ColoracionesColoraciones

GRAM:Fundamento:

Preparar un extendido fino del material a colorear y dejar secar al aire.

Fijar al calor, pasando el preparado 3 o 4 veces dentro de la llama del mechero bunsen.

Cubrir el portaobjeto con cristal violeta durante 1 min. y lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.

Cubrir el portaobjeto con solución de lugol durante 1 a 2 min. y lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.

Sostener el porta-objetos entre el dedo pulgar e índice y decolorar con alcohol-acetona. (10 seg.) La decoloración es el paso más crítico del procedimiento de esta técnica. la tendencia a sobredecolorar hace que bacterias Gram positivas aparezcan Gram negativas.

Lavar inmediatamente el portaobjetos con agua corriente para remover el alcohol-acetona y frenar la decoloración. Eliminar el exceso de agua.

Cubrir el frotis con solución de fucsina o safranina durante 30 – 60 seg. Lavar con agua corriente.

Control: Gram positivo: Staphylococcus aureus Gram negativo: Escherchia coli

Reactivos:

- Solución 1: sol. madre de cristal violeta. Disolver 10 grs. de colorante en 100ml de alcohol 95%. Guardar en botella de vidrio durante un año.

- Solución de trabajo: filtrar 10 ml de la solución madre y agregar 40 ml de solución recién filtrada de oxalato de sodio al 1% o de H2O dest.

- Lugol: Disolver 25 gr de Iodo cristalino + 50 g IK + 500 ml H2O dest. Guardar botella color caramelo.

- Decolorante: Partes iguales de etanol 95% y acetona. Guardar frasco color caramelo a TA (temperatura ambiente).

- Contracolorante: a) Safranina: tomar 20 ml de solución de safranina al 2,5 % en etanol 95% y agregar 180 ml de

H2O dest.b) Fucsina básica: disolver 0,1 o o,2 g de fucsina básica en 100 ml de H2O dest. Guardar en

botella oscura durante un año.

GRAM WEIGERT

Recomendado para observar quistes de P.carinii.

Fijar con metanol tres minutos.

Cubrir con eosina amarilla durante 5 minutos.

Lavar con agua y añadir cristal violeta recién filtrado. Dejar 3 min.

Lavar con solución de Iodo y dejar con esta misma 5 minutos.

Lavar con agua, secar cuidadosamente con papel, tanto la parte superior como la inferior del porta-objetos y dejar secar al aire.

Decolorar con anilina- xileno hasta que no desprenda más color púrpura ( el extendido debe quedar color rosado ).

Enjuagar con xileno, secar al aire y observar con inmersión.

Los quistes de P. Carinii y hongos se tiñen de azul oscuro e irregularmnete. Los núcleos celulares pueden teñirse de azul si no están bien decolorados, pero no son tan oscuros como los quistes de P. Carinii.

Reactivos:

- Eosina: Disolver 1g de eosina amarilla en 100 ml de agua dest.- Cristal violeta: mezclar soloc. A y B . Filtrar antes de usar. Estable por tres meses.- Solución A: mezclar 2 ml de anilina con 88 ml de agua dest. Filtrar- Solución B: disolver 5 g de cristal violeta en 10 ml de etanol al 95%.- Solución de Iodo: 2g de IK + pequeña cantidad de agua dest. Agregar 1 g de iodo y llevar a 300

ml con agua dest.- Anilina-xileno: mezclar partes iguales de los 2 reactivos.

ZIEHL NEELSEN

Fijar el extendido por calor Cubrir el preparado con sol. de fucsina y calentar el preparado hasta desprendimiento de humos

blancos, durante 5 min. Agregar agua si el preparado comienza a desecarse. Lavar con agua y decolorar con alcohol ácido . Lavar con agua y contracolorear con azul de metileno durante 1 min. Lavar y secar al aire. Mirar a 100x.

Reactivos:

- Fucsina: a) Disolver 3g de fucsina en 10 ml al 95%b) Disolver 5g de fenol cristalizado en 100 ml .c) Mezclar 10 ml de soluc. A con 90 ml de soluc. B y guardar a temp. ambiente durante

3 meses.- Alcohol ácido: 3ml de HCL + 97 ml de “ ol “ al 95%.- Azul de metileno: 0,3g de azul de metileno + 100 ml agua dest.

TINTA CHINA

Mezclar una gota de LCR con una gota de tinta china (Pelikan) o nigrosina, sobre un portaobjetos. Si la tinta china está muy concentrada diluir con agua destilada.

Colocar un cubreobjetos y observar antes que se seque con objetivo de 40 o 100x.

Permite observar con claridad microorganismos rodeados de cápsula ( por ej. C. Neoformans ).

KINYOUN

Fijar los extendidos con metanol.

Cubrir con carbolfucsina durante 5 min. + calor hasta vapores blancos una vez.

Lavar con agua. Decolorar con H2SO4 5% 30 – 60 segundos.

Lavar con agua. Escurrir. Agregar azul de metileno 3 min.

Lavar secar. Observar a 100x.

Permite observar Cryptosporidium parvum e Isospora belli ( color rojo a rosado ).

Reactivos

- Solución A: 0,3 g de fucsina + 10 ml de etanol al 95%

- Solución B: 5g de fenol + 100 ml de agua dest. Calentar hasta disolución.

- Mezclar A y B. Conservar a temp amb. Estable 1 año.

- Decolorante: 5 ml H2SO4 (c) + 95 ml de agua destilada

- Azul de metileno: 0,3g de azul de metileno + 100 ml de agua dest.

Infecciones de vías aéreasInfecciones de vías aéreas superioressuperiores

FARINGITIS:

Agentes etiológicos de faringitis aguda

VIRUS Rinovirus, Coronavirus,Adenovirus, Herpes 1 y2, Parainfluenza, Influenza, Coxackie A, Esptein Barr, Citomegalovirus

40 – 50 %

BACTERIASStreptococcus pyogenes

Streptococcus Grupo C y G

Anareobios ( Angina de Vincent, abscesos periamigdalinos )

Neisseria gonorrhoeae

Corinebacterium diphteriae y ulcerans

Arcanobacterium haemolyticum

Yersinia enterocolítica

Treponema pallidum

Clhamydia pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma hominis

15 – 30 %

5 – 10 %

< 1 %

< 1 %

< 1 %

< 1 %

< 1 %

< 1 %

desconocido

< 1 %

desconocido

AGENTES DESCONOCIDOS

15 – 30 %

DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO

1) Método de referencia:

Cultivo de Exudado Faríngeo

2) Toma de muestra:

Tratamiento previo del paciente por lo tanto los pacientes pretratados con ATB adecuados para faringitis estreptocococica no deberían ser cultivados, pues esto no tendría costo / efectividad positiva

Se coloca la cabeza del paciente en hiperextensión y se iluminan las fauces en forma conveniente.

Con hisopo estéril se frotan ambas amígdalas (o ambos pilares en pacientes amigdalectomisados). Si existiera exudado visible se debería tratar de tocarlo con la punta del hisopo. Se debe evitar el contacto del hisopo con el paladar y la lengua, por ello se debe utilizar un baja lengua (los microorganismos presentes en la saliva, lengua o paladar puede ejercer inhibición competitiva en los medios de cultivos ).

El hisopo se coloca en un tubo de cultivo seco o con gotas de solución fisiológica o en medio de transporte (Stuart, Cary Blair, etc.) y se lo conserva a temperatura ambiente.

3) Medios de cultivo:

Agar sangre ovina 5% (agar base columbia o TSA) Medio de cultivo selectivo:Agar sangre + colistina + Ac. Nalidixico (no se probo tener costo

beneficio positivo)

4) Siembra: Se utiliza una placa entera de agar sangre (aunque si la siembra se efectúa con cuidado, es posible

emplear solo media placa) Se frota el hisopo en una superficie en 1/8 de placa cercana al borde y con el ansa se disemina por

todo la placa con 3 o 4 estrías cruzadas. Luego se hunde el ansa en el agar efectuando 2 o 3 estrías oblicuas. (Para resaltar la hemólisis de

las capas de S. Pyogenes de estreptolisinas “O” lábil al oxigeno. La estreptolisina “S” es estable frente al oxigeno pero no todas las capas la producen).

Esquema de Siembra: HI SOPO

Solo se realiza coloración de GRAM cuando existe sospecha clínica de:

- Difteria- Candidiasis orofaríngea- Angina de Vincent (Asociación fuso-espirilar) GRAM positivos

ANSA

ESTRIAS

Fusobacterias anaerobias ( Fusobacterium spp )

Espiroquetas ( Borrelia spp )

5) Condiciones de incubación:

- Atmósfera normal y Tº no mayor de 37º C. Debe prolongarse hasta las 48 hs, si a las 24 hs las placas no muestran la presencia de colonias de Estreptococos Beta Hemolíticos.

6) Resultados del cultivo

A) CARACTERISTICAS CULTURALES

Colonias atípicas:- Puntuales: generalmente no son grupo “A”,

sino grupo “ milleri “, que aglutinan con antisuero para grupo A.

- Variantes nutricionales- Colonias con defecto en la producción de hemólisis

(son muy raras las grupo A no hemolíticas).

B) IDENTIFICACION DE S. PYOGENES

Colonias B- hemolíticas

Identificación de Streptococcus Beta Hemolíticos.

SEROGRUPO ESPECIE BAC PYR VP

A S. pyogenes S + -S. grupo milleri R(s) - +

B S. agalactiae R - +

C S. dysgalactiae ss. equisímilis R(s) - -S. equi ss equi R(s) - -

S. equi ss zooepidémicus R(s) - -S. grupo milleri R(s) - +

G S. dysgalatiae ss equisímilis R(s) - -S. grupo milleri R(s) - +

Colonias típicas:Circulares de bordes enteros. El tamaño de la zona de hemólisis es de 2 a 4 veces el diámetro de la colonia.

Coloración de GRAM: Cocos Gram + Catalasa: Negativa. Bacitracina: Sensible PYR: Positiva

F S. grupo milleri R(s) - +

No agrupables S. grupo milleri R(s) - + Prueba de la Bacitracina

- Disco de Bac 0,04 U- Placa de AS

a) Con las colonias B-hemolíticas aisladas del cultivo primario se efectúan estrías superpuestas en tres sentidos cubriendo una superficie de ¼ placa y en el centro se coloca el disco de Bacitracina ó se sacan dos colonias Beta hemolíticas y se estrían cada una en sentido opuesto y se coloca en el medio el disco de Bac (b).

Esquema:

Luego de 18 – 24 hs. de incubación se observa la formación o no de un halo de inhibición alrededor del disco.

Resultados:

Halo de inhibición (cualquier diámetro): Positivo

Ausencia de halo de inhibición : Negativo

La sensibilidad de la prueba es de aproximadamente del 100 %.La especificidad no es tan buena debido a que algunas cepas del grupo O, G y F pueden dar positivas (15,4 %) aún con el punto de corte de 15 mm.

Prueba del Pyr

S. pyogenes posee la enzima “ L- piroglutamilaminopeptidasa” que hidroliza sustratos con función amida formando B-naftilamina libre. Este compuesto al combinarse con N,N dimetilaminocina maldehido forma un producto de color rojo:

a) b)

Bac 0.04 U

30 a 35ºCAgrego una de gota revelador

Disco incoloro: Negativo

Disco rojo: Positivo

50 ul de SF ( suspensión densa )

Identificación de Estreptococos C y G

Se deben distinguir entre Estreptococos de los grupos C y G de colonia grande de otros que presentan colonias puntuales con halos de hemólisis 5 o más veces mayor que su diámetro que son Estreptococos grupo “ milleri “ que forman parte de los Estreptococos grupo “ viridans “ los cuales no producen faringitis, a diferencia de los grupo C y G de colonias grandes que si son patógenos primarios de faringitis y además pueden también producir glomerulonefritis post– faringea y aumentar los títulos de anticuerpos antiestreptolisina “ O “.

STREPTOCOCCUS GRUPO C ( colonias grandes )

ESPECIE Y SUBESPECIE TREHALOSA SORBITOLS. dyisgalactiae ss equisímilis + -

S. equi ss equi - -

S. equi ss zooepidémicus - +

Sensibilidad a los ATB en S.pyogenes

- Aún no se ha detectado resistencia a Penicilina ni a cefalosporinas de tercera generación, pero sí cepas tolerantes a Penicilina.

- La resistencia a TMS es casi universal.

- Ha aumentado el % a tetraciclinas

- La resistencia a Eritromicina ha presentado picos de importancia en determinados lugares en la década del 70, pero actualmente ha disminuido a cifras despreciables.

- Por ello para el caso de Ex. de fauces se recomienda una única prueba de sensibilidad por difusión en medio sólido con discos de eritromicina y clindamicina separados 2.5 cm para apreciar el antagonismo que genera cuando la resistencia a eritromicina es del tipo MLs inducible.

Disco PYR

Lavado BroncoalveolarLavado BroncoalveolarB.A.L.B.A.L.

Se utiliza en casos de Neumonía en pacientes ventilados.

Volumen de muestra:

Adulto: 100 – 200 ml en SFNiños: 5 – 10 ml SF

( 1º tubo ) ( 2º tubo )

10 ml (centrifugar 15 min a 2000 rpm Sembrar sin centrifugar

Sedimento Sobrenadante Ex fresco Ags solubles Tinta china Ex. químico Gram – Giemsa ZN – ZN modif. Kinyoun – Azul o- toloudina Sin diluir IFD – Ags bacterianos, fúngicos, Virales, parasit.

Cultivo - AS – ACH / CO2- EMB- CHAPMAN- HONGOS- L. JENSEN- STON.- OTRO CULTIVOS

Con lo que queda del tubo 2 :

- Centrifugar y hacer frotis: Gram, ZN, MGG, Directo

50 ul en AS, ACH, Y EMB o CLDE

½ placa en los 3 medios½ placa

Diluir 1/10 ( 100 ul en 1ml caldo o SF )Sembrar la otra mitad

Cálculos 0,05 ml ........ Rto col. 1 ml ............. x= 1 x Rto/0,05

Dilución 1/10:

Rto. Col x 1000 = UFC/ ml

NOTA: Se considera una muestra significativa cuando:

Recuento de células epiteliales escamosas < 1 %.

Útil documentar Rto PMN y su relación con macrófagos alveolares.

Células fagocíticas con bacterias en su interior es predictivo de neumonía.

CatéteresCatéteres

1) TECNICA SEMICUANTITATIVA DE MAKI

Rotar 4 veces 5 cm. De la punta del catéter sobre Agar sangre. Incubar a 37ºC 24-48hs a 72 hs ( 5-10% CO2 ). Hacer recuento e identificación de colonias.

Desventajas: - Solo evalúa los microorganismos adheridos a la parte externa del catéter.- Es difícil rotar un catéter si es curvo.- La contaminación de la piel afecta mucho.

2) TECNICAS CUANTITATIVAS

a) CLERI: Lavar 3 veces con aguja y jeringa el interior del catéter sumergido en caldo ( 2-10ml ) Hacer diluciones y sembrar un volumen determinado en Agar sangre

Punto de corte: 15 UFC

Punto de corte: > 1000 UFC/ml

Punto de Corte > 104 UFC / ml

b) LIÑARES:

Es una modificación de Cleri. Se lava la parte interna del catéter sin sumergirlo en el caldo o SF y luego se procesa según Maki.

c) BRUN- BUISSON:

Agitar la punta del catéter en 1 ml de caldo o SF ( 1 min. ). Hacer diluciones y sembrar un volumen definido

La adición de la técnica cuantitativa a la semicuanti. Permite aumentar la detección de bacteriemias asociadas a catéteres aproximadamente en un 13 % de casos.

El punto de corte está discutido y se dice que usar como punto de corte > 100 UFC/ml tiene buena sensibilidad y especificidad , especialmente para S.aurus y Cándida albicans.

CONSERVACION DE CATETERES

- Lo ideal es procesarlo de inmediato.

- Si no es factible puede colocarse en 1 ml de S.F a 4 ºC durante 24 – 48 hs. sin afectar los resultados.

RECOMENDACIONES FINALES

- Tomar como punto de corte para Maki > 15 UFC.

- No descartar como contaminantes recuentos de 100 – 1000 UFC/ml en Brun Buisson. Consultar con médico. Ver hemocultivo

- Cuando se aíslan levaduras jerarquizarlo sin importar recuento.

- No sembrar catéteres en caldo ( 25 – 50 % de falsos positivos ).

- Es convenientes sembrar las dos diluciones: 1/1000 ( B ) para cuantificar la mayoría de las infecciones y 50 ul del agitado sin diluir ( A ) para poder detectar recuentos entre 100 – 1000 UFC/ml.

- Lo ideal es hacer las 2 técnicas. Si no se puede ( por costo u otra causa ) hacer Maky y guardar el catéter en SF.

ESQUEMA TENTATIVO

Punto de corte: > 1000 UFC/mlNo bien definido todavía

1) Hacer Maki2) Introducir el mismo catéter en solución fisiológica y hacer Brun-Buisson.

A) 1ml SF estéril agitar en vortex 1 min.

Sem brar 50ul en Diluir 1/10 * Una placa de Agar Sembrar 10 ul ( dil final 1/100 ) Sangre. 24-48 hs En A.Sangre. 24-48hs. ( 5-10 % CO2 ) ( 5-10 % CO2 )

* Se puede hacer tomando 0.1 ml de ( A ) y colocarlo en 1 ml de SF estéril ( B ) y de allí sembrar 10 ul. 50 ul de A)

10 ul de B)

La siembra se puede hacer con espátula de Drigalski flameada a la llama previamente empapada en alcohol o en defecto con un tubo centrífuga ( con la colita ).

Cálculos: 50 ul..................... Nº de colonias

1000 ul X

X = Nº x 1000 : 50 = Nº de col x 20 = UFC / ml 0.001 ml ( diluc. final) ................ Nº colonias

1 ml X

X = Nºcol x 1000 = UFC / ml

HemocultivoHemocultivo

Preparación de la piel :

- Alcohol 70%- Yodo 2% - Solamente alcohol 70%- El tapón del frasco no debe limpiarse con yodo, solo con alcohol

Volumen de muestra : - Adultos 20- 30 ml (nunca menos de 10 ml)- Niños 1-5 ml- Neonatos 1-2 ml

El volumen de sangre tiene mayor importancia que otros parámetros lo más práctico es 10 ml por tubo. Relación sangre-medio: 1/5 a 1/10

Momento de la extracción:

Lo más rápido posible en el curso de un episodio febril, antes de cualquier tratamiento con antibióticos.

Cantidad de muestras :

Por lo menos 2 muestras de 10 ml c/u cada 20 a 30 min.

Procesamiento por el método convencional:

- Los frascos deben estar rotulados perfectamente.

- Ventilar uno de ellos para apresurar el desarrollo de Pseudomonas spp. y Cándida spp.

- Incubar los frascos hasta 7 días a 35-37 ºC observándolos diariamente (En este período se recuperan mas del 95 % de las bacterias significativas).

- En pacientes pediátricos hacer repique a ciegas a los 6-12hs.

- En pacientes adultos los repiques a ciegas se realizan cada 24-48 hs.

- El subcultivo se realiza preferentemente en Agar chocolate 72hs al 5-10% de CO2.

- Hacer GRAM y si se puede sembrar de acuerdo a lo observado:Ej. Agar sangre, si se ven estreptococos o cocos GRAM positivos. CLDE, si se ven Bacilos GRAM negativos etc.

En la página siguiente se muestra un esquema tentativo.

ESQUEMA TENTATIVO

Hemocultivo

Observación Microscópica

( + ) ( -- )

1) GRAM 1) Naranja de acridina 2) Subcultivo en medios apropiados 2) Subcultivo a ciegas en 3) Antibiograma tentativo Agar chocolate Observación diaria

Cultivo

( -- ) ( + ) ( + ) ( -- )

Anaerobios Subcultivo Medios p/fastidiosos terminal Mayor incubación 7º día

Tipificación y Antibiograma *

( * ) Antibiograma presuntivo: (luego del GRAM: monomicrobiana )

AGAR SANGRE y EMB o CLDE

Si se observan : Cocos GRAM positivos en racimos: OXA, TEICO, CIPRO ,RIFAM, TMS, GENTA

Cocos GRAM positivos en cadenas: AMN, AMS, VANCO, GENTA, ESTREPTO de alta carga, OXA, CLINDA, Bc y Op.

Bacilos GRAM negativos: CFX, CAZ, AMK, GEN, CIP, IMP, TAZO.

El AB debe confirmarse con las colonias aisladas del cultivo puro.

Atención al SCN: ha surgido como patógeno importante en pacientes hospitalizados y con dispositivos protésicos.

- 31% SCN en bacteriemias

- 67% en bacteriemias verdaderas

- 8% SCN en contaminaciones

- 60% son resistentes a OXA

...................................................................................

Diagnóstico MicológicoDiagnóstico Micológico

En micología la observación directa del hongo en el material tiene valor diagnóstico por si sola debida al carácter de patógeno primario del microorganismo: éste es el caso de los dermatofitos. Cuando desarrolla en cultivo un hongo saprófito o comensal, es necesario determinar su importancia clínica en base a las características del paciente. De esto surge la importancia de la observación de la lesión por parte del micólogo y de la buena toma de muestra para llegar a un buen resultado.

CLASIFICACION DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES

Las micosis superficiales se pueden dividir en dos grandes grupos: las queratomicosis o infecciones cutáneas producidas por especies que utilizan la queratina y las pilonodosis causadas por especies que crecen formando concreciones ( granos o nódulos ) sobre los pelos. Según los autores americanos se dividen en: superficiales, donde es invadida la superficie externa de la piel y no hay respuesta celular del huésped y las cutáneas, que involucran los tejidos queratinizados del cuerpo ( capa externa de la piel, pelos uy uñas

QUERATOMICOSIS PILONODOSIS (piedras )

DERMATOFITOSIS (tineas) DERAMATOMICOSIS(agente: dermatofitos) (agente: otros hongos )

Tinea capitis Pitiriasis versicolor Piedra blanca Tinea corporis Candidiasis intertriginosa Tinea negra Tinea criris Onicomicosis candidiásica Tinea pedis Tinea negra Tinea unguium Tinea barbae Tinea imbricata

RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

La calidad del diagnóstico de las micosis depende de las calidad y cantidad del material recogido del paciente, de las condiciones de envío, conservación, transporte y procesamiento y de la pericia del micólogo.Las muestras deben ser representativas, abundantes, libres de contaminantes exógenos o endógenos, y de sustancias que inhiban o alteren la viabilidad de los hongos.Para asegurar la calidad de la muestra no hay nada mejor que la toma de muestra la realice el micólogo, la inocule en los medios de cultivo, y la procese para la observación microscópica.Es conveniente recoger los espécimen en recipientes estériles irrompibles y tamaño adecuado y conservarlas a temperatura ambiente. Indicaciones previas al paciente:

- Suspender la medicación antifúngica interna y/o externa durante un lapso no inferior a las 72 horas antes de efectuar la toma de muestra; de igual modo se suspende el uso de pomadas, talcos,

tinturas u otras sustancias que enmascaren la presencia, inhiban o alteren la viabilidad de los hongos.

- Lavar la superficie afectada con agua y jabón blanco no perfumado tres veces por día durante tres días previos a la toma de muestra.

- Las uñas deben higienizarse además con un cepillo blando y no deben estar pintadas.

• Preparación del sitio para la toma de muestras:

- En el momento de la toma de muestra se desinfecta con alcohol 70º utilizando una gasa estéril. Si se sospecha una infección por levaduras desinfectar con solución fisiológica ya que estas pueden se susceptibles a la acción del alcohol.

- Materiales:a) cinta adhesiva transparenteb) bisturíc) pinza de depilard) placa de Petri estérile) porta-objetosf) diferentes tipos de ansag) agar Saboureaudh) agar Lacrimeli) agar DTM

Siempre es necesario tener tubos con medios de cultivo en lugar de la toma de muestra ya que a veces el material es escaso y en esos casos se recomienda realizar directamente la inoculación a los medios de cultivo.

• Métodos de obtención de muestras

a) Cinta adhesiva transparente: se aplica un fragmento de cinta de 10 cm sobre la lesión y se presiona raspando con el borde lateral de la uña, la superficie de la cinta que cubre la zona afectada para que se adhieran las escamas. La cinta se retira y se aplica sobre una lámina porta-objetos limpia, rebatiendo los extremos hacia abajo para que no se despegue. Es conveniente tomar dos o tres improntas y montarlas individuales

b) Raspado: se utiliza para todas las lesiones descamativas de la piel glabra ( sin pelo) en especial aquellas de gran tamaño. Para obtener el material se raspa el borde activo de la lesión con bisturí estéril . Cuando la lesión afecta los pliegues interdigitales el material se toma del borde de las lesiones, junto a la piel sana de los dedos o de la planta del pie, evitando las áreas maceradas; si la lesión afecta las uñas se raspa la cara profunda de la superficie afectada, próxima a la región sana de la uñas y el lecho subungueal ( se elidirán las zonas friables, de color anormal o hiperqueratósicas) Se debe recoger abundante cantidad de material.

c) Depilación: se utiliza en las lesiones de cuero cabelludo y otras áreas pilosas, y para recoger el vello de la piel cuando el folículo está inflamado (tinea corporis). La muestra se toma con pinza depilatoria estéril aplicada perpendicularmente a la superficie de la piel y siguiendo el sentido del pelo. Se deben extraer 20 pelos enfermos y las escamas circulantes.

• Transporte y conservación de muestras

Es preferible el transporte inmediato al laboratorio, pero no es imprescindible ya que los hongos que producen micosis superficiales pueden ser aislados de las muestras luego de varias semanas si el recipiente donde se han recolectado no tiene humedad.

EXAMEN MICOLOGICO

Examen microscópico directo

- Colocar una porción del material entre porta-objetos y cubreobjetos con KOH ( 10 – 40 % ) ó KOH en partes iguales con tinta Parker azul permanente ( sin hervir ) ó después de dejar durante toda la noche ( en cámara húmeda ). También se puede utilizar agua glicerinada, lo que permite observar los preparados hasta 72 hs sin que se alteren ni se sequen.

- Cuando e espécimen a examinar es una impronta tomada con cinta adhesiva por sospecha de pitiriasis, se coloca entre el portaobjetos y la cinta una gota de azul de metileno 1 %, dejar 10 minutos a temperatura ambiente

- Si se sospecha eritrasma, se deben digerir las escamas con KOH al 20 – 40 % durante toda la noche, luego se lavan las escamas 4 – 5 veces con agua destilada . Fijar con suero, hacer coloración de GRAM y Kinyoun. Se considera positiva cuando se observan filamentos finos y elementos cocoides irregularmente teñidos Gram positivos ó parcialmente ácido alcohol resistentes con Kinyoun.

Cultivos.

De rutina:

- DTM, Saboreaud y Lacrimel.........................25 – 28ºC durante 4 semanas con observación semanal.

- Medio de Bilis de Feo...................................25 – 28ºC durante 48 hs y hasta 5 días. Buscar levaduras.

- Saboureaud Sangre ó Agar Sangre( sospecha de eritrasma) ...........................37ºC durante 5 días en CO2. Para investigar Corynebacterium minutissimun (Nocardia ).

Identificación de cepas

- Dermatofitos : Los dermatofitos pueden ser identificados por sus formas características macro y microscópicas y el auxilio de unas pocas pruebas complementarias

- Levaduras: Cada laboratorio debe decidir respecto a la identificación se considera suficiente identificar Cándida albicans y derivar el resto de las cepas a Centros de Referencia.

Algoritmo para el Diagnóstico de Micosis Superficiales

SABOUREAUD – LACRIMEL – DTM ( 28ºC )

Recolección y Procesamiento de Recolección y Procesamiento de Muestras Fecales Muestras Fecales

Colonia vellosa, micelio negro, verde o marrón con o sin pigmento sin viraje en DTM.

Sospecha de oportunista, guardar la cepa reaislada y repetir el análisis sobre 2 muestras más.

Si se repite el aislamiento en tres muestras seriadas hacer disgregado con LF-AA. Identificación y caract. Macro y microscópicas.

Si la identificación no es exitosa derivar la cepa a laboratorio de referencia.

Colonia vellos, micelio blanco, amarillo o crema, con ó sin pigmento y viraje del DTM.

Sospecha de dermatofitoReasilamiento en Lacrimel.

Disgregado con LF-AA identificar por ssus caract macro y microscópicas.

Si la identificación no es exitosa: Colonia gigante Cultivo en lámina Crecimiento en granos

de arroz Perforación del pelo

in vitro Producción de ureasa

Colonia cremosa

Reaislamiento

Filamentación, producción de clamidósporas( medio de Feo )

( + ) ( - )

InformarC. albicans

Levadura No C.albicans

Todas las muestras de heces son una fuente potencial de infección por lo tanto deben ser manipuladas cuidadosamente por el operador teniendo en cuenta todas las precauciones de bioseguridad : guantes, gafas protectoras, contenedores para descartar el material; etc.

MUESTRA FRESCAS:

Deben ser remitidas inmediatamente en recipiente limpio y seco o en pañal; el examen directo debe realizarse lo más pronto posible después de la defecación, las amebas y los flagelados resisten varias horas si por algún motivo se demora en procesar las muestras se debe conservar las muestras en refrigerador para retrasar el crecimiento de hongos y bloquear la evolución de los huevos de los parásitos.

En heces líquidas se recomienda observar o preservar la muestra dentro de los 30 minutos luego de la evacuación.

En heces ligeras dentro de las 24 hs. pueden hallarse trofozoitos y quistes.

En heces formes dentro de las 24 hs. se pueden observar formas quísticas.

La recolección de heces frescas pueden ser realizadas con o sin previa administración de laxantes.

Las heces obtenidas sin laxantes permite juzgar el estado digestivo.Debe analizarse macro y microscópicamente.

Las heces obtenidas con purgantes salinas SO4 Na2 o SO4 Hg.La cantidad de Sulfato depende de la edad del enfermo y de su estado digestivo. El SO4 Na2 es menos irritante y mas colagogo que el So4 Hg. Se lo emplea a una dosis de 6 a 10 gr. para un adulto. Se puede dar una dosis de 5 gr. la noche anterior y 10 gr. la mañana del examen.

Importante : si el paciente tiene diarrea los purgantes salinos NO deben ser admitidos.En niños cuyo peso es menor de 14 Kg. Las purgas salinas NO deben ser tomadas.EL beneficio de trabajar con heces purgados es que dentro del tracto intestinal los purgantes hacen que las heces se transformen en liquidas esto induce la modulación de los parásitos, se puede observar muchas mas formas trofozoíticas móviles de ameba en materias fecales hidratadas que en heces sólidas. Otro beneficio de trabajar con heces purgadas es la facilidad con que pueden ser procesadas para colorear y además favorecen la eliminación de segmentos de gusanos chatos como Ascaris lumbricoides y Enterobius vermicularis adultos los que pueden ser detectados en el examen microscópico.

CONSERVADORES DE HECES

1) Formolina : agua al 5% formolada para heces compactas, para conservar quistes de protozoos.

2) Agua formolada al 10% para heces pastosas para preservar huevos y larvas.3) Agua formolada al 15% para heces liquidas y preferentemente para las que contengan A.

Lumbricoides para detener su evolución.

Ventajas:

1) Buen fijador para concentrar heces2) Fácil de preparar y vida útil.

Desventajas:

1) No preserva bien trofozoitos.2) No preserva la morfología de los elementos ni es buen sustrato para coloraciones permanentes

MIF (Merthiolate – Iodo –Formol )

Es un fijador que tiene la ventaja de fijar y teñir.Usando la dilución 1:3 (1 parte de heces y 3 de MIF) para grandes cantidades de heces.Usar la disolución 1:10 para pequeñas cantidades de heces.

Ventajas : 1) Fija y colorea estructuras simultáneamente.

2) Fácil de preparar larga vida útil.

3) Preserva bien las estructuras.

Desventajas: La muestra recolectada en MIF no es un buen sustrato para coloraciones permanentes .

PAF:

Es un buen fijador que permite, observar detalles en la cromatina de los trofozoitos de amebas.Las muestras recolectadas en PAF pueden ser observados agregando MIF con lo cual se ve mejor los detalles nucleares.

Ventajas: 1) fácil de preparar larga vida útil.

2) preserva bien las estructuras.

Desventajas: no constituye un buen sustrato para coloraciones permanentes.

COPROPARASITOLÓGICO SERIADO

Se aplica para búsqueda de trofozoitos, huevos y quistes parasitarios.

Se recomienda que en un lapso de 10 días se recojan 3 muestras en días separados.

En caso de diarrea crónica o sospecha de amebiasis se requiere una serie de 6 recolecciones en días separados dentro de 14 a 20 días (permite detectar un 90% de infecciones por amebas.

NO se recomienda tomar las 3 muestras en 3 días consecutivos.

El número indicado para controles post-terapeuticos es también de 3 muestras recolectadas en días separados .En pacientes que recibieron medicación para protozoarios se deben controlar después de 3 o 4 semanas post tratamiento y en los que tuvieron tratamiento para Taenia spp a las 5 ó 6 semanas post-tratamiento.

Indicar al paciente que defeque sobre una superficie con cubierta plástica o papel parafinado libre de orina o agua, de allí tomar una porción que debe colocar en un recipiente preferentemente de plástico y de boca ancha y con una solución fijadora como PAF la que se conservara en un lugar fresco ó a 40 C. EL volumen de heces deberá ser igual o inferior a la mitad del fijador que contenga el frasco y la materia fecal se mezclara hasta obtener una emulsión homogénea.

IMPORTANTE

No dejar muestras frescas para examinar pasado el tiempo recomendado.

No aceptar muestras mezcladas con orina.

No colocar el recipiente que contenga heces sobre la orden de solicitud del examen.

No recolectar las heces provenientes de inodoros ó retretes ó que estén en contacto con tierra ó agua sucia para evitar la contaminación ó helmitos libres.

Se recomienda una Dieta de 3 días antes de iniciar la recolección: ingerir carnes magras, pastas dulces y papas.

Evitar : mantecas, frutas de hollejos, verduras de hoja y lugumbre. Tomar mucho liquido (agua).

Suspender las medicaciones que puedan interferir, los purgantes oleosos, antiparasitarios, sustancias radiopacas ó compuestos que contengan carbón ó bario.

En nuestro laboratorio realizamos el método de Bacigalupi-Rivero:

METODO BACIGALUPI – RIVERO

Centrifugar sedimento

Flotación

Método de Enriquecimiento:

1) 10 gr. de materia fecal más 50 ml de H2O de la canilla.

2) Se filtra y se recoge en tubo de centrífuga. Agregar agua y mezclar.

3) Centrifugar 4 min. a 1800 r.p.m.

4) Volcar, agregar nuevamente agua mezclar y centrifugar 4 min a 1800 r.p.m.

5) Volcar sobrenadante,agregar solución fisiológica hasta la mitad del tubo. Luego agregar 2 ml de éter. Tapar y agitar.

6) Centrifugar 4 min a 3000 r.p.m.

7) Desechar sobrenadante y observar en microscopio el sedimento con una gota de Lugol.

ESCOBILLADO ANAL

“ Resulta de alto rendimiento para el diagnostico de oxiuriasis o teniasis por.saginata (90 % ”.

Recolección :

Tomar una muestra diaria durante 7 días consecutivos. Sin higiene previa por la mañana. El paciente esta acostado boca abajo, se le separan las nalgas para dejar al descubierto la zona anal. Se toma una gasa doble (5 x 5 cm) humedecido con agua de canilla y se tapa sobre el ano y luego se coloca en un recipiente que contenga 30 ml de formolina; también se puede poner en frasco seco , luego colocar la formolina en laboratorio.

IMPORTANTE

Durante la recolección No utilizar supositorios, pomadas ni talco.

TEST DE GRAHAM

Se reemplaza la gasa por un trozo de cinta transparente de celofán adhesiva que luego de ser aplicada sobre la superficie perianal se retira y se deposita la cinta sobre un porta objeto repitiendo la misma operación durante 7 días en porta objetos diferentes.

NOTA: todas las muestras parasitológicas deben estar acompañadas de escobillado anal ó test de Graham.

Exudados vaginales / uretralesExudados vaginales / uretrales

Toma de muestraToma de muestra: :

Búsqueda de Búsqueda de Neisseria gonorrhoeae.Neisseria gonorrhoeae.En En mujeresmujeres: conducto cervical, y también uretra, vagina, recto y orofaringe. : conducto cervical, y también uretra, vagina, recto y orofaringe. En En varones heterosexualesvarones heterosexuales: uretra.: uretra.En En varones homosexualesvarones homosexuales: uretra, recto y orofaringe.: uretra, recto y orofaringe.

Uretra masculinaUretra masculina: recoger directamente el pus con un hisopo de dacrón o: recoger directamente el pus con un hisopo de dacrón o alginato de calcio o de algodón atóxicos. Si no hay flujo purulento visible,alginato de calcio o de algodón atóxicos. Si no hay flujo purulento visible, exprimir la uretra de atrás a adelante para evacuar el exudado. Si no se obtieneexprimir la uretra de atrás a adelante para evacuar el exudado. Si no se obtiene exudado, introducir un ansa o hisopo 2-3 cm por el meato y girar el hisopoexudado, introducir un ansa o hisopo 2-3 cm por el meato y girar el hisopo durante 5-10 segundos. El paciente concurrirá con un mínimo de 3 hs dedurante 5-10 segundos. El paciente concurrirá con un mínimo de 3 hs de retención urinaria para evitar el arrastre mecánico de retención urinaria para evitar el arrastre mecánico de Neisseria gonorrhoeaeNeisseria gonorrhoeae..

Cuello uterinoCuello uterino: rotar el hisopo 5-10 segundos en el canal del endocérvix tratando: rotar el hisopo 5-10 segundos en el canal del endocérvix tratando de exprimir los conductos glandulares que desembocan allí. Previa eliminaciónde exprimir los conductos glandulares que desembocan allí. Previa eliminación del moco exocervical con una torunda o gasa estéril. Utilizar un espéculo sindel moco exocervical con una torunda o gasa estéril. Utilizar un espéculo sin lubricantes humedecido en agua tibia.lubricantes humedecido en agua tibia.

Uretra femeninaUretra femenina: hacer un masaje de la uretra comprimiéndola contra la sínfisis: hacer un masaje de la uretra comprimiéndola contra la sínfisis del pubis y aplicar la misma técnica que en los hombres.del pubis y aplicar la misma técnica que en los hombres.

VaginaVagina: solo se utiliza en mujeres que han sufrido histerectomía, o en niñas: solo se utiliza en mujeres que han sufrido histerectomía, o en niñas prepúberes, pues el epitelio vaginal es todavía cilíndrico y prepúberes, pues el epitelio vaginal es todavía cilíndrico y NeisseriaNeisseria gonorrhoeaegonorrhoeae puede provocar la infección inicial (vulvovaginitis). En el caso de puede provocar la infección inicial (vulvovaginitis). En el caso de las niñas, aprovechar el llanto o tos para recoger la gota de exudado quelas niñas, aprovechar el llanto o tos para recoger la gota de exudado que aparecerá en orificio himeneal. aparecerá en orificio himeneal.

OrofaringeOrofaringe: frotar con un hisopo la región de las criptas amigdalinas y la pared: frotar con un hisopo la región de las criptas amigdalinas y la pared posterior de la faringe.posterior de la faringe.

rectorecto: Que el paciente concurra con el intestino evacuado. Tomar la muestra: Que el paciente concurra con el intestino evacuado. Tomar la muestra introduciendo el hisopo 2-3 cm a través del ano y haciendo rotar 10 segundosintroduciendo el hisopo 2-3 cm a través del ano y haciendo rotar 10 segundos para extraer muestra de exudado de las criptas. Descartar si se produjerapara extraer muestra de exudado de las criptas. Descartar si se produjera contaminación fecal.contaminación fecal.

Siembra en medio Thayer Martín:Siembra en medio Thayer Martín:1. Con el hisopo que contiene la muestra, hacer una siembra en “Z”sobre el1. Con el hisopo que contiene la muestra, hacer una siembra en “Z”sobre el medio TM. El hisopo debe rodarse durante la siembra, de modo que toda lamedio TM. El hisopo debe rodarse durante la siembra, de modo que toda la superficie entre en contacto con el medio.superficie entre en contacto con el medio.2. Con un ansa bacteriológica, esparcir el material depositado en la “Z”,2. Con un ansa bacteriológica, esparcir el material depositado en la “Z”, haciendo estrías próximas unas a otras, en todos los sentidos.haciendo estrías próximas unas a otras, en todos los sentidos.

CoprocultivoCoprocultivo

Infecciones gastrointestinales:

1) Introducción:

La gastroenteritis se define como una enfermedad caracterizada por náuseas, vómitos, cólicos abdominales, diarrea y a veces fiebre.Las diarreas agudas de origen infeccioso pueden ser de etiología bacteriana, viral y/o parasitaria siendo las asociaciones de 20 o más agentes.Los microorganismos considerados como agentes de diarrea se presentan en la sgte. tabla:

Bacterias Virus Parásitos

Salmonella sppShigella sppVibrio choleraeEscherichia coli- Enteropatógeno ( EPEC )- Enterotoxigénico ( ETEC )- Enteroinvasivo ( EIEC )- Enterohemorrágico (EHEC )- Enteroagregativo ( EAggEC )Yersinia sppCampylobacter sppClostridium difficile

RotavirusAdenovirusNorwalkCalicivirusAstrovirus

Cryptosporidium sppGiardia lambliaEntamoeba histolytica

2) Patogenia :

La diarrea aguda infeccioso se produce cuando un microorganismo o en algunos casos su toxina preformada son ingeridos, estos resisten los mecanismos de defensa del huésped ( tabla 2) y alcanzan el tracto intestinal.Después que Salmonella spp, Shigella spp, Yersinia spp, Vibrio cholerae u otro patógenos han alcanzado la superficie mucosa existen distintos mecanismos para establecer la diarrea dependiendo de la capacidad de algunas bacterias de : colonizar, invadir, o de la naturaleza de las toxinas que produce.

Mecanismos de defensa del huésped

Boca Actividad antimicrobiana de la saliva

Estómago pH ácido

Intestino Peristaltismo Secreción de mucus Producción de sustancias antibacterianas

(lactoferrinas, IgA secretora) Competencia con la flora normal

3) Clasificación de las diarreas

Pueden producirse dos tipos de diarrea según el mecanismo fisiopatogénico del microorganismo:

A. DIARREA TIPO I o SECRETORA

Aquí, el microorganismo después de colonizar se multiplica en el lumen intestinal; en este sitio por secreción de una enterotoxina o bien por reducción de la superficie absortiva se produce una alteración del flujo bidireccional de agua y electrolitos dando por resultado una diarrea acuosa con escasos leucocitos ( 0 – 5 por campo ) en el directo de materia fecal.Ej. Vibrio cholerae, E. coli enterotoxigénico, rotavirus, Giardia lamblia, Cryptosporidium spp, EPEC.

B. DIARREA TIPO II o INFLAMATORIA

El microorganismo después de adherirse a nivel de intestino delgado, invade el mismo. Su multiplicación dentro de la mucosa o la liberación de una citotoxina causa la destrucción parcial o total de la célula. Se produce una diarrea con sangre, pus y abundante leucocitos polimorfonucleares ( mas de 20 por campo )Ej. Shigella spp, EIEC, Campylobacter jejuni, Salmonella entérica, Entamoeba Hitolytica.

4) Enteropatógenos que se investigan en nuestro servicio:

De rutina: Salmonella spp., Shigella spp., E.coli EPECOcasionalmente: Vibrio cholerae, E.coli O157

SALMONELLA SPP

El género comprende más de 2400 serovariedades distribuidas en 2 especies Salmonella enterica y Salmonella bongori.

El 99,5 % de los aislamientos en Microbiología Clínica corresponden a Salmonella enterica subespecie enterica.SHIGELLA SPP

El género Shigella comprende 4 especies o subgrupos: Shigella dysenteriae ( grupo A ), Shigella flexneri ( grupo B), Shigella boydii ( Grupo C ) y Shigella sonnei ( Grupo D ).En los países más desarrollados Shigella sonnei es el microorganismo más frecuente seguido de Shigella flexneri, mientras que las gastroenteritis por Shigella dysenteriae y Shigella boydii son raras. En países en desarrollo la infección por estos dos últimos subgrupos es más común y la debida a Shigella flexneri es más frecuente que la que ocurre por Shigella sonnei.

E.COLI EPEC

Actualmente este término s usado para definir cepas de E. coli que causan diarrea pero no producen toxinas citotónicas ni tienen capacidad invasiva en el test de Sereny.Los serogrupos asociados mas frecuentemente son: O55, O86, O111, O119, O125, O126, O127, 0128ab, O142. Con menos frecuencia: O18, O44, O112, O114.

E. COLI ENTEROHEMORRAGICO ( EHEC )

E. coli O157 es el prototipo de un grupo de más de 150n serotipos de E. coli. Los serotipos de E. coli productor de toxina Shiga (STEC ), asociados a enfermedades severas en el hombre pertenecen a la categoría de E. coli enterohemorrágico ( EHEC ).

VIBRIO CHOLERAE

Existen más de 30 especies de Vibrio de las cuales solo 12 se han encontrado en muestras clínicas. Entre las especies patógenas, las cepas de V. Cholerae que reaccionan con el antisuero somático del grupo O1 se denominan V.cholerae O1, mientras que las especies que pertenecen a otros serovares ( hasta el momento 155 )se denominan V. cholerae no O1.El cólera epidémico es causado por V. cholerae O1

Clasificación de Vibrio cholerae:

Vibrio cholerae

No O1 O1 ( 155 serogrupos)

Biotipos

CLÁSICO EL TOR

Serotipos

OGAWA, INABA, HIKOJIMA

NO TOXIGENICO TOXIGENICO

5) Procesamiento de materia fecal para la detección de enteropatógenos :

Recolección de la muestra:

En adultos: por deposición espontánea en recipientes estériles.

En lactantes: es útil el hisopado rectal. Es aconsejable evitar la toma directa del pañal salvo cuando la deposición es reciente.

Conservación:

Se recomienda la siembra inmediata. Cuando esto no es posible las heces pueden mantenerse en solución salina glicerinada y tamponada para su conservación hasta el momento de su procesamiento.

Examen macroscópico:

Se debe observar la presencia de sangre, mucus, parásitos, etc. en la materia fecal.

Examen microscópico:

1- En fresco con lugol:Colocar entre porta y cubre objeto una gota de lugol y emulsionar en ella una ansada de materia fecal. Es útil para detectar parásitos.

2- En fresco con azul de metileno:Permite diferenciar leucocitos polimorfonucleares. Además se debe observar la presencia de piocitos, mucus, hematies y levaduras.

Cultivo ( se muestra en la próxima pag.)

Cultivo :

Materia Fecal

Aislamiento Enriquecimiento

1º día EMB SS Incubar 24 – 48hs a 37 ºC 1º día Caldo selenito de potasio ( placa entera) (1/2 placa) Incubar 24 hs a 37ºC

2º día Selección de colonias 2º día Sembrar la mitad de SS

Fermentadoras No Fermentadoras 3º día Colonias No Ferm.

Pruebas bioqcas míninas: Pruebas bioqcas. Mínimas Incubar 24 hs a 37ºC

- TSI- SIM - LIA - BAM 4º día Confirmación serológica de:- UREA - CITRATO - Salmonella - ORNITINA - Shigella- Incubar 24 hs a 37ºC

3º día Confirmación serológica :

No Fermen. Fermen.

Salmonella E. coli EPECShigella

Esquema para el diagnóstico de E. coli O 157 productor de toxina Shiga ( STEC )

Materia fecal (suspención)

Agar MacConkey Agar MacConkey sorbitol con agregado de telurito de potasio y cefixima

10 col. ferm de lactosa 10 col. no ferm de sorbitol

Confirmaci ón bioquímica E. coli Serología O157 Enterohemolisina

( + )

Serol ogía E. coli Confirmación bioquímica(Fundamentalmente O26 y O111) Sorbitol en tubo ( cultivo de 24 hs.) B-Glucuronidasa Enterohemolisina

E. coli O157 sorbitol (-) Informe Presuntivo B-glucuronidasa (-) E. coli O157 Enterohemolisina (+)

Serología H7

No móvil o H7 (+)

Detección de Toxina Shiga Detección de Toxina Shiga

(-) (+) (-) (+)

ST EC no O157 STEC O157:H7 STEC O157:NM

Procesamiento de materia fecal para la detección de Vibrio cholerae

Suspención de heces

Agua peptonada alcalina6 hs (no mas de 8 hs) 37ºC

Diagnostico presuntivo Medio no selectivo Medio selectivo TSA ó agar sangre de carnero Agar TCBS

Seleccio nar 3 a 5 colonias Seleccionar 3 a 5 colonias típicas (amarill as, lisas de 2-3 mm de diámetro)

oxidasa TSA oxidasa ( + )

Agl utinación con suero Aglutinación con suero polival ente anti V.cholerae O1 polivalente anti V.cholerae O1 ( + ) V.cholerae O1 ( + ) V.cholerae O1 ( - ) V.cholerae O1 ( - ) V.cholerae no O1

Aglutinación con suero Aglutinación con suero anti –V. cholerae O139 Anti –V. cholerae O139

Pru ebas bioquímicas

Nota: Remitir para la determinación del biotipo, serotipo, antibiotipo y enterotoxina, al INEI.ANLIS “ Dr.C.G. Malbrán”

Tratamiento:

ENTEROPATOGENO TRATAMIENTO

E. coli EPEC La diarrea es generalmente autolimitada. Se debe recurrir al uso de antimicrobianos en aquellos casos en los que se prolonga más de 5 días y en niños desnutridos o que requieren hospitalización.

Salmonella En el hombre el tratamiento con antibióticos no es eficaz; el mismo no acelera la recuperación clínica, prolonga el estado de portados o favorece el desarrollo de cepas resistentes.

Shigella Lo más importante es la reposición de líquidos y electrolitos. Ampi, tetraciclinas y cloranfenicol acortan la duración de la enfermedad, pero debido a que es común la resistencia múltiple a los antibióticos es necesario determinar la sensibilidad de la cepa antes de comenzar el tratamiento.

Vibrio cholerae Restitución de líquidos y electrolitos ( sales de rehidratación oral aprobada por la OMS). La terapia antibiótica resulta útil, aunque no es esencial, porque acorta la duración de la enfermedad, disminuye el volumen de las heces y acorta el periodo de excreción. Los antibióticos de eficacia clínica son: tetraciclina, doxicilina, nitrofurantoina ( furazolidona ), trimetoprima-sulfametoxazol, eritrmicina, ampicilina, norfloxacina.

UrocultivoUrocultivo

DATOS DE MUESTRA

La muestra remitida al Laboratorio debe contener los siguientes datos:

- Tipo de muestra: Chorro medio, al acecho ( lactantes ), punción suprapúbica, cateterización, punción sonda.

- Datos del paciente:Edad – sexo – síntomas – factores predisponentes – Antecedentes de IU – ATB previos o actuales.

CONSERVACION

Inmediatamente después de recolectada se debe refrigerar a 4 – 8 ºC hasta su procesamiento.

PROCESAMIENTO

1) Siembra:

La muestra se siembra sin centrifugar.Existen numerosos medios de cultivos para sembrar una muestra de orina, su selección debe contemplar la relación costo- beneficio, teniendo en cuenta que :

- El 70 – 80 % de los urocultivos son negativos.

- El 85 – 90 % de la IU son producidas por Enterobacterias.

- De los microorganismos GRAM positivos los más frecuentes son Staphylococcus y Enterococcus.

Sugerimos las siguiente opciones:

A. CLDE

Se siembra con ansa en anillo calibrada ( 5 ul ), en media placa de CLDE en tres estrías.En este medio desarrollan todas las Enterobacterias, Staphylococcus y Enterococcus.

Nota: En caso de muestra con sedimento patológico y sin desarrollo a las 24 hs, se debe sembrara al otro día en As ( con estría de Staphylo ) o ACH en busca de bacterias nutricionalmente exigentes. Por ello se deben guardar las muestras por 24 hs. después de ser sembradas.

B.

EMB AS

En media placa de EMB y AS en tres estrías.

En EMB desarrollan Enterobacterias

En AS desarrollan Estafilococos, estreptococos y Corinebacterias.

Nota: Si sospecha de Haemophilus ( spp ) o Neisserias patógenas sembrar en ACH.

Interpretación:

- Crecimiento en 1º estría: Rto 103 UFC/ml

- Crecimento en 1º y 2º estría: Rto 104 UFC/ml

- Crecimiento en 1º , 2º y 3º estría: Rto > 105 UFC/ml

2) Exámen químico:

Se usan tiras reactivas. Los parámetros más importantes a tener en cuenta son:

PH Proteinas Densidad Glucosa Nitritos3) Sedimento urinario:

Luego de colocar las tiras reactivas se centrifuga la muestra 10 min a 2000 rpm y se observa al microscopio una gota del sedimento.

Parámetros importantes a tener en cuenta:

Nº de leucocitos por campo ( > 5 Leucocitos por campo se considera patológico ). Nº de hematíes por campo. Presencia de piocitos Presencia de cilindros. Presencia de bacterias y/o levaduras.

4) Coloración de GRAM

No se realiza de rutina. La presencia de 1 microorganismo por campo 1000 x se correlaciona con un cultivo de > 105 UFC / ml

Indicaciones para realizar una coloración de GRAM :

Pacientes que reciben ATB Pacientes que presentan sedimento patológico con cultivos negativos, para verificar presencia de

microorganismos nutricionalmente exigentes. Pacientes con sepsis de punto de partida urinario.

5) Condiciones de incubación

Atmósfera:

CLDE: atmósfera ambiental

AS y ACH : en atmósfera con tensión de CO2 5 – 7 % (lata con vela )

Temperatura:

35 +/- 2 ºC

Tiempo:

CLDE: 24 hs.

AS y ACH: 48 hs.

6) Interpretación e Informe:

Tener en cuenta que :

- La mayoría de las infecciones urinarias son monomicrobianas ( flora única o > 90% de un gérmen en una mezcla )

- Un muy bajo porcentaje ( aprox. 0,3% ) son polimicrobianas.

Se debe correlacionar el recuento de colonias con la presencia o ausencia de sedimento patológico:

Interpretación e informe:

RECUENTO INFORME

> 105 UFC/ ml con o sin sedimento patológicoRto de coloniasEspecie bacterianaAntibiograma

104 – 105 UFC/ ml con sedimento patológicoRto de coloniasEspecie bacterianaAntibiograma

104 – 105 UFC/ ml sin sedimento patológico Solicitar nueva muestra

103 – 104 UFC/ ml con sedimento patológico Estudiar cada caso

< 103 UFC/ ml sin sedimento patológico Negativo

EstafilococosEstafilococos

DETECCION DE METICILINO RESISTENCIA

METODO CONDICIONES

Difusión

Disco Oxa 1 ugMHA30 – 35 ºC24 hs.

Screening en Placa solo para S.aureusNo para SCN

MHA + 4% NaCl + Oxa 6 mg/ ml30 –35 ºC24 hs.

NUEVOS PUNTOS DE CORTE ( NCCLS 1999 )

DISCOS ESPECIE R I S

OXA S. aureus

SCN

< 10 11-12 > 13

< 17 --- > 18

VANCO >15Si da menos de 14 hay que testear con CIM

La resistencia a Oxa se liga a múltiple resistencia. Hay resistencias acompañantes. Esta usualmente ligada a multi resistencia en: Tetraciclina, aminoglucósidos (preferiblemente Genta ), Cloranfenicol, Eritromicina. Hay que probarlos ya que son marcadores fenotípicos en todos los estafilococos

Método de Determinación deMétodo de Determinación de Sensibilidad AntimicrobianaSensibilidad Antimicrobiana

1) Introducción:

Actualmente hay muchas metodologías de distintos grupos de expertos que más allá de diferir en la técnica difieren de alguna manera en los puntos de corte.En Argentina y en la mayoría de los países latinoamericanos se siguen las normas de NCCLS ( Comité Americano de Estandarización de Laboratorios Clínicos ) y nosotros nos guiaremos por ellas.El siguiente es un resumen de la Metodología referida como “Método de la OMS” muy similar al conocido Kirby Bauer.El principio del método involucra el uso de una cantidad constante de un antimicrobiano que está en un disco de papel aplicado sobre la superficie del agar en el que está el microorganismo en cuestión. Se forma así por difusión un gradiente de concentración del antimicrobiano y la sensibilidad está dada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del disco.Ese diámetro depende no solo del antibiótico (ATB) y del microorganismo sino también del:

Espesor de la capa del agar

PH

Composición del medio

Capacidad de difusión de la droga en el medio

Temperatura

Velocidad de duplicación bacteriana

Como es una técnica “cualitativa” para que los resultados sean confiables los procedimientos deberán ser controlados y estandarizados cuidadosamente y remitirse a las tablas de la NCCLS que se actualizan anualmente.

2) I ndicaciones para la realización de los test de susceptibilidad

- Están indicadas para cualquier microorganismo si su sensibilidad no puede ser preestablecida a partir de la identidad del germen.

- Frecuentemente están indicadas en caso de que por ejemplo la especie sea capaz de mostrar resistencia a los AB usados comúnmente.

- También puede ser indicado con fines epidemiológicos de resistencia y en el estudio de nuevos ATB.

- Se deben realizar a partir de una cepa aislada. solo en caso de EMERGENCIAS puede hacerse desde materiales clínicos donde el GRAM sugiere naturaleza monomicrobiana. Luego debe repetirse la metodología por el método estandarizado.

3) Selección de agentes antimicrobianos para pruebas de sensibilidad

- Se deberá remitir a la s tablas 1 y 1 A (pag...) que sugieren loa ATB a usar en el informe de rutina al médico.

- El número de agentes a probar debe ser limitado e incluirá solo un representante de cada grupo de drogas relacionadas.

- El grupo A se considera como test de rutina.

- El grupo B son de importancia clínica para infecciones hospitalarias particularmente y estarán en el test primario pero se informarán selectivamente solo a pedido o si hay resistencia a los agentes de la flia. del grupo A.

- El grupo C tiene agentes ATB alternativos o suplementarios que deben ser testeados en caso de mucha resistencia a varias drogas primarias, o pacientes alérgicos a drogas primarias.

- El grupo U enumera agentes que no se deben informar en casos de infecciones que se encuentran en otra localización que no sea la vía urinaria.

4) Procedimiento para la realización del test d difusión:

Reactivos: El agar Mueller Hinton es considerado como el mejor, dado que :

- Muestra buena reproducibilidad

- Contiene bajo nivel de inhibidores para TMS, tetra - Es adecuado para la mayoría de las bacterias patógenas

- Existen suficientes datos que avalan la experiencia de las pruebas en este medio

Volumen: El volumen será tal que pueda obtenerse una altura de 4 mm ( Aproximadamente 25-30 ml para placas de 100 mm )

Temperatura: Las placas preparadas deben conservarse entre 2 – 8 ºC.

pH : Debe ser controlado cuando se prepara el medio. El agar debe tener un pH de 7.2 – 7.4

Humedad: Si hay exceso de ella en la superficie deben secarse a 35 ºC entre 10 a 30 min. Las placas deberán estar húmedas pero no mostrar gotas en su superficie.

Suplementos: están indicados para ciertos microorganismos ( Ej. para St. pneumoniae se agrega sangre de oveja al 5% )

Conservación de los discos: deben mantenerse a 8 ºC o en freezer a -14 ºC. Los discos deben guardarse en contenedores herméticos y sacarse de la heladera 1 o 2 hs. antes de su uso a fin de lograr equilibrio entre Tº antes de ser abiertos los frascos.

Inóculo:

- Patrón de turbidez: para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez ( 0.5 de Mc Farland ). El estándar se guarda la abrigo de la luz y se debe agitar antes de su uso.

- Preparación del inóculo: A partir de 4-5 colonias aisladas y de igual morfología preparar una suspención en 4 – 5 ml de un caldo apropiado (tripteina soja, MHB o SF ) y puede procesarse de dos maneras:

a) Método del desarrollo previo:Una vez preparada la suspención se lleva a 35ºC hasta que alcance o exceda la turbidez ( 2 a 4 hs) Sacar de estufa y ajustar turbidez con SF o caldo hasta de 0.5 de Mc Farland por comparación visual. (La suspención contiene aproximadamente 1-2 x 108

b) Método directo: el inóculo se realiza directamente ajustando al 0.5 sin inoculación previa . Este método es de elección para microorganismos fastidiosos, por ej. Haemophilus spp , Streptococcus spp y Neisseria gonorrhoeae o Sthaphylococcus potencialmente meticilino resistente.

Inoculación de las placas:

Dentro de los 15 min. de ajustado el inóculo se hisopean las placas en 3 direcciones para asegurar una completa distribución del inóculo.Las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y el desarrollo confluente o casi confluente.No usar inóculos no estandarizados para el hisopeado de las placas. Los extremos en la densidad producen grandes cambios .

Aplicación de los discos:

Se colocan los discos con pinza estéril aplicándole una ligera presión a una distancia aproximadamente de 2 cm. No usar más de 6 discos por placa.

Incubación:

Incubar las placas invertidas a 35 ºC dentro de los 15 min. posteriores a que los discos fueron aplicados y sin atmósfera de CO2 con excepción de Streptococcus spp , Neisseria gonorrhoeae y Haemophilus spp.El tiempo de incubación es de 16 – 18 hs a menos que se trate de una cepa de Sthaphylococcus spp y Enterococcus spp que para los discos de Oxa y Vanco se necesitan 24 hs completas.

Lecturas de las placas

Se debe leer el área que no muestra desarrollo obvio a ojo desnudo no incluyendo velo decrecimiento o colonias muy pequeñas cerca del borde de crecimiento. Colonias más grandes dentro de la zona deben ser subcultivadas, reidentificadas y reensayadas. Los tamaños deben interpretarse con tablas correspondientes 2 A – 2B – 2C – 2D – 2E – 2F – 2G – 2H – 2I . Los microorganismos se informarán Sensibles, Intermedios o Resistentes frente al ATB ensayado.

Diferenciación entre Salmonella y Citrobacter

Pruebas o sustratos S. entericasubesp.entérica

S. entericasubesp arizonae

Citrobacterfreundii

Citrobacterdiversusu

ONPG - (2,1) + (97) + (98,7) + (98,7)

Ureasa - (0) - (5,1) + (70) + (75)

Gelatina - (0) + (99,4) - (0) - (0)

Malonato - (0) + (95) D (14) + (90)

Indol - (0) - (0) - (5) + (99)

LisinaDescaboxilasa + (98) + (99) - (0) - (0)

Ornitina Descarboxilasa + (98) + (99) D (20) + (99)

H2S (TSI) + (99) + (95) + (80) - (0)

KCN - (0) - (5,7) + (97) - (0)

( + ):positivo; ( - ) NegativoD: diferentes reacciones( ):% de positividad