facultad de química y farmacia. departamento de
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Facultad de Quiacutemica y Farmacia
Departamento de Licenciatura en Quiacutemica
Tiacutetulo Empleo de un extracto acuoso de ureasa obtenido a partir de la soya en la
determinacioacuten de urea en sangre
Autora Taimi de la Caridad Boffill Morrell
Tutores
Dra PT Neibys Casdelo Gutieacuterrez
MSc PA Eugenio R Martiacutenez Albelo
2
Dedicatoria
A mi mamaacute a papaacute Rolando y a mi hermana por siempre estar ahiacute cuando los necesito y
haberme apoyado en estos 5 antildeos de sacrificio guiaacutendome para que pueda alcanzar mis
suentildeos
A Victor por estar siempre conmigo y ser la luz de mi vida
A Baacuterbara y Pelli mis segundos padres por su gran apoyo incondicional
A Ela Lia y Marce por ser mis segundos hermanos por sus consejos y amor
A mis compantildeeros de aula por todo lo que hemos compartido durante estos antildeos juntos
A mis tutores Neibys y Eugenio por su paciencia dedicacioacuten e inteligencia
A todos
Gracias por confiar en miacute
3
Agradecimientos A mis tutores Neibys y Eugenio por guiarme por transmitirme sus conocimientos
A todos los profesores por educarme y mostrarme el mundo de la quiacutemica
A mi mamaacute y Rolando por ensentildearme la importancia de la perseverancia y darme todo su
amor
A Victor por ser mi fuerza y refugio
A Ela Lia y Marce por su amistad incondicional
A mis compantildeeros de aula por convertir estos antildeos en los mejores de mi vida
A todos aquellos que hicieron posible este resultado
Muchas gracias
4
RESUMEN
En este trabajo se desarrolloacute la extraccioacuten de la ureasa presente en el frijol de soya con el
empleo de cuatro teacutecnicas (Meacutetodo de Lorenc Meacutetodo de Schosinsky Meacutetodo salting- in y
Meacutetodo de Donal y Van Slyke) A partir de una evaluacioacuten cualitativa y cuantitativa de la
actividad enzimaacutetica y tomando como referencia los valores reportados por la literatura se
concluyoacute que los mejores resultados fueron los ofrecidos por el extracto de Lorenc Se
estudioacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima ureasa del extracto obtenieacutendose los
paraacutemetros Vmaacutex igual 3125 mmolL y Km igual 16710-1
molL a una temperatura de
40 oC y pH igual a 7 Se determinoacute cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se
comparoacute con la actividad de la enzima ureasa comercial procedieacutendose a aplicar el extracto
a muestras de plasma sanguiacuteneo no presentaacutendose diferencias significativas entre ambas
enzimas para ambos ensayos La caracterizacioacuten del extracto mediante la determinacioacuten de
proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret mostroacute una concentracioacuten de albuacutemina de 867
mgL y 2083 mgL de globulina El estudio de estabilidad reveloacute que el extracto es estable
por 7 diacuteas
5
ABSTRACT
In this work the extraction of the present urease was developed in the soybean with the
employment of four techniques (Method of Lorenc Method of Schosinsky Method salting
- in and Method of Donal and Van Slyke) Starting from a qualitative and quantitative
evaluation of the enzymatic activity and taking like reference the values reported by the
literature we concluded that the best results were those offered by the extract of Lorenc
The kinetics was studied to the reaction with the enzyme urease of the extract being
obtained the parameters Vmaacutex same 3125 mmolL and same Km 16710-1
molL to a
temperature of 40 oC and pH similar to 7 It was determined the activity quantitatively for
this extract and it was compared with the activity of the enzyme commercial urease being
proceeded to apply the extract to samples of sanguine plasm not presenting differs
significant among both enzymes for both rehearsals The characterization of the extract by
means of the determination of total proteins for the method of Biuret showed a
concentration of albumin of 867 mgL and 2083 mgL of globulin The study of stability
revealed that the extract is stable for 7 days
6
Iacutendice
Introduccioacuten 1
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica 4
11 La soya 4
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca () 5
121 Funciones de las Enzimas 6
122 Composicioacuten y estructura 6
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica 8
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica 8
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas 9
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa) 14
131 Estructura de la ureasa 15
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa 16
14 La urea como sustancia quiacutemica 17
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas 17
142 Estructura 17
143 Obtencioacuten 17
144 Aplicaciones de la urea 18
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo 18
151 Reaccioacuten de Berthelot 18
152 Reaccioacuten de Nessler 18
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre 19
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 19
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer) 19
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE 20
17 Procesos de extraccioacuten 20
18 Proteiacutenas 21
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas 21
7
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad 22
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos 23
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya 23
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008) 23
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003) 24
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velazquez 1998) 25
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008) 25
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya 26
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica 26
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico 28
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya 31
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero 35
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya 37
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales 37
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya 40
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales 40
261 Presentacioacuten de los resultados 40
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten 41
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya 41
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica 42
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya 48
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica 48
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica 49
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
50
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa 55
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo 59
341 Anaacutelisis estadiacutestico 60
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya 63
8
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido 63
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya 63
Conclusiones 65
Recomendaciones 66
Anexos 67
Bibilografiacutea 77
1
Introduccioacuten
El hombre excreta el exceso de nitroacutegeno resultante de la degradacioacuten metaboacutelica de los
aminoaacutecidos y otros compuestos nitrogenados mediante el ciclo de la urea Este ciclo es
una viacutea metaboacutelica de cinco pasos la cual resulta en la conversioacuten de dos moleacuteculas de
amoniacuteaco y una de hidroacutegeno carbonato en urea La urea como producto final se sintetiza
en el hiacutegado luego se secreta a la sangre y finalmente es captada por los rintildeones para
excretarla en la orina La siacutentesis inadecuada de la urea provoca la acumulacioacuten de
amoniacuteaco en las ceacutelulas del organismo generando la aparicioacuten de enfermedades El
diagnoacutestico de estos desoacuterdenes consiste en la medicioacuten de urea en sangre y orina lo que
permite poder realizar un diagnoacutestico y tratamiento acertados de las enfermedades
Existen varias teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la urea reportaacutendose los siguientes
meacutetodos la hidroacutelisis de la urea titulacioacuten con sales mercuacutericas y precipitacioacuten de la urea
con una disolucioacuten alcohoacutelica de xantidrol Ademaacutes de los meacutetodos que emplean la
diacetilmonoxima y p-dimetilamino-benzaldehiacutedo cuyo fundamento es la formacioacuten de un
compuesto coloreado Sin embargo los meacutetodos maacutes empleados son aquellos que se basan
en la formacioacuten de compuestos coloreados mediante reacciones enzimaacutetico-colorimeacutetricas
como son las reacciones de Nessler la de Betherlot y la de Betherlot modificada siendo
esta uacuteltima la utilizada en los laboratorios cliacutenicos mediante un diagnosticador que permite
cuantificar los niveles de urea en suero presentado por la Empresa de Produccioacuten de
Bioloacutegicos Carlos J Finlay (La Habana Cuba) que cuenta con un reactivo liofilizado de
ureasa el cual encarece su produccioacuten y solo es estable durante 7 diacuteas una vez restituido
La posibilidad de contar con un reactivo enzimaacutetico en disolucioacuten estable es uno de los
elementos que hariacutean maacutes sencillo este proceso de faacutecil y raacutepida ejecucioacuten por lo que una
forma de poder ofrecer este servicio a la poblacioacuten por maacutes tiempo seriacutea la sustitucioacuten del
liofilizado de ureasa por una disolucioacuten de ureasa estable Este anaacutelisis fue llevado a cabo
por (Borges 2014) quieacuten propuso el desarrollo de una formulacioacuten estable de ureasa liacutequida
para la determinacioacuten de urea en sangre sin embargo esta no se comercializa en Cuba
La ureasa (urea amidohidrolasa) es una enzima que se encuentra en muchas plantas
fundamentalmente en las leguminosas Se reportan trabajos que estudian el proceso de
extraccioacuten de esta enzima a partir de fuentes naturales como por ejemplo semillas de soya
frijoles jack garbanzos lentejas etc Ademaacutes en la industria de alimentos se controla la
2
cantidad de ureasa presente en los productos derivados de la soya precisamente por el
efecto inhibidor que produce sobre las propiedades nutritivas que aportan las proteiacutenas
Este estudio permite tener en cuenta la forma en que se produce esta reaccioacuten enzimaacutetica
para otros usos donde el objetivo sea emplear la ureasa para determinar urea en otras
muestras
Especiacuteficamente en la provincia de Villa Clara un grupo de especialistas de la sala de
cuidados intensivos del hospital provincial Arnaldo Miliaacuten Castro han mostrado intereacutes en
la evaluacioacuten de urea en sangre por la importancia de esta determinacioacuten en la deteccioacuten de
enfermedades donde la vinculacioacuten con la Facultad de Quiacutemica y Farmacia de la
Universidad Central Marta Abreu de Las Villas ha abierto nuevas posibilidades de
estudiar la temaacutetica
Basado en estos resultados previos y en la necesidad de encontrar alternativas que permitan
sustituir el reactivo de ureasa liofilizado en los laboratorios cliacutenicos para la evaluacioacuten de la
urea presente en muestras de suero sanguiacuteneo se identifica el siguiente problema cientiacutefico
Problema cientiacutefico iquestEs posible el uso del extracto de ureasa obtenido del frijol de soya
para la determinacioacuten de urea en sangre
Para la solucioacuten del problema se planea la siguiente hipoacutetesis
Si se demuestran las propiedades enzimaacuteticas del extracto de soya obtenido es posible su
empleo en la determinacioacuten de urea en sangre
Objetivo General
Extraer la ureasa presente en el frijol de soya para su uso en la determinacioacuten de urea en
muestras de sangre
Objetivos especiacuteficos
1 Extraer la ureasa presente en el frijol de soya
2 Determinar cualitativa y cuantitativa la actividad enzimaacutetica de la ureasa presente en
el extracto obtenido
3 Realizar el estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica empleando el extracto de soya
3
4 Evaluar la concentracioacuten de urea en muestras de sangre empleando el extracto de
soya
5 Caracterizar preliminarmente el extracto obtenido a partir de la soya
4
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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Action and Metabolism Voet amp Voet
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2
Dedicatoria
A mi mamaacute a papaacute Rolando y a mi hermana por siempre estar ahiacute cuando los necesito y
haberme apoyado en estos 5 antildeos de sacrificio guiaacutendome para que pueda alcanzar mis
suentildeos
A Victor por estar siempre conmigo y ser la luz de mi vida
A Baacuterbara y Pelli mis segundos padres por su gran apoyo incondicional
A Ela Lia y Marce por ser mis segundos hermanos por sus consejos y amor
A mis compantildeeros de aula por todo lo que hemos compartido durante estos antildeos juntos
A mis tutores Neibys y Eugenio por su paciencia dedicacioacuten e inteligencia
A todos
Gracias por confiar en miacute
3
Agradecimientos A mis tutores Neibys y Eugenio por guiarme por transmitirme sus conocimientos
A todos los profesores por educarme y mostrarme el mundo de la quiacutemica
A mi mamaacute y Rolando por ensentildearme la importancia de la perseverancia y darme todo su
amor
A Victor por ser mi fuerza y refugio
A Ela Lia y Marce por su amistad incondicional
A mis compantildeeros de aula por convertir estos antildeos en los mejores de mi vida
A todos aquellos que hicieron posible este resultado
Muchas gracias
4
RESUMEN
En este trabajo se desarrolloacute la extraccioacuten de la ureasa presente en el frijol de soya con el
empleo de cuatro teacutecnicas (Meacutetodo de Lorenc Meacutetodo de Schosinsky Meacutetodo salting- in y
Meacutetodo de Donal y Van Slyke) A partir de una evaluacioacuten cualitativa y cuantitativa de la
actividad enzimaacutetica y tomando como referencia los valores reportados por la literatura se
concluyoacute que los mejores resultados fueron los ofrecidos por el extracto de Lorenc Se
estudioacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima ureasa del extracto obtenieacutendose los
paraacutemetros Vmaacutex igual 3125 mmolL y Km igual 16710-1
molL a una temperatura de
40 oC y pH igual a 7 Se determinoacute cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se
comparoacute con la actividad de la enzima ureasa comercial procedieacutendose a aplicar el extracto
a muestras de plasma sanguiacuteneo no presentaacutendose diferencias significativas entre ambas
enzimas para ambos ensayos La caracterizacioacuten del extracto mediante la determinacioacuten de
proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret mostroacute una concentracioacuten de albuacutemina de 867
mgL y 2083 mgL de globulina El estudio de estabilidad reveloacute que el extracto es estable
por 7 diacuteas
5
ABSTRACT
In this work the extraction of the present urease was developed in the soybean with the
employment of four techniques (Method of Lorenc Method of Schosinsky Method salting
- in and Method of Donal and Van Slyke) Starting from a qualitative and quantitative
evaluation of the enzymatic activity and taking like reference the values reported by the
literature we concluded that the best results were those offered by the extract of Lorenc
The kinetics was studied to the reaction with the enzyme urease of the extract being
obtained the parameters Vmaacutex same 3125 mmolL and same Km 16710-1
molL to a
temperature of 40 oC and pH similar to 7 It was determined the activity quantitatively for
this extract and it was compared with the activity of the enzyme commercial urease being
proceeded to apply the extract to samples of sanguine plasm not presenting differs
significant among both enzymes for both rehearsals The characterization of the extract by
means of the determination of total proteins for the method of Biuret showed a
concentration of albumin of 867 mgL and 2083 mgL of globulin The study of stability
revealed that the extract is stable for 7 days
6
Iacutendice
Introduccioacuten 1
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica 4
11 La soya 4
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca () 5
121 Funciones de las Enzimas 6
122 Composicioacuten y estructura 6
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica 8
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica 8
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas 9
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa) 14
131 Estructura de la ureasa 15
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa 16
14 La urea como sustancia quiacutemica 17
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas 17
142 Estructura 17
143 Obtencioacuten 17
144 Aplicaciones de la urea 18
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo 18
151 Reaccioacuten de Berthelot 18
152 Reaccioacuten de Nessler 18
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre 19
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 19
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer) 19
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE 20
17 Procesos de extraccioacuten 20
18 Proteiacutenas 21
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas 21
7
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad 22
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos 23
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya 23
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008) 23
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003) 24
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velazquez 1998) 25
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008) 25
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya 26
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica 26
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico 28
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya 31
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero 35
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya 37
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales 37
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya 40
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales 40
261 Presentacioacuten de los resultados 40
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten 41
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya 41
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica 42
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya 48
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica 48
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica 49
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
50
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa 55
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo 59
341 Anaacutelisis estadiacutestico 60
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya 63
8
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido 63
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya 63
Conclusiones 65
Recomendaciones 66
Anexos 67
Bibilografiacutea 77
1
Introduccioacuten
El hombre excreta el exceso de nitroacutegeno resultante de la degradacioacuten metaboacutelica de los
aminoaacutecidos y otros compuestos nitrogenados mediante el ciclo de la urea Este ciclo es
una viacutea metaboacutelica de cinco pasos la cual resulta en la conversioacuten de dos moleacuteculas de
amoniacuteaco y una de hidroacutegeno carbonato en urea La urea como producto final se sintetiza
en el hiacutegado luego se secreta a la sangre y finalmente es captada por los rintildeones para
excretarla en la orina La siacutentesis inadecuada de la urea provoca la acumulacioacuten de
amoniacuteaco en las ceacutelulas del organismo generando la aparicioacuten de enfermedades El
diagnoacutestico de estos desoacuterdenes consiste en la medicioacuten de urea en sangre y orina lo que
permite poder realizar un diagnoacutestico y tratamiento acertados de las enfermedades
Existen varias teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la urea reportaacutendose los siguientes
meacutetodos la hidroacutelisis de la urea titulacioacuten con sales mercuacutericas y precipitacioacuten de la urea
con una disolucioacuten alcohoacutelica de xantidrol Ademaacutes de los meacutetodos que emplean la
diacetilmonoxima y p-dimetilamino-benzaldehiacutedo cuyo fundamento es la formacioacuten de un
compuesto coloreado Sin embargo los meacutetodos maacutes empleados son aquellos que se basan
en la formacioacuten de compuestos coloreados mediante reacciones enzimaacutetico-colorimeacutetricas
como son las reacciones de Nessler la de Betherlot y la de Betherlot modificada siendo
esta uacuteltima la utilizada en los laboratorios cliacutenicos mediante un diagnosticador que permite
cuantificar los niveles de urea en suero presentado por la Empresa de Produccioacuten de
Bioloacutegicos Carlos J Finlay (La Habana Cuba) que cuenta con un reactivo liofilizado de
ureasa el cual encarece su produccioacuten y solo es estable durante 7 diacuteas una vez restituido
La posibilidad de contar con un reactivo enzimaacutetico en disolucioacuten estable es uno de los
elementos que hariacutean maacutes sencillo este proceso de faacutecil y raacutepida ejecucioacuten por lo que una
forma de poder ofrecer este servicio a la poblacioacuten por maacutes tiempo seriacutea la sustitucioacuten del
liofilizado de ureasa por una disolucioacuten de ureasa estable Este anaacutelisis fue llevado a cabo
por (Borges 2014) quieacuten propuso el desarrollo de una formulacioacuten estable de ureasa liacutequida
para la determinacioacuten de urea en sangre sin embargo esta no se comercializa en Cuba
La ureasa (urea amidohidrolasa) es una enzima que se encuentra en muchas plantas
fundamentalmente en las leguminosas Se reportan trabajos que estudian el proceso de
extraccioacuten de esta enzima a partir de fuentes naturales como por ejemplo semillas de soya
frijoles jack garbanzos lentejas etc Ademaacutes en la industria de alimentos se controla la
2
cantidad de ureasa presente en los productos derivados de la soya precisamente por el
efecto inhibidor que produce sobre las propiedades nutritivas que aportan las proteiacutenas
Este estudio permite tener en cuenta la forma en que se produce esta reaccioacuten enzimaacutetica
para otros usos donde el objetivo sea emplear la ureasa para determinar urea en otras
muestras
Especiacuteficamente en la provincia de Villa Clara un grupo de especialistas de la sala de
cuidados intensivos del hospital provincial Arnaldo Miliaacuten Castro han mostrado intereacutes en
la evaluacioacuten de urea en sangre por la importancia de esta determinacioacuten en la deteccioacuten de
enfermedades donde la vinculacioacuten con la Facultad de Quiacutemica y Farmacia de la
Universidad Central Marta Abreu de Las Villas ha abierto nuevas posibilidades de
estudiar la temaacutetica
Basado en estos resultados previos y en la necesidad de encontrar alternativas que permitan
sustituir el reactivo de ureasa liofilizado en los laboratorios cliacutenicos para la evaluacioacuten de la
urea presente en muestras de suero sanguiacuteneo se identifica el siguiente problema cientiacutefico
Problema cientiacutefico iquestEs posible el uso del extracto de ureasa obtenido del frijol de soya
para la determinacioacuten de urea en sangre
Para la solucioacuten del problema se planea la siguiente hipoacutetesis
Si se demuestran las propiedades enzimaacuteticas del extracto de soya obtenido es posible su
empleo en la determinacioacuten de urea en sangre
Objetivo General
Extraer la ureasa presente en el frijol de soya para su uso en la determinacioacuten de urea en
muestras de sangre
Objetivos especiacuteficos
1 Extraer la ureasa presente en el frijol de soya
2 Determinar cualitativa y cuantitativa la actividad enzimaacutetica de la ureasa presente en
el extracto obtenido
3 Realizar el estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica empleando el extracto de soya
3
4 Evaluar la concentracioacuten de urea en muestras de sangre empleando el extracto de
soya
5 Caracterizar preliminarmente el extracto obtenido a partir de la soya
4
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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3
Agradecimientos A mis tutores Neibys y Eugenio por guiarme por transmitirme sus conocimientos
A todos los profesores por educarme y mostrarme el mundo de la quiacutemica
A mi mamaacute y Rolando por ensentildearme la importancia de la perseverancia y darme todo su
amor
A Victor por ser mi fuerza y refugio
A Ela Lia y Marce por su amistad incondicional
A mis compantildeeros de aula por convertir estos antildeos en los mejores de mi vida
A todos aquellos que hicieron posible este resultado
Muchas gracias
4
RESUMEN
En este trabajo se desarrolloacute la extraccioacuten de la ureasa presente en el frijol de soya con el
empleo de cuatro teacutecnicas (Meacutetodo de Lorenc Meacutetodo de Schosinsky Meacutetodo salting- in y
Meacutetodo de Donal y Van Slyke) A partir de una evaluacioacuten cualitativa y cuantitativa de la
actividad enzimaacutetica y tomando como referencia los valores reportados por la literatura se
concluyoacute que los mejores resultados fueron los ofrecidos por el extracto de Lorenc Se
estudioacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima ureasa del extracto obtenieacutendose los
paraacutemetros Vmaacutex igual 3125 mmolL y Km igual 16710-1
molL a una temperatura de
40 oC y pH igual a 7 Se determinoacute cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se
comparoacute con la actividad de la enzima ureasa comercial procedieacutendose a aplicar el extracto
a muestras de plasma sanguiacuteneo no presentaacutendose diferencias significativas entre ambas
enzimas para ambos ensayos La caracterizacioacuten del extracto mediante la determinacioacuten de
proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret mostroacute una concentracioacuten de albuacutemina de 867
mgL y 2083 mgL de globulina El estudio de estabilidad reveloacute que el extracto es estable
por 7 diacuteas
5
ABSTRACT
In this work the extraction of the present urease was developed in the soybean with the
employment of four techniques (Method of Lorenc Method of Schosinsky Method salting
- in and Method of Donal and Van Slyke) Starting from a qualitative and quantitative
evaluation of the enzymatic activity and taking like reference the values reported by the
literature we concluded that the best results were those offered by the extract of Lorenc
The kinetics was studied to the reaction with the enzyme urease of the extract being
obtained the parameters Vmaacutex same 3125 mmolL and same Km 16710-1
molL to a
temperature of 40 oC and pH similar to 7 It was determined the activity quantitatively for
this extract and it was compared with the activity of the enzyme commercial urease being
proceeded to apply the extract to samples of sanguine plasm not presenting differs
significant among both enzymes for both rehearsals The characterization of the extract by
means of the determination of total proteins for the method of Biuret showed a
concentration of albumin of 867 mgL and 2083 mgL of globulin The study of stability
revealed that the extract is stable for 7 days
6
Iacutendice
Introduccioacuten 1
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica 4
11 La soya 4
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca () 5
121 Funciones de las Enzimas 6
122 Composicioacuten y estructura 6
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica 8
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica 8
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas 9
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa) 14
131 Estructura de la ureasa 15
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa 16
14 La urea como sustancia quiacutemica 17
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas 17
142 Estructura 17
143 Obtencioacuten 17
144 Aplicaciones de la urea 18
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo 18
151 Reaccioacuten de Berthelot 18
152 Reaccioacuten de Nessler 18
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre 19
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 19
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer) 19
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE 20
17 Procesos de extraccioacuten 20
18 Proteiacutenas 21
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas 21
7
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad 22
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos 23
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya 23
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008) 23
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003) 24
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velazquez 1998) 25
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008) 25
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya 26
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica 26
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico 28
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya 31
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero 35
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya 37
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales 37
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya 40
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales 40
261 Presentacioacuten de los resultados 40
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten 41
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya 41
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica 42
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya 48
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica 48
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica 49
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
50
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa 55
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo 59
341 Anaacutelisis estadiacutestico 60
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya 63
8
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido 63
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya 63
Conclusiones 65
Recomendaciones 66
Anexos 67
Bibilografiacutea 77
1
Introduccioacuten
El hombre excreta el exceso de nitroacutegeno resultante de la degradacioacuten metaboacutelica de los
aminoaacutecidos y otros compuestos nitrogenados mediante el ciclo de la urea Este ciclo es
una viacutea metaboacutelica de cinco pasos la cual resulta en la conversioacuten de dos moleacuteculas de
amoniacuteaco y una de hidroacutegeno carbonato en urea La urea como producto final se sintetiza
en el hiacutegado luego se secreta a la sangre y finalmente es captada por los rintildeones para
excretarla en la orina La siacutentesis inadecuada de la urea provoca la acumulacioacuten de
amoniacuteaco en las ceacutelulas del organismo generando la aparicioacuten de enfermedades El
diagnoacutestico de estos desoacuterdenes consiste en la medicioacuten de urea en sangre y orina lo que
permite poder realizar un diagnoacutestico y tratamiento acertados de las enfermedades
Existen varias teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la urea reportaacutendose los siguientes
meacutetodos la hidroacutelisis de la urea titulacioacuten con sales mercuacutericas y precipitacioacuten de la urea
con una disolucioacuten alcohoacutelica de xantidrol Ademaacutes de los meacutetodos que emplean la
diacetilmonoxima y p-dimetilamino-benzaldehiacutedo cuyo fundamento es la formacioacuten de un
compuesto coloreado Sin embargo los meacutetodos maacutes empleados son aquellos que se basan
en la formacioacuten de compuestos coloreados mediante reacciones enzimaacutetico-colorimeacutetricas
como son las reacciones de Nessler la de Betherlot y la de Betherlot modificada siendo
esta uacuteltima la utilizada en los laboratorios cliacutenicos mediante un diagnosticador que permite
cuantificar los niveles de urea en suero presentado por la Empresa de Produccioacuten de
Bioloacutegicos Carlos J Finlay (La Habana Cuba) que cuenta con un reactivo liofilizado de
ureasa el cual encarece su produccioacuten y solo es estable durante 7 diacuteas una vez restituido
La posibilidad de contar con un reactivo enzimaacutetico en disolucioacuten estable es uno de los
elementos que hariacutean maacutes sencillo este proceso de faacutecil y raacutepida ejecucioacuten por lo que una
forma de poder ofrecer este servicio a la poblacioacuten por maacutes tiempo seriacutea la sustitucioacuten del
liofilizado de ureasa por una disolucioacuten de ureasa estable Este anaacutelisis fue llevado a cabo
por (Borges 2014) quieacuten propuso el desarrollo de una formulacioacuten estable de ureasa liacutequida
para la determinacioacuten de urea en sangre sin embargo esta no se comercializa en Cuba
La ureasa (urea amidohidrolasa) es una enzima que se encuentra en muchas plantas
fundamentalmente en las leguminosas Se reportan trabajos que estudian el proceso de
extraccioacuten de esta enzima a partir de fuentes naturales como por ejemplo semillas de soya
frijoles jack garbanzos lentejas etc Ademaacutes en la industria de alimentos se controla la
2
cantidad de ureasa presente en los productos derivados de la soya precisamente por el
efecto inhibidor que produce sobre las propiedades nutritivas que aportan las proteiacutenas
Este estudio permite tener en cuenta la forma en que se produce esta reaccioacuten enzimaacutetica
para otros usos donde el objetivo sea emplear la ureasa para determinar urea en otras
muestras
Especiacuteficamente en la provincia de Villa Clara un grupo de especialistas de la sala de
cuidados intensivos del hospital provincial Arnaldo Miliaacuten Castro han mostrado intereacutes en
la evaluacioacuten de urea en sangre por la importancia de esta determinacioacuten en la deteccioacuten de
enfermedades donde la vinculacioacuten con la Facultad de Quiacutemica y Farmacia de la
Universidad Central Marta Abreu de Las Villas ha abierto nuevas posibilidades de
estudiar la temaacutetica
Basado en estos resultados previos y en la necesidad de encontrar alternativas que permitan
sustituir el reactivo de ureasa liofilizado en los laboratorios cliacutenicos para la evaluacioacuten de la
urea presente en muestras de suero sanguiacuteneo se identifica el siguiente problema cientiacutefico
Problema cientiacutefico iquestEs posible el uso del extracto de ureasa obtenido del frijol de soya
para la determinacioacuten de urea en sangre
Para la solucioacuten del problema se planea la siguiente hipoacutetesis
Si se demuestran las propiedades enzimaacuteticas del extracto de soya obtenido es posible su
empleo en la determinacioacuten de urea en sangre
Objetivo General
Extraer la ureasa presente en el frijol de soya para su uso en la determinacioacuten de urea en
muestras de sangre
Objetivos especiacuteficos
1 Extraer la ureasa presente en el frijol de soya
2 Determinar cualitativa y cuantitativa la actividad enzimaacutetica de la ureasa presente en
el extracto obtenido
3 Realizar el estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica empleando el extracto de soya
3
4 Evaluar la concentracioacuten de urea en muestras de sangre empleando el extracto de
soya
5 Caracterizar preliminarmente el extracto obtenido a partir de la soya
4
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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4
RESUMEN
En este trabajo se desarrolloacute la extraccioacuten de la ureasa presente en el frijol de soya con el
empleo de cuatro teacutecnicas (Meacutetodo de Lorenc Meacutetodo de Schosinsky Meacutetodo salting- in y
Meacutetodo de Donal y Van Slyke) A partir de una evaluacioacuten cualitativa y cuantitativa de la
actividad enzimaacutetica y tomando como referencia los valores reportados por la literatura se
concluyoacute que los mejores resultados fueron los ofrecidos por el extracto de Lorenc Se
estudioacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima ureasa del extracto obtenieacutendose los
paraacutemetros Vmaacutex igual 3125 mmolL y Km igual 16710-1
molL a una temperatura de
40 oC y pH igual a 7 Se determinoacute cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se
comparoacute con la actividad de la enzima ureasa comercial procedieacutendose a aplicar el extracto
a muestras de plasma sanguiacuteneo no presentaacutendose diferencias significativas entre ambas
enzimas para ambos ensayos La caracterizacioacuten del extracto mediante la determinacioacuten de
proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret mostroacute una concentracioacuten de albuacutemina de 867
mgL y 2083 mgL de globulina El estudio de estabilidad reveloacute que el extracto es estable
por 7 diacuteas
5
ABSTRACT
In this work the extraction of the present urease was developed in the soybean with the
employment of four techniques (Method of Lorenc Method of Schosinsky Method salting
- in and Method of Donal and Van Slyke) Starting from a qualitative and quantitative
evaluation of the enzymatic activity and taking like reference the values reported by the
literature we concluded that the best results were those offered by the extract of Lorenc
The kinetics was studied to the reaction with the enzyme urease of the extract being
obtained the parameters Vmaacutex same 3125 mmolL and same Km 16710-1
molL to a
temperature of 40 oC and pH similar to 7 It was determined the activity quantitatively for
this extract and it was compared with the activity of the enzyme commercial urease being
proceeded to apply the extract to samples of sanguine plasm not presenting differs
significant among both enzymes for both rehearsals The characterization of the extract by
means of the determination of total proteins for the method of Biuret showed a
concentration of albumin of 867 mgL and 2083 mgL of globulin The study of stability
revealed that the extract is stable for 7 days
6
Iacutendice
Introduccioacuten 1
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica 4
11 La soya 4
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca () 5
121 Funciones de las Enzimas 6
122 Composicioacuten y estructura 6
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica 8
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica 8
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas 9
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa) 14
131 Estructura de la ureasa 15
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa 16
14 La urea como sustancia quiacutemica 17
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas 17
142 Estructura 17
143 Obtencioacuten 17
144 Aplicaciones de la urea 18
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo 18
151 Reaccioacuten de Berthelot 18
152 Reaccioacuten de Nessler 18
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre 19
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 19
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer) 19
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE 20
17 Procesos de extraccioacuten 20
18 Proteiacutenas 21
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas 21
7
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad 22
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos 23
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya 23
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008) 23
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003) 24
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velazquez 1998) 25
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008) 25
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya 26
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica 26
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico 28
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya 31
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero 35
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya 37
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales 37
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya 40
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales 40
261 Presentacioacuten de los resultados 40
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten 41
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya 41
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica 42
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya 48
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica 48
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica 49
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
50
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa 55
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo 59
341 Anaacutelisis estadiacutestico 60
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya 63
8
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido 63
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya 63
Conclusiones 65
Recomendaciones 66
Anexos 67
Bibilografiacutea 77
1
Introduccioacuten
El hombre excreta el exceso de nitroacutegeno resultante de la degradacioacuten metaboacutelica de los
aminoaacutecidos y otros compuestos nitrogenados mediante el ciclo de la urea Este ciclo es
una viacutea metaboacutelica de cinco pasos la cual resulta en la conversioacuten de dos moleacuteculas de
amoniacuteaco y una de hidroacutegeno carbonato en urea La urea como producto final se sintetiza
en el hiacutegado luego se secreta a la sangre y finalmente es captada por los rintildeones para
excretarla en la orina La siacutentesis inadecuada de la urea provoca la acumulacioacuten de
amoniacuteaco en las ceacutelulas del organismo generando la aparicioacuten de enfermedades El
diagnoacutestico de estos desoacuterdenes consiste en la medicioacuten de urea en sangre y orina lo que
permite poder realizar un diagnoacutestico y tratamiento acertados de las enfermedades
Existen varias teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la urea reportaacutendose los siguientes
meacutetodos la hidroacutelisis de la urea titulacioacuten con sales mercuacutericas y precipitacioacuten de la urea
con una disolucioacuten alcohoacutelica de xantidrol Ademaacutes de los meacutetodos que emplean la
diacetilmonoxima y p-dimetilamino-benzaldehiacutedo cuyo fundamento es la formacioacuten de un
compuesto coloreado Sin embargo los meacutetodos maacutes empleados son aquellos que se basan
en la formacioacuten de compuestos coloreados mediante reacciones enzimaacutetico-colorimeacutetricas
como son las reacciones de Nessler la de Betherlot y la de Betherlot modificada siendo
esta uacuteltima la utilizada en los laboratorios cliacutenicos mediante un diagnosticador que permite
cuantificar los niveles de urea en suero presentado por la Empresa de Produccioacuten de
Bioloacutegicos Carlos J Finlay (La Habana Cuba) que cuenta con un reactivo liofilizado de
ureasa el cual encarece su produccioacuten y solo es estable durante 7 diacuteas una vez restituido
La posibilidad de contar con un reactivo enzimaacutetico en disolucioacuten estable es uno de los
elementos que hariacutean maacutes sencillo este proceso de faacutecil y raacutepida ejecucioacuten por lo que una
forma de poder ofrecer este servicio a la poblacioacuten por maacutes tiempo seriacutea la sustitucioacuten del
liofilizado de ureasa por una disolucioacuten de ureasa estable Este anaacutelisis fue llevado a cabo
por (Borges 2014) quieacuten propuso el desarrollo de una formulacioacuten estable de ureasa liacutequida
para la determinacioacuten de urea en sangre sin embargo esta no se comercializa en Cuba
La ureasa (urea amidohidrolasa) es una enzima que se encuentra en muchas plantas
fundamentalmente en las leguminosas Se reportan trabajos que estudian el proceso de
extraccioacuten de esta enzima a partir de fuentes naturales como por ejemplo semillas de soya
frijoles jack garbanzos lentejas etc Ademaacutes en la industria de alimentos se controla la
2
cantidad de ureasa presente en los productos derivados de la soya precisamente por el
efecto inhibidor que produce sobre las propiedades nutritivas que aportan las proteiacutenas
Este estudio permite tener en cuenta la forma en que se produce esta reaccioacuten enzimaacutetica
para otros usos donde el objetivo sea emplear la ureasa para determinar urea en otras
muestras
Especiacuteficamente en la provincia de Villa Clara un grupo de especialistas de la sala de
cuidados intensivos del hospital provincial Arnaldo Miliaacuten Castro han mostrado intereacutes en
la evaluacioacuten de urea en sangre por la importancia de esta determinacioacuten en la deteccioacuten de
enfermedades donde la vinculacioacuten con la Facultad de Quiacutemica y Farmacia de la
Universidad Central Marta Abreu de Las Villas ha abierto nuevas posibilidades de
estudiar la temaacutetica
Basado en estos resultados previos y en la necesidad de encontrar alternativas que permitan
sustituir el reactivo de ureasa liofilizado en los laboratorios cliacutenicos para la evaluacioacuten de la
urea presente en muestras de suero sanguiacuteneo se identifica el siguiente problema cientiacutefico
Problema cientiacutefico iquestEs posible el uso del extracto de ureasa obtenido del frijol de soya
para la determinacioacuten de urea en sangre
Para la solucioacuten del problema se planea la siguiente hipoacutetesis
Si se demuestran las propiedades enzimaacuteticas del extracto de soya obtenido es posible su
empleo en la determinacioacuten de urea en sangre
Objetivo General
Extraer la ureasa presente en el frijol de soya para su uso en la determinacioacuten de urea en
muestras de sangre
Objetivos especiacuteficos
1 Extraer la ureasa presente en el frijol de soya
2 Determinar cualitativa y cuantitativa la actividad enzimaacutetica de la ureasa presente en
el extracto obtenido
3 Realizar el estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica empleando el extracto de soya
3
4 Evaluar la concentracioacuten de urea en muestras de sangre empleando el extracto de
soya
5 Caracterizar preliminarmente el extracto obtenido a partir de la soya
4
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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5
ABSTRACT
In this work the extraction of the present urease was developed in the soybean with the
employment of four techniques (Method of Lorenc Method of Schosinsky Method salting
- in and Method of Donal and Van Slyke) Starting from a qualitative and quantitative
evaluation of the enzymatic activity and taking like reference the values reported by the
literature we concluded that the best results were those offered by the extract of Lorenc
The kinetics was studied to the reaction with the enzyme urease of the extract being
obtained the parameters Vmaacutex same 3125 mmolL and same Km 16710-1
molL to a
temperature of 40 oC and pH similar to 7 It was determined the activity quantitatively for
this extract and it was compared with the activity of the enzyme commercial urease being
proceeded to apply the extract to samples of sanguine plasm not presenting differs
significant among both enzymes for both rehearsals The characterization of the extract by
means of the determination of total proteins for the method of Biuret showed a
concentration of albumin of 867 mgL and 2083 mgL of globulin The study of stability
revealed that the extract is stable for 7 days
6
Iacutendice
Introduccioacuten 1
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica 4
11 La soya 4
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca () 5
121 Funciones de las Enzimas 6
122 Composicioacuten y estructura 6
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica 8
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica 8
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas 9
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa) 14
131 Estructura de la ureasa 15
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa 16
14 La urea como sustancia quiacutemica 17
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas 17
142 Estructura 17
143 Obtencioacuten 17
144 Aplicaciones de la urea 18
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo 18
151 Reaccioacuten de Berthelot 18
152 Reaccioacuten de Nessler 18
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre 19
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 19
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer) 19
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE 20
17 Procesos de extraccioacuten 20
18 Proteiacutenas 21
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas 21
7
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad 22
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos 23
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya 23
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008) 23
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003) 24
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velazquez 1998) 25
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008) 25
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya 26
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica 26
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico 28
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya 31
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero 35
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya 37
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales 37
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya 40
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales 40
261 Presentacioacuten de los resultados 40
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten 41
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya 41
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica 42
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya 48
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica 48
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica 49
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
50
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa 55
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo 59
341 Anaacutelisis estadiacutestico 60
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya 63
8
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido 63
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya 63
Conclusiones 65
Recomendaciones 66
Anexos 67
Bibilografiacutea 77
1
Introduccioacuten
El hombre excreta el exceso de nitroacutegeno resultante de la degradacioacuten metaboacutelica de los
aminoaacutecidos y otros compuestos nitrogenados mediante el ciclo de la urea Este ciclo es
una viacutea metaboacutelica de cinco pasos la cual resulta en la conversioacuten de dos moleacuteculas de
amoniacuteaco y una de hidroacutegeno carbonato en urea La urea como producto final se sintetiza
en el hiacutegado luego se secreta a la sangre y finalmente es captada por los rintildeones para
excretarla en la orina La siacutentesis inadecuada de la urea provoca la acumulacioacuten de
amoniacuteaco en las ceacutelulas del organismo generando la aparicioacuten de enfermedades El
diagnoacutestico de estos desoacuterdenes consiste en la medicioacuten de urea en sangre y orina lo que
permite poder realizar un diagnoacutestico y tratamiento acertados de las enfermedades
Existen varias teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la urea reportaacutendose los siguientes
meacutetodos la hidroacutelisis de la urea titulacioacuten con sales mercuacutericas y precipitacioacuten de la urea
con una disolucioacuten alcohoacutelica de xantidrol Ademaacutes de los meacutetodos que emplean la
diacetilmonoxima y p-dimetilamino-benzaldehiacutedo cuyo fundamento es la formacioacuten de un
compuesto coloreado Sin embargo los meacutetodos maacutes empleados son aquellos que se basan
en la formacioacuten de compuestos coloreados mediante reacciones enzimaacutetico-colorimeacutetricas
como son las reacciones de Nessler la de Betherlot y la de Betherlot modificada siendo
esta uacuteltima la utilizada en los laboratorios cliacutenicos mediante un diagnosticador que permite
cuantificar los niveles de urea en suero presentado por la Empresa de Produccioacuten de
Bioloacutegicos Carlos J Finlay (La Habana Cuba) que cuenta con un reactivo liofilizado de
ureasa el cual encarece su produccioacuten y solo es estable durante 7 diacuteas una vez restituido
La posibilidad de contar con un reactivo enzimaacutetico en disolucioacuten estable es uno de los
elementos que hariacutean maacutes sencillo este proceso de faacutecil y raacutepida ejecucioacuten por lo que una
forma de poder ofrecer este servicio a la poblacioacuten por maacutes tiempo seriacutea la sustitucioacuten del
liofilizado de ureasa por una disolucioacuten de ureasa estable Este anaacutelisis fue llevado a cabo
por (Borges 2014) quieacuten propuso el desarrollo de una formulacioacuten estable de ureasa liacutequida
para la determinacioacuten de urea en sangre sin embargo esta no se comercializa en Cuba
La ureasa (urea amidohidrolasa) es una enzima que se encuentra en muchas plantas
fundamentalmente en las leguminosas Se reportan trabajos que estudian el proceso de
extraccioacuten de esta enzima a partir de fuentes naturales como por ejemplo semillas de soya
frijoles jack garbanzos lentejas etc Ademaacutes en la industria de alimentos se controla la
2
cantidad de ureasa presente en los productos derivados de la soya precisamente por el
efecto inhibidor que produce sobre las propiedades nutritivas que aportan las proteiacutenas
Este estudio permite tener en cuenta la forma en que se produce esta reaccioacuten enzimaacutetica
para otros usos donde el objetivo sea emplear la ureasa para determinar urea en otras
muestras
Especiacuteficamente en la provincia de Villa Clara un grupo de especialistas de la sala de
cuidados intensivos del hospital provincial Arnaldo Miliaacuten Castro han mostrado intereacutes en
la evaluacioacuten de urea en sangre por la importancia de esta determinacioacuten en la deteccioacuten de
enfermedades donde la vinculacioacuten con la Facultad de Quiacutemica y Farmacia de la
Universidad Central Marta Abreu de Las Villas ha abierto nuevas posibilidades de
estudiar la temaacutetica
Basado en estos resultados previos y en la necesidad de encontrar alternativas que permitan
sustituir el reactivo de ureasa liofilizado en los laboratorios cliacutenicos para la evaluacioacuten de la
urea presente en muestras de suero sanguiacuteneo se identifica el siguiente problema cientiacutefico
Problema cientiacutefico iquestEs posible el uso del extracto de ureasa obtenido del frijol de soya
para la determinacioacuten de urea en sangre
Para la solucioacuten del problema se planea la siguiente hipoacutetesis
Si se demuestran las propiedades enzimaacuteticas del extracto de soya obtenido es posible su
empleo en la determinacioacuten de urea en sangre
Objetivo General
Extraer la ureasa presente en el frijol de soya para su uso en la determinacioacuten de urea en
muestras de sangre
Objetivos especiacuteficos
1 Extraer la ureasa presente en el frijol de soya
2 Determinar cualitativa y cuantitativa la actividad enzimaacutetica de la ureasa presente en
el extracto obtenido
3 Realizar el estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica empleando el extracto de soya
3
4 Evaluar la concentracioacuten de urea en muestras de sangre empleando el extracto de
soya
5 Caracterizar preliminarmente el extracto obtenido a partir de la soya
4
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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Iacutendice
Introduccioacuten 1
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica 4
11 La soya 4
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca () 5
121 Funciones de las Enzimas 6
122 Composicioacuten y estructura 6
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica 8
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica 8
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas 9
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa) 14
131 Estructura de la ureasa 15
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa 16
14 La urea como sustancia quiacutemica 17
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas 17
142 Estructura 17
143 Obtencioacuten 17
144 Aplicaciones de la urea 18
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo 18
151 Reaccioacuten de Berthelot 18
152 Reaccioacuten de Nessler 18
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre 19
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 19
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer) 19
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE 20
17 Procesos de extraccioacuten 20
18 Proteiacutenas 21
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas 21
7
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad 22
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos 23
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya 23
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008) 23
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003) 24
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velazquez 1998) 25
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008) 25
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya 26
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica 26
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico 28
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya 31
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero 35
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya 37
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales 37
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya 40
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales 40
261 Presentacioacuten de los resultados 40
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten 41
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya 41
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica 42
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya 48
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica 48
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica 49
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
50
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa 55
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo 59
341 Anaacutelisis estadiacutestico 60
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya 63
8
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido 63
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya 63
Conclusiones 65
Recomendaciones 66
Anexos 67
Bibilografiacutea 77
1
Introduccioacuten
El hombre excreta el exceso de nitroacutegeno resultante de la degradacioacuten metaboacutelica de los
aminoaacutecidos y otros compuestos nitrogenados mediante el ciclo de la urea Este ciclo es
una viacutea metaboacutelica de cinco pasos la cual resulta en la conversioacuten de dos moleacuteculas de
amoniacuteaco y una de hidroacutegeno carbonato en urea La urea como producto final se sintetiza
en el hiacutegado luego se secreta a la sangre y finalmente es captada por los rintildeones para
excretarla en la orina La siacutentesis inadecuada de la urea provoca la acumulacioacuten de
amoniacuteaco en las ceacutelulas del organismo generando la aparicioacuten de enfermedades El
diagnoacutestico de estos desoacuterdenes consiste en la medicioacuten de urea en sangre y orina lo que
permite poder realizar un diagnoacutestico y tratamiento acertados de las enfermedades
Existen varias teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la urea reportaacutendose los siguientes
meacutetodos la hidroacutelisis de la urea titulacioacuten con sales mercuacutericas y precipitacioacuten de la urea
con una disolucioacuten alcohoacutelica de xantidrol Ademaacutes de los meacutetodos que emplean la
diacetilmonoxima y p-dimetilamino-benzaldehiacutedo cuyo fundamento es la formacioacuten de un
compuesto coloreado Sin embargo los meacutetodos maacutes empleados son aquellos que se basan
en la formacioacuten de compuestos coloreados mediante reacciones enzimaacutetico-colorimeacutetricas
como son las reacciones de Nessler la de Betherlot y la de Betherlot modificada siendo
esta uacuteltima la utilizada en los laboratorios cliacutenicos mediante un diagnosticador que permite
cuantificar los niveles de urea en suero presentado por la Empresa de Produccioacuten de
Bioloacutegicos Carlos J Finlay (La Habana Cuba) que cuenta con un reactivo liofilizado de
ureasa el cual encarece su produccioacuten y solo es estable durante 7 diacuteas una vez restituido
La posibilidad de contar con un reactivo enzimaacutetico en disolucioacuten estable es uno de los
elementos que hariacutean maacutes sencillo este proceso de faacutecil y raacutepida ejecucioacuten por lo que una
forma de poder ofrecer este servicio a la poblacioacuten por maacutes tiempo seriacutea la sustitucioacuten del
liofilizado de ureasa por una disolucioacuten de ureasa estable Este anaacutelisis fue llevado a cabo
por (Borges 2014) quieacuten propuso el desarrollo de una formulacioacuten estable de ureasa liacutequida
para la determinacioacuten de urea en sangre sin embargo esta no se comercializa en Cuba
La ureasa (urea amidohidrolasa) es una enzima que se encuentra en muchas plantas
fundamentalmente en las leguminosas Se reportan trabajos que estudian el proceso de
extraccioacuten de esta enzima a partir de fuentes naturales como por ejemplo semillas de soya
frijoles jack garbanzos lentejas etc Ademaacutes en la industria de alimentos se controla la
2
cantidad de ureasa presente en los productos derivados de la soya precisamente por el
efecto inhibidor que produce sobre las propiedades nutritivas que aportan las proteiacutenas
Este estudio permite tener en cuenta la forma en que se produce esta reaccioacuten enzimaacutetica
para otros usos donde el objetivo sea emplear la ureasa para determinar urea en otras
muestras
Especiacuteficamente en la provincia de Villa Clara un grupo de especialistas de la sala de
cuidados intensivos del hospital provincial Arnaldo Miliaacuten Castro han mostrado intereacutes en
la evaluacioacuten de urea en sangre por la importancia de esta determinacioacuten en la deteccioacuten de
enfermedades donde la vinculacioacuten con la Facultad de Quiacutemica y Farmacia de la
Universidad Central Marta Abreu de Las Villas ha abierto nuevas posibilidades de
estudiar la temaacutetica
Basado en estos resultados previos y en la necesidad de encontrar alternativas que permitan
sustituir el reactivo de ureasa liofilizado en los laboratorios cliacutenicos para la evaluacioacuten de la
urea presente en muestras de suero sanguiacuteneo se identifica el siguiente problema cientiacutefico
Problema cientiacutefico iquestEs posible el uso del extracto de ureasa obtenido del frijol de soya
para la determinacioacuten de urea en sangre
Para la solucioacuten del problema se planea la siguiente hipoacutetesis
Si se demuestran las propiedades enzimaacuteticas del extracto de soya obtenido es posible su
empleo en la determinacioacuten de urea en sangre
Objetivo General
Extraer la ureasa presente en el frijol de soya para su uso en la determinacioacuten de urea en
muestras de sangre
Objetivos especiacuteficos
1 Extraer la ureasa presente en el frijol de soya
2 Determinar cualitativa y cuantitativa la actividad enzimaacutetica de la ureasa presente en
el extracto obtenido
3 Realizar el estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica empleando el extracto de soya
3
4 Evaluar la concentracioacuten de urea en muestras de sangre empleando el extracto de
soya
5 Caracterizar preliminarmente el extracto obtenido a partir de la soya
4
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad 22
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos 23
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya 23
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008) 23
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003) 24
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velazquez 1998) 25
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008) 25
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya 26
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica 26
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico 28
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya 31
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero 35
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya 37
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales 37
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya 40
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales 40
261 Presentacioacuten de los resultados 40
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten 41
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya 41
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica 42
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya 48
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica 48
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica 49
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
50
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa 55
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo 59
341 Anaacutelisis estadiacutestico 60
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya 63
8
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido 63
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya 63
Conclusiones 65
Recomendaciones 66
Anexos 67
Bibilografiacutea 77
1
Introduccioacuten
El hombre excreta el exceso de nitroacutegeno resultante de la degradacioacuten metaboacutelica de los
aminoaacutecidos y otros compuestos nitrogenados mediante el ciclo de la urea Este ciclo es
una viacutea metaboacutelica de cinco pasos la cual resulta en la conversioacuten de dos moleacuteculas de
amoniacuteaco y una de hidroacutegeno carbonato en urea La urea como producto final se sintetiza
en el hiacutegado luego se secreta a la sangre y finalmente es captada por los rintildeones para
excretarla en la orina La siacutentesis inadecuada de la urea provoca la acumulacioacuten de
amoniacuteaco en las ceacutelulas del organismo generando la aparicioacuten de enfermedades El
diagnoacutestico de estos desoacuterdenes consiste en la medicioacuten de urea en sangre y orina lo que
permite poder realizar un diagnoacutestico y tratamiento acertados de las enfermedades
Existen varias teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la urea reportaacutendose los siguientes
meacutetodos la hidroacutelisis de la urea titulacioacuten con sales mercuacutericas y precipitacioacuten de la urea
con una disolucioacuten alcohoacutelica de xantidrol Ademaacutes de los meacutetodos que emplean la
diacetilmonoxima y p-dimetilamino-benzaldehiacutedo cuyo fundamento es la formacioacuten de un
compuesto coloreado Sin embargo los meacutetodos maacutes empleados son aquellos que se basan
en la formacioacuten de compuestos coloreados mediante reacciones enzimaacutetico-colorimeacutetricas
como son las reacciones de Nessler la de Betherlot y la de Betherlot modificada siendo
esta uacuteltima la utilizada en los laboratorios cliacutenicos mediante un diagnosticador que permite
cuantificar los niveles de urea en suero presentado por la Empresa de Produccioacuten de
Bioloacutegicos Carlos J Finlay (La Habana Cuba) que cuenta con un reactivo liofilizado de
ureasa el cual encarece su produccioacuten y solo es estable durante 7 diacuteas una vez restituido
La posibilidad de contar con un reactivo enzimaacutetico en disolucioacuten estable es uno de los
elementos que hariacutean maacutes sencillo este proceso de faacutecil y raacutepida ejecucioacuten por lo que una
forma de poder ofrecer este servicio a la poblacioacuten por maacutes tiempo seriacutea la sustitucioacuten del
liofilizado de ureasa por una disolucioacuten de ureasa estable Este anaacutelisis fue llevado a cabo
por (Borges 2014) quieacuten propuso el desarrollo de una formulacioacuten estable de ureasa liacutequida
para la determinacioacuten de urea en sangre sin embargo esta no se comercializa en Cuba
La ureasa (urea amidohidrolasa) es una enzima que se encuentra en muchas plantas
fundamentalmente en las leguminosas Se reportan trabajos que estudian el proceso de
extraccioacuten de esta enzima a partir de fuentes naturales como por ejemplo semillas de soya
frijoles jack garbanzos lentejas etc Ademaacutes en la industria de alimentos se controla la
2
cantidad de ureasa presente en los productos derivados de la soya precisamente por el
efecto inhibidor que produce sobre las propiedades nutritivas que aportan las proteiacutenas
Este estudio permite tener en cuenta la forma en que se produce esta reaccioacuten enzimaacutetica
para otros usos donde el objetivo sea emplear la ureasa para determinar urea en otras
muestras
Especiacuteficamente en la provincia de Villa Clara un grupo de especialistas de la sala de
cuidados intensivos del hospital provincial Arnaldo Miliaacuten Castro han mostrado intereacutes en
la evaluacioacuten de urea en sangre por la importancia de esta determinacioacuten en la deteccioacuten de
enfermedades donde la vinculacioacuten con la Facultad de Quiacutemica y Farmacia de la
Universidad Central Marta Abreu de Las Villas ha abierto nuevas posibilidades de
estudiar la temaacutetica
Basado en estos resultados previos y en la necesidad de encontrar alternativas que permitan
sustituir el reactivo de ureasa liofilizado en los laboratorios cliacutenicos para la evaluacioacuten de la
urea presente en muestras de suero sanguiacuteneo se identifica el siguiente problema cientiacutefico
Problema cientiacutefico iquestEs posible el uso del extracto de ureasa obtenido del frijol de soya
para la determinacioacuten de urea en sangre
Para la solucioacuten del problema se planea la siguiente hipoacutetesis
Si se demuestran las propiedades enzimaacuteticas del extracto de soya obtenido es posible su
empleo en la determinacioacuten de urea en sangre
Objetivo General
Extraer la ureasa presente en el frijol de soya para su uso en la determinacioacuten de urea en
muestras de sangre
Objetivos especiacuteficos
1 Extraer la ureasa presente en el frijol de soya
2 Determinar cualitativa y cuantitativa la actividad enzimaacutetica de la ureasa presente en
el extracto obtenido
3 Realizar el estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica empleando el extracto de soya
3
4 Evaluar la concentracioacuten de urea en muestras de sangre empleando el extracto de
soya
5 Caracterizar preliminarmente el extracto obtenido a partir de la soya
4
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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8
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido 63
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya 63
Conclusiones 65
Recomendaciones 66
Anexos 67
Bibilografiacutea 77
1
Introduccioacuten
El hombre excreta el exceso de nitroacutegeno resultante de la degradacioacuten metaboacutelica de los
aminoaacutecidos y otros compuestos nitrogenados mediante el ciclo de la urea Este ciclo es
una viacutea metaboacutelica de cinco pasos la cual resulta en la conversioacuten de dos moleacuteculas de
amoniacuteaco y una de hidroacutegeno carbonato en urea La urea como producto final se sintetiza
en el hiacutegado luego se secreta a la sangre y finalmente es captada por los rintildeones para
excretarla en la orina La siacutentesis inadecuada de la urea provoca la acumulacioacuten de
amoniacuteaco en las ceacutelulas del organismo generando la aparicioacuten de enfermedades El
diagnoacutestico de estos desoacuterdenes consiste en la medicioacuten de urea en sangre y orina lo que
permite poder realizar un diagnoacutestico y tratamiento acertados de las enfermedades
Existen varias teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la urea reportaacutendose los siguientes
meacutetodos la hidroacutelisis de la urea titulacioacuten con sales mercuacutericas y precipitacioacuten de la urea
con una disolucioacuten alcohoacutelica de xantidrol Ademaacutes de los meacutetodos que emplean la
diacetilmonoxima y p-dimetilamino-benzaldehiacutedo cuyo fundamento es la formacioacuten de un
compuesto coloreado Sin embargo los meacutetodos maacutes empleados son aquellos que se basan
en la formacioacuten de compuestos coloreados mediante reacciones enzimaacutetico-colorimeacutetricas
como son las reacciones de Nessler la de Betherlot y la de Betherlot modificada siendo
esta uacuteltima la utilizada en los laboratorios cliacutenicos mediante un diagnosticador que permite
cuantificar los niveles de urea en suero presentado por la Empresa de Produccioacuten de
Bioloacutegicos Carlos J Finlay (La Habana Cuba) que cuenta con un reactivo liofilizado de
ureasa el cual encarece su produccioacuten y solo es estable durante 7 diacuteas una vez restituido
La posibilidad de contar con un reactivo enzimaacutetico en disolucioacuten estable es uno de los
elementos que hariacutean maacutes sencillo este proceso de faacutecil y raacutepida ejecucioacuten por lo que una
forma de poder ofrecer este servicio a la poblacioacuten por maacutes tiempo seriacutea la sustitucioacuten del
liofilizado de ureasa por una disolucioacuten de ureasa estable Este anaacutelisis fue llevado a cabo
por (Borges 2014) quieacuten propuso el desarrollo de una formulacioacuten estable de ureasa liacutequida
para la determinacioacuten de urea en sangre sin embargo esta no se comercializa en Cuba
La ureasa (urea amidohidrolasa) es una enzima que se encuentra en muchas plantas
fundamentalmente en las leguminosas Se reportan trabajos que estudian el proceso de
extraccioacuten de esta enzima a partir de fuentes naturales como por ejemplo semillas de soya
frijoles jack garbanzos lentejas etc Ademaacutes en la industria de alimentos se controla la
2
cantidad de ureasa presente en los productos derivados de la soya precisamente por el
efecto inhibidor que produce sobre las propiedades nutritivas que aportan las proteiacutenas
Este estudio permite tener en cuenta la forma en que se produce esta reaccioacuten enzimaacutetica
para otros usos donde el objetivo sea emplear la ureasa para determinar urea en otras
muestras
Especiacuteficamente en la provincia de Villa Clara un grupo de especialistas de la sala de
cuidados intensivos del hospital provincial Arnaldo Miliaacuten Castro han mostrado intereacutes en
la evaluacioacuten de urea en sangre por la importancia de esta determinacioacuten en la deteccioacuten de
enfermedades donde la vinculacioacuten con la Facultad de Quiacutemica y Farmacia de la
Universidad Central Marta Abreu de Las Villas ha abierto nuevas posibilidades de
estudiar la temaacutetica
Basado en estos resultados previos y en la necesidad de encontrar alternativas que permitan
sustituir el reactivo de ureasa liofilizado en los laboratorios cliacutenicos para la evaluacioacuten de la
urea presente en muestras de suero sanguiacuteneo se identifica el siguiente problema cientiacutefico
Problema cientiacutefico iquestEs posible el uso del extracto de ureasa obtenido del frijol de soya
para la determinacioacuten de urea en sangre
Para la solucioacuten del problema se planea la siguiente hipoacutetesis
Si se demuestran las propiedades enzimaacuteticas del extracto de soya obtenido es posible su
empleo en la determinacioacuten de urea en sangre
Objetivo General
Extraer la ureasa presente en el frijol de soya para su uso en la determinacioacuten de urea en
muestras de sangre
Objetivos especiacuteficos
1 Extraer la ureasa presente en el frijol de soya
2 Determinar cualitativa y cuantitativa la actividad enzimaacutetica de la ureasa presente en
el extracto obtenido
3 Realizar el estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica empleando el extracto de soya
3
4 Evaluar la concentracioacuten de urea en muestras de sangre empleando el extracto de
soya
5 Caracterizar preliminarmente el extracto obtenido a partir de la soya
4
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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TANGARIFE R D M 2008 Guiacutea para Praacutecticas de Laboratorio Bioquiacutemica Palmira
Meacutexico
80
TORRES N T amp PALACIOS A R T 2009 La historia del uso de la soya en Meacutexico su
valor nutricional y su efecto en la salud 51 246-254
VELAZQUEZ M A 1998 Dosaje de la urea por la ureasa
VOET D amp VOET J G 2004 Biochemistry Biomolecules Mechanisms of Enzyme
Action and Metabolism Voet amp Voet
WEBB J 1963 Enzyme and Metabolic Inhibitors New York
1
Introduccioacuten
El hombre excreta el exceso de nitroacutegeno resultante de la degradacioacuten metaboacutelica de los
aminoaacutecidos y otros compuestos nitrogenados mediante el ciclo de la urea Este ciclo es
una viacutea metaboacutelica de cinco pasos la cual resulta en la conversioacuten de dos moleacuteculas de
amoniacuteaco y una de hidroacutegeno carbonato en urea La urea como producto final se sintetiza
en el hiacutegado luego se secreta a la sangre y finalmente es captada por los rintildeones para
excretarla en la orina La siacutentesis inadecuada de la urea provoca la acumulacioacuten de
amoniacuteaco en las ceacutelulas del organismo generando la aparicioacuten de enfermedades El
diagnoacutestico de estos desoacuterdenes consiste en la medicioacuten de urea en sangre y orina lo que
permite poder realizar un diagnoacutestico y tratamiento acertados de las enfermedades
Existen varias teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la urea reportaacutendose los siguientes
meacutetodos la hidroacutelisis de la urea titulacioacuten con sales mercuacutericas y precipitacioacuten de la urea
con una disolucioacuten alcohoacutelica de xantidrol Ademaacutes de los meacutetodos que emplean la
diacetilmonoxima y p-dimetilamino-benzaldehiacutedo cuyo fundamento es la formacioacuten de un
compuesto coloreado Sin embargo los meacutetodos maacutes empleados son aquellos que se basan
en la formacioacuten de compuestos coloreados mediante reacciones enzimaacutetico-colorimeacutetricas
como son las reacciones de Nessler la de Betherlot y la de Betherlot modificada siendo
esta uacuteltima la utilizada en los laboratorios cliacutenicos mediante un diagnosticador que permite
cuantificar los niveles de urea en suero presentado por la Empresa de Produccioacuten de
Bioloacutegicos Carlos J Finlay (La Habana Cuba) que cuenta con un reactivo liofilizado de
ureasa el cual encarece su produccioacuten y solo es estable durante 7 diacuteas una vez restituido
La posibilidad de contar con un reactivo enzimaacutetico en disolucioacuten estable es uno de los
elementos que hariacutean maacutes sencillo este proceso de faacutecil y raacutepida ejecucioacuten por lo que una
forma de poder ofrecer este servicio a la poblacioacuten por maacutes tiempo seriacutea la sustitucioacuten del
liofilizado de ureasa por una disolucioacuten de ureasa estable Este anaacutelisis fue llevado a cabo
por (Borges 2014) quieacuten propuso el desarrollo de una formulacioacuten estable de ureasa liacutequida
para la determinacioacuten de urea en sangre sin embargo esta no se comercializa en Cuba
La ureasa (urea amidohidrolasa) es una enzima que se encuentra en muchas plantas
fundamentalmente en las leguminosas Se reportan trabajos que estudian el proceso de
extraccioacuten de esta enzima a partir de fuentes naturales como por ejemplo semillas de soya
frijoles jack garbanzos lentejas etc Ademaacutes en la industria de alimentos se controla la
2
cantidad de ureasa presente en los productos derivados de la soya precisamente por el
efecto inhibidor que produce sobre las propiedades nutritivas que aportan las proteiacutenas
Este estudio permite tener en cuenta la forma en que se produce esta reaccioacuten enzimaacutetica
para otros usos donde el objetivo sea emplear la ureasa para determinar urea en otras
muestras
Especiacuteficamente en la provincia de Villa Clara un grupo de especialistas de la sala de
cuidados intensivos del hospital provincial Arnaldo Miliaacuten Castro han mostrado intereacutes en
la evaluacioacuten de urea en sangre por la importancia de esta determinacioacuten en la deteccioacuten de
enfermedades donde la vinculacioacuten con la Facultad de Quiacutemica y Farmacia de la
Universidad Central Marta Abreu de Las Villas ha abierto nuevas posibilidades de
estudiar la temaacutetica
Basado en estos resultados previos y en la necesidad de encontrar alternativas que permitan
sustituir el reactivo de ureasa liofilizado en los laboratorios cliacutenicos para la evaluacioacuten de la
urea presente en muestras de suero sanguiacuteneo se identifica el siguiente problema cientiacutefico
Problema cientiacutefico iquestEs posible el uso del extracto de ureasa obtenido del frijol de soya
para la determinacioacuten de urea en sangre
Para la solucioacuten del problema se planea la siguiente hipoacutetesis
Si se demuestran las propiedades enzimaacuteticas del extracto de soya obtenido es posible su
empleo en la determinacioacuten de urea en sangre
Objetivo General
Extraer la ureasa presente en el frijol de soya para su uso en la determinacioacuten de urea en
muestras de sangre
Objetivos especiacuteficos
1 Extraer la ureasa presente en el frijol de soya
2 Determinar cualitativa y cuantitativa la actividad enzimaacutetica de la ureasa presente en
el extracto obtenido
3 Realizar el estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica empleando el extracto de soya
3
4 Evaluar la concentracioacuten de urea en muestras de sangre empleando el extracto de
soya
5 Caracterizar preliminarmente el extracto obtenido a partir de la soya
4
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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cantidad de ureasa presente en los productos derivados de la soya precisamente por el
efecto inhibidor que produce sobre las propiedades nutritivas que aportan las proteiacutenas
Este estudio permite tener en cuenta la forma en que se produce esta reaccioacuten enzimaacutetica
para otros usos donde el objetivo sea emplear la ureasa para determinar urea en otras
muestras
Especiacuteficamente en la provincia de Villa Clara un grupo de especialistas de la sala de
cuidados intensivos del hospital provincial Arnaldo Miliaacuten Castro han mostrado intereacutes en
la evaluacioacuten de urea en sangre por la importancia de esta determinacioacuten en la deteccioacuten de
enfermedades donde la vinculacioacuten con la Facultad de Quiacutemica y Farmacia de la
Universidad Central Marta Abreu de Las Villas ha abierto nuevas posibilidades de
estudiar la temaacutetica
Basado en estos resultados previos y en la necesidad de encontrar alternativas que permitan
sustituir el reactivo de ureasa liofilizado en los laboratorios cliacutenicos para la evaluacioacuten de la
urea presente en muestras de suero sanguiacuteneo se identifica el siguiente problema cientiacutefico
Problema cientiacutefico iquestEs posible el uso del extracto de ureasa obtenido del frijol de soya
para la determinacioacuten de urea en sangre
Para la solucioacuten del problema se planea la siguiente hipoacutetesis
Si se demuestran las propiedades enzimaacuteticas del extracto de soya obtenido es posible su
empleo en la determinacioacuten de urea en sangre
Objetivo General
Extraer la ureasa presente en el frijol de soya para su uso en la determinacioacuten de urea en
muestras de sangre
Objetivos especiacuteficos
1 Extraer la ureasa presente en el frijol de soya
2 Determinar cualitativa y cuantitativa la actividad enzimaacutetica de la ureasa presente en
el extracto obtenido
3 Realizar el estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica empleando el extracto de soya
3
4 Evaluar la concentracioacuten de urea en muestras de sangre empleando el extracto de
soya
5 Caracterizar preliminarmente el extracto obtenido a partir de la soya
4
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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3
4 Evaluar la concentracioacuten de urea en muestras de sangre empleando el extracto de
soya
5 Caracterizar preliminarmente el extracto obtenido a partir de la soya
4
Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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Capiacutetulo I Revisioacuten bibliograacutefica
11 La soya
Con el nombre de Legumbres se entiende a los frutos y las semillas de las leguminosas
(garbanzo alverja lentejas habas soya etc) (Ridner 2006)
Las semillas constan de un embrioacuten rodeado por una cubierta protectora y por 2 grandes
hojas de reserva ldquolos cotiledonesrdquo y un tallo Los cotiledones aportan el grueso de la
nutricioacuten como el endospermo en los cereales La composicioacuten de alguna de ellas se
muestra en la tabla 1 (Hernaacutendez 2010)
Legumbre Energiacutea Humedad Proteiacutenas Hidratos de
carbono
Fibra Grasa
Judiacuteas 301 116 213 478 184 16
Guisantes 342 11 229 567 166 14
Lentejas 321 118 235 508 106 14
Garbanzo 337 8 227 546 107 3
Soya 357 85 369 61 209 181
Vitaminas Destacan acido foacutelico niacina riboflavina tiamina
Minerales Destacan calcio hierro fosforo potasio magnesio
Fitoquiacutemicos Isoflavonas (especialmente soya) lignanos
Tabla 1 Composicioacuten quiacutemica de las legumbres maacutes comunes ()
Mucho de estos componentes son beneficiosos para la salud como por ejemplo los
fitoquiacutemicos que pueden tener una funcioacuten importante en la reduccioacuten del riesgo de
desarrollar enfermedades croacutenicas(Torres and Palacios 2009) De todas ellas se
profundizaraacute en el estudio de la soya por ser de intereacutes en esta investigacioacuten
Con el nombre de soja o soya se entiende a la semilla del Glycinemax L Merr Esta
leguminosa es oriunda de China donde se le considera uno de los alimentos maacutes
importantes por su alto contenido de proteiacutenas y la amplia gama de alimentos a los que da
origen como el tofu la leche de soya y el natto entre otros (Allauca 2007)
5
111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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111 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Se ha encontrado datos que se refieren la composicioacuten de la soya en base seca la cual se
reporta en la tabla 2 (Boada 2014)
Proteiacutena Grasa Hidratos de
carbono
Cenizas Constituyentes
de la semilla
Soya total 40 21 34 49 -
Cotiledoacuten 43 23 29 50 90
Cascarilla 9 1 86 44 8
Hipocotilo 41 11 43 43 2
Tabla 2 Composicioacuten de la soya y de sus partes en base seca ()
Algunos de estos constituyentes aparecen ampliados a continuacioacuten
Liacutepidos
Aceite rico en aacutecidos grasos insaturados
12 de aacutecidos grasos saturados
20 de aacutecido oleico
60 de aacutecido linoleacuteico
4 de aacutecido linoleacutenico
Lecitina (propiedades emulsionantes y antioxidantes)
Isoflavonas genisteiacutena y daidzeiacutena actividad estrogeacutenica
Fibra soluble e insoluble
Ureasa
Hemaglutininas se inactivariacutean in vivo
Saponinas productoras de espuma Compuestos con sabores despreciables
(Hernaacutendez 2010)
Proteiacutenas globulinas (60 a 75 del total) y de albuacuteminas son deficientes en
metionina y cisteiacutena (Botta 1999) Rica en lisina (complemento de las proteiacutenas de
cereales)
La soya tambieacuten contiene antinutrientes como los inhibidores de tripsina y de
quimotripsina los cuales son muy difiacuteciles de eliminar sin embargo se conoce que
tienen un comportamiento semejante al de la ureasa frente a la accioacuten de la
6
temperatura por lo que mediante tratamientos teacutermicos si se elimina la actividad
ureaacutesica se elimina la accioacuten de estos inhibidores (Dergal 2000)
12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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12 Las enzimas
Las enzimas son proteiacutenas o aacutecidos nucleicos tienen masas molares entre 12000 y 1 milloacuten
de Daltons Son especiacuteficas de los sustratos yo reacciones que catalizan aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 10
17 veces siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataliacutetico
121 Funciones de las Enzimas
En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas que se describen a
continuacioacuten
1 Cataacutelisis La mayoriacutea de las reacciones quiacutemicas del metabolismo son lentas las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efectuacutee a la velocidad
que las ceacutelulas demandan
2 Direccioacuten Las enzimas no permiten la formacioacuten de productos secundarios de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energiacutea que la ceacutelula necesita
3 Control La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas
4 Acoplamiento Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontaacuteneas permitiendo que las mismas se realicen(Laidler
1973)
122 Composicioacuten y estructura
En 1905 Arthur Harden descubrioacute que la actividad de las enzimas requeriacutea de dos
fracciones una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura a la que llamoacute zimasa y otra
filtrable y de resistente al calentamiento la cozimasa La zimasa de Harden estaacute formada
por las proteiacutenas mientras que la cozimasa conteniacutea los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas
Los grupos quiacutemicos no proteiacutenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoriacuteas
7
1 Cofactores De naturaleza inorgaacutenica frecuentemente iones metaacutelicos entre los maacutes
comunes estaacuten Fe2+
Cu1+
Mg2+
Mo2+
Mn2+
y Zn2+
(Nelson 1992)
2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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2 Coenzimas Compuestos orgaacutenicos muchos de ellos derivados de vitaminas tambieacuten
conocidos como Cosustratos Algunos ejemplos son aacutecido lipoacuteico pirofosfato de tiamina
biotina y vitamina B12 Tradicionalmente se llaman coenzimas a los cosustratos libres
que se separan de la enzima por diaacutelisis
3 Grupos prosteacuteticos Se denomina asiacute a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima a veces mediante enlaces covalentes y no se separan por diaacutelisis
(Nelson and Cox 1992a)
Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas
1 Holoenzimas Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataliacutetica alta porque
estaacuten unidas a su coenzima o cofactor
2 Apoenzima Es la parte proteiacutenica de una enzima conjugada cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios En estas condiciones la proteiacutena pierde parte o
toda su actividad cataliacutetica
Basaacutendose en lo anterior se dice que la proteiacutena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la cataacutelisis
El primer paso en la cataacutelisis enzimaacutetica es la unioacuten del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES) El sustrato se une a la enzima en un lugar
especiacutefico de esta llamado Sitio Activo
El complejo ES se ha estudiado en varias enzimas usando teacutecnicas como la microscopiacutea
electroacutenica difraccioacuten de rayos X Resonancia Magneacutetica Nuclear y varios meacutetodos
espectroscoacutepicos determinaacutendose que las propiedades maacutes importantes del sitio activo
son(Voet and Voet 2004 )
1 Constituye soacutelo una pequentildea parte de toda la estructura de la enzima
2 Es el sitio de reconocimiento y unioacuten del sustrato
3 Contiene los restos de aminoaacutecidos que participan en las reacciones quiacutemicas
8
4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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4 Tiene una forma tridimensional caracteriacutestica determinada por el arreglo de restos de
aminoaacutecidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminoaacutecidos que se
aproximan entre siacute
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como
1 Enlaces electrostaacuteticos
2 Enlaces de hidroacutegeno
3 Fuerzas de Van der Waals
4 Interacciones hidroacutefobas
123 Mecanismos de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten mediante factores como
1 La orientacioacuten de los sustratos en el sitio activo es la maacutes apropiada para la reaccioacuten
2 La participacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos en el complejo ES permite
estabilizar los estados de transicioacuten
3 Los cambios de conformacioacuten de la enzima provocados por la unioacuten del sustrato al sitio
activo inducen tensioacuten en la moleacutecula y facilitan el rompimiento de enlaces
Ocasionalmente tambieacuten se pueden formar enlaces covalentes de corta duracioacuten(Webb
1963)
Existen dos modelos para explicar la unioacuten de la enzima y el sustrato en la cataacutelisis
enzimaacutetica
1 Modelo de la llave y la cerradura Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX Considera que la enzima es una estructura riacutegida a la cual se debe ajustar el sustrato
(Arias 2008)
2 Modelo de ajuste inducido Desarrollado por Daniel Koshlanden la deacutecada de 1960
Supone que la enzima es flexible capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unioacuten del sustrato moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccioacuten
124 Formas de expresar la actividad enzimaacutetica
La actividad de una enzima se puede expresar en teacuterminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI) La UI (recomendada por la Unioacuten Internacional de
9
Bioquiacutemica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversioacuten de un
micromol de sustrato en un minuto (micromolmin) La actividad especiacutefica es el nuacutemero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de proteiacutena (UImg de proteiacutena)
125 Fundamentos teoacutericos de los estudios cineacuteticos en reacciones enzimaacuteticas
Las enzimas son catalizadores bioloacutegicos en la mayoriacutea de los casos de naturaleza proteica
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E)
La mayoriacutea de las reacciones bioloacutegicas transcurren lentamente si no son catalizadas en
esencia las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacioacuten de los estados de
transicioacuten disminuyendo asiacute la energiacutea de activacioacuten en consecuencia la velocidad de la
reaccioacuten aumenta este fenoacutemeno se muestra en la figura 1
Figura 1 Efecto de las enzimas sobre la energiacutea de activacioacuten de la reaccioacuten
1251 Factores que inciden en la actividad enzimaacutetica
Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como la
temperatura del medio el pH la concentracioacuten de enzima el tiempo de incubacioacuten y la
concentracioacuten de sustrato
Efecto de la temperatura de incubacioacuten Dentro de ciertos liacutemites la velocidad de
reaccioacuten aumenta con la temperatura Como regla general se cumple que por cada aumento
10
de 10 degC la velocidad de una reaccioacuten se duplica En caso de reacciones enzimaacuteticas se
observa una temperatura oacuteptima por encima de la cual la velocidad decrece raacutepidamente
debido a la desnaturalizacioacuten de la enzima La temperatura de maacutexima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de maacutexima estabilidad El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimaacutetica se muestra en la Figura 2 (Arias 2008)
Figura 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Efecto del pH del medio de incubacioacuten Cambios moderados en el pH afectan el estado
ioacutenico de la enzima y con frecuencia tambieacuten del sustrato A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacioacuten de la enzima de ahiacute la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacioacuten del pH oacuteptimo este comportamiento se muestra en la Figura 3
donde se representa velocidad contra pH
Figura 3 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
Concentracioacuten de la enzima La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del
producto de reaccioacuten en funcioacuten del tiempo de incubacioacuten Ademaacutes se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracioacuten de enzima desde E1 a E4)
11
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta
en funcioacuten del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0)
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio) La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de enzima empleada Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima a
un tiempo fijo A una concentracioacuten de sustrato constante y en un rango de concentracioacuten
de enzima baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de enzima Sin embargo cuando la concentracioacuten de
enzima es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccioacuten La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej μmolesmin)
(Nelson and Cox 1992b)
Figura 4 Formacioacuten de producto en funcioacuten del tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una concentracioacuten de sustrato constante
Figura 5 Velocidad de reaccioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de enzima
12
Tiempo de incubacioacuten En la figura 6 se observa la variacioacuten de las concentraciones de
complejo enzima sustrato (E-S) de sustrato (S) de enzima (E) y de producto (P) en
funcioacuten del tiempo
Figura 6 Variacioacuten de la concentracioacuten de las especies quiacutemicas que participan en una
reaccioacuten catalizada por enzimas en funcioacuten del tiempo (E) concentracioacuten de enzima (S)
concentracioacuten de sustrato (ES) concentracioacuten de complejo enzima sustrato (P)
concentracioacuten de producto
Efecto de la concentracioacuten de sustrato Modelo cineacutetico de Michaelis-Menten
Para explicar las caracteriacutesticas cineacuteticas de algunas reacciones Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7) Este modelo asume que la
reaccioacuten inversa praacutecticamente no ocurre lo cual es posible a tiempos muy cortos (Perillo
2013) Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcioacuten
del tiempo cuando la concentracioacuten de producto es baja es decir a tiempos proacuteximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial
A su vez la ecuacioacuten de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicioacuten de estado estacionario en donde la concentracioacuten del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo
13
Figura 7 Curva de MichaelisndashMenten de Vo en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
La ecuacioacuten de MichaelisndashMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas
que son maacutes uacutetiles para el manejo de los datos experimentales Una de las maacutes utilizadas es
la transformacioacuten Lineweaver-Burk (Nelson and Cox 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V maacutexima de forma sencilla figura 8(Voet and Voet 2004 )
Figura 8 Representacioacuten de Lineweaver-Burk
A partir del graacutefico se puede determinar las constantes cineacuteticas que caracterizan a una
enzima Km (constante de Michaelis) y Vmaacutex (velocidad maacutexima) para un sustrato en
condiciones determinadas
Km este valor corresponde a la concentracioacuten de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmaacutex y estaacute relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato
14
Vmaacutex es la velocidad que se alcanza cuando la enzima estaacute saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato)
En cuanto a KM como ya se expresoacute que viene dada por
1
21
k
kkKM
Siendo
Constante de reaccioacuten directa de la primera etapa k1
Contante de la reaccioacuten inversa de la primera etapa k-1
Constante de la reaccioacuten de la segunda etapa k2
Los valores de KM para la mayoriacutea de las enzimas oscilan entre 10-1
y 10-7
molL(Stryer et
al 2013)
13 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa)
La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926 hecho que le permitioacute recibir el Premio Nobel en la Quiacutemica en
1946
La ureasa (urea amidohidrolasa) una enzima que se encuentra en muchas plantas cataliza
la hidroacutelisis de urea para formar amoniacuteaco e hidroacutegeno carbonato La funcioacuten principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitroacutegeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente (Romero 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacioacuten
debido a las reacciones que cataliza
ndash Accioacuten sobre enlaces carbono-nitroacutegeno (salvo enlaces peptiacutedicos)
ndash Sobre amidas lineales
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas
plantas hongos y bacterias
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana se deduce el
mismo patroacuten de cataacutelisis principalmente a causa de la secuencia similar de aminoaacutecidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+
en el sitio activo de la enzima (Hanif et al 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son proteiacutenas homondasholigomeacutericas de 90 KDa mientras que
las ureasas bacterianas son multiacutemeros de dos o tres subunidades complejas Los residuos
15
amino terminales de los monoacutemeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequentildeas subunidades de las enzimas bacterianas La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chiacutecharo (Canavalia Ensiformis) otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) asiacute como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del geacutenero Arabidopsis Las ureasas en la mayoriacutea
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones (Olivera et al 2006)
Las ureasas bacterianas desempentildean roles de virulencia humana y animal Bacterias
productoras de ureasa consideradas patoloacutegicas son Proteusmirabilis Staphylococcuss
aprophiticus Yersiniaenterocolitica Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum entre
otras (Sirko and Brodzik 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como uacutelceras duodenales y estomacales
carcinomas gaacutestricos y linfomas
131 Estructura de la ureasa
La ureasa estaacute unida a dos iones de niacutequel por subunidad tiene cuatro histidinas un
aspartato y una moleacutecula de carbamatondashlisina que sirve como ligando para estos metales
una histidina adicional estaacute involucrada en el mecanismo cataliacutetico El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (α β) con una estructura similar a la de otras hidrolasas
(Carlsson and Nordlander 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos moleacuteculas
de agua y un puente OH- La estructura se muestra en la figura 9
Figura 9 Estructura quiacutemica de la ureasa
16
132 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
El mecanismo de reaccioacuten es una interaccioacuten cooperativa entre los dos iones del niacutequel
Uno de los iones de niacutequel actuacutea como un aacutecido de Lewis El ioacuten metaacutelico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carboniacutelico y hacieacutendolo maacutes
reactivo a la adicioacuten nucleofiacutelica (Carlsson and Nordlander 2010)
El otro ioacuten de niacutequel aumenta la acidez de la moleacutecula de agua enlazada a eacutel provocando la
peacuterdida de un protoacuten y formaacutendose el ioacuten OH- fuerte nucleoacutefilo que ataca al carbono
carboniacutelico parcialmente positivo de la urea producieacutendose el ataque nucleofiacutelico
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado Se postula que la histidina es
el aacutecido Como resultado de la reaccioacuten se forma amoniacuteaco y carbamida aacutecida El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10 (Romero 2013)
Figura 10 Mecanismo de reaccioacuten de la ureasa
La carbamida aacutecida se descompone espontaacuteneamente para formar amoniacuteaco y dioacutexido de
carbono (Romero 2013)
En disolucioacuten acuosa se presenta el siguiente equilibrio
La ureasa es una enzima absolutamente especiacutefica por su sustrato la urea y compuestos
anaacutelogos estructurales como la thiourea no son degradados por esta enzima
17
14 La urea como sustancia quiacutemica
Urea Carbamida o Urea Compuesto quiacutemico cristalino e incoloro Su foacutermula quiacutemica
global es
(NH2)2CO
Tambieacuten es conocida como carbonildiamida o aacutecido carbamiacutedico El nombre IUPAC es
diaminocetona
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacioacuten del amoniacuteaco el cuaacutel es altamente toacutexico para ellos En los animales se halla
en la sangre orina bilis y sudor
Posee propiedades higroscoacutepicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
friacuteo y huacutemedo al tacto
141 Propiedades fiacutesicas y quiacutemicas
Foacutermula global CON2H4
Foacutermula semidesarrollada NH2ndashCOndashNH2
Masa molecular 6006 gmol-1
Estado de agregacioacuten soacutelido
Densidad 134 gcmsup3
Temperatura de fusioacuten 1327 ordmC
Calor de fusioacuten 2418 Jg
Calor de combustioacuten 10 590 Jg
Calor de disolucioacuten en agua 2418 Jg
142 Estructura
El carbono es el aacutetomo central de la moleacutecula de carbamida al cual se une un aacutetomo de
oxiacutegeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la moleacutecula una
estructura trigonal plana
143 Obtencioacuten
La carbamida se obtiene sinteacuteticamente a partir del amoniacuteaco (NH3) y el dioacutexido de
carbono (CO2) cuya interaccioacuten comprende dos etapas
18
En la primera tiene lugar la formacioacuten de carbamato de amonio seguacuten la reaccioacuten
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 ΔH= 1591 kJ
En la segunda etapa ocurre la deshidratacioacuten del carbamato formaacutendose la carbamida
NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O ΔH= ndash 285 kJ
Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 ordmC y
presioacuten de 18∙106 - 2∙107 Nm2 (200 atmoacutesferas)
144 Aplicaciones de la urea
Maacutes del 90 de la produccioacuten mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a traveacutes del riego
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plaacutesticos valiosos como los
llamados plaacutesticos amiacutenicos losas de viruta de madera colas sinteacuteticas y compuestos para
impregnar tejidos La carbamida tiene una amplia aplicacioacuten en la industria farmaceacuteutica
estando presente en la composicioacuten quiacutemica de medicamentos como la carbamazepina y
otros
15 Reacciones para la determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo
A partir del anaacutelisis bibliograacutefico realizado se identificaron varios meacutetodos para la
determinacioacuten de urea en plasma sanguiacuteneo los cuales se mencionaran a continuacioacuten
151 Reaccioacuten de Berthelot
Fundamento del meacutetodo La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra
formaacutendose amoniacuteaco y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El amoniacuteaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul cuya
concentracioacuten se puede determinar espectrofotomeacutetricamente (Cruz 2004)
152 Reaccioacuten de Nessler
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra formaacutendose amoniacuteaco y
anhiacutedrido carboacutenico (CO2) El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitroacutegeno del amoniacuteaco para producir un compuesto de color amarillo
19
153 Reaccioacuten de Berthelot modificada para determinar urea en sangre
La ureasa cataliza la hidroacutelisis de la urea presente en la muestra en amoniacuteaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhiacutedrido carboacutenico (CO2) Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO) en presencia del catalizador nitroprusiato para
formar 22 dicarboxiindofenol de color verde La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracioacuten de urea en la muestra ensayada (Cruz 2004)
La teacutecnica analiacutetica a aplicar se basa en la reaccioacuten de Berthelot modificada por lo cual se
utilizaraacuten los reactivos provistos por QUIMEFA Esta teacutecnica tiene su fundamento en los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos que permiten la determinacioacuten cuantitativa de muchas
especies tanto orgaacutenicas como inorgaacutenicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos
16 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Los meacutetodos espectrofotomeacutetricos de absorcioacuten molecular se basan en la medida de la
absorcioacuten de la radiacioacuten electromagneacutetica por las sustancias y son tambieacuten llamados
meacutetodos absorciomeacutetricos La absorcioacuten de la radiacioacuten visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacioacuten cuantitativa de muchas especies quiacutemicas (Harris 1996)
161 La absorcioacuten de la radiacioacuten Ley fundamental de la absorcioacuten (Ley de Lambert-
Bouguer-Beer)
Cuando un haz de energiacutea radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucioacuten homogeacutenea) contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenoacutemenos
1 La radiacioacuten puede pasar a traveacutes de la sustancia sin que ocurra absorcioacuten
2 La radiacioacuten puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva)
3 La direccioacuten de propagacioacuten de la radiacioacuten puede ser alterada mediante la reflexioacuten
refraccioacuten o dispersioacuten por las partiacuteculas en suspensioacuten (Ayres 1970)
La ley fundamental de la absorcioacuten plantea
Donde es la absortividad molar de la sustancia b es la longitud de la celda (camino
oacuteptico) y c es la concentracioacuten de la sustancia
20
El cumplimiento de dicha ley es la base del meacutetodo espectrofotomeacutetrico de anaacutelisis
cuantitativo Su representacioacuten graacutefica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas (Salvatierra et al 2005)
162 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometriacutea de absorcioacuten UV-
VISIBLE
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcioacuten de la radiacioacuten UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacioacuten de la absorcioacuten de la radiacioacuten de determinada longitud
de onda de una disolucioacuten de la especie absorbente que se analiza con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo ideacutenticas condiciones
En la praacutectica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucioacuten de referencia o
blanco la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza
(Alexeacuteiev 1988)
Se obtiene asiacute una curva de calibracioacuten que no es maacutes que un graacutefico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracioacuten de los patrones Se determina la
absorbancia de la disolucioacuten que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracioacuten
para obtener asiacute la concentracioacuten de la sustancia en la muestra
17 Procesos de extraccioacuten
La extraccioacuten es una teacutecnica de separacioacuten que se puede aplicar a todo tipo de mezclas ya
sean eacutestas soacutelidas liacutequidas o gaseosas La extraccioacuten se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado La forma maacutes simple de
realizar una extraccioacuten consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demaacutes no Sin embargo la teacutecnica de
extraccioacuten maacutes empleada consiste en la disolucioacuten de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes(Mitra 2003) A continuacioacuten se procede a la adicioacuten
de un segundo disolvente no miscible con el primero de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes seguacuten su coeficiente de reparto
21
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccioacuten consiste en la obtencioacuten del
extracto que implica la destruccioacuten de la ceacutelula y el paso de la enzima a la solucioacuten o
suspensioacuten esto puede llevarse a cabo por
Homogenizacioacuten mecaacutenica Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio mortero
licuadora a veces con el uso de abrasivos como aluacutemina con un solvente adecuado
isotoacutenico (sacarosa 025 molL NaCl 09 KCl 015molL) o ligeramente
hipertoacutenico en un buffer adecuado para controlar el pH
Homogenizacioacuten soacutenica El choque de ondas soacutenicas o ultrasoacutenicas provoca cambio
de presioacuten que rompe las paredes celulares Se usa generalmente para bacterias
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso rintildeoacuten
eritrocitos)
Desintegracioacuten teacutermica El congelamiento y descongelamiento raacutepidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos Por congelacioacuten se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura Al descongelarse las
ceacutelulas se destruyen osmoacuteticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido (Calvo 2016)
Desintegracioacuten quiacutemica Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol eacuteter de petroacuteleo isopentanol etc
Homogenizacioacuten por deshidratacioacuten Se basa en la precipitacioacuten de proteiacutenas por
disolventes orgaacutenicos como la acetona(Calvo 2016)
18 Proteiacutenas
181 Solubilidad y precipitacioacuten de las proteiacutenas
La solubilidad de una buena cantidad de proteiacutenas es funcioacuten de la fuerza ioacutenica el pH y la
concentracioacuten de disolventes orgaacutenicos A bajas concentraciones salinas del disolvente las
proteiacutenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples es decir cumplen la teoriacutea de Debye-Huckel o sea en esta regioacuten de
concentraciones de sal el aumento de eacutesta estabiliza los grupos cargados sobre la proteiacutena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacioacuten por salado salting-In) (Tangarife
2008) El fenoacutemeno contrario (precipitacioacuten por salado salting-out) que se observa a altas
fuerzas ioacutenicas Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas la
22
concentracioacuten efectiva de las moleacuteculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacioacuten total de la proteiacutena por lo tanto la interaccioacuten proteiacutena-proteiacutena
predomina sobre la interaccioacuten proteiacutena-agua y ocurre la precipitacioacuten
La solubilidad de la mayoriacutea de las proteiacutenas a una fuerza ioacutenica constante presenta un
miacutenimo cerca del punto isoeleacutectrico A este pH las repulsiones electrostaacuteticas
intermoleculares entre las moleacuteculas de soluto estaacuten minimizadas lo mismo que las
interacciones electrostaacuteticas entre los grupos polares cargados y el agua por lo tanto las
proteiacutenas precipitan maacutes faacutecilmente (Perillo 2013) La mayoriacutea de los disolventes
orgaacutenicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dieleacutectrica
182 Clasificacioacuten de Osborne de las proteiacutenas por el criterio de solubilidad
La clasificacioacuten comuacutenmente usada no se basa en aspectos estructurales de eacutestas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un liacutemite fijo sin embargo permite el fraccionamiento de
las proteiacutenas provenientes de una misma fuente Seguacuten Osborne las proteiacutenas vegetales
pueden clasificarse seguacuten su solubilidad en albuacuteminas globulinas y glutelinas
Las albuacuteminas corresponden al grupo de proteiacutenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas(Tangarife 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar en concentraciones entre el 50 y el 90
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de aacutecido o bases
23
Capiacutetulo II Materiales y meacutetodos
En este capiacutetulo se presentan cuatro meacutetodos para la extraccioacuten de la ureasa presente en la
soya a la cual se les mediraacute la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amoniacuteaco A continuacioacuten se realizaraacute la cineacutetica a la reaccioacuten con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
paraacutemetros que garanticen la mayor actividad de la misma para ello se determinaraacuten los
efectos de la temperatura y el pH cuya influencia sobre la actividad es determinante a cada
prueba se le realizaran tres reacuteplicas
Una vez fijados estos paraacutemetros se procederaacute a cuantificar el efecto de la concentracioacuten de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto Posteriormente se mediraacute
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se compararaacute con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizaraacute el mismo tratamiento este resultado
permitiraacute avalar o no el posible uso del extracto para la evaluacioacuten de urea en sangre
ensayo que seraacute realizado de obtenerse un resultado positivo Para una caracterizacioacuten maacutes
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizaraacute
la determinacioacuten de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne Ademaacutes se desarrollaraacute una evaluacioacuten preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido
21 Extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya
Para la extraccioacuten de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro meacutetodos reportados en
la literatura La diferencia entre ellos estaacute en el tipo de disolvente empleado A
continuacioacuten se describen cada uno de ellos
Meacutetodo 1 Meacutetodo de Lorenc (Lorenc 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipeta graduada (01 mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Papel de filtro
24
Reactivos
Agua destilada
soya
Procedimiento
1 Remojar las semillas de soya en agua durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche)
2 Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla esteacute suave (unos 5 min)
3 Filtrar el pureacute de soja a traveacutes de papel de filtro en un embudo
4 Reunir y conservar el filtrado que contiene ureasa
Meacutetodo 2 Meacutetodo de Schosinsky (Bolantildeos et al 2003)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Bomba a vaciacuteo marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Etanol
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Disoluciones
Etanol al 30 Tomar 1579 mL de etanol al 95 y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada
Procedimiento
1 Moler la soya
2 Pesar 10 g de frijol de soya molido
25
3 Antildeadir 30 mL de etanol al 30 a la soya molida y agitar durante 1 hora en bantildeo de
hielo
4 Filtrar la mezcla al vaciacuteo recogiendo el filtrado y antildeadir 50 mL de acetona
5 Centrifugar y decantar el liacutequido sobrenadante Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL
Meacutetodo 3 Meacutetodo de Donal y Van Slyke (Velaacutezquez 1998)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (01mL 05 mL 5 mL 10 mL)
Centriacutefuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos
Acetona
Agua destilada
Soya molida
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada agitar la mezcla
durante 1hora
2 Decantar el liacutequido sobrenadante y antildeadir a este 10 mL de acetona
3 Centrifugar descartando el liacutequido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL
Meacutetodo 4 Meacutetodo salting- in (Tangarife 2008)
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Centriacutefuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos
NaCl 1
26
Procedimiento
1 Pesar 10 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1
2 Agitar durante 3 minutos
3 Llevar al tubo de centriacutefuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min
4 Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL
22 Medicioacuten de la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
En los laboratorios de anaacutelisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad ureaacutesica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa por lo que en este trabajo se
utiliza este meacutetodo pero en sentido contrario poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa con una solucioacuten de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura lo que provoca que el pH de la misma aumente siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimaacutetica este es el fundamento del meacutetodo
cualitativo (Botta 1999)
Por otra parte una forma para establecer actividad enzimaacutetica es a traveacutes de la medicioacuten de
su producto generado Este puede ser determinado a traveacutes de la espectrofotometriacutea es por
eso que este seraacute el meacutetodo cuantitativo empleado teniendo en cuenta que para el suero el
rango en que se encuentra la urea es de 33-83 mmolL en niveles normales y hasta 266
mmolL en niveles patoloacutegicos datos reportados por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones la longitud de onda de maacutexima
absorcioacuten es 630 nm (2000a)
221 Meacutetodo cualitativo para determinarla actividad enzimaacutetica
La teacutecnica empleada para la medicioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica se describe a
continuacioacuten
Instrumental
Potencioacutemetro Microprocessor pHmeter modelo pH213 provisto de electrodos de vidrio
y calomel
27
Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapoacuten de caucho
Balanza analiacutetica sensible al 01 mg Marca Sartorius modelo BP221S
Reactivos
- Dihidroacutegeno fosfato de potasio (KH2PO4)
- Hidroacutegeno fosfato de potasio (K2HPO4)
- Urea reactivo para anaacutelisis
Preparacioacuten de las disoluciones de trabajo
- Disolucioacuten tampoacuten 005 molL de fosfato de potasio Disolver 03403 g de Hidroacutegeno
fosfato de potasio y 04355 g de dihidroacutegeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 70 si no lo es ajustar a este valor mediante soluciones de aacutecidos o bases
fuertes seguacuten sea el caso La vida uacutetil de esta disolucioacuten es de 90 diacuteas (Botta 1999) El
tampoacuten debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicioacuten
- Disolucioacuten tampoacuten de urea-fosfato de potasio Disolver 15 g de urea en 50 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
- De la disolucioacuten tampoacuten de urea fosfato de potasio se tomaron voluacutemenes de 053 mL
033 mL 024 mL 016 mL 012 mL 007 mL en matraces de 10 mL enrasando con
disolucioacuten buffer de fosfatos
Procedimiento para medir la actividad ureaacutesica en el extracto de soya
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucioacuten
tampoacuten de urea-fosfato de potasio
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucioacuten tampoacuten de fosfato de potasio
Caacutelculos
La actividad de la ureasa medida como el incremento de pH se determina aplicando la
siguiente ecuacioacuten
∆pH = pH1- pH2
donde
∆pH incremento de pH debido a la ureasa
pH1 pH leiacutedo para la muestra analizada
28
pH2 pH leiacutedo para el blanco
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres reacuteplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacioacuten en el pH
222 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica por meacutetodos
espectrofotomeacutetrico
Para la realizacioacuten de este ensayo se procederaacute a la preparacioacuten de una curva de calibracioacuten
en la cual seraacuten sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo a una
longitud de onda de 630 nm En el caso de la medicioacuten de la actividad del extracto se
antildeaden 005 mL de extracto y se omite la preparacioacuten del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color
Para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten se tomaron 00449 mL de una solucioacuten de
NH4OH al 280 y se llevoacute a un matraz de 25 mL del que se tomaron voluacutemenes de 113
mL 199 mL 312 mL 629 mL y 10 mL correspondientes a la concentraciones de 33
mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL y 266 mmolL respectivamente en cada
caso de enrasoacute con solucioacuten buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anaacutelisis
se realizoacute una 37 0C
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el meacutetodo
cualitativo
Instrumental
Balanza analiacutetica Sartorius modelo BP221S
Pipetas graduadas (2mL)
Micropipeta (50microL)
Matraces aforados (25 mL 10mL)
Termostato
Reloj
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
29
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
Ureasa comercial
Reactivo de trabajo reactivo color + ureasa comercial
Urea
NH4OH (280)
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Medir absorbancia a 630 nm
3 Calcular la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3 4 y 5 Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracioacuten ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Tabla 3 Procedimiento a seguir para la preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( microL)
-
20
20
20
20
20
Agua
destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Reactivo
color
(mL)
2
2
2
2
2
2
30
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
-
-
-
-
Urea
( microL)
-
20
20
20
20
20
Ureasa
extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
Tabla 4 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica
del extracto
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL)
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
( microL)
20
-
20
-
20
-
Urea
( microL)
-
2
0
-
20
-
2
0
Tabla 5 Procedimiento a seguir para la medicioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica de
la ureasa comercial
31
23 Estudio cineacutetico de la enzima ureasa extraiacuteda de la soya
Para la medicioacuten correcta de la actividad enzimaacutetica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican y que pueden provocar la desnaturalizacioacuten de la enzima
Estos factores son el pH la temperatura y el efecto de la concentracioacuten de sustrato que
variacutean en cada enzima e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extraiacuteda puede presentar diferencias en estos factores de ahiacute la importancia de su
medicioacuten Para el estudio cineacutetico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 20 mL y 10 mL
Micropipeta 50 microL
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Termostato
Reloj
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 45
Buffer fosfato 01 molL y pH 57
Buffer fosfato 01 molL y pH 70
Buffer fosfato 0 1 molL y pH 8
Reactivos provistos por QUIMEFA
Reactivo color que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio
Reactivo alcalino que contiene hipoclorito de sodio e hidroacutexido de sodio
32
Preparacioacuten de las soluciones de trabajo
Buffer de fosfatos (Solucioacuten A y B) e hidroacutexido de sodio
Solucioacuten A (NaH2PO4 02 molL) disolver 138 g de NaH2PO4 H2O en agua
destilada y enrasar hasta 50 mL
Solucioacuten B (NaHPO4 02 molL) 26825 g de Na2HPO4 7 H2O se disuelven en
agua destilada llevando el volumen final a 50 mL
Hidroacutexido de sodio (NaOH) de concentracioacuten 01 molL Pesar 004 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL
Se preparan disoluciones a los diferentes pH seguacuten se muestra en la tabla 6 las cuales
seraacuten utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
(Pucciarelli 2001) (Ortellado and Casas 2001)
NaOH
(mL)
Solucioacuten A
(mL)
Solucioacuten B
(mL)
Agua destilada
(ml)
pH
26 15 - - 45
- 234 16 25 57
- 98 153 25 7
- 13 238 25 8
Tabla 6 Preparacioacuten de las soluciones a los diferentes pH
Procedimiento
1 Desarrollar color
2 Determinacioacuten de la absorbancia
3 Determinacioacuten de la temperatura y el pH oacuteptimos asiacute como el efecto de la
concentracioacuten de sustrato
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el meacutetodo cualitativo
en el anaacutelisis del efecto de la temperatura para el efecto del pH se pesaron 00124 g de urea
para cada disolucioacuten buffer a ensayar
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7 8 y 9 en cada
cado B es el blanco y los nuacutemeros representan los patrones a ensayar Una vez preparados
33
los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura efecto del pH y de la concentracioacuten de
sustrato) se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima (excepto en el efecto
de la concentracioacuten de sustrato donde tambieacuten se evaluacutea el efecto del tiempo y se
realiza seguacuten se refleja en la tabla 9)
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos
B 1 B
2 B
3 B
4 B
5 B
6
Reactivo color
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(microL)
20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea 83 mmolL
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50
Tabla (VII) Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto de la temperatura sobre la
actividad ureaacutesica
34
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua
destilada(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
833mmol-L
(microL)
-
20
-
20
-
20
-
20
-
20
Extracto
(mL)
005 005 005 005 005 005 005 005 005 005
pH 45 45 57 57 7 7 8 8 10 10
Tabla 8 Procedimiento a seguir para la medicioacuten el efecto del pH sobre la actividad
ureaacutesica
Tabla 9 Procedimiento a seguir para la medicioacuten del efecto de la concentracioacuten de sustrato
sobre la actividad ureaacutesica
Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
20
-
20
-
20
-
20
-
Urea
(microL)
- 20 - 20 - 20 - 20 - 20
Extracto
(mL)
005
005
005
005
005
005
005
005
005
005
Tiempo de incubacioacuten
(minutos)
2
2
4
4
6
6
8
8
10
10
35
Tratamiento de resultados
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH se procesan de
forma similar de la siguiente manera
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia
Obtener el graacutefico de actividad vs temperatura y pH respectivamente
Determinar la temperatura y el pH oacuteptimo seguacuten corresponda
Efecto de la concentracioacuten de sustrato se procede seguacuten se describe a continuacioacuten
Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracioacuten para el amoniacuteaco y
obtener los mmolL de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmolL de urea que reaccionaron para cada tubo
Obtener el graacutefico de concentracioacuten (mmolL) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales
Realizar el graacutefico de Lineweaver-Burk
Representar el comportamiento seguacuten el modelo de Michaelis - Menten
24 Meacutetodo de Berthelot modificado para la determinacioacuten de urea en suero
Para la determinacioacuten de urea en suero se aplicoacute Meacutetodo de Berthelot el cual se describe a
continuacioacuten El procedimiento se realizoacute seguacuten lo planteado por el EPB ldquoCarlos J Finlayrdquo
en el kit de reactivos para la determinacioacuten de urea en sangre
Reactivos
Reactivos provistos por QUIMEFA
Disoluciones estaacutendar de urea (33 mmolL - 266 mmolL)
Agua destilada
Instrumental
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Pipetas (2 mL)
Micropipeta (50microL)
Termostato
36
Reloj
Procedimiento
1 Desarrollo de color
2 Medicioacuten de la absorbancia a 630 nm
3 Caacutelculo de la actividad ureaacutesica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto
La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10 Una vez preparados los
ensayos se procede siguiendo las siguientes etapas
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Adicionar el reactivo alcalino 2 mL en cada tubo
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura oacuteptima
Leer la absorbancia a 630 nm El color es estable por 1 hora
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra
Reactivo color
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
Agua destilada
(microL)
20
-
-
-
-
-
-
Urea (microL) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml)
005
005
005
005
005
005
005
plasma
sanguiacuteneo
(microL)
-
-
-
-
-
-
20
Tabla 10 Procedimiento a seguir para la determinacioacuten de urea en suero
37
25 Caracterizacioacuten del extracto de ureasa obtenido de la soya
251 Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales
La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas es por esta razoacuten y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacioacuten del extracto que se determinaraacute el contenido
de proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
gL seguacuten lo planteado por (Tangarife 2008) Esta reaccioacuten la producen los peacuteptidos y las
proteiacutenas pero no los aminoaacutecidos ya que se debe a la presencia del enlace peptiacutedico que
se destruye al liberarse los aminoaacutecidos cuando una proteiacutena se pone en contacto con un
aacutelcali concentrado se forma un complejo que en contacto con una solucioacuten de sulfato
cuacuteprico diluida da una coloracioacuten violeta caracteriacutestica (Calle et al 2013) (Butendieck
and Castillo 2014)
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml
Tubos para centriacutefuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 05 ml y 50 ml
Espectrofotoacutemetro Spekol 11
Reloj
Reactivos
NaCl 1
Agua destilada
NaOH 01 molL
Reactivo de Biuret Disuelva 25 g de sulfato cuacuteprico en un litro de agua destilada
Disuelva 440 g de hidroacutexido de sodio en un litro de agua destilada Luego mezcle estas dos
soluciones Esta preparacioacuten debe almacenarse en botellas oscuras (color aacutembar)
Preparacioacuten de las fracciones proteicas de muestra vegetal
Pesar 20 g de harina de soya agregar 10 mL de H2O desmineralizada agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensioacuten a 2500 rpm por 3 minutos Vaciar el
38
sobrenadante a un baloacuten aforado de 25 ml Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior Despueacutes de centrifugar el
sobrenadante de esta segunda extraccioacuten se adiciona al baloacuten que contiene al primer
sobrenadante Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase
Asiacute se tiene separada la fraccioacuten de las albuacuteminas
Sobre el residuo que queda de la separacioacuten de las albuacuteminas se repite ahora todo el
proceso anterior pero agregando esta vez NaCl al 1 Despueacutes de centrifugar los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccioacuten con NaCl al 1 se llevan a otro baloacuten
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1 Esta es la
fraccioacuten de las globulinas
Por uacuteltimo sobre el residuo anterior se adiciona NaOH 01 molL y aplicando el mismo
procedimiento general se separa la fraccioacuten de las glutelinas Este procedimiento se
muestra en la figura 11
Figura 11 Proceso de extraccioacuten de proteiacutenas
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
procederaacute a la determinacioacuten de proteiacutenas aplicando el meacutetodo de Biuret Para las muestras
de las fracciones de albuacuteminas y glutelinas deberaacute tomarse 05 mL de cada una y llevarse a
39
un volumen de 5 mL (dilucioacuten 1 a 10) con agua destilada para las albuacuteminas y con NaOH
01 molL para las glutelinas Estas diluciones se usaraacuten como extractos problemas para
dichas fracciones
Curva de calibracioacuten
Se prepararaacute la curva utilizando como patroacuten una solucioacuten de albuacutemina de concentracioacuten
(40 gL) tomando de la misma voluacutemenes de 0025 mL 25 mL 5 mL 75 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada
Procedimiento
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bantildeo de agua a 30degC durante 10 minutos para desarrollo del color
Leer en cada tubo a 540 nm
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11
Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albuacutemina Globulina Glutelina
Albuacutemina
(40gL) (mL)
-
2
2
2
2
2
-
-
-
Fraccioacuten
albuacutemina
(mL)
-
-
-
-
-
-
2
-
-
Fraccioacuten
globulina
(mL)
-
-
-
-
-
-
-
2
-
Fraccioacuten
glutelina(mL)
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Reactivo de
Biuret
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabla 11 Meacutetodo de Biuret para la determinacioacuten de proteiacutenas totales
40
252 Estabilidad del extracto enzimaacutetico obtenido de la soya
Para la realizacioacuten de este ensayo se procedioacute a medir la cantidad de amoniacuteaco formado
para un patroacuten de urea de 833 mmolL durante un periacuteodo de 7 diacuteas siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
26 Anaacutelisis estadiacutestico y elaboracioacuten matemaacutetica de los resultados experimentales
Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadiacutestico que permita obtener datos maacutes elaborados y confiables A continuacioacuten se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacioacuten
261 Presentacioacuten de los resultados
Los resultados experimentales cuantitativos carecen de intereacutes si no van acompantildeados de
una estimacioacuten de los errores involucrados en su medida Una praacutectica usual en la literatura
de quiacutemica analiacutetica es citar la media como estimacioacuten de la cantidad medida y la
desviacioacuten estaacutendar como la estimacioacuten de la precisioacuten En el caso que en este trabajo se
presenta fue mediante la praacutectica anteriormente mencionada que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas En el caso del estudio cineacutetico se eliminaron
los valores erraacuteticos para cada determinacioacuten y calculados los paraacutemetros cineacuteticos Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realizoacute una comparacioacuten mediante el ANOVA lo cual permitiraacute establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacioacuten 2010) y (Jurado 2008)
41
Capiacutetulo III Resultados y discusioacuten
En este capiacutetulo se hace el anaacutelisis de los resultados obtenidos siguiendo los experimentos
descritos en el Capiacutetulo II
El mismo se concentra en evaluar los diferentes meacutetodos de extraccioacuten de la ureasa
presente en la soya la determinacioacuten de la actividad enzimaacutetica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo asiacute como en la evaluacioacuten del efecto que producen los
factores temperatura pH y concentracioacuten de sustrato en dicha actividad Ademaacutes se
interpretan los resultados de la determinacioacuten de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya
31 Extraccioacuten de la enzima ureasa a partir del frijol de soya
Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Capiacutetulo II de este trabajo En todos los casos la muestra perteneciacutea a un mismo lote
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones es decir a temperatura
normal atmosfeacuterica La descripcioacuten del aspecto fiacutesico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12
Teacutecnica de
extraccioacuten
Meacutetodo I Meacutetodo II Meacutetodo III Meacutetodo IV
Color Liacutequido
amarillento
Liacutequido amarillo
claro
Pasta
amarillenta
Liacutequido
amarillo claro
Olor Inoloro Olores tiacutepicos de los
disolventes
empleados
Olor tiacutepico de
la acetona
Inoloro
pH 703 701 700 698
Tabla 12 Comparacioacuten entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya
Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el
valor del pH aspecto este de mayor relevancia para la aplicacioacuten del extracto donde en
42
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra se debe esperar un incremento del pH Ademaacutes el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacioacuten de la urea es 7
El aspecto fiacutesico se observa una disolucioacuten de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura (Jhon 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccioacuten es que los meacutetodos son faacuteciles de
realizar experimentalmente emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
quiacutemicos y cliacutenicos asiacute como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud
311 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
La actividad ureaacutesica se evaluoacute midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracioacuten conocida una vez que se poniacutean en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Capiacutetulo II En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7
Solucioacuten - buffer de fosfatos pH 2
Ureasa comercial + buffer fosfato 699
Extracto (I) 703
Extracto (II) 701
Extracto (III) 698
Extracto (IV) 700
Tabla 13 Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos
Tal y como se describioacute en el Capiacutetulo II se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucioacuten que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracioacuten de 01 gL a 1gL
43
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacioacuten del pH obtenido con la ureasa
comercial asiacute como el valor de las 3 reacuteplicas efectuadas para cada concentracioacuten
estudiada
Tabla 14 Valores de pH aplicando la ureasa comercial
Para la primera extraccioacuten (Meacutetodo de Lorenc) los resultados obtenidos se reflejan en la
tabla15
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 782 763 740 712 709 704
pH2 786 762 743 710 708 705
pH3 780 762 745 712 709 704
pH corregidos 783 762 7415 712 709 704
Tabla 15 Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 764 755 745 708 704 700
pH2 762 754 743 707 702 699
pH3 764 759 75 709 705 703
pH corregidos 764 756 746 708 704 701
44
Para la segunda extraccioacuten (Meacutetodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 770 747 727 708 706 701
pH2 772 748 728 709 707 702
pH3 769 750 726 709 708 703
pH corregidos 770 748 738 709 707 702
Tabla 16 Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccioacuten
Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccioacuten se muestran a continuacioacuten en
las tablas 17 y 18 respectivamente
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 743 742 740 731 711 703
pH2 742 740 741 732 710 702
pH3 743 741 740 731 713 705
pH promedio 743 741 740 722 711 703
Tabla 17 Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccioacuten
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
pH1 711 707 703 700 699 698
pH2 710 707 704 701 698 699
pH3 710 706 705 699 699 698
pH corregidos 710 707 738 709 699 698
Tabla 18 Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccioacuten
45
Para conocer si los meacutetodos difieren en su precisioacuten con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas Para esto se emplea la siguiente ecuacioacuten donde
F F calculada
S12
Varianza Meacutetodo 1
S22
Varianza Meacutetodo 2
Siendo la F (005 1716) = 232 (Miller and Miller 2002) Los valores de F se muestran en
la tabla 19
F extraccioacuten
(Meacutetodo I)
F extraccioacuten
(Meacutetodo II)
F extraccioacuten
(Meacutetodo III)
F extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
12627 10925 28426 10277
Tabla 19 Valores de F calculados para cada una de los extractos
Obtenieacutendose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
meacutetodos I y II lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
meacutetodos no son significativas a un nivel de confianza de 5
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos meacutetodos son
significativas a un nivel de confianza de 5
Para comparar las medias muestrales de los meacutetodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas
Siendo la t tabulada 4303 (Miller and Miller 2002) Los valores de t calculados para cada
meacutetodo de extraccioacuten se muestran en la tabla 20
Tabla 20 Valores de t calculados para cada una de los extractos
t extraccioacuten
(Meacutetodo I)
t extraccioacuten
(Meacutetodo II)
t extraccioacuten
(Meacutetodo III)
t extraccioacuten
(Meacutetodo IV)
24492 09817 00181 -46119
46
Los valores de t para los meacutetodos I II y III son menores que el valor de t tabulada por lo
tanto no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial En el
caso del meacutetodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este meacutetodo y por la ureasa comercial
La actividad ureaacutesica evaluada para el extracto obtenido por los meacutetodos de extraccioacuten y su
comparacioacuten con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial se muestra en la tabla
21 Esta actividad se expresa en variacioacuten del pH tal y como se ha descrito en los capiacutetulos
anteriores de este trabajo
Concentracioacuten 1 gL 08 gL 06 gL 04 gL 02 gL 01 gL
Δ pH ureasa
comercial 064 056 046 008 004 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo I) 080 059 039 009 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo II) 069 047 037 008 006 001
Δ pH ureasa
(Meacutetodo III) 043 041 040 022 011 003
Δ pH ureasa
(Meacutetodo IV) 012 009 04 011 001 0
Tabla 21 Determinacioacuten cualitativa de la actividad ureaacutesica
Analizando los resultados de la tabla 21 se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los meacutetodos I y II muestra la mayor actividad enzimaacutetica que en
este caso estaacute relacionada con la mayor variacioacuten en el valor del pH
Ademaacutes los resultados obtenidos en los 4 meacutetodos de extraccioacuten pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le antildeaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona
(Calvo 2016) Los disolventes orgaacutenicos interaccionan con el interior hidroacutefobo de las
proteiacutenas disminuyendo el grado de hidratacioacuten de los grupos ioacutenicos superficiales de la
47
moleacutecula proteica y desorganizando la estructura terciaria provocando su precipitacioacuten
(Loacutepez 2013) Esta es la razoacuten por la cual son utilizados en este trabajo para lograr una
precipitacioacuten de la ureasa en el caso de los extractos II y III Sin embargo las proteiacutenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgaacutenicos de constante dieleacutectrica baja que cuando estos solventes se encuentran ausentes
Esto explica la razoacuten por la cual el extracto I cuyo solvente fue agua presentoacute una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgaacutenicos
Por otra parte la solubilidad de una proteiacutena cuando la fuerza ioacutenica es pequentildea aumenta
(Mantildeas 2005) pues los contraiones recubren con maacutes eficacia las muacuteltiples cargas ioacutenicas
de las moleacuteculas de proteiacutenas aumentando por ello la solubilidad de las proteiacutenas este
efecto es conocido como disolucioacuten por salado
Al presentar el NaCl baja fuerza ioacutenica se utiliza en la obtencioacuten del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del meacutetodo cualitativo se
concluye que los meacutetodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicioacuten cuantitativa de la actividad seguacuten lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmolL de producto formado teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura Teniendo
en cuenta ademaacutes que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucioacuten presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacioacuten lograacutendose la obtencioacuten de una disolucioacuten transparente al adicionar 002 mL
de extracto enzimaacutetico por lo que es este el volumen con el que se realizaraacuten los ensayos
siguientes Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacioacuten de producto que se traduce en una mayor actividad
De ahiacute que este sea el extracto seleccionado para la realizacioacuten de los estudios cineacuteticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad pues estos paraacutemetros
dependen de la fuente y meacutetodo de extraccioacuten de la enzima(Martiacutenez et al 2002)
48
32 Estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica con la ureasa extraiacuteda de la soya
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cineacutetico de la reaccioacuten enzimaacutetica Los estudios cineacuteticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima En este caso se analizaron los
efectos del pH la temperatura y la concentracioacuten de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimaacutetica
321 Resultados del efecto del pH en la actividad enzimaacutetica
Los resultados de la aplicacioacuten del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12
Figura 11 Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
El graacutefico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7 lo cual se corresponde a su
vez con lo reportado en la literatura Sabiendo que las enzimas son proteiacutenas cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el caraacutecter ioacutenico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica (Nuacutentildeez 2012) afectando asiacute las propiedades cataliacuteticas de una enzima
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacioacuten de la enzima y en consecuencia su
inactivacioacuten
Un cambio en el pH que puede provocar la variacioacuten tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacioacuten del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efectuacutee la reaccioacuten enzimaacutetica
49
322 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimaacutetica
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos el
graacutefico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13
Figura 13 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacutetica
Igual que ocurre en las reacciones quiacutemicas no enzimaacuteticas al aumentar la temperatura
aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas Esto se debe a que un
mayor nuacutemero de moleacuteculas alcanzan la energiacutea cineacutetica necesaria para superar la energiacutea
de activacioacuten de la reaccioacuten Sin embargo el aumento de temperatura tambieacuten disminuye la
estabilidad de la estructura de las proteiacutenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimaacutetica tiende a disminuir
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura existe una
temperatura oacuteptima en la cual la actividad enzimaacutetica tiene un valor maacuteximo
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya la temperatura oacuteptima es de 40
oC lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccioacuten de la enzima ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima (Martiacutenez et al 2002) (Gonzaacutelez 2000) (Almanza et al 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos
Por otra parte la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccioacuten y
esta relacioacuten se expresa en la ecuacioacuten de Arrhenius
k=
50
Donde
k = Constante de velocidad especiacutefica
A = Factor prexponencial de Arrhenius
e= Base de los logaritmos naturales
Ea = Energiacutea de Activacioacuten
R = Constante universal de los gases
T = Temperatura absoluta
De todos los paraacutemetros el maacutes importante es la energiacutea de Activacioacuten que representa la
barrera energeacutetica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversioacuten
hacia los productos
Valores elevados de la energiacutea de activacioacuten se asocian comuacutenmente con reacciones lentas
y viceversa Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energeacuteticas considerables (energiacuteas de activacioacuten altas) se utilizan los
catalizadores que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccioacuten sin modificar
sus propiedades termodinaacutemicas esta funcioacuten es desempentildeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de la urea la cual a su vez aumenta su poder
cataliacutetico al aumentar la temperatura favorecieacutendose asiacute la disminucioacuten de la energiacutea de
activacioacuten producto de la estabilizacioacuten de los estados de intermedios de alta energiacutea
Este efecto de la temperatura tambieacuten coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin
2013) donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor oacuteptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidroacutegeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima
323 Resultados del efecto de la concentracioacuten de sustrato en la actividad enzimaacutetica
Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccioacuten expresado por la variacioacuten de
concentracioacuten de urea que se va transformando por la actividad enzimaacutetica se procedioacute
como se indica en el capiacutetulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 ndash 20 correspondientes se muestran a continuacioacuten
La correspondencia entre la concentracioacuten de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales es la siguiente
51
Figura 14 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 33 mmolL
Figura 15 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 63 mmolL
Figura 16 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 83 mmolL
Figura 17 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 167 mmolL
Figura 18 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 266 mmolL
Figura 19 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 391 mmolL
Figura 20 Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracioacuten inicial
igual a 483 mmolL
Figura 14 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 15 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
52
Figura 16 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 17 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 18 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Figura 19 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
53
Figura 20 Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimaacutetica
Del anaacutelisis de las curvas de comportamiento de la variacioacuten de la concentracioacuten de urea en
el tiempo se concluye que en todos los casos la transformacioacuten de praacutecticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos Se puede observar
tambieacuten que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracioacuten de sustrato empleada Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacioacuten de producto en funcioacuten de la concentracioacuten de sustrato
a un tiempo fijo A una concentracioacuten de enzima constante y en un rango de concentracioacuten
de sustrato baja la velocidad de formacioacuten de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracioacuten de sustrato Sin embargo cuando la concentracioacuten de
sustrato es alta la velocidad de la reaccioacuten tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccioacuten
A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes
concentraciones estudiadas se determinan las velocidades iniciales para cada concentracioacuten
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis ndash Menten y la representacioacuten de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos
54
Figura 21 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Michaelis - Menten)
Figura 22 Efecto de la concentracioacuten de
sustrato en la actividad enzimaacutetica
(Lineweaver - Burk)
El caacutelculo de los paraacutemetros cineacuteticos empleando la curva de Michaelis ndashMenten muestra
un valor de Vmax de 1001 mmolLmin y un valor de Km de aproximadamente 25 10-2
molL La representacioacuten de Lineweaver ndash Burk (doble reciacuteproca) permite una
determinacioacuten maacutes exacta del valor de Vmax ya que en la representacioacuten de Michaelis ndash
Menten solo se obtiene un valor aproximado puesto que es un valor liacutemite de una
concentracioacuten de sustrato infinita de ahiacute la forma que tiene la curva la cual se debe a que a
medida que aumenta la concentracioacuten de reactivo los sitios activos de la enzima se saturan
provocando que auacuten cuando la concentracioacuten del sustrato aumente la actividad de la enzima
no variacutee Es por esta razoacuten que para la determinacioacuten de los paraacutemetros cineacuteticos se utiliza
esta representacioacuten de la doble reciacuteproca
A partir de este graacutefico se obtienen los valores de Vmaacutexima y Km En el caso de Vmaacutexima
el valor obtenido fue de 3125 mmolLmin esta es la maacutexima actividad que puede alcanzar
una enzima teoacutericamente se logra en condiciones de concentracioacuten de sustrato grande ya
que la enzima se satura En la praacutectica es imposible que la enzima alcance el valor de
55
Vmaacutexima debido a limitaciones de difusioacuten de productos y sustratos desde y hacia el sitio
activo
El valor de Km fue 16710-1
molL es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato Si Km es grande significa que constante de la reaccioacuten inversa (k-1) es grande o
que la constante de la reaccioacuten directa (k1) es pequentildea por lo que la reaccioacuten inversa es maacutes
favorecida que la reaccioacuten directa y con ello la afinidad de la enzima por su sustrato es baja
Por el contrario si Km es pequentildea la afinidad de la enzima por el sustrato es grande La
literatura reporta que para una alta afinidad de la enzima por el sustrato los valores de Km
estaacuten comprendidos entre 10-1
molL y 10-7
molL (Stryer et al 2013) lo que estaacute en
correspondencia con el valor obtenido el valor de Km para algunas enzimas se muestra en
la tabla 22
Enzima Km (mmolL)
Catalasa 25
Carboacutenicoanhidrasa 9
Quimiotripsina 108
Tabla 22 Valores de Km de algunas reacciones enzimaacuteticas
33 Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad enzimaacutetica del extracto de ureasa
Posteriormente se procedioacute a la medicioacuten de la actividad ureaacutesica tanto para la ureasa
comercial como para la ureasa obtenida a partir de la soya Los resultados se muestran en la
tabla 23 estos fueron calculados teniendo en cuenta lo planteado por (Martiacutenez 2010) En
la cual se puede observar como la ureasa comercial presenta una actividad mayor Se puede
antildeadir que la diferencia en los datos obtenidos puede deberse entre otras causas a la
composicioacuten de la ureasa obtenida Frijol de soya agua destilada en comparacioacuten con la
ureasa comercial a la purificacioacuten de ambas siendo esta uacuteltima purificada liofilizada y
reconstituida con el reactivo color no siendo asiacute con la ureasa obtenida Por las razones
descritas anteriormente es posible considerar que la diferencia en el valor de la actividad de
ambas enzimas se debe a la accioacuten conjunta de un grupo de factores entre los que se
destacan la fuente y proceso de extraccioacuten (Martiacutenez et al 2002) que proporciona un
56
producto maacutes o menos concentrado seguacuten la situacioacuten particular lo que de hecho regula la
cantidad de enzima activa que contiene el preparado enzimaacutetico Es necesario sentildealar como
responsables fundamentales de estas diferencias las condiciones especiacuteficas de reaccioacuten
como pH temperatura concentracioacuten de sustrato pues la actividad de las enzimas estaacute
condicionada por estos paraacutemetros de los cuales existen valores oacuteptimos que le confieren su
maacutexima potencialidad cataliacutetica y la velocidad maacutexima de la reaccioacuten enzimaacutetica Sin
embargo el valor obtenido para la ureasa de la soya no difiere mucho del anterior por lo que
se puede esperar que pueda ser posible su utilizacioacuten para la determinacioacuten de urea en
sangre
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron los resultados se muestran en las tablas 42 y
43 de los anexos a partir de las cuales puede establecerse un rango para la concentracioacuten de
urea en sangre se recomienda que manera general que al realizar los anaacutelisis cliacutenicos cada
laboratorio establezca su propio intervalo de referencia (LTDA 2009) para cada uno de los
analitos a determinar es por esta razoacuten que se establece que el rango para el uso del
extracto de ureasa obtenida de la soya es de 30-79 mmolL en niveles normales y hasta
256 mmolL en niveles patoloacutegicos Para el uso la ureasa comercial el rango es de 32- 81
mmolL en niveles normales y hasta 266 mmolL en niveles patoloacutegicos Estos permitiraacuten
ademaacutes hallar la correspondencia entre los resultados obtenidos mediante el empleo de
ambas enzimas al evaluar la urea en plasma sanguiacuteneo
Tabla 23 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica
Actividad (mmolLmin)
Ureasa Comercial Extracto obtenido de la soya
256 245
493 484
655 637
1336 1291
2137 2065
57
Para determinar cuan semejante son ambos resultados y si es factible o no la sustitucioacuten de
la ureasa comercial por la ureasa obtenida mediante la soya se emplea como herramienta
estadiacutestica los caacutelculos ANOVA (Miller and Miller 1988) los cuales permitiraacuten comparar
los resultados obtenidos la curva de regresioacuten se muestra en la figura 23
Figura 23 Curva de regresioacuten para los datos obtenidos mediante el empleo de ambas
enzimas
Si cada muestra conduce a un resultado ideacutentico mediante el uso de cada enzima la recta de
regresioacuten presentara una ordenada en cero y un coeficiente de correlacioacuten y una pendiente
en uno en la praacutectica esto no ocurre debido a errores tanto aleatorios como sistemaacuteticos
cometidos por el analista En el caso de la recta obtenida se evidencian buenos resultados
ya que tanto la pendiente como el intercepto presentan valores cercanos a los ideales
(Miller and Miller 1988) los ejes x y y fueron seleccionados teniendo en cuenta que la recta
de regresioacuten de y sobre x se calcula bajo el supuesto de tener errores despreciables en los
valores de x pues se supone que todos los errores ocurren en el eje y de ahiacute que los datos
colocados en el eje x se corresponden con los resultados obtenidos a partir del empleo de la
enzima ureasa comercial tomada como patroacuten y en el eje y se colocan los resultados
obtenidos a partir de la ureasa de la soya Estos resultados son ampliados por los caacutelculos
ANOVA presentados a continuacioacuten en la tabla 24
58
Tabla 24 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales (Jurado 2008) Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo
obtenido en este trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es
significativa lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(136457915) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 24
Figura 24 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuos evidencia que no hay fuerte diferencia entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas mostrando una distribucioacuten homogeacutenea de los puntos a
ambos lados del eje X
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 0999
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
Fexp 395160566
Ftab 6115
59
34 Evaluacioacuten del extracto obtenido de la soya en muestras de plasma sanguiacuteneo
Seguidamente se procedioacute a evaluar tanto la ureasa comercial como el extracto obtenido en
las mismas muestras de sangre para luego comparar los resultados y corroborar la
posibilidad de su utilizacioacuten o no en los laboratorios cliacutenicos Las curvas de calibracioacuten
para cada uno se muestran a continuacioacuten en las figuras 25 y 26 respectivamente y los datos
correspondientes se muestran en la tabla 44 de los anexos
Figura 25 Curva de calibracioacuten para el
extracto obtenido de la soya
Figura 26 Curva de calibracioacuten para la
ureasa comercial
Los datos obtenidos para la evaluacioacuten en sangre se muestran a continuacioacuten en la tabla 25
Se reportan los valores de concentracioacuten de urea en sangre obtenidos en 5 muestras con
cada reactivo
60
Ureasa comercial Extracto de la soya
Concentracioacuten (mmolL) Concentracioacuten (mmolL)
805 789
518 504
441 430
385 378
1251 1221
Tabla 25 Evaluacioacuten de muestras de plasma sanguiacuteneo utilizando ambas enzimas
Como se puede observar los resultados son semejantes y aunque los valores alcanzados
mediante el empleo de la ureasa obtenida de la soya son ligeramente menores sin embargo
si hacemos coincidir los resultados obtenidos al evaluar urea para cada una de las muestras
de sangre con los rangos de la concentracioacuten de urea en sangre establecidos en este trabajo
tanto para la ureasa obtenida de la soya como para la ureasa comercial ambos resultados
exhiben el mismo comportamiento lo que avala la posibilidad de sustituir el reactivo de
ureasa liofilizado presente en el kit de reactivos por la ureasa obtenida a partir de la soya
341 Anaacutelisis estadiacutestico
Los caacutelculos ANOVA realizados con el objetivo de comparar los resultados obtenidos para
las curvas de calibracioacuten de la ureasa comercial y el extracto se muestran a continuacioacuten en
las tablas 26 y 27
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 1587951934
Tabla 26 Estadiacutestica de la regresioacuten para el extracto obtenido de la soya
61
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza Regresioacuten
F 103538921
Tabla 27 Estadiacutestica de la regresioacuten para la ureasa comercial
Ambas tablas evidencian un alto coeficiente de correlacioacuten lo que demuestra la linealidad
de los meacutetodos Los de valores experimentales de F son mayores en ambos casos que la F
tabulada (6115) ponieacutendose de manifiesto la buena precisioacuten de ambos meacutetodos Los
graacuteficos de residuales se muestran a continuacioacuten en las figuras 27 y 28
Figura 27 Graacutefico de residuales para el
extracto
Figura 28 Graacutefico de residuales para la
ureasa comercial
Ambos graacuteficos muestran una distribucioacuten al azar de los puntos a ambos lados del eje X lo
que evidencia la linealidad de las curvas obtenidas
Posteriormente se aplican los caacutelculos ANOVA para ver las diferencias entre los datos
obtenidos los resultados se presentan en la tabla 28
62
Estadiacutestica de la regresioacuten
Coeficiente de determinacioacuten 099
Anaacutelisis de varianza
F 11042728
Tabla 28 Estadiacutestica de la regresioacuten
En general si el valor de F es muy elevado la suma de cuadrados de residuales seraacute mucho
menor que la de regresioacuten con lo que tambieacuten seraacute mucho menor que la suma de cuadrados
totales Entonces R2 seraacute proacuteximo a 1 lo que se corresponde con lo obtenido en este
trabajo ademaacutes si F experimental gt F (005 1 n-2) la correlacioacuten lineal es significativa
(Jurado 2008) lo que se cumple en los resultados obtenidos siendo F experimental
(110427277) gt F tabulada (6115)
El graacutefico de residuales obtenido se muestra en la figura 29
Figura 29 Graacutefico de residuales
El graacutefico de residuales muestra una correcta distribucioacuten de los puntos a ambos lados del
eje lo que significa que no hay diferencias marcadas entre los resultados obtenidos
mediante el uso de ambas enzimas
63
35 Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
351 Cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en extracto obtenido
Al ser la soya uno de los alimentos con mayor contenido de proteiacutenas se determinoacute el
contenido de proteiacutenas totales en el extracto obtenieacutendose los resultados siguientes 867
mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina El contenido de glutelina no pudo
determinarse al no desarrollar color la muestra Esto se debe a que este meacutetodo solo es
sensible a concentraciones mayores de 1mgL de proteiacutena y la literatura plantea que el
contenido de glutelina en soya es muy pequentildeo siendo sus componentes en mayor
proporcioacuten las albuacuteminas y globulinas representando estas uacuteltimas hasta un 75 de toda la
proteiacutena presente resultado que se corresponde con lo obtenido en este trabajo La curva de
calibracioacuten obtenida se presenta a continuacioacuten en la figura 28 y sus datos correspondientes
en la tabla 45 de los anexos
Figura 28 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
352 Estabilidad del reactivo enzimaacutetico obtenido de la soya
El reactivo de ureasa de la soya fue utilizado durante el periacuteodo de 7 diacuteas determinando la
concentracioacuten de amoniacuteaco para un patroacuten de concentracioacuten de urea igual a 83 mmolL
este fue conservado en ese periacuteodo de tiempo en refrigeracioacuten a una temperatura de 2-8oC
Los resultados se muestran en la tabla 46 de los anexos donde se aprecia que los resultados
no difieren significativamente Es necesario destacar que a los 7 diacuteas de obtenido el
extracto este comenzoacute a fermentarse por lo que hubo que descontinuar su uso Esto estaacute
condicionado por la presencia de mohos y levaduras entre otros microorganismos los
cuales son eliminados durante el proceso de calentamiento al que es sometida la leche de
64
soya sin embargo un calentamiento en el caso de este trabajo significa la inactivacioacuten de la
enzima ureasa por lo que este paso es omitido
65
Conclusiones
bull La ureasa de la soya fue extraiacuteda empleando cuatro meacutetodos obtenieacutendose en el
caso de los meacutetodos I II y IV extractos liacutequidos y para el meacutetodo III una suspensioacuten
semisoacutelida todos de color amarillento El pH de los cuatro extractos fue cercano a
7
bull La evaluacioacuten cualitativa de la actividad enzimaacutetica brindoacute los mejores resultados
para los extractos I y II mientras que la determinacioacuten cuantitativa de actividad
enzimaacutetica de acuerdo a los valores fijados por la literatura reveloacute que la ureasa
obtenida por el meacutetodo I presentoacute la mayor actividad
bull El estudio cineacutetico empleando el extracto I permitioacute determinar los valores oacuteptimos
de pH= 7 y temperatura igual a 40 oC asiacute como los paraacutemetros cineacuteticos Km y
Vmaacutex con valores de 3125 mmolLmin y 167 10-1
molL respectivamente
bull No existen diferencias significativas al procesar estadiacutesticamente los resultados de
la aplicacioacuten del extracto de la soya comparado con la ureasa comercial tanto en
muestras patrones de urea como en plasma sanguiacuteneo
bull La caracterizacioacuten de las proteiacutenas totales por el meacutetodo de Biuret brindoacute los
siguientes resultados 867 mgL de albuacutemina y 2083 mgL de globulina al ser el
contenido de glutelina menor que 1 mgL no pudo ser detectado por este meacutetodo
66
Recomendaciones
1 Continuar el estudio de caracterizacioacuten del extracto obtenido
2 Profundizar los estudios de estabilidad del extracto obtenido a partir de la soya
3 Realizar el estudio termodinaacutemico de la reaccioacuten enzimaacutetica con el extracto
obtenido
67
Anexos
Anexo I Meacutetodo cuantitativo aplicando las condiciones fijadas por la literatura
Concentracioacuten (mmolL)
Extracto I Extracto II
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
Absorbancia
c(NH4)
mmolL
33 0217 548 0087 195
63 0420 1099 0127 304
83 0542 1431 0388 1013
167 1182 3170 0780 2078
266 1895 5108 1334 3583
Tabla 29 Meacutetodo cuantitativo de determinacioacuten de la actividad ureaacutesica a pH=7 y 37 oC
mmolL de producto formado
68
Anexo II Efecto del pH sobre la actividad enzimaacutetica
pH Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
35 0243 0244 0245 0244 621 250
57 0373 0375 0373 0373 972 391
7 0623 0624 0622 0623 1651 664
8 0402 0399 0401 0401 1047 421
10 0319 032 0319 0319 825 332
Tabla 30 Efecto del pH sobre la actividad ureaacutesica
69
Anexo III Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica Temperaturas oacuteptimas de
acuerdo a la fuente de extraccioacuten
Temperatura
(oC) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
Actividad
(mmolLmin)
25 0356 0355 0355 0355 9231 3711
30 0394 0393 0395 0394 10291 4137
37 042 0419 0418 0419 10970 4410
40 0622 062 0621 0621 16459 6617
45 046 0459 0459 0459 12057 4847
50 0368 0367 0365 0367 9548 3838
Tabla 31 Efecto de la temperatura sobre la actividad ureaacutesica
Fuente de extraccioacuten Temperatura (0C)
Judiacuteas sable 30
Canavalia 25
Lactobacillusfermentum 37
Tabla 32 Valores de temperatura oacuteptima para la ureasa extraiacuteda de diferentes fuentes
70
Anexo IV Efecto del tiempo sobre la urea transformada para las siguientes
concentraciones iniciales 33 mmolL 63 mmolL 83 mmolL 167 mmolL 266
mmolL 391 mmolL 483 mmolL
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0041 0041 0042 0042 0726 0363
4 007 009 006 0073 1577 0788
6 0098 0097 0098 0098 2247 1124
8 0116 0115 0117 0116 2736 1368
10 0236 0235 0236 0236 5997 2999
Tabla 33 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (33mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 006 0059 0061 006 1215 0607
4 009 009 01 009 2030 1015
6 0201 0202 0203 0202 5073 2537
8 039 038 039 039 10182 5091
10 0451 0452 045 0451 11840 5920
Tabla 34 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (63mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 0084 0083 0083 0083 1840 0920
4 0145 0144 0143 0144 3497 1749
6 0327 0326 0328 0327 8470 4235
8 0492 0493 0493 0493 12981 6490
10 0595 0594 0595 0595 15753 7876
71
Tabla 35 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (83mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 012 011 014 0123 2936 1468
4 0254 0253 0255 0254 6486 3243
6 068 069 069 069 18334 9167
8 098 096 099 0977 26124 13062
10 1197 1199 1198 1198 32139 16069
Tabla 36 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (167mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 035 034 034 0340 8823 4412
4 075 076 074 0750 19965 9982
6 098 097 098 0980 26215 13107
8 145 143 144 1440 38715 19357
10 1906 1907 1908 1907 51405 25702
Tabla 37 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (266 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 065 0652 0651 0651 17274 8637
4 0876 0878 0876 0876 23389 11694
6 1298 1299 1297 1298 34856 17428
8 1596 1598 1594 1596 42954 21477
10 1967 1967 1966 1967 53035 26518
72
Tabla 38 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (391 mmolL)
Tiempo
(min) Absorbancia
Absorbancias
corregidas
c(NH4)
mmolL
c(urea)
mmolL
2 096 0961 0959 0960 25671 12836
4 1023 102 1021 1021 27338 13669
6 1405 1407 1406 1406 37791 18895
8 1756 1754 1757 1756 47293 23646
10 1968 1967 1965 1967 53026 26513
Tabla 39 Efecto del tiempo sobre la actividad enzimaacutetica (483 mmolL)
73
Anexo V Efecto de la concentracioacuten de sustrato Representaciones de Michaelis ndash Menten
y Lineweaver - Burk
Concentracioacuten
(mmolL)
Velocidad
(mmolmin)
33 00601776
63 010476034
83 016809591
167 03000699
266 073602438
Tabla 40 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Michaelis ndash Menten
1Concentracioacuten
(1mmolL)
1Velocidad
(1mmolmin)
03030303 166174789
015873016 954559712
012048193 594898472
005988024 333255685
003759398 135865065
Tabla 41 Efecto de la concentracioacuten de sustrato Datos correspondientes a la
representacioacuten de Lineweaver - Burk
74
Anexo VI Evaluacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica para la ureasa comercial y el
extracto obtenido de la soya
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
0251 640 640489
0469 1233 1232880
0618 1638 1637772
1244 3339 3338859
1981 5342 5341576
Tabla 42 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Ureasa comercial
Absorbancia
Concentracioacuten
(mmolL)
Concentracioacuten
(micromolL)
024 611 610598
0458 1203 1202989
0598 1583 1583424
1197 3211 3211141
1906 5138 5137772
Tabla 43 Determinacioacuten cuantitativa de la actividad ureaacutesica Extracto de la soya
75
Anexo VII Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
c(urea)
mmolL
Absorbancia
Ureasa comercial
Absorbancia
Extracto
33 0251 0239
63 0469 0457
83 0618 0598
167 1243 1197
266 1980 1906
Tabla 44 Curvas de calibracioacuten ureasa comercial y extracto obtenido de la soya
76
Anexo VIII Caracterizacioacuten del extracto obtenido a partir de la soya
Curva de calibracioacuten obtenida de la aplicacioacuten del meacutetodo de Biuret para la cuantificacioacuten
de proteiacutenas totales
c(albuacutemina)
mmolL
Absorbancia
1 0098
10 016
20 022
30 0289
40 0345
Tabla 45 Curva de calibracioacuten Proteiacutenas totales
Diacuteas 1 2 3 4 5 6
Concentracioacuten de amoniacuteaco
(mmolL)
1581 1575 1581 1583 1576 1575
Tabla 46 Estabilidad del extracto de ureasa de la soya
77
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