La biopsia de músculo en las enfermedades mitocondriales: cuándo, donde y cómo

Técnica biopsia

Técnica biopsia

• Técnica Abierta: a menudo la técnica preferida

• Proporciona mayor cantidad de tejido: estudios bioquímicos (cadena respiratoria), moleculares (genética mitocondrial).

• Biopsias abiertas en adultos (generalmente anestesia local)/ Anestesia general se utiliza más en niños

• Debe extraerse un fragmento de músculo de aproximadamente 0,5-1 cm de longitud por 0,4 de grosor.

• Localización de biopsia importa menos en enfermedad mitocondrial (pero músculos con referencia)

Preparación muestra

• Gasa ligeramente humedecida.

• No formol.

• Bote de plástico pequeño en contenedor

refrigerado.

• Técnicas Histoquímicas: Tiempo desde la

extracción hasta la entrega (máximo 2-4 h).

• Especímenes adicionales para microscopía

electrónica (glutaraldehido), análisis

bioquímicos (cadena respiratoria), estudios

moleculares (mutaciones puntuales de

ADNmt, delecciones o depleción)

Técnicas Histoquímicas

• Hematoxilina-eosina

• Tricrómico

• PAS

• Oil Red O

• ATPasas pH 9.4, 4.6 y 4.3

• Técnicas enzimas oxidativos:

• -DPNH

• -SDH (Succínico Deshidrogenasa)

• -COX (Citocromo oxidasa)

ATPasa 4.3

Tipo II: Contracción rápida

Ejercicio de fuerza

Glicolisis anaerobia

Ricas en glucógeno

Tipo I: Contracción lenta, sostenida

Ejercicio de resistencia

Ac.grasos, ciclo Krebs

Ricas en lípidos y mitocondrias

I

II

I

Hemato

x-eosinaPas

TricrómicoOil Red O

Oil Red O

ATPasa pH 4.6

Técnicas Oxidativas

NADH COX

SDH

Diagnóstico

Estudio genético

Sanger

NGS (Next Generation Secuencing)Paneles, Exoma y Transcriptoma, Genoma

• El estudio histológico de enfermedad mitocondrial incluye las siguientes técnicas:

– HE

– Tricrómico Gomori (Fibra rojo-rota)

– SDH (Fibra azul-rota)

– COX

– Técnica combinada COX-SDH

Fibras rojo-rs

Tricromico Gomori

Fibras rojo-rotas

SDHCOX

SDH (succinato deshidrogenasa):

fibras “azul-rotas”

COX

COX

(Citocromo-c Oxidasa)

Combinada COX-SDH

Microscopia Electrónica

-Arquitectura anormal crestas-espirales-inclusiones paracristalinas.

• Biopsia muscular limitaciones de sensibilidad y especificidad: Falsos positivos y falsos negativos

• Un porcentaje definido de fibras RRF o COX-negativas (>5% mayores 50 y >2% mayores 50).

• Baja sensibilidad en niños y pacientes jóvenes.

• Los RRF también se pueden encontrar miopatiasinflamatorias, como la miositis por cuerpos de inclusión, miopatías tóxicas (estatinas y zidovudina), distrofia oculofaringea…

• CUANDO: La biopsia muscular a menudo son necesarias para definir el diagnóstico de pacientes con síntomas sugestivos de enfermedad mitocondrial, y en quienes la detección de mutación común inicial es negativo (heteroplasmia).

• DONDE: el diagnóstico de enfermedad mitoncondrial precisa estudio neuropatologico (morfológico e histoquímico), bioquímica y estudio genético. Se precisa centros donde se puedan realizar estos los estudios

• COMO: para los estudios histoquímicos se requiere tejido en congelación, el procesamiento tiene que ser idealmente en menos de 3-4 horas.

¿Cómo se debe preparar un segmento de nervio periférico para estudio anatomopatológico?

Biopsia Nervio

• Actualmente se realizan menos: mejora de estudios genéticos e inmunológicos fundamentalmente.

• Principales indicaciones: vasculitis, amiloidosis, casos atípicos de la neuropatía inflamatoria (como CIDP).

• Efectos secundarios: Déficit déficit sensitivo y, en algunos casos, dolor crónico.

• Por lo tanto, una biopsia de nervio debe realizarse solo cuando otros estudios de laboratorio, electrofisiológicos o genéticos no han podido aclarar la causa de la enfermedad

•La biopsia debe obtenerse de un nervio afectado

•El nervio sural el mas frecuentemente biopsiado

(nervio sensitivo puro)

•También otros nervios como el nervio peroneo

superficial+ biopsia de músculo adyacente

(aumenta sensibilidad en sospecha de vasculitis)

•La mielina es muy sensibles a daño mecánico:

Mucho cuidado en procedimiento quirúrgico de no

estirar o comprimir el nervio

Al nervio sural se accede haciendo una incisión en la piel entre maleolo externo y tendón de Aquiles. Se recomienda hacer la incisión en un punto que diste 2/3 del maleolo y 1/3 del tendón de Aquiles.

• La biopsia “fascicular” no

causa menos complicaciones o menos déficit

sensorial que la transección de todo el nervio.

Se recomienda biopsia de la sección transversal

completa del nervio.

• La longitud recomendada del segmento de la

biopsia es de 1- 5 cm.

• Técnicamente difícil: En hasta 4-10% de los

casos se confunde una vena con el sural nervio

El estudio neuropatológico del nervio debe incluir:

•Cortes para HE, histoquímica (rojo Congo, ZN…) e IHQ, sobre tejido fijado en glutaraldehído (o formol) e incluido en parafina.

• Cortes semifinos (azul toluidina)

• Microscopia Electrónica

• Preparaciones de fibras separadas,

• Estudios moleculares (preferentemente tejido congelación)

Nervio normal- N. suralBloque parafina

Nervio nor N. suralBloque parafina

Vasculitis

Amiloidosis

Bloque Parafina Cortes para HE, histoquímica e IHQ --sobre tejido fijado en glutaraldehído (o formol) e incluido en parafina--

• Las tinciones recomendadas incluyen H & E,Rojo Congo, Tioflavina, Tricrómico Gomori, elasticas van Gieson, Fite-Faraco (sospecha lepra).

• InmunoHistoqumica: neurofilamentos, CD45, CD3 y CD8, CD4 y CD20 y transtiretina.

• Osmio

Osmio

Cortes Semifinos: Azul Toluidina

• Imagen mucho más detallada con mayor resolución axones y vainas de mielina que secciones de parafina.

Cortes Semifinos: Azul Toluidina

• Imagen mucho más detallada con mayor resolución axones y vainas de mielina que secciones de parafina.

Microscopia Electrónica

Fibras amielínicas, descompactación mielina, desmielinización, depósitos amiloide o inclusiones patológicas (enfermedades depósito, tóxicos..)

Fibras separadas

• “Time-consuming” (al menos 100 fibras)• Desmielinización y remielinización, tomacula.. .

•Procesado del nervio :

1. Segmento se fija en glutaraldehido (se coloca el

nervio estirado sobre un cartón fino)

• Semifino (Azul toluidina)± corte ultrafino

(Microscopía electrónica)

• Inclusión en osmio (para ver mielina)

• Fibras separadas (también inclusión con osmio)

2. Un segmento fijado formol (se coloca el nervio

estirado sobre un cartón fino) (mejor para técnicas

IHQ)

3. Un segmento (opcional) congelar en isopentano

enfriado en nitrógeno líquido. ??????

• LO IDEAL: FRAGMENTO GLUTARALDEHIDO y FORMOL

• Si hay que elegir una: MEJOR GLUTARALDEHIDO (aunque algo peor para IHQ).

• Si se incluye en formol se pueden realizar algunos estudios pero limita técnicamente

• Se introduce en una solución de glutaraldehido al 2,5% (la solución comercial es generalmente al 25%, por lo que hay que diluirla 10 veces en tampón fosfato o cacodilato)

• Si se va a remitir a otro centro de referencia cerca: se puede enviar en fresco

¿Cuál es el papel de la biopsia cutánea en el diagnóstico de neuropatía de fibra fina?

• Cuantificar intra-epidérmicamentefibras nerviosas de pequeño diámetro, generalmente no mielinizadas, para estudio de Neuropatía de fibra Fina

• La Neuropatía de fibra fina (muchas veces dolorosa) no puede diagnosticarse por estudios de conducción nerviosa estándar (solo estudias fibras mielinizadas) y el diagnóstico es difícil de objetivar

• El objetivo no es un diagnóstico etiológico

• “Punch” cutáneo de 3 mm

• Mediante punzón circular tras anestesia local con lidocaína.

• Usualmente no requiere sutura posterior

• Son muy raras las complicaciones menores (sangrado, infección, etc.) son muy raros.

• La biopsia contiene la epidermisy dermis, incluidas las glándulas sudoríparas.

• En la mayoría de los casos, las biopsias de piel

se obtienen de la parte distal de la pierna (10

cm por encima del maléolo externo)

• En algunos casos también en la cara lateral

superior del muslo (20 cm por debajo

la espina ilíaca anterior).

• Por lo general, se obtienen biopsias de 3 a 4

mm de profundidad.

PREPARACIÓN DE BIOPSIA Y FIJACIÓN

• El fijador mas utilizado es paraformaldehído-lisina

peryodato (2% PLP).

• Tambien se utiliza fijador de Zamboni (paraformaldehído

al 2% y ácido pícrico).

• Se puede realizar fijación con FORMOL pero éste puede

dar fragmentación de las fibras nerviosas

aunque no afecta la medición de la densidad de

inervación.

PREPARACIÓN DE BIOPSIA Y FIJACIÓN

• Fijación durante 24 horas a 4 ° C.

• Cortes en serie con un criostato con cortes

verticales (bien orientados) de 40-50 μm

• Estudio Inmunohistoquímico con PGP9.5 para

examinar densidad de la fibra nerviosa

epidérmica

• El diagnóstico

precisión de la cuantificación de la fibra nerviosa

intraepidérmica en

SFN es alto, con tasas de sensibilidad y

especificidad de

alrededor del 90% (mucho mayor que QST:

Quantitative Sensory Testing, 46,9%)

• La biopsia se puede repetir para el seguimiento

para progresión de enfermedad o respuesta a

tratamiento

• Hay considerable

variación de edad y sexo correspondiente

(comparar los resultados

con los controles)

• También se pueden analizar la morfología

(dilataciones axón),

densidad del plexo subepidérmico y

inervación de glándulas sudoríparas

• Pero la correlación de estos parámetros con su

importancia clínica no están definidos y se

necesitan más estudios

¿Cuáles son los criterios diferenciales para meningioma atípico y meningioma maligno?

Meningioma atípico (grado II, OMS).Constituyen entre el 5-15% de todos los meningiomas.

CRITERIOS:

•Actividad mitótica ≥ 4 mitosis/10 campos de gran aumento (0,16 mm2)•Invasión parénquima cerebral •o cumplen al menos tres de los siguientes criterios:

– hipercelularidad, – Alto índice núcleo/citoplasma– Nucleolo prominente– Focos necrosis espontánea– Pérdida patrón

Mayores índices de recurrencia, que oscilan entre el 30-40%.Las variedades células claras y cordoide, también se consideran de grado II de la OMS

Grado III: Meningioma anaplásico (maligno) (grado III, OMS).

Representan entre el 1-3% de todos los casos.

CRITERIOS:

Histológicamente presentan:

• Índice mitóticos ≥ 20 mitosis/10 campos de gran aumento y/o

•Alta malignidad citológica (similar a carcinoma, melanoma, sarcoma)

•Suelen tener necrosis y Ki-67>20%

•Las variedades rabdoide y papilar, también se consideran de grado III de la OMS.

•Estos tumores tienen una notable tendencia a la invasión local,