metodos inmunologicos
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INTEGRANTES:
•Arbildo Bailon Yoseli.
•Baca Chavez Janai.
•Galiano Mejia Deisy.
•Perez Cotrina Javier.
•Yauce Ormeño Eliana.
DOCENTE: Msc. R. Diomedes Camones Maldonado.
Es una técnica deinmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune.
La prueba de ELISA se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad conocida.
El color se genera por la interacción de un sustrato cromogénico y una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector.
Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antígeno en la fase sólida, como una capa de captura.
Después de la reacción del antígeno con el suero del paciente, la capa de detección puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase específica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase específicos
Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimática se dividen en dos tipos:
:
En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color
Dentro de los no competitivos tenemos:
Los directos que detectan antígenos
Los indirectos que detectan anticuerpos.
Consta de las siguientes etapas:
•Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
•Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
•Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los
anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
Pasos generales de un ELISA
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o
anticuerpos3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o
antígeno tapizado en el posillo.4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o
antígeno no unido5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida8. Adición del sustrato9. Unión del sustrato a la enzima10. Desarrollo del color
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas,
como un extracto tisular).
El western blot es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas basada en la capacidad de unión a anticuerpos específicos. Luego
de separar las proteínas en un gel de SDS-poliacrilamida(SDS-PAGE), las bandas de proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa
(electro transferencia), las bandas individuales de proteína (proteína de interés) se identifican al inundar la membrana de nitrocelulosa con
anticuerpo policlonal o monoclonal radio marcado o unido a enzimas específicas para la proteína de interés.
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de
un cultivo celular:
Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un buffer de
extracción. Después se procede a homogeneizarlos, sea con
una licuadora (para grandes volúmenes de muestra), con un
homogenizador (para muestras pequeñas) o por sonicación.
Por último se centrifuga para obtener las proteínas en el
sobrenadante, la fracción no precipitada.
Las células pueden lisarse por uno de esos métodos
mecánicos. También pueden
usarse detergentes,sales o tampones que favorezcan la lisis
y solubilicen las proteínas. A veces se
añaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la
digestión por las enzimas celulares de las proteínas y de
las fosfoproteínas, respectivamente.
Las proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel
La electroforesis en gel más frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tampón con dodecilsulfato (SDS).
En esta técnica las proteínas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la pérdida de las estructuras secundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol (SH + SH)) y mantiene los polipéptidos en este estado desnaturalizado.
De este modo, la estructura tridimensional de las proteínas no influye en la electroforesis, y pueden separarse únicamente en función del tamaño.
Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción de un campo eléctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica (es decir, se adhieren a todas las proteínas con idéntica afinidad):
Las membranas de nitrocelulosa Las membranas de PVDF
Se ponen en contacto las superficies del gel electroforético y de la membrana y, sobre ésta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto pesado. Este montaje se coloca sobre un tampón, que ascenderá por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las proteínas. Al llegar a la membrana, quedarán retenidas en ella.
En esta técnica, se añade el poder de succión de una bomba conectada a un sistema de secado de planchas de gel, el cual lleva las proteínas desde el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa.
Se basa en una corriente eléctrica y un tampón de transferencia para llevar las proteínas desde el gel hacia la membrana.
Para ello, se apilan en el siguiente orden (del polo negativo o cátodo al positivo o ánodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, más papeles de filtro empapados y otra esponja.
Se aplica una corriente eléctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible, las proteínas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente de albúmina de suero bovino o ASB (más conocida por sus siglas en inglés, BSA), leche en polvo o caseína, con una diminuta fracción de detergente, como Tween 20 o Tritón X-100.
Las proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de la membrana que no estén ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo y los falsos positivos.
Se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína. Para ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica (produce color). De esta forma, se hace patente la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.
El primer paso es permitir la unión de un anticuerpo primario contra la proteína buscada. Éste se consigue inoculando dicha proteína o uno de sus epítopos (regiones capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o una cabra) o a un cultivo celular.
Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario. Éste reconoce de forma específica una región concreta del anticuerpo primario.Varios de estos anticuerpos se unirán a cada anticuerpo primario, amplificando la señal.
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detección de aquellas que sí se han unido a la proteína de interés.
Depende de la incubación del Western blot con un sustrato que reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al anticuerpo secundario.
La detección quimioluminiscente requieren la incubación de la membrana con un sustrato, que emitirá luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el anticuerpo secundario.
La luz emitida es captada por una película fotográfica o, más recientemente, por cámaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se analiza la imagen por densitometría para evaluar la cantidad relativa de mancha y cuantifica el resultado en términos de densidad óptica.
se coloca una película fotográfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador provoca la aparición en ella de regiones oscuras. Éstas se corresponderán con las bandas de las proteínas de interés.
Se procede a la excitación lumínica de éstos que les provoca una excitación. Ésta es detectable por un fotosensor, como una cámara CCD equipado con los filtros de emisión apropiados. Se consigue así una imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso molecular o la cuantificación proteica.
El Western blot es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular.
• Prueba de VIH• Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme
bovina, comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".• Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme
usan el Western blot.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASATécnica que nos permite amplificar selectivamente un segmento específico deDNA, hasta obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulación
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural delos ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para locual se emplean ciclos de altas ybajas temperaturas alternadas para separar las hebras deADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación.
DESNATURALIZACION DEL ADN DOBLE CADENA:
la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.
HIBRIDACIÓN DE LOS INICIADORES A LA ZONA 3´ESPECÍFICA DE CADA UNA DE LAS HEBRAS
los cebadores se unen a las zonas 3´complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65º C)
EXTENSIÓN DEL CEBADOR POR ACTUACIÓN DE LA DNA POLIMERASA
Se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde.
Secuenciación:
Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciación. Es mucho mas sencillo y rapido que la clonación en células.
Estudios evolutivos:
Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos.El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano.
Huellas dactilares del ADN:
La determinación de las huellas dactilares genéticas constituye una de las aplicaciones mas interesantes de la PCR.Mediante esta técnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones
1. Lugar físico exclusivo para realizar la PCR2. Uso de instrumental exclusivo para la PCR3. Utilización de reactivos y tubos estériles4. Uso de guantes por el manipulador
Se desarrollan líneas de investigación en enfermedades infecciosas y no infecciosas de impacto en salud pública, determinando características epidemiológicas y prevalencia de enfermedades virales: herpes-virus, citomegalovirus, hepatitis, rubéola, dengue, VIH/SIDA y otras ITS, HTLV I/II y parasitarias: toxoplasmosis, leishmaniasis, enfermedad de Chagas. En cuanto a las enfermedades no infecciosas se estudian enfermedades autoinmunes, Enfermedad Celiaca e inmunodeficiencias primarias.
Los marcadores tumorales (MT) son sustancias biológicas o bioquímicas
que aparecen como respuesta del organismo ante cierto tipo de tumores, se
detectan en el torrente sanguíneo y reflejan su crecimiento y actividad.
Constituyen una herramienta útil sobre todo para el seguimiento, evolución
y control del tumor, así como para el diagnóstico precoz de sus recidivas.
Estas sustancias pueden encontrarse en la sangre, en la orina, en la materia
fecal, en tejido de tumores o en otros tejidos o líquidos del cuerpo de
algunos pacientes con cáncer. La mayoría de los marcadores de tumores son
proteínas. Sin embargo, más recientemente, los patrones de expresión de los
genes y los cambios de ADN han empezado a usarse como marcadores de
tumores. Los marcadores del segundo tipo se evalúan específicamente en el
tejido tumoral.
Los marcadores de tumores se usan para ayudar a detectar, a
diagnosticar y a controlar algunos tipos de cáncer. Aunque una
concentración elevada de un marcador de tumores puede
sugerir la presencia de cáncer, este hecho solo no es suficiente
para diagnosticar cáncer. Por lo tanto, las mediciones de los
marcadores tumorales se combinan en general con otras
pruebas, como con biopsias, para diagnosticar el cáncer.
Un doctor toma una muestra de tejido del tumor o de líquido del cuerpo y lo envía a un laboratorio, en donde se usan varios métodos para medir la concentración del marcador de tumores.
Si el marcador de tumores se usa para determinar si el tratamiento está funcionando o si hay una recurrencia, la concentración se medirá en muchas muestras tomadas en un período de tiempo. En general, estas mediciones "en serie", que indican que la concentración de un marcador está en aumento, que está igual, o que está disminuyendo, son más importantes que una sola medición.
Tipos de Marcadores Tumorales
Varios marcadores de tumores se usan actualmente para una amplia gama de tipos de cáncer.
Alfa-fetoproteína (AFP) La alfafetoproteína (AFP, siglas en inglés) puede ser útil para diagnosticar y
guiar el tratamiento contra el cáncer de hígado (carcinoma hepatocelular). Los niveles normales de AFP generalmente son menores a 10 ng/ml; Los niveles de AFP a menudo son altos en los pacientes con cáncer de hígado. La AFP también es elevada en hepatitis aguda y crónica, pero rara vez es superior a 100 ng/ml en estas enfermedades.
En alguien con un tumor en el hígado, un nivel de AFP mayor a cierta cantidad puede significar que la persona tiene cáncer. En personas sin problemas en el hígado, el valor es de 400 ng/ml. Sin embargo, una persona con hepatitis crónica a menudo presenta niveles elevados de AFP. Para estas personas, un nivel de AFP por encima de 4,000 ng/mL indica una señal de cáncer de hígado.
La AFP también es útil para dar seguimiento de la repuesta al tratamiento contra el cáncer de hígado. Si el cáncer es extirpado completamente mediante cirugía, el nivel de AFP deberá bajar a niveles normales. Si el nivel vuelve a subir, a menudo indica que el cáncer ha regresado.
Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) Esta proteína, conocida también como HER1, es un receptor que se encuentra en
células que fomenta su crecimiento. Las pruebas realizadas en una muestra de tejido
canceroso pueden buscar si hay cantidades en aumento de estos receptores, lo cual
es una señal que puede que indique que el cáncer sea de rápido crecimiento y
propagación, al igual que más difícil de tratar. Los pacientes con un nivel elevado de
EGFR puede que tengan resultados menos favorables y requieran de un tratamiento
más agresivo, especialmente con medicamentos que bloqueen (o inhiban) los
receptores de EGFR.
El nivel de EGFR puede que se use para guiar el tratamiento y predecir el resultado
para el cáncer de células no pequeñas (cáncer no microcítico) de pulmón, así como
cáncer de cabeza, cuello, colon, páncreas o seno. Los resultados se reportan como un
porcentaje en función del número de las células sometidas a prueba.
Algunos cánceres de pulmón presentan ciertos defectos (mutaciones) en el gen
EGFR, lo cual los hace más propensos a responder a determinados medicamentos
contra el cáncer. Estos cambios genéticos son más comunes entre pacientes mujeres,
no fumadores o asiáticos con cáncer de pulmón.
Gonadotropina coriónica humana Los niveles sanguíneos de la gonadotrofina coriónica humana (también
conocida como HCG,) son elevados en pacientes con ciertos tipos de cáncer
testicular y ovárico , así como con neoplasia trofoblástica del embarazo,
principalmente el coriocarcinoma. También son elevados en algunas personas
con tumores de las células germinales mediastinales (cáncer en la parte media
del pecho: el mediastino) los cuales se originan a partir de las mismas células
que los tumores de las células germinales en testículos y ovarios. Los niveles de
HCG son útiles para diagnosticar estas afecciones y pueden ser observados
durante el tratamiento para comprobar su efectividad. También son útiles en
detectar la recurrencia de cáncer una vez que haya terminado el tratamiento.
En ciertas situaciones, un nivel elevado de HCG en la sangre indicará también
sospecha de cáncer; por ejemplo, un aumento de este marcador en una mujer
que sigue teniendo su útero dilatado después de que el embarazo haya concluido
podría ser un signo de cáncer. Esto aplica también para los hombres con un
testículo agrandado o con un tumor en el pecho.
Es difícil determinar el nivel normal de HCG debido a que hay distintas formas
para someter este marcador a prueba y cada una tiene su propio rango de valores
normales.
Lactato deshidrogenasa La lactato deshidrogenasa (LDH, siglas en inglés) se usa como un marcador tumoral
para el cáncer testicular y otros tumores de las células germinales. No es tan útil
como la AFP y la HCG para el diagnóstico debido a que se eleva por muchas otras
razones además del cáncer, incluyendo afecciones de la sangre y el hígado. No
obstante, los altos niveles de LDH predicen un pronóstico de supervivencia menos
favorable. Los niveles de LDH también se usan para monitorear el efecto del
tratamiento y ver si hay recurrencia de la enfermedad.
La LDH puede que se use para otros tipos de cáncer también, incluyendo linfoma,
melanoma y neuroblastoma.
Lactato deshidrogenasa La lactato deshidrogenasa (LDH, siglas en inglés) se usa como un marcador tumoral
para el cáncer testicular y otros tumores de las células germinales. No es tan útil
como la AFP y la HCG para el diagnóstico debido a que se eleva por muchas otras
razones además del cáncer, incluyendo afecciones de la sangre y el hígado. No
obstante, los altos niveles de LDH predicen un pronóstico de supervivencia menos
favorable. Los niveles de LDH también se usan para monitorear el efecto del
tratamiento y ver si hay recurrencia de la enfermedad.
La LDH puede que se use para otros tipos de cáncer también, incluyendo linfoma,
melanoma y neuroblastoma.
MARCADORES PARASITARIOS Parasitarias: toxoplasmosis, leishmaniasis, enfermedad de
Chagas.
MARCADORES VIRALES
Enfermedades virales: herpes-virus,
citomegalovirus, hepatitis, rubéola, dengue,
VIH/SIDA y otras.
Hepatitis Viral A
R.N.A del VHA: Se detecta en heces, suero e hígado.
Anti-HA IgM: Se eleva en sangre al mismo tiempo en que se presentan los síntomas y permanecen en suero durante 3-6 meses. Indica infección aguda o reciente.
Anti-HA IgG: Indica recuperación y estado de inmunidad
Hepatitis Viral B
HBs Ag: Se detecta en el periodo de incubación, fase aguda y crónica.
Anti-HBs: Indica recuperación o curación de la enfermedad, pacientes vacunados.
HBc Ag: Se detecta precozmente en tejido hepático
Anti-HBc IgM: Se detecta en la fase aguda cuando aparecen los primeros síntomas.
Anti-HBc IgG: Aparece 6-12 meses después de la recuperación.
HBe Ag: Indica replicación viral aguda y la sangre portadora es altamente infecciosa
Anti-HBe: En la fase aguda indica buena evolución y en la fase crónica escasa repli cación.
DNA VHB: Es el más específico
DNAp VHB: Indica infectividad y replicación viral.
Hepatitis Viral C
RNA VHC:
Anti HC: Aparece 2 a 17 semanas después de adquirida la infección aguda, su persistencia es indicador de infección crónica.
Anti-HC IgM: Infección aguda.
Anti-HC IgG: Indica estado de inmunidad.
HEPATITIS B Las técnicas serológicas actuales permiten detectar, en los pacientes
infectados, los antígenos del VHB y la respuesta de anticuerpos frente
dicha infección con distintos grados de sensibilidad y especificidad. Su
determinación cualitativa y cuantitativa nos permite realizar un
diagnóstico, establecer un pronóstico fiable de la infección, con o sin
tratamiento, y conocer la susceptibilidad de la población a la infección
por VHB (prevención).
HEPATITIS B
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-
protocolos.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Western_blot
http://www.slideshare.net/gabo91/western-blot-10328376
http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_po
limerasahttp://www.cancer.org/espanol/servicios/comocomprendersudiag
nostico/fragmentado/marcadores-tumorales-specific-markers
http://www.cancer.gov/espanol/recursos/hojas-informativas/deteccion-
diagnostico/marcadores-de-tumores
http://www.iics.una.py/?option=com_content&view=article&id=98&Itemid
=127
http://www.monografias.com/trabajos10/hepat/hepat.shtml