Microsoft Word - 01 presentacion.docEvaluación de la estabilidad química por el
método de vida de estante de una emulsión O/A de G-1.
AUTORA: Yusmilany Legón Herranz. TUTORES: Dr.C. Luis Ramón Bravo Sánchez. Ms.C. Miguel Ángel Alba de Armas.
Santa Clara 2009
Yusmilany Legón Herranz.
Evaluación de la estabilidad química por el método de vida de estante de una emulsión O/A  de G­1.    
PENSAMIENTO
Solo una cosa vuelve un sueño imposible: el miedo a fracasar.
Cuando alguien desea algo, debe saber que corre riesgos y por eso
la vida vale la pena.
“Paulo Coélho”
Yusmilany Legón Herranz.
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DEDICATORIA
Dedico este triunfo que hoy es mi graduación a todas esas
personas maravillosas que han estado a mi lado durante todo este
tiempo.
A mi mamita querida, por regalarme ese preciado tesoro que es la
vida, por permitirme ser quien soy, estar a mi lado, guiarme hacia
el mejor camino y brindarme todo el amor del mundo.
A mi padre y a mi hermano, aunque ya no estén presentes, están
en mi corazón y se que ellos deseaban que este día llegara, eso me
dió la fuerza necesaria para seguir adelante.
A toda mi familia, por darme la opotunidad de ser una mejor
persona cada día y se que han estado esperando ansiosamente
este momento.
Agradecimientos
Yusmilany Legón Herranz.
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AGRADECIMIENTOS
A todos los que de una forma u otra han hecho posible la
realización de este trabajo de diploma.
A mi madre por brindarme su apoyo incodicional, por todo el
esfuerzo y sacrificio que ha tenido que hacer para darme al
menos lo necesario.
A mi enorme familia por ofrecerme siempre lo que han tenido a su
alcance.
A mi novio por su gran ayuda, paciencia y comprensión, por
estar presente en los momentos más hermosos de mi vida y de
esta forma llenarme de felicidad.
A mis tutores Miguel Angel Alba de Armas y Luis Ramón Bravo
Sánchez por su gran colaboración durante el desarrollo de este
trabajo.
A los técnicos Adalberto, Venancio, Anita, Onelis y Maria por su
atención y apoyo en todo momento que me fue necesario.
A todos mis profesores por haberme formado durante todos estos
años de carrera.
A mis compañeros de aula por permitirme compartir con ellos
todos los momentos agradables que pasamos a lo largo de estos
años y de esta forma aportar también su granito de arena en mi
formación como profesional.
Yusmilany Legón Herranz.
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A todas mis amistades por dedicarme al menos un segundo de su
preciado tiempo.
A todos;
“Muchas Gracias”
Yusmilany Legón Herranz.
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RESUMEN. Se empleó una técnica de Cromatografía de Gases Capilar para la determinación
cuantitativa de G-1 en una emulsión oleoacuosa (O/A). Se utilizó para la separación
cromatográfica una columna capilar, nitrógeno como gas portador y un detector de
ionización por llama. Se optimizaron las condiciones cromatográficas hasta lograr una
alta eficacia en la separación. Se sometieron diferentes muestras de la emulsión a
condiciones drásticas de degradación: oxidación (H 2 O
2 al 3 %), hidrólisis ácida (HCl 1
mol/L), luz natural y temperatura (60 ºC durante 4 horas), posteriormente se analizaron
dichas muestras por la técnica antes mencionada, no observándose en los
cromatogramas obtenidos interferencia alguna al tiempo de retención del G-1. Se
concluye que la técnica analítica de Cromatografía de Gases Capilar es capaz de arrojar
resultados satisfactorios, ya que es específica para el desarrollo de estudios de
estabilidad de la emulsión. Se evaluó la estabilidad química por el método de vida de
estante de la emulsión mediante esta técnica, obteniéndose a los 10 días una
degradación del 5% de G-1, por lo que se propone este tiempo como el periodo de vida
útil de la emulsión.
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ÍNDICE
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1.5. Aspectos relacionados con la validación de técnicas analíticas………. 9 1.5.1. Especificidad para estudios de estabilidad.……………………………… 10 2. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………. 11 2.1. Técnica de elaboración para la emulsión de G-1…………………………. 11 2.2. Método analítico empleado para la cuantificación del G-1 en la emulsión (Cromatografía de Gases Capilar)……………………………………..
12
2.3. Especificidad de la técnica analítica mediante Cromatografía de gases para la estabilidad…………………………………………………………………….
13
2.4. Evaluación de la estabilidad, por el método de vida de estante……….. 14 2.4.1. Evaluación de la estabilidad química…………………………………….. 14 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………. 15 3.1 Determinación del contenido de G-1 en la emulsión……………………… 15 3.2. Evaluación de la especificidad para estabilidad de la emulsión……….. 17 3.3. Estudio de Estabilidad por vida estante……………………………………. 20 CONCLUSIONES……………………………………………………………………… 22 RECOMENDACIONES……………………………………………………………….. 23 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS………………………………………………… 24
Introducción
Yusmilany Legón Herranz.
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1
INTRODUCCION.
Resulta de vital importancia para la industria farmacéutica cubana el desarrollo de nuevos
ingredientes farmacéuticos activos (IFAs) a partir de materias primas de producción
nacional, con el objetivo de sustituir importaciones y disminuir los costos en la
elaboración de los medicamentos.
El ingrediente farmacéutico activo (IFA) G-1 (1-(5-bromofur-2-il)-2-bromo-2-nitroeteno)
[1], que se fabrica en el Centro de Bioactivos Químicos (CBQ) de la Universidad Central
“Marta Abreu” de Las Villas, se ha utilizado en la elaboración de medicamentos de uso
humano (Dermofural®) y veterinario (Queratofural®), así como en el desarrollo de un
esterilizante químico (Vitrofural®).
En el departamento de farmacia se desarrolló una emulsión O/A de G-1 para reconstituir
al inicio del tratamiento de la piodermitis y micosis cutáneas, formulación compuesta por
una fase oleosa que contiene dicho IFA, el span 20 como emulgente y el aceite mineral
como vehículo oleoso y una fase acuosa compuesta por tween 80 como emulgente y
agua como vehículo acuoso. En trabajos precedentes se desarrolló y validó una técnica
analítica de cromatografía en capa fina con elución para cuantificar el G-1 en el
concentrado emulsionable (fase oleosa) y en la emulsión, la cual resultaba trabajosa y
con un tiempo de análisis relativamente largo. Se empleó además dicha técnica para
evaluar la estabilidad de la emulsión reconstituida, obteniéndose a los 16 días una
degradación del 10% de G-1, tomándose este tiempo como el periodo de vida útil de esta
formulación. [2]
Para garantizar la calidad y estabilidad de un medicamento, resulta imprescindible contar
con técnicas analíticas que permitan la cuantificación del IFA en un tiempo relativamente
breve y a través de procedimientos sencillos y confiables; con este fin se suelen utilizar
las técnicas cromatográficas y en especial, la cromatografía de gases es el método de
elección para compuestos volátiles y termoestables como es el caso del G-1, la cual
permite lograr con facilidad la especificidad necesaria para el buen funcionamiento del
método de análisis.[3]
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En trabajos anteriores se desarrollaron y validaron técnicas de cromatografía de gases
con columna empacada [4] y cromatografía de gases capilar [5] para el control de la
calidad del concentrado emulsionable (fase oleosa de la emulsión), realizandose esta
última con un cromatógrafo de gases capilar acoplado a una computadora, permitiendo
así separaciones más eficaces y procesamiento de áreas más confiable,
respectivamente.
Teniendo en cuenta la confiabilidad y eficacia de la técnica de cromatografía de gases
capilar y las normativas actuales [6, 7] en relación al porciento de degradación del IFA
permitido (5%), se hace necesario evaluar nuevamente la estabilidad de la emulsión.
Estos antecedentes conducen a plantear el siguiente problema científico:
No se conoce el periodo de vida útil de la emulsión O/A de G-1 de acuerdo a las
normativas vigentes. [6, 7]
Hipótesis: es posible establecer el periodo de vida útil de la emulsión de G-1, de acuerdo
a las normativas vigentes [6, 7] si se utiliza para ello la cromatografía de gases capilar.
Por todo lo anterior el presente trabajo propone los siguientes objetivos:
Objetivo general:
Determinar el período de vida útil de la emulsión de G-1 al 0,233% en fase oleosa
mediante la técnica de cromatografía de gases capilar.
Objetivos específicos:
1. Evaluar la técnica de cromatografía de gases capilar desarrollada con anterioridad bajo
las nuevas condiciones de laboratorio existentes.
2. Determinar la especificidad de dicha técnica para estudiar la estabilidad de la
formulación.
3. Evaluar la estabilidad química de la formulación (emulsión) por el método de vida de
estante.
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1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 1.1. Generalidades sobre el G-1. 1.1.1. Actividad biológica. El 1-(5-bromofur-2-il)-2-bromo-2-nitroeteno (G-1) es un agente antibacteriano y antifúngico
de amplio espectro que ha sido empleado y registrado en forma de ungüento oftálmico de
uso veterinario (Queratofural) para el tratamiento de la queratitis y otras oftalmias
infecciosas, en forma de crema (Dermofural) de uso humano para el tratamiento de
piodermitis primaria y pitiriasis versicolor, dermatomicosis y candidiasis en piel. [1]
1.1.2. Propiedades químico-físicas. El G-1 posee la siguiente estructura química:
O CHBr C Br
Dicha estructura fue dilucidada mediante las técnicas espectroscópicas: ultravioleta visible,
infrarroja, resonancia magnética nuclear, espectrometría de masas y difracción de rayos X,
por la cual se determinó, además, su configuración espacial en estado cristalino y en
disolución [8] lo cual facilitó llevar a cabo un estudio teórico sobre la relación estructura
actividad biológica. [9]
La fórmula global del G-1 es C6H3Br2NO3 y su masa molar de 296,924 g/mol. Su obtención
se realizó a partir del 2-fur-2-il-2-nitroeteno el cual se conoce como inhibidor del crecimiento
de bacterias y hongos. [10]
El G-1 es un sólido cristalino de color amarillo naranja y de olor característico. Su
temperatura de fusión se encuentra entre 89 y 92°C. Es muy fácilmente soluble en
dimetilformamida, fácilmente soluble en éter etílico, cloroformo, dimetilsulfóxido y benceno,
soluble en tetracloruro de carbono y polietilenglicol-400, poco soluble en metanol absoluto,
etanol absoluto y etanol 90 grados, difícilmente soluble en etanol 70 grados, éter de petróleo
40-60oC, n-hexano y muy difícilmente soluble en agua. Posee características de ácido débil
con un pKa estimado en el intervalo de 9-10. De acuerdo al valor experimental de su
Capítulo I. Revisión Bibliográfica.
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coeficiente de reparto, expresado como log P, en la mezcla octanol / agua igual a 2,927, se
puede afirmar que es una sustancia fuertemente liposoluble.[11]
1.2. Emulsiones farmacéuticas. Una emulsión es una dispersión heterogénea de un líquido en otro líquido, inmiscibles entre
ellos, el primero se encuentra dispersado en forma de gotículas (fase interna) en el seno del
otro (fase continua). Los diámetros de las gotas líquidas que se encuentran dispersas están
en el intervalo de 0,1 y 20 µm. Las emulsiones pueden ser de aceite en agua (O/A) o de
agua en aceite (A/O). [12]
Las emulsiones farmacéuticas contienen uno o varios IFAs que generalmente se encuentran
disueltos en la fase interna, aunque pudieran estar en fase continua. Un componente
esencial en estos preparados lo constituyen los agentes emulsificantes que tienen como
función fundamental la disminución de la tensión interfasal y/o prevenir la coalescencia.
Otras sustancias auxiliares presentes en estos sistemas pueden ser los agentes
preservantes, los cuales son indispensables solo en emulsiones O/A. Además, las
emulsiones farmacéuticas pudieran contener antioxidantes, aromatizantes, colorantes,
espesantes, saborizantes, edulcorantes, etc. [12, 13]
Los preparados farmacéuticos, que se administran en forma de emulsión, pueden
comercializarse con todos sus componentes incorporados o en forma de concentrados
emulsionables, esto trae consigo un aumento de la estabilidad, al igual que en el caso de las
suspensiones que se expenden en forma de polvo para reconstituir. [2]
1.2.1. Reología de las emulsiones. La viscosidad es la resistencia a fluir que muestra un líquido, es decir, la resistencia al
movimiento de sus moléculas, denominado flujo. [12]
Isaac Newton encontró la ley elemental de la viscosidad que describe el comportamiento de
un líquido ideal:
τ = μ . Dr
μ - viscosidad dinámica (poise)
Capítulo I. Revisión Bibliográfica.
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Dr- velocidad de cizalla (1/segundo).
Hay numerosos factores que influyen en la viscosidad de una emulsión, entre ellos:
* viscosidad de la fase dispersante
* distribución del tamaño de gotículas
* concentración volumétrica de la fase dispersante
* naturaleza del agente emulsificante y de la película interfacial
* potencial electrostático
* viscosidad de la fase interna
Existe una gran correlación entre la viscosidad y el tamaño de los glóbulos.[2] La apariencia
de la emulsión puede ser función del tamaño del glóbulo como se muestra a continuación:
Tamaño de la gota (μm) Apariencia
>0,005 Transparente
energía mecánica (agitación vigorosa) para interponer las fases, estas se separan
rápidamente. La emulsificación y estabilización de una mezcla de líquidos inmiscibles
depende del balance hidrófilo-lipófilo (HLB), y de los agentes emulsificantes, compuestos
que se adsorben en la interfase líquida aceite - agua disminuyendo la tensión interfásica.
Más importante aún es su actuación como barrera mecánica frente a la agregación de las
gotículas de la fase interna. [14]
El tipo de emulsión que se tiende a formar depende del balance entre las propiedades
hidrófilas e hidrófobas del agente emulsificante.[15]
Los agentes emulsificantes tienen un valor asignado de HLB que varía de 1 a 20 y se ha
encontrado que las emulsiones A/O están comprendidas en un intervalo de HLB de 3 a 6 y
para emulsiones O/A el HLB se encuentra entre 8 y 18.
Capítulo I. Revisión Bibliográfica.
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Un buen agente emulsificante debe poseer ciertas propiedades para que pueda propiciar
una buena emulsión. Estas propiedades son:
* Debe reducir la tensión entre las dos fases (tensión interfasal).
* Debe estabilizar la emulsión, por lo cual no debe alterar la energía eléctrica de las fases.
Es por esto que un agente emulsificante no debe ser un electrólito, a no ser en casos
especiales.
* Debe ser estable por sí mismo respecto a los demás componentes de la formulación.
Los emulgentes más importantes son los tensoactivos, los coloides hidrófilos y ciertas
partículas sólidas. Las sustancias tensoactivas pueden tener características iónicas o no
iónicas; la actividad de estas últimas reside en la molécula entera; como ejemplo se puede
citar el tween 80 y el span 20. Los coloides hidrofílicos son capaces de emulsificar por
formación de una barrera hidrofílica que favorece las emulsiones directas, además,
aumentan la viscosidad del producto, un ejemplo típico lo constituye la goma arábiga. [14]
1.3. Estabilidad de productos farmacéuticos. 1.3.1. Generalidades. La estabilidad de los productos farmacéuticos representa un importante eslabón en el
desarrollo y formulación de toda forma terminada. De esta manera se pueden definir las
condiciones de almacenamiento en el envase propuesto y establecer su vida útil. Estos
estudios contemplan la conservación de la potencia, pureza, características organolépticas y
su efectividad en el tiempo.
Se define como estabilidad de un producto farmacéutico la capacidad del mismo de
mantener las especificaciones de calidad establecidas tanto del IFA, como de otros
ingredientes presentes en la formulación. [16]
1.3.2. Estudios de estabilidad. Estudios de estabilidad a largo plazo. Los estudios de estabilidad son pruebas que se efectúan para obtener información sobre
las condiciones en las que se deben procesar y almacenar las materias primas, los
productos semielaborados o los productos terminados, según sea el caso. Las pruebas de estabilidad también se emplean para determinar la vida útil del medicamento en su envase
primario original y en condiciones de almacenamiento especificadas. [17]
Capítulo I. Revisión Bibliográfica.
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Los estudios de estabilidad a largo plazo (tiempo real) son aquellos en los que se evalúan
las características físicas, químicas, biológicas o microbiológicas del medicamento durante
el período de validez, bajo condiciones controladas de almacenamiento. Estos estudios
deben llevarse a cabo teniendo en cuenta las especificaciones establecidas para la zona
climática donde se realicen. [17, 18]
El estudio de estabilidad de un medicamento debe incluir las pruebas requeridas para cada
forma farmacéutica. En el caso de las emulsiones se recomienda evaluar la concentración
del IFA y las características organolépticas, entre otras.
Todos los estudios deben llevarse a cabo en muestras contenidas en el envase primario
para determinar si existe alguna interacción entre ellos, que afecte la estabilidad del
producto. [19]
1.4. Los métodos cromatográficos. Cromatografía de gases: novedades y aplicaciones. La cromatografía en sus variadas modalidades se ha convertido en la técnica por excelencia
en los estudios de control de calidad y estabilidad de medicamentos debido a su gran
selectividad, ya que permite la separación del analito del resto de los componentes de la
formulación para que puedan ser identificados y cuantificados no solo los IFAs sino también
los productos de descomposición. [3]
La cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de separación: es
aplicable a cualquier mezcla soluble o volátil. La elección de una técnica cromatográfica
concreta dependerá de la naturaleza, cantidad de la muestra, del objetivo de la separación y
de las limitaciones de tiempo. [20]
Las técnicas instrumentales como la Cromatografía de Gases y la Cromatografía Líquida de
Alta Eficacia, han permitido ampliar las posibilidades analíticas, ya que con ellos es posible
la cuantificación de cantidades que pueden estar incluso en el nivel de los picogramos.
La cromatografía de gases se emplea actualmente, como método de separación con fines
tanto analítico como preparativo, debido a su fundamento simple, por la sencillez de su manejo, por la rapidez con que se efectúan las separaciones, su bajo costo y porque en la
mayor parte de los casos la separación y la precisión alcanzables son altamente
satisfactorias. [3]
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Esta cromatografía permite la separación de compuestos orgánicos e inorgánicos
térmicamente estables y volátiles. La fase móvil es un gas portador que contiene vapores de
la muestra a analizar y atraviesa la fase estacionaria a velocidad constante. [20]
Para la detección de los analitos que eluyen separados de la columna cromatográfica se
emplean varios tipos de detectores, dentro de los cuales el más utilizado para el análisis de
compuestos orgánicos es el de ionización por llama (FID); el mismo permite obtener una
respuesta proporcional a la concentración de la sustancia en cuestión, que se traduce en el
área bajo la curva de un pico cromatográfico. Mediante el uso de técnicas computarizadas
esta integral puede ser determinada exactamente y sustituye los métodos de integración
manual en cromatogramas registrados sobre papel.
Una vez determinadas las áreas de los picos en el cromatograma se procede a emplear
alguno de los métodos de cuantificación disponibles, entre los cuales puede citarse:
Normalización del área, Estándar externo y Estándar interno. Este último es el método
empleado para eliminar, fundamentalmente, los errores de inyección. El estándar interno es
normalmente una sustancia que eluye en condiciones cercanas a la sustancia de análisis y
es bien resuelta [3]; para el caso del G-1, la sustancia que más se ha utilizado como
estándar interno es el benzoato de bencilo. [4,5]
La Cromatografía de Gases fue utilizada para la cuantificación de G-1 en el concentrado
emulsionable, empleando para la separación cromatográfica una columna rellena de baja
polaridad (Columna SE-30 al 1,5% sobre Chromosorb W 80-100 mesh de 1,5 m de longitud
y 4mm de diámetro interno), de limitada eficacia, nitrógeno como gas portador y un
detector de ionización por llama [4]. Esta técnica analítica, pero empleando una columna
capilar (de mayor eficacia), fue también empleada para la cuantificación del G-1 en el
concentrado emulsionable. [5]
1.5. Aspectos relacionados con la validación de técnicas analíticas. La validación de un método analítico es el proceso en el cual queda establecido, por
estudios experimentales, que la capacidad del método satisface los requisitos para la
aplicación analítica deseada.[21]
Capítulo I. Revisión Bibliográfica.
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Para llevar a cabo la validación de una técnica analítica, deben evaluarse aquellos
parámetros de desempeño que permitan argumentar la confiabilidad de las determinaciones
que se realicen a través de ella.
El Proceso de Validación de Técnicas Analíticas se define como el establecimiento de
evidencia documentada de que un procedimiento analítico (método de ensayo) conducirá,
con un alto grado de seguridad, a la obtención de resultados precisos y exactos, dentro de
especificaciones de calidad previamente establecidas. [22]
Otra definición más completa de validación es la siguiente: “el proceso establecido para la
obtención de pruebas, convenientemente documentadas, demostrativas de que un proceso
de fabricación o método de control es lo suficientemente fiable para producir el resultado
previsto dentro de intervalos definidos”. [23]
Las características de funcionamiento o desempeño de un método analítico comprenden
todos los datos y resultados experimentales que demuestran su aptitud para el uso al que se
destina. Se consideran, en general, las siguientes características de funcionamiento:
* Practicabilidad: tienen en cuenta si el procedimiento analítico es fácil o difícilmente
realizable en la práctica.
* Idoneidad: tienen en cuenta los parámetros, por ejemplo los relacionados con la
eficacia (número de platos teóricos, resolución, etc.), que garantizan que el sistema
responda, en el momento del análisis, a los requisitos fijados en la validación del método.
* Fiabilidad: son las características que demuestran la capacidad de un método analítico
para mantener a lo largo del tiempo criterios fundamentales de validación.
La fiabilidad comprende los cinco criterios fundamentales de validación no necesariamente
aplicables en todos los casos: linealidad, precisión, exactitud, sensibilidad y especificidad.
[23]
1.5.1. Especificidad para estudios de estabilidad. La especificidad es la capacidad de detectar al analito sin interferencias de ningún otro
compuesto que forme parte de su matriz [23], estas pueden incluir impurezas, productos de
degradación, etc.
• Identificación: para garantizar la identidad de un analito.
Capítulo I. Revisión Bibliográfica.
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• Pruebas de pureza: para garantizar que todos los procedimientos analíticos
realizados permiten una precisa declaración del contenido de impurezas de un analito, es
decir, sustancias relacionadas como; metales pesados, disolventes residuales, etc.
• Ensayo (contenido o potencia): para proporcionar un resultado exacto, que permite
una precisa declaración sobre la potencia o el contenido del analito en una muestra [24]
La especificad del método de análisis es un atributo o propiedad, por la cual la respuesta
obtenida corresponde exclusivamente al compuesto que se desea detectar y cuantificar, sin
ninguna interferencia por parte de los demás componentes de la muestra. La especificidad
del método de análisis para los estudios de estabilidad es una condición sin la cual no se
justifica la validación del los demás atributos del método. [25]
Capítulo II: Materiales y Métodos
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- aceite mineral (calidad farmacéutica)
- span 20 (calidad farmacéutica)
- tween 80 (calidad farmacéutica)
- ácido sulfúrico (disolución al 33,3%) (UNI-CHEM®)
- agua destilada.
- Balanza Analítica Digital Boeco (Alemania)
- Refrigerador LG (China)
- Desecadora.
- Cristalería común de laboratorio.
2.1. Técnica de elaboración para la emulsión de G-1. Se pesa en balanza analítica, con exactitud (error de ± 0,1 mg); 1,0476g de span 20;
0,0373g de G-1 y 14,9224g de aceite mineral. Una vez pesados se lleva el G-1 y el aceite
Mineral al recipiente contenedor del span y se le aplica ultrasonido en baño ultrasónico
Capítulo II: Materiales y Métodos
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por 30 min, hasta lograr la homogeneidad del producto (concentrado emulsionable o fase
oleosa).
Luego, se procede a elaborar la fase acuosa que contiene 0,4476g de tween 80 y
13,4851g de agua destilada. Se disuelve el tween 80 en el agua destilada, se añade la
fase acuosa sobre la oleosa con agitación manual, quedando así, constituida la emulsión.
Se envasa bajo constante agitación en frascos de vidrio de color ámbar. [2]
2.2. Método analítico empleado para la cuantificación del G-1 en la emulsión (Cromatografía de Gases Capilar). El G-1 contenido en la formulación se determinó por Cromatografía de Gases Capilar [5],
a través del método de patrón interno, el cual se basa en la separación del G-1 (IFA) del
resto de los componentes de la formulación así como de sus impurezas y productos de
degradación, usando para ello una columna capilar y su detección para la cuantificación
mediante la ionización por llama.
• Condiciones Cromatográficas - Columna capilar: sílice fundida. Longitud 30 m, diámetro interno 0,53 mm, fase
estacionaria: 5% fenil metilpolisiloxano.
15ºC/min hasta 230ºC (10 min).
- Gas portador: Nitrógeno. Presión 7,1 psi. Velocidad de Flujo: 6 mL/min.
- Inyector: Split-Splitless (modo splitless: tiempo de spliless: 1min). Temperatura de
Inyección: 230ºC. Volumen de inyección: 1 µL
- Detector: Ionización por llama (280ºC)
- Gases auxiliares: Hidrógeno y aire para cromatografía.
• Procedimiento
Preparación de la disolución de estándar interno.
Se toman 0,05 mL de benzoato de bencilo, se transfieren a un matraz de 25 mL, se
completa el volumen con n-hexano y se homogeniza la disolución. Disolución A.
Capítulo II: Materiales y Métodos
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Preparación la disolución de referencia de G-1.
Se pesan con exactitud aproximadamente 10 mg de G-1, sustancia de referencia. Se
toma 1 mL de la disolución A, se transfieren a un matraz de 10 mL, se completa el
volumen con n-hexano y se homogeniza la disolución. Disolución B (Debe protegerse de
la luz).
Preparación de la disolución de la muestra de ensayo.
Se transfiere la emulsión a tubos de centrífuga y se centrifuga a 10 000 rpm durante 30
min. Se pesan con exactitud aproximadamente 4,3 g de la fase oleosa, se toma 1 mL de
disolución A y se transfieren a un matraz aforado de 10 mL, se completa el volumen con
n-hexano y se homogeniza la disolución (Debe protegerse de la luz). Una vez registrado
el cromatograma e integrado los picos, se realizan los cálculos mediante la siguiente
expresión:
Pm: peso de la muestra en gramos
Rp: cociente de la respuesta del patrón
Rm: cociente de la respuesta de la muestra
0,2: factor de dilución
2.3. Evaluación de la especificidad de la técnica analítica de Cromatografía de gases para la estabilidad. Con el objetivo de evaluar la especificidad del método se analizaron muestras sometidas
a condiciones drásticas de degradación como: hidrólisis ácida (HCl 1 mol/L), oxidación
(H 2 O
2 al 3%), temperatura (60 ºC) y exposición a la luz natural (debido a que el IFA es
fotosensible). Además se analizó la degradación del IFA por la presencia de agua en la
formulación en una muestra dejada en reposo durante 15 días.
Preparación de las disoluciones de las muestras a degradadas.
Capítulo II: Materiales y Métodos
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Oxidación: Se toma una muestra de aproximadamente 16 g del concentrado
emulsionable, se coloca en frascos de color ámbar, se le adiciona 10 mL de peróxido de
hidrógeno (H 2 O
2 ) al 3 % y se agita vigorosamente durante 5 minutos.
Hidrólisis ácida: Se toma una muestra de aproximadamente 16 g del concentrado
emulsionable, se coloca en frascos de color ámbar, se le adiciona 10 mL de HCl 1 mol/L
y se agita vigorosamente durante 5 minutos.
Ambas muestras se transfieren a tubos de centrífuga y se centrifuga a 10 000 rpm
durante 30 minutos.
Luz natural: Se coloca en un frasco incoloro aproximadamente 16 g del concentrado
emulsionable y se mantiene bajo el efecto de la luz solar directa durante un período de
tiempo de 6 horas.
Temperatura: Se toma una muestra de 16 g de concentrado emulsionable en un frasco
de color ámbar y se coloca en una estufa a 60 ºC durante un periodo de tiempo de 4
horas.
Degradación por la presencia de agua: Se prepara la emulsión, se coloca en un frasco de
color ámbar y se deja reposar a temperatura ambiente durante 15 días.
A continuación se procede según la metodología descrita en el epígrafe 2.2.
2.4. Evaluación de la estabilidad por el método de vida de estante. Para el estudio se elaboran tres lotes de emulsión, a escala de laboratorio, se envasan
en frascos de vidrio ámbar de 15 mL con tapa de baquelita de rosca, se colocan en una
desecadora saturada con una disolución de ácido sulfúrico al 33,3%, [26] lo que garantiza
una humedad relativa (HR) de un 65% y se almacenan a 30°C en una estufa. [6,7]
2.4.1. Evaluación de la estabilidad química. Se determina el contenido de G-1 en las muestras a los tiempos; cero, 3, 6, 10 y 15 días
de elaboradas, a través de la técnica de cromatografía de gases capilar descrita en el
epígrafe 2.2.
Se evalúa, además, los caracteres organolépticos para cada uno de los tiempos
establecidos para el análisis.
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3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 3.1 Determinación del contenido de G-1 en la emulsión.
El desarrollo de la técnica analítica se efectuó basado en los estudios realizados a la
materia prima (IFA G-1) [27] y la técnica de Cromatografía de Gases [4,5], desarrollada
previamente para la cuantificación de G-1 en el concentrado emulsionable.
Primeramente se inyectó el patrón bajo las siguientes condiciones:
- Columna capilar: sílice fundida. Longitud 30 m, diámetro interno 0,53 mm, fase
estacionaria: 5% fenil metilpolisiloxano.
(8min), 15ºC/min hasta 230ºC (10 min).
- Gas portador: Nitrógeno. Presión 6,1psi. Velocidad de Flujo: 5 mL/min.
- Inyector: Split-Splitless (modo splitless: tiempo de spliless: 1min). Temperatura de
Inyección: 230ºC. Volumen de inyección: 1 µL
- Detector: Ionización por llama (280ºC)
- Gases auxiliares: Hidrógeno y aire para cromatografía.
Dichas condiciones son iguales en cuanto a temperatura del horno y modo de
operación a la técnica desarrollada con anterioridad para el concentrado emulsionable.
[5]
El cromatograma obtenido se observa en la siguiente figura (figura 2):
Capítulo III. Resultados y Discusión.
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Figura 2: Cromatograma del patrón de G-1 a las condiciones de análisis descritas.
Como se puede apreciar los picos poseen buenas características pero el tiempo de
retención puede ser mejorado (disminuido) incrementando ligeramente la velocidad de
flujo del gas portador. El cromatograma obtenido bajo las nuevas condiciones es el
siguiente (figura 3):
Figura 3: Cromatograma del patrón de G-1 bajo las nuevas condiciones de análisis.
Velocidad de flujo 6 mL/min. Presión 7, 1 psi.
Como se observa en el cromatograma, se logró el efecto esperado de disminución de
los tiempos de retención, lo que contribuye a disminuir el tiempo total de análisis.
El aumento del flujo provoca un incremento en la velocidad lineal del avance del analito
por la columna cromatográfica; esto puede favorecer la eficacia de la separación
Capítulo III. Resultados y Discusión.
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(según la teoría dinámica) [3] ya que se contribuye a disminuir, entre otros aspectos,
los fenómenos de dispersión en fase móvil.
Se inyectó la muestra bajo las mismas condiciones de análisis y se obtuvo un
cromatograma con características adecuadas. (Figura 4).
Figura 4: Cromatograma de la muestra de ensayo bajo las nuevas condiciones.
Como se puede apreciar la separación del G-1 y su estándar interno del resto de los
componentes es adecuada.
Estas son las condiciones óptimas de análisis, bajo la cuales se ha de desarrollar el
presente trabajo.
3.2. Evaluación de la especificidad para estabilidad de la emulsión. Mediante la técnica de Cromatografía de Gases Capilar se evaluó la especificidad para
la estabilidad de la emulsión, bajo las condiciones descritas con anterioridad.
La figura 5 muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del método.
Se observa en los cromatogramas correspondientes a las muestras sometidas a
condiciones drásticas de exposición a la luz (A), temperatura (B), oxidación (C) e
hidrólisis ácida (D), una degradación parcial del IFA G-1, atribuible en el caso de la luz
y la temperatura a la posible formación de radicales libres en los carbonos olefínicos, lo
que conlleva a una pérdida de esa insaturación y por ende de la conjugación, trayendo
como resultado la disminución de la intensidad del color que se observó. En presencia
Capítulo III. Resultados y Discusión.
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de peróxidos la muestra puede sufrir degradación debido a la posible formación de
epóxidos, por reacción del enlace vinílico. En la reacción con HCl puede ocurrir adición
al doble enlace de la cadena lateral, lo que implicaría una pérdida de conjugación y por
tanto de color; el no percibir este cambio puede estar atribuido a la interacción del ácido
con el grupo nitro favoreciendo la forma aci. Para la muestra analizada por la presencia
de agua en la formulación (E), se observa la aparición de tres picos secundarios, a los
1,6; 2,3 y 3,7 min aproximadamente, atribuible a posibles productos de degradación,
los cuales no interfieren en la determinación del IFA.
A
B
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C
D
E
Figura 5: Resultados del estudio de especificidad del método. A: cromatograma de la
muestra degradada por exposición a la luz; B: cromatograma de la muestra degradada
por la temperatura; C: cromatograma de la muestra degradada por oxidación; D:
cromatograma de la muestra sometida a hidrólisis
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ácida HCl 1mol/L; E: cromatograma de la muestra analizada por la presencia de agua
en la formulación.
Los resultados obtenidos en este estudio, demuestran la especificidad del método, al
no presentarse interferencias de picos adicionales en la zona de elución del producto
principal y su estándar interno.
3.3. Estudio de Estabilidad por vida estante. Al analizar los caracteres organolépticos a lo largo del estudio, no se detectaron
variaciones significativas en cuanto a color, olor y aspecto general.
Los resultados de los análisis cuantitativos (concentración de IFA en la fase oleosa de
la emulsión) de los tres lotes en el estudio de estabilidad química por vida de estante a
los tiempos 0, 3, 6, 10 y 15 días, se exponen en la tabla 1:
Tabla # 1. Resultados del estudio de estabilidad por el método de vida de estante de la
emulsión de G-1 (concentración nominal de G-1 en fase oleosa: 0,233%).
Tiempo
0 0,2259
t (95% de confianza y 2 grados de libertad) = 2,92
Los intervalos de confianza se calculan según la expresión n
st × .
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Como se observa, la concentración del ingrediente farmacéutico activo G-1 disminuye
con el tiempo, una vez preparada la emulsión, bajo las condiciones de almacenamiento
descritas en el epígrafe 2.4.
A los 15 días de almacenamiento la degradación del G-1 es superior al 5% [6,7] por lo
que se decide considerar como período de vida útil 10 días, a temperatura ambiente y
protegida de la luz, para la emulsión después de elaborada.
Este resultado concuerda con el obtenido en trabajos anteriores, mediante la técnica de
cromatografía en capa delgada con elución, donde a los 9 días de almacenamiento la
degradación del G-1 era inferior al 5%. [2]
Conclusiones
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CONCLUSIONES.
1. La técnica de cromatografía de gases capilar, bajo las nuevas condiciones de
laboratorio resultó ser adecuada.
2. La técnica empleada es específica para el estudio de la estabilidad química de la
emulsión de G-1 al 0,233% en fase oleosa.
3. La formulación en estudio (emulsión) es estable, según los criterios establecidos,
durante un período de 10 días después de elaborada, en frascos de vidrio ámbar con
tapa de baquelita de rosca a condiciones ambientales.
Recomendaciones
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RECOMENDACIONES. 1. Valorar la utilización de un envase secundario con vistas a mejorar la foto
estabilidad de la formulación y la incorporación de algún agente antioxidante a la misma.
Bibliografía
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02 Pensamiento.pdf
03 Dedicatoria.pdf
04 agradecimientos.pdf
05 Resumen.pdf
06 Indice.pdf
07 Introducción.pdf
11 Conclusiones.pdf
12 Recomendaciones.pdf
13 Bibliografía.pdf