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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIERREZ

MAESTRÍA EN CIENCIAS EN INGENIERÍA BIOQUÍMICA

““Optimización de la viabilidad del Lactobacillus

plantarum encapsulado por secado de aspersión

empleando redes neuronales” ”

Protocolo

PRESENTA:

IBQ. Gerardo Alfredo Culej Vázquez

DIRECTOR DE TESIS:

Dr. Miguel Abud Archila

Tuxtla Gutiérrez, Chiapas Noviembre de 2013

Índice Resumen 4

1.0 Introducción 5

2.0 antecedentes 6

2.1 probióticos 6

2.2.Tipos de estrés a los que son sometidos los probióticos 6

2.3 Factores que afectan el crecimiento de los probióticos 7

2.4.Factores que afectan la supervivencia de los probióticos 8

2.5.Estabilización de los probióticos mediante el encapsulamiento 9

2.5.1 Encapsulamiento por liofilización 9

2.5.2 Encapsulamiento por secado de aspersión 9

2.5.3Encapsulamiento por emulsión y extrusión 10

2.6 Microencapsulacion de microorganismos por secado de aspersión 10

2.7 Parámetros que afectan la viabilidad de los probióticos en la encapsulación por secado de aspersión 11

2.7.1 Agentes encapsulantes 11

2.7.2 Temperatura del aire entrante 12

2.7.3 Flujo de atomización y alimentación 12

2.8 Modelación y optimización del secado por aspersión 13

2.8.1 Modelos empíricos 13

2.8.2 Método de superficie y respuesta 15

2.8.3 Redes neuronales artificiales 16

2.8.3.1 Estructura de un sistema neuronal artificial 17

2.8.3.2 Aplicación de las redes neuronales en el secado por aspersión 17

2.8.3.3 Modelo neuronal de multica-Perceptron con algoritmos de retropropagación 18

3. Planteamiento del problema 20

4. Justificación 21

5.0bjetivos 22

5.1 Objetivo general 22

5.2 Objetivo especifico 22

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6.0 Materiales y métodos 23

6.1 Reactivación de la cepa Lactobacillus plantarum 23

6.2 Microencapsulacion por secado de aspersión 23

6.3 Determinación de la supervivencia de Lactobacillus plantarum después del proceso de secado por aspersión 23

6.4 Determinación del rendimiento del proceso 24

6.5 Determinación de la actividad de agua (aw) 24

6.6 Determinación del color de la partícula 24

6.7 Condiciones de almacenamiento 24

7.0 Diseño experimental 25

7.1 Superficie y respuesta25

7.2 Diseño de red neuronal artificial 26

7.3 Validación de la red neuronal con datos experimentales 27

8.0 Cronograma de actividades 28

9. Bibliografía 29

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Resumen

La aplicación de redes neuronales en las últimas décadas como una herramienta más para la optimización del proceso de secado por aspersión ha tomado un interés por su capacidad de generalización de datos no-lineales. Investigaciones sobre la aplicación de las redes se encuentra en la proteómica, genómica y proceso biologios (fermentaciones) y en el área de medicina. Dentro de las aplicaciones de las redes neuronales en secado por aspersión se encuentran en la predicción de las propiedades fisicoquímicas en ciertos alimentos (frutas y verduras) después del secado, sin embargo no existe reportes sobre la modelación de redes neuronales en la optimización del proceso en la microencapsulacion del probióticos. Por lo tanto este trabajo tiene la finalidad de aplicar las redes neuronales artificiales para la optimización del proceso de secado por aspersión, empleando variables de entrada: 100 y 180°C, flujo de alimentación, 3 y 12 mL/min, y como variables de respuesta: viabilidad celular (% de supervivencia), color de la muestra, rendimiento y aw. Se empleara un diseño factorial 32 con tres replicas en el punto central, generando un total de 12 experimentos completamente al azar. Todos los resultados serán analizados mediante un análisis de varianza con un P<igual 0.05. Para la optimización del secado por aspersión con la red neuronal artificial se empleará la red neuronal artificial multicapa perceptrón de retroalimentación (feed-forward-MLP), con el algoritmo de retropropagación (BP) para desarrollar el modelo de predicción. Los resultados esperados por la simulación de la red serán entre un rango de aproximación (70-100% de supervivencia y 50-100% de rendimiento) con una R=0.9-1, para concluir que será posible aplicar este tipo de sistemas a los proceso de secado por aspersión.

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1. Introducción

Durante las últimas décadas, se ha considerado laencapsulación de microorganismos por secado de aspersión, como un proceso en el cual las células son encapsuladas dentro de una membrana (polisacáridos) con la finalidad de reducir daños celulares durante el almacenamiento (temperatura, humedad) y digestión (pH, sales biliares y proteasas). Las principales ventajas del secado de aspersión incluyen alta velocidad del secado, fácil operación, sin embargo dicho proceso para su optimización en la microencapsulación de probióticos se hace muy complejo debido a que deben controlarse las variables de entrada (temperatura, flujo de alimentación, flujo del atomizador) para interactuar entre ellos para generar una variable de respuesta (rendimiento, tamaño de partícula, aw y % de supervivencia) la interacción de las variables de entrada y salida son relaciones no-lineales que hacen difícil para su modelado y optimización. El método de optimización en los procesos no-lineales se encuentra el método estadístico de Superficie y Respuesta, esta tiene la capacidad de relacionar las variables de entrada con la salida para generar un modelo matemático, siendo uno de los métodos más aplicables. Sin embargo una herramienta aplicable a sistemas altamente no-lineales en el secado por aspersión son las redes neuronales artificiales, por su naturaleza estructural tienen la capacidad de relacionar más de una variable de entrada para generar los valores de salida y están aprenden con el entrenamiento prácticamente simulan la capacidad de un cerebro en su análisis de datos, estos modelos no generan modelos matemáticos.

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2. Antecedentes

2.1. Probióticos

Los probióticos son microorganismos vivos, que al ser administrados en dosis adecuadas, confieren un beneficio de salud en el huésped (FAO/OMS, 2002). Durante las dos últimas décadas los consumidores son más conscientes y preocupados por su estilo de vida y esto ha aumentado la demanda de alimentos que promueven la salud y el bienestar, tales como los productos funcionales que contienen microorganismos probióticos, los cuales tienen un efecto benéfico sobre el equilibrio de la microbiota intestinal. Dentro de los beneficios que tienen los probióticos se encuentran la reducción y la prevención de la diarrea, la mejora del equilibrio microbiano intestinal debido a la actividad antimicrobiana, la prevención de alergias a los alimentos y el aumento del potencial inmune (Aureli et al,2011). Entre los microorganismos probióticos más comúnmente utilizados por la industria alimentaria corresponden a aquellos del genero Lactobacillus. Sin embargo a través de los años, muchas especies de microorganismos han sido utilizadas como probióticos y no sólo consisten en bacterias ácido lácticas (Lactobacilos, Streptococos, Enterococos, Lactococos, Bifidobacterias), sino también se han incluido los Bacillus y algunos hongos, tales como Saccharomyces y Aspergillus. Cada uno de estos géneros de probióticos posee mecanismos de acción diferente sobre la salud, uno de los factores más importantes de los probióticos es que deben ser ingeridas a concentraciones 10 6 y 10 7 UFC/g. (Gonzales, 2013; Furtado et al, 2013).

2.2. Tipos de estrés a los que son sometidos los probióticos

Los probióticos son aislados de muchas fuentes naturales, la flora microbiana de humanos (boca, tracto intestinal y aparato reproductor femenino), leches fermentadas, quesos, mantequillas, pulque, entre otras fuentes (Soda et al, 2003; Gonzales, 2013). El cambio de su fuente natural en su reproducción en el laboratorio en medios sintéticos y las condiciones de cultivo (T, pH, concentración de sales), provoca un estrés celular. Cuando se cultiva en un fermentador por lote, el crecimiento de las bacterias se produce durante cuatro fases: fase-lag, fase-log, estacionaria y la muerte, las respuestas de estrés de cultivos varían en función de la fase de crecimiento. Las bacterias en la fase-log, debido a la privación de carbono y el agotamiento de las fuentes de alimentos disponibles se activan respuestas al estrés para permitir la supervivencia de la población celular. Las bacterias que entran en la fase estacionaria desarrollan una resistencia general al estrés y son por lo tanto más resistentes a diversos tipos de estreses. Por lo tanto, la fase de crecimiento óptima para la supervivencia en la deshidratación es la fase estacionaria.

Las bacterias probioticas crecen en un rango de temperatura de 2-53 ºC, sin embargo la temperatura óptima varía entre 28-44 ºC. Estos son microorganismos acidúricos, por lo que crecen óptimamente un pH entre 4.2 y 6.4 y toleran un rango de 4 a 6.5 % de NaCl (Estela

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et al, 2007). En cultivos por lote, al realizar cambios en la temperatura o el pH, se induce un estrés celular. Sin embargo estos cambios propicios no son letales cuando son sometidos a cambios muy bajos, tales como los pretratamientos térmicos suaves pueden conducir a una adaptación de la membrana celular mediante el aumento de la saturación y la longitud de los ácidos grasos con el fin de mantener la fluidez óptima de la membrana y la actividad de las proteínas intrínsecas. Por lo tanto, el efecto benéfico de estrés por calor puede ser por la producción de proteínas de choque térmico (HSPs) que promueven el correcto plegamiento de los polipéptidos, ensamblaje de complejos proteínas, la degradación y la translocación de las proteínas. Los dos grupos de proteínas principales involucrados en la corrección son las chaperonas de la familia DnaK 70-kDa y la familia GroEL 60-kDa (Gobbetti et al, 2004). Desmond et al (2004), reportaron que la proteína chaperona GroEL fue una de las proteínas más fuertemente expresado en la célula en condiciones de adaptación al calor.

El cambio de pH propicia estrés celular, este fenómeno puede alterar el estado fisiológico de las células bacterianas que conducen a una mayor síntesis de proteínas de choque térmico (Meng et al, 2006). El cultivo de L. delbrueckii bajo pH no controlado aumenta la producción de proteínas de choque térmico (Silva et al, 2005). Una viabilidad de 80% de supervivencia fue obtenido por liofilización cuando L. reuteri fue cultivado a un pH 5.0 con 2 horas de mantenimiento en la fase estacionaria (Meng et al,2008). Por lo tanto Las bacterias responden a los cambios en su entorno por una reprogramación metabólica que conduce a un estado celular de mayor resistencia (Pichereau et al, 2000).

2.3. Factores que afectan el crecimiento de los probióticos

La composición del medio de cultivo es un factor que contribuye a la tasa de crecimiento de los cultivos probióticos durante el secado, y en este sentido, se ha demostrado la importancia de la presencia de hidratos de carbono. El crecimiento de L. delbrueckii. y L. bulgaricus en presencia de azúcares, tales como lactosa, sacarosa y trehalosa, o crioprotectores químicos, tales como, glicerol, muestra que las células pueden adaptarse a la congelación y la descongelación por un estrés osmótico. La supervivencia de L. sakei al ser sometido por secado de aspersión se mejoró cuando las células fueron cultivadas en la presencia de sacarosa. Otros azúcares, tales como fructosa y el sorbitol también proporcionan un mejor crecimiento a los probióticos que la glucosa. El mecanismo para la protección de los azúcares en el medio de cultivo radica probablemente a que el crecimiento en presencia de diversos sustratos de azúcar produzca células con distintas características morfológicas y fisiológicas, lo que refleja la resistencia a diferentes tratamientos de estrés. Otros factores, incluyendo la presencia sales como de cloruro de sodio en el medio de crecimiento tiene efectos sobre la supervivencia de los probióticos cultivadas después de la deshidratación (Meng et al, 2008).

2.4. Factores que afectan la supervivencia de los probióticos

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Las condiciones de almacenamiento, tales como la temperatura de almacenamiento, el contenido de humedad del polvo, la humedad relativa, la composición del polvo, contenido de oxígeno, la exposición a la luz y los materiales de almacenamiento, tienen una influencia significativa en la supervivencia de los probióticos en los polvos secos, establecer las condiciones correctas son esenciales para mantener la viabilidad de las bacterias probióticas secadas por aspersión. La viabilidad de las bacterias probióticas durante el almacenamiento de polvo está inversamente relacionada con la temperatura de almacenamiento. La viabilidad de un número de especies de Bifidobacterias disminuye cuando se seca por aspersión en un vehículo a base de leche desnatada y se almacena a 15° C y 25° C disminuye su viabilidad (Simpson et al, 2005).

El contenido de humedad de los polvos de probióticos es un factor crítico que influye la estabilidad de la vida útil de las bacterias vivas. El contenido de humedad óptimo para el almacenamiento L. salivarius después del proceso de liofilizado está en un rango de 2.8% a 5.6%. La viabilidad de probióticos liofilizados en la leche descremada es inversamente proporcional a presión relativa de vapor (PRV), con 11,4% PRV produciendo más alta viabilidad durante el almacenamiento a temperatura ambiente (Meng et al. 2008).

Algunos estudios han demostrado que la presencia de polisacáridos (sacarosa, maltodextrina) puede estabilizar la membrana celular de los probióticos durante la congelación y almacenamiento, por ejemplo, se ha propuesto que el sorbitol previene el daño de la membrana por la interacción con la membrana y estabiliza la estructura y funcionalidad de la proteína (Meng et al. 2008).

Otro factor deterioro de la viabilidad durante el almacenamiento está relacionada con la oxidación de los lípidos de la membrana. Lípidos acilo insaturados tales como el ácido oleico, que no pueden ser considerados como constituyentes de los alimentos estables durante el almacenamiento de alimentos, como la presencia de uno o más grupos alilo dentro de la molécula de ácido graso se oxidan fácilmente a hidroperóxidos, por lo tanto los productos de la peroxidación lipídica induce a un daño en el ADN provocando la muerte celular (Meng et al. 2008).

La rehidratación de polvos probióticos es el paso crítico final para la reactivación de las células después de la deshidratación. El proceso de reconstitución en agua se puede dividir en cuatro pasos: humectación, inmersión, dispersión y disolución. La solución de rehidratación en sí (en términos de la osmolaridad, pH y la fuente de energía nutricional), así como las condiciones de rehidratación (en términos de temperatura de rehidratación y volumen) pueden afectar significativamente la tasa de recuperación al estado viable, y por lo tanto influir en el porcentaje de supervivencia (Carvalho et al, 2004). Para obtener resultados óptimos, se recomienda secar las células en la fase estacionaria de crecimiento y de utilizar procedimientos de rehidratación lentos. Algunos autores indican que se debe rehidratar con la misma solución con la que fue crioconservada (microencapsulada). La

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razón de esto es que tal solución proporciona un entorno de alta presión osmótica que podrían controlar la velocidad de hidratación, y por lo tanto evitar el choque osmótico. La temperatura de rehidratación de los probióticos liofilizados o por secado de aspersión también influye en la recuperación de células. La rehidratación a 15-25 °C produce el mayor número de células de Salmonella anatum recuperados, en comparación con la temperatura de 35° C y 45 °C, donde la recuperación celular fue menor (Meng et al. 2008).

2.5. Estabilización de los probióticos mediante el encapsulamiento

Aunque el contenido de agua es un componente esencial para el funcionamiento de la célula, la retención de la viabilidad durante el almacenamiento es a menudo mayor cuando la cantidad de contenido de agua es baja. Por lo tanto, la deshidratación se utiliza comúnmente como una técnica para estabilizar los probióticos para facilitar su almacenamiento, manipulación, transporte, y su aplicación en alimentos funcionales. La liofilización es la técnica más extendida para la deshidratación de cultivos probióticos y los productos lácteos, mientras que el secado por aspersión se ha aplicado a la deshidratación de un número limitado de cultivos probióticos (Meng et al, 2008).

2.5.1 Encapsulamiento por liofilización

El encapsulado por liofilización se ha usado para la fabricación de polvos con probióticos durante décadas y se basa en la sublimación, que ocurre en tres fases; las células son sometidas a una congelación de temperatura de -196 °C y posteriormente se introduce a una cámara de vacío para realizar la separación del agua por sublimación. Sin embargo las células sufren una inactivación que se produce sobre la etapa de congelación, el 60-70% de las células que sobrevivieron a la etapa de congelación pueden sobrevivir al momento de la hidratación. Durante la congelación, la formación de hielo extracelular provoca un aumento en la osmolalidad extra-celular, tan pronto como se forma hielo fuera de la célula en solución, la célula comienza a deshidratarse. La eliminación del agua ligada de las células bacterianas durante el proceso de secado conduce al daño de proteínas de la superficie, pared celular y la membrana celular. El agua ligada juega un papel importante en la estabilización estructural y funcional de la célula. En consecuencia, la eliminación del agua durante la desecación puede conducir a la desestabilización de la integridad estructural, por lo que resulta la pérdida o muerte celular de la bacteria (Meng et al, 2008).

2.5.2 Encapsulamiento por secado de aspersión

El secado por aspersión es una unidad operacional, en la que una alimentación liquida se pone en contacto con una corriente de gas (aire) caliente para obtener un producto seco instantáneamente. El producto seco puede obtenerse como un polvo granulado o aglomerado, lo cual depende de la naturaleza de la materia y las condiciones del secado por

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aspersión. El secado por aspersión es usado en la industria alimentaria para asegurar la estabilidad microbiológica de los productos. El secado por pulverización produce un polvo muy fino (10-50 µm) o partículas de gran tamaño (2-3 mm) dependiendo del material de alimentación y las condiciones de funcionamiento. El proceso de secado su principal función es eliminar el contenido de agua de la muestra (Gharsallaoui et al, 2007).

2.5.3 Encapsulamiento por emulsión y extrusión

La técnica de emulsión consiste en atrapar a bacterias en una solución de agua / sistema de aceite. El material encapsulado, por ejemplo, alginato de sodio, se mezcla primero con las células bacterianas y la mezcla se suspende en un baño de aceite que contiene tween 80 como emulsificante. La emulsión se rompe mediante la adición de CaCl2, y las microcápsulas formadas son recogidas por centrifugación. Otros materiales, tales como la carragenina con KCl como interruptor de la emulsión, se pueden utilizar para encapsular los probióticos mediante la técnica de emulsión. El tiempo de reacción afecta a la formación de microcápsulas y, por otro lado, la supervivencia de los microorganismos. El tamaño de las cápsulas de alginato de calcio se ha observado que disminuye a medida que la concentración de lauril sulfato sódico y Tween 80 incrementan. También es posible controlar el tamaño de las microcápsulas mediante el uso de una membrana de vidrio microporosa en el método de emulsión (Rustrían, 2012).

En la técnica de extrusión, una solución hidrocoloide es preparada como primer paso, un inóculo de microorganismos es adicionado y la solución es dosificada a través de una aguja de la jeringa o la boquilla. Las gotitas pueden caer en una solución de endurecimiento. En esta técnica se han utilizado alginato, carragenina, goma xantana con almidón de maíz y proteínas de suero de leche, como materiales de microencapsulación para lactobacilos y Bifidobacterias. El tamaño de las microcápsulas es afectado por el tamaño de la boquilla de la geringa. También el diámetro de las cápsulas de alginato se incrementan cuando la concentración del alginato de sodio.

2.6. Microencapsulacion de microorganismos por secado de aspersión

Investigaciones recientes consideran la encapsulación de microorganismos como un proceso en el cual las células se mantienen dentro de una membrana de encapsulado para reducir daños celulares y ha sido ampliamente utilizado para proteger a los microorganismos como probióticos (Rustrían, 2012). Las principales ventajas de la microencapsulación por secado de aspersión incluyen alta velocidad de secado, baja temperatura de alimentación, y mayor solubilidad de los productos, fácil operación y control. Tal técnica muestra una gran perspectiva en aplicación industrial, especialmente para materiales sensibles al calor (Yu et al, 2008). Sin embargo el secado por aspersión hablando estrictamente de los probióticos plantea, un gran obstáculo, en la preservación de la viabilidad durante y después del secado. Los probióticos son sensibles al calor ya que la mortalidad se incrementa con la temperatura de secado y acentúa típicamente por encima

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de 51 °C (Chávez et al, 2007). Sin embargo la exposición de las partículas al calor es del orden de unos pocos segundos y la rápida evaporación del agua de la superficie durante su solidificación mantiene la temperatura del núcleo por debajo de 100°C a pesar de las temperaturas elevadas durante el proceso de desecación. Esto le confiere la principal ventaja del método del secado por aspersión para su aplicación a muchos productos termolábiles (enzimas, microorganismos, antioxidantes) (Gharsallaoui et al. 2007; Rusian, 2012). En la microencapsulacion de probióticos la cantidad de humedad al final del proceso de secado, debe contener una humedad por debajo de 4% que se requiere para la estabilidad de almacenamiento (Chavez et al, 2007).

2.7. Parámetros que afectan la viabilidad de los probióticos en la encapsulación por secado de aspersión

2.7.1 Agentes encapsulantes

La elección de un agente de encapsulación es muy importante para la eficiencia de la encapsulación y la estabilidad de las microcápsulas. Los criterios para la selección de un material de pared se basan en las propiedades fisicoquímicas de la sustancia a encapsular (porosidad, solubilidad) y del agente de encapsulación (viscosidad, propiedades mecánicas), la compatibilidad entre los dos (el material de la pared debe ser insoluble y no debe reaccionar con el núcleo). Otro criterio a considerar es el tamaño deseado de las microcápsulas, debido a que un agente de encapsulación por sí sola no puede tener todas las características requeridas, una combinación de agentes de encapsulación puede ser utilizada. La microencapsulación de los ingredientes alimentarios se consigue a menudo con biopolímeros de diferentes fuentes. Algunos hidratos de carbono (por ejemplo, almidón, maltodextrinas, dextrosa), gomas (por ejemplo, goma árabe, goma de acacia, alginatos, carragenanos), proteínas (por ejemplo, leche o suero de leche proteínas, gelatina) (Meng et al. 2008; Nogueiro et al. 2013). El uso de goma de acacia en el medio de cultivo leche desnatada reconstituida (LDR) en el secado por pulverización a una temperatura de salida de aire de 100-105 °C, dio lugar a una mayor supervivencia del probiótico de L. paracasei NFBC 338, comparadas con el control que fueron cultivadas con 20% (p/v) de leche desnatada (LD), mostrando así 10 veces mayor supervivencia. El medio LDR parece ser un medio muy eficaz adecuado para el secado por pulverización de los cultivos probióticos. Solutos compatibles también han demostrado ser beneficos en la protección de la viabilidad de los probióticos en ambientes ácidos. Por ejemplo, la presencia de 19,4 mM de glucosa resultó con una supervivencia hasta 6-log10 Lactobacillus rhamnosus GG, después de 90 minutos de exposición al jugo gástrico simulado a pH 2,0 en comparación con el control simple medio de leche desnatada. Estos aumentos de la supervivencia se debe a la unión de ciertos enlaces de los agentes encapsulantes en la membrana celular provocando rigidez celular y mayor resistencia a los sistemas adversos (Meng et al, 2008).

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Otro factor importante es la proporción de agente ya que al aumentar la cantidad de los agentes encapsulantes (sólidos totales en la mezcla) la eficiencia de microencapsulacion aumenta. Trabajos recientes reportan que la encapsulación en microcápsulas de alginato-gelatina mejoró exitosamente la sobrevivencia de L. casei ATTCC 393 y esta propuesta puede ser útil en cultivos probióticos Por otra parte, los distintos materiales encapsulantes, como goma xantana y goma carragenato en particular, parecen ser tan eficaces como el alginato en la protección de las células probióticas durante el almacenamiento en condiciones ambientales (Rustrían, 2012)

2.7.2 Temperatura del aire entrante

El proceso de secado por pulverización consiste en la inyección de un gas (aire) caliente con una alta velocidad a temperaturas de hasta 200 °C. En consecuencia, este proceso da como resultado la exposición del medio de secado a altas temperaturas durante un corto período de tiempo, que pueden ser perjudiciales para la integridad de las células bacterianas vivas. El proceso de secado por aspersión tiene un efecto sobre la membrana celular ya que puede conducir a un aumento de la permeabilidad celular que puede resultar en la pérdida de componentes intracelulares de la célula en el medio ambiente circundante. La membrana citoplasmática se encuentra entre los sitios más sensibles en las células bacterianas a las tensiones asociadas con el secado por aspersión, el ADN y ARN también son afectadas, lo que lleva a la pérdida de la actividad metabólica (Meng, et al, 2008). Varios estudios han informado sobre el rendimiento de una variedad de probióticos durante el secado por pulverización, y, en general, la tasa de supervivencia de cultivos probióticos depende de factores tales como la cepa utilizada, las condiciones de operación del secado, la temperatura de entrada y salida, y el medio de encapsulamiento. Para encapsular L. paracasei NFBC 338, ha demostrado que la tasa de supervivencia fue > 80% durante el secado de aspersión usando leche descremada reconstituida con polisacáridos, con una temperaturas de salida de 85-90 °C (Gardiner et al., 2002), mientras que bajo condiciones similares (temperatura de salida de 80 °C), Ananta y Knorr (2003) reportaron una tasa de supervivencia mayor a 60% para L. rhamnosus GG. Por lo tanto las diferentes especies bacterianas varían con respecto a la tolerancia al secado por aspersión.

2.7.3 Flujo de atomización y alimentación

Dentro de los objetivos de atomización es la creación de una superficie máxima de transferencia de calor entre el aire seco y el líquido con el fin de optimizar las transferencias de calor y masa. Los parámetros atomizadores ejercen un efecto significativo sobre la distribución del tamaño de partícula de los polvos resultantes. Con frecuencia es conveniente producir grandes partículas para favorecer la dispersión durante la reconstitución. Las partículas pequeñas suelen ser de difícil dispersión puesto que tienden a flotar sobre las superficies líquidas. El aumento del flujo de atomización es la que propicia

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el tiempo de exposición entre la temperatura y la muestra, cuanto mayor es el flujo de atomización, la exposición de las partículas al calor es del orden de unos pocos segundos por lo tanto el daño por temperatura puede ser disminuido (Golowczyc et al, 201l).

2.8. Modelación y optimización del secado por aspersión

La modelación matemática y optimización de un proceso permite aumentar la eficiencia del proceso, esta etapa es considerada como una de las etapas más importantes en un proceso bioquímico (Bas et al.2007). El enfoque clásico para la optimización es la técnica de un factor-un-tiempo, lo que consume mucho tiempo, por otra parte, esta técnica no describe los efectos completos de los parámetros en el proceso. Debido a estos inconvenientes, los investigadores han buscado métodos alternativos. Uno de los métodos más populares utilizados en las dos últimas décadas es la metodología de superficie y respuesta (MSR) y las redes neuronales artificiales (RNA) (Bas et al.2007; Zhang et al. 2010).

2.8.1 Modelos empíricos

En la operación de secado, la transferencia de calor y masa dentro de la pulverización participan simultáneamente, aunque la transferencia de calor es el mecanismo que controla el proceso. Los secadores de aspersión y otros equipos el coeficiente de transferencia de calor, es la principal causa que refleja la cinética del proceso de secado. La importancia del coeficiente de transferencia de calor se debe: (a) es una cantidad fundamental para la evaluación de los efectos hidrodinámicos asociados con una cierta configuración de flujo y su influencia en la transferencia de calor; (b) que se utiliza para evaluar la capacidad de un dispositivo de secado o para la comparación entre diferentes tipos de equipos. El coeficiente de transferencia de calor se puede estimar usando correlaciones experimentales (Riveros et al, 2009).

Para un secador por aspersión, Kessler propone la siguiente correlación para el número de Nusselt ecuación 1:

Nu=2+0.535∗√ Rep ( 1)

Donde el número de Reynolds (Rep) utiliza la velocidad de sedimentación y el diámetro de la gota atomizada. La entrada y la salida de la humedad, el flujo de alimentación, y el tiempo de permanencia de la partícula en el secador se pueden medir experimentalmente. Además, el diámetro de partícula se puede calcular a partir de correlaciones para el tipo de boquilla de pulverización. De acuerdo con Coulson y Richardson una correlación, para estimar el diámetro de una gota de una boquilla de pulverización ecuación 2 (Riveros et al,

2009):

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Donde el número de flujo (FN) es una constante adimensional definida por la ecuación 3:

Basándose en los resultados experimentales, la velocidad de secado (en un periodo de velocidad de secado constante) y la transferencia de calor se calculan con la ecuación 4 y 5:

El flujo de convección de calor también se puede calcular como el producto entre el coeficiente de transferencia de calor global (determinado por el régimen de dinámica de fluidos de la partícula) y la diferencia entre el calor de bulbo seco del aire y temperaturas de bulbo húmedo. Sin embargo, la transferencia de calor es debido a la conducción y la radiación: la conducción puede ocurrir debido a la colisión de las partículas con la pared de la secadora, mientras que la radiación es pequeña en aquellos sistemas que operan a bajas temperaturas y por lo tanto es pequeña. Siguiendo esta lógica, los diferentes mecanismos pueden agruparse en un coeficiente global de transmisión de calor ecuación 6 (Riveros et al,

2009):

Donde ∆ Tml es la media logarítmica de la diferencia de temperatura entre el aire caliente- partículas húmedas y está dado por ecuación 7 (Riveros et al, 2009):

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3

(4) (5)

(6)

Es importante tener en cuenta que al utilizar estas ecuaciones, el coeficiente de transferencia de calor sólo puede ser aproximado, ya que es un fenómeno complejo y la cuantificación de la zona real de evaporación de la gota durante el secado no es simple. El coeficiente de transferencia de calor (U) no está relacionado con el volumen del secador por aspersión, ya que, en los sistemas el volumen de las partículas es del orden de 1% del volumen de la secadora en funcionamiento continuo. La transferencia de calor (U) con la expresión de coeficiente volumétrico es definida por Tamir ecuación 8 (Riveros et al, 2009):

Esta expresión del coeficiente compara la capacidad del equipo en función de su tamaño, utilizando esta relación para predecir la capacidad de evaporación de un prototipo de tamaño más grande (Riveros et al, 2009).

2.8.2 Método de superficie y respuesta

El método de superficie y respuesta es un conjunto de técnicas estadísticas y matemáticas útiles para el desarrollo y mejora de un proceso especifico, en los que una respuesta de interés está influenciada por diversas variables que describen la relación entre las entradas y la salida. El efecto entre las variables que interviene sobre el parámetro del valor óptimo lo representa en una gráfica tridimensional. Esta metodología experimental genera un modelo matemático, que describe el proceso (Bas et al.2007; Meena et al. 2011). Sin embargo, los modelos basados en la metodología de superficie y respuesta, son limitados por el número de relaciones entre un número de parámetros de entrada y de salida. Esto plantea una limitación en el uso de los modelos para procesos altamente no lineales. Estas restricciones han provocado el desarrollo de modelos basados en redes neuronales artificiales (Youssefi et al. 2009). Un modelo en particular fue obtenido con un diseño experimental para la encapsulación de Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 y Lactobacillus rhamnosus NRRL B-442 tomando como parámetros de entrada: Temperatura 100, 115 y 130 °C. Con flujos de alimentación: 10, 15, 20 mL/min y sólidos totales: relación malto dextrina 1:1, 1:1.5 y 1:2. (Anekella et al. 2013).

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(7)

(8)

% recuperacion=333.331−3.593∗RMD−7.236∗F+4.63∗RMD∗F

Donde RMD= la relación malto dextrina

F= flujo de alimentación

% supervivencia=67.933−8.98∗Te−2.681∗RMD+3.214∗F+4.863∗T e∗RMD+5.840∗RMD∗F

Donde Te= temperatura de entrada

RMD= relación malto dextrina

F= flujo de alimentación

2.8.3 Redes neuronales artificiales

El estudio de las redes neuronales puede orientarse en dos direcciones, bien como modelos del sistema nervioso y fenómenos cognitivos, o bien como herramientas para la resolución de problemas prácticos (Martin et al, 2007). Por lo tanto considerando el segundo punto de nuestro interés, una red neuronal artificial (RNA), fue definida por Lin y Lee en 1996, como un sistema de computación constituidos por un número de señales simples pero altamente interconectadas, como unidades de procesamiento de información denominadas neuronas artificiales, que intenta simular la capacidad de procesamiento neurológico del cerebro humano (Taylan, 2006; Youssefi et al.2009). El fundamento del procesamiento de la red neuronal artificial es idéntica a una neurona biológica (figura. 1a) que recibe datos de entradas del exterior, procedentes de otras fuentes, las combina, analiza y genera una operación no lineal en el resultado de salida figura. 1 (b), donde las entradas están representadas por símbolo X(n). Cada una de estas entradas se multiplican por un peso de conexión y estos pesos están representados por w. (Bas et al, 2007). Por lo tanto las neuronas artificiales son capaces de predecir por medio de aprendizajes utilizando la experiencia a partir de las señales o datos provenientes del exterior (Meena, 2011).

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a) Neurona biológica b) Neurona artificial.

Figura1. Estructura de una neurona biológica comparada con una red neuronal artificial. (a) Neurona biológica y b) Neuronal artificial.

2.8.3.1 Estructura de un sistema neuronal artificial

Los sistemas de redes neuronales artificiales imitan la estructura de una neurona biológica, con la intención de construir sistemas de procesamiento sobre la información en forma paralela, distribuida y generativa, por tal razón le confiere la capacidad de simular. El elemento de partida será una neurona, donde se organizara en capas; como resultado de las capas se crea una red neuronal artificial, junto con las interfaces de entrada y salida, constituirán el sistema global del proceso figura 2.

Figura 2.

2.8.3.2 Aplicación de las redes neuronales en el secado por aspersión

La selección de la estructura de la red neuronal artificial óptima incluye la determinación del número de capas ocultas, número de neuronas en cada capa, el número de enlaces entre las neuronas, esta es definida como la inmensidad de la red. Dentro de los métodos de optimización de la estructura RNA se pueden dividir en los siguientes grupos: algoritmos de construcción, los algoritmos de destrucción, métodos empíricos, los métodos combinados, algoritmos genéticos, etc. Una red neural artificial RNA óptima por lo general contiene un menor número de neuronas y conexiones que permiten su uso en aplicaciones a en tiempo real (Körösi et al, 2013).

Las redes neuronales artificiales, tienen la capacidad de manejar múltiples variables independientes X y dependientes Y, al mismo tiempo. Por ello los conocimientos previos

17

sobre la relación funcional del proceso no necesitan ser conocidos. Pudiendo así modelar fácilmente relaciones no lineales entre las variables. Por lo tanto la RNA difiere de los métodos computacionales tradicionales, por el estilo de procesamiento de datos, ya que procesan la información paralelamente. Por otro lado, los métodos tradicionales son secuenciales y lógicos. De hecho, los métodos tradicionales pueden aprender las reglas, pero la RNA aprende con el ejemplo (Bas et al, 2007; Mihajlovic et al, 2011; Körösi et al, 2013). Otra de las características de las RNA es que no generan una ecuación modelo similar al MSR, pero su función como el cerebro humano le permite estimar la respuesta sobre la base de los datos entrenados en el intervalo investigado (Gimeno et al. 2002).

2.8.3.3 Modelo neuronal de multica-Perceptron con algoritmos de retropropagación

Las rede neuronal artificial se denomina procesador elemental como un dispositivo simple de caculo que, a partir de un vector de entrada procedente del exterior o de otras neuronas, proporciona una única respuesta o salida. Los elementos que lo constituyen son los siguientes (figura 3).

Los conjuntos de entradas xj(t) y wij, representan la intensidad de interacción entre cada neurona.

La regla de retropropagación permite obtener, a partir de las entradas y los pesos, el valor del potencial postsináptico hi de la neurona ecuación 9.

hi ( t )=σ (wij , xj ( t ))

La función más habitual es de tipo lineal, y se basa en la suma ponderada de las entradas con los pesos sinápticos ecuación 10.

hi (t )=Σ wij xj

La función de activación proporciona el estado de activación actual ai(t) a partir del potencial postsináptico hi(t)y del propio estado de activación anterior ai(t-1) ecuación 11.

ai ( t )=fi (ai ( t−1 ) , hi ( t ))

18

Figura 3. Modelo genérico de una neurona artificial

(9)

(10)

(11)

Función de salida, esta proporciona la salida global de la neurona yi(t) en función de su estado de activación actual ai(t) ecuación 12.

yi(t)=Fi(ai(t))

El modelo más habitual para ejecutar las redes neuronales consiste en simular en un ordenador convencional, como un PC, haciendo uso de escritos en lenguajes de alto nivel Matlab,etc. ( Rajesh et al, 2006; Martin et al, 2007).

3. Planteamiento del problema

19

(12)

El secado por atomización aunque se considera un proceso tecnológico complejo, es una técnica que tiene una amplia gama de aplicaciones en la industria alimentaria y farmacéutica. La comprensión del cambio de los parámetros que afectan a las propiedades físico-químicas del producto, es especialmente importante para la producción. El secado por pulverización permite el ajuste de muchos parámetros del proceso, como consecuencia mejora los rendimientos del proceso y las características óptimas de partículas. La aplicación de diseño de experimentos (DE) y la red neuronal artificial (RNA) es un nuevo enfoque en el estudio de los sistemas de secado, con importantes ventajas como la modelización y optimización. Una RNA homogeniza los valores de los parámetros utilizando la correlación entre los parámetros medidos y los parámetros de destino. Los modelos de RNA han sido utilizados con éxito en la predicción de los problemas en bio-procesamiento y la ingeniería química. En el campo de secado, una RNA es una mejor alternativa a modelos empíricos y semi-empíricos convencionales basado en regresiones polinómicas y lineales, especialmente para los problemas que afectan a muchos parámetros, como el secado por aspersión. Varios modelos de RNA se han desarrollado y probado para el secado de atomización de materiales diversos, desarrollando un modelo que consiste en un RNA híbrido que incluye un modelo de regresión polinómica y una RNA estándar para la predicción de la porosidad de 11 tipos de frutas y verduras. Otros investigadores han desarrollado modelos de RNA para el modelado de secado de rodajas de patata, zanahorias, tomate, Echinacea angustifolia, y la manzana (liofilización) (Hussain et al. 2005). Los probióticos son microorganismos no patógenos que, cuando se ingiere en cantidades adecuadas, ejercen una influencia positiva en la salud de su anfitrión (FAO / OMS, 2006). Lactobacillus plantarum pertenece al género de Lactobacillus. Es una especie heterogénea y versátil que se encuentra en una variedad de nichos ambientales, incluyendo productos lácteos, carne, pescado y muchos vegetales. Si bien existen modelos de RNA para propiedades físico químicas de algunos alimentos, no existen modelos matemáticos que simulen la supervivencia de microorganismos de interés como probióticos mediante RNA.

4. Justificación

20

Los probióticos, debido a sus beneficios para la salud, han sido incorporados a una gran variedad de productos lácteos, como yogures, quesos, helados, leche en polvo y postres lácteos congelados. Sin embargo, todavía existen varios problemas con respecto a la disminución de la viabilidad de las bacterias probióticas durante el secado, durante el almacenamiento y durante la vida de anaquel de los productos. La microencapsulación de bacterias probióticas por secado de atomización puede ser utilizada para mejorar la viabilidad durante el procesamiento (Anil et al. 2007). Por lo tanto, es importante identificar los parámetros óptimos y las condiciones de procesamiento para asegurar la conservación o mejora de la calidad del producto. La aplicación de RNA es un nuevo enfoque en el estudio de los sistemas de secado de atomización para la optimización (Tijana et al. 2011). En la modelación matemática de la viabilidad del probiótico por secado de aspersión mediante RNA no hay trabajos reportados, por lo tanto la novedad del presente trabajo es la aplicación de una RNA para la predicción de la viabilidad microbiana que con lleva a la optimización de las variables del proceso de secado.

5. 0bjetivos

21

5.1 Objetivo general

Simular la viabilidad de Lactobacillus plantarum después del secado de aspersión empleando una red neuronal de retropropagación.

5.2 Objetivos específicos

Evaluar el efecto de las variables de proceso sobre el rendimiento y viabilidad de Lactobacillus plantarum después del secado por aspersión.

Diseñar la estructura arquitectónica de la red neuronal artificial multica Perceptron con el algoritmo retropropagación.

Validar la simulación de la red neuronal con nuevos datos experimentales.

6. Materiales y métodos

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6.1 Reactivación de la cepa Lactobacillus plantarum

La cepa Lactobacillus plantarum previamente aislada de la taberna será donado por el Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez del laboratorio de investigación que fue aislada de la taberna. Los cultivos stock se encuentran conservados en 40%(v/v) de glicerol a -18°C. La cepa se reactivar en un medio de cultivo MRS (DIBICO).

Se prepararán 250 mL de medio de cultivo MRS para transferir dos tubos de stock que contiene la cepa, incubar por 12 h a 35°C. Transferir 10%(v/v) de inóculo a un matraz de 25 mL, se incubara 35°C, agitación de 80 rpm por 24 h. El medio de cultivo se centrifugará a 8000 rpm a 25°C durante 10 min. para separar la biomasa y se lavarán con agua estéril (Golowczyc et al, 2009; Riveros et al, 2009; Gonzales, 2012). Se tomara 1 mL del cultivo, para realizar diluciones seriadas del orden de 10-6, tomar 0.1 mL de la dilución de 10-4 y 10-

6, y se sembrarán por la técnica de vaciado en placa en medio de cultivo agar MRS utilizando perlas de ebullición, incubar a 35°C por 48 h. La cuantificación del crecimiento se llevará a cabo mediante las unidades formadoras de colonias por mililitro (Gonzales, 2012).

6.2 Microencapsulacion por secado de aspersión

Se preparará la mezcla de emulsión Lactobacillus plantarum/ agente encapsulante, los agentes encapsulantes serán maltodextrina (MD) 30% (p/v) y alginato de sodio (AL) 3%(p/v), cada agente se rehidratará con agua esterilizada a 40°C, se mezclarán ambas soluciones en una relación de 60-40% (v/v), y se esterilizará la mezcla de solución a 121°C por 15 min. El pellet se mezclará con el agente encapsulante en una relación de 1:1 en un matraz de 250 mL, a 7200 rpm por 2 minutos. Se empleará el equipo de secado por aspersión BUCHI en el laboratorio de investigación del Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez. El secado de la solución se realizará utilizando una temperatura del aire entre 100 y 160°C y flujo de alimentación de 3 y 12 mL/min. El polvo obtenido después del secado se almacenará en bolsas selladas al vacío (Su et al. 2007; Ding et al. 2009; Rustrían, 2012) en condiciones de refrigeración y congelación.

6.3 Determinacion de la supervivencia de Lactobacillus plantarum después del proceso de secado por aspersión

Con base a la técnica reportada por Riveros et al (2009) y Rustrían (2012), se rehidratará el polvo obtenido después del proceso de secado con 9 mL de una solución Ringer estéril. Se realizarán diluciones seriadas en tubos de ensaye con agua peptonada estéril, hasta el orden 10-6. 0.1 mL de las diluciones serán sembradas en cajas de petri conteniendo agar MRS y se incubarán por 72 h a 37°C. Se calculará el porcentaje de supervivencia de Lactobacillus plantarum después del proceso de secado mediante la ecuación 1.

23

(1)

Donde N (UFC/mL) es el número de microorganismos determinados al final del proceso y Ni (UFC/mL) número de microorganismos determinados antes del proceso.

6.4 Determinación del rendimiento del proceso

Para determinar la eficiencia de microencapsulación se utilizará la ecuación 2, reportado por Su et al. 2007.

6.5 Determinación de la actividad de agua (aw)

Para la determinación de aw se utilizará el equipo medidor de actividad de agua HigroPalm Rotronic

6.6 Determinación del color de la particula

Para la determinación del color de la muestra se empleará el equipo ColorTec PCM/PSM. El índice de blancura (IB) puede ser calculado por la siguiente ecuación (3).

Donde L es la luminosidad que va de 0 (negro) a 100 (blanco). El valor de a (rojo-verde) donde los valores positivos son rojos y los valores negativos son verdes y 0 es neutral. El valor colorimétrico b (amarillo-azul) donde los valores positivos son amarillos, los valores negativos es azul y 0 es neutral (Su et al. 2007; Anekella et al, 2013).

6.7 Condiciones de almacenamiento

La cepa Lactobacillus plantarum después del proceso de secado serán almacenados en condiciones de refrigeración entre 4-8oC y en congelación a -18oC y se determinará la viabilidad cada mes mediante el conteo de unidades formadoras de colonias con diluciones seriadas en agua peptonada (apartado 3.0).

24

(2)

(3)

7. Diseño experimental

7.1 Superficie y respuesta

Se empleará un diseño factorial 32 con tres replicas en el punto central, generando un total de 12 experimentos completamente al azar (Tabla 1). Todos los resultados serán analizados mediante un análisis de varianza con un P≤ 0.05. Se empleará la metodología de superficie de respuesta para optimizar el proceso de secado que permitirá generará un modelo polinomial.

Yk=βk +βk T+ βk F+βk T 2+ βk F 2+βk FT

Donde βk son los coeficientes a identificar, T la temperatura (ºC); F flujo de alimentación (mL/min).

Tabla 3. Diseño factorial 32con tres replicas en el punto central

7.1 Tratamiento Temperatura (°C) Flujo (ml/min)1 100 32 130 123 130 34 160 35 100 7.56 160 7.57 100 128 130 7.59 160 1210 130* 7.5*11 130* 7.5*12 130* 7.5** Punto central

7.2 Diseño de red neuronal artificial

Se empleará la red neuronal artificial perceptrón de retroalimentación (feed-forward-MLP), con el algoritmo de retropropagación (BP) para desarrollar el modelo de predicción.

25

(4)

Ya que su capacidad está documentada para modelar cualquier función (Hornik, Stinchocombe, & White, 1989; Heinzow y Tol, 2003).

Consistirá en dos capas de entradas, la temperatura y el flujo de alimentación, las variables de respuesta serán, % de supervivencia, aw, rendimiento y color de la mezcla generando asi 4 capas de salida. Por lo tanto se tiene dos capas de entrada y 4 capas de salida (figura 4).

Para determinar el número de capas ocultas se seguirá la metodología Chegini, et al (2008), el ajuste de los parámetros de ANN incluido el número de capas y las neuronas ocultas, el tipo de función de transferencia, tasa de aprendizaje, el impulso, y el número de patrones. El primer paso será trabajar con modelos de redes de BP. Se seleccionarán el mejor modelo basado en la precisión de la predicción. El segundo será trabajar con el modelo para encontrar el número óptimo de las épocas y la función de activación. El tercer paso será encontrar el valor de aprendizaje óptimo y los valores de impulso.

Para calcular la exactitud del modelo neuronal se evaluara mediante el cálculo de error absoluto medio (MAE) para cada valor de salida ecuación 5.

Donde n es el número de datos, XM y XP son los valores de medición, predicción del proceso y los parámetros del producto, respectivamente.

7.3 Validación de la red neuronal con datos experimentales

En la validación se empleara los datos de la red neuronal con las mejores predicciones que se encuentren dentro del rango de 70-100% de supervivencia de los probióticos, y el rendimiento, se comprobara con los datos experimentales que se obtendrá con la parte experimental en el secado por aspersión tal como en el aparatado 2.0, se realizara por

26

Figura 4.0. Número de capas en la entra y salida

(5)

Supervivencia

triplicado. Se comprobaran las medias mediante un análisis de varianza con un valor de P ≤0.05.

8. Cronograma de actividades

2013 2014 2015

Actividades Ag Se Oc No Dic En Fe Ma Ab Ma Ju Ju Ag Se Oc No Dic En Fe Ma Ab Ma Ju Ju Ag

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o p t v e b r r y n l o p t v e b r r y n l oRevisión bibliográficaReactivación de la cepaPreparación del inóculoDesarrollo del experimentoDiseño y evaluación de la red neuronalValidación de la red neuronalAnálisis de resultadosRedacción de tesisRedacción de articuloObtención de grado

Actividades concluidasActividades por realizar

9. Bibliografía

Amiri, Z et al., 2010. Development of acidophilus milk via selected probiotics & prebiotics using artificial neural network. Advances in Bioscience and Biotechnology, 1(3), 224-231.

28

Baş, D et al., 2007. Modeling and optimization II: Comparison of estimation capabilities of response surface methodology with artificial neural networks in a biochemical reaction. Journal of Food Engineering, 78(3), 846-854.

Chávez, B et al., 2007. Drying of probiotics: optimization of formulation and process to enhance storage survival. Drying Technology, 25(7-8), 1193-1201.

Chegini, G., et al 2008. Prediction of process and product parameters in an orange juice spray dryer using artificial neural networks. Journal of food Engineering, 84(4), 534-543.

Desai, K et al., 2006. Optimization of fermentation media for exopolysaccharide production from Lactobacillus plantarum using artificial intelligence-based techniques. Process Biochemistry, 41(8), 1842-1848.

Desai, K et al., 2008. "Comparison of artificial neural network (ANN) and response surface methodology (RSM) in fermentation media optimization: case study of fermentative production of scleroglucan." Biochemical Engineering Journal 41.3 (2008): 266-273.

Garcia, Gimeno et al., 2002. Improving artificial neural networks with a pruning methodology and genetic algorithms for their application in microbial growth prediction in food. International journal of food microbiology, 72(1-2), 19-30.

Geethalakshmi, S et al., 2010. Artificial neural network based soft sensor for fermentation of recombinant Pichia Pastoris. In Advances in computer engineering (ACE), 2010 International Conference on (pp. 148-152). IEEE.

Ghandi, A et al., 2012. Effect of shear rate and oxygen stresses on the survival of Lactococcus lactis during the atomization and drying stages of spray drying: A laboratory and pilot scale study. Journal of Food Engineering, 113(2), 194-200.

Golowczyc, M et al., 2010. Preservation of probiotic strains isolated from kefir by spray drying. Letters in applied microbiology, 50(1), 7-12.

Kailasapathy, K. 2002. Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential applications. Current issues in intestinal microbiology, 3(2), 39-48.

29

Lian, W et la., 2002. Survival of bifidobacteria after spray-drying. International Journal of Food Microbiology, 74(1), 79-86.

Martin Bonifacio., 2007. Redes neuronales y sistemas borrosos, capítulo 1-2. Ed. Alfaomega. pp. 10-40.

Meena, G et al., 2011. Growth characteristics modeling of Bifidobacterium bifidum using RSM and ANN. Brazilian Archives of Biology and Technology, 54(6), 1357-1366.

Meng, X et al., 2008. Anhydrobiotics: The challenges of drying probiotic cultures. Food Chemistry, 106(4), 1406-1416.

Mihajlovic, T et al., 2011. Application of design of experiments and multilayer perceptron neural network in optimization of the spray-drying process. Drying Technology, 29(14), 1638-1647.

Neshat, N et al., 2011. An enhanced neural network model for predictive control of granule quality characteristics. Scientia Iranica, 18(3), 722-730.

Paéz, R et al., 2012. Effect of heat treatment and spray drying on lactobacilli viability and resistance to simulated gastrointestinal digestion. Food Research International. 48, 748–754

Rajesh, K., 2006. Artificial neural network for solving paper industry problems: A review. Journal of scientific & industrial research, 65, 565-573.

Riveros, B et al., 2009. Spray drying of a vaginal probiotic strain of Lactobacillus acidophilus. Drying Technology, 27(1), 123-132.

Rustrián Irene. 2012. Microencapsulación del consorcio microbiano de la “taberna” utilizando secado por aspersión. Tesis de maestría en ciencias bioquímicas del Instituto Tecnologico de Tuxtla Gutierrez. pp. 26,31.

Salar-Behzadi, S et al., 2013. Impact of heat treatment and spray drying on cellular properties and culturability of Bifidobacterium bifidum BB-12. Food Research International. 54,93–101.

Sivapathasekaran, C et al., 2010. Artificial neural network modeling and genetic algorithm based medium optimization for the improved production of marine biosurfactant. Bioresource technology, 101(8), 2884-2887.

30

Schuck, P et al., 2012. Spray drying of dairy bacteria: new opportunities to improve the viability of bacteria powders. International Dairy Journal. 31, 12-17.

Su L, et al., 2012. Development of an oriental-style dairy product coagulate by microencapsules containing probiotics and filtrates from fermente rice. Society of Dairy Techology, 60 (1), 49-55.

Taylan, O. 2006. Neural and fuzzy model performance evaluation of a dynamic production system. International journal of production research, 44(6), 1093-1105.

Youssefi, S et al., 2009. Comparison of artificial neural network (ANN) and response surface methodology (RSM) in the prediction of quality parameters of spray-dried pomegranate juice. Drying Technology, 27(7-8), 910-917.

Yu, C., et al., 2006. A neural network approach to predict survival/death and growth/no-growth interfaces for< i> Escherichia coli</i> O157: H7. Food microbiology, 23(6), 552-560.

Yu, C et al., 2010. Microencapsulation of Gram-Negative Bacteria by Spray Drying. International Journal of Food Engineering, 6(2), 1556-3758.

31