.4 Género Saccharomyces cerevisiae
Género que fue propuesto por primera vez por Meyen ex E.C. Hansen en el año
1883. Saccharomyces cerevisiae es una especie de levadura, tal vez la más útil,
después de haber sido fundamental para la vinificación, cocción y elaboración de
la cerveza desde la antigüedad. Se cree que fue aislada originalmente de la piel
de la uva (se puede ver la levadura como un componente de la delgada película
blanca sobre la piel de algunas frutas de color oscuro tales como ciruelas, sino
que existe entre las ceras de la cutícula). Es uno de los organismos eucariotas
más intensamente estudiados como modelo molecular en biología celular (Figura
1.3), como el modelo de la bacteria de Escherichia coli (Brock T.D., Smith, D.W. y
Madigan, 1897).
Figura 1.3 Levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo detrás del tipo más común de
fermentación, sus células son de redondas a ovales, de 5-10 micras de diámetro,
se reproduce por división de un proceso conocido como ciernes, es uno de los
modelos más adecuados para el estudio de problemas biológicos, es un sistema
eucariota, con una complejidad sólo ligeramente superior a la de la bacteria pero
que comparte con ella muchas de sus ventajas técnicas. Además de su rápido
crecimiento, la dispersión de las células y la facilidad con que se replican cultivos y
aíslan mutantes, destaca por un sencillo y versátil sistema de transformación de
ADN. Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulación con las
mínimas precauciones.
S. cerevisiae es un sistema genético que, a diferencia de la mayoría de los otros
microorganismos, presenta dos fases biológicas estables: haploide y diploide. La
fase haploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad,
mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de complementación. Una
ventaja adicional de este microorganismo consiste en que se conoce la secuencia
completa de su genoma y se mantiene en constante revisión. Ello ha permitido la
manipulación genética de los casi 6600 genes que codifica el genoma de levadura,
el uso extensivo de micromatrices de ADN para investigar el transcriptoma y
estudios a escala genómica de, entre otros muchos aspectos, la expresión génica,
localización de proteínas y la organización funcional del genoma y el proteoma.
21
Por estas razones, S. cerevisiae se ha convertido en una importante herramienta a
gran escala de análisis de genómica funcional (Freedman B.A. 1998).
Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de
cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y
etanol durante el proceso de fermentación. Básicamente este proceso se lleva a
cabo cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azúcares (como
la D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras
rutas metabólicas que le permiten obtener un mayor rendimiento energético, y por
tanto no realiza la fermentación. Desde el punto de vista científico, este
microorganismo se ha empleado como modelo simple de la célula eucariota. Esto
se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su velocidad de
división celular (Lewin, B. 2001).
1.4.1 Requerimientos nutricionales
Todas las cepas de S. cerevisiae puede crecer aeróbicamente en glucosa, maltosa
y trehalosa y dejan de crecer en lactosa y celobiosa. Sin embargo, el crecimiento
en otros azúcares es variable. Galactosa y fructosa se demuestra que son dos de
los mejores azúcares de fermentación. La capacidad de las levaduras para utilizar
diferentes azúcares puede diferir dependiendo de si se cultivan aeróbicamente o
anaeróbicamente. Algunas cepas no pueden crecer anaeróbicamente en sacarosa
y trehalosa.
En todas las cepas se pueden utilizar amoniaco y urea como la única fuente de
nitrógeno, pero no se puede utilizar nitrato, ya que carecen de la capacidad para
reducir los iones de amonio. También pueden utilizar más aminoácidos, pequeños
péptidos, y las bases de nitrógeno como fuente de nitrógeno. La Histidina, glicina,
cistina, y lisina son, sin embargo, no utilizadas. S. cerevisiae no excretan
proteasas, de manera que la proteína extracelular no puede ser metabolizad
Las levaduras también tienen un requisito de fósforo, que se asimila como ion
dihidrógeno fosfato, y azufre, que puede ser asimilado como un sulfato de iones o
como compuestos de azufre orgánicos tales como los aminoácidos metionina y
cisteína. Algunos metales, como el magnesio, hierro, calcio, y zinc, también son
necesarios para un buen crecimiento de la levadura.
1.4.2 Factores fisicoquímicos
La levadura Saccharomyces cerevisiae crece en una serie de fermentadores.
Estos fermentadores son operados bajo condiciones aeróbicas (en presencia de
oxígeno libre o exceso de aire) de 0.6 a 0.9 v.v.m, (puesto que bajo condiciones
anaeróbicas (limitación o ausencia de oxígeno) los azúcares fermentables son
consumidos en la formación de etanol y dióxido de carbono, lo cual resulta en
bajos rendimientos de levadura. Este proceso de fermentación aeróbico es
exotérmico, lo cual implica que el fermentador debe ser enfriado para mantener la
temperatura bajo 30ºC, mediante agua de refrigeración, consiguiendo así la
temperatura óptima de crecimiento (Fajardo y Sarmiento, 2007)
La cantidad y tipo de melaza que se utiliza depende de la disponibilidad de cada
tipo de melaza, los costos, y la presencia de inhibidores y toxinas. Generalmente,
en la fermentación se utiliza una mezcla de los dos tipos de melaza. Una vez que
se mezclan, se ajusta el pH entre 4.5 y 5.0 porque una mezcla alcalina promueve
el crecimiento de bacterias. El crecimiento de bacterias ocurre bajo las mismas
condiciones que el crecimiento de la levadura, y esto hace que el monitoreo del pH
sea muy importante.
La melaza es clarificada, con el fin de eliminar cualquier impureza; luego el mosto
(melaza clarificada y diluida con el pH ajustado) se esteriliza con vapor a alta
presión. Después de la esterilización, se diluye con agua y se mantiene en un
estanque hasta que se necesite en el proceso de fermentación
23
La etapa inicial del crecimiento de la levadura tiene lugar en un laboratorio. Una
porción de cepas de levadura (levadura madre) se mezcla con el mosto de la
melaza en frascos esterilizados, y se deja crecer por 2 a 4 días. La fermentación
del cultivo puro se realiza en fermentadores normalmente de tipo batch donde la
levadura crece por un período de 13 a 24 horas (Campbell M, Shawn O. Farrell,
1986)
La etapa final de la fermentación tiene el grado de aireación más alta, y se
incrementa la alimentación de melaza y nutrientes. Esta etapa tiene una duración
que varía entre 11 y 15 horas. Después que toda la melaza y los nutrientes son
adicionados, el líquido es aireado por un período adicional de 0.5 a 1 hora para
permitir la total maduración de la levadura, permitiendo así una mayor estabilidad
para el almacenamiento refrigerado.
1.5 Cinética de microbiana
"El crecimiento de células, microorganismos, células vegetales y animales, puede
mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo.
a) Células individuales o población de células en crecimiento sincronizado
para estudio del ciclo de vida celular. Procesos en laboratorio.
b) División estocástica de la población, o división al azar.
La división celular se efectúa luego de un aumento en el tamaño de la célula,
duplicación del núcleo, división celular, división citoplasmática (salva los
organismos cenóticos). De ésta manera una célula da nacimiento a dos células
hijas de tamaño idéntico y conteniendo los mismos elementos estructurales y
potencialidades.
En el caso de las levaduras, y otros microorganismos, se presenta una variante
que es la gemación o botón. Se forma una pequeña protuberancia que aumenta
progresivamente de tamaño, luego se produce la división en el núcleo y migra
hacia el botón. Finalmente crece hasta un tamaño suficiente y posteriormente se
separa formando otra célula idéntica a la madre. Las células hijas, sin importar el
procedimiento de división celular, deben heredar todo el potencial genético y son
idénticas." (Muñoz A, 1997).
1.5.1 Medición del crecimiento microbiano
El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a
cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa
celular (peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad celular
(grado de actividad bioquímica con relación al tamaño de la población). Todos
estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos
indirectos.
Métodos directos:
• Recuento del número de células en una cámara
• Peso seco celular
• Determinación de nitrógeno o de proteínas totales
• Determinación de DNA
Métodos indirectos:
• Recuento de colonias en placa
• Recuento sobre filtro de membrana
• Consumo de oxígeno
• Liberación de dióxido de carbono
• Concentración de un enzima constitutivo
• Decoloración de un colorante
• Incorporación de precursores radiactivos
• Medida de la turbidez
25
No existe necesariamente una relación proporcional entre la biomasa y el número
de células, esta relación es más compleja para los microorganismos que crecen
formando agregados o ramificaciones (cultivos miceliales). En el caso de cultivos
miceliales (hongos, actinomicetos), los microorganismos pueden desarrollarse en
forma difusa en toda la masa de líquido o en forma discreta adoptando la forma
esférica (pellets).
La biomasa y el número de células que interesan determinar son los
correspondientes a los microorganismos activos, aquellos que realmente
participan en el bioproceso, no todos los microorganismos vivos o medidos como
viables están realmente activos. La actividad microbiana se mide por la velocidad
para realizar la transformación de interés por cantidad de microorganismos
presentes en el sistema considerado (velocidades específicas). La biomasa que
debiera usarse en las ecuaciones que describen y cuantifican procesos
microbianos es la “biomasa activa”. En la práctica, se mide la masa celular total y
paralelamente se hacen de medidas de viabilidad o actividad celular.
1.6 Biorreactores
Un biorreactor o fermentador es un dispositivo biotecnológico que debe proveer
internamente un ambiente controlado que garantice y maximice la producción y el
crecimiento de un cultivo vivo; esa es la parte biológica. Externamente el
biorreactor es la frontera que protege ese cultivo del ambiente externo:
contaminado y no controlado
Es un sistema, tal como una cámara de fermentación grande, que puede contener
organismos en crecimiento, tales como bacterias o levaduras en condiciones
controladas. Los biorreactores se utilizan en la producción biotecnológica de
sustancias tales como productos farmacéuticos, anticuerpos, o vacunas, o para la
bioconversión de residuos orgánicos (Houghton Mifflin Company, 2010).
El también conocido como fermentador o reactor, es un recipiente donde se lleva a
cabo el proceso de fermentación. Su función principal es mantener el medio y el
microorganismo en las condiciones adecuadas para lograr la mayor producción de
los compuestos de interés. Es deseable que un fermentador cumpla con una serie
de requisitos, entre los que se encuentran:
Un consumo bajo de energía
Capacidad para mantener un mezclado uniforme del medio de cultivo y el
microorganismo, con el mínimo de variaciones durante su operación.
Adaptación fácil a diferentes procesos.
Precio de acuerdo con las características del fermentador.
Transferencia de calor buena
Sistema de mezclado que mantenga los microorganismos separados entre
ellos para evitar un daño mecánico de las células.
Diseño mecánico simple.
Controles de pH, oxígeno disuelto y la temperatura
Facilidad en la toma de muestras.
Sistema de eliminación de calor.
Diseño que permita mantener condiciones de asepsia durante el proceso.
1.6.1 Tipos de fermentadores
Existen muchos tipos de reactores; cada uno se encuentra diseñado de manera
que pueda adaptarse a las condiciones de operación necesarias para optimizar la
producción del compuesto de interés. Los más utilizados son:
El matraz erlenmeyer
El reactor del tanque agitado
El reactor de elevación con aire, comúnmente conocido por su nombre en
inglés, airlift.
El reactor de disco rotatorio
Un ejemplo de ellos se observa en la figura 1.4 y 1.5
27
Figura 1.4 Biorreactor de tipo tanque
agitado Figura 1.5 Biorreactor tipo air-lift
1.6.2 Escalamiento de un proceso de fermentación
El escalamiento involucra el estudio de los problemas asociados a transferir la
información obtenida en el laboratorio (ml) y desde escala de planta piloto (litros) a
escala industrial (m3). Las condiciones de producción a pequeña escala no son,
por lo general, extrapolables a la escala industrial, debido a que la fluido dinámica
del sistema, los procesos de transporte y el comportamiento celular son diferentes.
Por ello, se aplica un proceso gradual, manteniendo una velocidad de
transferencia de oxígeno constante, así como la potencia consumida por unidad
de volumen, al tiempo que el tamaño del cultivo se va aumentando en proporción
1:10
En cada una de las etapas de escalamiento se evalúan algunos aspectos del
proceso:
1. Escala de laboratorio se llevan a cabo:
• La selección de cepas
• Estudios básicos de cinéticas de crecimiento
• Selección del medio, etc.
2. Planta piloto se optimizan las condiciones de operación
• Forma de operación
• flujos, presiones
• Temperaturas
• velocidades de agitación, etc.
3. Escala industrial se lleva a cabo la producción del producto de interés a niveles
rentables.
1.6.3 Criterios de escalamiento
Algunas de las correlaciones para el coeficiente de transferencia de masa y las
variables de diseño se siguen determinando los criterios de diseño.
• Cuando una fermentación se aumenta de escala, es importante que en la
escala mayor se utilice el valor de KLa óptimo encontrado en la escala más
baja.
• El conocer los valores potencia que se le suministra al biorreactor va a
perimir mantener y controlar el nivel de agitación. Al momento de aplicarlo
se debe tener cuidado de no sobrepasar los límites tanto de esfuerzo de
corte máximo y nivel de trasferencia de oxígeno mínima.
• El conocimiento detallado la variable del esfuerzo de corte, permite
mantener el nivel de agitación adecuado y óptimo. Esta variable deber ser
simple y evaluada en cualquier momento dado que se puede estar
trabajando con microorganismos que no resistan esfuerzos de corte
mayores que los establecidos. Debe prevalecer este criterio.
• El conocer un adecuado número de Reynolds, asegura un nivel de agitación
adecuado ya que indica si el régimen del fluido es turbulento o laminar.
• La tasa de bombeo F/V (flujo de aire/ volumen del líquido) asegura una
adecuada aireación del sistema, lo cual no asegura una adecuada
transferencia de oxígeno, por lo cual se debe verificar en el proceso.
Algunas de las ecuaciones basadas en estos enunciados se basan en la tabla
1.10 de criterios de escalamiento.
29
Tabla 1.10. Relación de criterios de escalamiento que se usan generalmente en
biorreactores (Biochemical Engineering, 2007).
1.6.4 Geometría
Generalmente, los fermentadores se construyen de vidrio o de acero inoxidable
generalmente, a base de hierro, níquel y cromo; el más usado para biorreactores
es el 316 L. A escala de laboratorio, su volumen oscila desde uno hasta cincuenta
litros y, a escala industrial, pueden llegar hasta los trescientos mil litros, el volumen
de trabajo es, aproximadamente el 80% del volumen total. La geometría estándar
de un reactor es cilíndrica, y se debe tener en cuenta la efectividad de la mezcla y
las consideraciones estructurales (Biochemical Engineering, 2007c).
A continuación en la figura 4 se muestra un esquema de las dimensiones
utilizadas en diseño del tamaño de un fermentador y en la tabla 8 se relacionan las
dimensiones que generalmente se caracterizan para varios tipos de biorreactores.
Figura 1.6. Esquema de las dimensiones de un biorreactor (Biochemical
Engineering, 2007c).
El cálculo de las dimensiones de un reactor, dado que la mayoría de los reactores
tienen forma cilíndrica, puede llevarse a cabo aplicando las relaciones mostradas
en el figura 1.6 complementadas con la fórmula de dimensiones para determinar el
volumen del cilindro:
V= πr^2 h
Donde V es el volumen, π es la constante Pi, r es el radio del cilindro, y h la altura
del cilindro.
La tabla 1.11 muestra la relación de dimensiones que se usan generalmente en
biorreactores
31
Relación Valores típicos Observaciones
Volumen de trabajo Vs.Volumen del tanque 0.7 a 0.8
Ecuación
Altura del líquido en el reactor Depende de la cantidadVs. Altura del reactor 0.7 a 0.8 de espuma producida en la
Ecuación fermentación
Diámetro Vs. Altura delreactor 1 a 0.3
Ecuación
Diámetro del agitador Vs La turbina Rushton es generalmenteDiámetro del tanque. 0.3 a 0.5 1/3 del diámetro del tanque.
Ecuación Agitadores axiales son más largos.
Diámetro de deflectores Vs. 0.08 a 0.1Diámetro del tanque Ecuación
Alto de la paleta del agitador 0.2Vs. El diámetro del agitador Ecuación
Ancho de la paleta del 0.25agitador Vs. El diámetro del Ecuaciónagitador
Tabla 1.11 Relación de dimensiones que se usan generalmente en biorreactores
(Biochemical Engineering, 2007).
El cálculo de las dimensiones de un reactor, dado que la mayoría de los reactores
tienen forma cilíndrica, puede llevarse a cabo aplicando las relaciones mostradas
en el cuadro anterior complementadas con la fórmula para determinar el volumen
del cilindro:
V= πr2 h
Donde V es el volumen, π es la constante Pi, r es el radio del cilindro, y h la altura
del cilindro.
1.6.5 Instrumentación y Control de un fermentador
Para llevar a cabo durante la fermentación medidas para el análisis de datos y el
control del proceso se han desarrollado sensores especiales para biorreactores
que difieren en cierto modo de los de las industrias químicas:
1) Todos los sensores localizados en el área estéril deben ser esterilizables.
2) Algunos sensores deben estar específicamente adaptados a las necesidades
bioquímicas.
Los parámetros físicos y químicos que se indican en la Tabla 9 pueden ser
medidos directamente en muchas plantas piloto o fermentadores de producción o
pueden ser medidos “in situ” en el laboratorio.
Fuente: (ITESCAM, 2010)
Los parámetros biológicos que se indican deben ser medidos fuera del
fermentador, con la excepción de la medida del NADH2 que puede ser medido “in
situ” por métodos fluorescentes. Existen interesantes novedades en el campo de
33
los electrodos enzimáticos, los denominados biosensores. Tales sensores, sin
embargo, no pueden ser esterilizados.
Un procedimiento normal es determinar en el aire que entra y que sale el O2 y el
CO2 por separado mediante las propiedades paramagnéticas del O2 y el espectro
de absorción en infrarrojos del CO2. Los sensores para medir estos gases están
bien desarrollados y funcionan con pocas interrupciones. Pero el espectrómetro de
masas es más versátil, ya que puede medir también N2, NH3, metanol y etanol
simultáneamente, así como dar información cuantitativa y cualitativa sobre el
intercambio de O2 y CO2. Mediante el uso de membranas permeables a los gases
es posible medir los gases disueltos en el medio nutritivo. Se han desarrollado
instrumentos que analizan hasta 8 gases simultáneamente en la fermentación.
Es fácil encontrar equipos para la medida precisa del pH. Existen combinaciones
de electrodos (electrodos de cristal, electrodo de referencia y compensador de
temperatura en una sola mitad) capaces de soportar las temperaturas de
esterilización y las tensiones mecánicas o debidas a la presión. El tiempo de
respuestas y la sensibilidad de estos electrodos son satisfactorios para los
requerimientos normales de los fermentadores.
Los ordenadores pueden facilitar el control y análisis de un conjunto de funciones
en los procesos de fermentación:
1. Optimización mediante ordenador.
Los ordenadores se utilizan en el salto de escala y evalúan los parámetros de la
fermentación y miden los efectos de parámetros individuales sobre el
comportamiento metabólico de los cultivos.
2. Control mediante ordenador.
Los ordenadores pueden controlar los procesos de fermentación. El control “in
situ” de la fermentación se utiliza ampliamente por muchas compañías a escala de
producción.
La aplicación de ordenadores en biotecnología se utilizan primariamente para la
adquisición de:
a. Adquisición de datos
b. Análisis de datos
c. Desarrollos de modelos de fermentación
CAPITULO II
METODOLOGIA
Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Microbiología del Instituto Tecnológico
de Villahermosa (ITVH), forma parte de un proyecto para poner en marcha y
operación un biorreactor que se encuentra ubicado en el mismo laboratorio.
35
2.1 Traducción del Manual
La traducción del manual tuvo como intención servir de consulta, el cual fue de
gran utilidad para el presente trabajo.
Esta traducción se hizo en conjunto con ayuda de alumnos de las carreras de
Ingeniería en sistemas computacionales e Ingeniería Bioquímica.
2.2 Etiquetado
Una de las formas para poder familiarizarse con este equipo y hacer de una
manera más fácil su uso fue etiquetar cada una de las partes que integran el
equipo, desde su base y accesorios así como también el panel frontal y trasero de
los 5 módulos que conforman el biorreactor, apoyándome en el manual del
biorreactor.
2.3 Ensamblado
El ensamblado se realizó en el Laboratorio de Microbiología del Instituto
Tecnológico de Villahermosa, localizado en la ciudad de Villahermosa, Tabasco
siguiendo la guía de operaciones del MANUAL No. M1273-0054 BioFlo 110
Modular Benchtop Fermentor elaborado por la compañía fabricante New
Brunswick Scientific Co., Inc.
Tomándose en cuenta los siguientes puntos:
• Preparación del área de localización
• Instalación de los 5 módulos del biorreactor
• Colocación de la base del recipiente
• Esterilización de todos los componentes añadidos a la placa del cabezal
• Instalación del recipiente (7.5 litros)
• Instalación de la placa cabezal
• Instalación de la manta de calor
• Instalación del deflector
• Instalación del impulsor
• Instalación del serpentín de enfriamiento
• Instalación del aspersor
• Instalación del tubo recolector
• Instalación del tubo de muestreo
• Instalación del termopozo
• Instalación de la sonda de espuma
• Instalación del tubo escape de espuma
• Instalación de la sonda de nivel
• Instalación de los tubos de adición
• Instalación de la sonda de pH
• Instalación de la sonda de oxígeno disuelto
• Instalación del condensador de escape
• Instalación del muestreador
• Instalación de la trampa de espuma
• Conexión de los puertos no utilizados
• Instalación del motor de agitación
• Instalación del rotámetro
• Instalación de la bomba de aire (5 galones)
• Instalación del sistema del líquidos de adición
• Conexión eléctrica y,
37
• Conexión de agua
2.4 Puesta en marcha del biorreactor
1. Se conectó el biorreactor a una fuente de energía usando el cable
apropiado para la Unidad de Control de Procesos del equipo.
2. Se llenó el recipiente del biorreactor a un volumen de 5 litros de agua
3. Se encendió el equipo y se visualizó que las luces de encendido
permanecieran activas
4. Se inició la operación del tablero, seleccionando el idioma en español en la
pantalla de la Unidad de Control de procesos
5. Se colocó la manta de calor alrededor de la jarra y se programó 121°C para
iniciar la esterilización de la jarra y los accesorios colocados en la placa
cabezal como son: el deflector, el impulsor, el serpentín de enfriamiento, el
aspersor, el tubo recolector, el tubo de muestreo, el termopozo, la sonda de
espuma, el tubo de escape de la espuma, las sondas de nivel y el tubo de
adición.
6. Se coloca una bomba de aire de 5 galones, la cual le da oxígeno al medio y
que va conectada al rotámetro para poder controlar la entrada de aire.
7. Al sensor del dióxido de oxígeno se le añadió el líquido electrolito en el
recipiente que cubre la membrana del tubo del sensor, tal como lo indica el
manual, manteniendo su monitoreo, este no fue colocado hasta después de
agregar el medio en la siguiente prueba.
8. Se inició la esterilización de la jarra y demás accesorios sin los sensores de
pH y DO2, dejando un puerto de uno de los recipientes de la placa del
cabezal abierto, y un adaptador de rosca fijo por sujeción, envolviendo los
filtros con una capa protectora de papel de aluminio al igual que las sondas
y los demás adaptadores con sus respectivos rodamientos y empaques.
9. Se calibró el sensor de pH en dos soluciones amortiguadoras desde el
biorreactor, monitoreándose desde la pantalla, dejándose listo para la
siguiente prueba.
2.5. Materiales y Equipos
• Microorganismo de trabajo: Saccharomyces cerevisiae
• Matraces Erlenmeyer estériles de 250 ml y 1000 ml
• Recipientes de licuadoras estériles
• Licuadora
• Espátulas estériles
• Cajas de Petri estériles, de 15 x 100 mm, de vidrio o de plástico
desechables
• Pipetas estériles de 1 ml (con graduaciones de 0.01 ml), de 5 y 10 ml (con
graduaciones de 0.1 ml)
• Micropipetas con puntas (estériles)
• Asa bacteriológica
• Tubos de ensayo con tapón (estériles) de 16 x 150 mm y 20 x 150 mm
• Gradillas para tubos de ensayo
• Magnetos para agitación
• Algodón
• Cubre objetos
• Cámara de Neubauer
• Probetas estériles de 100 ml
• Vasos de precipitado de 250 ml
39
• Tiras reactivas de pH
• Papel estraza
• Papel aluminio
• Parafilm
• Cinta testigo y adhesiva
• Pinzas
• Guantes
• Autoclave ( 121 °C durante 15 minutos )
• Refrigerador de laboratorio, 4 ± 2 °C
• Horno para esterilizar (160°C por 2 horas ó 180 °C durante 1 hora)
• Balanza granataria: 2000 g de capacidad, sensibilidad de 0.1 g
• Balanza analítica
• Mecheros Bunsen
• Microscopio óptico
• Refractómetro Atago (0-20% o 0-32%)
• Peachímetro digital
• Espectrofotómetro
• Agitador de laboratorio
• Agitador Vórtex
• Biorreactor de 7.5 L de capacidad
• Bomba de aire para peces (5 galones)
• Embudos
2.6 Medios
2.6.1 Medios para la purificación de las cepas de levadura
Los criterios de selección primaria son los aspectos visibles como morfología
colonial y microscópica, halos de víveres de indicadores de pH, halos de hidrólisis
de sustratos y en cualquier alteración física o química del medio que implique el
crecimiento y actividad microbiana o bien el desarrollo o inhibición de
microorganismos de prueba; en ocasiones solo el crecimiento de los
microorganismos en medios altamente restrictivos, constituye el único criterio de
selección primaria. El objetivo en este punto fue que a partir de una fuente natural
se pudiera realizar el aislamiento y la selección primaria de tres Levadura
comerciales de panificación para la producción de biomasa y/o proteína, utilizando
los materiales y métodos adecuados para su preparación (Tabla 10), en un Medio
sólido para el crecimiento de levaduras.
Tabla 2. Medios para la preparación de la cepa de levadura
COMPONENTE CANTIDADInfusión de papa 200.0 mLdextrosa 20 g/LAgar Bacteriológico 15.0 g/LAgua 1 litro
Método:
Se adicionaron 39 g del medio PDA en un litro de agua purificada calentando con
agitación suave hasta su completa disolución y homogenización, la muestra se
mantuvo así durante un minuto. Finalmente se esterilizo en una autoclave a 121 °
C (15 libras de presión) durante 15 minutos para después enfriar a una
temperatura de 45-50 °C vaciándolo en cajas de Petri estériles logrando así la
purificación de cada una de las cepas.
41
2.6.2 Medios de cultivos para el arranque
Los medios para la elaboración del inóculo que se utilizaron tanto para las
pruebas de arranque como para el objetivo final fueron: la melaza de caña y el
jugo del banano de rechazo.
a. Preparación de la melaza de caña como sustrato para la producción de la
cepa de Saccharomyces cerevisiae fue proporcionada por el laboratorio de
Microbiología industrial ya que es frecuente su uso para diversas prácticas,
utilizándolo como sustrato para el crecimiento de diferentes
microorganismos, ya que es una fuente importante de azúcares. A
continuación se presenta en la siguiente tabla los componentes y el
volumen utilizados durante el desarrollo del presente trabajo con el uso de
un biorreactor.
Tabla 2.1. Composición del medio de melaza de caña utilizada para la
fermentación.
Componentes CantidadMelaza de caña 1.0204 kg
Extracto de levadura 25 gSulfato de Magnesio 3.0 g
Sulfato de Manganeso 0.15 gAgua destilada (cbp) Completar el litro
La concentración de melaza de caña seleccionada se pesó y se disolvió en agua
esterilizada hasta alcanzar un volumen total de 5000 ml, se calentó y agitó hasta
su completa disolución y homogenización. Posteriormente se esterilizó por 20
minutos a 15 libras de presión en una autoclave dejándose enfriar por una hora y
finalmente se le adicionaron las sales especificadas en la tabla anterior.
b. Elaboración de macerado con banano de rechazo a partir de la pulpa de
banano de rechazo para la producción de la cepa Saccharomyces
cerevisiae fue obtenido por estrujado y filtrado y ajustado por disolución
con agua destilada utilizando la técnica descrita por Bonilla & González
(2000) para la elaboración de la pulpa de banano utilizada en la
fermentación. A continuación se presenta en la siguiente tabla los
componentes y el volumen utilizados durante el desarrollo del presente
trabajo con el uso de un biorreactor.
Tabla 2.3 Composición del sustrato de banano utilizado como medio de
fermentación.
Componentes CantidadPulpa de banano 1 kg
Extracto de levadura 25 gSulfato de Magnesio 3.0 g
Sulfato de Manganeso 0.15 gAgua destilada Completar el litro
Fuente: López et al., 2004
Método.
Se utilizó banano con grado 7 de maduración o banano de rechazo por
disolución con agua destilada a 23.5 ° Brix ajustando el pH a 4.8- 5.2, el
banano se lavó con agua fría y se escaldó por 10 min con vapor a una
temperatura de 80°C. Posteriormente se peló y se realizó una molienda con
43
una malla de 0.125 pulgadas con lo que se obtuvo una pulpa fina, este
concentrado se puso a baño maría por 10 min a 80 °C dejándose enfriar para
luego ser colocado en matraces de 1000 ml los cuales se esterilizaron en un
autoclave a 121°C/15 lb, para después verterlos en la jarra del biorreactor.
2.6.3 Técnicas fisicoquímicas utilizadas
2.6.3.1 Técnica del Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)
Es una técnica de óxido-reducción que se basa en la capacidad de la glucosa para
reducir el ácido 3,5-dinitrosalicílico bajo determinadas condiciones; esta reducción
produce una coloración que se hace más intensa a medida que aumenta la
concentración de azúcares reductores. Se evidencia por medio de la lectura de la
absorbancia en espectofotómetro, lo que conlleva a la aplicación de la Ley de
Beer- Lambert (Miller, 1959).
El fundamento de esta técnica consiste en la oxidación de la glucosa, sin
embargo, la glucosa en solución acuosa se encuentra en su forma cíclica que es
muy estable y por lo tanto, no reacciona. Por esta razón, es necesario calentar la
muestra para que el anillo se abra dejando expuesto el aldehído dando lugar a una
reacción de oxidación como se observa en la Figura 4 (Routh et al., 1990).
Figura 4. Estructura del anillo antes y después de ser sometido a un proceso de calentamiento
(http://www.infoagro.com/viticultura/vino/analisis_vinos5.asp).
Para que se dé la reacción también es necesario proporcionar un medio alcalino;
esto es posible gracias a la adición de NaOH el cual es una base fuerte. En
solución acuosa se ioniza liberando Na+ y OH- al medio, el cual se alcaliniza,
permitiendo la oxidación de la glucosa; en esta oxidación, el carbono del grupo
aldehído se convierte en un ácido carboxílico por la pérdida de hidrógenos y la
ganancia de oxígeno, obteniéndose de esta forma el ácido glucónico; por otro
lado, el ácido 3,5 dinitrosalicílico es reducido gracias a la acción del tartrato de
sodio y potasio y de la oxidación de la Glucosa. Esta técnica fue utilizada para
hacer la preparación en base a los siguientes volúmenes de reactivos (tabla 13),
calculados en base a los fundamentos estipulados por Miller.
Tabla 2.4. Técnica Miller DNS
Agregara a la Mezcla: CantidadAgua destilada 1416 mL3,5 Acido Dinitrosalicílico 10.6 gHidróxido de sodio 19.8 gDisolver sobre, añadir:Sales (tartrato de sodio y potasio) 306 gFenol (a 50° C) 7.6 mLMetabisulfito de Sodio 8.3 g
Autor: Miller 1959
2.6.3.2 Curva Patrón DNS
.A partir de cada una de las soluciones hidrolizadas de sacarosa y en tubos
protegidos por la luz, se procede con el siguiente protocolo para la adición de los
siguientes reactivos que se muestran en la tabla 2.5.
Número de Tubos
1 2 3 4 5 6
Glucosa 0 mL 0.1 mL 0.2 mL 0.3 mL 0.4 mL 0.5 mLAgua Destilada 0.5 mL 0.4 mL 0.3 mL 0.2 mL 0.1 mL 0 mLDNS 1.5 mL 1.5 mL 1.5 mL 1.5 mL 1.5 mL 1.5 mL
Tabla 2.5 Datos obtenidos para realizar la curva patrón de la técnica DNS
Método:
1) En una rejilla se colocaron 6 tubos de ensayo añadiéndoles los reactivos
correspondientes.
2) Se agitaron los tubos en Vórtex.
3) Se llevaron a ebullición a 92ºC durante 5 minutos.
4) Se frenó la reacción con agua fría durante 5 minutos.
5) Se adicionaron 8 mL de agua destilada a cada uno de los tubos.
45
6) Posteriormente se realizaron las determinaciones de absorbancia (540nm)
ajustando el 0 de absorbancia con el blanco de la prueba.
7) Por último, con los datos obtenidos se realiza una curva patrón, para la
determinación de la concentración de azucares reductores.
2.7 Obtención de la cepa Saccharomyces cerevisiae.
Se partió del uso de 3 levaduras liofilizadas comerciales para panificación y se
realizaron los siguientes pasos:
1. Activación de las levaduras comerciales sembrada en PDA
2. Purificación de S. cerevisiae.
3. Mantenimiento de S. cerevisiae.
4. Inoculación del medio de cultivo
2.7.1 Activación de la levadura comercial
Las levaduras liofilizadas comerciales para panificación, S. cerevisiae, se activaron
usando agua estéril. Se esterilizaron 9 tubos de ensayo (16 x 150 ml) con 10 ml de
agua destilada cada uno. A cada tubo se le agregó un inóculo de 1.0 g de levadura
liofilizada de diferente marca en un área protegida de contaminación con
mecheros bunsen. Se colocaron en un baño maría a 35°C por 30 minutos. Se
incubaron en un horno a 28°C por 24 horas, después de los cuales se midió el pH
de un tubo de diferente levadura comercial con un potenciómetro. Finalmente se
tomó una muestra por frotis simple y se observó el crecimiento celular en un
microscopio óptico.
No existió contaminación microbiológica en las muestras, y por lo tanto se realizó
el aislamiento de la levadura S. cerevisiae como se describe a continuación.
2.7.2 Purificación de S. cerevisiae
El aislamiento de la levadura se realizó mediante el empleo de un medio selectivo;
PDA (Gutiérrez y Gómez, 2008; Yegres et al., 2003; Zapata et al., 2002) en esta
etapa se realizó la toma de muestra y siembra en condiciones asépticas.
Del producto obtenido en la etapa (I) se tomó con un asa de inóculo del tubo, se
sembró en PDA por estría y se incubó en una estufa a 28 ºC durante 5 días. Se
observó el crecimiento obtenido.
2.7.3 Mantenimiento de S. cerevisiae
Se tomó una asada de la cepa pura obtenida en la etapa anterior y se sembró
mediante la técnica de estriado en cajas Petri y tubos de ensaye en medio de
cultivo PDA. Los medios inoculados se incubaron a 28 ºC durante 5 días.
Posteriormente, para descartar la posibilidad de contaminación microbiológica, se
realizó la observación del crecimiento obtenido en el microscopio.
2.7.4 Inoculación del medio de cultivo
Se toman las resiembras de tubos inclinados y se procede a pasar 3 asadas a los
10 ml de agua previamente esterilizados. Teniendo ya las suspensiones, se toma
lectura de ellas en un espectrofotómetro obteniendo diferentes absorbencias para
cada una de las muestras
2.8 Pruebas preliminares de fermentación con melaza de caña
2.8.1 Experimentos a nivel biorreactor
El medio de cultivo utilizado para las dos pruebas preliminares fue la melaza de
caña, la cual presentó algunos resultados precisos y determinados en relación a la
puesta en marcha del biorreactor y a la producción de levaduras, siendo así como
posteriormente se pudo trabajar con el medio de cultivo seleccionado para este
trabajo como lo fue el jugo del banano de rechazo.
47
La melaza de caña fue tratada y extrapolada a un Biorreactor (Modelo Bioflo 110
New Brunswick Scíentific Co., Inc) de 7.5 litros de capacidad de acuerdo a la
siguiente metodología:
2.8.2 Activación de la cepa.
Descrita anteriormente en el punto 2.7.1
2.8.3 Preparación del inóculo.
Para obtener una concentración aproximada de 5 x 105 Levaduras /mL; al cultivo
de dos tubos inclinados se le adicionaron 5 mL de agua destilada estéril (para
remover las levaduras del micelio) y de ambas suspensiones de cada tubo se
transfirieron a dos matraces de 200 mL los cuales contenían una dilución de agua
destilada con dextrosa, después ambos matraces se mantuvieron en un agitador
mecánico durante 12 horas a una temperatura de 28°C,posteriomente se contaron
las levaduras en un hemocitometro hasta obtener un promedio de 50 levaduras
entre los cuatro cuadrantes, equivalentes a 5 x 105 Levaduras/mL. Estos matraces
fueron el medio de activación para la melaza de caña que fue utilizada para el
crecimiento de biomasa dentro del biorreactor manteniéndose de la misma forma
un monitoreo constante de su funcionamiento.
2.8.4 Producción de Levaduras
Del cultivo anterior de la solución dextrosa se depositaron IxlO6 levaduras/mL al
Biorreactor de 7.5 litros de capacidad conteniendo 5 litros del medio de cultivo de
melaza de caña manteniéndose una agitación rotatoria y un monitoreo constante
de los lazos de control. Los experimentos con melaza de caña se fueron
realizando sin duplicado.
2.8.5 Condiciones de fermentación.
Para tratar de encontrar una alta concentración y una mayor sobrevivencia de las
levaduras se utilizaron dos combinaciones de aereación y agitación presentados
en la tabla de resultados para ambos medios con un tiempo de proceso
determinado y una temperatura constante. El tiempo de proceso se consideró por
12 horas para obtener una buena concentración de levaduras.
Para controlar la espuma se utilizó el antiespumante tipo "A" de siliconas Dow
Corning al 10%, agregándose durante la fermentación bajo condiciones
necesarias. Durante el proceso de fermentación se colectaron muestras de 10 mL
del Biorreactor cada 3 horas para determinar lo siguiente: ° °Brix, concentración
de levaduras /mL, y pH presentadas en la tabla de resultados; también se tomaron
lecturas del porciento de Oxígeno consumido. Al terminar el proceso se obtuvieron
resultados que se fueron analizando a detalle durante el proceso, determinando
de esta forma nuevas condiciones de uso con el medio de cultivo de jugo de
banano de rechazo.
2.8.6 °Brix
A las muestras colectadas cada 3 horas se les determino la concentración de
Solidos Totales Disueltos (°Brix) con un refractómetro marca Atago HSR-500 ya
que esta considerado como un estándar en la industria, siendo utilizados por las
universidades y profesionales del sector industrial alimentario
2.8.7 Cuenta de Levaduras.
A las muestras colectadas cada 3 horas se les determinó la concentración de
Levaduras/mL, por el método de recuento celular en cámara de Neubauer. De
cada uno de las muestras obtenidas, se tomó 1.0 mL y se diluyó con 9.0 mL de
agua destilada estéril, contenida en tubos de ensaye (dilución 1:10);
posteriormente se efectuaron diluciones de 1:100 y 1:1000. Finalmente se efectuó
un recuento de las levaduras en el hemocitometro y se reportaron Levaduras/mL.
49
2.8.8 Medición de pH
Se mantuvo monitoreando la medición con el potenciómetro del biorreactor a las
muestras colectadas cada 3 horas. En las pruebas con melaza de caña no se
consideró controlar el pH, únicamente fue monitoreado en todo el transcurso del
proceso.
2.8.9 Seguimiento para el control de dO2
La medición se realizó con el mismo sistema del biorreactor que incluye un sensor
de DO2 el cual se iba monitoreando consecutivamente a las muestras colectas
cada 3 horas.
2.8.10 Azúcares reductores
Se determinaron las concentraciones de azúcares reductores para todas las
muestras colectadas cada 3 horas, diluyéndose si en su caso el contenido de
azucares reductores fuera mayor a 1mg/mL para que se encontrara el rango de 0
a 1mg/mL de glucosa, después se tomaba una alícuota de 0.5 mL y se agregaban
1.5 mL de solución de DNS, se agitaban en el vórtex y después se calentaban en
agua hirviendo por 5 minutos hasta que cambiara la coloración de ámbar claro a
oscuro, se aforaban a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y se volvía a
homogenizar dejándose enfriar y leyendo la absorbancia en el espectrofotómetro
a 540 nm calibrando con el blanco, para cada muestra.
Con las lecturas de la curva patrón se hacía una regresión lineal de concentración
de glucosa contra absorbancia y se calculaba la ecuación de la regresión lineal
correspondiente por medio del programa Excel. Sustituyendo el valor de
absorbancia de la muestra en la ecuación de regresión se calculaba la
concentración de azúcares reductores expresados como glucosa, al dato obtenido
se multiplicaba por la dilución.
2.9 Experimento central de fermentación con banano de rechazo
En esta parte del trabajo el medio de cultivo con el que se trabajo fue con la pulpa
de banano de rechazo (etapa 7) al cual de la misma forma que la melaza de caña
presenta resultados óptimos según la literatura en cuanto a la producción de
levaduras , este medio fue seleccionado y extrapolado en un biorreactor de cinco
litros de capacidad pero con diferentes concentraciones durante su preparación y
siguiendo diferente metodología en base a la obtención de resultados que
concretaran el crecimiento de biomasa a través de este medio de cultivo y a la
monitorización del proceso en cuanto a las funciones correlacionadas a ello.
Durante la experimentación se emplearon tres reactivos más, todo grado reactivo.
En lo que respecta a la formulación del jugo del banano se empleó fosfato de
potasio; peptona, y fosfato potásico (básico). Para el sistema de biorreacción se
empleó la levadura comercial de panificación que tuvo mejor desarrollo durante su
inoculación.
La metodología a seguir fue la misma que la melaza de caña, solo que aquí se
realizando 4 corridas con muestreo doble:
CAPITULO III
RESULTADOS
En éste capítulo se analizan los resultados obtenidos del presente trabajo,
encontrándose como parte importante la traducción del manual, el ensamblado y
funcionamiento del biorreactor marca Bioflo modelo 110 conteniendo una
fermentación alcohólica con dos medios de cultivo distintos, uno de ellos utilizado
para pruebas de arranque (melaza de caña) y el otro como objetivo primordial para
el desarrollo del presente trabajo (banano de rechazo),haciendo con ambos
medios análisis del crecimiento de microorganismos, medición de sólidos solubles
totales (°Brix), azúcares reductores totales y la monitorización respecto al
funcionamiento del sistema de regulación de pH y DO2 en el Bioflo 110.
51
3.1 Resultados obtenidos con la traducción del manual
La traducción del manual del biorreactor Bioflo 110 facilito la operación del equipo
siguiendo las pautas de funcionamiento, sin provocar daños a este, ni lesiones
personales.
Se pudo dar marcha al proceso ya que se encontró la ubicación correcta para
poder colocar los módulos del biorreactor en un lugar específico centrándose en
una de las mesas del laboratorio de microbiología, ya que es una zona lisa, plana
y resistente, con suficiente espacio alrededor de la parte trasera y la parte frontal
que nos permitió un buen acceso para su correcto funcionamiento.
3.2 Resultados obtenidos del ensamblado
El ensamblado determino los puntos claves para el funcionamiento de todo el
proceso tomándose en cuenta desde las conexiones eléctricas de todos los
módulos que fueron dirigidos en la parte trasera con un voltaje de electricidad
suministrado de 110v así como las conexiones que fueron dirigidas al biorreactor
como son la de los sensores requeridos que se situaron en la parte frontal de los
módulos y que fueron monitoreados gracias a un simulador de procesos centrado
en el primer módulo del sistema.
En cada ensamble o desensamble de los componentes del recipiente se manejó
una forma adecuada como el recostar la unidad a la placa frontal y al eje del
impulsor de agitación utilizando la posición correcta en una superficie solamente
plana, protegiendo de esta forma el eje del impulsor del peso como lo muestra la
figura 3.
Fig. 3 Manejo correcto del conjunto de la transmisión
Poniendo en práctica el buen uso del manual se puede mencionar de forma
secuencial la operación del ensamblado de la siguiente forma:
1. Ensamblado del recipiente
El recipiente se empotro en una base de acero inoxidable la cual tiene cuatro pies
de goma que le dio estabilidad, alrededor de ella se colocó una manta de calor
que es la que mantuvo el control de la temperatura al contenido del recipiente para
el medio y gracias a una ventana localizada en esta, el cultivo permaneció durante
todo el proceso visible para su inspección.
2. Instalación del recipiente en la base
Se colocó el anillo de bloqueo en la base del recipiente alineando lo agujeros del
anillo de bloqueo, con los pilares de soporte y deslizándolos a su lugar para dejar
descansar sólidamente el hombro de cada capilar.
Se colocaron las dos gomas de parachoques alrededor del interior del anillo de
bloqueo, presionando las dos gomas al borde interior del anillo, para después
descender el recipiente de vidrio a través del centro del anillo de bloqueo, hasta
que los bordes del recipiente descansaron cómodamente en los parachoques de
las gomas, orientando el recipiente a manera que las graduaciones en el vidrio
fueran claramente visibles encarando a las personas encargadas del proyecto
entre los dos pilares de la base del recipiente.
3. Instalación del deflector
53
Se colocó suavemente la placa deflectora, con la lengüeta hacia arriba, alrededor
de todos los demás instrumentos que sobresalían de la placa del cabezal,
incluyendo el serpentín de enfriamiento.
4. Instalación del impulsor.
Para la fermentación colocamos las hojas del impulsor de acuerdo a la tabla 3,
refiriéndonos a los 7.5 litros.
Tabla 3. Distancia desde el fondo de la placa superior al comienzo de la hoja
del impulsor
1.3 L 3.0 L 7.5 L 14 L
Impulsor inferior 4 1/8 in
105 mm
6 11/16 in
170 mm
8 7/8 in
225 mm
12 in
305 mm
Impulsor superior 2 5/8 in
67 mm
4 in
102 mm
6 ½ in
165 mm
9 ¼ in
235mm
Se lubricaron ligeramente todas las juntas tóricas, hilos y hebras de todos los
adaptadores del puerto con grasa de silicona antes de instalar el equipo en la
placa superior.
También cada vez que se lavaba y se volvía a ensamblar el biorreactor se
aseguraba que el anillo de la placa superior estuviera bien asentado en su
ranura.
5. Instalación del serpentín de enfriamiento
Por debajo de la placa superior, se insertaron ambos extremos del serpentín de
enfriamiento, tanto el puerto de entrada como el de salida, en ambos puertos se
colocaron adaptadores estriados que se fueron fijando con la mano
asegurándolos con la llave allen.
6. Instalación del rociador
Por debajo de la placa superior se insertó el tubo rociador en el orificio indicado
para este y de la misma forma se fijaron los tornillos del adaptador con la llave
allen.
7. Instalación del tubo de cosecha
En el ensamblado del tubo de cosecha se insertó en la placa superior en el puerto
del tubo de la cosecha, fijando un adaptador estriado con la mano y de la misma
forma utilizando una llave allen para fijar los tornillos de sujeción.
8. Instalación del tubo muestreador.
Trabajando por debajo de la placa superior, se instaló el puerto del tubo
muestreador, fijando un adaptador estriado con la mano y de la misma forma
utilizando una llave allen para fijar los tornillos de sujeción.
9. Instalación de la sonda de espuma
Se instaló la sonda del sensor de espuma por encima de la placa superior en la
ranura indicada por el manual, de la misma forma se fijó a mano el adaptador
estriado utilizando la llave allen para poder asegurarlo.
10. Instalación del tubo de escape de espuma
Por debajo de la placa superior se insertó el tubo de escape de espuma en el
puerto apropiado dentro de la tuerca de sujeción en la que va montada la trampa
de espuma, fijando a mano el adaptador estriado y asegurando los tornillos de
sujeción con la llave allen.
11. Instalación de la sonda de nivel
Se utilizó una sonda de nivel como parte del sistema antiespumante para detectar
el nivel del medio.
Trabajando desde arriba de la placa superior, se inserta la sonda de nivel en el
puerto correspondiente, apretando a mano el adaptador estriado.
12. Instalación de los tubos de adición
55
En la parte de la placa superior, se insertó el triport o tubo de adición de tres
puertos, dentro del puerto apropiado de la placa, se insertaron dos mangueras de
silicona de que fueron colocadas en dos puertos del tripor o (puertos de tres) que
se adecuaron para las adicciones del ácido-base y antiespumante, apretando la
parte estriada del adaptador del triport con los dedos.
13. Instalación de la prueba de pH
Antes de la instalación, la sonda de pH que se utilizo fue inspeccionada de daños
para reemplazarla si en su caso esta estuviera dañada, esta sonda se colocó de
una manera que no hubiera interferencia entre las demás sondas, el conjunto de
deflectores, palas impulsoras y serpentín de refrigeración.
Se tuvo problemas al momento de fijarla a la placa del cabezal, ya que el
adaptador estriado que le correspondía no se encontró dentro de los aditamentos
y fue fijada con algodón y cinta tape para proteger al medio de una contaminación.
14. Instalación de la prueba de DO2.
Antes de la instalación, la sonda de oxígeno disuelto que se utilizo fue
inspeccionada de daños, para reemplazarla si en su caso estuviera dañada, esta
sonda se colocó de una manera que no hubiera interferencia entre las demás
sondas y el conjunto de deflectores, palas impulsoras y serpentín de refrigeración.
La sonda fue cubierta ligeramente con glicerol, esta se deslizo suavemente por la
parte superior del adaptador estriado del puerto colocándole unos casquillos
blancos de plástico antes de insertarla por completo en el puerto como lo indica el
manual. Esta sonda se iba ajustando a la altura deseada.
15. Instalación del sistema de muestreo.
El biorreactor Bioflo 110 tiene un sistema opcional de muestreo que está diseñado
para eliminar asépticamente los residuos de muestras del lote utilizado .Toda esta
instalación del paquete de muestreo puedo ser desinfectada en un autoclave
como se hizo desde el inicio del uso.
La instalación de este sistema se hizo de la siguiente forma:
a. Se retiró la tuerca de fijación que esta adyacente al plato del cabezal y se
colocó el brazo de soporte del tubo de la toma de muestras por medio del
tornillo de sujeción.
b. Se colocaron 8 centímetros de manguera de silicona que van dirigidos a dos
extremos, uno al de la toma de muestras y otra a un tubo que sobresale a la
parte exterior de la plato del cabezal, asegurándose la manguera con una
abrazadera de plástico.
c. Se le conectó a la jeringa estéril un filtro que hace que la muestra quede libre
de impurezas
d. En otra manguera de silicona que sobresale de otro extremo del brazo de
soporte se colocó la jeringa con el embolo cerrado.
e. Se retiró la tapa de una de las botellas de muestra y se colocó dentro del
muestreador, fijándola en forma de rosca alistándolo para su uso.
16. Instalación de la trampa de espuma
1. Se desenrosco la tuerca de fijación en la parte de la placa superior (o la
tuerca de sujeción de base), donde fue montada la trampa en la base del
recipiente que quedo más cercano al tubo de escape de la espuma.
2. Se colocó una arandela en el tornillo de sujeción antes de montar la trampa
de espuma del portabotellas, fijándose también el soporte en su lugar con
la tuerca de sujeción suficientemente floja como para girar el soporte.
3. Después se colocó una botella de trampa de espuma de 500 ml en el
soporte.
4. Habiéndose realizado esta instalación se conectó una manguera de silicona
de 60 centímetros de largo en el tubo más largo que contiene el tapón de la
botella asegurándose este con una abrazadera de plástico y que fue fijado
en la parte superior con el tubo de escape de espuma que va coloca en el
plato del cabezal sujetado con una abrazadera y fijándose a mano el
adaptador estriado del tubo de escape de espuma.
57
17. Instalación del sistema antiespumante.
En este caso se instaló un matraz con un tubo de salida de 500 ml que contenía
el líquido antiespumante. El matraz de adición del antiespumante se conectó con
una manguera larga de silicona al tubo de adición de antiespumante que se
encuentra situado en la placa del cabezal pasando anteriormente por la bomba
peristáltica que automáticamente adicionaba el antiespumante cuando el
controlador de nivel se activaba.
Finalmente como lo indican la figura 3a y 3b, cuando el plato del cabezal estuvo
cubierto por los aditamentos que requeríamos y que eran necesarios para trabajar
con el equipo se fueron cerrando los puertos no utilizados instalando un tapón
ciego (sin agujero) en cada puerto de la placa del cabezal, fijando de igual forma
las mangueras de silicona con una abrazadera de plástico y manteniendo cerrado
cualquier tubo de acceso que no fuera utilizada, de esta manera se pudo iniciar la
operación del equipo comenzando con las primeras pruebas de arranque con el
medio de melaza y continuando con lo que finalmente fue el jugo de banano de
rechazo.
Figura 3a y 3b Muestran los resultados obtenidos por el ensamblado para su total
funcionamiento.
3.3 Resultados de las pruebas preliminares con melaza de caña
El Bioflo permite variar las velocidades de agitación. Para la primera prueba se
determinó una velocidad de agitación óptima de 250 r.p.m a 1.5 v.v.m de flujo de
aire para efectuar una fermentación alcohólica en el Biorreactor; con éste fin se
configura el sistema de temperatura, regulación de pH y de oxígeno disuelto,
empleando melaza de caña como medio de cultivo para determinar cada 3 horas
desde el tiempo de inicio la concentración de °Brix, azucares reductores y conteo
de levaduras de igual forma se sigue el monitoreo constante del funcionamiento
del sensor de oxígeno disuelto y del pH.
Tabla 3.1 Resultados obtenidos de la primera prueba de arranque con melaza de
caña como medio de cultivo.
59
HORAS TIEMPO AGITACIÓN °BRIX pH dO2 CONTEO DE LEVADURAS0 0 250 rpm 5 5.15 80 10,112,0003 1 250 rpm 4 4.36 36 10,800,0006 2 250 rpm 3.5 4 -0.34 15,400,0009 3 250 rpm 2.5 3.18 20 26,300,000
12 4 250 rpm 1 3 20 35,540,000
A velocidad de agitación de 250 r.p.m. se presenta turbulencia automática a las 3
horas, se visualiza que el parámetro de oxígeno disuelto arroja un dato negativo,
el sistema de agitación se desajusta y provoca que la velocidad del impulsor
automáticamente aumente a 1400 r.p.m provocando la formación de espuma, lo
cual no es deseable que se presente en el proceso de fermentación y se agrega el
antiespumante lo que hace que disminuya el nivel de espuma y se continúe con la
operación reiniciando la operación de agitación a 250 r.pm.
Para la segunda prueba se prevé calibrar de nuevo las sondas de pH y de oxígeno
disuelto, se realiza la esterilización nuevamente de todo el equipo y la melaza es
diluida a 10 °Brix, aquí se trabajan en diferentes condiciones determinando una
velocidad de agitación óptima de 350 r.p.m a 2.5 v.v.m de flujo de aire, se inicia el
proceso obteniéndose los siguientes resultados mostrados en la tablas 3.1 y 3.2.
Tabla 3.2. Resultados obtenidos de la segunda prueba de arranque con melaza de
caña como medio de cultivo.
HORAS TIEMPO AGITACIÓN °BRIX pH dO2 CONTEO DE LEVADURAS0 0 350 rpm 6.5 6.15 75 10,346,0003 1 350 rpm 5 5.18 70 22,200,0006 2 350 rpm 4.5 4.64 76 37,700,0009 3 350 rpm 3.5 4.12 60 42,000,000
12 4 350 rpm 2 3.36 20 56,900,000
Las gráficas de crecimiento para cada fermentación se presentan a continuación
con el fin comparativo de las mismas.
3.3.1 Resultados de sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa
Debido a que todas las muestras tomadas se midieron a 28 °C no fue necesario
realizar corrección con tablas a los datos obtenidos.
Gráfica 3.Curva comparativas de °Brix para fermentaciones con melaza de caña
El porcentaje de sacarosa medido a las 12 horas de cada fermentación fue de 1 y
2 % de sacarosa.
3.3.2 Resultados de crecimiento de microorganismos
Para las dos fermentaciones con melaza de caña, se presentan los datos de
crecimiento determinados por el conteo cámara Neubauer con los rangos de error
de precisión respectivos. Se calculó de acuerdo a la formula enunciada en el
procedimiento para conteo de microorganismos. Únicamente de manera preliminar
se mantuvo el sistema de regulación de pH sin control del Bioflo, observándose
que en el transcurso de la fermentación se formó un precipitado debido a la baja
solubilidad del Carbonato de calcio en el medio, presentando problemas para
realizar conteo de levaduras. En estas pruebas de arranque no se detectaron
diferencias significativas entre ambos tratamientos a pesar de que sensor del
oxígeno disuelto presento unas fallas debido a un daño situado en la punta de la
membrana.
En esta segunda prueba la melaza fue diluida a 10 °Brix determinándose de esta
manera una mayor producción de levaduras con los inóculos vertidos de la
solución de dextrosa.
61
Gráfica 3.1 .Curvas comparativas de crecimiento de levaduras para
fermentaciones con melaza de caña sin control de pH.
3.3.3 Resultados de azúcares reductores residuales
Los resultados obtenidos de la curva de calibración para los azúcares reductores
se presentan en la gráfica 3.2, así como también se presenta la tabla 3.3 y 3.4 en
la cual se localizan las concentraciones de los estándares empleados para la
curva de calibración, presentando en ambas fermentaciones una regresión lineal
de 0.9719 y 0.9733, lo cual nos determina que el método es confiable para poder
utilizarla y para determinar la concentración de azúcares reductores presentes en
el medio de cultivo de melaza de caña en el cual durante el transcurso de la
transformación nos da el azúcar residual presente y de esta manera se obtiene
información concerniente a la formación de levaduras a partir de los azúcares
presentes.
Tabla 3.5. Concentraciones estándares utilizadas para la curva de calibración de
la 1ª fermentación con melaza de caña.
HORAS AGITACIÓN ABSORBANCIA CONCENTRACIÓN A.R (mg/mL)0 250 rpm 0.675 0.7213 250 rpm 0.6 0.6546 250 rpm 0.523 0.5759 250 rpm 0.41 0.51
12 250 rpm 0.31 0.367
Tabla 3.6. Concentraciones estándares utilizadas para la curva de calibración de
la 2ª fermentación con melaza de caña.
HORAS AGITACIÓN ABSORBANCIA CONCENTRACIÓN A.R (mg/mL)0 350 rpm 0.73 0.823 350 rpm 0.693 0.76
6 350 rpm 0.553 0.689 350 rpm 0.442 0.525
12 350 rpm 0.332 0.41
Gráfica 3.2 Curvas comparativas de azúcares reductores en los medios de
melaza de caña.
3.4 Resultados de las pruebas centrales con banano de rechazo 1ª y 2ª
corrida sin control de pH
En ambas corridas se pudo mantener al sistema con un ambiente favorable para
la operación del proceso biológico deseado, asegurando la mezcla y la aireación
adecuada, no hubo contaminación del medio debido a que toda la esterilización
del material fue un éxito. El contenido máximo de oxígeno realmente fue bajo
El sistema de aspersión se aseguró correctamente y fue lo que hizo que las
burbujas fueran de tamaño muy pequeño, de modo que la disolución del oxígeno
de la burbuja en el seno del líquido puedo efectuarse con facilidad.
Tabla 3.6. Resultados obtenidos de la 1ª corrida con banano de rechazo como
medio de cultivo con agitación a 250 rpm, sin control de pH.
TIE M P O A G ITA C IÓ N °B R IX p H A B S O R B A N C IA ( 540 n m )C O N TE O D E LEV A D U R A S /1-1000 250 rp m 5.5 6.15 0.69 166,000,0003 250 rp m 5 5.45 0.61 194,000,0006 250 rp m 4.5 4.09 0.58 285,000,0009 250 rp m 4 3.51 0.54 312,000,00012 250 rp m 2 3.15 0.48 422,000,000
Tabla 3.7. Resultados obtenidos de la 2ª corrida con banano de rechazo como
medio de cultivo con agitación a 350 rpm, sin control de pH
63
T I E M P OA G IT A C I Ó N° B R I X p H A B S O R B A N C I A ( 5 4 0 n m )C O N T E O D E L E V A D U R A S / 1 - 1 0 00 3 5 0 r p m 5 5 . 4 5 0 . 7 3 1 2 0 , 0 0 0 , 0 0 03 3 5 0 r p m 4 . 5 5 . 1 0 . 6 9 3 1 6 8 , 0 0 0 , 0 0 06 3 5 0 r p m 4 4 . 0 9 0 . 5 5 3 7 2 4 , 0 0 0 , 0 0 09 3 5 0 r p m 3 3 . 5 1 0 . 4 4 2 1 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0
1 2 3 5 0 r p m 2 3 . 1 5 0 . 3 3 2 1 , 2 1 2 , 0 0 0 , 0 0 0
Grafico 3.3 Curva comparativas de °Brix para fermentaciones con banano de
rechazo, sin control de pH
Grafico 3.4 Curva comparativas de pH para fermentaciones con banano de
rechazo, sin control de pH
Grafico 3.5 Curva comparativas de Absorbancia para fermentaciones con banano
de rechazo, sin control de pH
65
Grafico 3.6 Curva comparativas de conteo de levaduras para fermentaciones con
banano de rechazo, sin control de pH
3.6 Resultados de las pruebas centrales con banano de rechazo 3ª y 4ª
corrida con control de pH
El Biorreactor Bioflo 110 consta de un sistema de cuatro bombas peristálticas
asignables dependiendo la variable a controlar. Cada bomba tiene un modo de
funcionamiento y operación dependiendo del parámetro a controlar en una
fermentación discontinua o continua. Los modos de funcionamiento son los
siguientes:
• Modo Off: En éste modo la bomba no tiene ningún funcionamiento ya que
no responde al Feedback Control Loop. La bomba se encuentra apagada.
• Modo Manual: Este modo funciona cumpliendo ciclos variables de las
bombas. Se le asigna un valor especifico entre 0% y 100%, que determina
un caudal para un porcentaje de velocidad.
Tabla 3.7 Resultados obtenidos de la 3ª corrida con banano de rechazo como
medio de cultivo con agitación a 350 rpm, con control de pH
TIE M P O A G IT A C IÓ N °B R IX p H A B S O R B A N C IA ( 540 n m )C O N T EO D E LE V A D U R A S /1- 1000 350 rp m 6 6.15 0.82 4 1 78,0 00,0 003 350 rp m 5.5 6.15 0.78 5 2 06,0 00,0 006 350 rp m 4.5 6.15 0.71 8 2 59,0 00,0 009 350 rp m 3 6.15 0.62 9 3 94,0 00,0 00
12 350 rp m 2 6.15 0.59 6 4 72,0 00,0 00
Tabla 3.8 Resultados obtenidos de la 4ª corrida con banano de rechazo como
medio de cultivo con agitación a 250 rpm, con control de pH
T I E M P O A G IT A C IÓ N ° B R IX p H A B S O R B A N C IA ( 5 4 0 n m )C O N T E O D E L E V A D U R A S / 1 - 1 0 00 2 5 0 r p m 6 6 .1 5 0 . 6 1 8 3 5 8 , 0 0 0 ,0 0 03 2 5 0 r p m 5 6 .1 5 0 . 5 2 9 4 1 0 , 0 0 0 ,0 0 06 2 5 0 r p m 3 . 5 6 .1 5 0 . 4 2 2 5 7 6 , 0 0 0 ,0 0 09 2 5 0 r p m 3 6 .1 5 0 . 3 8 9 6 2 0 , 0 0 0 ,0 0 0
1 2 2 5 0 r p m 0 6 .1 5 0 . 2 8 5 7 2 3 , 0 0 0 ,0 0 0
En las tablas 3.7 y 3.8 se puede apreciar el funcionamiento correcto del sistema
Bioflo 110 en el Modo Base y Acido, el sistema de regulación de pH entró en
funcionamiento, el modo ácido y base en las bombas peristálticas realizaron la
acción de control de pH a un valor específico de 6.15, de igual forma el Modo On
funciono cumpliendo una operación de velocidad fija en la bomba y su valor fue de
125%, donde la bomba funcionó de manera continua.
Para calcular la variación de pH a lo largo de las fermentaciones, se presentan en
las tablas 3.7 y 3.8 los porcentajes de variación de pH. El porcentaje de variación
se calculó comparando dos valores en la fermentación, uno comparando el valor
de pH del día final respecto al inicial y otro comparando el valor de pH mayor
durante la fermentación respecto al pH más bajo en la misma. Los porcentajes de
variación de pH calculados en la 3ª y 4ª corrida.
67
Grafico 3.7 Curva comparativas de °Brix para fermentaciones con banano de
rechazo, con control de pH.
El porcentaje de sacarosa medido para todos los medios de la fermentación de la
3ª y 4ª corrida fue del 2 %., disminuyendo los STD en el medio.
Grafico 3.8 Curva comparativas de pH para fermentaciones con banano de
rechazo, con control de pH.
Grafico 3.9 Curva comparativas de Absorbancia para fermentaciones con banano
de rechazo, con control de pH
Grafico 3.10 Curva comparativas de conteo de levaduras para fermentaciones
con banano de rechazo, con control de pH
69
CONCLUSIONES
• Se elaboró una traducción completa del manual y funcionamiento del
sistema del biorreactor Bioflo 110, dirigiendo el funcionamiento del sistema
en cuanto a la regulación de pH y dO2, para el manejo de flujos de entrada
y salida en el biorreactor a diferentes velocidades de flujo.
• El desarrollo de estos cuatro experimentos de fermentación bajo regulación
de pH a 6.15, temperatura constante de 28 °C, agitación de 250 rpm en el
Biorreactor marca Bioflo 110 presentó un mayor rendimiento en cuanto a
variables tales como crecimiento de levaduras .El control de la variable pH
presentó una incidencia directa en el desarrollo de una fermentación
mejorando el rendimiento de acuerdo a la formación de producto y
crecimiento de la levadura.
• De acuerdo a los parámetros determinados en una fermentación con
regulación de pH, el crecimiento de microorganismos y en la producción de
en la biomasa, consumo de sacarosa, variación de sólidos solubles,
contenido de azúcares reductores residuales son reproducibles en el
biorreactor ya que presentan similitud en las dos fermentaciones realizadas
• El jugo de banano presentó un alto potencial de uso como sustrato en los
procesos fermentativos logrando altos rendimientos con respecto a los
valores teóricos reportados, lo que lo convierte en un sustrato promisorio
para las fermentaciones alcohólicas. Cada uno de los procesos por
separado arrojó buenos resultados, permitiendo concluir que el jugo de
banano es un sustrato promisorio en los procesos de inmovilización que
permiten incrementar su productividad. Sin embargo en el caso del
Biorreactor se requiere considerar otro tipo de sustratos.
• Se pudo observar como Saccharomyces cerevisiae una vez adaptada al
medio es capaz de incrementar su biomasa a través del consumo de
71
sustratos, en este caso, la glucosa, al tiempo que incrementa la acidez del
medio y disminuye su pH, efecto ejercido por el ácido acético producido
durante su metabolismo. Su crecimiento es rápido, el corto tiempo de
adaptación al medio así como una amplia fase lag demuestra el porqué de
su amplia utilización en la industria, así que el monitoreo de la cinética de
crecimiento de microorganismos es de gran importancia, ya que nos puede
permitir definir el tiempo de reacción que necesita un sustrato determinado
para obtener un producto deseado, o en su defecto se pueden definir las
condiciones de un reactor BioFlo 110 con estos parámetros.
RECOMENDACIONES
• Antes de utilizar el equipo, se recomienda leer todo lo referente al manual de
mantenimiento general del equipo, manual de operación en proceso y
recomendaciones generales del uso de equipo.
• De igual manera, es muy importante tener un sustento teórico de los fenómenos
de las fermentaciones alcohólica y acética, para así realizar una correcta fase
experimental llevada de la mano con un correcto conocimiento teórico.
• Se recomienda ser cuidadosos durante el uso y almacenaje del equipo, para
evitar daños en la integridad tanto física, eléctrica y mecánica.
• Operar correctamente, aplicando las buenas prácticas de manufactura (BPM) en
cada proceso.
• Se recomienda implementar equipos auxiliares o de asistencia en los laboratorios
o planta de alimentos en la universidad, tales como: Refractómetros, balanzas,
potenciómetros, medidor de ppm, alcoholímetros, cubas y recipientes, tamices y
equipos de filtración, agua filtrada, reactivos, etc.
BIBLIOGRAFÍA
Aranda, A., Matallana, E. y del Olmo, M. (2005) Levaduras. Saccharomyces I.
Levaduras de primera fermentación. In Microbiología del vino. Carrascosa, A.V.,
Muñoz, R., y González, R. (eds). AMV Ediciones, pp. 19-56.
ALBA D. y Sierra R. Determinación de la incidencia de diferentes substratos en un
proceso de fermentación utilizando Saccharomyces. Tesis de grado. Universidad
de La Sabana, Ingeniería de Producción Agroindustrial, 1999.
ALEIXANDRE, J.L. Revista Alimentaria. Factores que intervienen en la
composición del un vino. Noviembre de 1998.
73
ALVAREZ, José. La viña, la vid y el vino. Editorial Trillas, México, 1991.
BONILLA H. y Martínez V. Manejo y funcionamiento del biorreactor Bioflo 110 en
una fermentación alcohólica a 30 °C. Tesis de Grado. Universidad de La Sabana,
Ingeniería de Producción Agroindustrial, 1999.
BROCK, Thomas y Madigan M. Microbiología. Editorial Prentice Hall. Sexta
edición, México, 1993.
MADRID, A. Revista de alimentación, equipos y tecnología. Sistemas de control y
mejora de la fermentación en la producción de vinos. Marzo de 1991.
MERCHAN C. Y Castillo A. Manejo y funcionamiento del biorreactor Bioflo 110
Bench Fermentor en tres fermentaciones alcohólicas a 25°C. Tesis de Grado.
Universidad de La Sabana, Ingeniería de producción Agroindustrial, 1999.
OWEN, Ward. Biotecnología de la Fermentación. Editorial Acribia S.A. España,
1991.
Revista de alimentación, equipos y tecnología. Control en un proceso de
fermentación. Junio de 1993.
SUAREZ, J. A. Microbiología enológica. Editorial Mundiprensa. España, 1990.
TREVAN, M. Biotecnología: principios biológicos. Editorial Acribia S.A., 1990.
TUITE, M. Saccharomyces. Biotechnology Handbooks. Editorial Plenum Press.
New York, 1991.