universidad de granada facultad de farmacia departamento

UNIVERSIDAD DE GRANADA

FACULTAD DE FARMACIA

Departamento de Química Farmacéutica y Orgánica

TESIS DOCTORAL

Nuevos derivados de purinas con actividad antiproliferativa y estudios de aminación reductora por biotransformación

Programa de doctorado en Farmacia

Nerea Fernández Sáez

Granada, 19 de Julio de 2019

Editor: Universidad de Granada. Tesis Doctorales

Autor: Nerea Fernández Sáez

ISBN: 978-84-1306-315-7 URI: http://hdl.handle.net/10481/57268

http://hdl.handle.net/10481/57268

A mi abuela Rosina

“Nuestrarecompensaseencuentraenelesfuerzoynoenelresultado.Un

esfuerzototalesunavictoriacompleta”(MahatmaGandhi)

AGRADECIMIENTOS

Esta Tesis Doctoral no podría haberse llevado a cabo sin las personas que a lo largo del camino, me han ayudado y apoyado. El proceso ha sido largo y tedioso, muchos días frustrantes y agotadores, en los que no salen los experimentos sin saber por qué y otros eufóricos en los que ves como el trabajo da sus frutos. Sin las personas que han estado ahí, de una forma o de otra, habría sido mucho más difícil llegar a este día que tanto ansiaba, por ello me gustaría agradecerles este trabajo.

A mis directoras, Dori y Encarna, por darme la oportunidad de

trabajar con vosotras y enseñarme tanto estos años. Gracias por vuestra paciencia y constancia para al final, conseguir leer por artículos pese a lo difícil se veía. Dori, me diste la primera oportunidad de descubrir lo que era la investigación en química farmacéutica, y resultó ser la vocación a la que intentaré dedicar mi futuro, gracias. Encarna, agradecerte la dedicación y sabiduría que has compartido conmigo todos estos años, eres un ejemplo a seguir.

A Joaquín, fuiste fuente de inspiración para mí y muchos otros

alumnos que asombrados, veíamos la pasión con las que nos dabas la asignatura de Química Farmacéutica, como hablabas del descubrimiento de nuevos fármacos y rutas sintéticas de una forma que parecía (y lo es) la cosa más interesante del mundo. Gracias por darme la oportunidad de investigar en vuestra línea de investigación, habéis cosechado muchos éxitos y estoy segura de que seguirá siendo así.

A mis padres, Juan y Mª Carmen, por creer en mí y apoyarme en

todo lo que me he propuesto hacer, gracias por tener siempre unas palabras de aliento, incluso en los días en los que lo único que quería era rendirme y dejar la tesis. Gracias por la “fundación SAT fersa” que me ha costeado todos los másters, cursos, estancias y doctorados que he querido hacer, gracias por ser tan buenos, comprensivos, inteligentes y generosos. Os lo debo todo.

A mi hermana, María, han sido unos años difíciles para todos pero,

a pesar de la distancia, sé que siempre estás ahí y que puedo contar contigo. Gracias por aguantarme cuando me pongo negativa y veo todo negro, siempre tienes algún consejo o refrán acertado para cada situación. Eres un ejemplo de superación y con esfuerzo y constancia llegarás donde te propongas.

A Mari Tere, si alguien sabe lo que es pasar por lo que he pasado hasta llegar aquí eres tú, me has acompañado desde el primer día de carrera hasta el último de tesis, y espero que esto sólo sea el principio. Gracias por apoyarme y darme ánimos hasta cuando tú estabas en la misma situación. Recordaré siempre nuestras risas, llantos y tiempo convivido, lo bueno y lo malo, me ha encantado compartirlo contigo. Eres la persona más fuerte y generosa que conozco, gracias por estar ahí.

A Manu, has sido uno de los mayores apoyos que he tenido a lo largo

de estos años, gracias por escucharme cuando necesitaba desahogarme porque no me salían las síntesis, cuando no avanzaba escribiendo, cuando no contestaban de las revistas y cuando me desesperaba hasta con el aire. Gracias por tu paciencia y tus palabras de ánimo en todo momento. Eres una de las personas de mejor corazón y más buenas que conozco, es una suerte tenerte en mi vida.

A Fabio, empezaste como compañero de laboratorio y te has

convertido en un buen amigo. Gracias por amenizar los largos ratos de laboratorio, ha sido un placer compartir contigo esta etapa. En breve terminarás tu tesis, te deseo lo mejor y que consigas todo lo que te propongas. A los compañeros del departamento, a Guille y Mª Dolores por las incontables ayudas en momentos de bloqueo. A Jesica, Ilaria y Stefanía por los buenos ratos, las largas conversaciones y la amistad que me habéis brindado en este tramo final de la tesis.

A mis amigas, a Rosa y Cristina, sabéis bien lo que es este proceso

y sois un ejemplo de constancia y esfuerzo, gracias por vuestro apoyo. A ti Ana Lorena, eres una bomba de alegría, es una suerte tenerte como amiga, no cambies nunca. A Radio Patio, somos un grupo grande pero, aunque diferentes, todas sois una parte importante de mi vida. Los ratos y viajes que hacemos han sido como un soplo de positivismo para seguir con energía e ilusión.

A mi familia, a mis tíos Rosa y Antonio, a mis primas Patri y Marina,

gracias por el entusiasmo que me habéis mostrado cuando os daba noticias sobre mi tesis, y la fuerza e ilusión que me trasmitíais para continuar. A mis tíos Juanjo y Adeli, que a pesar de decepcionaros cada vez que me preguntabais como iba el descubrimiento del crece pelo definitivo, siempre me habéis apoyado y dado ánimos. A mis primas Rosi, Lorena, Mari, Tamara, Yasmina y Aurori por darme ánimos para terminar y ser fuente de inspiración como mujeres fuertes y emprendedoras.

A mis abuelos, José y Carmen, gracias a vosotros por alentarme a

estudiar y conseguir lo que me proponga.

A mi abuela Rosina, te has ido antes de que pudiese acabar, el cáncer no tiene compasión con nadie pero tú has puesto todo de tu parte para que estemos lo mejor posible. Has sido un ejemplo para mí, de mujer fuerte y trabajadora, pero que también valoraba la familia y los buenos ratos, gracias por tus historias de juventud, por tu cariño y por tu sonrisa, te echo de menos y nunca te olvidaré.

ÍNDICE

I INTRODUCCIÓN

1. Cáncer.......................................................................................... 1

1.1. Ciclo celular........................................................................... 3

1.2. Muerte celular programada................................................... 5

1.2.1. Ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas.............. 6

1.2.2. Genes supresores de tumores y proto-oncogenes...... 10

1.3. Macrófagos M1 y M2............................................................. 14

1.4. Células madre cancerígenas................................................. 15

1.5. Líneas tumorales usadas en ensayos biológicos.................. 17

1.5.1. Ensayos en cultivos celulares 2D y 3D........................ 18

1.5.2. Ensayos biológicos realizados en células tumorales... 20

2. Antecedentes estructurales....................................................... 23

2.1. 5-Fluororuracilo..................................................................... 24

2.2. Desarrollo racional desde el 5-FU al bozinib......................... 24

2.2.1. Aciclonucleósidos........................................................ 24

2.2.2. Derivados 1-(1,4-diheteroepanilo) ............................. 27

2.2.3. Estructuras O,N-acetálicas cíclicas y acíclicas unidas

a 5-FU...................................................................................... 28

2.2.4. Estructuras O,N-acetálicas unidas a otras bases

nitrogenadas............................................................................ 33

2.3. Compuestos no acetálicos.................................................... 46

3. Otros antitumorales heterocíclicos 50

3.1. Purinas y heterociclos unidos a purinas con actividad

antitumoral................................................................................... 51

3.2. Derivados de 1,3- y 1,4-benzoxacinas................................. 52

3.3. Derivados de quinazolinas................................................... 54

3.4. Tetrahidroisoquinolinas........................................................ 55

3.5. Tetrahidroquinolinas.............................................................. 56

4. Biocatálisis y enantioselectividad............................................. 58

4.1. Importancia de las transaminasas (TAs) .............................. 61

5. Bibliografía.................................................................................. 63

II. OBJETIVOS.................................................................................. 87

III. METODOLOGÍA.......................................................................... 93

IV. RESULTADOS............................................................................ 97

Artículo 1.................................................................................. 99

Artículo 2.................................................................................. 171

Artículo 3.................................................................................. 195

V. CONCLUSIONES......................................................................... 221

VI. PERSPECTIVAS FUTURAS....................................................... 227

Abreviaturas

SEOM: Sociedad Española de Oncología Médica

ADN: Ácido desoxirribonucleico

OMS: Organización Mundial de la Salud

INC: Instituto Nacional del Cáncer

BCG: Bacilo de Calmette-Guérin

hTERC: ARN codificante de telomerasa humana, human Telomerase

Encoded RNA

hTERT: Transcriptasa Inversa del Telómero humano, human Telomere

Reverse Transcriptase

CDK: Quinasas dependientes de ciclinas, Cyclin-Dependent Kinase

ATP: Adenosina Trifosfato

RB: Gen retinoblastoma

RB: Proteína del retinoblastoma

FDA: Administración de comida y fármacos, Food and Drug Administration

ROX y RNX: Especies reactivas de oxígeno y nitrógeno

TAM: Macrófagos asociados a tumores, Tumor Associated Macrophages

CSC: Células madre cancerígenas, Cancer Stem Cells

MEC: Matriz extracelular

CCLE: Enciclopedia de líneas celulares de cáncer, Cancer Cell Line

Encyclopedia

5-FU: 5-Fluorouracilo

OPri: Isopropoxilo

OCp: Ciclopentoxilo

Hep-2: Línea celular de cáncer de laringe

CI50: Concentración inhibitoria máxima 50

HT-29: Línea de carcinoma humano de colon

MCF-7: Línea celular de cáncer de mama

DBDU: (RS)-1-(2,3-dihidro-5H-1,4-benzoxacepin-3-il)-uracilo

T: Timina

U: Uracilo

MCF-10: Línea celular sana del epitelio mamario no canceroso

IEC-6: Células del epitelio intestinal de una línea de rata no tumoral

IT: Índice terapéutico

Fmoc: Fluorenilmetoxicarbonilo

SAR: Relación estructura actividad, Structure-Activity Relationship

MDA-MB-231: Línea de cáncer de mama hormono-dependiente

TMSCl: Clorotrimetilsilano

HMDS: Hexametildisilazano

RKO y HCT-116: Líneas de cáncer de colon

IFN- α: Interferón-α

A375: Línea celular de melanoma humano

SKBR3: Línea celular de cáncer de mama

SNU638: Línea celular de cáncer de estómago

EGFR: Receptor del factor de crecimiento epidérmico, Epidermal Growth

Factor Receptor

THIQ: Tetrahidroisoquinolinas

ERα: Receptor de estrógenos-α, Estrogen Receptor-α

SERD: Degradación selectiva de receptores de estrógenos , Selective

Estrogen Receptor Degradation

THQ: Tetrahidroquinolinas

PANC-1: Línea celular de cáncer de páncreas

EPAC: Proteínas de intercambio activadas directamente por cAMP,

Exchange Proteins Directly Activated by cAMP

TAs: Transaminasas

I. INTRODUCCIÓN

Introducción

1

I INTRODUCCIÓN

1. Cáncer

El cáncer es una enfermedad genética que surge cuando hay mutaciones

en tres principales grupos de genes: protooncogenes, genes supresores de

tumores y genes reparadores del ADN. Entre los diferentes factores que

pueden causar estas alteraciones están incluidos el tabaquismo, la falta de

ejercicio físico, la alimentación, algunas infecciones, exposición a factores

químicos y radiaciones.

Los datos más recientes recogidos por la Sociedad Española de Oncología

Médica (SEOM) indican que los tumores más diagnosticados siguen siendo

el colorrectal, el de próstata, pulmón, mama, vejiga y el de estómago. En

España, en 2019 se estima que se alcanzarán los 277.234 nuevos casos

diagnosticados de cáncer y se predice que para 2035 la estimación sea de

315.413 nuevos casos1. Las cifras recogidas por la Organización Mundial

de la Salud (OMS) hablan de un mayor número de casos de cáncer en

2018, que oscilan en los 18.1 millones y estiman en 9.6 millones los casos

de muerte por esta causa; reporta, de igual manera, que a nivel mundial el

mayor número de casos de cáncer según localización corresponde a los de

pulmón, colorrectal y cáncer de mama en mujeres. Si hablamos de

mortalidad ocuparían el primer, segundo y quinto lugar respectivamente2.

La clasificación general de los tipos de tratamientos que existen para

combatir el cáncer (que se pueden hacer de forma independiente o

combinándolos) según el Instituto Nacional del Cáncer (INC) es:

§ Cirugía: se aplica cuando el cáncer está localizado. Existen diversas

clases en función del tipo de cáncer:

- Criocirugía, en cáncer de piel en estado inicial o retinoblastoma.


2

- Cirugía láser, cuando es en órganos internos como cáncer de cérvix, vagina, esófago...

- Terapia fotodinámica, empleando fármacos fotosensibles, en

cáncer de piel o de pulmón de células no pequeñas.

§ Radioterapia: en la que hay dos divisiones, de haz externo, para

tratamiento local (como cáncer de cérvix o pulmón) y de haz interno,

donde la fuente de radiación (que puede ser en estado sólido o

líquido) está dentro del cuerpo y se emplea para cánceres de cabeza

y cuello, o de mama, por ejemplo.

§ Quimioterapia: se pueden clasificar en función de la vía de

administración que puede ser oral, intravenosa (a través de un

catéter o puerto que puede ir unido a una bomba), por inyección,

intratecal, intraperitoneal, intraarterial o vía tópica. Otra clasificación

que puede hacerse es como neoadyuvante, para disminuir el

tamaño de un tumor antes de aplicar radioterapia o realizar una

intervención quirúrgica, o adyuvante, que se administra tras estos

procedimientos a fin de destruir las células cancerígenas que no

hayan sido eliminadas para que no se reproduzca el tumor de nuevo.

§ Inmunoterapia: se puede hacer una distinción entre los tratamientos

que refuerzan el sistema inmune y los que combaten más

activamente el tumor ayudando al sistema inmunitario.

- En el primer grupo se incluyen los inhibidores del punto de control, que ayudan a las células T a responder al tumor con

mayor agresividad, la transferencia adoptiva celular, que consiste

en crecer de forma artificial en un laboratorio las células T más

activas del paciente frente a ese tumor, los anticuerpos

monoclonales que son proteínas creadas en el laboratorio y, por

último, vacunas de tratamiento, las cuales son diferentes de las

vacunas de prevención.

Introducción

3

- En el segundo grupo se encuentra la inmunoterapia que combate el cáncer de forma más activa reforzando el sistema

inmune, como las citocinas (interferones e interleucinas) y el

bacilo de Calmette-Guérin (BCG).

§ Terapia hormonal: se divide en dos grupos bien definidos, los que

bloquean la producción de determinadas hormonas por parte del

organismo, y los que modulan la forma en la que las hormonas

actúan en el cuerpo.

§ Trasplante de células madre: este tratamiento se realiza cuando la

persona que tiene cáncer, o bien ha perdido células sanguíneas por

un tratamiento agresivo de quimioterapia o radioterapia, o bien el

cáncer es una leucemia y se encuentran afectadas las células

hematopoyéticas. En este último caso el trasplante también actuaría

combatiendo la neoplasia. En función del donante de células, estos

trasplantes se clasifican en:

- Autólogos cuando provienen del mismo paciente.

- Sintólogos cuando provienen de un hermano/a gemelo/a.

- Alogénicos cuando provienen de un familiar consanguíneo o

una persona compatible.

1.1. Ciclo celular

El ciclo celular de la mayoría de las células es un mecanismo de

proliferación a través de cuatro procesos coordinados: crecimiento celular

(fase G1), replicación de ADN (fase S), distribución del los cromosomas

duplicados (fase G2) y división celular (mitosis y citocinesis, fase M), para

dar dos células hijas, no solo para el crecimiento de los tejidos sino también

para el reemplazo de las células dañadas en tejidos y órganos adultos.

La célula también puede salir del ciclo celular por diferentes motivos, como

arresto permanente asociado a una diferenciación terminal o senescencia,


4

o bien una salida del ciclo reversible conocida como quiescencia (fase

G0)3(Figura 1).

Figura 1. Ciclo celular.

La transición a través del ciclo celular eucariota esta coordinada por la

fosforilación y defosforilación de sustratos específicos de cada fase,

conocidos como proteínas quinasas dependientes de ciclinas (CDKs)4. La

progresión de estas etapas depende de este aparato regulador conservado

que no sólo regula el paso entre las diferentes fases del ciclo (entre las

fases G1-S y la G2-M)5, sino que también regula la proliferación celular en

base a las señales externas como pueden ser inhibición por contacto o por

falta de nutrientes.

Hay que tener en cuenta que no todas las células del organismo tienen el

mismo periodo de división (aproximadamente de 24 horas) donde el

proceso de mitosis y citocinesis sólo dura sobre una hora. Una minoría de

células tiene un ciclo celular activo, es decir, están regularmente

proliferando, como pueden ser zonas que necesiten regenerarse

constantemente, por ejemplo, el tejido epitelial o la médula ósea. Por otra

parte, las células más especializadas se quedan en fase G0 (quiescencia),

DIVISIÓN

INTERFASE

Quiescencia

M

G1

S

G2

G0

Introducción

5

bien de forma irreversible (como las neuronas o los miocitos) o bien de

forma reversible que, al recibir estímulos vuelven al ciclo celular (como los

hepatocitos)6.

1.2. Muerte celular programada

En el organismo existe un equilibrio entre las nuevas células que se

generan y la desaparición de las que lo componen, con el objetivo de

mantener un tamaño constante. El proceso celular por el que una célula

induce su propia muerte es conocido como apoptosis, proceso que se

denomina también como “muerte celular programada”. Desde la etapa

embrionaria, millones de células mueren sin ser a causa de una patología

o porque estén dañadas, sino que se trata de un proceso natural, definido

genéticamente, por el cual las células mueren tras un determinado número

de divisiones. Este proceso está controlado por los telómeros, unas

secuencias ubicadas en los extremos de los cromosomas que se van

acortando en las sucesivas divisiones celulares7. Los telómeros, además,

poseen una actividad protectora manteniendo la integridad del ADN8.

Las telomerasas tienen dos componentes: uno de ellos es el ARN, conocido

como hTERC (ARN codificante de telomerasa humana, human Telomerase

Encoded RNA) y un componente catalítico resultado de la traducción de

ese RNA, hTERT (Transcriptasa Inversa del Telómero humano, human

Telomere Reverse Transcriptase). La función de la hTERT es la síntesis de

secuencias teloméricas que se han ido perdiendo a lo largo de las

sucesivas divisiones de la célula, y su actividad es crucial en la

estabilización de los telómeros, y lo hace a través de la incorporación de

secuencias repetidas de TTAGGG.

Las alteraciones genéticas que afectan a una erosión mayor de los

telómeros e inhiben la correcta reparación del ADN, tienen como

consecuencia un envejecimiento prematuro9, característica observada en


6

diferentes enfermedades tales como disqueratosis congénita10, síndrome

de Werner11 o anemia aplásica12, entre otras.

La célula menos diferenciada en los humanos es el cigoto, célula totipotente

a partir de la cual, a través de estímulos intrínsecos y extrínsecos a ella, se

repiten divisiones celulares para crear el organismo humano completo con

hasta 260 tipos de células que aparecen en distintas fases del desarrollo13.

Las células madre pluripotentes son células indiferenciadas que tienen la

habilidad de proliferar por un periodo indefinido de tiempo, dividirse dando

células hijas para la autorenovación, y diferenciarse en células

especializadas con el fin de cumplir con los requisitos del desarrollo del

organismo. Estas células madre se clasifican en tres grupos: células madre

somáticas, células madre embrionarias y células pluripotentes inducidas14.

A partir de todas ellas se generan dos tipos de células, las somáticas que

son las responsables del crecimiento de los tejidos y órganos, y las

germinales que son aquellas a partir de las cuales se forman los gametos.

El número de veces que una célula somática (en la mayoría de las cuales

no se expresa el hTERT) 8 se divide, suele adaptarse al límite de Hayflick,

en el que se estipula que el ciclo celular puede repetirse un número que

oscila entre 30 y 50 veces a lo largo de la vida de la célula 15,16.

1.2.1. Ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas

La regulación del ciclo celular es uno de los aspectos más importantes del

mismo, debido a las enfermedades derivadas de los fallos en el control de

la proliferación. Es por esto que los diferentes puntos de control han sido

objeto de estudio, ya que pueden usarse como dianas para posibles

tratamientos antitumorales. Los sistemas de control de regulación del ciclo

son unos complejos bioquímicos compuestos por proteínas reguladoras

que interaccionan entre sí, entre ellas las ciclinas y las quinasas

dependientes de ciclinas (CDKs).

Introducción

7

Las CDKs ejercen una regulación positiva sobre el ciclo, se trata de

enzimas binarias cuya subunidad catalítica se coordina con adenosina

trifosfato (ATP) y trasfiere un fosfato al sustrato apropiado. Por sí solas las

subunidades de CDK no tienen actividad enzimática, sino que necesitan

asociarse a un activador alostérico específico denominado ciclina. Estas

ciclinas son específicas para cada fase del ciclo, cuando se unen entre sí

inducen un cambio conformacional en el dominio C terminal que conlleva

la activación de las CDKs, y los complejos formados desencadenan la

transición de las distintas fases del ciclo celular17.

Se conocen más de 20 CDKs diferentes. De algunas de ellas, aún se

desconoce su función. Las restantes conocidas están identificadas como

reguladoras del ciclo celular, o como reguladoras de la transcripción18.

Existe una clasificación de las CDK en función de la etapa y los procesos

que controlan.

Los fármacos inhibidores de ciclinas basan su mecanismo de acción en

este sistema de regulación, el cual ha sido objeto de múltiples

investigaciones para el desarrollo de nuevos medicamentos contra el

cáncer. Su atención se ha alentado en los últimos años, no solo por el

hecho de que regulan el ciclo celular, sino porque también regulan diversos

aspectos de la transcripción. Debido a la falta de selectividad de los

fármacos inhibidores de las CDK, estos presentaban una alta toxicidad y

no tenían una buena actividad contra el cáncer19.

Las quinasas dependientes de ciclinas 4 y 6 juegan papeles fundamentales

en la proliferación de células mamarias. Su actividad enzimática en la

primera etapa del ciclo celular (G1) está regulada por ciclinas tipo D,

expresadas en respuesta a señales extracelulares, como por ejemplo

estimuladores de mitógenos, inductores de la diferenciación o contacto

célula-célula, entre otros20.


8

El gen retinoblastoma (RB) es un gen canónico supresor de tumores, la

proteína que codifica, RB, es desfosforilada (activada) en la fase M y

progresivamente refosforilada (inactivada) en la fase G1, primero por las

quinasas dependientes de ciclinas D (CDKs 4/6) y después por las E

dependientes (CDK 2). La proteína RB es completamente fosforilada al final

de la fase G1, lo que conlleva la inactivación de su función supresora de la

proliferación y permite la entrada de la célula en la siguiente fase, S21

(Figura 2). Se han relacionado las quinasas dependientes de ciclinas D con

diversos tipos de cáncer como el de mama. Cuando hay una

sobreexpresión de ciclinas tipo D o una falta del inhibidor de estas CDKs,

las proteínas INK4 (p16INK4A)22 inhiben la fosforilación de la proteína RB y

dejan a las células arrestadas en la fase G0 (quiescencia), en el punto de

restricción (Figura 2).

Figura 2. Fosforilación de RB en el ciclo celular por las quinasas.

Recientemente, se han desarrollado fármacos selectivos de isoformas

clave, como el palbociclib (Figura 3), un inhibidor selectivo de la isoforma

CDK4/6, activo frente a cáncer de mama. Esta técnica se basa en el estudio

Introducción

9

de biomarcadores personales de cada paciente, que permiten seleccionar

dianas más específicas y tener así una mayor ventana terapéutica. Sin

embargo, uno de los mayores problemas de esta familia de fármacos

antitumorales es la resistencia que generan23.

Otros ejemplos de fármacos inhibidores de las CDKs aprobados por la FDA

son el ribociclib (nombre comercial Kisqali®) o el abemaciclib (Verzenio®),

ambos activos contra las CDK4 y CDK6 para el tratamiento vía oral de

cáncer de mama. El ribociclib es activo cuando se administra en

combinación con inhibidores de aromatasa para el tratamiento de mujeres

pre/peri/post menopáusicas con HR+/HER2- avanzado o cáncer de mama

metastásico. Este fármaco inhibe la CDK4 con un valor de CI50 de 10 nM y

la CDK6 con una CI50 de 39 nM20. Sin embargo, la potencia inhibitoria contra

las CDKs 1 y 2 es mucho menor (>50 μM).

Figura 3. Moléculas inhibidoras de CDKs aprobados por la FDA (a-c);

Estructuras inhibidoras de CDKs que están actualmente en ensayos clínicos o

próximos a estarlo (d-f)24.

N

N N

O

OHNN

N

NH

N

N NHN

N

N

NH

O

NN

N

F

N N

F

NHN

NN

a) Palbociclib b) Ribociclib c) Abemaciclib

O

O

Cl

N

HOHO

OH

N

HO N

N

NNH

NO

N

N

NH

F

FF

O

SO

NH

OH

d) Alvocidib e) Dinaciclib f) Roniciclib


10

Estos son algunos de los fármacos inhibidores de las CDKs aprobados por

la FDA, pero también hay muchas moléculas que están en estudios clínicos

o que estarán en breve en este proceso (Figura 3).

Las ciclinas y las CDKs responden a señales intra y extracelulares que

determinan que la célula continúe el ciclo, señales positivas como pueden

ser los factores de crecimiento que estimulan la actividad de las CDKs, o

señales negativas como pueden ser daños o errores en el ADN.

1.2.2. Genes supresores de tumores y proto-oncogenes

Una idea importante a destacar, es que los tumores se desarrollan a partir

de una célula mutada, que ve afectada su capacidad de control sobre la

proliferación. A partir de ella, se crean clones con la misma mutación y, por

tanto, la misma capacidad de proliferar incontroladamente. Pero la

mutación no es única, es decir, para que una célula se vuelva cancerosa

tiene que pasar por un proceso de varias etapas donde se van acumulando

una serie de mutaciones25.

Los genes supresores de tumores y los oncogenes tienen un papel crucial

en funciones como la proliferación celular, el crecimiento y la apoptosis26.

Diversos estudios realizados en moscas de la especie Drosophila, han

demostrado que más del 75% de los genes que se han identificado en

enfermedades humanas tienen sus homólogos en este insecto modelo27;

las actividades de estos genes afectados han servido para explicar mejor

su contribución 28,29.

La competencia celular es un mecanismo por el cual células viables son

eliminadas por la presencia de células más competentes. Este mecanismo

potencia el desarrollo de los animales y los tejidos, sin embargo puede ser

alterado, como en el caso de las células malignas, para proliferar y

Introducción

11

expandirse26. Hay tres tipos de competitividades celulares en función de la

clase de células involucradas (estudiado en Drosophila):

• Competición canónica, en la que las células implicadas son

igualmente viables, pero una es superior a la otra. Por ejemplo, los

mutantes Minute, contienen mutaciones dominantes que afectan a

genes codificantes de proteínas de los ribosomas que causan un

crecimiento más lento (biogénesis reducida)30. Estas células, a

pesar de ser viables, en presencia de células silvestres (sin

mutación), son eliminadas por apoptosis31. Este fenómeno también

se ha observado en mamíferos32.

• Supercompetición, son células alteradas genéticamente que han

adquirido la habilidad de vencer a las células silvestres33,34. Estas

mutaciones pueden ser, bien por inactivación de genes supresores

del crecimiento (como el gen warts)35, o bien por activación de genes

promotores del crecimiento (como el protooncogen Myc)36,37.

• Competencia endógena, es la descubierta más recientemente.

Tiene lugar en el epiblasto (tejido embrionario que está formado por

células madre pluripotentes, a partir del cual se forma el embrión

completo), que tiene cantidades variables de la proteína Myc en sus

células. En este tejido se ha visto que la competición endógena

selecciona las células con mayores cantidades de Myc, como

consecuencia el epiblasto se enriquece con células con mayor

potencial de crecimiento38.

La competición celular mayoritariamente se ve como un sistema

homeostático en el que se sustituyen células ganadoras por células

perdedoras (subóptimas). La eliminación de estas últimas es necesaria

para la expansión de las células más competentes sin que afecte al tamaño


12

final del organismo. Teniendo en cuenta que los diferentes tipos de

competencia no ocurren de forma independiente y separada, no están

definidas del todo las características que determinan en un organismo qué

células son ganadoras y cuáles son perdedoras26.

Toda esta maquinaria de homeostasis del crecimiento y mantenimiento

celular es una caja de herramientas para las células cancerígenas, de modo

que una pérdida de la regulación que ejerce esta competición celular por

mutaciones en genes implicados, es un mecanismo para que un tumor

maligno se expanda y mantenga39,40.

Los genes supresores de tumores son un conjunto de genes que codifican

proteínas implicadas en la inhibición de la proliferación celular, como el gen

p53, clave en la respuesta al daño del ADN, (también conocido como “el

guardián del genoma”41) o el gen RB, ambos se han descubierto mutados

de forma excepcional en diversos tipos de cáncer. Para que una mutación

que afecte a estos genes desencadene un proceso tumoral deben verse

afectados ambos alelos del gen, es decir, son mutaciones genéticamente

recesivas42.

El gen p53 (que codifica la proteína p53) está mutado en aproximadamente

la mitad de los cánceres humanos. Este gen se activa como respuesta a

diversos estímulos, como agresiones al ADN por radiaciones, y factores

como el estrés o los malos hábitos, que crean radicales libres que atacan

al ADN. También se ve estimulado en respuesta a la activación de

oncogenes de forma que la proteína p53 induce transcripción de las

proteínas efectoras de la apoptosis PUMA Y NOXA43, aunque hay estudios

recientes que señalan que la pérdida de actividad de estas dos proteínas

por sí solas no es suficiente para la supresión de la formación de tumores,

ya que en ausencia de ellas no se forman tumores espontáneos44 (Figura

4).

Introducción

13

Figura 4. Mecanismo de acción de p53.

En este mismo apartado, nos encontramos con los genes que poseen una

actividad opuesta a los anteriormente mencionados, los oncogenes. Esta

familia de genes actúa activando la división celular incontrolada. Algunos

ejemplos de proteínas codificadas por dichos genes son los factores de

crecimiento, proteínas quinasas, factores de transcripción, o factores que

afectan a la apoptosis. A diferencia de los genes supresores de tumores,

en estos genes sería necesaria una única mutación en un alelo, lo que

significa que tiene un efecto dominante42.

Pese a conocer que estos genes están afectados en una amplia variedad

de tumores, un cáncer es dinámico y sus anormalidades aparecen por

evolución molecular45. Por ello, el descubrimiento de un tratamiento eficaz

encuentra muchos obstáculos. Pero el conocimiento de todos estos

sistemas de regulación y restricción, así como su desregularización, nos

acercan más a tratamientos efectivos y específicos26.

Estrés celular y daño en el ADN

Célula no estresada

(Niveles bajos de p53)

Estabilización de la prot. p53

Activación transcripcionalp53Apoptosis

PUMA

NOXA

Supresión del tumor

Otros

procesos

efectores


14

1.3. Macrófagos M1 y M2

Los macrófagos son células mieloides del sistema inmune innato

involucradas en diversos procesos tanto fisiológicos como patológicos.

Intervienen principalmente en infecciones e inflamación. Cuando tiene lugar

alguna de estas condiciones, los monocitos presentes en la sangre migran

al tejido afectado y se diferencian a macrófagos46, los cuales, dependiendo

del estímulo, pueden diferenciarse y adaptar su fenotipo debido a la alta

plasticidad que presentan47.

Los macrófagos se pueden asociar principalmente a dos estados de

polarización48: por un lado, nos podemos encontrar con la activación clásica

tipo 1 (M1) que ocurre tras un daño o una infección, produciéndose

citoquinas proinflamatorias como TNF-alfa, IL-1beta, IL-6 e IL-1249, o

especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROX y RNX) que inhiben la

polarización de los linfocitos por la vía alternativa y consecuente

diferenciación a macrófagos M250; por otro lado, la activación alternativa de

linfocitos (M2) está promovida por M-CSF, interleucinas como IL-3, IL-4, IL-

10, corticoides o la Vitamina D. Entre las funciones de estos M2 se

encuentran la inmunosupresión, reparación de tejidos, angiogénesis y

retirada de desechos, procesos que continúan llevándose a cabo en las

masas tumorales actuando de “trabajadores activos” en el mantenimiento

de las células51.

Dentro de esta vía hay diferentes subpoblaciones asociadas a su actividad.

Todos estos subtipos de macrófagos están definidos por la expresión de

marcadores canónicos Cd11d, F4/80 CSF 1R y la ausencia de Gr152, y

todos vienen determinados por señales del microentorno para adoptar un

fenotipo en concreto y actuar según la clasificación mostrada en la Figura

5.

Introducción

15

Figura 5. Funciones de los macrófagos M2 que aumentan la progresión tumoral.

Los macrófagos asociados a tumores (TAM, Tumor Associated

Macrophages) presentan un fenotipo similar a los M253, y representan la

mayor parte de los leucocitos presentes en un tumor sólido, constituyendo,

por las funciones que desempeñan en el crecimiento del cáncer, un

interesante objetivo para el desarrollo de nuevos fármacos

antineoplásicos54.

1.4. Células madre cancerígenas

Las células madre cancerígenas (CSC, Cancer Stem Cells), son una

subpoblación de células tumorales capaces de autoregenerarse,

proliferar55 y diferenciarse. Además presentan una gran plasticidad, por lo

que se adaptan rápidamente al entorno, lo que les confiere la capacidad de

evadir al sistema inmune. Estas características están asociadas a la

tumorogénesis, la metástasis y la resistencia a las terapias antitumorales56.

La célula de origen de las CSCs varía en los diferentes tipos de cáncer57.

Según determinadas hipótesis, estas provienen de células madre

somáticas, células madre parcialmente diferenciadas, o incluso de células

INFLAMACIÓN

REGULACIÓN INMUNE

ANGIOGÉNESISMETASTASIS

INTRAVASACIÓN

INVASIÓN DE CÉLULAS

TUMORALES

Macrófagos inmunosupresivos

Macrófagos activados

Macrófagos angiogénicosMacrófagos asociados a la metástasis

Macrófagos invasivos

Macrófagos perivasculares

Macrófago


16

ya diferenciadas que han adquirido el carácter de células madre por

diferentes mecanismos58.

Las células madre cancerígenas se encuentran en estado quiescente y así,

resisten a fármacos que actúan atacando a los tumores activos59. Además

estas células pueden bombear los quimioterápicos al espacio extracelular

al presentar una elevada expresión de proteínas que actúan como bombas

para extraer fármacos, incluso las CSCs pueden escapar de medicamentos

que inducen apoptosis60.

El porcentaje de células madre cancerígenas en un tumor viene

determinado por:

¨ Las características de las CSCs que han iniciado el proceso

tumoral.

¨ El microentorno en el que se desarrolla el tumor.

¨ La frecuencia con que se crean nuevas CSCs y la tasa de

eliminación de este tipo de células61.

Un mayor número de este tipo de células en una masa tumoral puede

indicar peores recuperaciones, mayor tasa de proliferación, mayor

inestabilidad genética (mayor probabilidad de sufrir mutaciones) o una falta

de diferenciación celular. Las CSCs también son conocidas como “células

iniciadoras de tumores”, ya que son las células predominantes en el inicio

de un tumor62.

Recientemente se han identificado marcadores de superficie de las CSCs,

como CD133, CD13, CD24, ALDH1A1 y CD44, entre otros63–66. Por lo

general, en la superficie celular se encuentran más de un tipo de marcador,

lo que indica la existencia de heterogeneidad entre estas células67. Una

mejor identificación del tipo de CSCs posibilita la elección de un tratamiento

más adecuado68. Además, estos marcadores son proteínas que pueden

Introducción

17

emplearse como dianas para tratamientos, como anticuerpos contra la

proteína CD13 presente en las CSCs del hígado que consiguen67

eliminarlas. Otras proteínas que se han empleado como objetivos

terapéuticos son las proteínas de membrana, usadas para provocar la

eliminación de las células madre, como la RSPO3 sobreexpresada en el

cáncer colorrectal, que juega un papel crucial para la renovación las CSCs

colorrectales, y se ha visto que, anticuerpos de bloqueo específicos de esta

proteína intervienen de forma eficaz en células madre cancerígenas y

tumorales de cáncer colorrectal69. Sin embargo, los marcadores de

superficie de las CSCs también se encuentran en la superficie de las

células madre de tejidos no tumorales, por lo que la intervención en los

procesos de las CSCs también puede afectar a la renovación y

homeostasis de los tejidos sanos60.

1.5. Líneas tumorales usadas en ensayos biológicos

La biología y patología de los cánceres humanos puede ser estudiada en

muestras de tumores extraídas en cirugías. De estos tejidos pueden

aislarse células individuales y, aplicando determinadas condiciones

nutricionales y ambientales, hacerlas proliferar hasta conseguir una línea

tumoral70. Estas nuevas células conservan los marcadores del cáncer, son

puras, fáciles de hacer crecer y genéticamente manipulables por lo que

proporcionan de resultados reproducibles cuando se aplica el mismo

protocolo en la misma etapa o tras numerosos cultivos.

Al comienzo de la década de los 90, el INC en Estados Unidos, introdujo

un nuevo sistema que consistía en un estudio de barrido de fármacos,

empleando un panel con 60 líneas celulares cancerígenas derivadas de 9

tipos cáncer (cerebro, colon, leucemia, pulmón, melanoma, ovario, renal,

mama y próstata)71. Esta técnica resultó muy útil ya que permitía ensayar

fármacos en diferentes líneas celulares, y hacer una rápida selección de


18

los posibles tipos de cáncer objetivo de los nuevos agentes

quimioterápicos, así como de las moléculas más activas.

Sin embargo, hay detractores del empleo de células tumorales ya que

defienden que no mantienen algunas características importantes para la

extrapolación de resultados72, como son:

• Las líneas celulares cambian al estar en cultivo (cambios genéticos

y en el ARNm).

• La heterogeneidad celular presente en el cáncer primario no se

conserva.

• Las líneas celulares no contienen los componentes del microentorno

que se forma en la localización de la masa tumoral.

Posteriormente se han desarrollado nuevas técnicas para corregir el

limitado abanico de tipos de cáncer ensayados, que sólo incluía 6 ó 7 líneas

celulares de cada tipo, así como cultivos celulares sin las limitaciones antes

mencionadas. Hoy día existen nuevas tecnologías de procesamiento de

datos de alto rendimiento, que hacen posible comparaciones de

mutaciones de genes, control de los cambios estructurales y perfiles de

expresión de ARNm, comparando las líneas tumorales primarias y las

obtenidas a partir de estas72.

1.5.1. Ensayos en cultivos celulares 2D y 3D

El cultivo celular es una herramienta básica en biología celular.

Tradicionalmente se han utilizado cultivos clásicos bidimesionales (2D)

(Figura 6), en los cuales una monocapa de células se hace crecer fijada a

una superficie plástica73. Las células precisan de un sustrato para su

crecimiento y supervivencia, los cultivos 2D han sido ampliamente

utilizados, pero esta técnica sólo nos aporta información in vitro, y no refleja

la realidad de, por ejemplo, un fármaco en un sistema biológico complejo74.

Introducción

19

Figura 6. Cultivos celulares bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D).

Con el objetivo de buscar cultivos más productivos y que se asemejen más

a las condiciones in vivo, se ha desarrollado el cultivo 3D (Figura 6). Estos

cultivos surgen como una herramienta que nos permite tener información

más fiable y realista del comportamiento de un agente químico en tejidos y

órganos, un punto intermedio entre los ensayos in vitro y los ensayos con

animales75.

Los cultivos 3D muestran mayor grado de complejidad y pueden mimetizar

características cruciales del entorno celular in vivo, como pueden ser

interacciones célula-célula o célula-medio extracelular. También permiten

que las células repliquen condiciones que presentan en los tejidos como

morfología, diferenciación, polarización, expresión genética y perfiles

genómicos. Además, se pueden estudiar otros aspectos importantes, como

heterogeneidad celular y gradientes de oxígeno y nutrientes en tumores76.

Sin embargo este procedimiento, pese a la superioridad en términos de

extrapolación de resultados, no está exento de desventajas. La

metodología del cultivo celular 3D necesita continuas mejoras para el

desarrollo de ensayos simples, reproducibles y bien validados, además el

coste es significativamente superior al de la técnica 2D77.

En relación al estudio del cáncer, los cultivos 3D permiten conocer aspectos

tales como morfología de células cancerígenas, microentorno en el que se

desarrollan, expresión genética y proteica, así como su comportamiento en

Cultivo celular 3D

Cultivo celular 2D


20

procesos de invasión, migración, metástasis, angiogénesis y metabolismo

de las masas tumorales75. Otra importante aplicación de esta técnica es

aplicarla para el descubrimiento de nuevos fármacos antitumorales,

ensayando agentes quimioterápicos y realizando estudios de la respuesta

adaptativa o el efecto sobre las CSCs.

En resumen, los cultivos celulares 2D proveen de información básica en el

descubrimiento de nuevos medicamentos, como citotoxicidad, penetración

del compuesto en la célula y acumulación de este. Por otro lado, los cultivos

3D, al mimetizar las condiciones in vivo, pueden reducir costes en el

desarrollo de fármacos, mejorar el cribado de compuestos activos,

minimizar la tasa de errores e incluso eliminar la experimentación con

animales durante la etapa inicial del desarrollo de nuevos agentes

antitumorales78.

1.5.2. Ensayos biológicos realizados en células tumorales

La investigación contra el cáncer se ha visto muy beneficiada por las líneas

celulares tumorales. Éstas proporcionan muestras uniformes y un gran

número de células aisladas75, lo que ha permitido someterlas a toda clase

de estudios y ensayos a fin de conocer más sobre su fisiología, y su

comportamiento, así como la posibilidad de estudiar el efecto de diferentes

compuestos químicos y agentes físicos sobre ellas.

Dentro de los diferentes ensayos que pueden realizarse sobre las líneas

tumorales se encuentran:

§ Ensayos de genotoxicidad, que consisten en la inducción de

daño en el material genético, tanto por un agente físico como

químico.

§ Migración celular. Las células tumorales se diseminan a lo largo

del cuerpo mediante migración e invasión atravesando la matriz

extracelular. Se produce una intravasación en el torrente

Introducción

21

sanguíneo o linfático, llegando a lugares distantes y finalmente

extravasación para la formación de otro nuevo tumor del mismo

tipo que el original (tumor primario). Este proceso es conocido

como metástasis. Por ello, es de gran importancia conocer el

comportamiento de las células cancerígenas en la migración

celular79.

§ Proliferación celular y ensayos de citotoxicidad. Los ensayos in

vitro se realizan para cuantificar la proliferación celular en

respuesta a diferentes estímulos celulares, o para determinar los

efectos de agentes químicos o físicos sobre las células. Este tipo

de estudios nos permite monitorizar la división celular, el número

de células generadas a lo largo del tiempo, o la viabilidad de

estas. Para comprobar estos parámetros se pueden emplear

diversos métodos, los cuales se clasifican en diferentes

categorías80:

- Métodos de tinte de exclusión, como el ensayo Trypan

Blue.

- Métodos basados en la actividad metabólica.

- Ensayos de ATP.

- Ensayos de Kiton Red 620, para la cuantificación de

proteínas celulares por métodos fluorométricos.

- Ensayos de marcadores de viabilidad de proteasas.

- Ensayos de supervivencia de células clonogénicas.

- Ensayos de proliferación celular por síntesis de ADN.

En muchos tipos de cáncer, las CSCs (descritas en el apartado 1.4.) son

una población celular distinta de las que forman la masa tumoral y pueden

ser aisladas del resto de células tumorales. La ventaja de estas células es

que, gracias a su capacidad de auto-renovación y auto-preservación, se

pueden obtener poblaciones durante un tiempo indeterminado. Sin

embargo, en algunos tipos de cáncer no es posible distinguir las CSCs de


22

las células tumorales normales, ya que todas presentan una alta tasa de

replicación81.

Otra posibilidad para el descubrimiento de nuevos fármacos antitumorales,

es el empleo de modelos de sistemas de predicción de actividad. Uno de

los más destacados es la Enciclopedia de líneas cancerígenas (Cancer Cell

Line Encyclopedia, CCLE), que consiste en una compilación de expresión

de genes, número de copias cromosomales y secuencias genéticas de 947

líneas celulares cancerígenas humanas82. En este modelo se ensayaron 24

fármacos anticancerígenos frente a 479 líneas celulares, lo que permitió

una predicción de la sensibilidad a medicamentos basada en la genética,

la línea celular y la expresión de genes. Esta base de datos se actualiza

constantemente83, lo que permite una predicción actualizada de la posible

actividad de las moléculas de interés. Si podemos predecir la respuesta

molecular de un tumor frente a un fármaco, aceleraremos los tratamientos

personalizados84–86 que con tanta urgencia necesitamos

Introducción

23

2. Antecedentes estructurales

El Esquema 1 muestra un resumen de las diferentes estructuras publicadas

por nuestro grupo de investigación, diseñadas a partir del 5-Fluorouracilo

(5-FU).

Esquema 1. Esquema general de la evolución del diseño racional desde el 5-FU hasta

los compuesto no acetálicos.

HN

NH

FO

OHO

O OR

5-FU

X

O

R

5-FU

O

O5-FU

R

R

R

R

O

OHOMe

5-FU

O

OO

O 5-FU

5-FU14

O

XN

NHO

O

RO

XN

N

NNY

X

O

XN

N

N

N YX

O

NR

Purinas/Pirimidinas

O

NS OO

R

R

X

O NN

NN

R

R

Seco-nucleósidos5-FU 1-(1,4-diheteroepanilos)

O,N-acetales cíclicos y abiertosDímero del O,N-acetal

Estructuras O,N-acetálicas unidas a otras bases nitrogenadas

Benzoxazepinas O,N-acetálicas unidas a bases púricas y pirimidínicasCompuestos no acetálicos


24

2.1. 5-Fluororuracilo

El (5-FU) (Esquema 1) es una molécula empleada como agente antitumoral

sintetizada en 1957 mediante un diseño racional. Se diferencia del uracilo

por tener un átomo de flúor en lugar de un hidrógeno en la posición 5 del

anillo pirimidínico87. Actualmente se sigue empleando en cáncer de tracto

genitourinario, tracto gastrointestinal (colon, páncreas y estómago), y

cáncer de mama, cabeza y cuello. También se ha visto que es más efectivo

cuando se aplica con radioterapia en cáncer de cuello, cabeza, páncreas,

esófago y gástrico88.

Esta molécula, que actúa como un antimetabolito89, requiere pasar por un

proceso enzimático (ribosilación y fosforilación) para ejercer su actividad

citotóxica, así su mecanismo de acción es a través de la interferencia con

la síntesis de ADN y la traducción de ARNm90.

Entre los muchos efectos secundarios tras su administración por perfusión,

destaca la mielotoxicidad, pero también presenta otros como son

estomatitis, eritrodisestesia palmo-plantar, neuro y cardiotoxicidad

asociados a un tratamiento continuado91. Hay técnicas nuevas para

disminuir estos efectos adversos, como los pellets inyectables92 o la

obtención de derivados mediante cambios estructurales93,94,95.

2.2. Desarrollo racional desde el 5-FU al bozinib

2.2.1. Aciclonucleósidos

Nuestro grupo de investigación partió de moléculas que en un principio se

diseñaron como profármacos del 5-FU, en busca de derivados más

efectivos y menos tóxicos. En primer lugar, se sintetizaron los denominados

seco-nucleósidos (Tabla 1), con una estructura de nucleósido no clásico

con el azúcar lineal en lugar de cíclico. Estos derivados se obtuvieron por

la reacción de acetales de 7 miembros (1a-g) con 5-FU en presencia de

Introducción

25

cloruro de estaño (IV), trimetilclorosilano y hexametildisilazano, a

temperatura ambiente, para dar 1{[3-(2-hidroxietilhetero)-1-alcoxi]alquil}-5-

fluorouracilos (1a-f) y 1-{[2-(3-hidroxipropoxi)-1-isopropoxi]etil}-5-

fluorourailo (1g) 96. Tabla 1. Derivados 1{[3-(2-hidroxietilhetero)-1-alcoxi]alquil}-5-fluorouracil (1a-f) y

1-{[2-(3-hidroxipropoxi)-1-isopropoxi]etil}-5-fluorouracilo(1g).

Precursor Comp. CI50 (μM)

-

45

18

45

25

362

4300

O

O

MeO

HO O OMe

5-FU

1a

O

O

PriO

HO O OPri

5-FU

1b

O

O

CpO

HO O OCp

5-FU

1c

O

O

PriO

HO O OPri

5-FU

1d

O

O

PriO

HO O OPri

5-FU

1e

O

S

PriO

HO S OPri

5-FU

1f

O

O OPri HO OOPri

5-FU

1g

HOO OR

5-FU

1a-gn


26

De estos derivados, los análogos con radicales isopropoxilo (OPri) y

ciclopentoxilo (OCp) fueron los que presentaron una mayor actividad

antiproliferativa frente a la línea celular humana Hep-2 (cáncer de laringe).

De todos ellos destacó el compuesto 1c, que resultó ser 4 veces más

potente que el 5-FU bajo las mismas condiciones de ensayo, con una CI50

de 18 μM frente a 90 μM de la molécula de referencia (5-FU). Los derivados

ensayados no mostraron una toxicidad clara en comparación con los

efectos tóxicos del 5-FU. Se observó también que la estructura más

lipofílica resultó ser la más activa96.

A partir de los compuestos 1a-g, mediante la modificación de la cadena de

3-(2-hidroxietoxi)propilo, se obtuvieron nuevos derivados (2a-i) a fin de

conocer un poco más las relaciones estructura-actividad de esta familia de

compuestos97 (Tabla 2).

Estas estructuras se ensayaron frente a la línea de carcinoma humano de

colon HT-29 y fueron diseñadas para liberar dos sustancias citotóxicas, la

acroleína por un lado y el antimetabolito 5-FU, por otro (Figura 7). Esta idea

se basaba en conjugar la actividad inhibitoria de la acroleína frente a células

tumorales de ovario de hámster chino, con una CI50 de 50 μM98, con la ya

mencionada actividad antiproliferativa del 5-FU.

Sin embargo, solo el compuesto 2h resultó activo frente a la línea HT-29,

presentando 8 veces menos actividad (CI50 = 70 μM) que el fármaco de

referencia (CI50 = 9 μM).

Figura 7. Descomposición de los aciclonucleósidos para liberar 5-FU y acroleína.

Y X OR

B5-FU

O

HAcroleína

Introducción

27

Tabla 2. Nuevos derivados de aciclonucleósidos

Comp. R X Y B

2a Me O CH2OTs 5-FU

2b Me S CH2Cl 5-FU

2c Me O COOMe 5-FU

2d iPr O CH=CH2 Uracilo

2e iPr O CH=CH2 Adenina

2f iPr O CH=CH2 5-FU

2g Me O CH(OH)CH2OH 5-FU

2h Me O CH(OH)CH2Cl 5-FU

2i Me O CH(OMe)5-FU 5-FU

2.2.2. Derivados 1-(1,4-diheteroepanilo)

La siguiente aproximación fue la obtención de derivados cíclicos (Figura 8),

anillos de 7 miembros (1-(1,4-diheteroepanilo) unidos a 5-FU99. La teoría

que sustentaba este diseño era la de actuar como profármaco, con la

liberación del 5-FU mediante la enzima uridina fosforilasa. Pero esas

estructuras resultaron ser menos activas que el fármaco solo, siendo

únicamente el estereoisómero cis del compuesto 3g moderadamente activo

(CI50 = 30 μM) frente a la línea celular HT-29, en comparación con la CI50 =

4.5 μM del 5-FU. La presencia del cloro y su electronegatividad parecían

proporcionar una mayor labilidad del enlace hemiacetálico por hidrólisis

enzimática.

Y X OR

B

2a-i


28

2.2.3. Estructuras O,N-acetálicas cíclicas y acíclicas unidas a 5-FU

Teniendo en cuenta que de la serie de los seco-nucleósidos la estructura

más lipofílica fue la más activa96, se siguió esa vía con objeto de obtener

compuestos más potentes. Tras la síntesis de los derivados de 1-(1,4-

diheteroepanilo) se llevo a cabo la obtención de nucleósidos cis/trans-[3-

(hidroximetil)-1,4-dioxepan-5-il]pirimidina 4a-e100(Figura 9), para su posible

aplicación como antineoplásicos y antivirales. Sin embargo los ensayos

biológicos no fueron satisfactorios.

Figura 9. Estructura cis/trans-[3(hidroximetil)-1,4-dioxepan-5-il]pirimidinas 4a-e.

O

O BHOH2C

4a-e

comp. B

4a 5-FU

4b 5-bromouracilo

4c 5-(trifluorometil)uracilo

4d timina4e citosina

Compuesto X R

3a O H

3b S H

3c NTs H

3d O 6-Me*

3e O 7-Me*

3f O 3-Me*

3g O CH2Cl*

3h O CH2I*

Figura 8. Estructura general de los derivados 5-FU con un resto de 1-(1,4-

diheteroepanilo); (*cis/trans).

X

O

R

5-FU

3a-h

Introducción

29

Así, con idea de aumentar la lipofilia, la siguiente aproximación fue la

obtención de una serie bioisostérica de O,N-acetales de siete miembros

condensados con benceno 6 y 7101 basados en el compuesto 5 previamente

publicado por el grupo102. Durante la preparación de estos productos se

obtuvo también el derivado de seis miembros 8. En todos los casos la unión

del 5-FU tenía lugar a través de la posición N1 del anillo pirimidínico (Figura

10).

La estrategia sintética para la obtención de los cicloacetales de siete

miembros partió del alcohol 2-hidroxibencílico 9a o sus correspondientes

derivados sustituidos con un grupo metoxilo en posición 3 ó 5 del anillo 9b-c, que se cicló en dos etapas hasta los derivados benzo[1,4]dioxepínicos

11a-c y posteriormente se unió a la base pirimidínica 5-FU (Esquema 2).

Esquema 2. Ruta sintética para la obtención de O,N-acetales de siete miembros

unidos a benceno.

O 5-FU

O

O5-FU

R2

R1

O 5-FU OOH

5-FU5 7 86

comp. R1 R2 %Rto

6a H H 43

6b OMe H 40

6c H OMe 16

R2

R1

OH

OH

R2

R1

O

OHOMe

OMe

O

OOMe

BrCH2CH(OMe)2

HNa, DMF anh.BF3·Et2O

Et2O anh.

R2

R1

5-FU, HMDS, TCS

SnCl4/CH2Cl2, CH3CN

10a-c 11a-c9a-c

O

O5-FU

R2

R16a-c

Figura 10. Nuevos derivados O,N-acetálicos.


30

Para la síntesis del compuesto 7 se partió de acroleína (Esquema 3), que

se transformó en la correspondiente sal de fosfonio no aislada (12),

obtenida por un método ya publicado103, y esta se hizo reaccionar con 2-

hidroxibenzaldehído vía reacción de Wittig para obtener el aducto Z-13. La

ciclación posterior empleando BF3 en éter etílico, dio el compuesto 2-

metoxi-2,3-dihidrobenzoxazepina 14. Finalmente, la sustitución del grupo

metoxilo por 5-FU se llevó a cabo como se describe en el Esquema 3 para

dar el derivado 7101.

Esquema 3. Síntesis de (RS)-1-(2,3-dihidrobenzoxepin-2-il)-5-fluorouracilo 7.

El último compuesto que se obtuvo de esta serie fue el 8. Cabe destacar

que durante su síntesis se forma un anillo de seis miembros, en lugar de

uno de siete (Esquema 4). En el penúltimo paso de ciclación, el trifluoruro

de boro se coordinó con uno de los grupos metoxilo para dar un ion

oxocarbenio, resultante de la pérdida del otro grupo metoxilo, de modo que

la ciclación podía progresar por dos vías:

a) Ciclación intramolecular con el grupo hidroxifenólico y la

consiguiente formación del anillo de siete miembros 15. Este

proceso era bastante improbable debido a la pobre nucleofília del

antes mencionado grupo hidroxilo, al estar formando un complejo

con el ácido de Lewis, BF3.

O

H

CH(OMe)2

PPh3

OH

O OH CH(OMe)2

BF3·Et2OO

OMe5-FU, HMDS, TCS

SnCl4/CH2Cl2, CH3CN

Acroleína 12 Z-13

14

Ph3P, TMSCl

MeOH

O 5-FU

7

Introducción

31

b) Ciclación intramolecular con el anillo aromático, cuya posición no

sustituida adyacente al oxígeno etéreo era suficientemente

nucleofílica para formar el cromeno no acetálico 16.

La sustitución del grupo metoxilo por un resto de 5-FU se llevó a cabo

partiendo en este caso del cromeno 16, utilizando las mismas condiciones

experimentales que en los casos anteriores para, finalmente, obtener el

compuesto 8.

Esquema 4. Síntesis del derivado de cromeno 8.

De todos los derivados O,N-acetálicos obtenidos mediante las rutas

sintéticas descritas, los compuestos 6a (CI50 = 7 μM) y 6b (CI50 = 4.5 μM)

fueron los que presentaron mejores resultados como inhibidores del

crecimiento celular de la línea MCF-7 de cáncer de mama. El derivado 7

inducía la apoptosis en un 57.33% de la población celular total en 24 horas.

Es interesante destacar que los compuestos 6a-c, 7 y 8 han resultado

detener el ciclo celular en la fase G0/G1 cuando se han ensayado en la línea

MCF-7, a diferencia del 5-FU que lo hace en la fase S, de lo que se deduce

que estas estructuras no actúan como profármacos del 5-FU sino como

fármacos en sí, entendiendo que los anillos de 5, 6 y 7 miembros

benzofusionados son necesarios para su actividad inhibitoria, además del

resto 5-FU104.

OH

OH OH

O OMe

OMeO

OOMe

OH

O

O

O O

OMe

OH

K2CO3, acetona anh.

BrCH2CH2CH(OMe)2

K2CO3, acetona anh., BrCH2CH2CH(OCH2)2

MeOH anh, 1% H2SO4

BF3·Et2O en Et2O anh.

O

5-FU

OH

16 8

15

5-FU, HMDS, TCS

SnCl4/CH2Cl2, CH3CN


32

En base a los resultados obtenidos para los derivados de O,N-acetales con

anillos de siete miembros fusionados con benceno y unidos a 5-FU, 6a y

6b101, se prepararon análogos abiertos y cíclicos con otros sustituyentes en

el anillo bencénico para evaluar su efecto inhibitorio frente a células de

cáncer de mama105.

Por otro lado se llevó a cabo la condensación directa de los O,O-acetales

acíclicos 17a-f (con grupos tanto dadores como atrayentes de electrones

en el anillo aromático), con 5-FU según se describe en el Esquema 5. En

este caso, los compuestos resultantes fueron derivados cíclicos (6a-c) y

acíclicos (18b-f), a través de un proceso cuya regioselectividad dependía

de los sustituyentes del anillo bencénico. Así, en el caso del compuesto 17a

(anillo bencénico sin sustituir), sólo se obtuvo el derivado cíclico 6a; cuando

el anillo aromático estaba sustituido por grupos electrón donantes (17b-c),

se obtuvieron mezclas de productos cíclicos (6b-c) y acíclicos (18b-c) y,

finalmente, sólo se obtuvieron acetales abiertos (18d-f) partiendo de los

acetales (17d-f) con sustituyentes electrón atrayentes en el anillo

bencénico

Esquema 5. Síntesis O,N-acetales cíclicos y abiertos.

En la reacción entre el O,O-acetal acíclico sin sustituyentes en el anillo de

benceno (17a) y el 5-FU, además del ya comentado anteriormente 6a, se

comp. R1 R2a H Hb OMe Hc H OMed Cl He Br Hf NO2 H

R2

R1

O

OHOMe

OMe

5-FU, HMDS, TCS

SnCl4/CH2Cl2, CH3CN O

O5-FU

R2

R1

R2

R1

O

OHOMe

5-FU

17a-f 6a-c 18b-f

Introducción

33

obtuvo también su correspondiente dímero 19 (Esquema 6), con un tiempo

de reacción de 24 horas y empleando SnCl4 como ácido de Lewis.

Esquema 6. Obtención del dímero de 14 miembros 19 y del acetal cíclico 6a

Esta estructura correspondía a un éter que presentaba una corona de 14

miembros con dos fragmentos de 5-FU. El rendimiento para este producto

19 fue muy bajo, pero la estructura resultaba muy atractiva y presentaba

interesantes propiedades biológicas.

Respecto a las actividades inhibitorias de este nuevo grupo de análogos

abiertos y cíclicos procedentes de los O,O-acetales cíclicos, los

compuestos más activos fueron los derivados 18f (CI50 = 5.42 ± 0.26 μM) y

19 (CI50 = 5.5 ± 0.58 μM) con actividades en el mismo orden que el fármaco

de referencia ftorafur (CI50 = 3 ± 0.11 μM) frente a la línea MCF-7105.

2.2.4. Estructuras O,N-acetálicas unidas a otras bases nitrogenadas

Una vez estudiada la influencia del resto O,N-acetálico y visto que el

mecanismo de acción de estos compuestos es diferente al del 5-FU, el

siguiente paso de este desarrollo racional consistió en obtener derivados

con distinta base nitrogenada104.

En primer lugar se sintetizó el derivado (RS)-1-(2,3-dihidro-5H-1,4-

benzoxacepin-3-il)-uracilo (DBDU) (Figura 11), con la misma estructura que

el compuesto 6a, pero sustituyendo la base 5-FU por la base natural uracilo

(U)104. Se observó que este compuesto actuaba sobre la ciclina D1 a nivel

de la transcripción. El arresto que producía en la fase G1/G0 era irreversible,

O

OHOMe

OMe5-FU, HMDS, TCS

SnCl4/CH2Cl2, CH3CN anh. O

O5-FU

O

OO

O 5-FU

5-FU14

17a 6a 1924h


34

conduciendo a las células a la apoptosis por una vía independiente de p53,

y presentaba una CI50 = 5 ± 0.25 μM en la línea MCF-7. También se vio que

la administración intravenosa, dos veces por semana de 50 mg por kg en

ratas, durante cinco semanas no producía muerte ni toxicidad104.

Figura 11. Estructura de DBDU.

Más tarde se obtuvieron seis derivados O,N-acetalicos (20a-f) con bases

diferentes a 5-FU (Figura 12). Las dos modificaciones principales que se

hicieron fueron, por un lado, la de la base pirimidínica, empleando las bases

naturales timina (T) y uracilo (U), y, por otro lado, la sustitución del O del

anillo de siete miembros que está directamente unido al benceno por azufre

(S) y óxidos de azufre (SO y SO2)106.

En este sentido, la oxidación de sulfuros es una técnica importante y directa

para preparar sulfonas, las cuales se han empleado en la obtención de

sustratos activos para la síntesis de fármacos107.

O

ON

NHO

O

DBDU

Comp. X R

20a S H

20b S Me

20c SO H

20d SO Me

20e SO2 H

20f SO2 Me

Figura 12. Derivados O,N-acetálicos con timidina (R=Me) y uracilo (R=H).

O

XN

NHO

O

R20a-f

Introducción

35

La síntesis de los mencionados compuestos se llevó a cabo aplicando un

procedimiento similar al descrito anteriormente para la obtención de los

derivados (RS)-3-metoxi-2,3-dihidro-5H-1,4-benzodioxepinas 6b-c101 y

partiendo del compuesto comercial (2-mercaptofenil)metanol. Este

compuesto se sometió a una alquilación selectiva empleando las

condiciones descritas por Crombie et al.108 para dar el compuesto 21 con

un rendimiento del 79%. A continuación, la ciclación se realizó usando

cantidades catalíticas de ácido p-toluensulfónico en tolueno anhidro

durante un tiempo de reacción de 3 horas para obtener el compuesto 22

con un rendimiento del 95%. La introducción de las bases pirimidínicas T y

U se realizó empleando el mismo procedimiento descrito en los análogos

oxigenados con el 5-FU tal y como se detalla en el Esquema 7.

Esquema 7. Síntesis de los derivados O,N-acetales 20a-f.

Estos seis compuestos 20a-f fueron ensayados frente a la línea tumoral

MCF-7, y los mejores resultados se obtuvieron para las moléculas 20f (CI50

= 12.74 ± 4.79 μM) y trans-20d (CI50 = 30.05 ± 0.71 μM), resultando el resto

inactivos con una CI50 > 100 μM. Es interesante destacar que estos dos

compuestos contenían la base natural timina en su estructura.

SH

OHBrCH2CH(OMe)2 HNa, DMF anh.

S

OHOMe

OMe

p-TsOH tolueno anh. O

SOMe

U o T, HMDS, TCSSnCl4, CH3CN O

SN

NHO

O

R20a-b 20c-d

20e-f

OXONETM

MeOH, H2O

21 22

H2O2, Sc(OTf)3 CH2Cl2/10% EtOH O

SN

NHO

O

R

O

SN

NHO

O

R

O

OO


36

La siguiente aproximación consistió en la sustitución de la base pirimidínica

en el compuesto 6a por una púrica109. Con este cambio se pretendían

mejorar tanto la lipofilia como la diversidad molecular.

En este caso se obtuvieron dos familias de análogos que diferían en el N

de la purina a través del cual se formaba el enlace O,N-acetálico, N7’ ó N9’

(Figura 13). Esta modificación abrió las puertas a nuevas estructuras con

bases nucleotídicas, purinas sustituidas, para su posible utilidad como

agentes antitumorales.

Figura 13. Derivados O,N-acetálicos unidos a purinas.

En general los derivados con el resto purina unido a través del N7’, 24a-h,

presentaban mejor actividad que sus regioisómeros unidos por el N en

posición 9’, excepto en el caso de compuestos que contenían un resto CF3

en posición 6’ de la purina (23e). También se llegó a la conclusión de que

era necesaria la presencia de, al menos, un halógeno para que la molécula

presentara actividad antiproliferativa. El compuesto más activo resultó ser

la N7’-2’,6’-dicloropurina 24c, con una CI50 = 1.28 ± 0.61 μM, siendo 3.4

veces más potente que el 5-FU (CI50 = 4.32 ± 0.02 μM), sin embargo su

regioisómero N9’-2’,6’-dicloropurina 23c presentaba la misma potencia

inhibitoria que el fármaco de referencia.

La siguiente modificación realizada, con objeto de obtener compuestos más

potentes, fue la combinación del anillo benzoxatiepínico con bases tanto

O

ON

N

NNR2

R1

O

ON

N

N

N R1R2

Derivados N9’23a-g

Derivados N7’24a-h

comp. R1 R2

a H Clb H Ic Cl Cl

d H H

e H CF3

f H Phg H NH2h H NMe2

Introducción

37

pirimidínicas como púricas que contenían átomos de halógenos (Esquema

8).

Esquema 8. Nuevos derivados cíclicos y acíclicos O,N-acetálicos con bases

pirimidínicas y púricas halogenadas

Así en el transcurso de esta investigación se obtuvieron las moléculas 4,1-

benzoxatiepínicas cíclicas y acíclicas110 representadas en el Esquema 8,

25-33. Estos compuestos con pirimidinas sustituidas con F, H, Br y CF3 y

6-cloropurina se sintetizaron empleando el procedimiento usado para

obtener sus análogos no halo-sustituidos mostrado en el Esquema 7.

Además, partiendo de 28 se obtuvieron dos compuestos, uno con la purina

sustituida en posición 6 por un grupo metoxilo, 34, y otro derivado con el

resto de 6-cloropurina y el azufre monooxidado, 35, como se muestra en el

Esquema 9

O

SOMe

O

SN

O

SOMe

OO

O

SOO

NHO

O

RS

OMe

NNH

O

O

R

OH

SOMe

NOH N

NN

ClO

S6-cloropurina

SOMe

OH

25b-c 26a-b

27 N7’28 N9’

29

30 N7’31 N9’

32 N7’33 N9’

O O

comp. Ra Hb Fc Brd CF3

6-cloropurina6-cloropurina


38

Esquema 9. Obtención del derivado de 6-metoxipurina 34 y del sulfóxido 35.

De estos 14 compuestos finalmente sintetizados destacaron las actividades

de 27 (CI50 = 3.55 ± 1.10 μM), 28 (CI50 = 5.46 ± 0.02 μM) y 30 (CI50 = 2.58

± 0.08 μM) frente a la línea de cáncer MCF-7. Estas moléculas fueron

seleccionadas y testadas frente a otra línea celular cancerosa, HT-29, y las

correspondientes líneas de células sanas del epitelio mamario no

canceroso (MCF-10) y células del epitelio intestinal de una línea de rata no

tumoral (IEC-6) (Tabla 3). El objetivo de este ensayo era determinar la

selectividad de los compuestos por las células cancerosas frente a las

sanas de modo que pudiera valorarse la toxicidad de los distintos

derivados.

Tabla 3. Actividades antiproliferativas de los compuestos más activos, 27, 28 y

30 frente a líneas MCF-7, MCF-10, HT-29 e IEC-6 con 5-FU de referencia .Índice

terapéutico (IT): a) In vitro IT(mama)= CI50 MCF-10/CI50 MCF-7; b) In vitro

IT(intestinal)= CI50 IEC-6/CI50 HT-29.

Comp. CI50 MCF-7 CI50 MCF-10 IT (a) CI50 HT-29 CI50 IEC-6 IT (b)

5-FU 4.32 ± 0.02 0.73 ± 0.12 0.17 1.08 ± 1.15 0.66 ± 0.10 0.61

27 3.55 ± 1.10 1.68 ± 0.12 0.47 2.85 ± 0.26 5.46 ± 0.34 1.90

28 5.46 ± 0.02 1.85 ± 0.10 0.34 0.92 ± 0.04 11.7 ± 2.40 12.7

30 2.58 ± 0.08 5.84 ± 2.48 2.26 10.48 ± 4.03 10.36 ± 0.01 0.99

O

SN

N

NN

Cl

O

SN

N

NN

Cl

O

SN

N

NN

OMe

H2O2 50%

Sc(OTf)3

NaH/MeOH

O

28

34

35

Introducción

39

De estos ensayos se pudieron obtener las siguientes conclusiones: a) Las

estructuras más activas fueron los derivados 4,1-benzoxatiepínicos (27 y

28) y las 1,1-dioxo-4,1-benzoxatiepinas-6’-cloropurinas 30 y 31 (CI50 = 16.5

± 1.59 μM); b) los regioisómeros con la purina unida a través del N7’ (27,

30) presentaron mejor actividad que las unidas por N9’ (28, 31) y c) el

compuesto más activo fue la N7’-6’-cloropurina 30, que resultó ser dos

veces más potente que el 5-FU frente a MCF-7.

Para continuar ampliando la diversidad de compuestos 4,1-

benzoxazepínicos, y tomando como referencia el compuesto DBDU anteriormente sintetizado104, se llevó a cabo la síntesis de una nueva familia

por sustitución del resto de pirimidina de DBDU por uno de purina, tratando

de encontrar análogos con buena actividad inhibitoria y baja toxicidad. Se

sintetizaron compuestos unidos tanto por el N9’ como por el N7’ de las

purinas sustituidas en posición 6’ por grupos voluminosos como fenoxilo,

feniltio, p-fluorofeniltio ó 2,4-diclorofeniltio, y por otros grupos más

pequeños como aliloxi o metiltio, con objeto de estudiar la influencia del

tamaño del sustituyente en la actividad biológica111 (Esquema 10).

Así, de esta serie de derivados, se pudieron obtener diversas conclusiones

en base a los resultados: primero, la síntesis asistida por microondas

proporciona un procedimiento más rápido y selectivo para obtener los

regioisómeros N7’ ó N9’ simplificando así su purificación; segundo, en base

a los resultados biológicos en la línea MCF-7, se pudo concluir que la

actividad biológica depende de los sustituyentes en la posición 6’ de la

purina; por último, se observó que los derivados con purinas cloradas son

los más activos.


40

Esquema 10. Síntesis de los derivados (RS)-6’-sustituidos-7’ ó 9’-(2,3-dihidro-

5H-1,4-benzodioxepin-3-il)-7H ó 9H purinas a) 45°C, 24-72 h; b) Microondas,

130°C, 5 min; c) Microondas, 100°C, 5 min.

El siguiente cambio que se propuso fue la sustitución del heteroátomo en

posición 1 en el anillo de siete miembros por un nitrógeno112, que permitía

la introducción en esa posición de diferentes sustituyentes, entre ellos el

grupo toluensulfonilo sustituido en posiciones orto o para por un grupo nitro

(57 y 58). Además, para seguir aumentando la diversidad estructural se

sintetizaron, con la metodología previamente publicada, bioisósteros con

restos de pirimidinas113 así, como con diferentes purinas sustituidas110,

obteniéndose en este segundo caso los derivados unidos por N9’ (59a-c) y

por N7’ (60a-j) (Figura 14).

O

OOMe

O

Opurina

N

N NH

NR

36 R = OCH2-C6H1137 R = OC6H538 R = OCH2CH=CH239 R = SC6H540 R = SC6H5-F-(p)41 R = SC6H5-Cl2-(2,4)42 R = SMe

36-42, HMDS, TCS,

SnCl4, CH3CN

43 = N9’3644 = N9’3745 = N9’41

46 = N7’3647 = N7’3748 = N7’41

O

Opurina

O

Opurina

49 = N9’3850 = N9’3751 = N9’4052 = N9’41

53 = N7’3854 = N7’3755 = N7’4056 = N7’42

a)

b)

c)

Introducción

41

Figura 14. Benzoxazepinas O,N-acetálicas unidas a pirimidinas (57a-g y 58a-f) y

unidas a purinas por N9’(59a-c) o por N7’ (60a-j).

También se sintetizaron compuestos con el nitrógeno sustituido por

diferentes grupos voluminosos, entre ellos un resto de

fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). La síntesis de estas estructuras con Fmoc

como sustituyente se realizó mediante la condensación del O,O-acetal 61

con 6-cloropurina, según el procedimiento empleado para obtener sus

análogos con nosilo en el nitrógeno110, igualmente a 50°C durante 48 horas

(Esquema 11).

O

NN

NHO

O

R1

R2O

NN

NHOR1

R2O

comp. R1 R2a H F

b p-Ns F

c o-Ns F

dSO2-C6H4-oNH2

F

e p-Ns H

f o-Ns H

gSO2-C6H4-pNH2

F

57a-g 58a-f

O

NR1

N

N

NN

R2

O

NR1

N

N

N

N

R260a-j59a-c

comp. R1 R2a p-Ns Cl

b o-Ns Clc Fmoc Cl

d p-Ns OHe o-Ns OHf Fmoc OHg H SPhh p-Ns SPhi o-Ns SPh

jSO2-C6H4-oNH2 Cl


42

Esquema 11. Síntesis de los derivados O,N-acetálicos sustituidos en N con el

grupo Fmoc.

Las actividades que destacaron de las nuevas 4,1-benzoxazepinas unidas

a purinas y pirimidinas ensayadas frente a la línea tumoral MCF-7 fueron

las de los compuestos 60b (CI50 = 0.92 ± 0.01 μM), 60h (CI50 = 0.86 ± 0.12

μM), 60c (CI50 = 0.84 ± 0.09 μM) y 59c (CI50 = 0.67 ± 0.18 μM), con valores

de CI50 por debajo de 1 μM. Las dianas objetivo de estos derivados con

actividad antitumoral fueron principalmente reguladores positivos de genes

proapoptóticos, así como inhibidores de genes involucrados en

carcinogénesis, proliferación celular e invasión tumoral114.

Se utilizaron los compuestos 59c y 60h para intentar establecer los

objetivos moleculares claves para su actividad anticancerígena. A través

de ensayos de microarrays (chips de ADN y ARN usados para el estudio

de la expresión de muchos genes simultáneamente), se determinó que los

objetivos moleculares eran genes proapoptóticos con actividad proteína-

quinasa como GP132, ERN1 ó RAC1, los cuales previenen la progresión

de la metástasis.

Para completar el estudio de relación estructura actividad (SAR) se

sintetizaron una serie de compuestos asistidos por microondas, las (RS)-6-

sustituidos-7- ó 9-(1,2,3,5-tetrahidro-4,1-benzoxazepin-3-il)-7H ó 9H-

purinas115, las cuales se ensayaron frente a las líneas tumorales MCF-7 y

MDA-MB-231 (línea de cáncer de mama hormona-dependiente).

O

N

O

NN

N

NN

Cl

O

NN

N

N

N

R2

OO

OO

OO

SnCl4, HMDSTCS, MeCN,6-cloropurina

60c y f59c

OMe

61

Introducción

43

Inicialmente se obtuvieron los derivados 63-66, que se sintetizaron en un

solo paso mediante la condensación de Vorbrüggen asistida por

microondas de los acetales cíclicos 62o y 62p con tres bases púricas

comerciales, 6-cloro-, 6-bromo- y 2,6-dicloropurina-, empleando TMSCl,

HMDS y SnCl4 en acetonitrilo anhidro116 (Esquema 12).

Esquema 12. Compuestos (RS)-6-sustituidos-7 ó 9-(1,2,3,5-tetrahidro-4,1-

benzoxazepin-3-il)-7H ó 9H-purinas.

Por último, se hicieron varias modificaciones en el compuesto 63b. Por una

parte, la posición 6 de la purina fue sustituida mediante una sustitución

nucleofílica selectiva, empleando yoduro sódico y ácido trifluoroacético

para dar 67. También se realizó una reducción del grupo NO2 a NH2 y

NHOH con SnCl2, para obtener 68a y 68b, respectivamente. Para terminar

con los derivados de este apartado de O,N-acetales con bases

nitrogenadas diferentes de 5-FU, se trató el compuesto 63b con tiofenol

para dar los derivados 69a-b (Esquema 13)115.

O

NS

O2N

OO

O

NN

N

N

N

S OO

O

NN

N

NN

R2S

O2N

OO

O

NS

O2N

OO

OMe

66o-p

R1

N

OH

S OMe

N

NN

NO O

NO2

Cl

Cl

64

Cl

Cl

NO2

65

62o-p

63a-d

comp. x-NO2 R1 R2a p-NO2 Cl Cl

b o-NO2 Cl Cl

c p-NO2 H Br

d o-NO2 H Br

comp. x-NO2

o o-NO2p p-NO2


44

Esquema 13. Compuestos obtenidos a partir de 63b.

En estos derivados (RS)-6-sustituidos-7- ó 9-(1,2,3,5-tetrahidro-4,1-

benzoxazepin-3-il)-7H- ó 9H-purinas nos encontramos que la mayoría

tienen una CI50 con valores por debajo de 1 μM. Entre ellos destaca 63a, la

molécula más activa publicada hasta ese momento115. Los compuestos se

ensayaron frente a dos líneas tumorales de cáncer de mama, MCF-7 y

MDA-MB-231 y, adicionalmente, se ensayaron en una línea no tumoral,

MCF-10, con la finalidad de estudiar el índice terapéutico. En estos ensayos

de actividad destacó por su elevada citotoxicidad el compuesto 63a, que

posteriormente pasaría a ser conocido como bozepinib. Las actividades de

la mezcla racémica frente a las líneas tumorales, así como de los

enantiómeros separados, están recogidas en la Tabla 4.

O

NN

N

NN

IS OO

68a-b

NO2

Cl

O

NN

N

NN

ClS OO

Cl

O

NN

N

NN

ClS OO

R

Cl

O

HN

N

N

NN

R2

R1

NO2

63b

comp. R

a NH2

b NHOH

comp. R1 R2

a SPh SPh

b Cl SPh67

69a-b

NaI, TFA,butanona,-15ºC

SnCl2·2H2O,EtOH, reflux

PhSH, K2CO3,DMF

Introducción

45

Tabla 4. Actividades antiproliferativas de la mezcla racémica de (RS)-63a y los

enantiómeros (R)-63a y (S)-63a frente a líneas MCF-7 y MDA-MB-231.

Comp. CI50 MCF-7 CI50 MDA-MB-231

(RS)-63a 0.355 ± 0.011 0.166 ± 0.063

(R)-63a 0.19 ± 0.001 0.11 ± 0.001

(S)-63a 0.1 ± 0.001 0.11 ± 0.001

La tabla muestra cómo los enantiómeros en ambas líneas tumorales

presentan más actividad antiproliferativa que la correspondiente mezcla

racémica. (R)-63a induce la apoptosis hasta el 52.5% de la población

celular tras 48 horas en la línea MCF-7, resultando más activo que el

fármaco empleado en la práctica clínica, el paclitaxel, que induce un 43%

de apoptosis. El índice terapéutico (IT= CI50 MCF-10/CI50 MCF-7) del

compuesto (RS)-63a para MCF-7 es de 5.14 y para MDA-MB-231 de 11.0.

Posteriormente se hizo un estudio para determinar el mecanismo de acción

del bozepinib ((RS)-63a) y mostró un interesante efecto inhibitorio sobre las

quinasas involucradas en carcinogénesis, proliferación y angiogénesis117.

Este compuesto se ensayó también frente a líneas de cáncer de colon, RKO

y HCT-116, mostrando mayor actividad frente a ellas que respecto a las

líneas de cáncer de mama inicialmente ensayadas. En este mismo estudio

se ensayó la actividad sinérgica del bozepinib con interferón-α (IFN- α)

presentando una CI50 = 0.09 ± 0.01 μM frente a la línea tumoral RKO

cuando se administraban conjuntamente (RS)-63a e IFN-α118.

Recientemente se ha llevado a cabo una investigación en la que el

bozepinib se ha administrado en combinación con el gen suicida gef,

obteniéndose un IT de 11.30 (frente al valor de 5.14 que presenta al

administrarse solo). Estos resultados muestran una nueva aproximación

para agentes antitumorales que eviten la proliferación tumoral con una

dosis mínima, más efectiva y menos tóxica 119.


46

Para analizar la influencia del anillo de siete miembros benzofusionado en

la actividad biológica, dado que se ha demostrado que los fragmentos de

purinas no tienen actividad por sí solos, se sintetizaron una serie de

derivados de 1-(bencenosulfonil)-4,1-benzoxazepinas (70-72) sin unir a

bases nitrogenadas120 (Figura 15).

Figura 15. Derivados 1-(bencensulfonil)-4,1-benzoxazepinas.

Tras la síntesis de estas nuevas estructuras sin restos de purina, se analizó

su influencia sobre la proliferación celular, la progresión del ciclo celular y

la apoptosis frente a tres líneas tumorales, MCF-7, HCT-116 y la línea de

melanoma humano A375. Estos ensayos llevaron a la conclusión de que el

grupo sulfonilo unido a un resto de metilenoxienamina presente en las

estructuras 71a-d, era esencial para su actividad antitumoral.

2.3. Compuestos no acetálicos

Un estudio demostró que cuanto más débil era el enlace con el N1 del 5-

FU, mayores eran tanto la actividad antitumoral como la toxicidad de sus

derivados121. Así que, teniendo en cuenta esto y que los compuestos

descritos hasta ahora no actúan como profármacos104, no era necesario

mantener las características de los O,N-acetales. Así, se diseñaron nuevas

estructuras que contenían tanto el anillo heterocíclico benzofusionado

como las bases de purina sustituidas, pero en este caso unido el anillo a la

purina mediante un puente metilénico. Concretamente se obtuvo una

familia de derivados con un anillo de seis miembros y dos heteroátomos en

O

NOCH3

S OO

R

O

NS OO

R

O

NS OO

R

70a-d 71a-d 72a-d

comp. R

a p-NO2

b o-NO2

c p-CH3

d p-NH2

Introducción

47

su estructura. En primer lugar, se sintetizaron derivados de 1,5-

benzoxatiepina mediante la reacción de 2-mercaptofenol con

epiclorhidrina122 (Esquema 14) y, posteriormente, se produjo la contracción

del anillo para dar los compuestos unidos a purinas 75a-k123. También se

formó un derivado, en menor proporción, con un anillo de seis miembros,

74, resultado del ataque del oxígeno fenólico a la posición más impedida

del anillo del epóxido.

Esquema 14. Síntesis de los derivados 2- y 6-disustituidos (RS)-9-(2,3-dihidro-

1,4- benzoxatin-3-ilmetil)-9H-purina.

La contracción del anillo que tiene lugar en la molécula 73 para dar los

derivados de seis miembros benzofusionados unidos a purinas 75a-k, se

podría explicar debido al impedimento estérico causado por la Ph3P al

unirse al grupo hidroxilo secundario de 73, el cual afectaría al ataque de un

grupo voluminoso como la 6-cloropurina durante la reacción de Mitsunobu.

La participación del grupo vecino S-3 implicaría la formación de un

intermedio episulfonio debido al fuerte carácter nucleófilo del azufre

(Esquema 15).

OH

SH

OH

SO

S

OOH

S

O

2-mercaptofenol

NaOH

H2O, 100ºC

73 74

Purina, Ph3P, DIAD, MeCN ó THF anh.

S

O

N

N

NN

R2

R1

O Cl

piridina, H2O,

OH

comp. R1 R2

a H Clb H Brc H SMed H OPhe H SPhf H NHPhg H OCH2CH=CH2h H OCH2Ph

i H SCH2Phj H OCH2C6H11k Cl Cl

75a-k


48

Esquema 15. Posible vía de formación de los productos 75a-k mediante la

reacción de Mitsunobu.

Las condiciones de reacción empleadas para la síntesis de estos derivados

(microondas, 5 min, 140°C), llevaron a la obtención de los distintos

compuestos con rendimientos satisfactorios (>50%).

La actividad antiproliferativa se estudió frente a la línea tumoral MCF-7,

destacando los compuestos 75b (CI50 = 6.18 ± 1.70 μM) y 75k (CI50 = 8.97

± 0.83 μM). Al comparar estas actividades con la del 5-FU (CI50 = 4.32 ±

0.02 μM) en las mismas condiciones, se deduce que la presencia de un

halógeno en la posición 6’ de la purina o la presencia de dos cloros en la

posiciones 2’ y 6’ de dicha base confieren a las moléculas una capacidad

antiproliferativa casi comparable a la del 5-FU124.

Basándose en los nuevos resultados más prometedores obtenidos en la

serie anterior (75a-b y 75k), se sintetizaron isómeros con átomos de

halógenos en el resto de purina y con la base natural adenina,

obteniéndose dos series de bioisósteros: por una parte, (RS)-9-(2,3-dihidro-

1,4-benzoxatin-2-il-metil)-9H-purinas (77a-d) en las que la unión de la

purina, en lugar de mediante la cadena metilénica unida por la posición 3

como sus análogos (75a-b y 76k), se hace a través de la posición 2 y (RS)-

9-(2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-2-ilmetil)-9H-purinas (78a-d)125 en los que el

azufre se ha reemplazado por un oxígeno (Figura 16).

S

OOH

S

OO PPh3

S

ON

N N

NR2

R1

S

O

N

N

NN

R2

R1

75a-k

73

Introducción

49

El compuesto de partida (RS)-2,3-dihidro-2H-1,4-benzoxatin-2-methanol

74, fue sintetizado con la metodología previamente descrita para el

precursor de los isómeros de posición 75a-k123. Por otra parte, el producto

de partida con el anillo benzodioxínico 76 se obtuvo por la reacción de

catecol con epiclorhidrina en NaOH y agua126.

Figura 16. (RS)-9-(2,3-dihidro-1,4-benzoxatin-2-ilmetil)-9H-purinas (77a-d) y

(RS)-9-(2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-2-il-metil)-9H-purinas (78a-d).

Todos los derivados de halopurinas sintetizados presentaron buena

actividad, destacando el bioisostero 77c, isómero de posición de 75k, que

mostró una notable mejoría de la capacidad apoptótica, con una CI50 = 2.75

± 0.03 μM, siendo incluso mejor que el 5-FU. Los derivados con adenina

no presentaron una actividad llamativa.

Dentro de la serie de benzoxatinas, los compuestos más activos (75a-b, 75k, 77a-c) se seleccionaron para la obtención de sus enantiómeros puros.

Se publicaron síntesis enantioespecíficas efectivas así como ensayos de

actividad antiproliferativa contra dos líneas de cáncer de mama (MCF-7 y

SKBR3), de los enantiómeros puros (R y S) y de las mezclas racémicas

(RS)127.

Los enantiómeros presentaron actividades diferentes entre ellos y con

respecto a la mezcla de ambos (Tabla 5), donde la mayor diferencia se

encontró entre los enantiómeros de 77a y los valores más similares entre

S

O NN

NN

R2

R1

O

O NN

NN

R2

R1

comp. R1 R2

a H Clb H Brc Cl Cld H NH2

X

OOH

74 X=S76 X=O

Purina, Ph3P, DIAD,

MeCN ó THF anh.

77a-d 78a-d


50

enantiómeros y con la mezcla racémica fue para 77b. De todos ellos

destaca el compuesto (S)-75k con una CI50 = 1.85 ± 0.05 μM.

Tabla 5. Actividades antiproliferativas (CI50 = μM) de las mezclas racémicas y los

enantiómeros puros frente a líneas MCF-7 y SKBR3.

Comp. CI50 MCF-7 CI50 SKBR3 Comp. CI50 MCF-7 CI50 SKBR3

(RS)-75a 9.24 ± 0.01 8.04 ± 0.00 (RS)-77a 10.6 ± 0.66 8.17 ± 0.00

(R)-75a 4.73 ± 0.02 6.56 ± 0.11 (R)-77a 15.2 ± 0.03 12.1 ± 0.04

(S)-75a 11.4 ± 0.06 9.46 ± 0.00 (S)-77a 3.33 ± 0.02 4.50 ± 0.12

(RS)-75b 4.87 ± 0.02 7.25 ± 0.00 (RS)-77b 6.18 ± 1.70 8.98 ± 0.00

(R)-75b 4.45 ± 0.07 5.18 ± 0.00 (R)-77b 6.17 ± 0.07 9.94 ± 0.00

(S)-75b 3.33 ± 0.13 7.78 ± 0.00 (S)-77b 6.32 ± 0.04 9.05 ± 0.14

(RS)-75k 2.75 ± 0.03 5.0 ± 0.00 (RS)-77c 8.97 ± 0.83 5.73 ± 0.22

(R)-75k 3.33 ± 0.04 4.34 ± 0.00 (R)-77c 10.3 ± 0.01 7.52 ± 0.01

(S)-75k 1.85 ± 0.05 7.03 ± 0.00 (S)-77c 6.93 ± 0.09 4.35 ± 0.00

3. Otros antitumorales heterocíclicos

Los heterociclos son unas estructuras moleculares muy empleadas en

diversas aplicaciones terapéuticas128–130. Entre ellas, el desarrollo de

nuevos fármacos con actividad antitumoral, aparte de los compuestos

sintetizados y ensayados previamente en el grupo, tal y como se describe

en el apartado 2, se han desarrollado otras familias de compuestos

relacionados.

Introducción

51

3.1. Purinas y heterociclos unidos a purinas con actividad antitumoral

Las purinas son un grupo de heterociclos ampliamente usado en el diseño

de fármacos antitumorales, tienen la característica de unirse fuertemente a

pliegues hidrofóbicos e inhibir un amplio abanico de enzimas clave131. En

1953 y 1966132, entre los primeros fármacos anticancerígenos descubiertos

estaban la 6-mercaptopurina y la tioguanina (Figura 17). Estas purinas

modificadas empleadas como antimetabolitos se utilizaban como

inhibidores del metabolismo de ácidos nucleicos en leucemia infantil133–135,

sin embargo la pobre biodisponibilidad de estas moléculas, la desactivación

metabólica, el desarrollo de resistencia frente a ellas y su toxicidad, limitan

su uso clínico136.

Figura 17. 6-mercaptopurina y tioguanina.

Otros análogos de purinas unidas a fragmentos más voluminosos o a

heterociclos han sido sintetizados posteriormente, entre ellos destacan

algunas moléculas ya empleadas en la práctica clínica o en estados

avanzados de desarrollo, como el (R)-roscovitina (Seliciclib®) o la

olomoucina137 (Figura 19), inhibidores de CDKs 138,139. Otro ejemplo de

fármaco derivado de purina unido a un heterociclo que actúa como inhibidor

de las CDKs es el N2-(4-aminociclohexil)-9-ciclopentil-N6-[6-(2-

hidroxifenil)- piridin-3-ilmetil]-9H-purina-2,6-diamina, 79 (Figura 18). Este

compuesto presenta una CI50 = 0.018 μM frente a la línea celular MCF-7 y

una CI50 = 0.035 μM frente a la línea HCT-116. Esta molécula se diseñó a

partir de la (R)-roscovitina, la cual mostró una CI50 de 12.3 y 14.4 μM

respectivamente, para las mismas líneas tumorales140.

N

NH

N

HN

S

6-Mercaptopurina

N

NH

N

HN

S

Tioguanina

H2N


52

Figura 7. Estructura de fármacos antitumorales con restos de purina

olomoucine, (R)-roscovitine y 79.

Por último, las purinas unidas a pentosas son otro grupo de moléculas de

gran interés141. Existen fármacos ya comercializados y empleados en la

práctica clínica que actúan como antimetabolitos de nucleósidos, como la

clofarabina (Clolar®) o la fludarabina (Fludara®)131. Se han descrito

derivados de estos nucleósidos con diferentes aplicaciones en cáncer,

como por ejemplo el derivado de adenosina con sal de aspartato que

muestra actividad como preventivo de la aparición de tumores en el

hígado142. Entre los últimos nucleósidos en ensayos clínicos se encuentran

la sapacitabina, para el tratamiento de leucemia mieloide crónica y otros

tumores sólidos, y ECyD, un análogo de la citidina para su uso contra el

cáncer de cuello y cabeza143.

3.2. Derivados de 1,3- y 1,4-benzoxacinas

Las benzoxacinas son compuestos heterocíclicos que han demostrado

importante actividad como proapoptóticos e inhibidores de la proliferación

celular144,145. También son componentes muy útiles en la obtención de

derivados mas complejos con actividad terapéutica146, por ejemplo, en la

síntesis de compuestos con actividad quimiosensibilizadora frente a

fármacos antitumorales, como la doxorrubicina, para su empleo en cáncer

N

N N

NNH

HN

(R)-roscovitinaOH

N

N N

NNH

NH

79

H2N

N

OH

N

N N

NNH

HN

OHOlomoucina

Introducción

53

de colon, actuando como potenciador del quimioterápico al inhibir la

fosforilación de la enzima AKT, encargada de la reparación de la rotura de

la doble cadena147.

Recientemente se han descrito estructuras con benzoxazinas

benzofusionadas que han presentado una interesante actividad antitumoral

frente a las líneas tumorales HCT-116, MDA-MB-231 y SNU638 (cáncer de

estómago). Entre estas moléculas destacó el compuesto 80, que

presentaba una CI50 de 0.58 ± 0.03 , 0.59 ± 0.02 y 0.52 ± 0.04 μM

respectivamente para estas líneas de cáncer ensayadas. Este compuesto

además fue estudiado en dos líneas celulares sanas, indicando que el

compuesto 80 inhibe la proliferación celular de forma selectiva en células

cancerígenas148

Figura 19. Estructura de 80

Últimamente se ha publicado un artículo en el que derivados

benzoxacínicos del eugenol (Figura 20) (fitofenol bioactivo utilizado como

fármaco natural que ha demostrado una supresión del crecimiento de

melanoma149), en combinación con óxido de grafeno, el cual es empleado

como vehículo, han resultado ser activos frente a líneas tumorales de

cáncer de mama. En concreto, el compuesto 81 presentó una prometedora

actividad frente a las líneas MCF-7 y MDA-MB-231 (CI50 = 31.3 μM y CI50

= 21.8 μM, respectivamente).

O

N O

NO

N

ONHSO

O

F F

80


54

Figura 20. Eugenol y su derivado benzoxacínico, 81

En el 2018 se han obtenido otros derivados de 1,3-benzoxazinas

benzofusionados con aplicaciones en tratamiento del cáncer, con ensayos

in vitro e in vivo, que han puesto de manifiesto una potente actividad

antitumoral a través de la unión al bolsillo hidrofóbico en el sitio de unión

del ATP de EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico)150.

3.3. Derivados de quinazolinas

Los heterociclos con nitrógeno representan un importante grupo de

compuestos ampliamente usados en ciencia de los materiales, agroquímica

y química médica151,152. Debido a la gran importancia de este tipo de

compuestos, la obtención de nuevas rutas sintéticas mas económicas y

efectivas es objeto de trabajo de muchos grupos de investigación151,153–155.

En los últimos años, han sido publicados derivados de quinazolinas con

aplicación como inhibidores de EGFR, por ejemplo gefitinib, erlotinib,

canertinib y afatinib156(Figura 21), algunos de ellos han sido recientemente

puestos en fase 4 de ensayos clínicos, como el fármaco de segunda

generación, afatinib que bloquea de forma irreversible miembros de la

familia EGFR157,158.

OHO

eugenol

ONO O

81

Introducción

55

Figura 21. Estructuras químicas de los principales fármacos inhibidores de

EGFR.

Entre los fármacos de primera generación que inhiben de forma reversible

EGFR, se encuentran el erlotinib y gefitinib159 (Figura 21). Sin embargo se

han detectado resistencias al fármaco de primera línea, gefitinib, asociada

a la actividad de los TAMs y a diversos tipos de células tumorales160–162.

3.4. Tetrahidroisoquinolinas

Las tetrahidroisoquinolinas (THIQ), son moléculas ampliamente estudiadas

por su presencia en la estructura de multitud de fármacos con diferentes

actividades terapéuticas, como antitusivos, agentes antimuscarínicos o con

propiedades anti-isquémicas, entre otras163,164. Estos heterociclos también

son muy útiles en el desarrollo de agentes antitumorales165. Un ejemplo

actual es el compuesto 82, potente antagonista de los receptores de

estrógenos-α (ERα) y con capacidad para degradar de forma selectiva

estos (SERD, Selective Estrogen Receptor Degradation), presenta una

buena disponibilidad oral, eficacia antitumoral y buena SERD (CI50 = 0.9

nM) 166 frente a la línea MCF-7.

N

NOO

OO

HNErlotinib

HCl N

NO

OHN

NO Cl

FGefitinib

N

NO

HN Cl

FAfatinib

NH

O

O

N


56

Figura 22. Estructura del compuesto 82.

Las posibles vías de actuación como antitumorales de los derivados de

THIQ han sido estudiadas por muchos investigadores, como por ejemplo

su aplicación antiproliferativa a través de su capacidad disruptiva de los

microtubos167, como antagonistas del receptor de quimiocinas CXCR4168,

involucrado en la progresión del cáncer169, o como moduladores de

glicoproteínas-P (transportadores de membrana altamente expresados en

CSCs, que están relacionados con fallos y resistencias a muchos

tratamientos quimioterápicos)170,171.

3.5. Tetrahidroquinolinas

Las tetrahidroquinolinas (THQ), son un grupo de compuestos considerado

como privilegiado por sus aplicaciones médicas, debido a su afinidad por

diferentes dianas moleculares, tienen un amplio espectro de actividades

biológicas172 , entre ellas destaca su actividad anticancerígena173–175.

Algunos ejemplos de derivados de THQ con interesantes actividades como

antitumorales son, el compuesto 83 que presenta valores de CI50 = 9.7 μM

para la línea tumoral MCF-7 y de 2.5 μM en la línea tumoral de glioma

murino C6, los estudios realizados parecen indicar que este compuesto

actúa induciendo la apoptosis mitocondrial175. Otra molécula derivada de

THQ con actividad interesante desarrollada recientemente, es el derivado

N

HO

HO O

82

Introducción

57

84, este compuesto actúa inhibiendo la formación de colonias e induciendo

la apoptosis en la línea de cáncer de páncreas PANC-1, mostrando una

CI50 = 4.9 μM176.

Figura 23. Derivados de THQ con actividad anticancerígena.

Se han publicado estudios SAR de análogos de THQ con diferentes

sustituyentes173. El compuesto 85 (Figura 24) mostró una potente actividad

inhibitoria de las proteínas de intercambio activadas directamente por

cAMP (EPAC) implicadas en numerosos procesos celulares como

secreción de insulina, supervivencia celular, apoptosis, transcripción de

genes e integridad cromosomal177. Además se ha visto que la activación de

las EPAC está relacionada con la regulación de procesos de proliferación

y migración en el cáncer de próstata178. Estos estudios demostraron que,

los diferentes enantiómeros presentaban distintas actividades, siendo el

derivado (R)-85, con una CI50 = 3.3 ± 0.4 μM, mucho mas activo que el su

estereoisómero S (CI50 = 31.3 ± 9.2 μM) frente a la proteína EPAC1.

Figura 24. Estructura del compuesto 85.

NH

N

N

O

H

H

83

N

OH

O

O NH

OS

84

N

HO

BrF

Br

85


58

4. Biocatálisis y enantioselectividad

El empleo de enzimas aisladas o de células enteras (que incluyen

cofactores como ATP, NAD o CoASH, entre otros) como catalizadores para

síntesis química, se conoce como biocatálisis179. El uso de esta técnica

para llevar a cabo transformaciones estereoselectivas, está adquiriendo

gran auge en las últimas décadas, tanto en el sector académico como en

la industria180. La gran abundancia de enzimas en la naturaleza capaces de

producir compuestos enantioméricamente puros, nos permite realizar

transformaciones de manera eficiente y selectiva para obtener una gran

variedad de compuestos quirales181.

La decisión de emplear enzimas aisladas o el microorganismo entero (libre

o inmovilizado) depende de muchos factores, como el tipo de reacción, si

hay cofactores involucrados que necesiten ser reciclados, o la escala a la

que debe realizarse la reacción. Además, el empleo de la célula completa

puede presentar otros problemas entre los que destacan: que otra enzima

metabolice el sustrato, el transporte hacia dentro y hacia afuera de la célula

del producto o del sustrato, o que estos sean tóxicos para la célula182.Sin

embargo, el uso de células enteras es muy útil cuando se hacen múltiples

reacciones catalizadas por enzimas, o cuando las enzimas requieren estar

unidas a la membrana. En casos como preparaciones a gran escala en la

industria se pueden emplear enzimas inmovilizadas que presentan muchas

ventajas183,184. Suelen ser más activas y más estables, y los rendimientos

de la relación espacio-tiempo de reacciones optimizadas suelen ser más

altos181,185.

Un conjunto de estudios bioquímicos, microbiológicos y de ingeniería

bioquímica (biotecnología) ha llevado al desarrollo de rutas para la

obtención de compuestos, desde aminoácidos hasta penicilinas, partiendo

de fuentes económicas de carbono como son los carbohidratos186.

Introducción

59

El empleo de enzimas para catalizar reacciones no siempre es posible. Su

uso presenta una serie de ventajas aunque también diversas

desventajas182:

Ventajas

• Puede aumentarse la tasa de transformación hasta en 10 veces187.

• Amplia tolerancia a la variabilidad estructural de sustratos.

• Alto grado de regio, estéreo y enantioselectividad.

• La reacción se puede llevar a cabo en condiciones suaves.

• Las enzimas pueden sobreexpresarse y actuar incrementando la

eficiencia y/o la especificidad de unión al sustrato.

• Baja sobrecarga operacional.

• Reacción considerada como “química verde” o sostenible con el

medio ambiente188.

• Baja producción de desechos con un ratio de efectividad alto.

• Los desechos producidos por la fermentación son, normalmente,

sostenibles y pueden ser retiradas por el sistema municipal de

recogida de residuos.

Desventajas:

• Inestabilidad de algunas enzimas en estado aislado.

• Necesidad de cofactores cuando se emplean oxidoreductasas.

• Baja disponibilidad comercial y coste de aislamiento elevado así

como alta sobreexpresión de las enzimas requeridas.

• Dificultad de sustitución de procesos ya establecidos, debido a que

la biocatálisis suele aceptarse mejor para nuevos productos cuyo

proceso de obtención no existe todavía.

• Requiere nuevas técnicas que precisan de formación específica.


60

Existen más de 3000 enzimas conocidas, las cuales se pueden clasificar

en seis grupos mayoritarios:

Tipo de enzima Actividad

Oxidoreductasas

llevan a cabo oxidación de

alcoholes, dobles enlaces, cetonas

así como reducción de cetonas,

aldehídos y enolatos

Hidrolasas producen la formación e hidrólisis

de esteres, péptidos, glicéridos,

etc.

Liasas

generan enlaces múltiples, adición-

eliminación de pequeñas

moléculas sobre enlaces C=C,

C=N, C=O, etc.

Isomerasas producen la isomerización de

olefinas y racemización

Ligasas forman de enlaces C-O, C-N, C-S y

enlaces fosfóricos.

Transferasas

producen la transferencia de

grupos de una molécula a otra

(metilo, acilo, fosfato, glicosilo y de

grupos amino)

De esta clasificación, las enzimas más empleadas son las hidrolasas, muy

útiles para la resolución de racematos y desimetrización de moléculas

meso con la consiguiente formación de compuestos enantioméricamente

puros. Por otro lado, las enzimas oxidoreductasas se emplean para

convertir compuestos aquirales y meso en enantiómeros ópticamente

puros.

Introducción

61

Como se ha comentado antes, la biocatálisis ha suscitado gran interés en

las últimas décadas, sobre todo en la industria farmacéutica189,190. La

síntesis de moléculas con centros estereogénicos supone en muchas

ocasiones un reto para la obtención de compuestos enantioméricamente

puros. A raíz de este problema, se han desarrollado múltiples

aproximaciones basadas en métodos organometálicos y organocatalíticos

que pueden llegar a convertirse en síntesis complejas180.

4.1. Importancia de las transaminasas (TAs)

La obtención de aminas enantioméricamente puras es una técnica de

síntesis que ha generado un gran interés, sobre todo en la industria

farmacéutica y agrícola191. Las aminas quirales son uno de los

componentes estructurales básicos para la formación del núcleo de los

fármacos con centros quirales 192. Existen diferentes aproximaciones

biocatalíticas para la obtención de aminas quirales, como el empleo de

hidrolasas, oxidoreductasas o transferasas193. Dentro de los posibles

procesos están la resolución cinética con hidrolasas194 o la

desracemización con monoamina oxidasa195. Sin embargo, el proceso que

ha generado mayor interés es la resolución cinética y síntesis asimétrica

con ω-transaminasas (ω-TA)196,197 ya que son la únicas enzimas capaces

de producir una aminación estereoselectiva de cetonas de forma

natural196,198.

Las transaminasas (TAs) pueden clasificarse en α-TA y ω-TA, basándose

en la posición relativa del grupo amino que va a ser transferido en relación

al grupo carboxilo del sustrato199. En el caso de α-TA se requiere la

presencia de una ácido carboxílico en la posición α respecto a la función

ceto o amino y sólo permite la formación de α-amino ácidos192. Sin embargo

las ω-TA permiten la aminación de cetoácidos, aldehídos y cetonas200.

Existen ω-TAs con preferencia enantioselectiva (R) o (S). Dentro de estos

dos grupos de TAs (α-TA y ω-TA) hay una gran cantidad de enzimas, de


62

las que se ha estudiado su adecuación para diferentes tipos de

reacciones201. Un ejemplo de síntesis en que está involucrada una TA es

aquella que emplea aminoácidos como donadores del grupo amino

(Esquema 16).

Esquema 16. Trasferencia de un grupo amino biocatalizado por una

transaminasa (ω-TA).

Para conseguir una conversión eficiente es necesario forzar un equilibrio

termodinámico favorable mediante la eliminación o retirada del producto

ceto formado como subproducto, siendo posible incluso su reciclado con

una ácido deshidrogenasa202. Una técnica puede ser mediante la reducción

del producto ceto a un ácido hidroxílico para forzar la conversión al grupo

amino (Esquema 17).

Esquema 17. Trasferencia de un grupo amino y reducción del producto

secundario formado.

R R’

O

R R’

NH2ω-TA

L- o D- Alanina Piruvato

R R’

O

R R’

NH2TA

NH2

O

OHO

O

OHOH

O

OHLDH/NADH

Ácido láctico

Introducción

63

5. Bibliografía (1) Las cifras del cáncer en España, 2018 https://seom.org/ultimas-noticias/106525-las-cifras-del-cancer-en-espana-2018).

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II. OBJETIVOS

Objetivos

89

Debido a la falta de modelos químicos útiles para el desarrollo de agentes

antitumorales y a la urgente necesidad de nuevos fármacos para tratar la

alarmante aparición del elevado número de casos de cáncer, el objetivo de

esta Tesis doctoral es la búsqueda de nuevos prototipos estructurales más

potentes y útiles.

El propósito general de este trabajo de investigación, es la obtención y

evaluación biológica de derivados de purinas unidas a diferentes

heterociclos, así como análogos abiertos relacionados y la síntesis de un

heterociclo de 7 miembros condensado con benceno para su reducción

enantioespecífica por biocatálisis.

En base a los resultados antes obtenidos por el grupo de investigación, se

plantean los siguientes objetivos específicos:

1. Síntesis de los derivados abiertos mediante protección ortogonal desde

la L-serina para otra serie de compuestos (unidos a metilo y unidos a

etilo) con las diferentes purinas:

2. Síntesis de derivados de purina unidos a benzoxazinas a partir de

aminofenol:


90

3. Síntesis de derivados de purina unidas a tetrahidroquinolina a partir de

tetrahidroquinolina-3-carbonitrilo:

4. Síntesis de derivados de purina unida a piridoxazina a partir de 2-

amino-3-hidroxipiridina:

5. Purificación e identificación inequívoca de las moléculas sintetizadas

mediante estudios de resonancia magnética nuclear (RMN) mono (1H, 13C, DEPT) y bidimensionales (HSQC, HMBC), espectrometría de masas

de alta resolución (HRMS) y análisis elemental de los productos finales.

6. Evaluación in vivo de los compuestos sintetizados como

antiproliferativos, proapoptóticos y agentes que actúan sobre el ciclo

celular contra las líneas tumorales A375, MCF-7 y HCT-116.

7. Síntesis de heterociclo de 7 miembros condensado con benceno

(concretamente benzoxatiepinona) con objeto de llevar a cabo estudios

de aminación reductora estereoespecífica con microorganismos.

III. METODOLOGÍA

Metodología

95

La metodología empleada para la realización de este trabajo consiste en:

En primer lugar, la síntesis y el análisis estructural de los nuevos derivados

incluidos en las distintas familias anteriormente mencionadas. Este análisis

se ha realizado mediante el uso de técnicas espectroscópicas de

resonancia magnética nuclear (RMN), tanto de protones (1HRMN) como de

carbono-13 (13CRMN) y de espectrometría de masas de alta resolución.

También se han llevado a cabo estudios de resonancia bidimensional de

tipo HMBC (1H/13C) y HSQC (1H/13C) para los compuestos representativos

de cada familia estructural, a fin de elucidar de forma inequívoca las

estructuras de los nuevos compuestos sintetizados. La pureza de los

compuestos sometidos a ensayos biológicos ha sido determinada mediante

los correspondientes análisis elementales de C, H y N.

Las técnicas descritas anteriormente están disponibles en el Centro de

Instrumentación Científica de la Universidad de Granada.

Desde el punto de vista biológico se ha llevado a cabo la evaluación de la

inhibición de la proliferación celular in vitro de los compuestos sintetizados,

utilizando diversas líneas celulares tumorales, A375, MCF-7 y HCT-116.

Estos ensayos se detallan en Artículo 1.

Las relaciones estructura-actividad en los derivados ensayados nos

permitirán proponer posibles modificaciones estructurales con objeto de

incrementar la potencia y selectividad de los compuestos.

Por último, la reducción enantioespecífica del derivado de 7 miembros,

benzoxatiepinona, se llevó a cabo empleando TAs comerciales, para la

obtención de los derivados enantioespecíficos aminados.

IV. RESULTADOS

Artículo 1

Artículo 1

101

Abstract

Aim: Identification of new antiproliferative compounds.

Methodology: Four series of compounds were synthesized by the

Mitsunobu reaction. Their antiproliferative activity was studied against

several cancer cells and a non-cancerous fibroblast cell line. Their apoptotic

activity was analyzed using a caspase 3/7 fluorescence assay.

Results & Conclusion: 9-Alkylated-6-halogenated and 2,6-dihalogenated

purines show remarkable inhibition of tumour cell proliferation, with the

dichloro derivatives being the most potent of all the series. The most

promising compound, tetrahydroquinoline 4c, exhibits significant

antiproliferative activity against the cancer cells tested, while displaying a

19-fold lower potency against non-cancerous fibroblasts, a key feature that

indicates potential selectivity against cancer cells. This compound produces

a high percentage of apoptosis (58%) after 24h treatment in the human

breast cancer MCF-7 cells.

Research Article

For reprint orders, please contact: [email protected]

Purine derivatives with heterocyclic moietiesand related analogs as new antitumor agentsNerea Fernandez-Saez1, Belen Rubio-Ruiz2, Joaquın M Campos1,3, Asier Unciti-Broceta2,Marıa Dora Carrion*,‡ ,1,3 & Marıa Encarnacion Camacho**,‡ ,1,3

1Departamento de Quımica Farmaceutica y Organica, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada 18071, Spain2Cancer Research UK Edinburgh Centre, MRC Institute of Genetics & Molecular Medicine, University of Edinburgh, Crewe RoadSouth, Edinburgh EH4 2XR, UK3Instituto de Investigacion Biosanitaria de Granada (ibs. GRANADA), Complejo Hospitalario Universitario de Granada, Universidadde Granada, Granada, Spain*Author for correspondence: [email protected]**Author for correspondence: [email protected]‡These authors contributed equally

Aim: Identification of new antiproliferative compounds. Methodology: Four series of compounds weresynthesized by the Mitsunobu reaction. Their antiproliferative activity was studied against several cancercells and a noncancerous fibroblast cell line. Their apoptotic activity was analyzed using a caspase 3/7fluorescence assay. Results & conclusion: 9-alkylated-6-halogenated and 2,6-dihalogenated purines showremarkable inhibition of tumor cell proliferation, with the dichloro derivatives being the most potent ofall the series. The most promising compound, tetrahydroquinoline 4c, exhibits significant antiproliferativeactivity against the cancer cells tested, while displaying a 19-fold lower potency against noncancerousfibroblasts, a key feature that indicates potential selectivity against cancer cells. This compound producesa high percentage of apoptosis (58%) after 24 h treatment in human breast cancer MCF-7 cells.

Graphical abstract:

N

N

N

NN

Cl

Cl

Ts

O

S

N

N

NN

Y

X

2a–c

A

B 4c

Isostericreplacementin fragment A

Promising tetrahydroquinolinelinked to 2,6-dichloropurinefor future drug development

First draft submitted: 3 July 2018; Accepted for publication: 14 November 2018; Published online:15 January 2019

Keywords: antiproliferative activity • apoptosis • benzoxazine • Mitsunobu • pyridoxazine • quinoline

Cancer is one of the major public health problems in the world with 17.5 million cases worldwide and 8.7 milliondeaths in 2015 [1]. An increase of 13.1 million cancer deaths has been estimated in 2030, according to the WHO [2].Although in recent years there have been important advances in the understanding of the underlying mechanismsleading to many cancers, some of them are still very difficult to treat and remain unmet clinical needs. Multidrugresistance and systemic toxicity are some of the main drawbacks limiting the efficacy of current cancer treatments [3].To tackle these limitations, the design of more effective and safer drugs is required.

It is known that many drugs activate apoptosis as a mechanism for their antitumor activity. Apoptosis is acellular natural process whereby cells induce their own death in response to several biochemical signals that aretypically triggered by an irreparable damage to DNA. It is a fundamental process of protection and maintenance of

Future Med. Chem. (Epub ahead of print) ISSN 1756-891910.4155/fmc-2018-0291 C⃝ 2019 Newlands Press


102

Graphical abstract

Keywords: benzoxazine, quinoline, pyridoxazine, Mitsunobu,

antiproliferative activity, apoptosis.

Introduction

Cancer is one of the major public health problems in the world with 17.5

million cases worldwide and 8.7 million deaths in 2015 [1]. An increase of

13.1 million cancer deaths has been estimated in 2030, according to the

World Health Organization [2]. Although in recent years there have been

important advances in the understanding of the underlying mechanisms

leading to many cancers, some of them are still very difficult to treat and

remain unmet clinical needs. Multi-drug resistance and systemic toxicity are

some of the main drawbacks limiting the efficacy of current cancer

treatments [3]. To tackle these limitations, the design of more effective and

safer drugs is required.

It is known that many drugs activate apoptosis as a mechanism for their

antitumour activity. Apoptosis is a cellular natural process whereby cells

induce their own death in response to several biochemical signals that are

typically triggered by an irreparable damage to DNA. It is a fundamental

process of protection and maintenance of homeostasis. Generally, a group

of cysteine aspartyl proteases known as caspases are responsible for the

initiation (e.g. caspases 2, 8, 9 and 10) and effecting (e.g. caspases 3, 6

Artículo 1

103

and 7) of apoptosis [4]. The development of drugs that induce apoptosis is

an area of great activity for the discovery of new anticancer therapies [5].

Our research group has previously published several compounds that

effectively induce caspase-mediated apoptosis, including a series of benzo-

fused six-membered rings linked to purines through a methylene group.

Substituted 9-(2,3-dihydro-1,4-benzo[b][1,4]oxathiin-3-ylmethyl)-9H-

purines (1a-c) [6] and their isomers 9-(2,3-dihydro-1,4-

benzo[b][1,4]oxathiin-2-ylmethyl)-9H-purines (2a-c) [7] (Figure 1) showed

interesting antiproliferative activities and high apoptosis levels on the

human breast adenocarcinoma MCF-7 cells.

In this article, we have introduced several structural modifications on the

scaffold 2 to explore a new chemical space (Figure 1). A bioisosteric

replacement was made by changing the sulfur atom of the 6-membered ring

by a nitrogen one, obtaining the 2H-1,4-benzoxazine derivatives 3 (series

A). For synthetic reasons, in order to carry out the Mitsunobu reaction, the

nitrogen atom in the heterocycle was converted into the tosylsulfonamide

group. This moiety was maintained in the structure as the removal of the o-

and p-nosyl group in a series of benzoxapine derivatives proved to be

deleterious for the antiproliferative activity in a previous work [8] (see Figure

S.1. in Supplementary Information). Additionally, the toxicity described for

the NO2 group [9, 10] led us to replace it by the p-CH3 on the benzene ring

(tosyl group). The influence of the distance between the heterocyclic ring

and the purine was also evaluated by introducing a linker of two carbon

atoms. Electron-withdrawing groups (Cl, Br, di-Cl) were used as

substituents at positions 2 and 6 of the purine ring since they conferred good

antiproliferative properties in previously reported derivatives 1 and 2 [6, 7].

Additionally, we decided to explore the introduction of a trifluoromethyl

group (CF3), a common substituent used in medicinal chemistry. This group

offers not only high lipophilicity but also increased electron density, and is


104

found in approved drugs such as efavirenz (for HIV disease) [11] and

desoxyepothilone b (anticancer activity) [12]. Finally taking 3 as a reference

scaffold, the following modifications were also introduced: (a) Elimination of

the oxygen atom in the heterocycle and shortening of the side chain

(derivatives 4, series B); (b) change of the benzene ring for a pyridine moiety

and linking the (purine-9-yl)ethyl fragment through the position 3 of the

[1,4]oxazine (compounds 5, series C); (c) aperture of the heterocycle to

obtain open analogues, in which the tosyl group and the substituted purine

moieties have been maintained (derivatives 6 and 7, series D).

Figure 1. Benzo-fused six-membered rings linked to purines described by our research group (1 – 2) and chemical structure of the novel compounds objective of this article

(3 – 7).

O

SN N

NN

XY

O

S

N

N

NN

X

Y1 21a, X = Br, Y = H1b, X = Cl, Y = H1c, X = Y = Cl

2a, X = Br, Y = H2b, X = Cl, Y = H2c, X = Y = Cl

N

N

Ts

N

NN

X

Y

NN

N

N

Y

XO OR

NTs

O

O

a) b)

c)

4a-d 3a-d

6a-d, R = Me 7a-d, R = Et

5b-c

series B series A series C

series D

X = Br, Cl, CF3; Y = H, Cl X = Br, Cl, CF3; Y = H, Cl X = Cl; Y = H, Cl

X = Br, Cl, CF3; Y = H, Cl

O

NTs

N N

NN

X

Y

N

O

NTs

N N

NN

X

Y

Artículo 1

105

Materials and methods

Chemistry

The determination of melting points was made in open capillaries employing

an Electrothermal 1A 6301 instrument and they are unrectified. Elemental

analyses were designated by the element symbols, the results were not

over 0.4% of the postulated values and they were carried out in a Thermo

Scientific Flash 2000 analyzer. Silica (0.035-0.070 mm), 60 Å used for flash

chromatography was manufactured by Acros Organic. NMR spectra were

carried out on a Varian Direct Drive 400 spectrometer operating at 400 MHz

for 1H and 101 MHz for 13C, on a Varian Direct Drive 500 spectrometer

operating at 500 MHz for 1H and 126 MHz for 13C at room temperature (rt)

in all cases. Chemicals shifts (d) are reported in ppm and are referenced to

the residual solvent peak. A VG AutoSpec Q high-resolution apparatus

(Fision Instrument) was used to perform the high-resolution mass

spectroscopy (HRMS). Anhydrous reactions were carried out under argon

atmosphere. Reagents were purchased from Sigma-Aldrich (now Merck)

and Acros Organics (part of Thermo Fisher Scientific).

Synthesis and characterization of the intermediate derivatives are

presented in the Supplementary Information.

Characterization of 6-bromopurines 3a, 4a, 6a, and 7a, are described in the

Supplementary Information.

Synthesis and characterization of 6-trifluoromethylpurines 3d, 4d, 6d and

7d are reported in the Supplementary Information.

General synthetic procedure of halo and dihalopurine derivatives

The tosylated derivatives 9, 11, 16 or 18 (0.31 mmol), Ph3P (164.43 mg,

0.63 mmol) and the adequate halo or dihalopurine (0.34 mmol) were purged

with 3 cycles of vacuum-argon exchanges in a Schlenck line previously


106

anhydrified. Anhydrous THF was added (2 mL) under argon atmosphere

and the reaction mixture was cooled to -20°C. After that, DIAD (124 µl, 0.63

mmol) was added dropwise and stirred from -20°C to rt. After 36 h the

solvent was evaporated and the residue was purified by flash

chromatography (EtOAc/hexane, 2:1).

Characterization of 6-chloropurines 3b, 4b, 5b, 6b and 7b.

2-(2-(6-Chloro-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazine (3b)

White solid (92 mg, 0.195 mmol), yield 63%, mp: 189 - 190°C; 1H NMR (400

MHz, CDCl3): d (ppm) 8.75 (s, 1H, Hpurine), 7.96 (s, 1H, Hpurine), 7.79 (dd, J1

= 8.3 Hz, J2 = 1.5 Hz, 1H, Hbenz), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H, 2xHtosyl), 7.16 –

7.00 (m, 3H, 2xHtosyl,Hbenz), 7.01 – 6.88 (m, 1H, Hbenz), 6.78 (dd, J1 = 8.2 Hz,

J2 = 1.5 Hz, 1H, Hbenz), 4.52 – 4.39 (m, 2H, CH2N), 4.20 (dd, J1 = 14.1 Hz,

J2 = 1.9 Hz, 1H, Hoxazine), 3.38 – 3.27 (m, 1H, Hoxazine), 3.21 (dd, J1 = 14.1

Hz, J2 = 9.7 Hz, 1H, Hoxazine), 2.39 (s, 3H, CH3tosyl), 2.35 – 2.18 (m, 1H,

CH2CH2N), 2.10 – 1.93 (m, 1H, CH2CH2N); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): d

(ppm) 152.0 (CHpurine), 151.7 (Cpurine), 151.1 (Cpurine), 146.0 (Cbenz), 145.2

(Cpurine), 144.6 (Ctosyl), 135.3 (Ctosyl), 131.6 (Cpurine), 129.7 (2xCHtosyl), 126.9

(2xCHtosyl), 126.3 (CHbenz), 124.3 (CHbenz), 123.5 (Cbenz), 121.4 (CHbenz),

117.2 (CHbenz), 68.3 (CHoxazine), 48.2 (CH2oxazine), 40.3 (CH2N), 31.7

(CH2CH2N), 21.6 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for

C22H21N5O3SCl (M + H)+ 470.1054, found 470.1055. Anal. Calc. for

C22H20N5O3SCl: C, 56.23; H, 4.29; N, 14.90. Found: C, 56.22; H, 4.31; N,

14.88.

3-((6-Chloro-9H-purine-9-yl)methyl)-1-tosyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoline (4b)


MHz, CDCl3): d (ppm) 8.74 (s, 1H, Hpurine), 8.04 (s, 1H, Hpurine), 7.73 (dd, J1

= 8.3 Hz, J2 = 11.2 Hz, 1H, Hbenz), 7.39 (d, J = 8.1 Hz, 2H, 2xHtosyl), 7.23 –

Artículo 1

107

7.17 (m, 1H, Hbenz), 7.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H, 2xHtosyl), 7.10 – 7.05 (m, 1H,

Hbenz), 6.98 (dd, J1 = 7.6 Hz, J2 = 1.5 Hz, 1H, Hbenz), 4.25 (dd, J1 = 14.2 Hz,

J2 = 7.2 Hz, 1H, CH2N), 4.15 (dd, J1 = 14.2 Hz, J2 = 6.7 Hz, 1H, CH2N), 4.01

(dd, J1 = 13.5 Hz, J2 = 4.1 Hz, 1H, Hpyr), 3.45 (dd, J1 = 13.5 Hz, J2 = 8.9 Hz,

1H, Hpyr), 2.59 (dd, J1 = 16.0 Hz, J2 = 5.3 Hz, 1H, Hpyr), 2.42 – 2.37 (m, 1H,

Hpyr), 2.36 (s, 3H, CH3tosyl), 2.30 (dd, J1 = 15.9 Hz, J2 = 9.1 Hz, 1H, Hpyr); 13C

NMR (101 MHz, CDCl3): d (ppm) 152.0 (CHpurine), 151.8 (Cpurine), 151.3

(Cpurine), 145.2 (CHpurine), 144.0 (Ctosyl), 136.3 (Cbenz), 136.2 (Ctosyl), 131.6

(Cpurine), 129.7 (2xCHtosyl), 129.3 (CHbenz), 127.3 (Cbenz), 127.2 (CHbenz),

126.8 (2xCHtosyl), 125.2 (CHbenz), 124.0 (CHbenz), 48.5 (CH2pyr), 46.7 (CH2N),

32.8 (CHpyr), 30.7 (CH2pyr), 21.5 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for

C22H21N5O2SCl (M + H)+ 454.1104, found 454.1098. Anal. calc. for

C22H20N5O2SCl: C, 58.21; H, 4.44; N, 15.43. Found: C, 58.19; H, 4.46; N,

15.45.

3-(2-(6-Chloro-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazine (5b)

Yellowish solid (80 mg, 0.171 mmol), yield 55%, mp: 180 - 181°C; 1H NMR

(500 MHz, CDCl3): d (ppm) 8.73 (s, 1H, Hpurine), 8.30 (s, 1H, Hpurine), 8.02

(dd, J1 = 4.7 Hz, J2 =1.5 Hz, 1H, Hbenz), 7.84 (d, J = 8.1 Hz, 2H, 2xHtosyl),

7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H, 2xHtosyl), 7.15 (dd, J1 = 8.0 Hz, J2 = 1.5 Hz, 1H,

Hbenz), 6.96 (dd, J1 = 8.0 Hz, J2 = 4.6 Hz, 1H, Hbenz), 4.80 – 4.75 (m, 1H,

Hoxazine), 4.61 – 4.43 (m, 2H, CH2N), 4.18 (dd, J1 = 11.4 Hz, J2 = 1.4 Hz, 1H,

Hoxazine), 3.77 (dd, J1 = 11.4 Hz, J2 = 2.3 Hz, 1H, Hoxazine), 2.49 – 2.39 (m,

1H, CH2CH2N), 2.38 (s, 3H, CH3tosyl), 2.20 – 2.09 (m, 1H, CH2CH2N); 13C

NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm) 151.8 (Cpurine), 151.7 (CHpurine), 151.0

(Cpurine), 146.0 (CHpurine), 144.4 (Ctosyl), 140.9 (CHbenz), 140.3 (Cbenz), 137.1

(Cbenz), 136.2 (Ctosyl), 131.8 (Cpurine), 129.4 (2xCHtosyl), 128.2 (2xCHtosyl),

124.7 (CHbenz), 120.4 (CHbenz), 67.0 (CH2pyr), 51.2 (Cpyr), 41.6 (CH2N), 30.8

(CH2CH2N), 21.5 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for

C21H20N6O3SCl (M + H)+ 471.1006, found 471.0981. Anal. calc. for


108

C21H19ClN6O3S: C, 53.56; H, 4.07; N, 17.85. Found: C, 53.54; H, 4.09; N,

17.88.

Methyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-chloro-9H-purine-9-yl)propanoate (6b)

White solid (110 mg, 0.217 mmol), yield 70%, mp: 164 - 165°C; 1H NMR

(500 MHz, CDCl3): d (ppm) 8.67 (s, 1H, Hpurine), 8.20 (s, 1H, Hpurine), 7.59 (d,

J = 8.1 Hz, 2H, 2xHtosyl), 7.18 (d, J = 8.1 Hz, 2H, 2xHtosyl), 5.58 (dd, J1 = 9.4

Hz, J2 = 4.9 Hz, 1H, Hprop), 5.05 (dd, J1 = 14.7 Hz, J2 = 4.9 Hz, 1H, Hprop),

4.95 (dd, J1 = 14.7 Hz, J2 = 9.4 Hz, 1H, Hprop), 3.83 (s, 3H, OCH3), 2.41 (s,

3H, CH3tosyl), 1.34 (s, 9H, 3xCH3); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm)

167.8 (COOMe), 152.0 (Cpurine), 151.9 (CHpurine), 150.9 (Cpurine), 149.8

(COOBut), 145.5 (CHpurine), 144.8 (Ctosyl), 135.6 (Ctosyl), 131.3 (Cpurine),

129.0 (2xCHtosyl), 128.1 (2xCHtosyl), 86.1 (C(CH3)3), 58.1 (CHprop), 53.0

(OCH3), 43.4 (CH2prop), 27.6 (C(CH3)3), 21.5 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF)

(m/z) calcd. For C21H25N5O6SCl (M + H)+ 510.1214, found 510.1215. Anal.

calc. for C21H24N5O6SCl: C, 49.46; H, 4.74; N, 13.73. Found: C, 49.48; H,

4.74; N, 13.71.

Ethyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-chloro-9H-purine-9-yl)propanoate (7b)



(d, J = 8.2 Hz, 2H, 2xHtosyl), 7.19 (d, J = 8.2 Hz, 2H, 2xHtosyl), 5.55 (dd, J1 =

9.2, J2 = 5.0 Hz, 1H, Hprop), 5.03 – 4.97 (m, 2H, Hprop), 4.27 (q, J = 7.2 Hz,

2H, OCH2CH3), 2.43 (s, 3H, CH3tosyl), 1.33 (s, 9H, 3xCH3), 1.26 (t, J = 7.3

Hz, 3H, OCH2CH3); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): d (ppm) 167.3 (COOEt),

152.1 (Cpurine), 151.8 (CHpurine), 150.9 (Cpurine), 149.8 (COOBut), 145.4

(CHpurine), 144.7 (Ctosyl), 135.7 (Ctosyl), 131.4 (Cpurine), 128.9 (2xCHtosyl), 128.0

(2xCHtosyl), 85.9 (C(CH3)3), 62.3 (OCH2CH3), 58.1 (CHprop), 43.3 (CH2prop),

27.6 (C(CH3)3), 21.4 (CH3tosyl), 13.8 (OCH2CH3); HRMS (ESI-TOF) (m/z)

Artículo 1

109

calcd. forC22H27N5O6SCl (M + H)+ 524.1371, found 524.1370. Anal. Calc.

for C22H26N5O6SCl: C, 50.43; H, 5.00; N, 13.37. Found: C, 50.41; H, 5.03;

N, 13.35.

Characterization of 2,6-dihalopurines 3c, 4c, 5c, 6c and 7c.

2-(2-(2,6-Dichloro-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazine (3c)

White solid (91 mg, 0.221 mmol), yield 68%, mp: 195-196°C; 1H NMR (400

MHz, CDCl3): d (ppm) 7.96 (s, 1H, Hpurine), 7.77 (dd, J1 = 8.3 Hz, J2 = 1.6

Hz, 1H, Hpurine), 7.40 (d, J = 8.2 Hz, 2H, 2×Htosyl), 7.16 – 7.02 (m, 3H, 2×Htosyl,

Hbenz), 7.01 – 6.88 (m, 1H, Hbenz), 6.76 (dd, J1 = 8.2 Hz, J2 = 1.6 Hz, 1H,

Hbenz), 4.46 - 4.41 (m, 2H, CH2N), 4.19 (dd, J1 = 14.2 Hz, J2 = 2.3 Hz, 1H,

Hoxazine), 3.42 – 3.29 (m, 1H, Hoxazine), 3.28 – 3.13 (m, 1H, Hoxazine), 2.39 (s,

3H, CH3tosyl), 2.30 – 2.14 (m, 1H, CH2CH2N), 2.09 – 1.97 (m, 1H, CH2CH2N

); 13C NMR (101 MHz, CDCl3):d (ppm) 153.2 (2×Cpurine), 151.9 (CPurine)

146.1 (CPurine), 146.0 (Cbenz), 144.8 (Ctosyl), 135.5 (Ctosyl), 130.9 (Cpurine),

129.9 (2×CHtosyl), 127.1 (2×CHtosyl), 126.4 (CHbenz), 124.3 (CHbenz), 123.7

(Cbenz),, 121.6, (CHbenz), 117.4 (CHbenz), 68.7 (CHoxazine), 48.3 (CH2oxazine),

40.6 (CH2N), 31.9 (CH2CH2N), 21.8 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z)

calcd. for C22H20N5O3SCl2 (M + H)+ 504,0586, found 504,0636; Anal. Calc.

for C22H19N5O3SCl2: C, 52.39; H, 3.80; N, 13.89. Found: C, 52.37; H, 3.82;

N, 13.91.

3-((2,6-Dichloro-9H-purine-9-yl)methyl)-1-tosyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoline (4c)


MHz, CDCl3): d (ppm) 8.07 (s, 1H, Hpurine), 7.69 (dd, J1 = 8.3 Hz, J2 =1.1 Hz,

1H, Hbenz), 7.38 (d, J = 8.0 Hz, 2H, 2×Htosyl), 7.21 – 7.12 (m, 3H, Hbenz,

2×Htosyl), 7.08 – 7.03 (m, 1H, Hbenz), 6.97 (dd, J1 = 7.6 Hz, J2 = 1.6 Hz, 1H,

Hbenz), 4.20 (dd, J1 = 14.1 Hz, J2 = 7.3 Hz, 1H, CH2N), 4.12 (dd, J1 = 14.2

Hz, J2 = 6.7 Hz, 1H, CH2N), 3.98 (dd, J1 = 13.5 Hz, J2 = 3.8 Hz, 1H, Hpyr),


110

3.42 (dd, J1 = 13.5 Hz, J2 = 8.7 Hz, 1H, Hpyr), 2.59 (dd, J1 = 15.9 Hz, J2 =

5.2 Hz, 1H, Hpyr), 2.39 – 2.37 (m, 1H, Hpyr), 2.35 (s, 3H, CH3tosyl), 2.31 (dd,

J1 = 15.9 Hz, J2 = 9.0 Hz, 1H, Hpyr); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm)

153.0 (Cpurine), 152.9 (Cpurine), 151.8 (Cpurine), 146.0 (Cpurine), 144.0 (Ctosyl),

136.1 (Cbenz), 135.9 (Ctosyl), 130.6 (Cpurine), 129.6 (2xCHtosyl), 129.3 (CHbenz),

127.0 (Cbenz), 126.9 (CHbenz), 126.7 (2xCHtosyl), 125.1 (CHbenz), 123.6

(CHbenz), 48.2 (CH2pyr), 46.7 (CH2N), 32.3 (CHpyr), 30.4 (CH2pyr), 21.4

(CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for C22H20N5O2SCl2 (M + H)+

488.0637, found 488.0640. Anal. Calc. for C22H19Cl2N5O2S: C, 54.11; H,

3.92; N, 14.34. Found: C, 54.13; H, 3.90; N, 14.32.

3-(2-(2,6-Dichloro-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazine (5c)


MHz, CDCl3): d (ppm) 8.30 (s, 1H, Hpurine), 8.02 (dd, J1 = 4.6 Hz, J2 = 1.5

Hz, 1H, Hbenz), 7.85 – 7.80 (m, 2H, 2×Htosyl), 7.28 - 7.25 (m, 2H, 2×Htosyl),

7.15 (dd, J1 = 8.1 Hz, J2 = 1.5 Hz, 1H, Hbenz), 6.96 (dd, J1 = 8.0 Hz, J2 = 4.6

Hz, 1H, Hbenz), 4.81 – 4.73 (m, 1H, Hoxazine), 4.56 – 4.49 (m, 1H, CH2N), 4.47

– 4.40 (m, 1H, CH2N), 4.18 (dd, J1 = 11.4 Hz, J2 = 1.4 Hz, 1H, Hoxazine), 3.75

(dd, J1 = 11.4 Hz, J2 = 2.4 Hz, 1H, Hoxazine), 2.49 – 2.39 (m, 1H, CH2CH2N),

2.38 (s, 3H, CH3tosyl), 2.16 – 2.09 (m, 1H, CH2CH2N); 13C NMR (126 MHz,

CDCl3): d (ppm) 153.1 (Cpurine), 152.6 (Cpurine), 151.7 (Cpurine), 146.7

(CHpurine), 144.5 (Ctosyl), 140.9 (CHbenz), 140.3 (Cbenz), 137.0 (Cbenz), 136.0

(Ctosyl), 131.9 (Cpurine), 129.4, (2×CHtosyl), 128.2 (2×CHtosyl), 124.8 (CHbenz),

120.5 (CHbenz), 66.9 (CH2pyr), 51.1 (Cpyr), 41.7 (CH2N), 30.6 (CH2CH2N),

21.5 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for C21H19N6O3SCl2 (M + H)+

505.0859, found 505.0823; Anal. calc. for C21H18Cl2N6O3S: C, 49.91; H,

3.59; N, 16.63. Found: C, 49.93; H, 3.61; N, 16.62.

Artículo 1

111

Methyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(2,6-dichloro-9H-purine-9-yl)propanoate (6c)


MHz, CDCl3): d (ppm) 8.21 (s, 1H, Hpurine), 7.59 (d, J = 8.1 Hz, 2H, 2×Htosyl),

7.16 (d, J = 8.1 Hz, 2H, 2×Htosyl), 5.47 (dd, J1 = 9.4 Hz, J2 = 4.7 Hz, 1H,

Hprop), 4.98 – 4.81 (m, 2H, Hprop), 3.78 (s, 3H, OCH3), 2.37 (s, 3H, CH3tosyl),

1.31 (s, 9H, 3×CH3); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm) 168.2 (COOMe),

153.9 (Cpurine), 153.3 (Cpurine), 151.8 (Cpurine), 150.1 (COOBut), 146.7

(CHpurine), 145.3 (Ctosyl), 135.9 (Ctosyl), 130.9 (Cpurine), 129.4 (2×CHtosyl),

128.4 (2×CHtosyl), 86.7 (C(CH3)3), 58.7 (CHprop), 53.4 (OCH3), 43.9

(CH2prop), 28.1 (C(CH3)3), 21.9 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for

C21H24N5O6SCl2 (M + H)+ 544.0824, found 544.0855; Anal. calc. for

C21H23N5O6SCl2: C, 46.33; H, 4.26; N, 12.86. Found: C, 46.31; H, 4.27; N,

12.83.

Ethyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(2,6-dichloro-9H-purine-9-yl)propanoate (7c)


MHz, CDCl3): d (ppm) 8.19 (s, 1H, Hpurine), 7.68 (d, J = 8.2 Hz, 2H, 2×Htosyl),

7.22 (d, J = 8.2 Hz, 2H, 2×Htosyl), 5.47 (dd, J1 = 9.2 Hz, J2 = 4.8 Hz, 1H,

Hprop), 5.04 – 4.84 (m, 2H, Hprop), 4.28 (q, J = 6.8 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.42

(s, 3H, CH3tosyl), 1.37 (s, 9H, 3×CH3), 1.27 (t, J = 6.8 Hz, 3H, OCH2CH3 );13C

NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm) 167.2 (COOEt), 153.5 (Cpurine), 153.0

(Cpurine), 151.6 (Cpurine), 149.8 (COOBut), 146.1 (CHpurine), 144.8 (Ctosyl),

135.7 (Ctosyl), 130.6 (Cpurine), 129.0 (2×CHtosyl), 128.1 (2×CHtosyl), 86.2,

(C(CH3)3), 62.4 (OCH2CH3), 58.3 (CHprop), 43.5 (CH2prop), 27.7 (C(CH3)3),

21.5 (CH3tosyl); 13.9 (OCH2CH3); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for

C22H26N5O6SCl2 (M + H)+ 558.0981, found 558.0972; Anal. calc. for

C22H25N5O6SCl2: C, 47.32; H, 4.51; N, 12.54. Found: C, 47.35; H, 4.50; N,

12.52.


112

Biology

Tissue culture

Cell lines were maintained in a tissue culture incubator with 5% CO2 at 37ºC

and grown in culture media complemented with 10% fetal bovine serum

(FBS) and L-glutamine (2 mM). Human breast adenocarcinoma MCF-7 cells

(purchased from ATCC), human melanoma A375 (a kind gift from Dr Liz

Patton) and RFP TERT immortalized fibroblasts [13] were cultured in

Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM). Human colorectal carcinoma

HCT-116 cells (a kind gift from Prof Mark Arends) were cultured in McCoy's

5A Medium.

Dose−Response Viability Assay

All final products were preserved at -20ºC dissolved in DMSO. In order to

obtain the desired concentrations in each experiment, the stock solutions

(100 mM) were successively diluted in culture media. 96-Well plates were

used to seed the cells at 1,000 cells/well for A375; 1,500 cells/well for MCF-

7 and HCT-116 and 2000 cells/well for RFP TERT immortalized fibroblasts.

After 48 h of incubation, cells were treated with compounds 3a-d, 4a-d, 5b-

c, 6a-d and 7a-d (0.01 µM – 100 µM) and incubated for 5 d. Each

experiment was performed in triplicate. Cells treated with DMSO (0.1 % v/v)

were used as control. After 5d treatment, cell viability was determined using

PrestoBlueTM reagent (10 % v/v) and results analyzed as previously

described [14]. EC50 (half-maximal effective concentration) values are

expressed as mean ± SD of 3 independent experiments.

Apoptosis Assay

Nunc black optical bottom plates acquired from Thermo Scientific were used

to seed MCF-7 cells at 1500 cells/well. After 48h of incubation, NucView

488 substrate (Biotium) at 1 μM concentration in culture media was added

Artículo 1

113

to each well and cells treated either with DMSO or compounds 3c, 4c, 4d

and 5c at 3, 10 and 30 μM. Plates were imaged in an IncuCyteTM ZOOM

system for 5d and cell confluence and apoptotic counts determined with the

IncuCyte software as previously described [15].

Results and discussion

Chemistry

The synthetic routes of all compounds included in four series are outlined in

Figures 2 – 5. Derivatives 3a-c enclosed in the first series have been

synthesized from 2-aminofenol and ethyl 4-bromobut-2-enoate to give the

ethyl 2-(3,4-dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazine-2-yl)acetate [16], that was

reduced with LiAlH4 to give alcohol 8. This alcohol was tosylated to give

derivative 9, which was treated with different purines under Mitsunobu

conditions to produce the final molecules 3a-c. Finally, the 6-Br group of 3a

was substituted by 6-CF3 to obtain 3d [17] (Figure 2).

Figure 2. Synthesis of compounds included in series A. Reagents and conditions:

(i) ethyl 4-bromobut-2-enoate, NaHCO3, EtOH, 3 h, rt, then K2CO3, 30 min; (ii) LiAlH4, Et2O, 1 h, 0ºC to rt; (iii) TsCl, py, 12 h, 0ºC to rt; (iv) 6-halopurine or 2,6-dihalopurine,

DIAD, Ph3P, 36 h, -20ºC to rt; (v) MFSDA, CuI, HMAP, DMF, 12 h, 70ºC.

NH2

OH O

NTs

O

HN

8 9

3a-c (X = Br, Cl; Y = H, Cl) 3d (X = CF3; Y = H)

(i)

(ii)

(iii)

(iv) (v)

OH OH

O

NTs

N N

NN

X

Y

O

NTs

N N

NN

X

Y


114

Figure 3 shows the synthetic route followed for compounds 4a-d included

in series B. These compounds have been synthesized from quinoline-3-

carbonitrile, which is transformed into quinoline-3-carboxilic acid by

treatment with aq. NaOH and acidified with HCl 1N [18]. The carboxylic acid

is esterified to ethyl quinoline-3-carboxilate [19] and then partially reduced

to the ethyl 1,2,3,4-tetrahydroquinoline-3-carboxilate using sodium

cyanoborohydride [18]. Reduction of the ester function to the corresponding

alcohol 10 [16] and subsequent tosylation with p-toluensulfonyl chloride

gave (1,2,3,4-tetrahydro-1-tosylquinoline-3-yl)methanol 11. Final

compounds 4a-c were obtained by Mitsunobu reaction with DIAD and the

corresponding purines (6-bromo-, 6-chloro-, and 2,6-dichloro-purines).

Finally, derivative 4d was synthesized from bromopurine 4a, as in the

previous series, using MFSDA, CuI and HMPA [17].

Figure 3. Synthesis of compounds included in series B. Reagents and conditions: (i) aq. NaOH, EtOH, 20h, reflux, then HCl 1N; (ii) SOCl2, EtOH, 4h, reflux; (iii)

NaBH3CN, THF, MeOH, HCl, Et2O, 6h, rt; (iv) LiAlH4, THF, 1h, 0ºC; (v) TsCl, py, 12h, 0ºC to rt; (vi) 6-halopurine or 2,6-dihalopurine, DIAD, Ph3P, 36h, -20ºC to rt; (vii)

MFSDA, CuI, HMAP, DMF, 12h, 70ºC.

The synthesis of series C is shown in Figure 4. Firstly, 2-aminopyridine-3-ol

was acetylated and then, cyclized with ethyl 4-bromobut-2-enoate to give

12, which was reduced to the alcohol 13 and then silylated to 14. This

4a-c (X = Br, Cl; Y = H, Cl) 4d (X = CF3; Y = H)

(i), (ii)N

CN

HN

(iii), (iv)

(v) N

OH

Ts

(vi) (vii)

10 11

NTs

NN

N N

X

Y

NTs

NN

N N

X

Y

OH

Artículo 1

115

compound was tosylated with p-toluenesulfonyl chloride to 15 and the silyl

group was removed to give the alcohol 16. The last step includes the

Mitsunobu reaction with 6-chloro- and 2,6-dichloro-purines to lead to 5b-c.

Figure 4. Synthesis of compounds included in series C. Reagents and conditions: (i) Ac2O/py, 5min, reflux, then NaOH; (ii) ethyl 4-bromobut-2-enoate, K2CO3, EtOH,

24h; (iii) LiAlH4, THF, 1h, 0ºC to rt; (iv) TBDMSCl, Et3N, DMAP, DCM, 12h, rt; (v) TsCl, Et3N, DMAP, DCM, 12h, rt; (vi) AcOH, H2O, THF, 12h, rt; (vii) 6-chloropurine or 2,6-

dichloropurine, DIAD, Ph3P, -20ºC to rt, 36h.

Finally, compounds 6a-d and 7a-d were synthesized as shown in Figure 5

from D/L-serine, which is tosylated [20], then esterified with methanol or

ethanol [21] and silylated to compounds 17a-b [22]. Subsequent protection

of the amine with Boc anhydride [23], followed by removal of the silyl group

[24] leads to the alcohols 18a-b, which are transformed into the last

derivatives 6a-c and 7a-c by the Mitsunobu reaction with the appropriate

purines. Finally, 6a and 7a were converted into 6d and 7d as previously

described.

(iv)

14, R = Si(CH3)2C(CH3)3

5b-c (X = Cl; Y = H, Cl)

N

OH

NH2

(i)

(ii) N N

O

O

COOEt(iii)

N NH

O

OR

12 13, R = H

N N

O

OR

(v)

Ts

(vii)

(vi)

15, R = Si(CH3)2C(CH3)316, R = H

N N

O

NTs

N

NN

X

Y


116

Figure 5. Synthesis of compounds included in series D. Reagents and conditions:

(i) TsCl, 2N NaOH, 12h, rt; (ii) SOCl2, ROH, 1h, 0ºC, then 12h rt; (iii) TBDMSCl, Et3N, DMAP, DCM, 2h, rt; (iv) (Boc)2O, DMAP, Et3N, DCM, 2h; (v) AcOH, H2O, THF, 12h, rt;

(vi) 6-halo- or 2,6-dihalo-purines, DIAD, Ph3P, 36h, -20ºC to rt; (vii) MFSDA, CuI, HMAP, DMF, 12h, 70ºC.

Biological evaluation

Breast adenocarcinoma MCF-7 [25], colorectal carcinoma HCT-116 [26]

and melanoma A375 [27] are human cell lines that have been widely used

as experimental cell models in drug discovery. These 3 types of cancers are

nowadays in the top-20 of the most deadly ones, therefore the identification

of new treatments is required.

We first analysed the antiproliferative properties of the 18 synthesized

compounds against MCF-7 cell line. Those structures that exhibited an EC50

value lower than 50 μM were further investigated in A375 and HCT-116

cells. The results of this assessment are shown in Table 1. 5-Fluorouracil

(5-FU) has been used as a control for the breast and colon carcinoma cell

lines. Today this drug and its derivatives such as capecitabine, are widely

used in different solid tumours despite its high toxicity and side effects [28,

29].

TsN

N N

NN

X

Y

O

O

OOR

TsN

OHO

O

OOR

TsHN

O

OOR

SiH2N

OH

OHO

17a-b

(i), (ii)

(iii)

(iv)

(v)

R = Me, Et R = Me, Et

TsN

N N

NN

XO

O

OOR

YX = Br, Cl; Y = H, Cl

6a-c (R = Me)7a-c (R = Et)

X = CF3; Y = H6d (R = Me)7d (R = Et)

(vi)

18a-b

(v)

Artículo 1

117

In general, 6-halo, 2,6-dihalo and 6-trifluoromethyl groups on the 9-alkylated

purine show a notable inhibition on cell proliferation, with the dichloro

analogue being the most interesting in each of the series and tumour cell

lines. This data are in agreement with the results previously published by

our research group where the highest antiproliferative activity were obtained

with electron-withdrawing groups in the purine ring [7], specifically

derivatives bearing two chloro atoms at 2 and 6 positions. Accordingly, the

most active compounds in MCF-7 cell line are the 9-alkylated 2,6-

disubstituted purines with two chlorine atoms, with 4c being the most potent

inhibitor (EC50 = 4.26 ± 0.15 μM), only slightly less active than the positive

control 5-FU. Compounds 4c-d (within series B), which feature a

tetrahydroquinoline heterocycle, exhibited higher activity than their isosteric

benzoxazines 3c-d (series A). The open structures included in series D (6a-d and 7a-d) mediated no or low inhibition of cell proliferation. Only the most

lipophilic derivative, 7c (R = Et; X = Cl, Y = Cl), showed some level of

activity. This might be due to a reduced capacity of the open structures to

penetrate the cell membrane.

Regarding the A375 cell line, derivatives with a tetrahydroquinoline (4c) and

pyridoxazine (5c) heterocycle show similar inhibition values (EC50 = 5.54 ±

0.64 and 5.66 ± 0.65 μM, respectively). In this cell line there is not much

difference of activity between the 6-chloro (3b) and 2,6-dichloro (3c)

derivatives from series A.

The best inhibition values were obtained in the carcinoma colon line HCT-

116 where the 2,6-dicloro derivatives 3c (7.06 ± 0.80 µM), 4c (2.80 ± 0.31

µM) and 5c (3.13 ± 0.35 µM) mediated high activity. 4c, the most potent

derivative of the series, showed an activity comparable to the reference

compound 5-FU. Interestingly, in this tumour cell line the open derivative

with a methyl carboxylate moiety (6c) shows a better inhibition than the one

with an ethyl carboxylate group, unlike the other two cell lines.


118

Generally, in all derivatives it is observed that the oxygen atom of the

benzoxazine ring (derivatives 3) is not essential for the antitumour activity

since when it was eliminated (derivatives 4) compounds show better

inhibition values. Furthermore, if we compare derivatives 3 and 5, the

substitution of the benzene ring by its isosteric pyridine, as well as the

change of the side chain position in the condensate system, have led to an

improvement in the activity. Finally, the presence of a heterocyclic system

is very important for the antitumour inhibition since compounds are less

active when it is not present (open derivatives 6 and 7).

Table 1. In vitro anticancer activity of final compounds against MCF-7, A375

and HCT-116 tumour cells. Comp X Y R Cancer cell lines

MCF-7 EC50

(μM)a

A375 EC50 (μM)a HCT-116 EC50

(μM)a

3a Br H - 27.45 ± 0.18 26.11 ± 3.01 17.30 ± 2.67

3b Cl H - 37.63 ± 4.85 13.32 ± 0.43 17.54 ± 0.86

3c Cl Cl - 13.00 ± 0.11 10.85 ± 1.40 7.06 ± 0.80

3d CF3 H - 33.61 ± 3.62 34.59 ± 2.80 56.06 ± 2.66

4a Br H - > 100 - -

4b Cl H - > 100 - -

4c Cl Cl - 4.26 ± 0.15 5.54 ± 0.64 2.80 ± 0.31

4d CF3 H - 21.95 ± 1.7 61.57 ± 0.67 60.14 ± 5.35

5b Cl H - > 100 - -

5c Cl Cl - 11.56 ± 0.28 5.66 ± 0.65 3.13 ± 0.35

6a Br H Me > 100 - -

6b Cl H Me > 100 - -

6c Cl Cl Me 45.96 ± 5.69 20.48 ± 2.40 22.20 ± 1.57

6d CF3 H Me > 100 - -

7a Br H Et > 100 - -

7b Cl H Et > 100 - -

7c Cl Cl Et 26.15 ± 3.22 17.62 ± 1.90 38.32 ± 2.01

7d CF3 H Et > 100 - -

5-FU 1.5 ± 0.31 - 2.40 ± 0.62 aCell viability was measured after 5 days treatment using the PrestoBlueTM reagent. Experiments

were conducted in triplicate. Data are the mean ± SD of 3 independent determinations.

Artículo 1

119

To analyze if the observed growth inhibition was due to an apoptotic effect,

NucView™ 488 caspase-3 substrate was used to assess the rate of

caspase-3/7 mediated apoptosis in MCF-7 cells once treated with

derivatives 3c, 4c, 4d and 5c. This fluorescent probe contains a peptide

sequence (DEVD) that after cleaved by caspase-3/7 activity releases a

DNA-binding dye which stains the cell nucleus bright green.

As shown in Figure 6, image-based measurement of caspase 3/7 activity

demonstrated significant levels of apoptotic cell death in a time-dependent

manner in comparison with the control DMSO.

Figure 6. (A) Percentage of apoptotic cells after treatment with compounds 3c, 4c, 4d and 5c (30 µM) for 12h (blue), 24 h (light green) and 48h (dark green). (B) Representative images of MCF-7 cells stained using caspase 3/7-detecting reagent after 24 h treatment with compound 4c (30 µM).

The most interesting compound was the tetrahydroquinoline 4c that

induces 58% apoptosis after 24 h treatment at 30 µM. This structure also

displayed strong apoptotic activity at lower concentrations (see Figure

S.2. of the Supplementary Information). On the contrary, compound 5c (which showed moderate activity in MCF-7 with an EC50 value of 11.56 ±

0.28 μM) did not produce an important increase in apoptotic cells (18% at

48 h). This fact could indicate a different mechanism of action (e.g. cell cycle

inhibitor, cytotoxic, etc.) for this pyridoxazine derivative. In addition, the

change of the 2,6-dichloropurine moiety (4c) to 6-trifluoromethylpurine (4d)

has produced a significant decrease of apoptosis (from 58 to 25% after 24h)


120

as we observed with the antiproliferative activity. The benzoxazine 3c has

shown moderate apoptosis after 48h of treatment (45%).

Furthermore, as a preliminary assessment of the safety profile of compound

4c, a cell proliferation study was performed in non-tumour cells (RFP TERT

immortalized fibroblasts). As shown in Figure 7, treatment of non-cancerous

fibroblasts with compound 4c resulted in a significantly lower

antiproliferative activity, with a reduction of activity of up to 19-fold respect

to the HCT-116 tumour cell line, indicating promising preferential activity

towards cancerous cells.

Figure 7. Semilog dose-response curves and EC50 values for compound 4c against

RFP TERT immortalized fibroblasts, A375, MCF-7 and HCT-116 cells. Error bars: ±

SD from n = 3.

Conclusion

In an attempt to find new antitumour agents, eighteen purine molecules

linked to different heterocycles (benzoxazine, quinoline and pyridoxazine)

and open analogues (methyl and ethyl propanoate derivatives) were

synthesized. We evaluated their antiproliferative activity against three

cancerous cell lines (MCF-7, A375 and HCT-116) and the induction of

Artículo 1

121

apoptosis in MCF-7. In this study we have shown the importance of the

substitution in the purine rings since compounds with a 2,6-dichloropurine

moiety are consistently more active than other members of the series. In

addition, compounds with the complete heterocyclic systems have been

more active than open analogues, highlighting the compound with the

quinoline ring. In addition, an increase in the distance between the purine

and the heterocycle leads to a decrease of antiproliferative activity. 4c is the

most active compound in the cancer cell lines tested and an apoptotic

inducer through activation of caspases 3/7, with a low cytotoxicity in non-

cancerous cells. In conclusion, this derivative can be considered as a

promising antiproliferative lead compound for future optimization

campaigns.

Future prespective

One of the main hallmarks of cancer is the ability of malignant cells to evade

programed cell death. Therefore, the development of chemical structures

able to effectively induce apoptosis represents an interesting approach in

the finding of new anticancer treatments. In the search for improved

therapies, chemical moieties such as purines and related heterocycles are

privileged structures in medicinal chemistry. This work reports an interesting

derivative 4c (3-((2,6-dichloro-9H-purine-9-yl)methyl)-1-tosyl-1,2,3,4-

tetrahydroquinoline) that was easily prepared and had a promising activity

against three cancer cells lines. Moreover, this compound induces

apoptosis through activation of caspases, and shows a good safety profile.

This quinoline could be an interesting starting point for further structural

optimization to obtain new promising antitumour agents.


122

Executive summary

Purine derivatives linked to heterocycles as a promising scaffold

• 18 Novel purine compounds incorporating different heterocycles and their

open analogues were designed, synthesized and evaluated for their

antiproliferative activity.

• In the 4 series of derivatives the most interesting molecules have a moiety

of 2,6-dichloropurine.

Antiproliferative and apoptosis activity

• Compound 4c with a quinoline ring shows the lowest EC50 values against

MCF-7 (4.26 μM), A375 (5.54 μM) and HCT-116 (2.80 μM).

• 4c induced apoptosis by activation of caspases 3/7 in a time-dependent

manner. It shows a pronounced selectivity against cancer cells.

• 4c is therefore a leading structure for future anticancer drug development

due to its straightforward synthesis and relevant bioactivity.

Supplementary data

See online the supplementary data with the synthesis and characterization

of intermediate compounds, 6-bromo and 6-trifluoromethylpurines

derivatives and a two-day time-lapse motion picture of MCF-7 cell

proliferation under treatment with 30 μM of 4c with Nucview 488 (apoptosis

fluorescent marker).

Financial & competing interest disclosure

This paper was supported financially by the Junta de Andalucía (project no.

CS2016.1).

Artículo 1

123

The authors have no other relevant affiliations or financial involvement with

any organization or entity with financial interest in or financial conflict with

the subject matter or materials discussed in the manuscript apart from those

disclosed.

No writing assistance was utilized in the production of this manuscript.

References Papers of special note have been highlighted as: • of interest; •• of

considerable interest

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124

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Artículo 1

127

Supplementary Information

PURINE DERIVATIVES WITH HETEROCYCLIC

MOIETIES AND RELATED ANALOGUES AS NEW

ANTITUMOUR AGENTS

Nerea Fernández-Sáez1, Belén Rubio-Ruiz2, Joaquín M. Campos1,3, Asier Unciti-

Broceta2, M. Dora Carrión1,3,‡,*, M. Encarnación Camacho1,3,‡,*

1Departamento de Química Farmacéutica y Orgánica, Facultad de Farmacia,

Universidad de Granada 18071, Spain.

2Cancer Research UK Edinburgh Centre, MRC Institute of Genetics and Molecular

Medicine, University of Edinburgh, Crewe Road South, Edinburgh EH4 2XR, UK.

3Instituto de Investigación Biosanitaria ibs.GRANADA. Complejo Hospitalario

Universitario de Granada/Universidad de Granada, Granada, Spain.

¶ These authors contribute equally

* Corresponding authors

E-mail:[email protected]; [email protected]


128

Preparation of intermediate derivatives

2-(3,4-Dihydro-2H-1,4-benzo[b][1,4]oxazine-2-yl)ethanol (8)

To a solution of LiAlH4 1M (1.79 mL, 1.79 mmol) in anhydrous diethyl ether

(7.5 mL) at 0ºC, ethyl 2-(3,4-dihydro-2H-1,4-benzo[b][1,4]oxazine-2-

yl)acetate (396 mg, 1.79 mmol) in anhydrous diethyl ether (7.5 mL) was

added dropwise and stirred for 1h. After this time, fresh water (15 mL) was

added and the resulting mixture was extracted with DCM. The combined

organic layers were washed with brine and dried over Na2SO4, filtered, and

evaporated. The resulting residue was purified by flash chromatography

(EtOAc/hexane, 1:1) to afford 8. White solid (240 mg, 1.34 mmol), yield

89%, mp: 55 - 56°C;1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 6.80 – 6.74 (m,

2H, Hbenz), 6.66 (dd, J1 = 7.7 Hz, J2 = 1.5 Hz, 1H, Hbenz), 6.60 (dd, J1 = 7.7

Hz, J2 = 1.5 Hz, 1H, Hbenz), 4.33 – 4.27 (m, 1H, Hoxazine), 3.91 – 3.83 (m, 2H,

CH2OH), 3.36 (dd, J1 = 11.6 Hz, J2 = 2.4 Hz, 1H, Hoxazine), 3.17 (dd, J1 =

11.6 Hz, J2 = 7.7 Hz, 1H, Hoxazine), 2.99 (s, 1H, NH), 2.02 – 1.89 (m, 1H),

1.90 – 1.77 (m, 1H, CH2CH2OH); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm) 143.3

(Cbenz), 132.9 (Cbenz), 121.2 (CHbenz), 118.7 (CHbenz), 116.6 (CHbenz), 115.3

(CHbenz), 72.2 (CHoxazine), 59.4 (CH2OH), 45.3 (CH2oxazine), 35.2

(CH2CH2OH); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for C10H14NO2 (M + H)+

180.0946, found 180.0878.

(3,4-Dihydro-4-tosyl-2H-1,4-benzo[b][1,4]oxazine-2-yl)ethanol (9)

A solution of (3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazine-2-yl)ethanol 8 (292 mg, 1.63

mmol) and pyridine (396 µL, 4.89 mmol) in DCM (17 mL) was prepared

under argon atmosphere and cooled to 0°C, then p-toluenesulfonyl chloride

(1.34 mg, 1.63 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at rt.

after 12h, cold water was added, the reaction was extracted with DCM, and

the organic layer was washed with aq. 1N HCl and brine, dried over Na2SO4,

filtered, and evaporated. The residue was purified by flash chromatography

Artículo 1

129

(EtOAc/hexane, 1:3). White solid (429 mg, 1.288 mmol), yield 79%, mp: 130

- 131°C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.83 (dd, J1 = 8.3 Hz, J2 = 1.6

Hz, 1H, Hbenz), 7.56 – 7.51 (m, 2H, Htosyl), 7.26 – 7.20 (m, 2H, Htosyl), 7.04

(ddd, J1 = 8.2 Hz, J2 = 7.3 Hz, J3 = 1.6 Hz, 1H, Hbenz), 6.92 (ddd, J1 = 8.3

Hz, J2 = 7.3 Hz, J3 = 1.5 Hz, 1H, Hbenz), 6.79 (dd, J1 = 8.2 Hz, J2 = 1.6 Hz,

1H, Hbenz), 4.32 (dd, J1 = 14.3 Hz, J2 = 2.4 Hz, 1H, Hoxazine), 3.80 – 3.73 (m,

2H, CH2OH), 3.63 – 3.54 (m, 1H, Hoxazine), 3.19 (dd, J1 = 14.3, J2 = 9.9 Hz,

1H, Hoxazine), 2.38 (s, 3H, CH3tosyl), 1.83 – 1.72 (m, 2H, CH2CH2OH); 13C

NMR (101 MHz, CDCl3): d (ppm) 146.4 (Cbenz), 144.1 (Ctosyl), 135.4 (Ctosyl),

129.7 (2xCHtosyl), 127.1 (2xCHtosyl), 125.8 (CHbenz), 124.0 (CHbenz), 123.5

(Cbenz), 120.8 (CHbenz), 117.2 (CHbenz), 70.0 (CHoxazine), 58.7 (CH2OH), 48.5

(CH2oxazine), 34.9 (CH2CH2OH), 21.4 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z)

calcd. for C17H19NO4NaS (M + Na)+ 356.0932, found 356.0919.

(1,2,3,4-Tetrahydro-1-tosylquinoline-3-yl)methanol (11)

Following the same procedure used for the synthesis of 9, and starting from

(1,2,3,4-tetrahydroquinoline-3-yl)methanol 10 (266 mg, 1.63 mmol), a

residue was obtained and was purified by flash chromatography

(EtOAc/hexane, 1:2). Yellow solid (414 mg, 1.30 mmol), yield 80%, mp: 172

- 173°C;1H NMR (500 MHz, CDCl3): d (ppm) 7.68 (d, J = 8.3 Hz, 1H, Hbenz),

7.51 (d, J = 8.0 Hz, 2H, Htosyl), 7.21 (d, J = 8.0 Hz, 2H, Htosyl), 7.18 – 7.13

(m, 1H, Hbenz), 7.08 – 7.01 (m, 2H, Hbenz), 4.12 (dd, J1 = 13.4 Hz, J2 = 4.2

Hz, 1H, Hpyr), 3.57 – 3.47 (m, 2H, CH2OH), 3.42 (dd, J1 = 13.3 Hz, J2 = 9.4

Hz, 1H, Hpyr), 2.59 (dd, J1 = 16.5 Hz, J2 = 6.0 Hz, 1H, Hpyr), 2.38 (s, 3H,

CH3tosyl), 2.24 (dd, J1 = 16.5 Hz, J2 = 9.1 Hz, 1H, Hpyr),1.98 – 1.90 (m, 1H,

Hpyr); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm) 143.8 (Ctosyl), 137.0 (Cbenz), 136.9

(Ctosyl), 129.8 (2xCHtosyl), 129.5 (CHbenz), 129.3 (Cbenz), 127.1 (2xCHtosyl),

126.6 (CHbenz), 124.9 (Cbenz), 123.8 (CHbenz), 64.3 (CH2OH), 48.5 (CH2pyr),

35.2 (CHpyr), 29.5 (CH2pyr), 21.6 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for

C17H20NO3S (M + H)+ 318.1086, found 318.1103.


130

Ethyl (4-acetyl-3,4-dihydro-2H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazine-3-yl)acetate (12)

To a K2CO3 solution (1.089 g, 7.88 mmol) in EtOH (20 mL), N-(3-

hydroxypyridine-2-yl)acetamide (300 mg, 1.97 mmol) and ethyl 4-bromobut-

2-enoate (0.54 mL, 2.96 mmol) were added. The reaction mixture was

stirred at rt for 24h. After this time, the solvent was removed and the residue

was purified by flash chromatography (EtOAc/hexane, 2:1) to provide 12.

Yellow solid (264 mg, 0.99 mmol), yield 51%, mp: 59 - 60°C; 1H NMR (500

MHz, CDCl3): d (ppm) 7.96 (dt, J1 = 4.7 Hz, J2 = 1.3 Hz, 1H, Hpyr), 7.20 (dt,

J1 = 8.1 Hz, J2 = 1.3 Hz, 1H, Hpyr), 7.00 (ddd, J1 = 8.0 Hz, J2 = 4.6 Hz, J3 =

0.9 Hz, 1H, Hpyr), 5.44 – 5.38 (m, 1H, Hoxazine), 4.47 (dd, J1 = 11.4 Hz, J2 =

1.2 Hz, 1H, Hoxazine), 4.16 – 4.09 (m, 2H, CH2CH3), 4.07 (dd, J1 = 11.4 Hz,

J2 = 2.9 Hz, 1H, Hoxazine), 2.59 (s, 3H, COCH3), 2.51 – 2.45 (m, 2H,

CH2COO), 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH2CH3); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d

(ppm) 170.2 (COO), 169.7 (COCH3), 140.7 (Cpyr), 139.5 (CHpyr), 138.5

(Cpyr), 124.3 (CHpyr), 120.6 (CHpyr), 67.2 (CH2oxazine), 60.7 (CH2CH3), 44.6

(CHoxazine), 33.6 (CH2COO), 25.7 (COCH3), 13.9 (CH2CH3); HRMS (ESI-

TOF) (m/z) calcd. for C13H17N2O4 (M + H)+ 265.1188, found 265.1182.

2-(3,4-Dihydro-2H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazine-3-yl)ethanol (13)

To a solution of 12 (950 mg, 3.59 mmol) in anhydrous THF (36 mL) at 0ºC,

LiAlH4 1M (4.5 mL, 4.5 mmol) was added dropwise and stirred for 1h. After

this time, ethyl acetate (3 mL) and sodium potassium tartrate (3 mL) were

added. The resulting precipitate was filtered over celite. The filtrated solvent

was extracted with ethyl acetate. The organic layer was dried over Na2SO4,

filtered, and evaporated. The residue was purified by flash chromatography

(EtOAc/hexane, 5:1). Yellow solid (455 mg, 2.51 mmol), yield 70%, mp: 90

- 91°C; 1H NMR (500 MHz, CDCl3): d (ppm) 7.57 (dt, J1 = 5.1 Hz, J2 = 1.4

Hz, 1H, Hpyr), 6.93 (dt, J1 = 7.8 Hz, J2 = 1.3 Hz, 1H,Hpyr), 6.49 (ddd, J1 = 7.8

Hz, J2 = 5.0 Hz, J3 = 1.1 Hz, 1H, Hpyr), 6.14 (bs, 1H, OH), 5.12 (bs, 1H, NH),

4.15 (ddd, J1 = 10.3 Hz, J2 = 2.8 Hz, J3 = 1.3 Hz, 1H, Hoxazine), 3.99 – 3.95

Artículo 1

131

(m, 1H, CH2OH), 3.88 – 3.85 (m, 1H, CH2OH), 3.82 (ddd, J1 = 10.3 Hz, J2 =

7.6 Hz, J3 = 1.3 Hz, 1H, Hoxazine), 3.78 – 3.74 (m, 1H, Hoxazine), 1.78 – 1.61

(m, 2H, CH2CH2OH); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm) 147.0 (Cpyr),

139.1 (Cpyr), 139.0 (CHpyr), 121.7 (CHpyr), 113.2 (CHpyr), 68.7 (CH2oxazine),

60.1 (CH2OH), 49.2 (CHoxazine), 33.3 (CH2CH2OH); HRMS (ESI-TOF) (m/z)

calcd. for C9H13N2O2 (M + H)+ 181.0977, found 181.0965.

3-((((tert-Butyldimethyl)silyl)oxy)ethyl)-3,4-dihydro-2H-pyrido[3,2-

b][1,4]oxazine (14)

To a suspension of DMAP (14 mg, 0.11 mmol), Et3N (427µL, 2,22 mmol),

13 (200 mg, 1.11 mmol) in anhydrous DCM (5 mL), TBDMSCl (250 mg, 1,66

mmol) dissolved in anhydrous DCM (1 mL) was added under argon

atmosphere and stirred at rt. After 12h the reaction mixture was poured into

aq. AcOH (5%) and extracted with DCM. The organic layer was dried over

Na2SO4, filtered, and evaporated. The residue was purified by flash

chromatography (EtOAc/hexane, 1:5). Yellow oil (278 mg, 0.94 mmol), yield

86%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): d (ppm) 7.66 (d, J = 5.0 Hz, 1H, Hpyr), 6.94

(d, J = 7.7 Hz, 1H, Hpyr), 6.52 (dd, J1 = 7.7 Hz, J2 = 4.9 Hz, 1H, Hpyr), 5.32

(bs, 1H, NH), 4.21 (dd, J1 = 10.7 Hz, J2 = 2.9 Hz, 1H, Hoxazine), 3.87 (dd, J1

= 10.6 Hz, J2 = 7.0 Hz, 1H, Hoxazine), 3.84 – 3.77 (m, 2H, CH2O), 3.77 – 3.70

(m, 1H, Hoxazine), 1.76 – 1.65 (m, 2H, CH2CH2O), 0.91 (s, 9H, (CH3)3), 0.07

(s, 6H, (CH3)2Si); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): d (ppm) 147.5 (Cpyr), 140.5

(CHpyr), 139.6 (Cpyr), 122.1 (CHpyr), 114.2 (CHpyr), 69.3 (CH2oxazine), 60.7

(CH2O), 48.6 (CHoxazine), 35.3 (CH2CH2O), 26.4 ((CH3)3), 18.7 (C(CH3)3), -

4.9 (CH3Si), -5.0 (CH3Si); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for C15H27N2O2Si

(M + H)+ 295.1842, found 295.1863.

3-(2-((tert-Butyldimethylsilyl)oxy)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-pyrido[3,2-

b][1,4]oxazine (15)


132

To a suspension of DMAP (73.30 mg, 0.6 mmol), Et3N (812µL, 5.82 mmol)

and 14 (857 mg, 2.91 mmol) in dry DCM (10 mL) under argon atmosphere,

p-toluenesulfonyl chloride was added (1.165 g, 6.11 mmol) at 0°C and

stirred at rt. After 36h the reaction mixture was poured into fresh water. The

precipitate was filtered off and the solvent was purified by flash

chromatography (EtOAc/hexane, 1:10). Yellow sirup (391 mg, 0.87 mmol),

yield 30%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): d (ppm) 8.01 (d, J = 8.3 Hz, 2H,

Htosyl), 7.94 (dd, J1 = 4.7 Hz, J2 = 1.6 Hz, 1H, Hpyr), 7.28 (d, J = 5.9 Hz, 2H,

Htosyl), 7.12 (dd, J1 = 8.0 Hz, J2 = 1.6 Hz, 1H, Hpyr), 6.90 (dd, J1 = 8.0 Hz, J2

= 4.7 Hz, 1H, Hpyr), 5.01 - 4.96 (m, 1H, Hoxazine), 4.37 (dd, J1 = 11.1 Hz, J2 =

1.6 Hz, 1H, Hoxazine), 4.02 (dd, J1 = 11.1, J2 = 2.5 Hz, 1H, Hoxazine), 3.72 –

3.62 (m, 2H, CH2O), 2.40 (s, 3H, CH3tosyl), 1.73 (q, J = 6.4 Hz, 2H,

CH2CH2O) 0.90 (s, 9H, (CH3)3), 0.04 (s, 3H, (CH3)2Si), 0.05 (s, 3H,

(CH3)2Si); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): d (ppm) 143.4 (Ctosyl), 140.7 (Cpyr),

140.1 (CHpyr), 138.0 (Cpyr), 137.9 (Ctosyl), 128.9 (2xCHtosyl), 128.3 (2xCHtosyl),

123.9 (CHpyr), 119.6 (CHpyr), 67.4 (CH2oxazine), 59.4 (CH2O), 50.9 (CHoxazine),

33.3 (CH2CH2O), 25.7 ((CH3)3), 21.4 (CH3tosyl), 18.0 (C(CH3)3), -5.5 (CH3Si),

-5.7 (CH3Si); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for C22H33N2O4SiS (M + H)+

449.1930, found 449.1964.

2-(4-Tosyl-3,4-dihydro-2H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazine-3-yl)etanol (16)

The silyl derivative 15 (200 mg, 0.44 mmol) was added to a mixture of

THF/H2O (1:1) (6.6 mL) and glacial acetic acid (16 mL) was added. After

stirred for 22h the mixture was poured into sat. NaHCO3 (25 ml). The

aqueous fractions were extracted with EtOAc. The organic layers were

combined, dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The residue was

purified by flash chromatography (EtOAc/hexane, 1:2). Colourless oil (74

mg, 0.22 mmol), yield 50 %; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): d (ppm) 7.97 (dd,

J1 = 4.7 Hz, J2 = 1.6 Hz, 1H, Hpyr), 7.93 (d, J = 8.3 Hz, 2H, Htosyl), 7.26 (d, J

= 8.1 Hz, 2H, Htosyl), 7.14 (dd, J1 = 8.1 Hz, J2 = 1.5 Hz, 1H, Hpyr), 6.92 (dd,

Artículo 1

133

J1 = 8.1 Hz, J2 = 4.7 Hz, 1H, Hpyr), 4.95 (m, 1H, Hoxazine), 4.27 (dd, J1 = 11.2

Hz, J2 = 1.5 Hz, 1H, Hoxazine), 3.86 (dd, J1 = 11.2 Hz, J2 = 2.5 Hz, 1H, Hoxazine),

3.84 – 3.79 (m, 1H, CH2OH), 3.74 – 3.68 (m, 1H, CH2OH), 2.38 (s, 3H,

CH3tosyl), 1.89 - 1.71 (m, 2H, CH2CH2OH); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): d

(ppm) 144.0 (Ctosyl), 140.5 (Cpyr), 140.2 (CHpyr), 137.4 (Cpyr), 136.7 (Ctosyl),

129.2 (2xCHtosyl), 128.2 (2xCHtosyl), 124.5 (CHpyr), 119.8 (CHpyr), 67.4

(CH2oxazine), 58.3 (CH2OH), 50.8 (CHoxazine), 33.4 (CH2CH2OH), 21.7

(CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for C16H19N2O4S (M + H)+

335.0987, found 335.0878.

Methyl/Ethyl 2-(N-(tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-

hydroxypropanoate (18a,b)

To a suspension of DMAP (11.4 mg, 0.1 mmol), Et3N (156.3 µl, 1.12 mmol)

and 17a,b (360 mg, 0.95 mmol) in anhydrous DCM (3 ml) under argon

atmosphere, (Boc)2O was added (244 mg, 1.12 mmol), dissolved in

anhydrous DCM (3 ml) and stirred at rt. After 2h the reaction mixture was

poured into aq. AcOH (5%) and extracted with DCM. The organic layer was

dried over Na2SO4, filtered, and evaporated. The crude obtained without

isolation was added to a mixture of THF/H2O (1:1) (10 ml) and glacial acetic

acid was added (40 ml). After stirring for 22h the mixture reaction was

poured into brine and sat. NaHCO3. The aqueous fraction was extracted

with EtOAc, and the organic layer was dried, filtered and evaporated. The

residue was purified by flash chromatography (EtOAc/hexane, 1:7).

(18a): White solid (262 mg, 0.846 mmol), yield 89%, mp: 102 - 103°C;1H

NMR (500 MHz, CDCl3): d (ppm) 7.93 – 7.90 (m, 2H, Htosyl), 7.34 – 7.30 (m,

2H, Htosyl), 5.22 (t, J = 6.5 Hz, 1H, Hprop), 4.31 (dd, J1 = 11.6 Hz, J2 = 6.4 Hz,

1H, Hprop), 3.96 (dd, J1 = 11.6 Hz, J2 = 6.5 Hz, 1H, Hprop), 3.76 (s, 3H, OCH3),

2.45 (s, 3H, CH3tosyl), 1.31 (s, 9H, 3xCH3); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d

(ppm) 169.6 (COOMe), 150.2 (COOBut), 144.4 (Ctosyl), 136.5 (Ctosyl), 129.1

(2xCHtosyl), 128.3 (2xCHtosyl), 85.4 (C(CH3)3), 61.8 (CH2prop), 59.9 (CHprop),


134

52.4 (OCH3), 27.7 (C(CH3)3), 21.5 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd.

for C16H24NO7S (M + H)+ 374.1273, found 374.1278.

(18b): White solid (282 mg, 0.874 mmol), yield 92%, mp: 119 - 120°C; 1H

NMR (500 MHz, CDCl3): d (ppm) 7.94 – 7.90 (m, 2H, Htosyl), 7.33 – 7.30 (m,

2H, Htosyl), 5.19 (t, J = 6.5 Hz, 1H, Hprop), 4.32 (dd, J1 = 11.5 Hz, J2 = 6.6 Hz,

1H, Hprop), 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3.95 (dd, J1 = 11.5 Hz, J2 =

6.4 Hz, 1H, Hprop), 2.45 (s, 3H, CH3tosyl), 1.31 (s, 9H, 3xCH3), 1.23 (t, J = 7.1

Hz, 3H, OCH2CH3); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm) 169.7 (COOEt),

150.6 (COOBut), 144.9 (Ctosyl), 137.1 (Ctosyl), 129.5 (2xCHtosyl), 128.8

(2xCHtosyl), 85.9 (C(CH3)3), 62.3 (OCH2CH3), 62.2 (CH2prop), 60.3 (CHprop),


calcd. for C17H26NO7S (M + H)+ 388.1430, found 388.1444.

Synthesis and characterization of 6-bromopurines 3a, 4a, 6a, and 7a

For the preparation of these compounds the general synthetic procedure of

halopurine derivatives is followed.

2-(2-(6-Bromo-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-

benzo[b][1,4]oxazine (3a)

Yellow solid (120 mg, 0.232 mmol), yield 75%, mp: 192 - 193°C; 1H NMR


(dd, J1 = 8.3 Hz, J2 = 1.6 Hz, 1H, Hbenz), 7.44 – 7.31 (m, 2H, Htosyl), 7.12 –

7.01 (m, 3H, 2xHtosyl, Hbenz), 6.93 (ddd, J1 = 8.8 Hz, J2 =7.3 Hz, J3 =1.5 Hz,

1H, Hbenz), 6.77 (dd, J1 = 8.2 Hz, J2 = 1.5 Hz, 1H, Hbenz), 4.54 – 4.38 (m, 2H,

CH2N), 4.19 (dd, J1 = 14.2 Hz, J2 = 2.3 Hz, 1H, Hoxazine), 3.36 – 3.32 (m, 1H,

Hoxazine), 3.21 (dd, J1 = 14.2 Hz, J2 = 9.7 Hz, 1H, Hoxazine), 2.39 (s, 3H,

CH3tosyl), 2.30 – 2.26 (m, 1H, CH2CH2N), 2.10 – 1.96 (m, 1H, CH2CH2N); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm) 151.8 (CHpurine), 150.4 (Cpurine), 145.9

(Cbenz), 145.0 (CHpurine), 144.5 (Ctosyl), 143.1 (Cpurine), 135.2 (Ctosyl), 134.1

Artículo 1

135

(Cpurine), 129.6 (2xCHtosyl), 126.8 (2xCHtosyl), 126.2 (CHbenz), 124.1 (CHbenz),

123.4 (Cbenz), 121.3 (CHbenz), 117.2 (CHbenz), 68.3 (CHoxazine), 48.1

(CH2oxazine), 40.3 (CH2N), 31.7 (CH2CH2N), 21.6 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF)

(m/z) calcd. for C22H21N5O3SBr (M + H)+ 514.0548, found 514.0565. Anal.

calc. for C22H20N5O3SBr: C, 51.37; H, 3.92; N, 13.61. Found: C, 51.35; H,

3.90; N, 13.63.

3-((6-Bromo-9H-purine-9-yl)methyl)-1-tosyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoline

(4a)


MHz, DMSO-d6): d (ppm) 8.76 (s, 1H, Hpurine), 8.70 (s, 1H, Hpurine), 7.61 (d,

J = 8.3 Hz, 1H, Hbenz), 7.25 (d, J = 7.9 Hz, 2H, 2xHtosyl), 7.21 – 7.12 (m, 3H,

2xHtosyl, Hbenz), 7.07 (d, J = 4.5 Hz, 2H, 2xHbenz), 4.26 (dd, J1 = 8.0 Hz, J2 =

7.6 Hz, 2H, CH2N), 4.05 (dd, J1 = 13.5, J2 = 4.0 Hz, 1H, Hpyr), 3.35 (dd, J1 =

9.4 Hz, J2 = 4.3 Hz, 2H, 2xHpyr) 2.55 (dd, J1 = 16.5 Hz, J2 = 5.3 Hz, 1H, Hpyr),

2.30 (s, 3H, CH3tosyl), 2.15 – 2.04 (m, 1H, Hpyr); 13C NMR (101 MHz, DMSO-

d6): d (ppm) 151.8 (CHpurine), 150.9 (Cpurine), 147.6 (CHpurine), 144.0 (Ctosyl),

142.0 (Cpurine), 136.0 (Cbenz), 135.7 (Ctosyl), 133.6 (Cpurine), 129.9 (2xCHtosyl),

129.7 (CHbenz), 128.8 (Cbenz), 126.7 (CHbenz), 126.6 (2xCHtosyl), 125.1

(CHbenz), 123.5 (CHbenz), 48.5 (CH2pyr), 46.1 (CH2N), 32.6 (CHpyr), 30.3

(CH2pyr), 21.1 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for C22H21N5O2SBr

(M + H)+ 498.0599, found 498.0619. Anal. calc. for C22H20N5O2SBr: C,

53.02; H, 4.04; N, 14.05. Found: C, 53.05; H, 4.01; N, 14.02.

Methyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-bromo-9H-purine-9-

yl)propanoate (6a)

White solid (139 mg, 0.251 mmol), yield 81%; mp: 160 - 161°C; 1H NMR

(500 MHz, CDCl3): d (ppm) 8.56 (d, J = 6.4 Hz, 1H, Hpurine), 8.19 (s, 1H,

Hpurine), 7.53 (d, J = 8.0 Hz, 2H, 2xHtosyl), 7.14 (d, J = 8.0 Hz, 2H, 2xHtosyl),

5.54 (dd, J1 = 9.4 Hz, J2 = 4.9 Hz, 1H, Hprop), 4.98 – 4.93 (m, 2H, Hprop), 3.78


136

(s, 3H, OCH3), 2.36 (s, 3H, CH3tosyl), 1.30 (s, 9H, 3xCH3); 13C NMR (126

MHz, CDCl3): d (ppm) 168.0 (COOMe), 151.9 (Cpurine), 151.0 (CHpurine),

149.9 (COOBut), 145.6 (CHpurine), 144.9 (Ctosyl), 143.0 (Cpurine), 135.7 (Ctosyl),

134.1 (Cpurine), 129.1(2xCHtosyl), 128.1 (2xCHtosyl), 86.2 (C(CH3)3), 58.2

(CHprop), 53.1 (OCH3), 43.5 (CH2prop), 27.8 (C(CH3)3), 21.7 (CH3tosyl); HRMS

(ESI-TOF) (m/z) calcd. for C21H25N5O6SBr (M + H)+ 554.0709, found

554.0728. Anal. calc. for C21H24N5O6SBr: C, 45.49; H, 4.36; N, 12.63.

Found: C, 45.51; H, 4.34; N, 12.61.

Ethyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-bromo-9H-purine-9-

yl)propanoate (7a)


(500 MHz, CDCl3): d (ppm) 8.63 (s, 1H, Hpurine), 8.19 (s, 1H, Hpurine), 7.60 (d,

J = 8.1 Hz, 2H, 2xHtosyl), 7.19 (d, J = 8.1 Hz, 2H, 2xHtosyl), 5.55 (dd, J1 = 9.3


4.95 (dd, J1 = 14.7 Hz, J2 = 9.3 Hz, 1H, Hprop), 4.28 (q, J = 7.4 Hz, 2H,

OCH2CH3), 2.41 (s, 3H, CH3tosyl), 1.33 (s, 9H, 3xCH3), 1.27 (t, J = 7.4 Hz,

3H, OCH2CH3); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm) 167.6 (COOEt), 152.1

(CHpurine), 151.1 (Cpurine), 150.1 (COOBut), 145.6 (CHpurine), 145.0 (Ctosyl),

143.3 (Cpurine), 136.0 (Ctosyl), 134.3 (Cpurine), 129.2 (2xCHtosyl), 128.3

(2xCHtosyl), 86.3 (C(CH3)3), 62.6 (OCH2CH3), 58.4 (CHprop), 43.7 (CH2prop),


calcd. for C22H27N5O6SBr (M + H)+ 568.0865, found 568.0867; Anal. calc.

for C22H26N5O6SBr: C, 46.49; H, 4.61; N, 12.32. Found: C, 46.51; H, 4.60;

N, 12.34.

Synthesis and characterization of 6-trifluoromethylpurines 3d, 4d, 6d and 7d

A mixture of FSO2CF2CO2Me (MFSDA, 32µl, 0.25 mmol), CuI (32 mg, 0.17

mmol), HMPA (30.5 µl, 0.175 mmol) and the appropriate bromopurines (3a,

Artículo 1

137

4a, 6a and 7a) (0.14 mmol) in anhydrous DMF was stirred for 13h at 70°C.

After this time, the reaction was cooled, dissolved in EtOAc/hexane (7:3),

washed with sat. aq. NH4Cl, sat. aq. NaHCO3, water and brine, dried, filtered

and the solvent was evaporated off. The residue was purified by flash

chromatography using EtOAc/hexane as eluent.

2-(2-(6-Trifluromethyl-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-

benzo[b][1,4]oxazine (3d)

(EtOAc/hexane, 1:1), white solid, (47 mg, 0.094 mmol), yield 67%, mp: 178

- 179°C; 1H NMR (500 MHz, CDCl3): d (ppm) 9.08 (s, 1H, CHpurine), 8.13 (s,

1H, CHpurine), 7.76 (dd, J1 = 8.3 Hz, J2= 1.6 Hz, 1H, CHbenz), 7.46 – 7.35 (m,

2H, 2xCHtosyl), 7.10 (d, J = 8.0 Hz, 2H, 2xCHtosyl), 7.08 – 7.03 (m, 1H,

CHpurine), 6.95 – 6.90 (m, 1H, CHpurine), 6.74 (dd, J1 = 8.2 Hz, J2= 1.5 Hz, 1H,

CHpurine), 4.55 – 4.49 (m, 2H, CH2CH2N), 4.20 (dd, J1 = 14.2 Hz, J2 = 2.4

Hz, 1H, CH2oxazine), 3.46 – 3.42 (m, 1H, CHoxazine), 3.23 (dd, J1 = 14.3 Hz, J2

= 9.6 Hz, 1H,CH2oxazine), 2.37 (s, 3H, CH3tosyl), 2.30 – 2.25 (m, 1H,

CH2CH2N), 2.13 – 2.05 (m, 1H, CH2CH2N); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d

(ppm) 153.6 (Cpurine), 152.4 (Cpurine),151.8 (CHpurine), 145.8 (Cbenz), 145.2 (q,

J = 37.1 Hz, Cpurine),144.6 (Ctosyl), 135.3 (Ctosyl), 129.9 (Cpurine), 129.7

(2xCHtosyl), 126.8 (2xCHtosyl), 126.2 (CHbenz), 124.0, (CHbenz), 123.4 (Cbenz),

121.4 (CHbenz), 120.69 (q, J = 274.9 Hz, CF3), 117.1 (CHbenz), 68.6

(CHoxazine), 48.1 (CH2oxazine), 40.1 (CH2CH2N), 31.8 (CH2CH2N), 21.4

(CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for C23H21N5O3SF3 (M + H)+

504.1317, found 504.1345. Anal. Calc. for C23H20N5O3SF3: C, 54.87; H,

4.00; N, 13.91. Found: C, 54.86; H, 4.03; N, 13.94.

3-((6-Trifluoromethyl-9H-purine-9-yl)methyl)-1-tosyl-1,2,3,4-

tetrahydroquinoline (4d)

(EtOAc/hexane, 1:1), yellowish solid, (41 mg, 0.105 mmol), yield 75%, mp:

195 - 196°C;1H NMR (500 MHz, CDCl3): d (ppm) 9.08 (s, 1H, CHpurine), 8.21


138

(s, 1H, CHpurine), 7.72 (d, J = 8.3 Hz, 1H), CHbenz, 7.40 (d, J = 7.9 Hz, 2H,

2xCHtosyl), 7.20 (t, J = 7.8 Hz, 1H, CHbenz), 7.16 – 7.09 (m, 2H, 2xCHtosyl),

7.07 (d, J = 7.3 Hz, 1H, CHbenz), 6.99 (d, J = 7.6 Hz, 1H, CHbenz), 4.32 (dd,

J1= 14.3 Hz, J2 = 6.6 Hz, 1H, CH2N), 4.21 (dd, J1 = 14.4 Hz, J2 = 6.4 Hz,

1H, CH2N), 4.02 (dd, J1 = 13.5 Hz, J2 = 3.7 Hz, 1H, CH2pyr), 3.48 (dd, J1 =

13.5 Hz, J2 = 8.5 Hz, 1H, CH2pyr), 2.61 (dd, J1 = 15.9 Hz, J2 = 5.1 Hz, 1H.

CH2pyr), 2.49 – 2.38 (m, 1H, CHpyr), 2.35 (s, 3H, CH3tosyl), 2.31 (d, J = 8.6

Hz, 1H, CH2pyr); 13C NMR (126 MHz, CDCl3): d (ppm) 154.2 (Cpurine), 152.4

(CHpurine), 147.9 (CHpurine), 145.8 (q, J = 37.7 Hz, Cpurine),144.4 (Ctosyl), 136.7

(Cbenz), 136.6 (Ctosyl), 130.4 (Cpurine), 130.1 (2xCHtosyl), 129.8 (CHbenz), 127.6

(CHbenz), 127.5 (Cbenz), 127.2 (2xCHtosyl), 125.6 (CHbenz), 124.3 (CHbenz),

120.8 (q, J = 275.9 Hz, CF3), 48.9 (CH2pyr), 47.0 (CH2N), 33.2 (CHpyr), 31.1

(CH2pyr), 21.9 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for C23H21N5O2SF3

(M + H)+ 488.1368, found 488.1415. Anal. Calc. for C23H20N5O2SF3: C,

56.67; H, 4.14; N, 14.37. Found: C, 56.65; H, 4.15; N, 14.40.

Methyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-trifluoromethyl-9H-

purine-9-yl)propanoate (6d)


- 157°C; 1H NMR (500 MHz, CDCl3): d (ppm) d 9.03 (s, 1H, CHpurine), 8.36

(s, 1H, CHpurine), 7.63 (d, J = 8.1 Hz, 2H, 2xCHtosyl), 7.19 (d, J = 8.1 Hz, 2H,

2xCHtosyl), 5.61 (dd, J1 = 9.2 Hz, J2 = 4.9 Hz, 1H, Hprop), 5.12 (dd, J1 = 14.7


3.85 (s, 3H, OCH3), 2.40 (s, 3H, CH3tosyl), 1.28 (s, 9H, 3xCH3); 13C NMR

(126 MHz, CDCl3): d (ppm) 168.1 (COOMe), 154.3 (Cpurine), 152.1 (CHpurine),

150.1 (COOBut), 148.0 (CHpurine), 145.3 (Ctosyl), 145.1 (q, J = 37.2 Hz,

Cpurine), 135.9 (Ctosyl), 130.1 (Cpurine), 129.3 (2xCHtosyl), 128.4 (2xCHtosyl),

120.6 (q, J = 275.9 Hz, CF3),86.5 (C(CH3)3), 58.1 (CHprop), 53.3 (OCH3),

43.7 (CH2prop), 27.8 (C(CH3)3), 21.7 (CH3tosyl); HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd.

for C22H25N5O6SF3 (M + H)+ 544.1478, found 544.1480. Anal. calc. for

Artículo 1

139

C22H24N5O6SF3: C, 48.62; H, 4.45; N, 12.89. Found: C, 48.63; H, 4.42; N,

12.91.

Ethyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-trifluoromethyl-9H-

purine-9-yl)propanoate (7d)


- 161°C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): d (ppm) 9.03 (s, 1H, CHpurine), 8.36 (s,

1H, CHpurine), 7.65 (d, J = 8.2 Hz, 2H, 2xCHtosyl), 7.21 (t, J = 8.2 Hz, 2H,

2xCHtosyl), 5.57 (dd, J1 = 9.0 Hz, J2 = 5.1 Hz, 1H, Hprop), 5.07 – 5.03 (m, 2H,

Hprop), 4.29 (q, J = 7.1 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.41 (d, J = 8.9 Hz, 3H, CH3tosyl),

1.30 (s, 9H, 3xCH3), 1.27 (t, J = 7.2 Hz, 3H, OCH2CH3); 13C NMR (101 MHz,

CDCl3): d (ppm) 167.9 (COOEt), 154.7 (Cpurine), 152.4 (CHpurine), 150.4

(COOBut), 148.4 (CHpurine), 145.2 (q, J = 37.4 Hz, Cpurine), 144.9 (Ctosyl),

136.3 (Ctosyl), 130.4 (Cpurine), 129.5 (2xCHtosyl), 128.7 (2xCHtosyl), 120.6(q, J

= 275.9 Hz, CF3), 86.7 (C(CH3)3), 63.0 (OCH2CH3), 58.5 (CHprop), 43.9

(CH2prop), 28.2 (C(CH3)3), 22.0 (CH3tosyl), 14.4 (OCH2CH3); HRMS (ESI-

TOF) (m/z) calcd. for C23H27N5O6SF3 (M + H)+ 558.1634, found 558.1634.

Anal. calc. for C23H26N5O6SF3: C, 49.55; H, 4.70; N, 12.56. Found: C, 49.57;

H, 4.69; N, 12.56.

Figure S.1. Chemical structure of benzoxazepine derivatives [Díaz-

Gavilán, M. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 18, 1457-1460 (2008)]

Figure S.1. Benzoxazepine derivatives previously published by our group.

O

NR1

NN

N

NR2

a R1 = SO2-C6H4-oNO2, R2 = SPhb R1 = SO2-C6H4-pNO2, R2 = SPhc R1 = H, R2 = SPh


140

Figure S.2. Apoptosis after treatment with 4c at lower concentrations

Figure S.2. Percentage of apoptotic cells after treatment with compound 4c at 3, 10 and 30 µM.

Supplementary video: two-day time-lapse motion picture of MCF-7 cell

proliferation under treatment with 30 μM of 4c with Nucview488 (apoptosis

fluorescent marker)

Artículo 1

141

1H and 13C-RMN spectra of intermediate derivatives

1H NMR 2-(3,4-Dihydro-2H-1,4-benzo[b][1,4]oxazine-2-yl)ethanol (8)

13C NMR


142

1H NMR (3,4-Dihydro-4-tosyl-2H-1,4-benzo[b][1,4]oxazine-2-yl)ethanol (9)

13C NMR

Artículo 1

143

1H NMR (1,2,3,4-Tetrahydro-1-tosylquinoline-3-yl)methanol (11)

13C NMR


144

1H NMR Ethyl (4-acetyl-3,4-dihydro-2H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazine-3-

yl)acetate (12)

13C NMR

Artículo 1

145

1H NMR 2-(3,4-Dihydro-2H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazine-3-yl)ethanol (13)

13C NMR


146

1H NMR 3-((((tert-Butyldimethyl)silyl)oxy)ethyl)-3,4-dihydro-2H-pyrido[3,2-

b][1,4]oxazine (14)

13C NMR

Artículo 1

147

1H NMR 3-(2-((tert-Butyldimethylsilyl)oxy)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-

pyrido[3,2-b][1,4]oxazine (15)

13C NMR


148

1H NMR 2-(4-Tosyl-3,4-dihydro-2H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazine-3-yl)etanol

(16)

13C NMR

Artículo 1

149

1H NMR Methyl 2-(N-(tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-hydroxypropanoate (18a)

13C NMR


150

1H NMR Ethyl 2-(N-(tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-hydroxypropanoate (18b)

13C NMR

Artículo 1

151

1H and 13C-RMN spectra of 6-halo and 2,6-dihalopurines 1H NMR 2-(2-(6-Bromo-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-

benzo[b][1,4]oxazine (3a)

13C NMR


152

1H NMR 2-(2-(6-Chloro-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-

benzo[b][1,4]oxazine (3b)

13C NMR

Artículo 1

153

1H NMR 2-(2-(2,6-Dichloro-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazine (3c)

13C NMR


154

1H NMR 3-((6-Bromo-9H-purine-9-yl)methyl)-1-tosyl-1,2,3,4-

tetrahydroquinoline (4a)

13C NMR

Artículo 1

155

1H NMR 3-((6-Chloro-9H-purine-9-yl)methyl)-1-tosyl-1,2,3,4-

tetrahydroquinoline (4b)

13C NMR


156

1H NMR 3-((2,6-Dichloro-9H-purine-9-yl)methyl)-1-tosyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoline (4c)

13C NMR

Artículo 1

157

1H NMR 3-(2-(6-Chloro-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-

pyrido[3,2-b][1,4]oxazine (5b)

13C NMR


158

1H NMR 3-(2-(2,6-Dichloro-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-2H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazine (5c)

13C NMR

Artículo 1

159

1H NMR Methyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-bromo-9H-

purine-9-yl)propanoate (6a)

13C NMR


160

1H NMR Methyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-chloro-9H-

purine-9-yl)propanoate (6b)

13C NMR

Artículo 1

161

1H NMR Methyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(2,6-dichloro-9H-purine-9-yl)propanoate (6c)

13C NMR


162

1H NMR Ethyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-bromo-9H-

purine-9-yl)propanoate (7a)

13C NMR

Artículo 1

163

1H NMR Ethyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-chloro-9H-

purine-9-yl)propanoate (7b)

13C NMR


164

1H NMR Ethyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(2,6-dichloro-9H-purine-9-yl)propanoate (7c)

13C NMR

Artículo 1

165

1H and 13C-RMN spectra of 6-trifluoromethylpurines 1H NMR 2-(2-(6-Trifluromethyl-9H-purine-9-yl)ethyl)-4-tosyl-3,4-dihydro-

2H-benzo[b][1,4]oxazine (3d)

13C NMR


166

1H NMR 3-((6-Trifluoromethyl-9H-purine-9-yl)methyl)-1-tosyl-1,2,3,4-

tetrahydroquinoline (4d)

13C NMR

Artículo 1

167

1H NMR Methyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-

trifluoromethyl-9H-purine-9-yl)propanoate(6d)

13C NMR


168

1H NMR Ethyl-2-(N-tert-butoxycarbonyl)-N-tosylamino)-3-(6-trifluoromethyl-

9H-purine-9-yl)propanoate(7d)

13C NMR

Artículo 2

Artículo 2

173

NMR studies of new heterocycles tethered to purine moieties with anticancer activity

Nerea Fernández-Sáez, Joaquín M. Campos, M. Encarnación Camacho,*

M. Dora Carrión*

Departamento de Química Farmacéutica y Orgánica, Facultad de

Farmacia, Universidad de Granada, 18071 Granada, Spain.

Abstract: Ten compounds containing benzoxazine (3a-d), quinoline (5a-d)

and pyridoxazine (11a-b) heterocycles linked to purine fragments, designed

as anticancer molecules, as well as their eight intermediate precursors (1,

2, 4, 6-10) have been elucidated completely using 1D and 2D spectroscopic

*Corresponding author: M. Encarnación Camacho. Departamento de Química Farmacéutica y Orgánica. Facultad de Farmacia. Universidad de Granada. c/ Campus de Cartuja, s/n. 18071 Granada, Spain. E-mail: [email protected]. Tfno. +34958243844. *Corresponding author: M. Dora Carrión. Departamento de Química Farmacéutica y Orgánica. Facultad de Farmacia. Universidad de Granada. c/ Campus de Cartuja, s/n. 18071 Granada, Spain. E-mail: [email protected]. Tfno. +34958240728.

L E T T ER ‐ S P E C TRAL A S S I GNMENT

NMR studies of new heterocycles tethered to purinemoieties with anticancer activity

1 | INTRODUCTION

Cancer is one of the greatest threats of our society becauseit is one of the leading causes of death. Many active com-pounds have been developed to face this problem in recentyears.[1–3] Some purine derivatives with an interesting anti-proliferative activity have been previously synthesized bycombining benzo‐fused heterocycles linked to substitutedpurines.[4–10] In order to improve the activity and have adeeper idea of the structure–activity relationship, newcompounds have been obtained. Such changes includesome bioisosteric replacements as elimination of oxygenatom of the heterocycle or elongation of the linkingchain between the six‐membered heterocycles and thesubstituted purines.

In this way, the synthesis and biological evaluation ofthese novel families of purine derivatives linked to six‐membered heterocyclic moieties 3a–d, 5a–d, and 11a–b,which were designed and evaluated as anticancer agents,have been described.[11]

The structures of these new compounds have beendetermined by 1H and 13C nuclear magnetic resonance(NMR) and mass spectrometry. Some of them have beenstudied more in detailed in order to corroborate their skel-eton by using two‐dimensional techniques, and an elemen-tal analysis has been performed to all the final compounds.

The present study reports the unambiguous assignmentof each signal in the 1H and 13C NMR spectra in benzoxa-zine derivatives (3a–d), including elongation of the sidechain, tetrahydroquinolines (5a–d), and pyridoxazinederivatives (11a–b) in which a pyridine ring is merged tothe oxazine heterocycle, using one‐ and two‐dimensionalresonance techniques. The assignment of derivatives 1, 2,4, and 6–10, the precursors in their synthetic pathway, isalso included.

2 | EXPERIMENTAL

2.1 | NMR spectra

NMR spectra were made on 400‐MHz 1H NMR and 101‐MHz 13C NMR Agilent Varian Direct Drive and 500‐

MHz 1H NMR and 125‐MHz 13C NMR Agilent VarianInnova Unity spectrometers at 298 K. In DEPT experi-ments, the employed parameters were the following:pulse width (135°), 9.0 ms; recycle time, 1 s; 0.5 J(CH) = 4 ms; 65,536 data points acquired and trans-formed from 1,024 scans; spectral width, 15 KHz; and linebroadening, 1.3 Hz. Chemical shifts (δ) are quoted inparts per million (ppm) and are referenced to the residualsolvent peak: CDCl3, δ = 7.26 ppm (1H), δ = 77.4 ppm(13C) or (CD3)2SO, δ = 2.50 ppm (1H), δ = 39.52 ppm(13C). Spin multiplicities are given as s (singlet), bs (broadsinglet), d (doublet), dd (doublet of doublet), ddd (doubletof doublet of doublet), td (triplet of doublet), t (triplet), tt(triplet of triplet), q (quadruplet), and m (multiplet). Cou-pling constants (J) are given in Hertz.

The heteronuclear single‐quantum correlation (HSQC)spectra were calculated with a pulse sequence gc2hsqcse(standard sequence, Agilent Vnmrj_3.2A software). TheHMBC spectra were determined with a pulse sequencegc2hmbc (standard sequence, Agilent Vnmrj_3.2A soft-ware) optimized for 8 Hz (interpulse delay for the evolu-tion of long‐range couplings: 62.5 ms).

Nuclear Overhauser spectra were recorded on anAgilent Varian Direct Drive spectrometer, operating at500 MHz, with a spectral width of 8.01 KHz at 16 K com-plex points (acquisition time 2 s). The mixing time in one‐dimensional nuclear Overhauser spectroscopy (NOESY)experiment was 0.5 s. Data processing with zero fillingat 64 K and apodization with exponential function (LineBroadening (LB) = 0.5 Hz).

3 | RESULTS AND DISCUSSION

Schemes 1–3 depict the synthetic route carried out in thepreparation of final compounds 3a–d, 5a–d, and 11a–bpreviously reported,[11] and Tables 1–4 show the spectro-scopic data for both the intermediate and final synthe-sized compounds.

The structure of these compounds has been elucidatedby routine 1H and 13C NMR techniques. Nevertheless, adefinitive assignment of all signals was accomplished with

Received: 23 January 2019 Revised: 18 March 2019 Accepted: 18 March 2019

DOI: 10.1002/mrc.4871

Magn Reson Chem. 2019;1–11. © 2019 John Wiley & Sons, Ltd.wileyonlinelibrary.com/journal/mrc 1


174

experiments (1H NMR, 13C NMR, DEPT, HSQC and HMBC). Derivative 6,

predecessor of the pyridoxazine series, has also been studied in detail to

corroborate the obtaining of the 3-regioisomer only in the cyclization

process of its synthesis. In addition, 2D NOESY experiments have been

used to investigate the chain conformation for a series of structures.

KEYWORDS: 1H and 13C 1D NMR; 1H/13C 2D NMR (HSQC, HMBC); 2D

NOESY; benzoxazine, quinoline, pyridoxazine.

Introduction

Cancer is one of the greatest threats of our society because is one of the

leading causes of death. Many active compounds have been developed to

face this problem in recent years.[1-3] Some purine derivatives with an

interesting anti-proliferative activity have been previously synthesized by

combining benzo-fused heterocycles linked to substituted purines.[4-10] In

order to improve the activity and have a deeper idea of the structure-activity

relationship, new compounds have been obtained. Such changes include

some bioisoteric replacements as elimination of oxygen atom of the

heterocycle or elongation of the linking chain between the six-membered

heterocycles and the substituted purines.

In this way the synthesis and biological evaluation of these novel families of

purine derivatives linked to six-membered heterocyclic moieties 3a-d, 5a-d and 11a-b, which were designed and evaluated as anticancer agents, have

been described.[11]

The structures of these new compounds have been determined by 1H and 13C NMR and mass spectrometry (MS). Some of them have been studied

more detailed in order to corroborate their skeleton by using two-

dimensional techniques, and an elemental analysis have been performance

to all the final compounds.

Artículo 2

175

The present study reports the unambiguous assignment of each signal in

the 1H and 13C NMR spectra in benzoxazine derivatives (3a-d), including

elongation of the side chain, tetrahydroquinolines (5a-d) and pyridoxazine

derivatives (11a-b) in which a pyridine ring is merged to the oxazine

heterocycle, using one- and two-dimensional resonance techniques. The

assignment of derivatives 1, 2, 4, 6-10, the precursors in their synthetic

pathway, are also included.

Experimental

NMR spectra

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectra were made on a 400-MHz 1H

and 101 MHz 13C NMR Agilent Varian Direct Drive, and a 500-MHz 1H and

125-MHz 13C NMR Agilent Varian Innova Unity spectrometers at 298 K. In

DEPT experiments the employed parameters were the following: pulse

width (135°), 9.0 ms; recycle time, 1 s; ½ J (CH) = 4 ms; 65 536 data points

acquired and transformed from 1024 scans; spectral width, 15 KHz; and line

broadening, 1.3 Hz. Chemical shifts (δ) are quoted in parts per million (ppm)

and are referenced to the residual solvent peak: CDCl3, δ = 7.26 ppm (1H),

δ = 77.4 ppm (13C) or (CD3)2SO, δ = 2.50 ppm (1H), δ = 39.52 ppm (13C).

Spin multiplicities are given as s (singlet), bs (broad singlet), d (doublet), dd

(doublet of doublet), ddd (doublet of doublet of doublet), td (triplet of

doublet), t (triplet), tt (triplet of triplet), q (quadruplet), and m (multiplet).

Coupling constant (J) are given in Hz.

The HSQC spectra were calculated with a pulse sequence gc2hsqcse

(Standard sequence, Agilent Vnmrj_3.2A software). The HMBC spectra

were determined with a pulse sequence gc2hmbc (standard sequence,

Agilent Vnmrj_3.2A software) optimized for 8 Hz (inter-pulse delay for the

evolution of long-range couplings: 62.5 ms).


176

Results and Discussion

Schemes 1-3 depict the synthetic route carried out in the preparation of final

compounds 3a-d, 5a-d and 11a-b, previously reported[11] and Tables 1-4

show the spectroscopic data for both the intermediate and final synthesized

compounds.

Scheme 1. Synthesis of compounds 3a-d included in the benzoxazine family. Reagents and conditions: (i) ethyl 4-bromobut-2-enoate, NaHCO3, EtOH, 3 h, rt, then

K2CO3, 30 min; (ii) LiAlH4, Et2O, 1 h, 0ºC to rt; (iii) TsCl, py, 12 h, 0ºC to rt; (iv) 2,6-

dihalopurine or 6-halopurine, DIAD, Ph3P, 36 h, -20ºC to rt; (v) MFSDA, CuI, HMAP, DMF,

12 h, 70ºC.

Scheme 2. Synthesis of the tetrahydroquinoline family compounds (5a-d). Reagents

and conditions: (i) aq. NaOH, EtOH, 20 h, reflux, then HCl 1N; (ii) SOCl2, EtOH, 4 h, reflux;

(iii) NaBH3CN, THF, MeOH, HCl, Et2O, 6 h, rt; (iv) LiAlH4, THF, 1 h, 0ºC; (v) TsCl, py, 12 h,

12

345

6

78

NH2

OH O

NS

O

HN(i)

(ii)

(iii) (iv)

OR OR1

2

345

6

78 O

NS

N N

NN

X

Y

1

2'

3'

4' 5'

6'

7'8'

2

345

6

78

1'

9'

O O

CH3

O O

CH3

1''2''

3''4''

5''

6''1'

2'

3'4'

5'

6'

3d (X = CF3, Y = H)

3a (X = Cl,Y = Cl)3b (X = Cl, Y = H)3c (X = Br, Y = H)(vii)

1, R = H 2, R = H

4, R = H

5d (X = CF3, Y = H)

5a (X = Cl,Y = Cl)5b (X = Cl, Y = H)5c (X = Br, Y = H)

(i), (ii)N

CN

HN

(iii), (iv)

(v) (vi)

(vii)

OH

N

OR

S1

2

345

6

78

O O

CH3

1'2'

3'4'

5'

6'

1

2'3'4'

5'6'

7'8'2

345

6

78

1'

9'

1''2''

3''4''

5''

6''

NS

N

O O

CH3

N

N N

X

Y

Artículo 2

177

0ºC to rt; (vi) 2,6-dihalopurineor 6-halopurine, DIAD, Ph3P, 36 h, -20ºC to rt; (vii) MFSDA, CuI, HMAP, DMF, 12 h, 70ºC.

Scheme 3. Synthesis of compounds belonging to the pyridoxazine family (11a-b). Reagents and conditions: (i) Ac2O/py, 5 min, reflux, then NaOH; (ii) ethyl 4-bromobut-2-

enoate, K2CO3, EtOH, 24 h; (iii) LiAlH4, THF, 1 h, 0ºC to rt; (iv) TBDMSCl, Et3N, DMAP,

DCM, 12 h, rt; (v) TsCl, Et3N, DMAP, DCM, 12 h, rt; (vi) AcOH, H2O, THF, 12 h, rt; (vii) 2,6-

dichloropurine or 6-halopurine, DIAD, Ph3P, -20ºC to rt, 36 h.

1

2'3'

4' 5'

6'

7'8'

2

345

6

78

1'

9'

1'2'

3'4'

5'

6'

12

345

6

78

1''2''

3''4''

5''

6''7, R = H8, R = Si(CH3)2C(CH3)3

11a (X = Cl, Y = Cl)11b (X = Cl, Y = H)

N

OH

NH2

(i)

N NH

O

OR N N

O

OR

(v)

S

(vii)

(vi)

9, R = Si(CH3)2C(CH3)310, R = H

N N

O

NS

N

NN

X

Y

O O

CH3

O O

CH3

N N

O

COOEt(ii)

(iii)

(iv)

O

6

12

345

6

781

2

345

6

78


178

Artículo 2

179


180

The structure of these compounds has been elucidated by routine 1H and 13C NMR techniques. Nevertheless, a definitive assignment of all signals

was accomplished with the help of NMR techniques. Such procedures

include the following: i) DEPT experiments for determining the presence of

primary, secondary and tertiary carbon atoms; ii) HSQC spectra to assign

the 13C resonances of the primary, secondary and tertiary carbons; iii)

HMBC sequences to corroborate the signals of quaternary carbons via two-

bond and three-bond interactions.

Tables 1 and 2 show the 1H NMR signals of each proton for molecules 1-

11, whereas Tables 3 and 4 show the corresponding 13C NMR chemical

shifts for the same compounds. The NMR spectra of the intermediates were

carried out in CDCl3 solutions. The NMR spectra of the final compounds

were performed in CDCl3 solutions, except for 5c, which was accomplished

in DMSO-d6. For this reason, some significant variations are observed in

the chemical shifts depending of the solvent.

In relation to the benzoxazine family, chemical shifts of 1H and 13C NMR of

the tosylated intermediate 2 and the final derivatives 3a-d are similar for H-

2, H-3a, H-3b, H-5, H-6, H-7 and H-8; nevertheless, in the untosylated

intermediate 1, H-2 appears at a greater chemical shift than H-3a. In the

same way, C-2 of the intermediate 1 appears at a higher shift than C-2 in

both compounds, the tosylated intermediate 2 and the tosylated purines 3a-d. Finally, the presence of trifluoromethyl group in 3d is justified due to the

following C-F couplings: 145.20 (q, JC-CF3 = 37.1, C-6’) and 120.69 (q, JCF =

274.9, CF3).

In addition, in the dihydroquinoline series, the 1H NMR signals are similar in

both, the intermediate 4 and the final purines 5a-d, except for the CH2 signal

of the side chain. In derivative 4 the CH2 linked to the OH group appears as

a multiplet at δ = 3.53 ppm, while in 5a-d the CH2 peak, which is linked to

the purine moiety, appears as two doublet of doublets between δ 4.12 - 4.21

Artículo 2

181

ppm and δ 4.20 - 4.32 ppm respectively. Nevertheless, the methylene group

of 5c appears as multiplet centered at δ 4.26 ppm. Moreover, in this family,

the main difference in 13C is the CH2 aliphatic signal, which appears at δ

64.34 ppm in the intermediate 4 and between δ 46.10 - 47.00 in purines 5a-d. Otherwise, the trifluoromethyl group presents in 5d is corroborated by the

two quadruplets in the 13C NMR spectrum which appear at δ 145.80 ppm

(JC-CF3 = 37.7, C-6’) and δ 120.80 ppm (JCF = 275.9, CF3), respectively.

In the last pyridoxazine family, the intermediate 6, structurally different from

derivatives 7 – 10, does not follow the same coupling pattern of the latter,

being similar the signals of the remaining intermediates except for H-3. This

proton appears between δ 3.74 – 3.76 ppm in the untosylated derivatives

(7, 8) and at δ 4.95 – 4.98 ppm in the tosylated ones (9, 10), respectively.

In addition, target molecules 11a and 11b show similar chemical shifts with

respect to their tosylated intermediates, except for the CH2X and CH2CH2X

aliphatic signals, due to the different nature of the heteroatom linked to the

aliphatic chain (X = O in the intermediate compounds; X = N in the final

derivatives).


182

Artículo 2

183


184

HSQC and HMBC experiments were performed on an intermediate and a

final molecule of each family. Table 5 shows the HSQC correlations for

compounds 2, 4, 7, 3c, 5b and 11a, whereas Figure 1 illustrates the more

important connectivities found in the HMBC spectra of the same molecules.

Table 5. HSQC correlations found for compounds 2, 4, 6, 7, 3c, 5b and 11a 1H/13C 2 4 6 7 3c 5b 11a H-2 3.58 4.12,

3.42 4.47, 4.07

4.15, 3.82 3.34 4.01,

3.45 4.18, 3.75

C-2 69.97 48.47 67.17 68.7 68.32 48.47 66.92

H-3 4.32, 3.19 1.94 5.41 3.76 4.19,

3.21 2,39 4.77 C-3 48.47 35.25 44.57 49.25 48.08 32.85 51.13 H-4 - 2.24 - 5.12 - 2.30 - C-4 - 29.48 - - - 30.67 - H-5 6.79 7.04 - - 6.77 6.98 - C-5 115.35 129.52 - - 117.17 129.34 - H-6 6.92 7.15 7.96 7.57 6.93 7.2 8.02 C-6 120.76 126.62 139.5

6 139.02 121.31 127.19 140.34 H-7 7.04 7.04 7.00 6.49 7.06 7.08 6.96

C-7 125.82 124.93 120.60 113.18 126.18 125.2 120.46

H-8 7.83 7.8 7.20 6.93 7.77 7.73 7.15

C-8 123.98 123.60 124.30 121.72 124.13 123.97 124.79

H-2’ - - - - 8.69 8,74 - C-2' - - - - 151.8 152.01 153.13 H-8’ - - - - 7.98 8.04 8.30 C-8' - - - - 145.03 145.22 146.72

CH2X 3.76 3.53 2.47 3.87, 3.97 4.44 4.15,4.2

5 4.44, 4.52

CH2X 58.7 64.34 33.60 60.06 40.29 46.7 41.74

CH2CH2X 1.77 - - 1.70 2.04, 2.28 - 2.13

CH2CH2X 34.88 - - 33.35 31.67 - 30.63 COOCH2CH3

- - 4.12 - - - -

COOCH2CH3

- - 60.69 - - - -

COOCH2CH3

- - 1.22 - - - -

COOCH2CH3

- - 13.95 - - - -

COCH3 - - 2.59 - - - - COCH3 - - 25.70 - - - -

Artículo 2

185

HSQC experiments performed on compounds 2, 4, and 7 allows the

assignment of the secondary carbon atoms chemical shifts C-3, CH2OR and

CH2CH2OR, and the assignment of the chemical shifts for tertiary carbon

atoms C-5, C-6, C-7 and C-8 in the intermediate derivatives 1, 2, 4, 6-8 and

10. These atoms show signals in ranges of δ 48.87 - 72.24 (C-2), δ 35.25 -

50.92 (C-3), δ 33.60 - 64.34 (CH2OR), δ 33.33 - 35.26 (CH2CH2OR), δ

115.35 - 129.52 (C-5), δ 120.76 -140.52 (C-6), δ 113.18 - 125.82 (C-7) and

δ 116.60 - 124.46 (C-8).

Similar HSQC experiments performed on 3c, 5b and 11a indicate that the 13C NMR signals for the secondary and tertiary carbon atoms in the purine

derivatives 3a-d, 5a-d and 11a-b are in similar ranges. Such chemical shifts

are the following: δ 48.22 - 68.66 (C-2), δ 32.35 - 51.21 (C-3), δ 40.15 -

47.00 (CH2N), δ 30.63 - 31.88 (CH2CH2N), δ 30.30 - 31.09 (C-4), δ 117.15

- 129.79 (C-5), δ 121.31 - 140.94 (C-6), δ 120.31 - 126.44 (C-7), δ 123.47 -

124.79 (C-8), δ 151.02 -153.19 (C-2’) (except for 3a, 5a and 11a where C-

2’ is a quaternary carbon atom) and δ 145.03 - 147.92 (C-8’).

The quaternary carbon signals were confirmed by HMBC spectra on the

intermediate (2, 4 and 7) and final (3c, 5b and 11a) compounds (Figure 1).

In 2, correlation between H-6 (δ 6.92) and the 13C at 123.51 ppm, allows the

unequivocal assignment of C-4a; another correlation between H-7 (δ 7.04)

and the peak at 146.44 ppm allows the identification of C-8a. In the same

way, the H-2’ and H-6’ signals (δ 7.54) correlate with the 13C peak at 144.07

ppm, making possible to assign this peak to C-4’, and the H-3’ and H-5’

signals (δ 7.23) correlate to peak at δ 135.41 ppm, being identified as C-1’

accordingly. In 4, correlations between H-6 (δ 7.15) and H-5 (δ 7.04) with

the 13C signal which appears at 137.01 ppm allow to identify it as C-4a.

Assignation of C-8a has been possible due to the interactions between the

signals at δ 7.06 ppm (H-7) and δ 7.68 ppm (H-8) and the 13C peak at 129.27

ppm. Correlation between H-4 (δ 2.24 and δ 2,59 ppm) and the same 13C

peak permits us to assign this peak to C-8a. Furthermore, the quaternary


186

carbons of the tosyl group C-1’’ and C-4’’ were assigned by the observed

correlation among δ 7.21 ppm (H-3’’ and H-5’’) and the 13C atom at 139.90

ppm (C-1’’). Correlation between δ 7.51 ppm (H-2’’ and H-6’’) and δ 143.78

ppm allows us to assign inequivocally this signal to C-4’’. Finally, in 7,

correlations of H-2a (δ 4.14), H-2b (δ 3.82) and H-7 (δ 6.49) and the 13C at

δ 139.08 ppm enables the assignment of C-8a at δ 130.08 ppm. In addition,

the assignment of C-4a is possible due to the observed correlation between

H-6 (δ 7.57) and H-8 (δ 6.93) with the peak at δ 139.08 ppm.

The HMBC experiment performed on 3c indicates correlations between H-

3 (δ 4.19) and H-6 (δ 6.93) with the signal δ 123.42 ppm (C-4a). Other

correlation exits between H-7 (δ 7.06) and the peak which appears at δ

145.88 ppm (C-8a). In the same way, the 13C at δ 150.39 ppm that correlates

with H-2’ (δ 8.69), H-8’ (δ 7.98) and CH2N (δ 7.98) can be identified as C-

4’. A correlation of H-2’ (δ 8.69) and the 13C peak at δ 143.07 ppm allows to

identify C-6’ and finally, correlation of H-8’ (δ 7.98) and the signal at 135.20

ppm permits us to identify it as C-5’. C-1’’ corresponds to a signal appearing

at δ 134.11 ppm due to its correlation with H-2’’ and H-6’’ (δ 7.36). C-4’’ is

assigned to the 13C peak at δ 129.64 ppm because is correlated with H-3’’

and H-5’’ (δ 7.06).

Artículo 2

187

Figure 1. Main connectivities found in the HMBC 1H/13C spectra of intermedia compounds

(2, 4, 6, 7) and final derivatives (3a-d, 5a-d, 11a-b).

In 5b, the assignment of the C-4a and C-8a signals of the quaternary

carbons included in the tetrahydroquinoline heterocycle has been deduced

through the correlations between H-6 (δ 7.20) and the 13C at 136.33 ppm

(C-4a). In the same way, correlations between δ 7.08 (H-7), δ 6.96 (H-5)

and H-4 (δ 2.31 and 2.59) with δ 127.23, permits the latter to be assigned

to C-8a. In addition, the quaternary carbons of the purine moiety and the

tosyl group have been assigned by similar correlations to those of their

benzoxazine isosteres, being these signals C-4’ (δ 151.84 ppm), C-5’ (δ

131.59 ppm), C-6’ (δ 152.01 ppm), C-1’’ (δ 136.21 ppm) and C-4’’ (δ 143.99

ppm).

The HMBC experiment performed on 11a, shows that H-8 (δ 7.15) is

correlated with the 13C signal at δ 137.00 ppm, being assigned this to C-4a.

H-7 (δ 6.96) and H-2a (δ 4.18) are correlated with the peak at δ 140.34 ppm

(C-8a). Furthermore, the signal appearing at δ 153.13 ppm is assigned to

C-4’ due to its correlation with H-8’ (δ 8.30) and CH2N (δ 4.44 and δ 4.52).


188

In addition, H-8’ is correlated with a signal at δ 130.95, which can be

assigned to C-5’. Moreover, the quaternary carbon atoms identification of

the tosyl moiety has been deduced similary as in their two isosteric families,

being C-1’’ the peak at δ 136.01 ppm and C-4’’ the δ 144.51 ppm signal. At

last, the characterization of quaternary atoms in the purine skeleton C-2’

and C-6’ has been deduced by analogy to the corresponding purine

chemical shifts already justify in the two previous isosteric families (see

Figure 1).

Intermediate 6, precursor of the pyridoxazine family 11a-b, has been

studied in detail to prove its structure. In this way, to obtain only the desired

3-regioisomer we have started from 2-aminopyridin-3-ol, followed by

acylation of its amino group by treatment with acetic anhydride and pyridine,

to decrease the nucleophilicity of the amino group. Subsequently,

cyclization of this intermediate with 4-bromobut-2-enoate (ethyl crotonate)

in ethanol and K2CO3 only gave 6, but not its 2-regioisomer 12 (Scheme 4).

This is contrary to that described by other authors who obtained a mixture

of two pyridoxazine regioisomers (ethyl-4-acetyl-3,4-dihidro-2H-pyrido[3,2-

b][1,4]oxazine-2-carboxylate and ethyl-4-acetyl-3,4-dihidro-2H-pyrido[3,2-

b][1,4]oxazine-3-carboxylate), by reaction between N-(3-hydroxypyridin-2-

yl)acetamide and ethyl 2,3-dibromopropionate in the presence of K2CO3,

employing CH3CN as solvent [12].

In order to unequivocally determine the structure of 6, 2D NMR (HSQC and

HMBC) experiments have been carried out. HSQC (Table 5) allows the

unequivocal assignment of the tertiary carbon in the pyrido[3,2-

b][1,4]oxazine ring C-3, C-6, C-7 and C-8, and the methyl group of both,

acetyl and ethyl carboxylate moieties. These atoms show signals at δ 44.57,

139.56, 120.60, 124.30, 25.70 and 13.95 ppm, respectively. In addition, the

secondary carbons C-2 (δ 67.17 ppm), the CH2 linker carbon (δ 33.60 ppm)

and the CH2 of the ethyl carboxylate group (δ 60.69 ppm) have also been

assigned.

Artículo 2

189

The HMBC experiment to determine the quaternary carbons (Figure 1)

shows that H-2a (δ 4.47 ppm) and H-8 (δ 6.93 ppm) are correlated with the 13C at δ 140.67 ppm (C-8a). H-3 (δ 5.41 ppm) and H-6 (δ 7.96 ppm) peaks

are correlated with the signal at δ 138.46 (C-4a). In addition, both ester and

amide CO groups show very similar chemical shifts (δ 170.21 and δ 169.69

ppm). The signal at δ 4.12 ppm of the CH2 ethyl carboxylate group is

correlated with a peak at δ 170.21 ppm (CO ester group). Furthermore, a

corrrelation between the CH3 amide group (δ 2.59 ppm) and the 13C at δ

169.69 ppm indicates that this peak is the CO amide moiety.

Scheme 4. Detailed route leading to the intermediate regioisomer 6 from 2-aminopyridin-3-ol.

Scheme 4 shows two possible structures (6 and 12) that could be formed in

the cyclization reaction. In our case, we have only obtained 6, as

demonstrated by the 1H/13C HMBC study. This experiment corroborates that

H-3 (δ 5.41 ppm) is correlated with the 13C chemical shift of the amide group

(δ 169.69). This correlation confirms the proximity between these groups

and proves that 6 but not 12 is the obtained regioisomer.

Due to 6 is the intermediate of the final purines 11a-b, it is demonstrated

that the side chain links through the 3-position of the heterocycle, unlike

derivatives 3a-d, whose purine residue binds through its 2-position.

Nuclear Overhauser Spectroscopy experiments performed on compound

3c (X = Br, Y = H) shows the existence of a NOESY effect between H-2 and


190

H-8’ and within both multiplet hydrogen atoms CH2CH2N of the linear chain

and H-8’, A correlation with CH2N and the same hydrogen of the purine

skeleton H-8’ is observed, but no NOESY effects are noticed among H-3a

or H-3b and H-8’. These facts are compatible with a preferred

conformational arrangement in which the imidazole ring of the purine is

located below that of the benzoxazine moiety (Figure 2a).

Figure 2. Selected NOESY correlations for compound 3c.

Acknowledgements

This work was partially supported by the Junta de Andalucía (project no

CS2016.1).

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O

NSO O

H3aH3b

NN

H8'Ha

Hb O

NSO O

H3aH3b

NN

H8'

Ha

Hb

NN

NN

Br

Br

CH3 CH3

H2H2

a) b)

Artículo 2

191

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Artículo 3

Artículo 3

197

Abstract: The stereoselective synthesis of chiral amines is an appealing

task nowadays. In this context, biocatalysis plays a crucial role due to the

straightforward conversion of prochiral and racemic ketones into

enantiopure amines by means of a series of enzyme classes such as amine

dehydrogenases, imine reductases, reductive aminases and amine

transaminases. In particular, the stereoselective synthesis of 1,5-

benzoxathiepin-3-amines have attracted particular attention since they

possess remarkable biological profiles; however, their access through

catalysts

Article

Development of Biotransamination Reactionstowards the 3,4-Dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-amine EnantiomersDaniel González-Martínez 1, Nerea Fernández-Sáez 2, Carlos Cativiela 3, Joaquín M. Campos 2,4,*and Vicente Gotor-Fernández 1,*

1 Organic and Inorganic Chemistry Department, University of Oviedo, Avenida Julián Clavería 8,33006 Oviedo, Spain; [email protected]

2 Departamento de Química Farmacéutica y Orgánica, Facultad de Farmacia, c/Campus de Cartuja s/n,18071 Granada, Spain; [email protected]

3 Departamento de Química Orgánica, Instituto de Síntesis Química y Catálisis Homogénea (ISQCH),CSIC–Universidad de Zaragoza, 50009 Zaragoza, Spain; [email protected]

4 Instituto de Investigación Biosanitaria ibs.GRANADA, Complejo Hospitalario Universitario deGranada/Universidad de Granada, 18071 Granada, Spain

* Correspondence: [email protected] (J.M.C.); [email protected] (V.G.-F.);Tel.: +34-958-243-850 (J.M.C.); +34-985-103-454 (V.G.-F.)

Received: 7 September 2018; Accepted: 16 October 2018; Published: 19 October 2018!"#!$%&'(!!"#$%&'

Abstract: The stereoselective synthesis of chiral amines is an appealing task nowadays. In thiscontext, biocatalysis plays a crucial role due to the straightforward conversion of prochiral andracemic ketones into enantiopure amines by means of a series of enzyme classes such as aminedehydrogenases, imine reductases, reductive aminases and amine transaminases. In particular,the stereoselective synthesis of 1,5-benzoxathiepin-3-amines have attracted particular attentionsince they possess remarkable biological profiles; however, their access through biocatalyticmethods is unexplored. Amine transaminases are applied herein in the biotransamination of3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-one, finding suitable enzymes for accessing both target amineenantiomers in high conversion and enantiomeric excess values. Biotransamination experiments havebeen analysed, trying to optimise the reaction conditions in terms of enzyme loading, temperatureand reaction times.

Keywords: amine transaminases; asymmetric synthesis; benzoxathiepins; biocatalysis; biotransamination;stereoselective synthesis

1. Introduction

We have reported several (RS)-benzo-fused seven-membered rings with oxygen and sulfur atomsin 1,5 relative positions with interesting anti-proliferative activities against the MCF-7 cancer cell line.The most active compounds are 1 and 2 [1] (Figure 1). Other compounds, such as 3 [2] and 4 [3], exhibitedmore potent anti-ischemic effects than reference compounds, whilst 5 can be the prototype for the design ofmore potent anti-proliferative agents [4] (Figure 1). The (3R)-3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-aminecore appears in red in compounds 3–5 (Figure 1). Such a (3R)-amino-1,5-benzoxathiepin scaffold has beenobtained from L-cystine ((2R)-2-amino-3-[[(2R)-2-amino-2-carboxyethyl]disulfanyl]propanoic acid) [4,5].The incorporation of ↵-amino acids into heterocyclic structures is an effective strategy for generatingnumerous peptidomimetics and combinatorial library scaffolds.

Catalysts 2018, 8, 470; doi:10.3390/catal8100470 www.mdpi.com/journal/catalysts


198

biocatalytic methods is unexplored. Amine transaminases are applied

herein in the biotransamination of 3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-

one, finding suitable enzymes for accessing both target amine enantiomers

in high conversion and enantiomeric excess values. Biotransamination

experiments have been analysed, trying to optimise the reaction conditions

in terms of enzyme loading, temperature and reaction times.

Keywords: amine transaminases; asymmetric synthesis; benzoxathiepins;

biocatalysis; biotransamination; stereoselective synthesis

1. Introduction

We have reported several (RS)-benzo-fused seven-membered rings with

oxygen and sulfur atoms in 1,5 relative positions with interesting anti-

proliferative activities against the MCF-7 cancer cell line. The most active

compounds are 1 and 2 [1] (Figure 1). Other compounds, such as 3 [2] and

4 [3], exhibited more potent anti-ischemic effects than reference

compounds, whilst 5 can be the prototype for the design of more potent anti-

proliferative agents [4] (Figure 1). The (3R)-3,4-dihydro-2H-1,5-

benzoxathiepin-3-amine core appears in red in compounds 3–5 (Figure 1).

Such a (3R)-amino-1,5-benzoxathiepin scaffold has been obtained from L-

cystine ((2R)-2-amino-3-[[(2R)-2-amino-2-

carboxyethyl]disulfanyl]propanoic acid) [4,5]. The incorporation of �-amino

acids into heterocyclic structures is an effective strategy for generating

numerous peptidomimetics and combinatorial library scaffolds.

Artículo 3

199

Figure 1. Benzo-fused seven-membered rings with oxygen and sulphur atoms in 1,5 relative positions (1–5) with interesting biological properties [1–5]. The (3R)-3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-amine core appears in red in compounds 3–5.

Due to the fact that the primary amine is a key functional group in all areas

of chemistry, methods to generate molecules containing primary amine

groups are of intense interest and impact on many research fields. The use

of enzymes in organic synthesis has gained maturity in the last few

decades, since the advances in enzyme immobilisation, modification and

rational design allow for the application of improved biocatalysts for the

development of a wide variety of stereoselective transformations [6–10]. In

this context, the synthesis of chiral amines is particularly challenging, with

the conversion of prochiral ketones into optically active amines receiving

great attention in recent years [11–14] by using mainly imine reductases

[15–17] and amine transaminases (ATAs) [18–23]. Taking into account the

potential of ATAs in the single biotransamination of cyclic ketones [24–32],

even as part of multienzymatic sequences [33–38], but especially since they

have served as valuable biocatalysts in the production of pharmacologically

active products [39–43], we have focused herein our efforts in the pursuit of

an efficient biotransamination protocol for 3,4-dihydro-2H-1,5-

benzoxathiepin-3-one (6).


200

2. Results and Discussion

The synthesis of the benzo-fused seven-membered ketone 6 is depicted in

Scheme 1. 2-Mercaptophenol was alkylated with two equivalents of ethyl

bromoacetate in refluxing acetone in the presence of dry potassium

carbonate to give diester 7 (83%). Examination of the Dieckmann reaction

of 3 showed that the reaction occurred smoothly when sodium

ethoxide/ethanol was used as a base in dry tetrahydrofuran (THF) to give

ethyl 3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,5-benzothiepin-4-carboxylate 8 as the sole

cyclised product in 90% yield. Decarboxylation of the b-ketoester 4 in boiling

acetic acid containing aqueous sulfuric acid gave the 3,4-dihydro-2H-1,5-

benzothiepin-3-one (6, 60%). Regioselectivity of the Dieckmann cyclisation

was deduced based on the 1H-NMR (CDCl3) spectral data of the resulting

product 8, which exhibited two doublets (integrating each one for 1H) at d

4.88 and 4.59 ppm (J = 17.5 Hz) assignable to the geminal methylene

protons adjacent to the oxygen atom in the seven-membered ring.

Compounds 7 and 8 have not been described previously, whilst ketone 6

was reported formerly by Sugihara et al. [44].

Scheme 1. Chemical synthesis of 3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-one 6.

Artículo 3

201

Due to the amine transaminases catalytic mechanism, which involves two

pairs of ketones and amines in equilibrium, the reductive amination of the

substrate must be thermodynamically favoured in order to obtain high yields

of the desired product [45,46]. In order to displace the equilibrium towards

amine formation, the removal of the generated co-products by coupling

different multienzyme networks is often required [20], but also worth noting

is the use of sacrificial substrates, which normally range from the use of a

large excess of a commercially available amine donor, typically

isopropylamine [47], to “smart cosubstrates”, mainly diamines, in a

stoichiometric amount that are able to drive equilibrium by spontaneous

cyclisation or aromatisation reactions [31,48–50]. Promisingly, we have

found a favourable DG of ‒31.0 kJ/mol (calculated at M06-2X/6-

311++G(3df,2p) level; see Section 3.8) for the transamination of 6 to 9 when

using isopropylamine and acetone is formed as a by-product, probably due

to ring strain instability. Figure 2 shows the charge density of the optimised

geometry of the ketone 6, where steric and electronic differences between

the two substituents of the carbonyl group can be observed. This prompted

us to study the biocatalytic process in depth.

Figure 2. Optimised geometry of 3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-one (6): electronic isodensity contour (left); colour-mapped with the electrostatic potential (right), where red and blue zones are related to the electrophilic and nucleophilic zones of the molecule, respectively.

The biotransamination of 3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-one (6, 20

mM) was then studied in standard conditions previously employed in our


202

research group [46,51]. These settings include the use of a large excess of

isopropylamine as amine donor (1 M), pyridoxal 5’-phosphate (PLP, 1 mM)

as cofactor, a 100 mM phosphate buffer pH 7.5 with acetonitrile (5% v/v) as

cosolvent to favour the ketone solubility, at 30 °C and 250 rpm for 20 h

(Scheme 2). Three different types of enzymes were employed: (a)

lyophilised Escherichia coli cells containing overexpressed ATAs; (b)

commercially available ATAs from Codexis Inc.; (c) commercially available

ATAs from Enzymicals AG.

Scheme 2. Biotransamination of 3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-one (6) into amine 9, using ATAs.

Initially, for the biotransamination experiments made in house ATAs were

used, all of them overexpressed in Escherichia coli. Some of them, such as

the ones from Chromobacterium violaceum [52] or Arthrobacter species

[53], displayed very low activity (<5%), while others such as Arthrobacter

citreus [54] or the Arthrobacter species evolved variant named ArRmut11

[55] provided almost quantitative conversion but moderate (74% ee) or

negligible stereoselectivity, respectively. Trying to improve both activity and

selectivity values, commercially available ATAs were employed from two

different commercial sources (Codexis Inc. and Enzymicals AG).

To start with, 30 Codexis enzymes were employed (Table 1), and we found

that 19 of them led to the complete disappearance of the starting ketone.

Remarkably, four enzymes from this kit provided the desired amine 9 in

optical purities over 80% ee, the ATA-200 conducting to the (S)-9 (entry 8),

Artículo 3

203

while the TA-P1-B04, TA-P1-F03 and TA-P1-G05 gave access to its amine

antipode (entries 23, 24 and 26).

Table 1. Biotransamination of ketone 6 using Codexis ATAs.a

Entry Enzyme Conversion (%) b ee (%) c 1 ATA-7 <1 n.d. 2 ATA-13 30 n.d. 3 ATA-24 93 <1 4 ATA-25 96 <1 5 ATA-33 >99 <1 6 ATA-113 13 n.d. 7 ATA-117 2 n.d. 8 ATA-200 >99 85 (S) 9 ATA-217 6 n.d. 10 ATA-234 4 n.d. 11 ATA-237 >99 41 (S) 12 ATA-238 4 n.d. 13 ATA-251 >99 72 (S) 14 ATA-254 >99 56 (S) 15 ATA-256 >99 63 (S) 16 ATA-260 >99 79 (S) 17 ATA-301 >99 7 (S) 18 ATA-303 >99 <1 19 ATA-412 >99 55 (S) 20 ATA-415 >99 <1 21 TA-P1-A01 >99 62 (R) 22 TA-P1-A06 >99 50 (R) 23 TA-P1-B04 >99 82 (R) 24 TA-P1-F03 >99 90 (R) 25 TA-P1-F12 >99 28 (R) 26 TA-P1-G05 >99 93 (R) 27 TA-P1-G06 >99 67 (R) 28 TA-P2-A01 4 n.d. 29 TA-P2-A07 60 16 (S) 30 TA-P2-B01 99 19 (R)

a For reaction details, see Section 3.6. b Conversion values measured by GC analyses of the reaction crudes. c Enantiomeric excess (ee) of amine 9 determined by HPLC analyses after derivatisation of the reaction crude. These ee values were calculated for those reactions with conversions over 30% (n.d.: not determined).

Using the best found enzyme, TA-P1-G05 (entry 26, >99% conversion and

93% ee), the transamination of 6 was followed over time using two enzyme

loadings (90% and 45% w/w enzyme vs. ketone); we observed a very fast

conversion in the first 2 h and then a slower rate until complete depletion of

the substrate occurred, after 6 h or 24 h, respectively (Figure 3).


204

Figure 3. Study of the enzymatic transamination of ketone 6 with TA-P1-G05 over time employing: ( ) 90% of enzyme loading (w/w) or ( ) 45% of enzyme loading (w/w vs. 6).

Eight enzymes from Enzymicals AG were employed (Table 2), finding in

three cases an amine with over 90% ee (entries 3, 7 and 8). Interestingly,

the ATA08 from Silicibacter pomeroyi allowed the quantitative conversion

of the ketone into the amine (R)-9 (entry 7).

Table 2. Biotransamination of ketone 6 using Enzymicals AG ATAs.a

Entry Enzyme Conversion (%) b ee (%) c

1 ATA01 Aspergillus fumigatus 9 n.d. 2 ATA02 Gibberella zeae <1 n.d. 3 ATA03 Neosartorya fischeri 29 90 (S) 4 ATA04 Aspergillius oryza 2 n.d. 5 ATA05 Aspergillius terreus 8 n.d.

6 ATA06 Penicillium chrysogenum <1 n.d.

7 ATA07 Mycobacterium vanbaalenii 20 95 (S)

8 ATA08 Silicibacter pomeroyi >99 91 (R) a For reaction details, see Section 3.6. b Conversion values measured by GC analyses of the reaction crudes. c Enantiomeric excess of amine 9 determined by HPLC analyses after derivatisation of the reaction crude. These values were calculated for those reactions with conversions over 20% (n.d.: not determined).

In order to improve the conversion values towards the amine (S)-9 the

ATA03 Neosartorya fischeri (entry 3) and ATA07 Mycobacterium

vanbaalenii (entry 7) were selected for optimization studies. So, new

experiments were developed that includes the decrease of the substrate

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20

conv

ersi

on (%

)

t (h)

90% TA-P1-G05(w/w)

Artículo 3

205

concentration, the use of longer reaction times, higher temperatures and

enzyme loadings, and the performance of the biotransaminations without

an organic cosolvent (Table 3). Interestingly, the best results were found

when no cosolvent was employed, suggesting a deactivation of both

enzymes in the presence of even low amounts of the organic solvent

(MeCN, 5% v/v). In particular, the reduction of the substrate concentration

from 20 to 10 mM of ketone 6 allowed higher conversions, although this

limited its practical application. In addition, prolonged reaction times led to

better conversions, while the use of higher temperatures led to a significant

deactivation of the enzyme.

Table 3. Optimisation of the biotransamination of ketone 6 using selected enzymes.a

Entry Enzyme [6] (mM) Cosolvent b T (°C) t (h) c (%) c

1 ATA03 Neosartorya fischeri 20 MeCN (5%) 30 20 29 2 ATA03 Neosartorya fischeri 10 none 30 48 86

3 ATA07 Mycobacterium vanbaalenii 20 MeCN (5%) 30 20 20

4 ATA07 Mycobacterium vanbaalenii 10 none 30 20 73

5 ATA07 Mycobacterium vanbaalenii 20 none 45 48 43

6 d ATA07 Mycobacterium vanbaaleniid 20 none 30 65 91

a For reaction details, see Section 3.6. b Concentration values in v/v % indicated in brackets. c Conversion values measured by GC analyses of the reaction crudes. d Double the amount of enzyme was used (4 mg, 180% w/w).


206

Scheme 3. Scale-up of the biotransamination towards the (3R)-3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-amine (R-9).

Focusing on the scaling up of the biotransformations, we decided to move

to higher substrate concentrations (50 mM of ketone) in order to produce a

significant amount of the optically active amine (R)-9, which is a precursor

of organic molecules with interesting biological profiles [2–5]. In this case,

225 mg of 6 were used, selecting TA-P1-G05 (entry 26, Table 1) as the ideal

candidate since in standard conditions the amine (R)-9 was formed in

complete conversion and good selectivity (93% ee). The enzyme loading

was reduced from an initial 90% w/w enzyme vs. substrate ratio to 33% to

improve the economy of the process, and after 22 h quantitative conversion

was also achieved, maintaining the selectivity and isolating the desired

amine in 98% yield after a simple liquid‒liquid extraction protocol (Scheme

3). Measurement of the optical rotation for the pure amine and its

corresponding hydrochloride salt allowed us to unequivocally assign the

absolute configuration by comparison with previously reported data [4,5].

3. Materials and Methods

3.1. General Materials and Methods

2-Mercaptophenol, ethyl bromoacetate and sodium ethoxide were

purchased from Sigma-Aldrich, now Merck (Madrid, Spain). PLP as enzyme

cofactor, other chemical reagents and solvents were obtained with the

highest quality available from Sigma-Aldrich-Fluka (Steinheim, Germany).

Amine transaminases were obtained from Codexis Inc. (Redwood City, CA,

Artículo 3

207

USA) and Enzymicals AG (Greifswald, Germany). Transaminases from

Chromobacterium violaceum (2.1 U/mg), Arthrobacter citreus (0.9 U/mg),

Arthrobacter species (0.6 U/mg) and the evolved ArRmut11 were

overexpressed in E. coli and used as lyophilised cell lysates, as previously

reported [26,56].

Melting point of compound 6 was measured in an open capillary in an

Electrothermal digital melting point IA9200 apparatus (Cole-Parmer, Stone,

UK) and is uncorrected. Elemental analyses were performed on a Thermo

Scientific Flash 2000 analyzer (Thermo Flash & Carlo Erba Analyzers,

Pennsauken, NJ, USA) and the measured values were indicated with the

symbols of the elements or functions within ± 0.4% of the theoretical values.

NMR spectra were recorded on a Bruker AV300 MHz spectrometer (Bruker

Co., Faellanden, Switzerland). All chemical shifts (δ) are given in parts per

million (ppm) and referenced to the residual solvent signal as internal

standard. High-resolution mass spectroscopy (HRMS) was performed on a

VG AutoSpec Q high-resolution mass spectrometer (Fision Instrument,

Milford, MA, USA). Measurement of the optical rotation values was carried

out at 590 nm on an Autopol IV Automatic polarimeter (Rudolph Research

Analytical, Hackettstown, NJ, USA).

Gas chromatography (GC) analyses were performed for the determination

of conversion values using a Hewlett-Packard HP-6890 chromatograph

(Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA). A non-chiral HP-1 column (Agilent

Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA) was used with the following

temperature programme: 90 °C (2 min) then 10 °C/minutes and finally 180

°C (0 min). The reaction crudes were analysed, obtaining the following

retention times: 9.3 min for ketone 6 and 10.5 min for amine 9.

High-performance liquid chromatography (HPLC) analyses were performed

for enantiomeric excess value measurements using an Agilent 1260 Infinity

chromatograph with UV detector at 210 nm (Agilent Technologies, Inc.,


208

Wilmington, DE, USA). A Chiralpak IA (25 cm ´ 4.6 mm) was used as chiral

column at 30 °C (Chiral Technologies, Mainz, Germany), employing a

mixture of n-hexane/2-propanol (90:10) as eluent with a 0.8 mL/min flow.

The reaction crudes were derivatised as acetamides, obtaining the following

retention times: 11.2 min for the (R)-10 and 12.6 min for the (S)-10

enantiomer (Figure 4).

Figure 4. Structures of (R)- and (S)-10.

Thin-layer chromatography (TLC) analyses were conducted with Merck

Silica Gel 60 F254 precoated plates (Merck KGaA, Darmstadt, Germany).

They were visualised with UV and potassium permanganate stain. Column

chromatography purifications were performed using Merck Silica Gel 60

(230–400 mesh, Merck KGaA, Darmstadt, Germany).

3.2. General Procedure for the Synthesis of Ethyl 2-Ethoxycarbonylmethylthiophenoxyacetate (7)

A mixture of 2-mercaptophenol (1 g, 7.925 mmol), ethyl bromoacetate (1.93

mL, 17,4 mmol) and dry K2CO3 (3.3 g, 23.8 mmol) in anhydrous acetone

(20 mL) was added under argon atmosphere, and then stirred under reflux.

After 24 h the solvent was evaporated under reduced pressure and the

residue purified by column chromatography (EtOAc/n-hexane, 1:8),

obtaining 7 as a colourless syrup. Yield 83%. 1H NMR (300.13 MHz, CDCl3)

δ 7.43 (dd, JHH = 7.7, 1.7 Hz, 1H), 7.21 (td, JHH = 7.9, 1.7 Hz, 1H), 6.95 (td,

JHH = 7.5, 1.2 Hz, 1H), 6.76 (dd, JHH = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.26

(q, JHH = 7.1 Hz, 2H), 4.11 (q, JHH = 7.1 Hz, 2H), 3.72 (s, 2H), 1.28 (t, JHH =

7.1 Hz, 3H), 1.18 (t, JHH = 7.1 Hz, 3H) ppm. HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd.

Artículo 3

209

for C14H19O5S (M + H)+ 299.0953, found 299.0955. Anal. Calcd for

C14H18O5S: C, 56.36; H, 6.08; S, 10.75. Found: C, 56.45; H, 5.89; S, 10.55.

3.3. General Procedure for the Synthesis of Ethyl 3-Oxo-3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-4-carboxylate (8)

To a mixture of diester 7 (1.37 g, 4.59 mmol) in THF (40 mL) at 0 °C, a

solution of NaOEt (21% wt, 1.78 g, 5.51 mmol) in EtOH (2.06 mL) was

added. The mixture was stirred at 0 °C for 1 h and then refluxed for 15 h.

Solvent was evaporated under reduced pressure and the residue cooled to

0 °C, quenched first with water, and later with an aqueous HCl 6 M solution

up to pH 6. The mixture was extracted with EtOAc (2 × 40 mL) and the

organic fractions combined, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and the

solvent was removed under reduced pressure. Compound 8 was purified by

column chromatography (EtOAc/n-hexane, 1:7) as a colourless oil. Yield,

90%. 1H NMR (300.13 MHz, CDCl3) δ 7.22–7.12 (m, 1H), 7.08-6.85 (m, 3H),

4.88 (d, JHH = 17.5, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.59 (d, JHH = 17.5, 1H), 4.29–4.15

(m, 2H), 1.21 (td, JHH = 7.1, 1.4 Hz, 3H) ppm. HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd.

for C12H11O4S (M - H)+ 251.0378, found 251.0376. Anal. Calcd for

C12H12O4S: C, 57.13; H, 4.79; S, 12.71. Found: C, 56.99; H, 4.98; S, 12.72.

3.4. General Procedure for the Synthesis 3,4-Dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-one (6)

A mixture of keto ester 8 (2.5 g, 11.9 mmol), acetic acid (4.16 mL), H2SO4

concentrated (4.16 mL) and H2O (23.8 mL) was refluxed for 1 h. The

reaction was cooled to 0 °C, and water was added and extracted with

CH2Cl2 (2 × 40 mL). The organic fractions were combined, dried (anhydrous

Na2SO4), filtered and the solvent was removed under reduced pressure.

Compound 6 was purified by column chromatography (n-hexane and then,

EtOAc/n-hexane 0.5:10) as a white solid, mp 29–31 °C, literature 28–31 °C

[43]. Yield 60%. 1H NMR (300.13 MHz, CDCl3) δ 7.18 (dd, JHH = 8.0, 1.8 Hz,

1H), 7.14–7.07 (m, 1H), 7.01 (m, JHH = 8.1, 4.8, 1.5 Hz, 2H), 4.75 (s, OCH2,


210

2H), 3.93 (s, SCH2, 2H) ppm. HRMS (ESI-TOF) (m/z) calcd. for C9H9O2S

(M + H)+ 181.0323, found 181.0321.

3.5. General Procedure for the Biotransamination of 6 Using ATAs Overexpressed in Escherichia coli

The lyophilised cells of E. coli containing overexpressed transaminases (5

mg) were suspended in a 100 mM phosphate buffer pH 7.5 (475 µL)

containing PLP (1 mM) and 2-propylamine (1 M). Then, a stock solution of

ketone 6 in MeCN was added (25 µL of stock 0.4 M; final concentration 20

mM) and the mixture was shaken at 30 °C and 250 rpm for 20 h. After this

time, the reaction was quenched by adding an aqueous 10 M NaOH solution

(200 µL) and extracted with EtOAc (2 × 500 µL). The organic phases were

combined and dried over anhydrous Na2SO4. The reaction crudes were

analysed by GC to determine conversion values. Derivatisation were carried

out in situ using acetic anhydride and K2CO3 for the measurement of the

enantiomeric excesses through HPLC.

3.6. General Procedure for the Biotransamination of 6 Using Commercial ATAs

Transaminases from Codexis or Enzymicals AG (2 mg, 90% w/w) were

suspended in a 100 mM phosphate buffer pH 7.5 (475 µL) containing PLP

(1 mM) and 2-propylamine (1 M). Then, a stock solution of ketone 6 in

MeCN was added (25 µL of stock 0.4 M; final concentration 20 mM) and the

mixture was shaken at 30 °C and 250 rpm for 20 h. After this time, the

reaction was quenched by adding an aqueous 10 M NaOH solution (200

µL) and extracted with EtOAc (2 × 500 µL). The organic phases were

combined and dried over anhydrous Na2SO4. Reaction crude was analysed

by GC to determine conversion values and in situ derivatisation was carried

out using acetic anhydride and K2CO3 for the measurement of the

enantiomeric excesses by HPLC.

3.7. Preparative Biotransamination of 6 under Optimised Conditions

Artículo 3

211

Ketone 6 (225 mg, 1.25 mmol) was dissolved in MeCN (1.25 mL) and 100

mM phosphate buffer pH 7.5 (25 mL), containing PLP (0.5 mM) and 2-

propylamine (1 M), and the TA-P1-G05 (75 mg, 33% w/w) were

successively added. The mixture was shaken at 30 °C and 250 rpm for 22

h. The reaction was quenched by adding an aqueous NaOH 4 M solution (5

mL) and extracted with EtOAc (3 × 15 mL). The organic phases were

combined, dried over anhydrous Na2SO4, combined and the solvent

removed under reduced pressure, affording the (R)-9 amine (220 mg).

(3R)-3,4-Dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-amine (R)-9. Yield: 220 mg

(98%). 1H NMR (300.13 MHz, CDCl3): δ 7.37 (dd, JHH = 7.7, 1.7 Hz, 1H),

7.15 (ddd, JHH = 8.1, 7.3, 1.7 Hz, 1H), 7.02–6.92 (m, 2H), 4.12–4.08 (m,

2H), 3.50–3.42 (m, 1H), 3.18 (dd, JHH = 14.2, 3.2 Hz, 1H), 2.80 (dd, JHH =

14.2, 5.7 Hz, 1H), 1.89 (br s, 2H) ppm. For the free amine (R)-9 in 93% ee [α]%&' = +32.6 (c = 0.1, MeOH), and for the hydrochloride salt (R)-9.HCl in

93% ee [α]%&' = +41.2 (c = 0.1, MeOH); literature [α]%&' = +48.9 (c = 0.35,

MeOH) for the (R)-9.HCl in >99% ee [4].

3.8. Computational Methods

Calculations were performed using the Gaussian 09 package [57] at the

M06-2X/6-311++G(3df,2p) level [58]. Molecular geometries of the studied

compounds were optimised with tight convergence criteria and the

frequencies were computed in order to obtain the thermal correction to the

energy (298.15 K).

The molecular electrostatic potential of 3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-

3-one (6) was computed at M06-2X/6-311++G(3df,2p) level with tight SCF

procedure and generating the density and potential cubes to plot the

isodensity surface, colour-coded with the electrostatic potential.


212

4. Conclusions

The synthesis of the 3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-amine

enantiomers has been possible by means of the stereoselective

biotransamination of the 3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-one. A broad

panel of commercially available amine transaminases were employed,

finding after optimisation of parameters that affect the enzyme catalysis

suitable reaction conditions for the access to both amine antipodes in high

conversions and good selectivities. A scale-up experiment considering 50

mM substrate concentration was successfully achieved for the formation of

the (R)-3,4-dihydro-2H-1,5-benzoxathiepin-3-amine (R-9), a valuable

precursor of anti-proliferative agents.

Author Contributions: C.C, J.M.C. and V.G.-F. conceived the project; N.F-

S performed the experiments for the chemical synthesis of the starting

ketone; D.G.-M. performed the biotransamination experiments; D.G.-M.

carried out analytical measurements and analysed the data; C.C, J.M.C.

and V.G.-F. wrote the paper.

Funding: Financial support has been received from the Spanish Ministry of

Economy and Competitiveness (MINECO, Projects CTQ2013-40855-R and

CTQ2016-75752-R), Junta de Andalucía (Project CS2016.1) and Gobierno

de Aragon-FEDER (Research group E19_17R).

Acknowledgments: D.G.-M (Severo Ochoa predoctoral fellowship) thanks

the Asturian regional government for personal funding.

Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.

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V. CONCLUSIONES

Conclusiones

223

De manera general, en la presente Tesis Doctoral se han diseñado,

sintetizado y caracterizado tres familias de compuestos heterocíclicos y una

de análogos abiertos, con posible aplicación como agentes antitumorales.

Entre los derivados cíclicos se encuentran las familias de benzoxazinas,

quinolinas y piridoxazinas. Los análogos abiertos poseen diferentes

radicales en el grupo éster, habiéndose obtenido una serie con metilo y otra

con etilo.

Todas las moléculas se han ensayado frente a las líneas celulares de

adenocarcinoma de mama humano MCF-7, melanoma humano A375, y

cáncer colorrectal HCT-116. Se ha realizado un estudio de apoptosis con

el compuesto más activo.

También se ha llevado a cabo la síntesis de una benzoxatiepinona para

estudiar su aminación reductora enantioselectiva por transaminasas,

obteniéndose buenos rendimientos y una gran estereoselectividad.

En concreto, en el trabajo de investigación llevado a cabo en esta Tesis se

han obtenido las siguientes conclusiones:

1. Con la finalidad de encontrar nuevos agentes antitumorales, se ha

sintetizado una familia de benzoxazinas unidas a diferentes purinas

sustituidas con halógenos, 6-cloro, 2,6-dicloro, 6-bromo y 6-

trifluorometilpurina.

2. Se han obtenido derivados de quinolina unida por un enlace metilénico

a purinas halosustituidas (6-cloro, 2,6-dicloro, 6-bromo y 6-

trifluorometilpurina).


224

3. Dos compuestos con restos de piridoxazina unida a 6-cloro y 2,6-

dicloropurina, han sido sintetizados para comprobar el efecto sobre la

actividad antiproliferativa de la introducción de un átomo de nitrógeno en el

benceno fusionado al anillo oxazínico inicial.

4. Se han sintetizado ocho análogos abiertos, unidos a restos de purinas

sustituidas por halógenos (6-cloro, 2,6-dicloro, 6-bromo y 6-

trifluorometilpurina), para estudiar el papel del heterociclo en la actividad

anticancerígena.

5. Se ha evaluado su actividad antiproliferativa frente a tres líneas

tumorales, MCF-7, A375 y HCT-116, así como la inducción de la apoptosis

frente a la línea de cáncer de mama humano MCF-7.

6. De los compuestos ensayados con diferentes bases púricas, se deduce

que aquellos que incluyen la base 2,6-dicloropurina son los más activos.

Además, los análogos cíclicos mostraron mayor actividad que los abiertos,

destacando los derivados de quinolina.

7. Ha quedado demostrado que la distancia entre el heterociclo y el resto

de purina también influye en la actividad, existiendo una relación inversa

entre ellas, es decir, a mayor distancia menor actividad.

8. El compuesto 4c (3-((2,6-dicloro-9H-purina-9-il)metil-1-tosil-1,2,3,4-

tetrahidroquinolina) del artículo 1, ha resultado ser el más activo frente a

las líneas celulares ensayadas, con un valor de CE50 de 2.8 ± 0.31μM frente

a la línea HCT-116. Este derivado induce apoptosis a través de la activación

de las caspasas 3/7. Destaca también su baja citotoxicidad en las células

no cancerígenas.

9. Las estructuras han quedado inequívocamente determinadas por

estudios de resonancia magnética nuclear (RMN) tanto mono (1H, 13C,

Conclusiones

225

DEPT) como bidimensionales (HSQC, HMBC), espectrometría de masas

de alta resolución (HRMS) y análisis elemental.

10. Con objeto de obtener información sobre la disposición espacial de los

derivados heterocíclicos, se ha llevado a cabo un experimento

bidimensional NOESY sobre el compuesto 3c del artículo 2, siendo

compatibles los efectos NOESY encontrados con una conformación

preferida.

11. Los estudios bidimensionales HMBC han demostrado que la cadena

lateral de los derivados piridoxazínicos enlaza a través de la posición 3 del

heterociclo, a diferencia de sus isósteros benzoxazínicos.

12. Gracias a una biotransaminación estereoselectiva de la 3,4-dihidro-2H-

1,5-benzoxatiepin-3-ona, se han sintetizado diferentes aminas

enantioméricamente puras, empleando un amplio número de

transaminasas comerciales.

13. Una optimización de los parámetros que afectan a la reacción

enzimática, ha permitido obtener aminas estereoisómeras con altos

rendimientos y buena selectividad.

14. Se ha llevado a cabo con éxito un experimento de escalado para la

obtención de la amina (R)-9 del artículo 3, empleando una concentración

50 mM de la benzoxatiepinona y la transaminasa TA-PI-G05, lo que podría

ser útil para la obtención industrial de esta amina precursora de moléculas

biológicas con interesantes actividades antiproliferativas.

VI. PERSPECTIVAS FUTURAS

Perspectivas futuras

229

Esta investigación ha proporcionado nuevas moléculas con actividad

antitumoral, algunas de ellas con una interesante CE50, que nos han

permitido un mejor conocimiento de las relaciones estructura-actividad de

los compuestos obtenidos por el grupo, así como el desarrollo de nuevas

estrategias sintéticas. No obstante, presenta algunas limitaciones que

requieren futuras investigaciones:

a) Los compuestos obtenidos se han sintetizado como mezclas racémicas

y, teniendo en cuenta la importancia del uso de fármacos

enantioméricamente puros,dadas las diferentes actividades que pueden

presentar ambos estereoisómeros, se plantea el reto de cada uno de los

enantiómeros.

b) En los antecedentes del grupo se ha visto la importancia de un

sustituyente voluminoso en el nitrógeno del heterociclo benzofusionado,

por lo que la síntesis con sustituyentes como nosilo o fmoc, que han

demostrado ser una buena opción para aumentar la actividad, sería una

interesante aproximación para los derivados de tetrahidroquinolina.

c) Todos los compuestos sintetizados en este trabajo poseen halógenos

únicamente en el resto de purina. Sería interesante estudiar la influencia

sobre la actividad antitumoral de la introducción de sustituyentes electrón-

atrayentes en el otro sistema heterocíclico, tal y como muestran otras

estructuras del apartado 3 de la introducción.

d) Se han realizado estudios de actividad sobre líneas celulares

cancerígenas para determinar qué moléculas son activas así como su EC50,

pero aún se desconoce el mecanismo de acción y las dianas concretas de

los compuestos obtenidos en esta Tesis, por lo que serán necesarios


230

posteriores ensayos para determinar la vía de actuación de los derivados

más activos.

e) Los estudios computacionales representan una valiosa herramienta en

el campo de la Química Farmacéutica, por lo que los conocimientos

teóricos que aportarían estos estudios ayudarían a un mejor entendimiento

de las relaciones estructura-actividad.

A pesar de estas limitaciones, los resultados obtenidos en este trabajo

serán de gran ayuda para definir futuras líneas de investigación. La

continuación del trabajo con el tipo de estructuras descritas, junto con los

estudios para determinar las dianas terapéuticas mediante ensayos más

específicos y estudios computacionales, servirán para encontrar moléculas

no sólo más potentes, sino también más selectivas.

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