Guía 7. Extracción y verificación de la actividad de las enzimas: succínico deshidrogenasa y citocromo oxidasa y estudio del efecto de algunos inhibidores

I. EL PROBLEMA Realizar experimentalmente la extracción de enzimas a partir de un tejido animal. Verificar in vitro la actividad de las enzimas que se extrajeron mediante el uso de aceptores electrónicos coloreados. Reconocer el efecto de los inhibidores en la actividad de las enzimas y sobre la fosforilación oxidativa y el ciclo de Krebs. II. FUNDAMENTO TEÓRICO La mitocondria es el organelo citoplasmático en donde se lleva a cabo la respiración celular representada en vías metabólicas como el ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa. Posee dos membranas: la externa altamente permeable por proteínas de membrana llamadas porinas y la interna con pliegues o crestas y de permeabilidad alatemnte selectiva (ver figura 1).

Figura 1. La mitocondria

El ciclo de Krebs Es una ruta aerobia cuyos complejos multienzimáticos se encuentran localizados en la matriz mitocondrial con excepción de la succínico deshidrogenasa proteína integral de la membrana interna.

Este proceso metabólico permite la descarboxilación de los esqueletos carbonados que le llegan en forma de Acetil CoA, provenientes de diferentes compuestos (carbohidratos, ácidos grasos, aminoácidos). Esta vía metabólica oxidativa está asociada a la reducción de las coenzimas FAD y NAD

+, que finalmente ingresan a la

cadena de transporte electrónico para su reoxidación (ver figura 2).

Figura 2. Ciclo de Krebs

Figura 2. Ciclo de krebs Acción de la succínico deshidrogenasa. La succínico deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa o complejo II es una enzima que remueve dos protones y dos electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidación asociada a la coenzima FAD

+,

que transfiere los electrones a la cadena de transporte electrónico. Este proceso lo inhibe en forma competitiva la presencia de otros ácidos dicarboxílicos como el malonato, oxalacetato y y oxalato, los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, situación que genera la acumulación de succinato. El proceso se puede observar in vitro mediante el uso de un aceptor electrónico artificial como el azul de metileno que es coloreado en su estado oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida que se reoxida la coenzima FAD. Cuando éste indicador de oxido – reducción se encuentra en contacto con el O2 del aire se reoxida tomando de nuevo la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno. Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire, se reoxida tomando la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno, por esta razón el sistema se aísla mediante una capa de aceite mineral.

La cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa La cadena de transporte de electrones o cadena respiratoria como parte de la fosforilación oxidativa es un proceso que se lleva a cabo en la membrana interna mitocondrial y está constituido por una serie de complejos enzima-coenzima de oxidorreductasas y ferroproteínas. (ver figura 3) A través de la cadena de transporte de electrones se realiza la reoxidación de las coenzimas NADH

+ H

+ y

FADH2 producidas en las rutas catabólicas, ya que permite el transporte de los electrones hasta el O2, que es el aceptor final reduciéndose para formar agua. Este flujo de electrones es exergónico por esto tres complejos enzimáticos de la cadena respiratoria utilizan la energía liberada para bombear protones al espacio intermembrana de las mitocondrias, generando un potencial electroquímico que pormueve después el regreso de los protones a la matriz mitocondrial y la síntesís de ATP através del complejo V o la ATP sintasa. Acción de la citocromo oxidasa. El complejo citocromo oxidasa o complejo IV es el componente final de la cadena respiratoria y está constituido por el citocromo a y a3 y dos iones Cu

++. Aproximadamente el 90% del consumo celular del

oxígeno se debe a la acción de este complejo que cataliza la reducción del oxígeno para formar agua.

Figura 3. Cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa

Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores más fuertes como es el caso de ión cianuro (CN

-), azida

(N3-), monóxido de carbono (CO) y otros inhibidores que bloquean irreversiblemente este complejo

enzimático. Con ello se ve interrumpido el transporte electrónico y se deja de utilizar el O2 generando una condición de cianosis celular. La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidación de aceptores electrónicos artificiales como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia del sistema de citocromos de los complejos de la cadena respiratoria. Esta sustancia es muy reactiva así que se condensa y polimeriza fácilmente originando mezclas de pigmentos oscuros.

La siguiente ecuación química representa la acción de esta sustancia indicadora de las reacciones de oxido – reducción en los sistemas in vitro.

III. REACTIVOS. Buffer de fosfatos 0,1M pH = 7,4 Succinato de sodio, 1% en buffer p – fenilendiamina, 1% en agua *Cianuro de potasio, 0,05M en agua Azul de metileno 0,01% en agua *Azida de sodio, 0,5% en agua Oxalato de sodio, 1,5% en buffer Malonato de sodio, 1% en buffer Arena lavada Agua destilada Aceite mineral Hielo IV. MATERIALES. 12 Tubos de ensayo - gradilla Balanza 3 Pipetas (1, 2 y 5 mL) Baño termostatado 1 Vaso de precipitados (250 mL) Centrífuga 2 Tubos de centrífuga Trípode – mechero 1 Erlenmeyer Placa de calentamiento 1 Mortero – pistilo Bisturí – cuchilla 1 Termómetro Pipeta Pasteur. 1 Espátula MATERIAL DE PRUEBA. Tejido muscular, hepático, cardíaco de vaca, conejo o ave, bien fresco (traído del matadero ese mismo día). V. PROCEDIMIENTO. Extracción y preparación de las enzimas y coenzimas. Procedimiento para el monitor: Pesar una muestra de aproximadamente 6 g de tejido libre de sangre y colocarla en un mortero con arena lavada, enfriada previamente en un baño de hielo. Proceder a macerar cuidadosamente hasta formar una pasta suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de

buffer fosfato pH 7,4, hasta completar un volumen de aproximadamente 18 mL. Transferir la mezcla a un erlenmeyer de 150mL y mantenerlo en un baño con hielo durante 15 minutos, mezclando ocasionalmente. Pasar la muestra a tubos de centrífuga y centrifugar a 1500 rpm por 7 minutos. Transferir el sobrenadante a otro erlenmeyer de 150mL y marcarlo como extracto enzimático; mantenerlo en baño de hielo hasta su posterior uso. Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa. Preparar una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la Tabla 1, hasta adicionar el agua. Dejar los tubos incubando a 37ºC durante 10 minutos y sin retirarlos del baño agregar el extracto enzimático y la p-fenilendiamina, agitar bien, este momento corresponde al tiempo cero, observar y registrar el tiempo en que aparece el complejo coloreado, el color final y la intensidad del color.

Tabla 1. Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa

Tubos

Reactivos (mL)

Blanco 1 2 3 4

Buffer fosfatos pH 7,4 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Malonato de sodio 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0

Cianuro de potasio 0,0 0,0 1,0 0,0 0,0

Azida de sodio 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0

Agua destilada 2,0 1,0 0,0 0,0 0,0

Extracto enzimático 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

p-fenililendiamina 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa Prepare una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la tabla 2. Antes de agregar el extracto enzimático, deje los tubos incubando a 37ºC durante 10 minutos, y sin retirarlos del baño agregue el extracto enzimático, inmediatamente agite bien y coloque el aceite mineral. Tome como tiempo cero el momento en que colocó el extracto enzimático y anote el tiempo en que cambia el color, color e intensidad de color final.

Tabla 2. Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa

Tubos Reactivos mL

Blanco 1 2 3 4 5

Buffer fosfato pH 7.4 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 1,0

Succinato de sodio 1% 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Azul de metileno 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0,5

Malonato de sodio 1%. 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0

Oxalato de sodio 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0

Extracto enzimático 1,0 0,5 1,0 1,5 1,0 1,0

Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1,0

VI. BIBLIOGRAFÍA. - MATHEWS C., VAN HOLDE K., AHERN K G. (2002). Bioquímica. 3 ed. Madrid: Addison Wesley. - PLUMMER, D. (1981). Bioquímica práctica. México: Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana. - NELSON, David. L. y COX, Michael. Lehninger. Principles of Biochemistry. 3 ed. New York: Worth Publischer, 1993.

PREINFORME E INFORME

Extracción y verificación de la actividad de las enzimas: succínico deshidrogenasa y citocromo oxidasa y estudio del efecto de algunos inhibidores Nombre __________________________Fecha __________________Grupo___ CUESTIONARIO PARA EL PREINFORME. En una hoja responda las siguientes preguntas 1- La ecuación de las reaciones que catalizan las enzimas a utilizar en la práctica. 2-Para los órganos a utilizar mencione brevemente si su metabolismo es más fermentativo (anaerobio) o aerobio, tenga en cuenta el color característico de los citocromos que hacen parte de la fosforilación oxidativa. 3- tabla con los valores de potencial redox para todos los componentes de la cadena respiratoria, así como del azul de metileno y la p-fenilendiamina, compuesto que se usarán para evidenciar la actividad de las enzimas citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa. 4- De acuerdo con el fundamento teórico de la guía y la bibliografía describa brevemente los cambios de color en el azul de metileno y la p-fenilendiamina cuando:

a- La citocromo oxidasa y la succínico deshidrogenasa se encuentran sin inhibidores. b- La citocromo oxidasa y la succínico deshidrogenasa se encuentran con los inhibidores (cianuro, azida, malonato u oxalato).

1. Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa Escriba las hipótesis con base en la consulta realizada en el preinforme ____________________________________________________________________________________________________________________________________ Diagrama de flujo

Diagrama de flujo

2. Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa Escriba las hipótesis con base en la consulta realizada en el preinforme ____________________________________________________________________________________________________________________________________ Diagrama de flujo

Fichas técnicas. Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio.

Nombre Fórmula Aspecto Peligrosi

dad*

Primeros auxilios y

medidas de higiene

Forma de

eliminación

*Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F),

extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N). Pictogramas SGA

PAUTAS PARA LA ELABORACIÓN DEL INFORME

Escribir los datos, observaciones y fotos debidamente tabulados. Haga un análisis de las observaciones de la práctica con citas Usando toda la información de su guía y preinforme:

- Explique el propósito de agregar cada reactivo y la tempertaura de incubación en cada caso. -Explique el tipo de inhibidores presentes en algunos tubos de ensayo y sus efectos. - Explique el efecto de la concentración de extracto enzimático en el ensayo que corresponda. -Para cada tubo de ensayo realice una figura diferente ilustrativa de la cadena respiratoria, con las siglas de cada componente y su secuencia, indique hasta dónde se llevo a cabo la fosforilación oxidativa, la ubicación del aceptor de electrones artificial (azul de metileno o p-fenilendiamina), de acuerdo con su potencial de reducción estándar(E°) y aclare si quedó oxidado o reducido de cauerdo con sus observaciones. -Compare y discuta qué tan aerobio o anaerbio es su tejido muestra y por lo tanto que rutas usa principalmente para la generación de energía. - Explique si se cumplieron o no las hipótesis planteadas.

Bibliografía con normas APA