Propiedades de hidratación: dependen de las interacciones proteína-agua:

• Absorción de agua• Capacidad de mojado (humectación)• Capacidad de hinchamiento• Capacidad de retención de agua• Adhesividad• Dispersabilidad• Solubilidad• Viscosidad

Propiedades relacionadas con interacciones proteína-proteína: precipitación, gelación, formación de estructuras (masa, fibras, películas, adhesión, cohesión). Propiedades de superficie: dependen de la composición superficial (capacidad para ligar grasas sabores). La emulsión y el espumado son dos fenómenos ligados directamente con los fenómenos de superficie.

Clasificación de las Propiedades Funcionales de las Proteínas

Clasificación de las Propiedades Funcionales de las Proteínas

Propiedades hidrodinámicas

Alimentodeshidratado

Vap

or d

e

agua

Agua

líquida

Adsorciónde agua

Absorciónde agua

Tiempo prolongado en presencia de

vapor

Solubilidad Dispersabilidad

Aumento de volumen

Retención de agua

Hinchamiento

Fuerza externa:centrifugación,presión

Propiedades de hidrataciónAgua: componente esencial, modifica las propiedades fisicoquímicas de

las proteínas amorfas o semicristalinas (efecto plastificante, cambia Tg y Tf).

Las moléculas de agua se fijan a varios grupos de las proteínas, entre los que se incluyen:• los cargados (interacciones ion-dipolo)• las interacciones dipolo-dipolo

los grupos peptídicos del esqueleto los grupos amida de Asn y Gln los grupos hidroxilo de los restos de Ser, Thr y Tyr

• con restos apolares (interacciones dipolo inducido-dipolo, hidratación hidrofóbica).

La capacidad de fijación de agua a las proteínas se define en términos de gramos de agua fijados por gramo de proteína, cuando una proteína deshidratada, en polvo, se equilibra con vapor de agua a una humedad relativa del 90-95%.

Las capacidades de fijación de agua o de hidratación de diversos grupos polares y apolares de las proteínas

Capacidad de hidratación: relacionada con su composición aminoacídica .

• restos aminoacídicos con grupos cargados fijan unas 6 mol de agua/mol de aminoácido• restos polares no cargados fijan 2 mol de agua/mol de aminoácido• restos apolares fijan 1 mol de agua/mol de aminoácido.

Número de restos cargados capacidad de hidratación

Capacidad de hidratación de una proteína se puede calcular a partir de su composición aminoacídica, utilizando la ecuación empírica:donde a es g de agua/g de proteína y fc, fp y fN son las fracciones de restos cargados, polares y apolares de la proteína, respectivamente.

Cantidad de agua fijada por gramo de proteína en función de la humedad relativa (isoterma de adsorción) es invariablemente una gráfica sigmoidea. Monocapa tiene lugar a actividad de agua

(a,) de 0,05-0,3 Multicapas sucede en un rango de actividad de agua de 0,3-0,7. El agua presente en la monocapa se asocia fundamentalmente con los grupos iónicos, no se congela, no participa como disolvente en las reacciones químicas (agua ligada), agua de movilidad restringida.• G para la desorción del agua de la monocapa de hidrataci6n (0,07-0,27 g deagua/g de proteína) es de sólo alrededor de 0,75 kJmol a 25°C. • Ec térmica del agua a 25°C es de alrededor de 2,5 kJmol

las moléculas de agua de la monocapa son razonablemente móviles.

A a, = 0,9, las proteinas fijan alrededor de 0,3-0,5 g de agua/g de proteína .

monoca

pa

mult

icap

a

La capacidad de retención de agua de las proteínas se ve influida por varios factoresambientales : pHla fuerza iónicael tipo de salesla temperaturala conformación proteica.

• La mayor parte de este agua no se congela a 0°C.

•A aw > 0,9, el agua líquida se condensa en las huecos de las moléculas proteicas o en los capilares de los sistemas de proteínas insolubles, como las miofibrillas.

• Propiedades de este agua similares a las del resto del agua

agua hidrodinámica, se mueve con las moléculas proteicas.

DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD

CLASIFICACION DE LOS METODOSDIRECTOS

GRAVIMETRICOSSECADO EN HORNO(TERMOGRAVIMETRICO*)DESECADO QUIMICOLIOFILIZACION

DESTILACION(METODOS DE EXTRACCION)

QUIMICOSTITULACION DE KARL FISHER.

INDIRECTOSELECTRICOS-ELECTRONICOS

CONDUCTIVIDADRESISTENCIA

ESPECTROSCOPICOSINFRARROJARESONANCIA MAGNETICA NUCLEARSONICOS Y ULTRASONICOS(MICROONDAS)

•

METODOS GRAVIMETRICOS (POR SECADO O EVAPORACION)

Miden la diferenciade peso una vezretirada el agua delalimento.

Requieren materialde peso conocido(peso constante).

METODOS POR SECADO CON CALOR SON LOS MAS UTILIZADOS

LOS EQUIPOS MAS COMUNES SON:•Hornos de convección o con flujo de aire•Hornos al vacío (normalmente 25-100 mm Hg)•Hornos de microondas*•Lámparas de secado infrarrojas (termobalanzas)*.

VENTAJAS: Precisos, relativamente baratos, fáciles de usar, oficiales para muchos alimentos, pueden ser analizadas muchas muestras al mismo tiempo.

DESVENTAJAS: Destructivo*, no esta recomendado para algunos alimentos (volátiles y termolábiles), requieren mucho tiempo.

LIOFILIZACION• SUBLIMACION DEL AGUA

– Paso de sólido a gas• ESPECIALMENTE UTIL EN MUESTRAS CON MUCHOS VOLATILES• MUY CARA

– Bajas temperaturas (-20 A -50°C)– Muy bajas presiones (25 A 5 6m)

Absorción de agua:

Aptitud de un material para incorporar agua en su estructura cuando se lo pone en contacto con agua a través de una superficie húmeda o por inmersión.

Importante característica para la textura de productos semisólidos (embutidos, carnes enlatadas, geles)

Capacidad de absorción de agua

Este método consiste en determinar la cantidad de agua que un polvo proteico es capaz de absorber a una temperatura dada, espontáneamente, cuando se pone en contacto con una cantidad limitada de agua.

El equipo consiste en una pipeta de pequeño volumen (1 o 2 ml) graduada, cuyo eje longitudinal se encuentra al mismo nivel que la superficie de contacto entre el agua y elpolvo proteico. El polvo se coloca sobre un papel filtro que está apoyado en una superficie plana y en un embudo.

Ambos, la pipeta y el embudo se conectan a través de una manguera transparente. Los resultado se expresan en cantidad de agua absorbida por cantidad de aislado (mL de agua/ g aislado) en función del tiempo

Procedimiento

1.El equipo mantenido a temperatura constante se llena con agua, evitando la incorporación de burbujas y se coloca el papel de filtro dejando que embeba agua aproximadamente 5 min.

2.Con un papel absorbente se elimina el exceso de agua sobre el papel de filtro hasta lograr enrasar en cero la columna de agua en la pipeta.

3.Se deja 5-10 min para verificar la nivelación del equipo (en este tiempo no debe variar la posición del menisco de agua).

4.Se pesa 50 a 100 ± 0,1 mg de muestra.

5.Se esparce la muestra rápidamente formando una capa uniforme sobre el papel de filtro mojado mientras se dispara un cronómetro.

6.Se registra el retroceso de la columna de agua en la pipeta en función del tiempo hasta que ésta no varíe más.

7.El tiempo para llegar al valor de equilibrio puede variar entre 5 min y 2 horas, dependiendo del tipo de proteína y granulometría de la muestra,

Curvas de Absorción de AguaLa cantidad de agua absorbida (q) a cada tiempo se expresa como mL de agua/g masa seca (MS) y se grafica en función del tiempo.WIC (water imbibing capacity): cantidad de agua absorbida/ g MS a tiempos largos.Otro parámetro:t1/2: tiempo necesario para alcanzar la mitad de la máxima capacidad de absorción, es decir, WIC/2 (min).A partir de estos datos:

tt

tWIC

1/2 q

1/2 tWIC

1 k Cte específica de velocidad de absorción

Proteínas de harina de trigo de distintos cultivares

Efectos ambientales: pH T Otros solutos

Proteínas muy solubles

No se puede definir un WIC

Capacidad de Retención de agua (WHC):

Capacidad de un material hidratado para retener el agua frente a la acción de una fuerza externa (de gravedad, centrífuga o de compresión)

Se determina bajo la acción de una fuerza centrífuga. Su valor depende de: condiciones de centrifugación (rev/min), tiempo y temperatura.

Método: se prepara una suspensión 10-20% p/v de la muestra en agua destilada. Se agitó cada 10 minutos con vortex durante una hora. Posteriormente se separó el sobrenadante del precipitado por medio de centrifugación durante 20 minutos a 20°C. Se determina la masa del precipitado y se cuantificó la concentración de proteínas por Bradford en el sobrenadante (m3).

W2= agua contenida en el residuoW1= se calcula como diferencia e/ agua agregada y W2

inicial agua g

agua g x100WW

W

21

2HW

Solubilidad: se forman soluciones coloidales, finas partículas de sólidos, constituidas por grupos de moléculas contenidas en un líquido.

El equilibrio en la soluciones coloidales puede romperse por:• cambios de pH• Tratamientos enzimáticos• Calentamiento

Las proteínas coagulan, floculan o forman una estructura de gel.

Solubilidad: cantidad de proteína que se disuelve en una determinada cantidad de solvente luego del proceso de solubilización. Procesos:

• Separación de las moléculas del disolvente•Separación de moléculas de proteína• Dispersión de moléculas del disolvente para favorecer la máxima interacción.

Determinación de la Solubilidad: Método del dispersado lentoSe expresa como:1.N2 soluble en agua o índice de Nitrógeno soluble (NSI %)2.Proteína soluble en agua o índice de Proteína soluble (PSI %)

Procedimiento:• Trituración • Tamizado (95 % de la muestra, 100 mesh)• Dispersado en baño termostatizado, 30 °C , 120 rpm,120 min• Alícuota y centrifugado• Filtrado del sobrenadante• Alícuota y determinación de la conc de proteína por el método de Kjeldahl.

Determinación del N2 proteico y/o proteína:La elección del método depende de:• cantidad de proteína disponible• concentración de proteína• posibles interferencias• especifidad del ensayo•Facilidad, confiabilidad, exactitud y precisión del método

Clasificación:• Destructuvos: método de kjeldahl.• No destructivos:

Físicos:o Espectrofotometría UV (A280, A205)o Espectrofotometría por flourescenciao Turbidimetríao Espectroscopía IR

Químicoso Biuret (A540- 560)o Lowry (A745-750)o Bradford (A595)

Método de KjeldahlSe evalúa el contenido de Nitrógeno, en una proteína éste varía de acuerdo al origen de la misma entre 15 % y 18 % , tomándose como un valor promedio 16 %.

METODO KJELDAHL Consta de tres etapas:Digestión: conversión del Nitrógeno (proveniente de las proteínas, por ejemplo) en ion amonio con SO4H2.Destilación: separación por arrastre con vapor del amoníaco y posterior solubilización en una solución ácida de concentración conocida.Valoración: medición de la cantidad de ácido neutralizado por el amoníaco disuelto, lo que indica la cantidad de Nitrógeno presente en la muestra inicial. Digestion (1) n - C -NH2 + mH2SO4 catalizadores CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 proteína calor

Neutralización y destilación(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O (3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) NH4 + H2BO3

- (ión borato) TitulaciónEl anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl estandarizado: (4) H2BO3

- + H+ H3BO3

CALCULOS%P = ( V -- VB ). 14.007 . N . F 100/M donde:%P: porcentaje de proteínas en la muestra, V: volumen de ácido consumido durante la valoración de la muestra, (mililitros)VB: volumen de ácido consumido durante la valoración del blanco, (mililitros)N: Normalidad del ácido titulanteM: masa de la muestra (gramos)F: Factor de proteína, acorde al origen de la muestra gelatina (5,55) leche, (6,30),Carne bovina (6,25), pescado (6,25), aceite vegetal (5,40), maíz (6,25)

Espectrometría UVSe basa en la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV

LEY DE LAMBERT-BEER

la ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos Io y Is, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida. Considérese un rayo de energía radiante con una intensidad inicial Io que se hace pasar a través de una celda de vidrio cuadrada contiendo una solución homogénea de una sustancia que absorbe luz de cierta longitud de onda. La intensidad de la energía radiante transmitida Is es menor a la intensidad inicial Io. debido precisamente a que la solución fue capaz de absorber cierta cantidad de energía radiante.

METODO UVMETODO UV

LAS PROTEÍNAS MUESTRAN UN FUERTE GRADO DE LAS PROTEÍNAS MUESTRAN UN FUERTE GRADO DE ABSORCIÓN A 280nm EN UV, PRINCIPALMENTE POR LOS ABSORCIÓN A 280nm EN UV, PRINCIPALMENTE POR LOS RESIDUOS DE TRIPTOFANO Y LA TIROSINA. YA QUE LAS RESIDUOS DE TRIPTOFANO Y LA TIROSINA. YA QUE LAS CONCENTRACIONES DE ESTOS AMINOÁCIDOS EN LAS CONCENTRACIONES DE ESTOS AMINOÁCIDOS EN LAS PROTEÍNAS ES FRANCAMENTE CONSTANTE SE PUEDE PROTEÍNAS ES FRANCAMENTE CONSTANTE SE PUEDE UTILIZAR LA ABSORBANCIA A 280nm PARA ESTIMAR LA UTILIZAR LA ABSORBANCIA A 280nm PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNASCONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

C= A/EC= A/E280280 l l

VENTAJASVENTAJAS

•MÉTODO RÁPIDO Y RELATIVAMENTE SENSIBLE (VARIAS VECES MÉTODO RÁPIDO Y RELATIVAMENTE SENSIBLE (VARIAS VECES MÁS SENSIBLE QUE EL MÉTODO DE BIURET)MÁS SENSIBLE QUE EL MÉTODO DE BIURET)

•NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO Y OTRAS NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO Y OTRAS SALES BUFFERSALES BUFFER

•MÉTODO NO DESTRUCTIVOMÉTODO NO DESTRUCTIVO

DESVENTAJASDESVENTAJAS

•LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TAMBIÉN ABSORBEN EN LA LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TAMBIÉN ABSORBEN EN LA REGIÓN DE 280nm REGIÓN DE 280nm

•EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS DIFIERE EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS DIFIERE CONSIDERABLEMENTE EN VARIAS PROTEÍNAS.CONSIDERABLEMENTE EN VARIAS PROTEÍNAS.

•LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E INCOLORA. LA LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E INCOLORA. LA TURBIDEZ PUEDE PRODUCIR RESULTADOS ERRÁTICOSTURBIDEZ PUEDE PRODUCIR RESULTADOS ERRÁTICOS

•SE REQUIERE UN SISTEMA RELATIVAMENTE PURO PARA SE REQUIERE UN SISTEMA RELATIVAMENTE PURO PARA UTILIZAR ESTE MÉTODOUTILIZAR ESTE MÉTODO

MÉTODO DE BIURET

El reactivo de Biuret se compone de hidróxido de sodio y sulfato de cobre (solución alcalina fuerte), el grupo amino de las proteínas reacciona con los iones del cobre del reactivo dando el color púrpura, la cantidad del color producido es proporcional al número de enlaces peptídicos, y por lo tanto a la cantidad de proteína. METODO

1. 5 mL DE REACTIVO DE BIURET SE MEZCLA CON 1mL DE SOLUCIÓN PROTÉICA (1-10 mg DE PROTEÍNA/mL).

2. DESPUÉS DE REPOSO A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 15 A 30 MINUTOS, SE LEE LA ABSORBANCIA A 540nm CONTRA UN BLANCO CON SÓLO REACTIVO.

3. SE DEBE ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR DE CONCENTRACIÓN VS ABSORBANCIA UTILIZANDO ALBÚMINA DE SUERO DE BOVINO (BSA) PARA COMPARACIÓN CON LA MUESTRA BAJO ESTUDIO

VENTAJAS:

RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30 MINUTOS)

ES EL MÉTODO MÁS SIMPLE DE ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

NO ES FRECUENTE ENCONTRAR DERIVACIONES DE COLOR

POCAS SUBSTANCIAS NO PROTÉICAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN DE BIURET

NO DETECTA N2 DE FUENTES NO PROTÉICAS O NO PEPTÍDICAS

DESVENTAJAS:DESVENTAJAS:

NO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MÉTODO DE LOWRYNO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MÉTODO DE LOWRY

REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTEÍNA POR PRUEBAREQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTEÍNA POR PRUEBA

LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE AMONIO LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN INTERFIEREN CON LA REACCIÓN

DEBE ESTANDARIZARSE EL COLOR MEDIANTE CANTIDADES DE DEBE ESTANDARIZARSE EL COLOR MEDIANTE CANTIDADES DE PROTEÍNA CONOCIDASPROTEÍNA CONOCIDAS

MÉTODO DE LOWRY

El método de Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se le añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer.1) Los iones Cu2+, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+ proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción.

2) Se lleva acabo la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

VENTAJAS

•MUY SENSIBLEMUY SENSIBLE

•MENOS AFECTADO POR LA TURBIDEZ DE LA MUESTRAMENOS AFECTADO POR LA TURBIDEZ DE LA MUESTRA

•MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA DE LOS OTROS MÉTODOSMÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA DE LOS OTROS MÉTODOS

•RELATIVAMENTE SIMPLERELATIVAMENTE SIMPLE

•SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 HORASSE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 HORAS

DESVENTAJAS•EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS QUE EL EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS QUE EL MÉTODO DE BIURET)MÉTODO DE BIURET)

•EL COLOR NO ES ESTRICTAMENTE PROPORCIONAL A LA EL COLOR NO ES ESTRICTAMENTE PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNASCONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

•LA SACAROSA, LÍPIDOS, BUFFERS FOSFATO, MONOSACÁRIDOS Y LA SACAROSA, LÍPIDOS, BUFFERS FOSFATO, MONOSACÁRIDOS Y HEXOAMINAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓNHEXOAMINAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN

•LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES, LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES, SULFATO DE AMONIO Y COMPUESTOS CON SULFIDRILO SULFATO DE AMONIO Y COMPUESTOS CON SULFIDRILO INTERFIEREN CON LA REACCION.INTERFIEREN CON LA REACCION.

MÉTODO DE BRADFORD

EL AZÚL BRILLANTE G-250 COOMASSIE SE ADHIERE A LA PROTEÍNA, EL EL AZÚL BRILLANTE G-250 COOMASSIE SE ADHIERE A LA PROTEÍNA, EL

COLORANTE SE TORNA DE ROJIZO A AZULADO Y EL MÁXIMO DE COLORANTE SE TORNA DE ROJIZO A AZULADO Y EL MÁXIMO DE

ABSORCIÓN DEL COLORANTE CAMBIA DE 465 A 595nm. EL CAMBIO EN ABSORCIÓN DEL COLORANTE CAMBIA DE 465 A 595nm. EL CAMBIO EN

LA ABSORBANCIA A 595nm ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE LA ABSORBANCIA A 595nm ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE

PROTEÍNA EN LA MUESTRA.PROTEÍNA EN LA MUESTRA.

VENTAJAS

• MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN SE PUEDE COMPLETAR EN 2 MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN SE PUEDE COMPLETAR EN 2 MINUTOS)MINUTOS)

• REPRODUCIBLEREPRODUCIBLE

• SENSIBLE (MUCHO MÁS QUE EL MÉTODO DE LOWRY)SENSIBLE (MUCHO MÁS QUE EL MÉTODO DE LOWRY)

• NO EXISTE INTERFERENCIA DE CATIONES COMO K+, Na+, Y NO EXISTE INTERFERENCIA DE CATIONES COMO K+, Na+, Y Mg+Mg+

DESVENTAJASDESVENTAJAS

•EL COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE FORMADO PUEDE UNIRSE A EL COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE FORMADO PUEDE UNIRSE A LAS CELDAS DE CUARZOLAS CELDAS DE CUARZO

•EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES TIPOS DE PROTEÍNAS. EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES TIPOS DE PROTEÍNAS.

•LA PROTEÍNA ESTÁNDAR DEBE SELECCIONARSE CON MUCHO LA PROTEÍNA ESTÁNDAR DEBE SELECCIONARSE CON MUCHO CUIDADOCUIDADO

•INTERFERENCIA CON DETERGENTES.INTERFERENCIA CON DETERGENTES.