SUBSECRETARA DE EDUCACIN SUPERIOR DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR TECNOLGICA INSTITUTO TECNOLGICO DE TUXTLA GUTIRREZ

INGENIERA EN BIOQUIMICA

Dalia Ramos Toledo

Anlisis de crecimiento de microalgas a diferentes condiciones de iluminacin y nutrientes

ENERO-JUNIO 2011

ndice

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Justificacin ................................................................................................................................... 5 Objetivos ....................................................................................................................................... 6 Objetivo general ........................................................................................................................ 6 Objetivos especficos.................................................................................................................. 6 Caracterizacin del rea en que particip....................................................................................... 6 Problemas a resolver ..................................................................................................................... 6 Alcances y limitaciones .................................................................................................................. 7 Alcances..................................................................................................................................... 7 Limitaciones ............................................................................................................................... 7 Fundamento terico ...................................................................................................................... 8 Taxonoma ................................................................................................................................. 8 Morfologa ................................................................................................................................. 9 Ultraestructura ........................................................................................................................ 10 Composicin qumica ............................................................................................................... 12 Protenas.............................................................................................................................. 12 Carbohidratos ...................................................................................................................... 13 Lpidos ................................................................................................................................. 13 Vitaminas ............................................................................................................................. 14 Pigmentos ............................................................................................................................ 14 Aplicaciones ............................................................................................................................. 14 Aplicaciones teraputicas ..................................................................................................... 14 Aplicaciones comerciales ...................................................................................................... 15 Cintica de crecimiento............................................................................................................ 17 Condiciones de crecimiento ..................................................................................................... 19 Iluminacin .......................................................................................................................... 19 Temperatura ........................................................................................................................ 19 Nutricin .............................................................................................................................. 20 La absorcin de nitrato por las algas......................................................................................... 20 Proceso bioqumico .............................................................................................................. 21 Procedimiento y descripcin de las actividades realizadas............................................................ 23 Microorganismo....................................................................................................................... 23

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Condiciones y medio de cultivo ................................................................................................ 23 Medio de cultivo .................................................................................................................. 23 Mantenimiento de la cepa y preinculos .............................................................................. 24 Inculos ............................................................................................................................... 24 Cultivos experimentales ....................................................................................................... 25 Mtodos analticos ................................................................................................................... 25 Peso seco ............................................................................................................................. 25 Determinacin de clorofila ................................................................................................... 26 Resultados ................................................................................................................................... 26 Conclusiones................................................................................................................................ 29 Bibliografa .................................................................................................................................. 30

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ndice de tablas

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Tabla 1 Ubicacin taxonmica de Spirulina maxima ....................................................................... 9 Tabla 2 Contenido de aminocidos en Spirulina maxima .............................................................. 13 Tabla 3 Soluciones estndar para la preparacin del medio bg-11 ............................................... 23 Tabla 4 Solucin bg-11 de metales traza...................................................................................... 24 Tabla 5 Principales parmetros cinticos obtenidos del crecimiento de Spirulina maxima en los ensayos con diferente fuentes de nitrgeno .......................................................................... 26

ndice de figuras

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Figura 1 Spirulina maxima ............................................................................................................ 10 Figura 2 Ciclo de vida Spirulina maxima ....................................................................................... 12 Figura 3 Asimilacin de nitrato ..................................................................................................... 22 Figura 4 Produccin de biomasa en Spirulina maxima.................................................................. 27 Figura 5 Produccin de biomasa y clorofila en Spirulina maxima .................................................. 28

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JustificacinSpirulina maxima es una cianobacteria filamentosa, auttrofa, reconocida tambin como alga verde-azul, y que deriva su nombre de la naturaleza helicoidal o en espiral de sus filamentos.

Su alto contenido nutricional justifica que se analice su produccin en cantidades suficientemente altas para permitir su comercializacin en un mbito nacional e internacional. Spirulina maxima contiene entre 50 60% de protena bruta. El espectro de sus aminocidos es similar al de otros microorganismos y patrones protenicos alimenticios como huevos o leche, aun cuando es deficiente en metionina, cistena y lisina (Snchez et al., 2003). Spirulina spp. es una fuente importante de vitaminas, especialmente vitamina B12 y carotenos; tambin de minerales como el hierro y de cidos grasos esenciales como el gama-linoleico (Gault, 2009). De hecho, la composicin qumica, de la S. maxima es el factor ms importante para evaluar la utilizacin de esta cianobacteria, como fuente potencial de alimento, lo que hace pertinente que se realicen estudios sobre su crecimiento y produccin.

Spirulina maxima puede cultivarse fcilmente, en biorreactores y sistemas acuosos abiertos, naturales y artificiales, en los que el medio de cultivo lquido contiene sales como bicarbonato de sodio y nitratos, que contribuyen a la alcalinidad del medio, uno de los factores ms determinantes en el escalado y produccin (Richmond, 2004). La iluminacin es importante por ser Spirulina maxima organismo fotoautotrfico, y para lograr una adecuada distribucin de nutrientes, se mantiene agitacin por medio mecnico o por burbujeo.

Una instancia previa al cultivo industrial es la experimental, con el fin de obtener conocimiento sobre las condiciones ambientales que ms favorecen el crecimiento y cultivo de Spirulina maxima.

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Objetivos

Objetivo general Evaluar los efectos de parmetros de cultivo en el crecimiento de la microalga Spirulina maxima y seleccionar aquellos que lo favorezcan.

Objetivos especficos Evaluar el efecto de diferentes fuentes de nitrgeno en el crecimiento de Spirulina maxima.

Evaluar el efecto de diferentes concentraciones de nitrgeno en el crecimiento de Spirulina maxima.

Caracterizacin del rea en que participLas actividades realizadas con la preparacin de cultivos de la microalga Spirulina maxima se realiz en el laboratorio de biotecnologa vegetal del Instituto Tecnolgico de Tuxtla Gutirrez; y el manejo e inoculacin de esta fue efectuado en el laboratorio de posgrado de la misma institucin.

Problemas a resolverMediante esta investigacin fue posible determinar la mejor fuente de nitrgeno y concentracin que favoreciera el crecimiento de la microalga Spirulina maxima ya que por su alto contenido nutricional justifica que se analice su produccin en

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cantidades suficientemente altas para permitir su comercializacin en un mbito nacional e internacional.

Alcances y limitaciones

Alcances Conocer las condiciones ms adecuadas para la nutricin de Spirulina maxima y el efecto de esta sobre el crecimiento.

Aprender las tcnicas de cultivo de microalgas, as como el manejo de equipo para las distintas determinaciones.

Conocer el manejo de paquetes computacionales que permitieron el anlisis estadstico de los datos obtenidos.

Limitaciones

Slo se estudi la especie Spirulina aunque existen ms tipo de microalgas

nicamente se analiz el efecto del nitrgeno

Slo se estudi en condiciones a nivel matraz aunque en un futuro se espera escalar a biorreactor.

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Fundamento tericoSpirulina maxima es una cianobacteria planctnica que forma poblaciones masivas en cuerpos de agua tropicales y subtropicales caracterizados por altos niveles de carbonato, bicarbonato y pH. Mientras que S. platensis parece ser la especie ms distribuida, principalmente en frica, Asia y Sudamrica, S. mxima parece estar esencialmente confinada a Amrica Central. Esta ltima especie representa el principal componente del fitoplancton del Lago de Texcoco, que podra ser considerado el hbitat original de esta especie (Richmond, 2004).

TaxonomaDesgraciadamente existe una confusin entre los trminos Spirulina y Arthrospira, la cual proviene a la vez de errores en las determinaciones cientficas de los aos 1950 y de la denominacin comercial de ciertas cianobacterias alimentaras. Los trminos al asignarse en momentos histricos y autores diferentes, pero al argumentar un conjunto de conceptos a favor de uno y otro trmino, parece favorecer con mejores argumentos cientficos la denominacin Arthrospira. El gnero Arthrospira spp. incluye el conjunto de cianobacterias alimentaras vendidas comercialmente bajo el nombre de Spirulina. Los nombres cianobacteria, algas verde-azules o cianofceas, se consideran trminos compatibles. El primero se refiere a la relacin taxonmica y filogentica, mientras el segundo representa la correlacin ecolgica y biolgica. As, segn la revisin actual para este microorganismo, en la tabla 1 encontramos su clasificacin taxonmica.

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Tabla 1 Ubicacin taxonmica de Spirulina maxima (Guiry, 2011) Dominio: Bacteria Phylum: Cyanobacteria Clase: Cyanophyceae Orden: Oscillatoriales Familia: Phormidiaceae Gnero: Arthrospira Especie: Spirulina maxima (=Arthrospira)

MorfologaS. mxima es una cianobacteria filamentosa reconocible por la principal caracterstica morfolgica del gnero: la disposicin de los tricomas multicelulares cilndricos en una hlice abierta. Bajo el microscopio de luz, los filamentos azul-verde no heterocsticos, estn compuestos por clulas vegetativas que cuando experimentan la fisin binaria en un solo plano, muestran fcilmente las paredes transversales. Los filamentos son solitarios, estn flotando libremente y muestran movimiento por deslizamiento. Los tricomas estn envueltos por una capa delgada, que muestra constricciones poco pronunciadas en las paredes transversales y tiene pices poco o nada atenuados. Las clulas apicales pueden estar ampliamente redondeadas o puntiagudas. La anchura de los tricomas, compuesto por clulas cilndricas ms cortas que anchas, vara de 6 a 12 m en una variedad de formas. Factores ambientales, principalmente la temperatura, condiciones fsicas y qumicas, pueden afectar la geometra de la hlice. Una drstica alteracin de la geometra es la transicin reversible de la hlice a una forma de espiral despus de la transferencia de los filamentos de un medio lquido a uno slido. (Vonshak , 1997)

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Figura 1 Spirulina maxima (Institute of Botany, 2011)

Ultraestructura

La organizacin celular de S. maxima es tpica de los organismos procariotas, que carecen de ncleo morfolgicamente limitado, de plsticos y una envoltura tipo gram-negativa, la pared celular. Los tricomas son rodeados por una delgada vaina difluente. La vaina es de aproximadamente 0.5m de espesor y tiene un fibrilar, como la estructura de una red. El material de la envoltura, se excreta a travs de poros situados en la pared celular, se cree que participan en el movimiento del filamento. La pared celular de varias capas es delgada, sobre 40-60m, y tiene una capa fcilmente detectable que corresponde al peptidoglicano. Los espacios entre las paredes transversales que dividen el tricoma en clulas, estn conectados por plamodesmos, que son formados por el crecimiento centrpeto y la ampliacin

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tanto del peptidoglicano y la capa ms interna de la pared celular hacia el centro de la clula Justo debajo de la pared celular esta la membrana plasmtica, que rodea al citoplasma, es rica en inclusiones subcelulares tpicas de las cianobacterias. Estas inclusiones tienen una precisa disposicin y distribucin dentro del citoplasma. La regin perifrica de la clula se caracteriza por un citoplasma lleno de grnulos de poliglucano y vacuolas de gas. Tambin hay pequeos grnulos osmifilos, fibras y gotas de lpidos. Las membranas de los tilacoides, que se encuentran entre la regin perifrica y el citoplasma central, se disponen en paralelo y tienen asociados ficobilisomas. Las otras reas estn llenas de ribosomas y de fibrillas de ADN. Las pequeas gotitas de lpidos se encuentran dispersas entre los paquetes de tilacoides y en las zonas libres de tilacoides. A veces, algunos esfricos, muy osmiofilos grnulos de polifosfato y grandes granulos de cianoficina pueden ser observados. La zona central del citoplasma contiene carboxisomas, reconocibles por su perfil polidrico y apariencia pseudocristalina y algunos cuerpos cilndricos. (Vonshak , 1997) El ciclo de vida de Spirulina maxima es simple, es decir, la reproduccin se lleva a cabo por la fragmentacin de un tricoma maduro en una serie de segmentos ms cortos a travs de la destruccin de clulas especializadas, llamado necridia. Los segmentos resultantes aumentan la longitud por fisin binaria en un solo plano a lo largo del eje longitudinal del tricoma y luego asumen la forma helicoidal. (Richmond, 2004)

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Figura 2 Ciclo de vida de Spirulina maxima (Snchez et al., 2003)

Composicin qumicaProtenas

Spirulina tiene una alta concentracin de protenas alrededor del 64-74 porciento del peso seco (Vonshak, 1997). Con todos los aminocidos esenciales que se requieren nutricionalmente segn la FAO, pero con un contenido bajo en metionina (tabla 2).

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Tabla 2 Contenido de aminocidos en Spirulina maxima Aminocidos Isoleucina Leucina Lisina Fenilalanina Metionina Treonina Triptfano Valina Datos FAO protena) 4.2 4.8 4.2 2.8 2.2 2.8 1.4 4.2 (g/100g

Carbohidratos

El contenido de carbohidratos es moderado en rangos entre el 15 al 20%. La mayora de los carbohidratos pueden ser extrados por agua; a un pH de 8.0 se ha obtenido una mejor extraccin (Vonshak , 1997). El azcar ms abundante es la glucosa alrededor del 7-8 %, la ramnosa no excede el 0.9%.Lpidos

Spirulina contiene slo del 6-13% de lpidos, la mitad son cidos grasos. Monogalactosildiacilglicerol (MGDG), sulfoquinovosildiacilglicerol (SQDG) y

fosfatidilglicerol (PG) son los lpidos en mayor cantidad, alrededor del 20-25% cada uno del contenido en lpidos. DGDG contribuye slo en el 7-10%, mientras que los triglicridos son el componente minoritario 1-2%. El raro cido graso poliinsaturado (PUFA) -cido linoleico (18:36, GLA) se le afirma que tiene propiedades medicinales. GLA baja las lipoprotenas de baja densidad en los pacientes con hipercolesterolemia, siendo alrededor de 170 veces ms eficaz que el cido linoleico, componente principal de la mayora de los aceites poliinsaturados. Adems, se ha utilizado para el tratamiento del eccema atpico, y para aliviar los sntomas del sndrome pre-menstrual. Tambin se cree que tienen un efecto positivo en las enfermedades del corazn, enfermedades del Parkinson y la esclerosis mltiple. (Vonshak, 1997)

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Vitaminas Vitamina B12

Spirulina contiene un alto contenido de cianocobalamina alrededor de 11 mg por kg de biomasa seca. Sin embargo esta vitamina es producida comercialmente por una bacteria mutante en grandsimas cantidades as es improbable producir vitamina B12 a partir de Spirulina. (Richmond, 2004)Pigmentos

Spirulina contiene clorofila a, con un contenido del 0.8 al 1.5 % del peso seco. (Vonshak, 1997)

AplicacionesAplicaciones teraputicas

La

clulas

de

Spirulina

y

sus

extractos

han

reportado

actuar

como

antiinflamatorios, antioxidantes y agentes anti cncer y tener acciones teraputicas contra enfermedades como hipercolesterolemia. Estas propiedades son probablemente por la composicin nica como - cido linoleico (GLA), ficocianina y polisacridos. (Gault, 2009)Efecto anti-inflamatorio

Dosis de 100 y 200 mg/kg de ficocianina C, obtenida de Spirulina spp. administrada oralmente a ratones, redujeron la inflamacin de las extremidades posteriores, producida por glucosa oxidasa. Tambin se encontr que este pigmento disminuy significativamente el edema producido por cido araquidnico y acetato de 12-Otetradecanoil forbol. Igualmente redujo, el causado por la inoculacin de carragenina en la extremidad posterior de ratas y el granuloma provocado por la implantacin de algodn. Ms recientemente encontraron que la ficocianina C inhibi significativamente el edema y las concentraciones de

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leucotrieno TB4 inducidos por cido araquidnico. Adems se encontr efecto antiinflamatorio en la colitis, originado en ratas por edema (Gault, 2009).

Antioxidante

Spirulina contiene una gran cantidad de pigmentos especialmente -carotenos, que proporciona algn efecto antioxidante. Spirulina tambin contiene altas

cantidades de ficocianina el cual se ha reportado tener efectos antioxidantes, antiinflamatorios, anti-cncer y propiedades de inhibir virus. (Gault, 2009)

Hipercolesterolemia

La suplementacin de 4g/da de Spirulina

en pacientes con isquemia en el

corazn significativamente disminuye el contenido de colesterol, triglicridos, colesterol LDL y VLDL e incrementa el colesterol HDL. (Gault, 2009)

Aplicaciones comerciales

Acuacultura

La cra de microcrustceos, moluscos y peces, como consumidores de plancton, requiere procesos de reproduccin y cra artificial a gran escala y por lo tanto es de gran inters tener plantas pilotos de produccin de la cianobacteria para la alimentacin de los primeros estados larvales. Se mantiene en el medio una alta productividad y estos tapetes biolgicos constituiran una ptima calidad para el agua, acumulando el oxgeno transfiriendo sustancias metablicas producidas por los organismos en cultivo.

Favorece la cra de peces ornamentales especialmente ya que la espirulina tiene buen contenido de carotenos y permite mejorar el colorido y vistosidad de estas especies. La cra de microcrutceos tambin se ha implementado para el cultivo

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de peces, pero se ha comprobado que la eficiencia es mayor con las microalgas y cianobacterias. Los moluscos producidos en base a este tipo de alimentacin no convencional reduciran los costos de produccin y proporcionaran al mercado alimento de alta calidad con mayores ganancias para el productor. (Snchez et al., 2003)

Tratamiento de aguas negras

Se han tratado aguas de desecho en base a Spirulina maxima, utilizada como purificadora de aguas residuales que remueve los nitratos, fosfatos, y otros elementos presentes en gran cantidad. En piscinas de oxidacin o estanques se pueden obtener dos productos esenciales: protena vegetal contnua y aguas tratadas y recuperadas, evitando la contaminacin y eutroficacin activada por la ozonizacin del agua lo cual permite utilizar el agua para consumo humano.

En Israel se aprovechan las aguas de las costas para produccin de microalgas como Spirulina sp. o Scenedesmus sp., tratando de implementar mtodos menos costosos y eficientes para el tratamiento de aguas de desecho industriales y domsticas. En Londres se utilizan las aguas de tratamiento terciario de desechos para producir biomasa y purificarlas. (Snchez et al., 2003)

Fuente energtica

Existen numerosos estudios sobre el posible uso de la energa solar, con gran prioridad en numerosos pases que poseen tecnologa de alto riesgo y mucho costo. Las cianobacterias, como responsables de la fijacin del nitrgeno y produccin de hidrgeno con altas tazas de reproduccin a travs de la utilizacin de energa solar y agua, mantienen el sistema con tcnicas de produccin simples adicionando la obtencin de biomasa usada en medicina, cosmetologa y nutricin. (Snchez et al., 2003)

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Produccin comercial

La produccin de Spirulina spp. se puede llevar a cabo en sistemas cerrados o abiertos. El primero implica foto-bioreactores y este no se utiliza en la produccin industrial por su complejidad. El segundo sistema, denominado Raceway, debido a su costo de produccin bajo, fcil manejo y alta produccin de biomasa, se escoge con frecuencia para la produccin industrial. Este mtodo utiliza una charca con una isleta central y un motor que opera paletas anchas que permite el desplazamiento continuo del cultivo lquido en la periferia. Si fuera necesario, platos acoplados al sistema de agitacin se pueden introducir para evitar la formacin de puntos muertos (Richmond, 2004).

El proceso productivo tiene cinco etapas: 1. Filtracin y Limpieza: Realizado con un filtro de nylon en la entrada de la charca de agua, para eliminar impurezas slidas de tipo ambiental de mediano tamao. 2. Pre-Concentracin: Buscando obtener la biomasa del alga, se debe lavar para reducir el contenido de sales. 3. Concentracin: En el cual se quita la mayor cantidad posible de agua intrnseca (localizada entre los filamentos). 4. Neutralizacin: La biomasa se neutraliza con la adicin de una solucin cida. 5. Desintegracin: Donde La biomasa es desintegrada por molienda. 6. La Deshidratacin por secado: es un paso adicional, y de gran importancia econmica ya que implica cerca de 20-30% del costo de produccin.

Cintica de crecimientoEl crecimiento de Spirulina spp. en un cultivo por lotes, bajo condiciones preestablecidas por cada investigador o productor, presenta las siguientes fases de desarrollo: (Vonshak, 1997)

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1. Fase de adaptacin 2. Fase de crecimiento exponencial 3. Fase de crecimiento lineal 4. Fase estacionaria 5. Fase de muerte.

Durante la primera fase (fase de adaptacin) el cultivo de Spirulina spp. se acopla a las condiciones establecidas, la tasa de crecimiento especfico es baja y se incrementa paulatinamente con el tiempo del cultivo y la capacidad biolgica de adaptacin de la cepa utilizada. En la segunda fase (fase exponencial), el cultivo de Spirulina spp. se ha adaptado a las condiciones de crecimiento. La intensidad lumnica no es una limitante, y los cambios en la concentracin de nutrientes causada por la adaptacin de Spirulina spp. son tan bajos que el efecto en el crecimiento del cultivo no es significativo. En un cultivo, sin luz ni nutrientes limitados, el incremento en la biomasa de la microalga (expresada como peso seco, nmero de clulas, densidad ptica etc.) por unidad de tiempo, es proporcional a la biomasa inicial del cultivo

El crecimiento de Spirulina spp. continua hasta la tercera fase (fase de crecimiento lineal), en la cual la multiplicacin celular se extiende, hasta llegar a ocultarse una clula sobre la otra, lo que produce una disminucin de luz. Este efecto reduce la 39 tasa de crecimiento especfico y el incremento de biomasa de Spirulina spp. llega a ser lineal. Esta fase lineal contina hasta llegar a una inhibicin del crecimiento debido al agotamiento de nutrientes; el cultivo alcanza un estado, en el cual la respiracin celular llega a ser una interferencia. Si el cultivo se mantiene rico en nutrientes, esta fase lineal puede permanecer varios das. Durante la cuarta fase (fase estacionaria), con una disminucin de la tasa de crecimiento, el suplemento lumnico en las clulas de Spirulina spp. es limitado y la respiracin aumenta. El metabolismo oxidativo de sntesis de sustancias llega a reducir el constante aumento de biomasa. En este punto del crecimiento, la curva de crecimiento presenta el valor aproximado mximo de concentracin de biomasa

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de Spirulina spp., aqu se alcanza el equilibrio entre la concentracin mxima de biomasa y la prdida debida a los procesos de degradacin. Durante la quinta fase (fase de muerte) las clulas de Spirulina spp. mueren, liberando materia orgnica. Esta fase es causada por las condiciones desfavorables del ambiente, sobre el cultivo y el limitado suplemento de luz y nutrientes o la contaminacin de otros microorganismos, este tipo de crecimiento ocurre en sistemas cerrados.

Condiciones de crecimiento

Iluminacin

La iluminacin es indispensable para el crecimiento de Spirulina spp. debido al proceso de la fotosntesis, determinante para su constitucin estructural. Un filamento individual de Spirulina spp. no puede soportar una exposicin prolongada a la iluminacin ya que podra ser destruido por fotolisis. De ah, la necesidad de mantenerla iluminacin controlada en fotoperodos regulados de tiempo 12/12 (da/noche) cada perodo genera reacciones particulares: en el da, se favorece la asimilacin de CO2 a travs del ciclo de Calvin, lo que permite la formacin de glicgeno como material de reserva en la clula. En la noche ocurren reacciones bioqumicas de sntesis de material proteico. La intensidad lumnica a escala de laboratorio, puede variar entre 1500-2000 lux. (Richmond, 2004)

Temperatura

La temperatura del lquido de cultivo tiene una influencia directa con la velocidad de crecimiento de Spirulina spp., y es necesario tener como referencia dos tipos de temperatura a escala de laboratorio: la primera, la del medio ambiente y la segunda se refiere al medio lquido de cultivo; esta ltima es importante ya que, Spirulina spp. no inicia su crecimiento de una manera considerable por debajo de 20C. La mxima velocidad de crecimiento se alcanza entre los 35 38 C, por

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encima de esta temperatura, hay riesgo de la destruccin rpida del cultivo. En general los cambios bruscos de temperatura en el cultivo disminuyen el rendimiento de la biomasa (Richmond, 2004).

Nutricin

Las cianobacterias crece en muchos medios lquidos y slidos de cultivo como: BG11, ASM-1, Z8, DOBLEGA, BBM, AA, KMC, y para Spirulina spp. los medios de cultivo predilectos son: Zarrouk y SSM (el Medio Salino de Mar). (Arthur, 2005)

Vonshak (1986) resumi los requerimientos de los medios para el cultivo de algas de la siguiente manera: i. El total del contenido de sal es determinado por el hbitat del cual es originario el alga. ii. La composicin celular en trminos de los principales componentes ionicos como K, Mg, Na, Ca, SO4 y Cl. iii. iv. v. vi. vii. Fuente de carbono ya sea carbonatos o bicarbonatos. pH Elementos traza y agentes quelantes como el EDTA Vitaminas La fuente de nitrgeno especialmente nitratos, amonio y urea.

La absorcin de nitrato por las algasLa captacin de nitrgeno disponible (principalmente como nitrato o amonio) en las clulas de las algas es el primer paso importante en la incorporacin de nitrgeno en la biomasa del ecosistema de agua dulce. La urea, que a veces llega a concentraciones apreciables en las aguas naturales, se utiliza como fcilmente por variaciones en forma de iones de amonio.

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Proceso bioqumico

La asimilacin de nitrato consiste en la captacin activa de este anin en las clulas de las algas, seguido por su transformacin en amonaco utilizando el poder de reduccin de la fotosntesis. La posterior formacin de aminocidos se produce en el plstido y est mediada por dos enzimas clave glutamina sintetasa y glutamato sintasa (tambin

llamado glutamina-oxoglutarato animo transferasa, abreviado GOGAT).

La reduccin del nitrato en el interior de la clula de las algas se produce como un proceso de dos etapas de la siguiente manera (Sigee, 2005):

El nitrato se convierte en nitrito en el citosol por la enzima nitrato reductasa que requiere molibdeno como cofactor. La reduccin de poder de NO3-, puede ser suministrada por el plasto, plstido o plastidio reduciendo triosas fosfato y/o dicarboxilatos como es en las plantas superiores.

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Figura 3 Asimilacin de nitrato (Sigee, 2005)

El NO2 formado de esta manera se reduce a NH4 + en el plstido, utilizando ferredoxina como donador de electrones. Esta conversin es mediada por la enzima nitrito reductasa, que se localiza en el plstido y requiere de Fe y Cu como cofactores.

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Procedimiento y descripcin de las actividades realizadas

MicroorganismoEn el presente estudio se utiliz la cepa de Spirulina mxima proveniente de la coleccin de algas de Ceparios CIBNOR S.C (Clave UTEX 2342).

Condiciones y medio de cultivoMedio de cultivo Medio BG-11

El medio utilizado para el cultivo de Spirulina mxima fue el Medio BG-11 (Arthur 2005). La preparacin de este medio de cultivo requiere de 8 soluciones de macronutrientes y de una solucin de metales traza. Las concentraciones requeridas para la elaboracin de cada una de estas soluciones estndar se indica en las tablas siguientes (University of Texas, 2010):Tabla 3 Soluciones estndar para la preparacin del medio BG-11

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Componente

Cantidad (ml/L) NaNO3 10 K2HPO4 10 MgSO4. 7H2O 10 CaCl2.2H2O 10 cido ctrico 10 Citrato frrico 10 Na2EDTA.2H2O 10 NaCO3 10 Solucin BG-11 1 de metales traza

Stock (g/200ml) 30 0.8 0.15 0.72 0.12 0.12 0.02 0.4

Concentracin final (mM) 17.6 0.22 0.03 0.2 0.03 0.02 0.002 0.18

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Tabla 4 Solucin BG-11 de metales traza

No. 1 2 3 4 5 6

Componente H3BO3 MnCl2.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2

Cantidad (g/L) 2.86 1.81 0.22 0.39 0.079 0.0476

Concentracin final (M) 46 9 0.77 1.6 0.3 0.17

Para preparar un litro de medio BG-11, a aproximadamente 900 ml de agua destilada se aadieron los primeros 9 componentes en el orden especificado mientras agita continuamente. Llevar a un volumen total de un litro con agua destilada. Una vez preparado el medio de cultivo, este debe ser esterilizado en autoclave a 121C y 15 Lb/in 2 de presin por 20 min. Cabe mencionar que es posible solidificar el medio a travs de la adicin de agar, pero preparando 500 ml de medio de cultivo y en otro recipiente aadir 15 g de agar a 500 ml de agua destilada. Esterilizar y combinar la solucin de agar con una solucin de tiosulfato de sodio estril de 24.8 g/ 100 ml. Luego combinar el agar y el medio de cultivo.

Mantenimiento de la cepa y preinculos

La cepa Spirulina mxima se mantuvo en cultivos lquidos de 100 ml de volumen de medio BG-11, inoculados al 10% y en medios slidos de BG-11. Fueron preservados bajo las siguientes condiciones: a una temperatura de 24C e iluminacin con luz blanca continua a una intensidad de 2000 Lux durante periodos de dos semanas para posteriormente ser renovados. Los preinculos fueron preparados en sistemas de esta ndole bajo las mismas condiciones de incubacin durante 7 das, para despus ser empleados en la preparacin de inculos.Inculos

Los inculos se prepararon en matraces Erlenmeyer de 1 L de volumen con tapones los cuales cuentan con lnea de aireacin y toma de muestra. Los inculos consistieron en cultivos lquidos de 200 ml de medio BG-11 inoculados al 10% a partir de los preinculos. Los inculos fueron incubados

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durante periodos de siete das bajo las condiciones siguientes: temperatura de 24C e iluminacin con luz blanca contina a una intensidad de 2000 Lux.Cultivos experimentales

Los cultivos experimentales fueron preparados y evaluados en matraces de 1L. Con un volumen de trabajo de 200 ml inoculados al 10% a partir de los inculos. Una vez inoculados bajo condiciones aspticas, los cultivos de S. maxima en medio BG-11, fueron incubados durante 8 das, bajo las condiciones estndar siguientes: temperatura de 24C, fotoperiodo de 12:12 h e iluminacin con luz blanca de 2000 Lux. Cabe mencionar que las condiciones de cultivo correspondiente a la concentracin de las distintas fuentes de nitrgeno, variaron de acuerdo a los parmetros evaluados de 0.2 y 0.1 g por litro de urea, y 0.75 y 0.375 g por litro de nitrato de sodio (Godoy et al., 2011). Fueron definidas mediante la adicin de distintos volmenes de soluciones estndar de NaNO3 y urea, respectivamente durante la preparacin del medio de cultivo. Todos los cultivos experimentales evaluados en este proyecto fueron monitoreados cada 24 h, durante un perodo total de 4 das. Las variables analizadas fueron peso seco, clorofila y nitrgeno. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.

Mtodos analticosPeso seco (Wolfgang, 1994)

Pesar membranas de nitrocelulosa de 0.5 m. Estas se pusieron previamente a secar a 70C por 24 horas. Filtrar 10 ml de muestra y dejar secar por 24 h a 70C Pesar

Frmula para calcular peso seco

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Determinacin de clorofila (Wolfgang, 1994)

Extraer 5 ml de muestra Centrifugar a 3500 rpm por 10 min Desechar sobrenadante y agregar 5 ml de metanol al 90% a la pastilla y mezclar perfectamente. Calentar la mezcla pastilla-metanol a bao mara a 60C por 10 min. Refrigerar 24 horas en la obscuridad Centrifugar a 3500 rpm por 10 min Desechar pastilla y aforar el sobrenadante a 5 ml con metanol al 90% dependiendo de la concentracin del extracto metanol-pigmento. Tomar lecturas de absorbancia a 663 y 645 nm.

Frmula para calcular contenido de clorofila a

(

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)

ResultadosAl evaluar el desarrollo del cultivo en todos los ensayos con distintas fuentes de nitrgeno y su concentracin, se observaron slo las etapas de adaptacin y exponencial por slo contar con 4 das para su elaboracin. Spirulina maxima es capaz de crecer bajo las dos distintas fuentes, mostrando el valor ms alto de biomasa con urea al 0.2 g/L, de ah con nitrato de sodio al 0.75 g/L y seguido por urea al 0.1 g/L y finalmente nitrato de sodio al 0.375 g/L, como se muestra en la tabla 5 y figura 4.Tabla 5 Principales parmetros cinticos obtenidos del crecimiento de Spirulina maxima en los ensayos con diferente fuentes de nitrgeno

Ensayo Control(1.5g/L NaNO3) 0.2 g/L urea 0.75 g/L NaNO3 0.375 g/L NaNO3 0.1 g/L urea

Velocidad de crecimiento (h-1) 0.0238 0.0222 0.0258 0.0211 0.0195

Tiempo de duplicacin (h) 41.9815 45.0247 38.6249 47.3709 51.2295

Mxima biomasa (mg/L) 280 0.02 260 0.17 230 0.014 170 0.007 170 0.014

Mxima clorofila (mg/L) 3.15 0.16 3.05 0.06 2.99 0.09 2.38 0.1 2.82 0.04

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El tiempo de duplicacin vari desde 38 horas a 51 horas, bibliogrficamente se ha reportado tiempo de duplicacin de 16 a 38 horas para las microalgas (Snchez et al., 2003). Pero este valor es general no se especifica para que microalga y tambin a que se vari la fuente de nitrgeno y su concentracin dio como resultado valores mucho ms grandes. Aunque el tiempo de duplicacin del ensayo de 0.2 g/L de urea fue lento a diferencia del ensayo de 0.75 g/L de nitrato de sodio produjo una mayor cantidad de biomasa y clorofila, ya que la urea es ms fcilmente asimilable que el nitrato de sodio (Sigee, 2005).350

300

250 Biomasa mg/L

200

150

100

50

0 0 20 40 60 Tiempo (h) Urea 0.2 g/L Nitrato 0.75 g/L Urea 0.1g/L Nitrato 0.375 g/L Control 80 100 120

Figura 4 Produccin de biomasa en Spirulina maxima

El anlisis de contenido de clorofila que se muestra en la figura 5 indica que urea a 0.2 g/L produjo la ms alta cantidad de clorofila seguido por nitrato de sodio a 0.75 g/L, urea a 0.1 g/L y nitrato de sodio a 0.375 g/L. Este hecho prueba la posibilidad de sustituir el nitrato de sodio con urea.

27

Godoy et al. (2011) con Spirulina platensis en medio Zarrouk obtuvo valores de clorofila de 14.25 mg/L en 1 g/L de NaNO 3 y 15.05 mg/L en 0.1 g/L de urea. Resultando que los valores obtenidos en este estudio son muy pequeos esto quizs al haber usado un medio diferente y que el BG-11 no es un medio especfico para Spirulina maxima. (Arthur, 2005)

350

3.5

300

3

250

2.5

Biomasa mg/L

150

1.5

100

1

50

0.5

0 Control 0.2 g/L urea 0.75 g/L NaNO3 0.375 g/L NaNO3 Biomasa mg/L 0.1 g/L urea

0

Clorofila mg/L

Figura 5 Produccin de biomasa y clorofila en Spirulina maxima al final de la cintica

Clorofila mg/L28

200

2

Para un cultivo ms econmico el uso de urea sera lo ms rentable, ya que comercialmente cuesta la mitad que el nitrato de sodio. La utilizacin de la urea como fuente de nitrgeno proporciona una ganancia de energa debido a su hidrlisis espontnea a amonaco en el medio alcalino, que luego es fcilmente asimilable por Spirulina maxima (Sigee, 2005).

Conclusiones Los resultados presentes en este estudio muestran que el uso de urea como fuente alternativa de nitrgeno en la produccin comercial de Spirulina maxima es la ms adecuada.

Los ensayos con una concentracin de nitrato de sodio menor a la control resultaron poco beneficos ya que no se obtuvo una buena produccin de biomasa.

El uso de un medio de cultivo no especfico para Spirulina maxima pudo haber afectado los resultados. Lo que deja la posibilidad de estudios con otros medios de cultivo.

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BibliografaArthur, R. Algal culturing techniques. Academic Press, 2005. Godoy Danesi E.D., Rangel-Yagui C.O., Sato S., Monteiro de Carvalho J.C. "Growth and content of Spirulina platensis biomass chlorophyll cultivated at different values of light intensity and temperature using different nitrogen sources." Brazilian journal of microbiology, 2011: 362-373. Guiry, M.D. Algaebase. 2011. http://www.algaebase.org/search/species/detail/?species_id=30167 (accessed Abril 25, 2011). Institute of Botany, Academy of Sciences of the Czech Republic. Culture Collection of Autotrophic Organisms. 2011. http://www.butbn.cas.cz/ccala/index.php?ch1=checked&ch2=checked&ch3=checked&ge nus=Arthrospira%20sp.%20('platensis')&bol5=b5ge&bol1=b1a&species=&bol2=b2a&strai n=&bol3=b3a&locality=&bol4=b4a&page=sr&Search=Odeslat+dotaz (accessed Junio 20, 2011). M. Gault, Percy. Handbook on cyanobacteria biochemistry, biotechnology and applications. New York: Nova Science Publishers, 2009. Richmond, A. Handbook of microalgal culture. biotechnology and applied phycology. Wiley Blackwell, 2004. Schez, M.r., BernalJ., Rozo C., Rodrguez I. "Spirurilina (Arhrospira): An edible microorganism." Universitas Scientiarum, 2003: 11. Sigee, D.C. Freshwater microbiology: biodiversity and dynamic interactions of microorganisms in the aquatic environment. Hoboken, NJ: Wiley, 2005. University of Texas, Austin. UTEX The culture collection of algae. 2010. http://web.biosci.utexas.edu/utex/mediaDetail.aspx?mediaID=26 (accessed Abril 25, 2011). Vonshak, A. Handbook of Microalgal Mass Culture. Boca Raton: CRC Press, 1986. Vonshak, Avigad. Spirulina plantesis (Arthrospira) Physiology, cell biology and biotechnology. CRC, 1997. Wolfgang, E. Microalgae: biotechnology and microbiology. Cambridge Univ Pr., 1994.

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