DESCUBRIMIENTO, SÍNTESIS Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE LAS TIAZOLOQUINAZOLINAS COMO POTENTES INHIBIDORES DE CD38

Sergio Ávila B.Gregory Díaz A.

Daniela Mardones V.

INTRODUCCIÓN

NAD

Nicotinamida adenina dinucleotido es sintetizada a partir del triptófano y/o de la nicotinamida más niacina; determina el estado redox mitocondrial y citosolico y participa en el monitoreo del estado metabolico de la celula.

Además es sustrato de diversas enzimas, donde se consume, en el proceso de donación de ADP-ribosa a moléculas aceptoras

INTRODUCCIÓN

CD38

CD38 o ADP ribosil ciclasa cataliza la ruptura de NAD.

La inhibición de esta traería como consecuencia aumentar los niveles de NAD

¿Cuándo se necesita inhibir CD38?

En algunas enfermedades las cuales tengan disminuidos los niveles de NAD como en la obesidad, o en el envejecimiento. Y en aquellas que tengan una sobreexpresión del CD38

Además hay un ligamiento genético entre el gen que contiene CD38 y el síndrome metabolico que sugiere que las enfermedades relacionadas con el síndrome metabolico pueden ser objetivos de los inhibidores de CD38

INHIBIDORES DE CD38 En literatura se encuentran varios informes de pequeñas moléculas inhibidoras de CD38. Sin embargo, muchos de estos compuestos poseen actividad inhibidora moderada a débil contra la enzima (IC50> 1 M) y/o tienen selectividad limitada.

Se logró descubrir el compuesto 1 con un IC50 = 1,21 uM:

CD38 tiazol screening hit

NUEVOS INHIBIDORES CD38

Compuesto 1 (IC50: 1,21uM)

Compuesto 3b (IC50: 1,20 uM)

El trabajo de síntesis fue dirigido inicialmente hacia el núcleo bicíclico y la sustitución en la posición 4 del compuesto 1. Los estudios de modelos sugieren que la carboxamida en la posición 3 era perjudicial para la potencia debido a las pobres interacciones con el residuo W176.

Compuesto 2 (IC50: 298nM)

Tiazoloquinolina Tiazoloquinazolina

QUÍMICA

A pesar de que el anillo quinolina es 4 veces mas potente que el compuesto 1, los autores deciden por facilidad y rapidez de síntesis trabajar el SAR de las quinazolinas

1°trabajo de síntesis fue de tiazoquinazolinas 4- amino sustituidas a partir de 6-bromo-4-cloroquinazolina

a) RNH2, rt, CH3CN b) PdCl2·dppf·CH2Cl2, 5-tributylstannyl thiazole, DMF a 100°-140°C

QUÍMICA

Se amplió la investigación a análogos de quinazolin(on)as C8 y C2 sustituidas.

La síntesis de ambos compuestos tiene dos pasos fundamentales:

1. La formación de la quinazolina

2. La formación de la 6- tiazoquinazolina 4-amino sustituida

SÍNTESIS QUINAZOLINAS C8 SUSTITUIDAS

e

f) R2NH2, rt, CH3CN

g) PdCl2·dppf·CH2Cl2, 5-tributylstannyl thiazole, DMF a 100°-140°C

d) HCONH2, 165°C

e) SOCl2, DMF (cat)

SÍNTESIS 2-QUINAZOLINONA Para la posición C2 se encontró que la incorporación de un grupo amino entrega una potente inhibición a CD38, pero la mayoría de los compuestos tienen una baja solubilidad y/o permeabilidad. Un grupo funcional más productivo resultó ser el residuo hidroxilo, que por equilibrio ceto-enólico queda como cetona en la posición 2.

c) iPr2NEt, R2NH2, iPrOH

e) CuI, K2CO3, PdCl2·dppf·CH2Cl2, 5-tributylstannyl thiazole, DMF a 100°-140°C

a) urea, melt

b) POCl3, 105°C

b

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Fue construido un modelo de unión utilizando una estructura cristalina hCD38 con E226Q proteina mutante, unido a nicotinamida mononucleotido (NMN)

Por remoción del anillo de nicotinamida el sustrato intermediario de ribosa fue modelado dentro del sitio de unión de hCD38 creando un modelo hCD38/complejo intermediario ribosa.

HCD38

Hay evidencia en compuestos similares a esta serie de que el nitrógeno del anillo del tiazol puede estar envuelto en una reacción catalítica reversible y de corta duración con sustratos intermediarios producidos por CD38.

El Anillo tiazol esté pre-orientado en el sitio catalitico hCD38 de tal forma que el nitrógeno quede cerca de la posición 1’ del intermediario ribosa 5 fosfato

1’

HCD38 – COMPUESTO 3B Mayoria de la afinidad de enlace puede ser debido a interacciones pi-pi entre el anillo tiazolfenil del nucleo biciclico y el indol de W189

Aunque no hay evidencia en este modelo, T221 puede formar puentes de hidrogeno con el nitrógeno 4-amino proporcionando una afinidad de enlace adicional, aquellos sin hidrogeno del 4-amino fueron menos activos siendo oxigeno y heteroatomos de azufre unos de ellos.

Filtrado inicial: inhibidores con IC50<0.1uM. Aunque si tenían menor potencia y buenas propiedades para estudios in vivo se consideraban.

SAR PARA C4

R IC50 humanos (uM)

IC50 ratones (uM)

4-(1-imidazol)-fenil

0.46 0.026

4- CONH2-fenil 0.56 0.024

2-Me-fenil 12.8 0.065

Comp. 1 1.21 0.205

Comp. 3b 1.20 0.032

R IC50 humanos (uM)

IC50 ratones (uM)

Cis-2-metilciclohexil

0.049 0.012

Trans-4-CONH2-ciclohexil

0.078 0.009

4-piperidinil >30.2 0.275

Comp. 1 1.21 0.205

Comp. 3b 1.20 0.032

AnilinasAminas alifaticas

SAR PARA C2 Y C8R1 R2 R3 X IC50

humano (uM)

IC50 ratones (uM)

Permeabilidad (nm/s)

CH3 Trans-4-MeO-ciclohexil

OH N 0.026 0.001

CH3 3-Cl-4-F-fenil OH N 0.028 0.004 ND

CH3 3-Cl-4-F-fenil H N 0.206 0.010

H Trans-4-MeO-ciclohexil

OH NMe

0.053 0.008 47

H Trans-4-OCH2CH2OCH3-ciclohexil

OH NMe

0.064 0.008 30

OCH3

3-Cl-4-F-fenil H N 4.71 0.009

Tiene la potencia necesaria para las enzimas humanas como de ratones, pero sus propiedades fisicoquimicas son pobres en solubilidad y permeabilidad para realizar un estudio in vivo.Así, se incorporarán sustituyentes que mantengan la potencia mientras mejoran las propiedades fisicoquímicas necesarias para realizar el estudio in vivo

EN RESUMEN… SAR:

Sustitución C4

Amina alifática>amina aromatica

Sustitución para>meta>orto

Alifáticos estereoquímica trans>cis PERO si está sustituido en 2 y es hidrofóbico no aplica

Sustitución C2 y C8

C2 con carbonilo>CH3>H

C8 con CH3CF3>OCH3>H

QUINOLINAS

R1 R2 R3 IC50 humano (uM)

IC50 ratones (uM)

Permeabilidad (nm/s)

H H Trans-4-CONHMe-ciclohexil

0.0034 0.0009 <3.0

H Me Trans-4-CONHMe-ciclohexil

0.0048 0.0011 9.9

Me Me Trans-4-CONHMe-ciclohexil

0.0053 0.00078 21

H Me 4-piranil 0.089 0.015 200

Me Me Trans-4-OCH3-ciclohexil 0.015 0.0014 300

H Et Trans-4-OCH2CH2OMe-ciclohexil

0.054 0.0052

R2: CH3 mejor propiedad farmacoquímicaR2: CH2CH3reduce potenciade enzima humana

MODELO ACOPLAMIENTO

Compuesto con R-amino(C4): éter. La fraccion 4-metoxietoxil puede incrementar las interacciones hidrofobicas entre éste grupo y W176.

El residuo C2 (C=O) que podria formar puentes de hidrogenos con N183 es incapaz de esto por la distancia inadecuada y el bajo Angulo y el grupo amida de N183 esta formando puentes de hidrogeno en una critica loop-estabilizacion con un residuo de cadena principal (C180), por lo que no esta disponible para interactuar con el inhibidor.

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS Y FARMACOCINETICASCompuesto

(quinolinas)Permeabilidad (>100 nm/s)

Solubilidad (>100 uM)

Criterio ChromLogD (<4.0)

78b 200 350 2.37

78c 162 >364 3.22

79c 195 >323 3.54

79d 300 >340 3.47Comp. Dosis

(mg/Kg)Vía Clearence (mL/min/Kg) Vd

(L/Kg)T1/2 (h)

78b 30 v.o 44.7 1.2 ND

78c 30 v.o 21 1.3 3.5

2 i.V 5.3

79c 10 v.O 8.9 0.32 1.3

1 i.V 0.46

79d 30 v.O 33.4 1.1 3.2

ESTUDIO IN VIVO

Para maximizar la absorción oral se ocupó una mezcla de 5%solutol:95%vehículo la cual incrementó 15 veces la absorción del compuesto 78c.

Se utilizaron ratones con una dieta alta en grasas (obesos), ya que este modelo demostró tener bajos niveles de NAD al comparar con uno control.

NIVELES DE NAD CON INHIBIDOR CD38

Se administró el compuesto 78c y se observaron los cambios de NAD en hígado y músculo (gastrocnemio)

Estudios validaron la hipótesis que la inhibición de CD38 modulan los niveles de NAD elevándolos in vivo.

CONCLUSION

Los investigadores fueron capaces de identificar series de quinazolinas inhibidoras de cd38 que hasta ahora no habían tenido precedentes de la potencia detallada partir del SAR del compuesto 1

La molécula 78c fue encontrada no solo un muy buen potente inhibidor si no que también poseía buenas propiedades fisicoquímicas, fue capaz de elevar el NAD en hígado y gastrocnemio (gemelos) cuando fue administrado oralmente en ratones obesos.

CONCLUSION

La identificación y desarrollo de este pequeño potente inhibidor permitirá establecer un detallado análisis de como elevar las concentraciones de NAD cuando se encuentra en estados de déficit, que afecta a toda la fisiología del cuerpo, además estos estudios ayudan en la aproximación para encontrar un tratamiento para la terapia de déficit de NAD.

SECCIÓN EXPERIMENTAL

- Todos los productos químicos y disolventes comerciales fueron de grado reactivo y fueron usados sin purificación adicional a menos que se especificara lo contrario.

- Todas las reacciones excepto aquellas en medios acuosos se llevaron a cabo con el uso de técnicas estándar para la exclusión de humedad

- Las reacciones se controlaron mediante cromatografía en capa fina (TLC)

- Los compuestos finales fueron normalmente purificados por cromatografía flash en gel de sílice

- La pureza analítica se evaluó por cromatografía líquida UltraPerformance de fase inversa (RP-UPLC)

SECCIÓN EXPERIMENTAL

4-(((1r,4r)-4-(2-Metoxietoxi)ciclohexil)amino)-1-metil-6-(tiazol-5-il)quinolin-2(1H)-ona (78c)

4-cloro-1-metil-6-(tiazol-5-il) quinolin-2 (1H) -ona 73 (0,14 g, 0,506 mmol), (1R, 4R) -4-(2-metoxietoxi) ciclohexanamina (0,175 g, 1,01 mmol), y iPr2NEt (0,25 ml, 1,43 mmol) en CH3CN (1,0 ml) y NMP (1 ml) fueron calentados a 180 ° C durante 10 h. La solución se diluyó con EtOAc y se lavó con agua (2 veces) y salmuera.

Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron, y se concentraron bajopresión reducida. El residuo se cromatografió eluyendo con un gradiente de 2 a 10% de MeOH / DCM.

Se recuperó un aceite de color marrón como 4 (((1R, 4R) -4- (2-metoxietoxi) ciclohexil) amino) -1-metil-6- (tiazol-5-il) quinolin-2 (1H) -ona (87,3 mg, 0,201 mmol).