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EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES QUE CODIFICAN PARA
PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO HSP DE PLÁNTULAS DE ARROZ (Oryza
sativa) IRRADIADAS CON 60Co TOLERANTE, RESISTENTE Y SUSCEPTIBLE
AL ESTRÉS POR ALTAS TEMPERATURAS.
RODOLFO ELÍAS ARCE LOZANO
CINDY JOHANNA MARTINEZ SAAVEDRA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
2017
2
EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES QUE CODIFICAN PARA
PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO HSP DE PLÁNTULAS DE ARROZ (Oryza
sativa) IRRADIADAS CON 60Co TOLERANTE, RESISTENTE Y SUSCEPTIBLE
AL ESTRÉS POR ALTAS TEMPERATURAS.
RODOLFO ELÍAS ARCE LOZANO
CINDY JOHANNA MARTÍNEZ SAAVEDRA
Proyecto de Trabajo de Grado para optar al título de Licenciado en Química y
Licenciado en Biología
Dr. LUIS FRANCISCO BECERRA GALINDO
Licenciado en Biología. Msc. Ciencias Biológicas.
Director
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
2017
3
LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
No se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo, aquí expuesto
por sus autores, según el artículo 117 Acuerdo 029 que el Consejo Superior de la
Universidad Distrital Francisco José de Caldas expidió en Junio de 1988.
4
Nota de Aceptaciónmmm
_________________________
Jurado (Nombre/Firma)
_________________________
Director (Nombre/Firma)
Bogotá, Junio 2017
5
AGRADECIMIENTOS
Le damos gracias en primera instancia a Dios, por darnos la vida, la sabiduría, paciencia y
la oportunidad de recorrer este camino, donde aprendimos y crecimos a nivel personal y
profesional.
A nuestros padres y hermanos por su cariño, paciencia y apoyo incondicional en cada una
de las etapas de este proceso.
Agradecemos al profesor Francisco Becerra ¨Pacho¨ y Luis Armando Quevedo por darnos
la oportunidad de ingresar al grupo de investigación de Biología Molecular BIOMOL y
confiar en nuestro trabajo, por sus consejos y por compartir sus conocimientos cuando lo
requeríamos. A los integrantes de BIOMOL quienes nos apoyaron para culminar este
trabajo, de igual manera a los integrantes del almacén de biología por su apoyo
incondicional, en especial a Andrés Caballero.
A la Universidad Distrital que nos abrió las puertas para formarnos como Licenciados en
biología y química y permitirnos conocer grandes personas, amigos y profesores.
Agradecemos a cada una de las personas que nos acompañaron de una u otra manera en
este camino.
Gracias.
6
CONTENIDO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABLAS
LISTA DE GRÁFICAS
RESUMEN ………………………………………………………………………………..1
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 2
2. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA .............................................................................. 4
3. ANTECEDENTES ....................................................................................................... 5
4. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................... 10
5. HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 12
5.1. HIPÓTESIS DE VARIEDADES .............................................................................. 12
5.2. HIPÓTESIS DE TRATAMIENTOS ......................................................................... 12
6. OBJETIVOS ................................................................................................................... 13
6.1. OBJETIVO GENERAL .............................................................................................. 13
6.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 13
7. MARCO TEÓRICO ....................................................................................................... 14
7.1. GENERALIDADES DEL ARROZ........................................................................... 14
7.1.1. Clasificación taxonomía ..................................................................................... 14
7.1.2. Morfología del arroz .......................................................................................... 15
7.1.3. Crecimiento y desarrollo de la planta de arroz ................................................ 19
7.2. ESTRÉS POR FACTORES ABIÓTICOS ................................................................ 21
7.2.1. Estrés por altas temperaturas ............................................................................ 21
7.3. MEJORAMIENTO DEL ARROZ ............................................................................ 23
7.3.1. Fedearroz 473 .................................................................................................... 23
7.3.2. Fedearroz Mocarí .............................................................................................. 24
7.3.3. Línea Avanzada Lv 1645 .................................................................................... 24
7.4. PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO .................................................................. 24
7.4.1. Clasificación de las proteínas de choque térmico .............................................. 25
7.5. PCR EN TIEMPO REAL ........................................................................................ 37
7.5.1. Fases de una PCR .............................................................................................. 38
7.5.2. Cuantificación mediante PCR en tiempo real .................................................... 38
7.6. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON DODECIL
SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE) .............................................................................. 39
7.6.1. Preparación del gel de poliacrilamida con SDS ................................................ 39
8. METODOLOGÍA ........................................................................................................... 42
8.1. DELIMITACIÓN Y ÁREA DE ESTUDIO .............................................................. 42
7
8.2. PRE GERMINACIÓN .............................................................................................. 42
8.3. MEDIO DE CULTIVO YANG XIAO´ER ............................................................... 42
8.4. GERMINACIÓN ...................................................................................................... 43
8.5. ESTRÉS TÉRMICO .................................................................................................. 43
8.6. DISEÑO DE CEBADORES .................................................................................... 43
8.7. EXTRACCIÓN DE ARN .......................................................................................... 45
8.8. QRT- PCR ................................................................................................................. 45
8.9. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES ......................................................... 46
8.10. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL ..................................................... 47
8.10.1. Cuantificación por Bradford ............................................................................ 47
8.11. SDS-PAGE .............................................................................................................. 47
8.12. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO.......................................................................... 48
9. RESULTADOS Y ANÁLISIS ....................................................................................... 49
9.1. ESTANDARIZACIÓN DE PRIMER’S .................................................................... 49
9.1.1. Gen Hsp 16.9 ...................................................................................................... 49
9.1.2. Gen Hsp 18 ......................................................................................................... 50
9.1.3. Gen Hsp 26.7 ...................................................................................................... 50
9.2. TASA DE GERMINACIÓN ..................................................................................... 52
9.3. CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS .................................................................... 53
9.3.1. Características fenotípicas en el Tratamiento control (TC) .............................. 53
9.3.2. Características fenotípicas en el Tratamiento 1 (T1) ......................................... 56
9.3.3. Características fenotípicas en el Tratamiento 2 (T2) ......................................... 58
9.3.4. Crecimiento de las tres variedades en los tratamientos ..................................... 59
9.4. EXTRACCIÓN ARN ................................................................................................ 60
9.5. CURVA MELTING ................................................................................................. 61
9.6. CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA ........................................................................... 62
9.6.1. Gen HSP90 ......................................................................................................... 62
9.6.2. Gen Hsp70 .......................................................................................................... 71
9.6.2. Gen HSP26.7 ...................................................................................................... 79
9.6.4. Gen Hsp18 .......................................................................................................... 86
9.6.5. Gen Hsp16.9 ....................................................................................................... 96
9.8. CUANTIFICACIÓN RELATIVA .......................................................................... 104
9.9. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES POR VARIEDAD ................ 106
9.9.1. Variedad Fedearroz 473 ................................................................................... 106
9.9.2. Variedad Mocarí .............................................................................................. 108
9.9.3 Variedad Línea avanzada1645 .......................................................................... 109
9.10. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES ............................................. 110
9.10.1. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento Control ............................. 112
9.10.2. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento 1 ........................................ 112
9.10.3. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento 2 ........................................ 113
9.11. SDS-PAGE ............................................................................................................ 113
9.11.1. Geles SDS-Page Tratamiento Control (TC .................................................... 113
9.11.2. Geles de SDS-Page Tratamiento 1 (T1) ......................................................... 114
9.11.3. Geles de SDS-Page Tratamiento 2 (T2) ......................................................... 114
8
10. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO ........................................................................... 117
10.1. ANÁLISIS DE DISTRIBUCIÓN DE LOS DATOS ............................................ 118
10.2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DESCRIPTIVO ....................................................... 118
10.2.1. Histograma ..................................................................................................... 118
10.2.2. BoxPlot ........................................................................................................... 119
10.2.3. Pruebas de significación ................................................................................ 121
10.3. ANALISIS DE VARIANZA (ANOVA) ............................................................... 122
10.4. CORROBORACIÓN DE HIPÓTESIS ................................................................. 129
11. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 130
12. RECOMENDACIONES ............................................................................................ 132
13. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 133
14. ANEXOS ..................................................................................................................... 143
ANEXO 1. SECUENCIAS DE CADN Y PRIMER’S .................................................. 143
ANEXO 2. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN EN PLANTAS ................... 148
ANEXO 3. CUANTIFICACIÓN DE ADN ................................................................... 151
ANEXO 4. KIT PCR ...................................................................................................... 152
ANEXO 5. EXTRACCIÓN DE ARN EN PLANTAS ................................................. 153
ANEXO 6. KIT QRT-PCR ............................................................................................. 154
ANEXO 7. TINCIÓN CON AZUL DE COOMASIE. .................................................. 155
ANEXO 8. CUANTIFICACIÓN EXTRACCIONES DE ARN .................................... 156
ANEXO 9. TABLA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ......................................................... 156
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Morfología de la planta de arroz [23]..................................................................... 15
Figura 2. Morfología de los órganos vegetativos. a. raíz; b. tallo; c. hoja ......................... 17
Figura 3. Morfología de los órganos reproductores. a. panícula de arroz; b. espiguilla y c.
semilla .......................................................................................................................... 18
Figura 4. Fases de crecimiento y desarrollo de la planta de arroz ...................................... 20
Figura 5. Función de las proteínas de choque térmico en la célula. ................................... 25
Figura 6. Clasificación y organización de dominios de proteínas de la familia Hsp100 .... 26
Figura 7. Estructura de la proteína ClpB. ............................................................................ 27
Figura 8. Estructura de proteínas de la familia Hsp90. ....................................................... 29
Figura 9. ciclo ATPasa de Hsp90 ....................................................................................... 29
Figura 10. estructura lineal de proteínas de la familia Hsp70. ............................................ 31
Figura 11. Mecanismo de acción de la Hsp70, que es dependiente de ATP, y co-chaperonas
como Hsp40. ................................................................................................................. 32
Figura 12. a. estructura lineal de las proteínas de la familia Hsp60 .................................... 33
Figura 13. a. Estructura primaria de las proteínas del a familia sHsp ................................. 35
Figura 14. Mecanismo de accion de las proteinas de la familia sHsp. ................................ 36
Figura 15. Representación gráfica de las fases de PCR junto con el ciclo umbral CT ........ 38
Figura 16. Polimerización de poliacrilamida....................................................................... 41
Figura 17. a. electroforesis en gel discontinuo de poliacrilamida con SDS; b. luego de la
electroforesis las proteínas se visualizan con azul de coomassie. ................................ 41
Figura 18. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 16.9 en Gel Doc XR
System Bio Rad, amplificado por PCR. ...................................................................... 49
Figura 19. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 18 en Gel Doc XR System
Bio Rad, amplificado por PCR. . .................................................................................. 50
Figura 20. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 26.7 en Gel Doc XR
System Bio Rad, amplificado por PCR. 1: 57ºC; 2:57.6ºC; 3:58.2ºC; 4: 59.1ºC;
5:60.2ºC; 6:61,6ºC; 7:62.8ºC; Marcador Hyperlader IV (M); Actina (Ac). ................. 51
Figura 21. a) Amplificación de los primer’s por PCR, visualización en Gel Doc XR System
Bio Rad. 1) gen Hsp 16.9; 2) gen Hsp 18; 3) gen Hsp 26.7; 4) Marcador Hyperladder
IV; 5) gen Hsp 70; 6) gen Hsp 90. b) Marcador de peso molecular Hyperladder IV . 51
Figura 22. a. semillas sembradas en cajas de Petri; b. 40 semillas de cada variedad por caja;
c. brote de raíz en la semilla, d; germinación de la semilla. ......................................... 53
Figura 23. F473 TC E1 ........................................................................................................ 54
Figura 24. F473 TC E2 ........................................................................................................ 54
Figura 25. F473 TC E3 ........................................................................................................ 54
Figura 26. F473 irradiada TC E1 ......................................................................................... 54
Figura 27. F473 irradiada TC E2 ......................................................................................... 54
Figura 28. F473 irradiada TC E3 ......................................................................................... 54
Figura 29. Mocari TC E1 .................................................................................................... 55
10
Figura 30. Mocari TC E2 .................................................................................................... 55
Figura 31. Mocari TC E3 .................................................................................................... 55
Figura 32. Mocari irradiada TC E1 ..................................................................................... 55
Figura 33. Mocari irradiada TC E2 ..................................................................................... 55
Figura 34. Mocari irradiada TC E3...................................................................................... 55
Figura 35. Lv 1645 TC E1 ................................................................................................... 55
Figura 36. Lv 1645 TC E2 ................................................................................................... 55
Figura 37. Lv 1645 TC E3 ................................................................................................... 55
Figura 38. Lv 1645 irradiada TC E1 ................................................................................... 56
Figura 39. Lv 1645 irradiada TC E2 .................................................................................. 56
Figura 40. Lv 1645 irradiada TC E3 ................................................................................... 56
Figura 41. F473 irradiada T1 E1 ......................................................................................... 57
Figura 42. F473 irradiada T1 E2 ......................................................................................... 57
Figura 43. F473 irradiada T1 E3 ......................................................................................... 57
Figura 44. Mocari irradiada T1 E1 ...................................................................................... 57
Figura 45. Mocari irradiada T1 E2 ...................................................................................... 57
Figura 46. Mocari irradiada T1 E3 ...................................................................................... 57
Figura 47. Lv 1645 irradiada T1 E1 .................................................................................... 57
Figura 48. Lv 1645 irradiada T1 E2 .................................................................................... 57
Figura 49. Lv 1645 irradiada T1 E3 .................................................................................... 57
Figura 50. F473 irradiada T2 E1 ......................................................................................... 58
Figura 51. F473 irradiada T2 E2 ......................................................................................... 58
Figura 52. F473 irradiada T2 E3 ......................................................................................... 58
Figura 53. Mocari irradiada T2 E1 ...................................................................................... 58
Figura 54. Mocari irradiada T2 E2 ...................................................................................... 58
Figura 55. Mocari irradiada T2 E3 ...................................................................................... 58
Figura 56. Lv 1645 irradiada T2 E1 .................................................................................... 58
Figura 57. Lv 1645 irradiada T2 E2 .................................................................................... 58
Figura 58. Lv 1645 irradiada T2 E3 .................................................................................... 58
Figura 59. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-PAGE con tinción azul de Comassie.
.................................................................................................................................... 114
Figura 60. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-Page con tinción azul de Comassie.
.................................................................................................................................... 115
Figura 61. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-Page con tinción azul de Comassie.
.................................................................................................................................... 115
Figura 62. Conjunto de datos activos. ............................................................................... 118
Figura 63. ANOVA de Bloques relacionando. SQ (número de copias), Gen (Hsp90, Hsp70,
Hsp26.7, Hsp18 y Hsp16.9), Tratamiento (TC, T1 y T2) y las Variedades (F473,
MOCARÍ y Lv 1645). ................................................................................................ 122
11
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación taxonómica dela arroz...................................................................... 15
Tabla 2. Fases y etapas del desarrollo del arroz [17,19,20] ...................................................... 20
Tabla 3. Efecto de la temperatura en el desarrollo y crecimiento de la planta de arroz [5] .. 22
Tabla 4. Rango de separación de proteínas, según el porcentaje de acrilamida [81] ............. 40
Tabla 5. Composición nutricional para un litro de cultivo líquido r..Yang Xiao´er............ 42
Tabla 6. Condiciones de estrés térmico para cada uno de los tratamientos (TC, T1 y T2) . 43
Tabla 7. Secuencias de cebadores para los genes de interés realizados en Integrated DNA
Tecnologies (IDT). ....................................................................................................... 44
Tabla 8. Volúmenes para PCR para un tubo /muestra ......................................................... 44
Tabla 9. Programa PCR en tiempo real para Hsp70, Hsp90 y sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18,
Hsp26.7) ....................................................................................................................... 45
Tabla 10. Cronograma de extracción de ARN para un día .................................................. 45
Tabla 11. Volúmenes para qRT-PCR para un tubo /muestra .............................................. 46
Tabla 12. Programa PCR en tiempo real para Hsp70, Hsp90 y sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18,
Hsp26.7) ....................................................................................................................... 46
Tabla 13. Cronograma de extracción de proteínas totales para un día ............................... 47
Tabla 14. Concentraciones para la preparación de la curva de calibración con BSA y las
muestras [89] .................................................................................................................. 47
Tabla 15. SDS-PAGE 12.5% para proteínas de alto peso molecular .................................. 48
Tabla 16. Temperatura de anillamiento y pb para los primer’s de interés .......................... 52
Tabla 17. Porcentajes de germinación de las 3 variedades .................................................. 53
Tabla 18. Comparación del crecimiento de los genotipos F473, Mocarí, Lv 1645 control e
irradiadas, en las tres extracciones del tratamiento control. ......................................... 53
Tabla 19. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento control. Tomado
por: Autoría propia Arce R, Martínez C (2016). .......................................................... 54
Tabla 20. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento 1. Tomado por:
Autoría propia Arce R, Martínez C (2016). .................................................................. 57
Tabla 21. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento 2. Tomado por:
Autoría propia Arce R, Martínez C (2016). .................................................................. 58
Tabla 22. Comparación del crecimiento de los genotipos F473, M, Lv 1645 irradiadas, en
las tres extracciones del tratamiento TC, T1, T2. ......................................................... 59
Tabla 23. Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E1. ................. 64
Tabla 24. Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E2. ................. 66
Tabla 25. Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E3. ................. 68
Tabla 26. Concentración de Hsp70 en estándar y muestras problema en la E1 .................. 75
Tabla 28. Concentración de Hsp70 en estándar y muestras problema en la E3 .................. 77
Tabla 29. Concentración de Hsp26.7 en estándar y muestras problema en la E1 ............... 81
Tabla 30. Concentración de Hsp26.7 en estándar y muestras problema en la E2 ............... 83
Tabla 31. Concentración de Hsp26.7 en estándar y muestras problema en la E3 ............... 85
12
Tabla 32. Concentración de Hsp18 en estándar y muestras problema en la E1 .................. 90
Tabla 33. Concentración de Hsp18 en estándar y muestras problema en la E2 .................. 91
Tabla 34. Concentración de Hsp18 en estándar y muestras problema en la E3 .................. 93
Tabla 35. Concentración de Hsp16.9 en estándar y muestras problema en la E1 ............... 98
Tabla 36. Concentración de Hsp16.9 en estándar y muestras problema en la E2 ............. 100
Tabla 37. Concentración de Hsp16.9 en estándar y muestras problema en la E3 ............. 101
Tabla 38. Cuantificación relativa de cada uno de los genes usando actina como gen de
referencia .................................................................................................................... 104
Tabla 39. Absorbancia de la curva patrón y las muestras del Tratamiento Control (TC),
Tratamiento 1 (T1) y del Tratamiento 2 (T2) en las tres variedades Fedearroz 473
(F473), Mocarí y Línea Avanzada 1645 (Lv1645)..................................................... 110
Tabla 40. Pruebas de significación. Anderson-Darling ..................................................... 121
13
LISTA DE GRÁFICAS
Gráfica 1. Comparación del crecimiento foliar de F473, Mocarí y Lv 1645 en los tres
tratamientos. ................................................................................................................. 60
Gráfica 2. Cuantificación de una muestra de ARN de Lv 1645 ..................................... 60
Gráfica 3. Curva melting. a) Hsp90; b) Hsp70; c) Hsp26.7; d) Hsp18; e) Hsp16.9. ......... 61
Gráfica 4. a. curva de amplificación estándar de Hsp90; b. curva estándar de Hsp90...... 62
Gráfica 5. Expresion de Hsp90 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar ......................... 63
Gráfica 6. Expresion de Hsp90 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ........................ 65
Gráfica 7. Expresion de Hsp90 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ........................ 67
Gráfica 8. Comparación de la Expresión Hsp90 de las variedades en los tres tratamientos
...................................................................................................................................... 69
Gráfica 9. a. curva de amplificación estándar de Hsp70; ................................................... 71
Gráfica 10. Expresion de Hsp70 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ........................ 72
Gráfica 11. Expresion de Hsp70 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ........................ 74
Gráfica 12. Expresion de Hsp70 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ........................ 76
Gráfica 13. Comparación de la Expresión Hsp70 de las variedades en los tres tratamientos
...................................................................................................................................... 77
Gráfica 14. a. curva de amplificación estándar de Hsp70;b. curva estándar de Hsp70..... 79
Gráfica 15. Expresion de Hsp26,7 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ........................ 80
Gráfica 16. Expresion de Hsp26,7 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ........................ 82
Gráfica 17. Expresion de Hsp26,7 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ........................ 84
Gráfica 18. Comparación de la Expresión Hsp26.7 de las variedades en los tres tratamientos.
...................................................................................................................................... 86
Gráfica 19. a. curva de amplificación estándar de Hsp18; b. curva estándar de Hsp18..... 88
Gráfica 20. Expresion de Hsp18 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ....................... 89
Gráfica 21. Expresion de Hsp18 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ....................... 91
Gráfica 22. Expresion de Hsp18 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ....................... 93
14
Gráfica 23. Comparación de la Expresión Hsp18 de las variedades en los tres tratamientos.
...................................................................................................................................... 94
Gráfica 24. a. curva de amplificación estándar de Hsp16.9; b. curva estándar de Hsp16.9
...................................................................................................................................... 96
Gráfica 25. Expresion de Hsp16.9 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ....................... 97
Gráfica 26. Expresion de Hsp16.9 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ....................... 99
Gráfica 27. Expresion de Hsp16.9 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ..................... 101
Gráfica 28. Comparación de la Expresión Hsp16.9 de las variedades en los tres
tratamientos. ............................................................................................................... 102
Gráfica 29. Cuantificación relativa de los genes Hsp16,9, Hsp18, Hsp26,7, Hsp70 y
Hsp90 en las tres variedades. ...................................................................................... 105
Gráfica 30. Expresión de los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 en la
variedad F473 en el TC, T1 y T2................................................................................ 107
Gráfica 31. Expresión de los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 en la
variedad Mocarí en el TC, T1 y T2. ........................................................................... 109
Gráfica 32. Expresión de los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 en la
variedad Lv1645 en el TC, T1 y T2. .......................................................................... 110
Gráfica 33. Curva estándar por método de Bradford. ...................................................... 111
Gráfica 34. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento control TC relacionados
con la curva estándar. ................................................................................................. 112
Gráfica 35. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento 1 T1 relacionados con la
curva estándar. ............................................................................................................ 112
Gráfica 36. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento 2 T2 relacionados con la
curva estándar. ............................................................................................................ 113
Gráfica 37. Histograma de frecuencias contrastando el número de copias (SQ) con las
variedades F473, Lv 1645 y Mocarí. .......................................................................... 119
Gráfica 38. a. BoxPlot contrastando SQ vs VARIEDADES. b. BoxPlot contrastando SQ vs
TRATAMIENTOS. .................................................................................................... 120
Gráfica 39. BoxPlot Variedades F473, MOCARÍ y Lv1645 vs Número de Copias (SQ).
.................................................................................................................................... 123
Gráfica 40. BoxPlot Tratamientos TC (28 °C), T1 (35 °C) y T2 (42 °C) vs Número de
Copias (SQ). ............................................................................................................... 124
Gráfica 41. Básica de Diagnostico. 1. Residuos Frente a Ajustados. 2. Residuos tipificados
frente a cuantiles teórico. 3. Escala-posición: raíz de valor absoluto de residuo frente a
valores ajustados. 4. Residuos tipificados frente a palancaje. ................................... 127
Gráfica 42. Gráfica de efectos. Relación entre las medias de Variedad, Tratamiento y Gen.
.................................................................................................................................... 128
1
RESUMEN
Las plantas son organismos que se encuentran constantemente expuestos a diferentes tipos
de estrés abiótico alterando su desarrollo óptimo y por ende la productividad de los cultivos
se ve afectada. Debido al estrés generado por la variación de temperatura, las plantas han
desarrollado un grupo de proteínas conocidas como proteínas de choque térmico (HSP), que
actúan como chaperonas moleculares, ayudando a la planta en los procesos de plegamiento
adecuado de proteínas, transporte a través de membranas, modulación de la actividad proteica
y regulación de la degradación de proteínas, aportando de esta manera, tolerancia a la planta
frente al cambio constante de temperatura.
El presente trabajo evaluó la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque
térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7), Hsp70 y Hsp90 en variedades de arroz (Oryza
sativa): Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Línea avanzada Lv 1645 que han sido irradiadas
con una dosis de 60 Gy de 60Co en su primera generación. Para tal fin se realizaron cultivos
hidropónicos con medio Yang para cada una de las variedades; una vez alcanzaron el estadio
de plántula fueron sometidas a estrés térmico durante un día de 11:00 am a 3:10 pm de la
siguiente manera: un tratamiento control (TC) a una temperatura de 28°C, un tratamiento de
estrés moderado (T1) a 35°C y un tratamiento de estrés alto (T2) a 42°C. Durante cada
tratamiento se realizaron tres extracciones de ARN y proteínas totales para cada variedad en
tres momentos diferentes; la primera extracción se hizo a las 11:10 am, la segunda a la 1:10
pm y la última a las 3:10 pm
El ARN se cuantifico a través de Thermo Scientific NanoDrop 2000c UV-Vis
spectrophotometer, posteriormente se escogieron las muestras de mejores características para
el desarrollo del trabajo. Por medio de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
(q-RT-PCR) se hizo una cuantificación absoluta de los genes de interés; se cuantificaron las
proteínas totales por el método de Bradford, adicional a ello se realizaron geles de
poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) al 12.5%.
Como resultados se obtuvo que los tres genotipos F473, Mocarí Lv 1645 no presentan
diferencias significativas en el crecimiento de las plántulas durante las cuatro horas de
exposición al estrés térmico por altas temperaturas, por otro lado una dosis de 60 Gy de 60Co
genera alteraciones físicas en las variedades Mocarí y Lv 1645, a nivel de expresión de
proteínas de choque térmico (Hsp) en los tres genotipos, esta incrementa a medida que
aumenta la temperatura como mecanismo de protección de la plántula y la expresión de estos
genes está relacionada con la tolerancia a altas temperaturas, siendo Fedearroz 473 tolerante,
Mocarí resistente y Línea avanzada 1645 susceptible a altas temperaturas. A nivel proteico
se concluye que la proteínas que presenta mayor intensidad corresponde a 50 kDa, siendo
está correspondiente a proteínas glutelinicas que constituyen entre el 70 y 90% de proteínas
totales en arroz.
Palabras clave: proteínas de choque térmico, estrés térmico, Oryza sativa,
2
1. INTRODUCCIÓN
Durante los últimos siglos se ha observado una serie de cambios en las condiciones climáticas
generales del planeta, este fenómeno denominado "cambio climático global” ha sido de gran
importancia en estudios en el aumento en la temperatura del planeta, encontrándose que
durante los últimos 30 años la temperatura media del planeta ha aumentado entre 0,5°C a 3°C [1]. A su vez, diversos modelos predicen que en los próximos 50 años la temperatura global
del planeta podría incrementarse entre 1,3°C a 5,8°C comparado con tiempos pre-industriales [1]. Si bien este aumento global de la temperatura afectará a todos los ecosistemas del planeta,
se ha establecido que algunos de ellos serán más sensibles que otros a dichas modificaciones
climáticas [2].
Las plantas al estar expuesta a este estrés abiótico (altas temperaturas), han desarrollado
adaptaciones fisiológicas que le permiten un mejor rendimiento. Diversos estudios
demuestran que una de estas adaptaciones es la producción de proteínas de choque térmico
(HSP) las cuales son conservadas evolutivamente y el estímulo para la transcripción de estas
proteínas es un fenómeno común en todos los seres vivos. Sin embargo, un cambio de
temperatura significativo en un periodo de tiempo corto, disminuye las posibilidades de
adaptación de los seres vivos en especial de las plantas, por esta razón, el fitomejoramiento
juega un papel importante en la creación de distintas variedades de plantas que sean capaces
de soportar todo tipo de estrés abiótico.
En los resultados de diversas investigaciones, la Federación Nacional de Arroceros en
Colombia, FEDEARROZ, ha creado ciertas variedades de la especie Oryza Sativa, de las
cuales algunas son implementadas en distintas regiones de Colombia. FEDEARROZ 473,
FEDEARROZ Mocarí y Línea Avanzada (Lv 1645), son plantas que se utilizan actualmente
en Colombia. Debido a la geografía del país, existen territorios con temperaturas que superan
los valores de resistencia térmica teóricos para el desarrollo óptimo de la planta, lo cual no
afecta la producción del grano en estos cultivos; una de las razones es la expresión de las
proteínas de choque térmico que cumplen diversas funciones fisiológicas, como colaborar en
la adquisición de la estructura terciaria de las proteínas en formación, interviniendo en su
ensamble, translocación y secreción así como también en la degradación o reparación de
proteínas anormales o actuando como chaperonas moleculares.
Por tal razón, el propósito del proyecto de investigación fue evaluar la expresión de los genes
que codifican las proteínas de choque térmico sHSP’s (subunidades: Hsp16.9, Hsp18,
Hsp26.79), Hsp70 y Hsp90 en tres variedades de arroz (Oryza Sativa), Fedearroz 473,
Fedearroz Mocarí, Línea Avanzada Lv 1645 irradiadas con 60Co las cuales se desarrollaron
en cultivo hidropónico y fueron sometidas a diferentes tratamientos de estrés térmico por
altas temperaturas en el estadio de plántula con el fin de inducir la expresión de HSP y
empleando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) se realizó un
perfil analítico de la expresión de los genes que codifican para Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7,
3
Hsp70 y Hsp90, de igual manera se empleó geles de poliacrilamida con dodecilsulfto de
sodio (SDS-PAGE) para separar las proteínas expresadas durante el estrés de acuerdo a su
relación carga-masa. Como resultado la expresión de proteínas de choque térmico (Hsp) en
los tres genotipos incrementa a medida que aumenta la temperatura como mecanismo de
protección de la plántula y la expresión de estos genes está relacionada con la tolerancia a
altas temperaturas, siendo Fedearroz 473 tolerante, Mocarí resistente y Línea avanzada 1645
susceptible a altas temperaturas.
4
2. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Las plantas de arroz Oryza Sativa, es uno de los cultivos de mayor importancia a nivel
mundial después del trigo. Su importancia radica debido a que el arroz es el alimento básico
de más de la mitad de la población mundial, ya que su producción se extiende en más de 100
países en los continentes de Asia, América, Europa y África, lo que conlleva a que sea una
de las fuentes económicas de mayor importancia en el mundo.
El cultivo de arroz se concentra en Asia, principalmente en la China, donde se produce cerca
del 90% de la producción mundial. En Colombia se cultiva esta planta en 211 municipios
produciendo más de 1 millón de toneladas al año. El cultivo de arroz, requiere de unas
condiciones de temperatura, humedad, y nutrientes adecuados para una producción óptima.
No obstante, los cambios en el clima que se han generado en los últimos años, han provocado
aumento en la temperatura de hasta 5°C, alterando la temperatura óptima en cada una de las
fases de crecimiento de la planta haciendo que esta entre en un periodo de estrés, lo que
conlleva disminución y pérdidas en la producción del cultivo.
Diversos estudios han demostrado que los organismos vivos sintetizan un grupo de proteínas
como respuesta al estrés térmico conocidas como Proteínas de Choque Térmico (HSP), que
están relacionadas con la defensa frente a los efectos del estrés por alta temperatura siendo
muy conservadas evolutivamente.
De acuerdo a lo mencionado anteriormente, en este trabajo de grado se aborda la siguiente
pregunta de investigación:
¿Existen diferencias en la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque
térmico sHsp’s (Hsp16?9, Hsp18, Hsp26.7), Hsp70 y Hsp90 en variedades de arroz (Oryza
sativa) irradiadas con 60Co: Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Línea avanzada Lv 1645?
5
3. ANTECEDENTES
El presente trabajo toma como antecedentes los trabajos de grado y artículos internacionales
relacionados al estudio de las proteínas de choque térmico, bajo estrés abiótico. Dentro de
los cuales podemos citar:
En el año 2013, en Colombia, Cañate Olaya J y Novoa Sánchez C[3]. presentaron una
investigación en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas sobre la relación en la
respuesta al estrés térmico por calor en plántulas de arroz Oryza sativa de la línea avanzada
Lv 1645 y las variedades FEDEARROZ 473 y MOCARÍ con la expresión de los genes que
codifican para las proteínas de choque térmico HSP70 y HSP90, donde demostraron que
dichas proteínas tenían mayor expresión en el tratamiento utilizado a mayor temperatura 42
°C con todos los genotipos y en los otros dos tratamientos de 28 y 35 °C existió una menor
expresión de estos genes. También comprobaron que entre los tratamientos de menor
temperatura no se presentaron diferencias significativas en los niveles de expresión. Al ser
esta la primera investigación donde se comparan los niveles de expresión entre las proteínas
HSP70 y HSP90 en estrés calórico en Colombia los resultados se convierten en un primer
reporte de la expresión de esta proteína para el país, debido a que existen pocos estudios de
la HSP70 en Oryza sativa.
En el mismo año en el mes de julio se publicó en la revista “Cell Stress & Chaperones” el
trabajo realizado en la India por Sarkar, N. K., Kundnani, P., & Grover, A [4] titulado
“Functional analysis of Hsp70 superfamily proteins of rice (Oryza sativa)” en el cual se
identificó y caracterizó la funcionalidad de genes Hsp70 en el genoma del arroz, para
entender la red funcional de chaperonas. También, analizaron ADN mitocondrial de arroz
mHsp70 y se propone como supresor de calor y muerte celular programada, inducida por
H2O2 corroborando la información de Qi et al. 2011 [5,6]. Se identificaron 32 genes de dominio
Hsp70 en el genoma del arroz, que constituyen esta superfamilia, esto incluye 24 Hsp70 y 8
genes Hsp110. Por último se realizó un análisis de la expresión de Transcripción que reveló
que varias Hsp70 se rigen bajo diferentes condiciones de estrés y los genes se expresan
constitutivamente o es regulado por el desarrollo.
En este mismo año en el mes de septiembre el estudio realizado por Mulaudzi-Masuku, T.,
Mutepe, R. D., Mukhoro, O. C., Faro, A., & Ndimba, B., [7] en Sudáfrica, fue publicado en
la revista “Cell Stress & Chaperones” y describen la primera caracterización molecular
detallada de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70) en Sorghum bicolor, trabajo titulado
“Identification and characterization of a heat-inducible Hsp70 gene from Sorghum bicolor
which confers tolerance to thermal stress” en el cual, con el ADNc de longitud completa
realizaron un análisis de SbHsp70-1 que consta de 2524 pb con un marco de lectura abierto
de 1950 pb, y codifica una proteína de 649 aminoácidos. Los resultados muestran que la
expresión de SbHsp70-1 se induce a temperaturas de 37, 42, y 4 °C, además, la transcripción
6
SbHsp70-1 ARNm se expresa constitutivamente en hojas y el tallo, pero se incrementa
significativamente en choque térmico a 42 °C. Al choque de frío a 4 °C, el nivel de
transcripción de ARNm SbHsp70-1 aumentó en la hoja, pero no se observó ningún cambio
significativo en el tallo. La expresión de la pET28a-SbHsp70-1 en células de Escherichia
coli bajo el estrés por calor resultaron en su supervivencia incluso a temperatura más alta (65
°C). Los resultados de la investigación sugieren que SbHsp70-1 es una proteína inducible
por calor que confiere tolerancia térmica a las células bacterianas y puede ser un objetivo
prometedor para estudiar la tolerancia al estrés en los cultivos.
Con relación a las proteínas de choque térmico (HSP90) Chong, L. P., Wang, Y., Gad, N.,
Anderson, N., Shah, B., & Zhao, R [8]. publicaron en el mes de junio del año 2015 en la
revista “Journal of Experimental Botany” una investigación titulada “A highly charged
region in the middle domain of plant endoplasmic reticulum (ER)-localized heat-shock
protein 90 is required for resistance to tunicamycin or high calcium-induced ER stresses”
donde analizaron la secuencia de ER-localización en Arabidopsis de HSP90.7 y otras
proteínas ER Grp94 de plantas y animales, e identificaron una región corta, cargada,
específicamente presente en el dominio medio de proteínas Grp94 derivados de plantas. Para
entender el papel de esta región cargada, se analizaron en el estudio las plantas transgénicas
que expresan una proteína mutante, HSP90.7Δ22, que tenía esta región cargada eliminada
demostrando que las plántulas que expresan HSP90.7Δ22 habían mejorado significativamente
la sensibilidad al estrés inducida por tunicamicina o una alta concentración de calcio, aunque
su actividad chaperona en general es la prevención de la proteína modelo a partir de la
agregación inducida por calor no se vio afectada significativamente. También se analizó la
actividad de hidrólisis de ATP vinculante y de tipo salvaje y las proteínas mutantes HSP90.7,
en donde encontraron que tenían ligeramente diferentes afinidades de unión a ATP.
Finalmente, utilizando dos híbridos de levadura, se identificó un pequeño conjunto de
interactores HSP90.7 y se demostró que la región cargada no se requiere para la interacción
con el cliente candidato, aunque puede afectar su afinidad de unión, proporcionando así los
posibles objetivos para una mayor investigación HSP90.7 de funciones.
Por otra parte, en la investigación de Jie Z, Ailing L, Xinbo C, Xiaoyun Z, Guofu G, Wenfang
W & Zhang X., [9] publicada en el 2009 en la revista “Journal of Plant Physiology” titulada
“Expression analysis of nine rice heat shock protein genes under abiotic stresses and ABA
treatment” se realizaron perfiles de la expresión de nueve genes de arroz de proteínas de
choque térmico (OsHSPs) donde se analizaron por reacción en cadena de la polimerasa con
transcriptasa reversa semicuantitativa (RT-PCR) y los nueve genes exhibieron una expresión
distintiva en diferentes órganos. La expresión de nueve genes OsHSP se vio afectada
diferencialmente por estrés abiótico y el ácido abscísico (ABA). Todos los nueve genes
OsHSP fueron inducidos fuertemente por el tratamiento de choque térmico, mientras que
ninguno de ellos fue inducido por el frío. Las transcripciones de OsHSP80.2, OsHSP71.1 y
OsHSP23.7 se incrementaron durante el tratamiento de estrés salino. La expresión de genes
OsHSP80.2 y OsHSP24.1 se mejoraron con 10% de PEG. Sólo OsHSP71.1 fue inducido por
7
ABA mientras OsHSP24.1 fue suprimida por la ABA. Estas observaciones implican que los
nueve genes OsHSP pueden desempeñar diferentes funciones en desarrollo de la planta y las
respuestas de estrés abiótico. Los datos en la investigación sobre los nueve genes OsHSP
sugieren que OsHSPs se expresan bajo condiciones normales con preferencia de tejido;
OsHSPs expresión se mejora, en general bajo el estrés por calor y algunas HSPs pueden ser
inducida por estrés por sal y PEG; y ambas vías ABA-dependiente e -independiente pueden
existir en la transducción de señales de estrés para regular la expresión de HSP.
Teniendo en cuenta las investigaciones de HSPs de bajo peso molecular Chandel G, Dubey
M, Mena R [10]. En agosto del 2012 publican una investigación titulada “Differential
expression of heat shock proteins and heat stress transcription factor genes in rice exposed to
different levels of heat stress” en la revista “Journal of Plant Biohemistry and Biotecnology”
donde para dilucidar las diferencias genotípicas en arroz en respuesta al estrés de alta
temperatura, las plantas fueron expuestas a diferentes niveles de temperatura que varía de 37
°C a 48 °C. La expresión de los genes pertenecientes a Hsps y Hsf se analizó inicialmente
por microarray digital y más tarde por análisis semi-cuantitativa RT-PCR utilizando tejidos
de las hojas. Los genes que codifican para Hsps (OsHsp 16, OsHsp 17.7 y OsHsp 18), OsHsp
70, DnaK, OsHsp 100 y OsHsf A2a mostraron fuerte inducción al estrés por calor a diferentes
temperaturas. Los genotipos R-1389 RF-42 y Nagina22 (tolerante al calor) mostraron altos
niveles de expresión génica para la mayoría de los genes probados de hsp y Hsf demostrando
mejor forma de regulación que contribuyó a su mayor tolerancia al calor y superar el estrés.
El estudio de Xinhai C, Shoukai L, Qiulin L, Jian H, Wenfeng Z, Jun L, Yong fei W, Yuqin
K, Huaqin H y Ahmed A.[11,12], en relación con Proteínas de Choque Térmico de bajo peso
molecular publicada en el año 2014 en la revista “Biochimica et Biophysica ACTA” realizan
un estudio de Hsp26.7, Hsp23.2, Hsp17.9A, Hsp17.4 y Hsp16.9A con referencia a
Nipponbare durante las etapas de plántulas y etapas antesis en respuesta al estrés por calor.
Posteriormente, los niveles que expresan estas cinco sHsps en el cultivo de la variedad Co39
tolerante al calor, eran todos significativamente más altos. Esto indica que el nivel de
expresión de estos cinco sHsps se relaciona positivamente con la capacidad de las plantas de
arroz para evitar el estrés por calor. Por lo tanto, el nivel de expresión de estos cinco sHsps
puede considerarse como marcadores biológicos para el cribado de los cultivares de arroz
con diferentes habilidades para evitar el estrés por calor. Hsp18.1, Hsp17.9A, Hsp17.7 y
Hsp16.9A, en los tres cultivares de arroz bajo estrés por calor se encontró que estan
involucrados en un complejo de proteínas de Native-PAGE, y las interacciones de Hsp18.1
y Hsp 17.7, HSP18 0.1 y Hsp 17.9A y Hsp17.7 y Hsp16.9A fueron validados 2-hibridación
de la levadura. Con el ensayo Pull-down se confirmó la interacción entre Hsp17.7 y
Hsp16.9A en arroz bajo estrés por calor. La sobre regulación de los 5 genes sHsps es un paso
clave para el arroz de tolerar el estrés por calor, cuando las sHsps se ensamblan formando un
complejo de hetero-oligómeros. Además, a través de la interacción proteína-proteína,
Hsp101 regula la biosíntesis de tiamina, y Hsp82 interviene en el metabolismo del nitrógeno,
mientras que Hsp81-1esta involucrado en la síntesis de almidón en las plantas de arroz bajo
8
estrés por calor [13]. Los resultados de esta investigación proporcionan nueva información
sobre el mecanismo de regulación de sHsps en el arroz.
En noviembre del 2014 en la revista “PLoS ONE” fue publicada la investigación realizada
por Company, N., Nadal, A., Ruiz, C., & Pla, M [14]. titulada “Production of Phytotoxic
Cationic α-Helical Antimicrobial Peptides in Plant Cells Using Inducible Promoters”
demostrando que la producción de péptidos recombinantes fitotóxicos en plantas
transgénicas es posible gracias a la limitación estricta de la expresión transgénica de ciertos
tejidos y en diferentes condiciones, y principalmente en la minimización de esta expresión
durante la transformación y regeneración de las plantas transgénicas, lo cual es esencial para
obtener biofábricas vegetales viables. Sobre la base de todo el trancriptoma de datos
disponibles en línea, este estudio se identificó el promotor Os.hsp82 que fue altamente
inducida en respuesta a choque térmico. Con esta estrategia, se generaron líneas de arroz
transgénicas que producen rendimientos moderados de derivados gravemente fitotóxicos
BP100 sobre la exposición a altas temperaturas. Además, un umbral para la expresión génica
en tejidos y etapas seleccionadas se establece experimentalmente, por debajo del cual los
promotores correspondientes deben ser adecuados para la conducción de la expresión de
proteínas recombinantes en fitotóxicos plantas modificadas genéticamente. Se utilizaron
cuatro secuencias [AK063751.1 (Os.hsp82), X60820.1, AU165294 y AK071240
(Os.hsp18)] que codificadas proteínas de choque térmico que pertenecen a las familias de
Hsp90 (Os.hsp82) y Hsp pequeñas (sHsp). Específicamente, el gen Os.hsp18, que codifica a
Hsp18.0 citosólica de clase II, tenía muy alta expresión tras la inducción, aunque el análisis
de microarrays demostró que conserva algo de actividad en etapas y condiciones que son
fundamentales para la producción de plantas transgénicas de desarrollo. Os.hsp82 tenía
extremadamente baja expresión en tejidos de control y alcanzó altos niveles de expresión en
respuesta al calor, pero Os.hsp18 no fueron inducidos de manera significativa por otras
condiciones de estrés, tales como frío, NaCl y la sequía. Hemos producido péptidos
antimicrobianos a-helicoidales fitotóxicos derivados de BP100 en las plantas sobre la base
de una estricta regulación de la transcripción del transgén.
En el estudio de Kaur, H., Petla, B. P., Kamble, N. U., Singh, A., Rao, V., Salvi, P., Majee,
M. [15] en el 2015 titulado “Differentially expressed seed aging responsive heat shock protein
OsHSP18.2 implicates in seed vigor, longevity and improves germination and seedling
establishment under abiotic stress” publicado en la revista Frontiers in Plant Science reveló
que OsHSP18.2,es una HSP de clase II citosólica, es una proteína sensible en el
envejecimiento, su abundancia aumentó significativamente después del envejecimiento
artificial en semillas de arroz. En la transcripción de OsHSP18.2 se encontró un aumento
marcado en la etapa de maduración tardía al ser muy abundante en semillas secas y disminuyó
considerablemente después de la germinación. En un estudio bioquímico quedó demostrado
que la forma de OsHSP18.2 es un complejo homooligomérico y es de naturaleza
dodecamerica al igual que funciona como una chaperóna molecular. Por otra parte,
OsHSP18.2 mostró actividad de chaperona, ya que era eficaz en la prevención de la
inactivación térmica de Citrato sintasa. Además, para analizar la función de esta proteína en
9
la fisiología de la semilla, se generaron líneas de sobreexpresión específicos en Arabidopsis
de semillas para OsHSP18.2. El análisis funcional demostró que OsHSP18.2 tiene capacidad
para mejorar vigor de la semilla y la longevidad mediante la reducción de la acumulación de
ROS nocivo en las semillas. Además, las semillas de Arabidopsis transformadas también
mostraron un mejor rendimiento en la germinación y emergencia de cotiledón bajo
condiciones adversas. Por último el estudio demuestra que OsHSP18.2 es una proteína
sensible al envejecimiento que funciona como una chaperona molecular y, posiblemente,
protege y estabiliza las proteínas celulares del daño irreversible en particular durante la
maduración de secado, desecación y el envejecimiento en las semillas mediante la restricción
de la acumulación de ROS y por lo tanto mejora el vigor de la semilla, la longevidad y el
establecimiento de plántulas.
Por ultimo, en la investigación titulada “Rice sHsp genes: genomic organization and
expression profiling under stress and development” de Sarkar, N. K., Kim, Y.-K., & Grover,
A [16]. En el 2009 se publicó en la revista BMC Genomics un análisis de todo el genoma del
arroz para examinar la respuesta de estrés HT de estos genes, los microarrays de tejidos de
hojas de arroz se llevaron a cabo apoyado por el análisis RT-PCR de 20 genes. Los resultados
muestran la complejidad y diversidad de la familia de genes sHsp de arroz a nivel estructural
y de expresión. Se encontraron tres genes sHsp núcleo-citoplasma que sólo se encuentran en
las monocotiledóneas y en un análisis de los perfiles de expresión de genes sHsp reveló que
estos genes se expresan diferencialmente bajo estrés y en diferentes etapas en el ciclo de vida
de la planta de arroz. Por lo tanto, se muestra que sHsps pueden estar involucrados en las
funciones celulares en condiciones de no estrés y estrés, así como durante los procesos de
desarrollo y tienen diferente patrón de expresión dependiendo del órgano, tejido y etapa de
desarrollo, son importantes en la coordinación de la respuesta global de choque térmico.
Hasta el momento solamente se encuentra un trabajo con relación a la expresión de proteínas
de choque térmico Hsp70 y 90 en Colombia, pero no se ha registrado ningún trabajo a nivel
molecular de la evaluación de expresión de los genes que codifican las proteínas de choque
térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7), Hsp70 y Hsp90 en variedades de arroz (Oryza
sativa): Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Línea avanzada Lv 1645 que han sido irradiadas
con 60Co.
10
4. JUSTIFICACIÓN
Los enormes avances logrados en la investigación científica en el área de la Genética
Molecular durante las últimas décadas han posibilitado progresos trascendentales en la
aplicación de las tecnologías biológicas en el área productiva. El objetivo de las
investigaciones en Genética Molecular, actualmente se centra en usar estos conocimientos
para el desarrollo de una metodología técnica y económicamente competitiva, que a través
del uso inteligente y respetuoso de los sistemas vivientes y los organismos, facilite la
resolución de importantes problemas productivos y sociales. Los profesionales que trabajan
con este tipo de sistemas biológicos deben conocer profundamente las problemáticas que
estos sistemas presentan y consecuentemente, estar preparados para contribuir a la solución
de las mismas. Por lo tanto, deben adquirir herramientas que les permitan profundizar,
complementar y actualizar conocimientos y habilidades que completen su formación
profesional, en el área de la Genética Molecular. En la biología hay áreas especializadas en
el estudio de los organismos vegetales, que junto a la química se encargan de realizar
investigaciones con miras al mejoramiento de cultivos y cosechas, con el fin de lograr una
óptima producción de las especies y un mejoramiento en cuanto a su resistencia a los agentes
externos, tales como la temperatura, salinidad, humedad, metales pesados, entre otros.
La expresión de proteínas en especial de choque térmico (HSP) está determinada por diversos
factores que afectan el metabolismo de la planta, en particular por estrés térmico. Las plantas
de arroz son una de las principales fuentes alimenticias de la población mundial, y están
siendo afectadas por el calentamiento global, razón por la cual resulta relevante establecer la
expresión de los genes que codifican estas proteínas, lo anterior se enmarca en la rama de la
Genética Molecular.
Con éste proyecto de investigación, se busca ampliar el conocimiento sobre la expresión de
los genes que codifican las proteínas de choque térmico (HSP) en tres variedades Fedearroz
473, Fedearroz Mocarí, Lv 1645 de Oryza Sativa; la información obtenida con los datos
cuantitativos que se adquieran realizando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo
real (qRT-PCR) y electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfto de sodio (SDS-
PAGE) permitirán evaluar la expresión de los genes que codifican las proteínas HSP de la
planta durante la inducción del estrés térmico, con el fin de entender la relación temperatura-
HSP en el estadio de plántula, lo cual ampliará la información molecular de la expresión de
estas proteínas; además, éste proyecto también permitirá conocer las condiciones de
temperatura necesarias para la producción de HSP y por ende las adaptaciones moleculares
de las plantas de arroz en respuesta al calentamiento global; el conocimiento que se obtenga,
sobre las proteínas HSP sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90, permitirá su
posterior utilización, por parte de otros estudiantes de la Universidad Distrital Francisco José
de Caldas o de otras entidades, como material de referencia, consulta para otros estudios
moleculares, biotecnológicos o ecológicos, que estén involucrados en la producción de las
11
proteínas de choque térmico; la información, también podrá ser utilizada como material
pedagógico y didáctico, con fines informativos, sobre las adaptaciones de las plantas en
respuesta al calentamiento global.
12
5. HIPÓTESIS
5.1. HIPÓTESIS DE VARIEDADES
Hipótesis nula (H0): el estrés por alta temperatura no genera diferencias en la expresión de
genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7)
Hsp70 y Hsp 90 en las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 irradiadas
con 60Co.
Hipótesis alterna (H1): el estrés por alta temperatura si genera diferencias en la expresión de
genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7)
Hsp70 y Hsp 90 en las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 irradiadas
con 60Co.
5.2. HIPÓTESIS DE TRATAMIENTOS
Hipótesis nula (H0): las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 no presentan
diferencias significativas en la expresión de genes que codifican las proteínas de choque
térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en los diferentes tratamientos
(TC, T1 y T2).
Hipótesis alterna (H1): las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 si
presentan diferencias significativas en la expresión de genes que codifican las proteínas de
choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en los diferentes
tratamientos (TC, T1 y T2).
13
6. OBJETIVOS
6.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s
(Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 yHsp90 de tres variedades Fedearroz 473, Mocarí, Lv
1645 irradiadas con 60Co de Oryza Sativa, mediante qRT-PCR y SDS-PAGE.
6.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Germinar semillas de arroz Oryza Sativa de las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí,
Lv 1645 irradiadas con 60Co, mediante cultivo hidropónico.
Inducir a estrés térmico las plántulas de arroz Oryza Sativa de las variedades Fedearroz 473,
Fedearroz Mocarí, Lv 1645 irradiadas con 60Co.
Evaluar la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s
(Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp90 de plántulas de arroz Oryza Sativa de las
variedades Fedearrodz 473, Fedearroz Mocarí, Lv 1645 irradiadas con 60Co a través de qRT-
PCR y SDS-PAGE.
Analizar la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s
(Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 yHsp90 de plántulas de arroz Oryza Sativa de las
variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí, Lv 1645 irradiadas con 60Co con los resultados
obtenidos con qRT-PCR y SDS-PAGE y los antecedentes bibliográficos.
14
7. MARCO TEÓRICO
7.1. GENERALIDADES DEL ARROZ
El origen del arroz se ubica en el continente asiático, donde comenzó a cultivarse
aproximadamente hace 10.000 años principalmente al sur de la India, de allí se extendió a
China, y posteriormente se estableció en Corea y Japón [17], probablemente hubo varias rutas
por las cuales se introdujo el arroz desde Asia a otras partes del mundo.
El género Oryza tiene más de 24 especies silvestres que crecen en regiones inundadas, semi-
sombreadas y bosques en el sureste Asiático, Austria, África, Sur y Centro América [18]
siendo la especie Oryza sativa L. la de mayor importancia económica en el mundo; dentro
de esta especie se presentan dos grupos: Índica y Japónica consideradas razas eco
geográficas. Estos grupos mantienen características particulares diferenciadas en cuanto a
porte o altura de plantas, coloración del follaje, tipo de macollamiento, tipo de grano,
tendencia al desgrane y sensibilidad al fotoperiodo [17].
El tipo Índica, se cultiva en los climas tropicales, pero también prospera en condiciones
climáticas templadas, representando así la mayor parte de la producción mundial de arroz y
es la que se utiliza actualmente en todo el territorio colombiano. Este grupo se caracteriza
por presentar mayor altura que otras variedades, macollamiento denso, hojas largas e
inclinadas de color verde pálido y grano de tamaño mediano a largo [19]. Debido al alto
contenido de amilosa, le da un aspecto blando y seco al grano, haciéndolo poco apto para la
desintegración en la cocción [19]. En torno a ellas, los trabajos de mejoramiento genético han
dado lugar a la producción de variedades de porte bajo, con excelente capacidad de
macollamiento y altos rendimientos [19,20].
El tipo Japónica, se cultiva y se consume sobre todo en zonas climáticas templadas y
tropicales de tierras altas, en Australia, China, Taiwán, la República Democrática de Corea,
la Unión Europea, Japón, Rusia, Turquía y los Estados Unidos (Estado de California). Está,
se distingue de la índica, por tener hojas erectas de color verde intenso, y una capacidad de
macollamiento menor que las de tipo índica, sus granos son cortos y anchos y su contenido
bajo de amilosa lo hace susceptible a la desintegración durante la cocción [19,20].
7.1.1. Clasificación taxonomía
En cuanto a la taxonomía (tabla 1), el arroz es una fanerógama, clasificada como especies
del grupo Oryza sativa [17,21]
15
Tabla 1. Clasificación taxonómica dela arroz
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
División Magnoliophyta
Clase Monocotiledóneas
Orden Poales
Familia Poaceas
Tribu Oryzeae
Genero Oryza
Especie Oryza Sativa L
Grupos Indica, Japonica
7.1.2. Morfología del arroz
El arroz es una gramínea anual, de tallos redondos y huecos compuestos por nudos y
entrenudos, hojas de lámina plana unidas al tallo por la vaina y su inflorescencia es en
panícula. El tamaño de la planta varía de 0.4 m (enanas) hasta más de 7.0 m (flotantes) [20].
Los órganos de la planta se dividen en dos grupos (figura 1): órganos vegetativos (raíz, hoja
y tallos), y órganos reproductivos (flor y semillas) [21,22].
Figura 1. Morfología de la planta de arroz. Recuperado de: Ávila L, (2010). Identificación
de genes que se expresan en la lámina foliar de plantas de arroz (Oryza sativa) [23].
16
7.1.2.1. Órganos vegetativos
Raíz
Las raíces son delgadas, fibrosas, y fasciculadas [21], durante su desarrollo la planta de arroz
comprende dos tipos de raíces (figura 2a): las seminales (temporales) y las adventicias o
principales (permanentes).
Las raíces seminales, temporales o primarias se originan en la radícula, viven un corto tiempo
después de la germinación y son reemplazadas por las raíces adventicias [22]. Las raíces
adventicias, secundarias o permanentes se forman a partir de los nudos inferiores del tallo
joven. En los estadios iniciales de crecimiento estas raíces son blancas, cortas y gruesas; a
medida que la planta crece las raíces se alargan, se adelgazan y se ramifican en abundancia [17,21].
Las puntas de las raíces están protegidas por una masa de células, llamada coleorriza, para
facilitar la penetración de la raíz en el suelo. La forma y el desarrollo de las raíces del arroz
dependen del medio de cultivo y el nivel de nitrógeno en el suelo. Cuando los suelos están
inundados la parte externa de las raíces toma una coloración amarillo rojiza, debido a la
presencia de compuestos férricos; en los suelos aireados las raíces conservan su coloración
blanca [17,19] cuando las raíces son de color negro es debido a una alta concentración de
sulfuros en el suelo.
Tallo
El tallo de arroz se forma de nudos y entrenudos alternados (figura 2b). El tallo de una planta
de arroz, en sus inicios, es una estructura muy corta (mucho menos de 1 cm) y subterránea
donde se encuentran bien diferenciados los nudos, en secuencia alterna con los entrenudos
que más tarde se alargan. En cada nudo se forma una hoja y una yema; este último puede
desarrollarse dando lugar a una macolla o hijo [19] Las macollas primarias emergen
sucesivamente del primero, segundo y de los demás nudos que siguen al nudo principal del
tallo; las macollas secundarias nacen del segundo nudo de cada hijo primario; y las macollas
terciarias, nacen del segundo nudo de cada macolla primaria. Entre los 50 y 55 días, el tallo
deja de ser subterráneo, al iniciar su proceso de alargamiento, para convertirse en una
estructura hueca y cilíndrica, donde los entrenudos basales se conservan muy cortos y los
superiores se alargan sobre los 10 o 15 centímetros [17].
El número total de macollas por planta es una característica del genotipo y se encuentra
influenciada por el sistema de siembra, la nutrición y el clima [17,19].
17
Hoja
Las hojas se distribuyen en forma alterna a un lado y otro a lo largo del tallo, son
envainadoras, con el limbo lineal, agudo, largo y plano La primera hoja que aparece en un
nudo basal del tallo principal se denomina profilo el cual no tiene lámina y está constituido
por dos brácteas aquilladas. En cada nudo, con excepción del nudo de la panícula, se
desarrolla una hoja. La última hoja que nace en el tallo debajo de la panícula es llamada hoja
bandera [22].
En el máximo desarrollo del estado de plántula el arroz muestra seis hojas, de las cuales tres
están completamente formadas, dos en proceso de crecimiento y una muerta [17]. En una hoja
completa se distinguen las siguientes partes (figura 2c): la vaina, el cuello y la lámina.
La vaina o base de la hoja, sale de un nudo y envuelve el entrenudo superior llegando en
algunos casos hasta el nudo siguiente. Es generalmente glabra y puede tener pigmentos de
antocianinas en su base o en sectores de la superficie. El pulvínulo de la vaina es una
protuberancia situada encima del punto de unión de la vaina con el tallo, en algunos casos es
confundido con el nudo [17,19]
Figura 2. Morfología de los órganos vegetativos. a. raíz; b. tallo; c. hoja. Recuperado y
modificado de: http://www7.uc.cl/sw_educ/cultivos/cereales/arroz.htm [24]]
La vaina y la lámina se unen en un punto intermedio llamado cuello, en el cual se distinguen
la lígula y las aurículas que en la plántula de arroz sirven para distinguirlas de algunas
malezas comunes [17,21]. La lígula es una estructura triangular apergaminada o membranosa
situada en el interior del cuello y contigua a la vaina, que difiere en tamaño, color y forma
según la variedad de arroz [19]. Las aurículas son dos apéndices del cuello que tienen forma
de hoz y abrazan el tallo; en su parte convexa tienen un tejido en forma de dientes pequeños [19].
18
7.1.2.2. Órganos reproductores
Flor
Las flores (figura 3a) de arroz están reunidas en una inflorescencia compuesta llamada
panícula, está situada sobre el nudo apical del tallo, llamado nudo ciliar [20]. La panícula
consta de un eje principal, cuya parte superior corresponde al raquis y la inferior al pedúnculo
o cuello, el cual se encuentra más o menos cubierto por la hoja bandera. Sobre el raquis se
forman ramificaciones (primarias, secundarias y hasta terciarias), que finalmente rematan en
el pedicelo (ramificación terminal) y sobre éste se desarrollan las espiguillas, conformada
por tres estratos de piezas florales, de los cuales el más importante es el de las glumas fértiles,
denominadas lemma y pálea; estructuras que en definitiva van a conformar la cáscara del
grano [17,19].
Las flores comprenden seis estambres y un pistilo. Los estambres son filamentos delgados
que sostienen las anteras que son alargadas y bífidas y contienen los granos de polen; en el
pistilo se distinguen el ovario que es de cavidad simple y contiene un solo ovulo; el estilo es
corto y termina en un doble estigma plumoso, que presenta diferentes colores según la
variedad de arroz: puede ser blanco, verde pálido, amarillo, purpura pálido o purpura [19,20].
Los lodículos son dos protuberancias redondeadas y transparentes que se encuentran en la
base de la flor, al lado de la palea. Durante la antesis los lodículos se ponen turgentes logrando
que la lemma y la palea se separen, simultáneamente se alargan los estambres y las anteras
emergen. La dehiscencia de las anteras puede efectuarse antes o al mismo tiempo en que se
abren las lemmas, mostrando tendencia a la cleistogamia. Después de que las anteras hayan
derramado el polen las lemmas se cierran [17,19,20]. A diferencia del maíz, las flores del arroz
tienen los dos sexos en la misma flor.
Figura 3. Morfología de los órganos reproductores. a. panícula de arroz; b. espiguilla y c.
semilla. Recuperado y modificado de:
http://www7.uc.cl/sw_educ/cultivos/cereales/arroz.htm [24]
19
Semillas
La semilla de arroz corresponde a un ovario maduro, seco e indehiscente, que consta de las
siguientes partes (figura 3c):
La cascara formada por la lema, la palea y las partes asociadas a estas dos estructuras.
Las lemas estériles, la raquilla, la arista y el embrión que está situado en el lado ventral
de la semilla, cerca de la lemma.
El endospermo, que provee alimento durante la germinación.
Debajo de la lemma y la palea hay tres capas de células que constituyen el pericarpio; debajo
de éstas se encuentran dos capas, el tegumento y la aleurona [21]. El embrión consta de la
plúmula u hojas embrionarias y la radícula o raíz embrionaria primaria. La plúmula está
cubierta por el coleóptilo, y la radícula está envuelta por la coleorriza [21,22].
El grano de arroz descascarado se conoce como arroz integral, y pueden clasificarse de
acuerdo a su tamaño en [19]:
Grano extralargo (EL) : 7.5 mm o mas
Grano largo (L): de 6.6 a 7.4. mm
Grano medio (M): 5.6 a 6.5 mm
Grano corto (C): 5.5. mm o menos
7.1.3. Crecimiento y desarrollo de la planta de arroz
El crecimiento de la planta de arroz es un proceso fisiológico continuo, corresponde a un
ciclo completo desde la germinación hasta la maduración del grano [25] (figura 4).El ciclo de
vida de la planta está comprendido entre 100 a 210 días generalmente y siendo el más común
entre 130 a 150 días, el cual puede variar dependiendo de las características genéticas de la
planta o de la influencia del ambiente [20,25].
El crecimiento de la planta de arroz se divide en tres fases, donde se desarrollan nueve etapas [10], (tabla 2).
Fase vegetativa: desde la germinación hasta la iniciación de la panícula.
Fase reproductiva: desde la iniciación de la panícula hasta la floración
Fase de maduración: desde la floración hasta la madurez total del grano.
20
Figura 4. Fases de crecimiento y desarrollo de la planta de arroz Recuperado de: Sánchez C.
Identificación y cuantificación de especies del genero Merluccius mediante la utilización de
PCR a tiempo real [26].
Las fases reproductiva y de maduración tienen por lo general, una duración constante. La
fase vegetativa es la que determina la duración del ciclo de vida de las variedades [17].
Tabla 2. Fases y etapas del desarrollo del arroz [17,19,20]
Fase Etapa
Vegetativa (55 a
60 días)
0 Germinación de la semilla (5-7 días). Desde el humedecimiento
de la semilla hasta la aparición de la primera hoja a través del
coleoptilo.
1 Plántula (15-20 días). Desde la aparición de la primera hoja hasta
la aparición del primer hijo
2 Macollamiento (30 -35 días). Desde la aparición del primer hijo
hasta el máximo macollamiento (2Mx)
3 Elongación del tallo (5-7 días). Desde el alargamiento del cuarto
entrenudo hasta inicio (micro) del primordio floral.-
Reproductiva
(35 días)
4 Inicio de panícula (10-11 días). Desde la formación microscópica
del primordio floral hasta hacerse visible.
5 Desarrollo de panícula (20-25 días). Desde que se hace visible
hasta la emergencia a través de la hoja bandera
6 Floración (7-10 días). Desde la apertura de glumas en el tercio
superior hasta la emergencia total y fecundación.
Maduración (30
días)
7 Grano lechoso (7-10 días). Desde la fecundación hasta la
formación inicial del grano.
8 Grano pastoso (10-13 días)
21
7.2. ESTRÉS POR FACTORES ABIÓTICOS
Las plantas en la naturaleza, están constantemente expuestas a estrés abiótico o ambiental.
El estrés abiótico vegetal se define como todo factor externo que afecte negativamente el
crecimiento, productividad y capacidad reproductiva o de supervivencia de las plantas [10,27,28]. Si el estrés es demasiado intenso o el periodo de acción es demasiado largo los daños
latentes se transforman en daños irreversibles que pueden afectar a la planta entera o partes
de la misma [29]. Se estima que únicamente un 10% de la superficie de la tierra arable se
encuentra libre de estrés. Cerca del 20% de la tierra presenta algún tipo de deficiencia o
toxicidad mineral, el 26% es afectado por estrés de sequía y el 15% por congelación [29].
Incluso las plantas que se encuentran protegidas por invernadero y túneles presentan eventos
de estrés biótico y abiótico disminuyendo la productividad y calidad de los cultivos [29].
Son múltiples los factores ambientales que originan estrés en las plantas, entre ellos se
encuentra: deficiencias o excesos de agua y nutrientes minerales, pasando por altos
contenidos salinos de los suelos, altas o bajas temperaturas extremas, excesiva radiación solar
(PAR, UVB), excesiva alcalinización o acidificación de los suelos y factores mecánicos
(compactación de los suelos, viento, nieve, granizo) hasta la presencia de contaminantes
químicos en los suelos (metales pesados, agentes xenobióticos, etc.) o en el aire (SO2, O3,
óxidos de nitrógeno (NOx), HF, nitrato de peroxiacetilo, etc.) [27].
En los cultivos de arroz el estrés abiótico afecta la planta por dos vías, la primera perjudica
directamente los procesos fisiológicos involucrados en la producción del grano, tales como
crecimiento vegetativo, desarrollo de espiguillas y llenado de grano y la segunda vía afecta
indirectamente los rendimientos a través de la incidencia de enfermedades e insectos
fitófagos [30]. El estrés que sufre la planta está relacionado con la tolerancia al mismo, siendo
este la capacidad que tiene la planta para hacer frente a las condiciones desfavorables y se
mide mediante el rendimiento del cultivo, el crecimiento, o los procesos de asimilación
primaria (incorporación de CO2 y minerales) que están relacionados con el crecimiento [27,28].
7.2.1. Estrés por altas temperaturas
Los seres vivos están adaptados a desarrollarse en un rango óptimo de temperatura. Unas
temperaturas que superen dicho rango pueden provocar daños en los procesos fisiológicos,
incluso efectos letales sobre el individuo [31]. De acuerdo a esto, el rendimiento potencial de
la planta está relacionado con la temperatura a la que se encuentra expuesta. Cada una de las
etapas de desarrollo de la planta de arroz tiene una temperatura óptima en la cual la
productividad es favorable, no obstante las plantas de arroz se ven afectadas por estrés
abiótico por altas temperaturas afectando negativamente su desarrollo y crecimiento (tabla
3). Las temperaturas críticas para la planta de arroz están, generalmente por encima de 30°C
y varían según el estado de desarrollo de la planta [19].
22
Durante la germinación y crecimiento de la plántula temperaturas de 45°C provocan la
aparición de punta blanca, bandas cloróticas y manchas sobre la lámina de las hojas; cuando
la temperatura es de 35°C el macollamiento es reducido. En la fase reproductiva un estrés de
alta temperatura a 38°C o más da lugar a una reducción del número de espiguillas [32].Estudios
previos, por Yoshida [33] han mostrado que las espiguillas en antesis que son expuestas a
temperaturas superiores a 35°C por cerca de 5 días durante la etapa de floración resultan
estériles, la cual es causada por una pobre dehiscencia y una baja producción de polen, y de
allí que se presenta un bajo número de granos de polen que germinan en el estigma [20,34].
Así mismo, se ha encontrado que menos de una hora de exposición a altas temperaturas es
suficiente para inducir esterilidad en arroz (Jagadish et al, 2007).
Además, la fotosíntesis en el cultivo del arroz es severamente afectada por temperaturas
superiores a los 40°C, y se encuentra relacionada directamente con el contenido de clorofila
de la hoja [20]. Cuando se exceden los límites de temperatura óptimos se presentan
alteraciones fisiológicas importantes, como desnaturalización de proteínas, alteraciones de la
fluidez de membranas, inhibición en el transporte de electrones, entre otras, afectando el
crecimiento, desarrollo y el rendimiento final del cultivo [20,35].
Tabla 3. Efecto de la temperatura en el desarrollo y crecimiento de la planta de arroz [5]
Etapas de desarrollo
Temperatura
alta (°C) Efecto Temperatura
óptima (°C)
Germinación 45
Punta blanca, bandas
cloróticas y manchas en
las hojas
20-35
Emergencia y
establecimiento de la
plántula
35
25-30
Enraizamiento 35 25-28
Elongación de las hojas 45 31
Macollamiento 33 Reducido 25-31
Iniciación de la
panícula (primordio
floral)
- Panícula blanca
-
Diferenciación de la
panícula
38 Número reducido de
espiguillas -
Antesis (floración) 35 Esterilidad 30-33
Maduración 30 Menor llenado del
grano 20-25
23
7.3. MEJORAMIENTO DEL ARROZ
El objetivo principal del Fitomejoramiento es desarrollar variedades que presenten mayores
rendimientos de producción, mayor resistencia a plagas, enfermedades y efectos ambientales
que puedan alterar su ciclo su vida [19,20]. Encontrar una variedad que cumpla y satisfaga las
necesidades del agricultor requiere de un ardua investigación de casi siete a doce años. Los
tres métodos más usados en el mejoramiento son el masal, el de pedigree y el de
retrocruzamiento; no obstante, actualmente se está haciendo uso de agentes mutagénicos
tanto químicos como físicos [19,22].
Los mutagénicos físicos son un amplio grupo de radiaciones entre las que se encuentran los
rayos gamma, rayos X, neutrones, ultravioleta, partículas alfa, beta y protones. Estas
radiaciones pueden ser divididas en ionizantes y no ionizantes; la primera categoría incluye
aquellas radiaciones capaces de producir iones al interactuar con la materia (rayos X, gamma,
protones y neutrones), mientras que la segunda se refiere a los rayos ultravioleta que
transfieren la energía por excitación [20,36].
Las principales fuentes de rayos gamma son los isotopos 60Co, y 137Cs, utilizados
ampliamente en radiobiología [20,22]. Las radiaciones provenientes de estos isotopos rompen
las moléculas de agua, produciendo iones (H+, H-, OH+, OH-), radicales libres (Ho, OHo) y
peróxidos (O22-) que atacan las moléculas de ADN y ARN, los cromosomas y las enzimas
[22]. De este modo, se presentan cambios permanentes y heredables en el genoma del tejido
tratado [22]. Para el año 2000 la Agencia Internacional de Energía Atómica (AIEA) reporta
434 variedades de arroz obtenidas mediante esta técnica, para mejorar características como
la calidad del grano, la altura de la planta, el potencial de rendimiento, calidad culinaria,
tolerancia al frio, resistencia a Pyricularia , entre otros.
Estudios realizados en el 2010 por Castilla [36] mostraron que la variedad Fedearroz 473 y
Fedearroz Mocarí presentaron mayor adaptación a altas temperaturas (34°C) en Ambalema
y el Espinal municipios del Tolima; la variedad de mayor rendimiento fue Fedearroz 473.
Junto a ello se encontró que la variedad Fedearroz Lv 1645 presenta bajos rendimientos ante
este tipo de estrés. A partir de esto se escogieron para el presente estudio las variedades
Fedearroz 473 (resistente), Fedearroz Mocarí (tolerante) y Lv 1645 (susceptible) a estrés por
altas temperaturas, las cuales han sido irradiadas con 60Co.
7.3.1. Fedearroz 473
Es una variedad de porte bajo, pero a pesar de esta característica tiende al volcamiento, posee
buen vigor inicial, alto macollamiento, arquitectura de la planta erecta, ciclo vegetativo corto
y alto potencial de rendimiento. Si se atrasa el momento oportuno de cosecha, se afecta su
calidad de molinería; por tal motivo se sugiere cosecharla por encima de un 23% de humedad.
Al presentarse un “stress” por mal manejo del agua de riego o en su defecto en los lotes altos
24
de secano sin curvas a nivel, es afectada por Helmintosporiosis en hoja y en el cuello. Esta
variedad registra buen comportamiento en ambos semestres. Se siembra en la actualidad en
Caribe seco, húmedo y el Centro del país donde se encuentran las zonas con más altas
temperaturas debido a su buen rendimiento en dichos sitios [30].
7.3.2. Fedearroz Mocarí
Es un genotipo liberado hacia el año 2010 al mercado nacional, se caracteriza por un alto
vigor inicial, periodo vegetativo corto, buena capacidad de macollamiento, excelente calidad
molinera y buena sanidad foliar. En cuanto a la oferta ambiental, es de amplia adaptabilidad
y estabilidad. Está aprobada para las zonas del Caribe seco, húmedo y centro del país, sin
embargo, en los meses del año donde la temperatura alcanza su máximo, tiende a bajar su
producción. Un reciente trabajo realizado en el centro del país con respecto a la nutrición con
Nitrógeno, indica que se obtiene un aumento en el rendimiento significativo cuando se aplica
el 60% del Nitrógeno programado hacia el inicio del primordio floral [30].
7.3.3. Línea Avanzada Lv 1645
Esta línea avanzada en la actualidad se encuentra en la fase de ensayos de rendimiento,
pruebas que ha pasado con altos niveles de producción, sin embargo, estos ensayos al ser
ejecutados en la zona Caribe donde las temperaturas son elevadas merma significativamente
su rendimiento, por esta razón se ha clasificado como susceptible ante altas temperaturas, lo
que compromete su liberación como variedad, aunque aún es prematuro sacar conclusiones
ya que faltan más estudios para definir su viabilidad [3].
7.4. PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO
Debido a la sensibilidad de las fuerzas responsables del plegamiento de las proteínas a altas
temperaturas, las proteínas se desnaturalizan fácilmente, o se pliegan de manera incorrecta;
los organismos biológicos tienen un conjunto de proteínas que se expresan en respuesta a la
alta temperatura que previenen o revierten los efectos del calor sobre la desnaturalización de
las proteínas [37] estos se denominan proteínas de choque térmico (Heat shock proteins, HSP).
Es importante aclarar que estas proteínas de choque térmico también se expresan como
respuesta a otros tipos de estrés como temperaturas bajas, salinidad, metales pesados, sequia.
Las Hsps están relacionadas con la adquisición de termo tolerancia, siendo muy conservadas
evolutivamente, puesto que presentan función y estructura muy similar en archea, bacterias,
levaduras, plantas y animales [38], Todas las HSP se caracterizan por la presencia de un N-
terminal carboxílico llamado dominio de choque térmico [39].
Las HSP se conocen como Chaperones moleculares ya que facilitan una serie de procesos
que incluyen el plegamiento de proteínas, el transporte de proteínas a través de membranas,
25
la modulación de la actividad de la proteína, la regulación de la degradación de proteínas y
la prevención de la agregación de proteínas irreversibles [37,38] (figura 5).
7.4.1. Clasificación de las proteínas de choque térmico
Las proteínas de choque térmico se han agrupado en cinco familias denominadas: Hsp100,
Hsp90, Hsp70, Hsp60 y sHsp’s (de bajo peso molecular), de acuerdo a sus estructura, peso
molecular y grado de homología [10].
Figura 5. Función de las proteínas de choque térmico en la célula. Chaperonas de diversos
tipos se unen a los polipéptidos recién sintetizados en los ribosomas, otras se unen a las
proteínas que atraviesan las membranas de diversos organelos, o a proteínas que se han
desnaturalizado debido a cualquier tipo de estrés. En todos los casos la función de las
chaperonas es ayudar al correcto plegamiento de las proteínas, desagregación y reactivación
de las proteínas. Recuperado y modificado de: Doyle S, Genest O, Wickner S. (2015) Protein
rescue from aggregates by powerful molecular chaperone machines. [62].
7.4.1.1. Hsp100
Las proteínas de mayor tamaño se agrupan en la familia Hsp100 que a su vez pertenecen a
la superfamilia AAA (Atpasa asociada con varias actividades), esta familia se caracteriza por
la presencia de 200 a 250 aminoácidos que conforman el dominio α-helicoidal y un dominio
de unión de nucleótidos tipo Walker. Su peso oscila entre los 100 y 114 kDa de las que
26
algunas son inducidas por calor y otras son constitutivas tanto en eucariotas como
procariotas, y se localizan en el citosol, mitocondria y cloroplasto [28].
La primera Hsp100 fue descrita como componente de una proteasa dependiente de ATP en
Escherichia coli, la proteasa caseinolitica (Clp). Esta proteasa posee tres miembros de
regulación (ClpA, ClpB, ClpC) y un miembro catalizador (ClpP) [40]. La primera Hsp100
asilada en eucariotas fue la Hsp104 de Sacharomyces cerevisiae [41]. Esta proteína se expresa
en respuesta al estrés y juega un papel central en la tolerancia a condiciones extremas [42]. En
plantas superiores como arabidopsis, soja, tabaco, arroz, maíz, trigo, guisante y judía se ha
logrado aislar proteínas correspondiente a esta familia, donde su estructura se asemeja a la
ATP-dependiente ClpB de E. coli. [43]. Se ha demostrado que la expresión de Hsps100 en
plantas se induce por una gran variedad de condiciones ambientales estresantes como calor,
frio, salinidad, deshidratación y metales pesados. Además su expresión también está regulada
durante el desarrollo [42]. En Oryza sativa, se aisló la Hsp110 kDa, que es homólogo de la
Hsp104 de levadura y se expresa frente a estrés por altas y bajas temperaturas, salinidad y
ABA [43].
De acuerdo a la presencia de uno o dos dominios de unión a ATP las Hsps100 se dividen en
dos clases: clase I y clase II (figura 6). Las Hsp100 de clase I en su estructura contienen dos
dominios de unión a ATP (NBD-1 yNBD-2); en un extremos se encuentra el dominio N-
Terminal (domino N), seguido por un dominio de unión de nucleótidos (NBD-1), un dominio
medio (dominio M), y un segundo dominio de unión a nucleótidos (NBD-2), seguido del
dominio carboxilo (dominio C) [43]. Las proteínas de esta familia presentes en Oryza sativa,
se clasifican en la clase I tipo (ClpB) (figura 7).
Figura 6. Clasificación y organización de dominios de proteínas de la familia Hsp100. La
estructura de las proteínas Hsp100 están conformadas por dos clases. La Clase I posee un
dominio N-terminal, seguido de un dominio de unión a sustrato 1 (NBD-1), posteriormente
se encuentra el dominio M, le sigue una segunda región de unión a sustrato (NBD-2) y
finalmente el dominio c-terminal. La clase II está formada únicamente un dominio de unión
a sustrato similar al NBD-2 de la clase I. Recuperado de:
http://pdslab.biochem.iisc.ernet.in/hspir/hsp100.php
27
Las Hsp100 de clase II contienen solo un dominio de unión a ATP que es similar al dominio
NBD-2 de las Hsp100 de clase I [44]. Dentro de sus funciones se encuentra, facilitar la
solubilidadx y eliminación de agregados de proteínas desnaturalizadas, implicando la
participación de otras chaperonas como las HSP70 y proteasas [31,38]. Otra función descrita
para las Hsp100 de plantas es su papel como reguladores de la expresión de genes [31,37].
Figura 7. Estructura de la proteína ClpB. Compuesta por un dominio N terminal (gris), una
región de unión a sustrato 1 y 2 (NBD-1 y NBD-2) (azul y verde respectivamente, un dominio
medio en espiral (naranja), en amarillo se muestra la presencia de nucleótido unido a las
regiones NBD1 y NBD2. Protein rescue from aggregates by powerful molecular chaperone
machines. Recuperado de: Doyle S, Genest O, Wickner S. (2015) Protein rescue from
aggregates by powerful molecular chaperone machines. [62].
7.4.1.2. Hsp90
Las proteínas de esta familia tienen un tamaño que oscila entre 82 y 96 kDa, se encuentran
en el citosol y retículo endoplasmatico. Estas proteínas son muy conservadas evolutivamente
y esenciales para la viabilidad de las células eucariotas, siendo dependiente de ATP [45].
Hsp90 es una de las proteínas más abundantes en los eucariotas, representando
aproximadamente el 1% de proteínas solubles totales bajo condiciones normales. A
diferencia de otras proteínas la familia Hsp90 no actúa en el plegamiento de la proteína
naciente, si no que interviene en el plegamiento final de la proteína.
Las Hsp90 actúan como chaperonas moleculares durante un estrés térmico y a temperaturas
normales de crecimiento son indispensables para el funcionamiento de los receptores de
hormonas esteroides, la actividad o estabilidad de muchas proteínas esenciales para la célula,
fundamentalmente quinasas de proteínas implicadas en transducción de señales y en el
control del ciclo celular, convirtiéndose en un objetivo para la terapia del cáncer [46]. Por lo
tanto Hsp90 no solo interviene en el plegamiento de proteínas si no en diversos proceso
celulares, transducción de señales, transporte intracelular y degradación de proteínas [46].
28
Para lograr su función, la Hsp90 trabaja en conjunto con un grupo de cofactores denominados
co-chaperonas como p50, p23, Aha1 y proteínas con motivo TPR, que facilitan la maduración
de la proteína cliente.
En los animales Hsp90 es muy conocida como un componente de un complejo que ayuda a
doblar el receptor de glucocorticoides. En las plantas, Hsp90 participa en un complejo
multiproteico similar que también incluye Hsp70 y una pequeña proteína ácida conocida
como p23, [37] además son necesarias para el crecimiento y desarrollo normal de la planta.
Por otro lado las Hsp90 es regulada en respuesta a diversos estrés abióticos y bióticos y
también participan en la respuesta inmune de las plantas [47], aunque el mecanismo de acción
aún no se conoce.
Se han aislado genes de Hsp90 en diferentes especies de plantas, en Arabidopsis thalina, se
encuentra 7 proteínas de las cuales 4 se localizan en el citoplasma y se considera que las otras
3 se ubican en el retículo endoplasmatico y mitocondria [48]. También se han encontrado en
Licopersicum esculentum [49] Zea mays [49], y Brassica napus [48] y Oryza sativa. En el arroz
se expresó el gen Hsp90 en semillas y hojas bajo el estrés por sales (NaCl, NaHCO3 y
Na2CO3), desecación, pH y temperatura alta [50]. Sin embargo no está claro su mecanismo
molecular [47].
La familia Hsp90 es altamente conservada, en el citosol bacteriano se presenta la HtpG,
Grp94 / gp96 en el retículo endoplasmático de eucariotas, Hsp75 / TRAP1 en la matriz
mitocondrial y Hsp90 en el citosol de eucariotas. Hsp90 del citosol se denominan además
como Hsc82 y Hsp82 en la levadura, Hsp83 en Drosophila m., Hsp86 y Hsp84 en ratones,
Hsp90α (inducible) y Hsp90β (constitutiva) en los seres humanos. Todos estos homólogos
comparten una estructura común y por lo tanto tienen un modo de acción similar. Hsp90
forma un homodímero constitutiva a través de sus residuos carboxilo-terminal. Cada unidad
posee tres dominios (figura 8) [47]. Inicialmente se encuentra el dominio N-terminal (dominio
N) el cual es altamente conservado y posee el sitio de unión a ATP, está conectado mediante
una secuencia cargada al dominio medio (dominio M) donde se una la proteína cliente, y
finalmente se encuentra un dominio carboxilo-terminal (dominio C) que favorece la
homodimerizacion; junto a esta región se encuentra un motivo conservado MEEVD que sirve
como sitio de acople para la interacción con co-chaperonas que contienen tetratricopeptido
(TPR) [46,51,52] . Esta conformación es conservada desde levaduras hasta el ser humano [46].
Hsp90 es muy dinámica, ya que fluctúa rápidamente entre conformaciones que van desde
una forma de V abierta a una forma cerrada que asemeja a un par de manos ahuecadas (figura
9 a.) [51]. En el estado inicial la Hsp90 posee una conformación abierta.
29
Figura 8. Estructura de proteínas de la familia Hsp90. a. estructura lineal de proteínas Hsp90,
domino N-terminal (amarillo), seguido de una secuencia cargada, posteriormente se presenta
el dominio M (verde) y en el extremo un domino C-terminal (azul) junto con una pequeña
región MEEVD; b. Estructura terciaria de las proteínas de Hsp90. Recuperado y modificado
de Taipale M, Jarosz D, Lindquist S. (2015). Hsp90 at the hub of protein homoestasis:
emerging mechanistic insights.[53]
La unión de ATP desencadena una serie de cambios conformacionales incluyendo el
reposicionamiento de la tapa de la región N-terminal, y un cambio brusco en la orientación
del dominio N-M. Después de la unión de ATP, y de la proteína cliente al sustrato la Hsp90
alcanza el primer estado intermedio, en la que la tapa se cierra, pero los dominios-N aún están
abiertos, posteriormente se lleva a cabo la dimerización del dominio N-terminal que conduce
a un segundo estado intermedio, en el que el dominio M y N interactúan y la Hsp90 alcanza
un estado completamente cerrado en el que se produce la hidrolisis de ATP. Una vez la ATP
se hidroliza los dominios-N se disocian, se libera ADP, Pi y la proteína activa y la Hsp90
vuelve a su conformación abierta (figura 9 b.) [53].
Figura 9. a. ciclo ATPasa de Hsp90, esta fluctúa entre una conformación abierta en V y
cerrada para su funcionamiento; b. ciclo de la chaperona Hsp90, la cual requiere de ATP y
de co-chaperonas como Hsp40 y Hsp70, Recuperado de: Taipale M, Jarosz D, Lindquist S.
(2015). Hsp90 at the hub of protein homoestasis: emerging mechanistic insights. [53]
7.4.1.3. Hsp70
Las proteínas que pertenecen a la familia Hsp70, presentan un peso molecular entre 69 y 71
kDa. Se localizan en el citosol, mitocondria y cloroplasto. Es una de las familias más
estudiadas y conservadas en eucariotas y procariotas [37]. Algunos miembros de esta familia
30
se expresan constitutivamente y se conocen como Hsc70 (Heat Shock Cognate), mientras
que las Hsp70jk se expresan únicamente cuando el organismo se encuentra en un estrés por
temperaturas extremas, presencia de metales pesados como arsénico, cadmio, cobre,
mercurio, u otro tipo de estrés abiótico [54]. No se han establecido aun diferencias en la
función de las Hsc70 y Hsp70 [37,55]. La Hsp70 fue descubierto originalmente por Fm Ritosa
en la década de 1960 cuando la temperatura de Drosophila melanogaster fue impulsado por
accidente. Al examinar los cromosomas se observó una región sobresaliente que indicaba la
elevada transcripción de genes de una proteína desconocida. Más adelante estas proteínas
fueron denominadas como “proteínas de choque térmico (Hsp)” [54].
La función de las Hsp70 principalmente es actuar como chaperonas moleculares, pero no
sobre polipéptidos sintetizados de novo, sino sobre proteínas maduras, protegiéndolas del
choque térmico y facilitando su recuperación del mismo. Además son esenciales en el
plegamiento de proteínas, unión y desunión de oligómeros, translocación de proteínas de un
orgánulo a otro o degradación de las mismas [31,54]. Además de su función como chaperona,
las Hsp70 desempeñan un papel regulador de la expresión de otros genes asociados con el
estrés.
La proteína Hsp70 mas estudiada en procariotas se conoce como DnaK y sus co-chaperonas
DnaJ y GrpE. En eucariotas se han encontrado proteínas de la familia Hsp70 en todos los
compartimientos subcelulares. Las Hsp70 localizadas en el retículo endoplasmatico también
se denominan BiP (Binding Protein) o GRP78 (78kD Glucose-Regulated Protein). Esta
diferencia en la localización subcelular implica especificidad funcional [56]. Recientemente
se han identificado en eucariotas un grupo de proteínas de mayor tamaño, pero que de
acuerdo a sus propiedades estructurales y funcionales, se han considerado una subfamilia de
las Hsp70. Esta subfamilia conocida como Hsp110, incluye la Hsp110 de mamíferos, las
proteínas SSE de levaduras y sus homólogos en el retículo endoplasmático y los ortólogos
de Grp170 en mamíferos [56,57].
En plantas la familia de proteínas es relativamente grande, en Arabidopsis thaliana, se han
asignado 18 genes que codifican para proteínas de esta familia, ubicadas en el retículo
endoplasmático, cloroplasto, mitocondria y citosol [58]. Se han encontrado Hsp70 en Glycine
max, Cucumis sativus,Nicotiana tabacum, Oryza sativa, Ricinus communi, Solanum
tuberosum, Zea mays. La expresión de Hsp70 es inducido por el estrés térmico por altas y
bajas temperaturas [44]. La mayoría de Hsp70 en plantas muestra una fuerte inducción después
de 30 minutos a 2 horas de estrés de 37 a 45°C [59]. Además algunas Hsp70 se expresan en
respuesta a la infección por virus [58,59].
El amplio espectro de funciones celulares de las proteínas Hsp70 se logra a través de tres
factores. El primero es la amplificación y diversificación de los genes Hsp70 que ha generado
a lo largo de la evolución chaperonas especializadas, el segundo es el uso de co-chaperonas
por parte de las chaperonas para cumplir con funciones celulares específicas y tercero es la
31
cooperación del sistemas Hsp70 con otros sistemas de chaperonas como Hsp90, Hsp100 lo
que permite ampliar su espectro [60].
Las proteínas Hsp70 tanto procariotas como eucariotas comparten una estructura similar, por
lo cual tienen un modo de acción igual. Todas las proteínas Hsp70 contienen dos dominios
principales (figura 10). El primer dominio es el ATPasa N- terminal de 45kDa donde se une
el ATP y se hidroliza a ADP, este está unido al segundo dominio mediante una región
hidrofóbica que es susceptible a la escisión por proteasas. El segundo dominio es el dominio
de unión a sustrato (SBD) de 25kDa que puede interactuar con segmentos peptídicos lineales
cortos. Este dominio se subdivide en dos, en la región donde se une el péptido de 15kDa y el
dominio C-terminal de 10kDa que presenta una conformación de hélice α y actúa como una
tapa en el momento en el que la proteína se une al sustrato [52, 55,58]. Cuando la Hsp70 se une
a ADP el dominio de unión a sustratos está cerrado y el intercambio de sustratos es lento, la
unión de ATP hace que se abra este dominio, lo que produce un rápido intercambio de
sustratos [60].
Figura 10. a. estructura lineal de proteínas de la familia Hsp70, está conformada por un
dominio ATPasa N-terminal (azul), seguido de una región hidrofóbica, seguido se encuentra
el dominio de unión a sustrato (SBD) (verde y amarillo), que se divide en el sitio de unión a
sustrato (verde) y el dominio c-terminal que actúa como tapa (amarillo); b. conformación
abierta de una proteína Hsp70; conformación cerrada de una proteína Hsp70. Recuperado de
Kampinga H, Craig E (2010). The Hsp70 chaperone machinery J proteins as drivers of
functional specificity. [61].
El funcionamiento de la Hsp70 (figura 11) es regulada por dos actividades principales: unión
de péptido y la hidrolisis de ATP. Inicialmente el ATP se ha unido al dominio N-terminal
donde la Hsp70 adquiere una conformación abierta. Posteriormente la proteína cliente
interactúa con el sitio de unión del péptido que se encuentra “abierto”. La hidrólisis de ATP
32
es estimulada por co-chaperonas como la Hsp40 que generan mayor estabilidad al complejo
Hsp70, causando un cambio conformacional en Hsp70 que permite el cierre de la tapa sobre
la hendidura helicoidal y estabiliza la interacción con el cliente, en seguida la co-chaperona
abandona el complejo. Un factor de intercambio de nucleótidos (NEF), que tiene una mayor
afinidad por Hsp70-ADP que Hsp70-ATP se une a la Hsp70 para estimular la disociación de
ADP, después de esto se une ATP a Hsp70. El cliente adquiere una conformación nativa y
es liberado debido a su baja afinidad por Hsp70-ATP. Si no se alcanza la conformación
nativa, la proteína cliente se une de nuevo a la Hsp70 y el ciclo comienza de nuevo [61,62].
Figura 11. Mecanismo de acción de la Hsp70, que es dependiente de ATP, y co-chaperonas
como Hsp40. Recuperado de: Doyle S, Genest O, Wickner S. (2015) Protein rescue from
aggregates by powerful molecular chaperone machines. [62].
7.4.1.4. Hsp60
Las proteínas de esta familia se conocen como chaperoninas y se caracterizan por tener un
tamaño entre 53 y 62 kDa [63]. Las chaperoninas son indispensables para el funcionamiento
adecuado de procariotas y eucariotas a todas las temperaturas [63]. Son la familia más
conservada y participan en el correcto plegamiento de proteínas desnaturalizadas, recién
sintetizadas o bajo condiciones de estrés ayudándolas a conseguir su estructura terciaria y
por consiguiente su función, [64] también participa en el transporte y transducción de señales [65].
Las chaperoninas se clasifican en dos subfamilias, que son estructuralmente similares pero
se diferencian en su secuencia. El grupo I se encuentra en procariotas y orgánulos
endoplasmáticos como mitocondria y cloroplastos, una de ellas es GroEL en el citosol
bacteriano, Hsp60 en las mitocondrias y proteína de unión a Rubisco (RuBisCoBP) en el
cloroplasto que participa en el plegamiento de proteínas tan importantes como el Rubisco y
por lo tanto son esenciales en el desarrollo del cloroplasto [39,55]. Para su funcionamiento las
chaperoninas del grupo I requieren de las co-chaperonas Hsp10, que proporcionan la tapa
para el cierre de la cavidad del sustrato. El Grupo II se presenta en arquea y el citosol de
eucariotas, entre estas se tiene TF55 en arquea y TRiC/CCT en el citosol de eucariotas [54,64];
a diferencia de las Hsp60 del grupo I ellas no requieren la ayuda de co-chaperonas, pues
33
cuentan con una región que actúa como tapa. Las proteínas de los dos grupos presentan
funciones similares, pero se diferencian en la forma como encapsulan el sustrato lo cual está
relacionado con la estructura de cada una. Las chaperoninas al igual que las Hsp100, Hsp90
y Hsp70 son proteínas dependientes de ATP [66].
Las chaperoninas del grupo I (figura 12) forman estructuras oligomericas formadas por dos
anillos apilados de 7 unidades cada uno [66]. La cavidad central del cilindro proporciona el
ambiente adecuado para el plegamiento de la proteína sustrato. Las chaperoninas de
procariotas y mitocondrias presentan 14 subunidades, y las de cloroplasto están formadas por
dos tipos de subunidades α y β [64,68]. Cada subunidad consta de tres dominios: el dominio
ecuatorial que contienen el sitio de unión a ATP y es el lugar donde se producen las
interacciones entre subunidades, el dominio apical que contienen el sitio de unión a
aminoácidos hidrofóbicos y de unión a su co-chaperona, seguido del dominio intermedio que
está localizado entre los dominio ecuatorial y apical que transfiere la información alostérica
entre ellos [52, 54,66].
Figura 12. a. estructura lineal de las proteínas de la familia Hsp60, están conformadas por
un dominio apical (rojo) donde se une ATP y el sustrato, seguido de un dominio intermedio
(amarillo) que transfiere la información alostérica y el dominio ecuatorial (verde); b
Estructura terciaria de las chaperoninas. Recuperado y modificado de:
http://pdslab.biochem.iisc.ernet.in/hspir/hsp70.php
Las chaperonas de tipo II forman estructuras similares a las de tipo I pero con la diferencia
de que cada anillo está formado por 8 o 9 subunidades distintas [66]. El dominio apical de
estas chaperoninas tiene una extensión que podría realizar un papel similar al de las co-
chaperonas del tipo I [52,66].
Para el funcionamiento de las Hsp60, inicialmente la proteína cliente se une a la cavidad
central de la chaperona a través de las regiones hidrofóbicas expuestas en la proteína.
Posteriormente se une el ATP y la co-chaperona a la región ecuatorial, lo que produce un
cambio conformacional de la chaperona, que supone un aumento de tamaño de la cavidad
central y además pasa a ser hidrofilia, proporcionando así un ambiente adecuado para el
plegamiento de la proteína. Seguido a ello la hidrolisis de ATP es esencial para que la
proteína pueda liberarse de la chaperona [65,66].
34
En plantas se han estudiado principalmente las chaperoninas de tipo I. en Arabidopsis
thaliana sean identificado 11 genes que codifican para chaperoninas de tipo I, 7 de ellas se
encuentran en el cloroplasto y las otras 4 en la mitocondria. Las proteínas de tipo II en plantas
son poco abundantes, en Arabidopsis se han identificado 9 genes que codifican proteínas de
este tipo [64,65]. Las sHSps actúan como chaperonas moleculares frente al estrés térmico,
dentro de sus funciones esta unir y estabilizar las proteínas, controlar la unión y liberación
de las mismas, facilitar su correcta localización subcelular, su plegamiento, e incluso
controlar la destrucción por degradación [66]. Estas proteínas pueden ser importantes en la
protección de las plantas frente al estrés salino [66].
7.4.1.5. sHsp’s
Las proteínas de choque térmico de bajo peso molecular, tienen un tamaño que oscila entre
12 y 43 kDa, suelen encontrarse en el citosol, mitocondria, cloroplasto y retículo
endoplasmático [28,68]. Son un grupo de proteínas muy diverso que juegan un papel importante
en el mantenimiento y control de calidad de las proteínas en la célula [67]. La mayoría de las
sHsps comparten algunas características comunes como: la presencia de un dominio α-
cristalina conservado de aproximadamente 90 residuos, una pequeña masa molecular de 12
a 43 kDa, formación de grandes oligómeros de 200 a 300 kDa, e inducción por estrés a altas
temperaturas y otros tipos de estrés como metales pesados.
Las sHsps se encuentran en organismos eucariotas y procariotas pero el número de sHsps
encontrado en diferente especie varia significativamente. Los organismos procariotas suelen
tener una o dos sHsps, excepto algunas especies del genero Rhizobium que tienen diez sHsps [67]. En levaduras se han encontrado dos sHsps, mientras que en el resto de eucariotas el
número de genes que codifican sHsps es mucho mayor, por ejemplo en Drosophila
melanogaster se han identificado cuatro genes, dieciséis en Caenorhabditis elegans,[13] diez
en humanos y diecinueve en Arabidopsis thaliana. En Oryza sativa se han identificado la
expresión de doce genes de sHsps a los 5,15 y 45 minutos frente a estrés por temperaturas de
37, 42 y 48°C [9,13].
Las plantas se caracterizan por presentar una mayor abundancia y diversidad de sHsps que
en otros eucariotas, debido a su inmovilidad inherente lo que le impide evitar el estrés y les
obliga a lidiar con el mismo mediante la acción de las proteínas de choque térmico [48]. En
las plantas las sHsps son rápidamente inducidas por el calor, convirtiéndose en uno de los
ARN más abundantes en la célula [68,69], además pueden alcanzar hasta el 1% del total de
proteínas en hojas y raíces. Estas proteínas están codificadas por genes nucleares y se
agrupan en seis clases según el grado de homología en la secuencia de aminoácidos, donde:
las clases CI, CII y CIII están localizadas en el citosol [54] o en el núcleo, la clase P localizada
en los cloroplastos [48], la clase ER en el retículo endoplasmático [81] y la clase M se ubica en
35
las mitocondrias [54]. Actualmente se cree que hay un grupo de sHsps que actúa en el
peroxisoma [67]. Esta clasificación solo aplica para plantas terrestres.
A pesar de la diversidad de proteínas sHsps, en cuanto a su estructura todas las sHsp’s tienen
una organización estructural conservada (figura 13). Las sHsps se componen de una región
N-terminal que es altamente variable en longitud y secuencia entre las sHsps seguido por el
dominio α-cristalino altamente conservado en todas las sHsps y una región C-terminal [67].
Figura 13. a. Estructura primaria de las proteínas del a familia sHsp, poseen un dominio N-
terminal (verde), seguido de un dominio α-cristalino (rojo) que posee una extensión para el
C-terminal; b. Estructura terciaria de proteína sHsps. Recuperado y modificado de: Sun Y,
MacRae T. (2005). Small heat chock proteins: molecular structure and chaperone
function.[70].
El domino α-cristalino, está comprendido por aproximadamente 100 aminoácidos, consiste
en un β-sandwich con dos laminas β antiparalelas [54] por lo que se puede dividir en dos
subdominios, denominados consenso I y II, separados por una región hidrofílica de longitud
variable [68]. El consenso I tiene 27 aminoácidos de longitud, de los cuales el motivo Pro-
X(14)-Gly-val-Leu, es una secuencia conservada en la mayoría de sHsps. En el consenso II
existe un motivo de secuencia similar: Pro-X(14)-Val-Leu-Ile-Val-Leu-Ile [70,71].
El dominio amino terminal varia bastante entre las distintas clases de sHsps, además las
sHsps cloroplastidicas, mitocondriales y las de retículo endoplasmático tienen la secuencia
señal típica de exportación al orgánulo correspondiente [71]. Las sHsps cloroplastidicas de
clase I tienen en la región amino terminal un dominio de 28 aminoácidos rico en metionina,
las sHsps de clase II contienen una pequeña región de 11 aminoácidos conservada en mayoría
de las especies y en las sHsps citosolocias de clase I se presentan 17 aminoácidos [70,71]. Las
sHsps mitocondriales presentan dos secuencias amino terminal, localizadas entre los
aminoácidos 95-105 y 142-152 [68]; esta diversidad en la secuencia de la región amino
terminal puede ser muy importante, ya que les permite a las sHsps unirse a una amplia
cantidad de sustratos [70].
La extensión C-terminal también es bastante diversa entra las distintas clases de sHsps, con
la excepción del motivo Ile-Val-X-Ile-Val que esta conservado en todos los tipos de sHsps
36
[70,72]. Esta región aunque no tiene un papel directo en la unión de los sustratos, contribuye a
la actividad chaperona estabilizando los oligómeros de sHsps [82].
Los modelos actuales proponen que sHSPs actúan como chaperonas independientes de ATP
(figura 14), para ello las sHsps forman oligómeros de 200-300kDa, que en las plantas suelen
estar compuestos por 12 subunidades [67]. Cuando la proteína nativa se encuentra bajo estrés
esta se desnaturaliza y puede unirse a dímeros y oligómeros de sHsps conformando el
complejo proteína-sHsps para evitar de este modo la agregación irreversible. Este complejo
actúa con proteínas como Hsp70, Hsp40, Hsp110 que son dependientes de ATP, para así
permitir el replegamiento del sustrato y permitir su liberación [66].
Figura 14. Mecanismo de accion de las proteinas de la familia sHsp. Recuperado y
modificado de: http://mmbr.asm.org/content/76/2/115/F10.expansion.html
Las sHsps no solo se inducen en respuesta a altas temperaturas, sino que también responden
a otros estímulos ambientales. Las sHsps en animales se relacionan con proceso como la
apoptosis o la formación de tumores [44,54,55]. En el caso de las plantas, los procesos en los
que se evidencia mayor expresión de sHsps en ausencia de choque térmico son la formación
del polen, el desarrollo embrionario [44,55], la maduración del fruto [44] y la maduración de la
semilla. El papel de las sHsps en estos procesos aún no se conoce, pero se cree que
desempeñan un papel importante para desencadenar dichos procesos, quizás relacionado con
la activación y/o desactivación de proteínas relevantes en cada uno [44,67].
37
7.5. PCR EN TIEMPO REAL
La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o cuantitativa (qPCR), es una
modificación de la PCR convencional [72,73]. En principio es igual a una PCR tradicional, la
diferencia se basa en la inclusión de fluorocromos en la mezcla de reacción y un
termociclador especial para la detección de fluorescencia [74].
Mediante la detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad
de ácidos nucleicos específicos en una mezcla, ya que la emisión de fluorescencia producida
en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado [73,74]. Debido a esto la q-PCR
presenta ventajas con respecto a la PCR convencional como la rapidez, la precisión en la
cuantificación de los amplicones presentes en la muestra, la ausencia de manipular geles de
agarosa, y menor riesgo de contaminación.
Los reactivos a usar en la PCR en tiempo real, son los mismos que se utilizan en una PCR
convencional, con la diferencia que en la PCR en tiempo real los primers deben ser diseñados
para garantizar una alta especificidad y generen ampliaciones de un tamaño que oscile entre
100 a 150 pb; si estos son más grandes, la eficiencia de la reacción disminuye
considerablemente [75], además se adiciona un fluorocromo para detectar los productos
amplificados. Los sistemas de fluorescencia pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes y
sondas de hibridación específicas.
Los agentes intercalantes son fluorocromos que tienen afinidad por el ADN de doble cadena
que al ser oxidadas generan una señal fluorescente; la fluorescencia emitida es capturada en
la etapa de extensión de cada ciclo y es proporcional al número de copias de ADN de doble
cadena obtenidas en cada ciclo de la PCR. El más empleado es SYBER Green, este es
excitado a una longitud de onda de 480 nm, mientras que la longitud de onda de emisión
corresponde a 520 nm [75], el principal inconveniente es su baja especificidad, debido a que
se puede unir a cualquier cadena de ADN de doble cadena, para ello se recomienda hacer la
curva melting y corroborar que solamente amplifique una región de ADN.
Por otro lado, las sondas de hibridación específicas, son sondas marcadas con dos tipos de
fluorocromos, un donador y un aceptor. Este proceso sigue el principio de transferencia de
energía de resonancia fluorescente (FRET) para generar la señal; este método consiste en
transferir energía desde un donador o reportero fluorescente a un aceptor o quencher [75].
Sin importar el método que se utilice para detectar los productos amplificados los
termocicladores de PCR en tiempo real incorporan la tecnología de un termociclador de PCR
tradicional con fluorímetros integrados y detectores que proporcionan la capacidad de excitar
tanto un fluorocromo, detectar la luz emitida y realizar el análisis cuantitativo [74,75].
38
7.5.1. Fases de una PCR
Durante la amplificación por PCR, las secuencias cortas de ADN se copian en cada ciclo.
Teóricamente, la cantidad de ADN en la reacción debe duplicar en cada ciclo, lo que resulta
en una amplificación exponencial del ADN objetivo inicial [74]. El proceso se divide en tres
fases (figura 15).
Figura 15. Representación gráfica de las fases de PCR junto con el ciclo umbral CT.
Recuperado y modificado de: Kainz P. (2000) The PCR plateau phase – towaards and
understanding of its limitations [70].
La primera de ellas es una fase exponencial en la que, si la eficiencia de la reacción es del
100%, se produce en cada ciclo exactamente el doble de producto que en el ciclo anterior.
En esta fase la reacción es muy específica y precisa. A continuación tiene lugar la fase lineal,
en la que alguno de los reactivos puede ser limitante, la Taq polimerasa pierde actividad o
bien algún de los productos comienza a degradarse, la reacción se hace lenta y por lo tanto
aumenta la variabilidad en la cantidad del producto final. Finalmente se produce una fase de
meseta (“plateau”), en la que existe inhibición por producto y la reacción de síntesis se
detiene [76].
7.5.2. Cuantificación mediante PCR en tiempo real
El número de ácidos nucleicos diana en la muestra original puede determinarse con precisión
cuando se determina el número de ciclos de PCR donde la señal de fluorescencia se eleva
respecto a la línea base, el cual se conoce como ciclo umbral (CT) (figura 6), o punto de corte
(crossing point) [75].
La cuantificación de la PCR puede ser una cuantificación absoluta o cuantificación relativa
de acuerdo a los intereses del análisis.
39
En la cuantificación absoluta es necesario realizar una curva patrón con estándares conocidos [26]. Estas curvas producen relaciones lineales entre el CT y la cantidad inicial de RNA o
cDNA, permitiendo determinar la concentración de muestras desconocidas mediante el
análisis de sus CT y aplicando la ecuación de la recta. Esta cuantificación se emplea para
conocer la cantidad inicial de ADN molde, número de copias, o concentración en masa [26].
La cuantificación relativa se usa cuando se desean evaluar los cambios en la expresión de
genes en distintos estados fisiológicos. Estos cambios se basan en los niveles del ARNm del
gen blanco comparados con un gen de referencia que no cambia su expresión a pesar de que
los estados fisiológicos se modifiquen por diversas causas. Los datos son expresados como
relativos al gen de referencia y generalmente son referidos como el número de veces en el
que aumentaron o disminuyeron los niveles de ARNm [77]. En este caso se parte de los niveles
del transcrito o ARNm de las muestras, por lo que es necesario realizar la transcripción
reversa (RT) donde el ARN es retrotranscrito en cADN y los ensayos se conocen como RT-
PCR en tiempo real [75,77].
7.6. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON DODECIL
SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE)
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas en un campo eléctrico,
la velocidad de migración de las moléculas depende de su relación carga: masa [78]. La
electroforesis se utiliza para separar y visualizar proteínas, lo que permite estimar
rápidamente el número de diferentes proteínas en una mezcla o el grado de pureza de una
preparación de proteína particular. También permite la determinación de propiedades
significativas como el punto isoeléctrico y el peso molecular aproximado [79]. Generalmente
esta técnica de separación de proteínas se lleva a cabo en geles de poliacrilamida (PAGE).
La poliacrilamida, es un polímero reticulado, químicamente inerte, resistente a agentes
desnaturalizantes (Urea, detergentes), forma geles transparentes con estabilidad mecánica, y
permite buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado, además tiene la
ventaja de que al variar la concentración de polímero se puede modificar de manera
controlada el tamaño del poro [80] que actúa como un tamizador molecular, garantizando la
migración de proteínas por medio de su relación carga- masa. Un método comúnmente
empleado en la electroforesis de proteínas hace uso del detergente dodecilsulfto de sodio
(SDS).
7.6.1. Preparación del gel de poliacrilamida con SDS
El soporte se prepara a partir del monómero de acrilamida que forma largas cadenas lineales,
con abundantes grupos polares que las hace solubles en medios acuosos. Al no estar las
cadenas unidas entre sí, formarían un gel sin consistencia mecánica y totalmente inmanejable.
Para evitar esto, se utiliza otro monómero, la N,N’-metilen-bisacrilamida que forma uniones
covalentes con las cadenas de acrilamida para formar un entramado [79,81] . En función de la
40
concentración de acrilamida se obtienen entramados más o menos densos, mientras que la
cantidad de N,N’-metilen-bisacrilamida condiciona el grado de entrecruzamiento de las
cadenas. Ambos componentes determinan, en conjunto, las características físicas del gel
resultante como su resistencia mecánica, fragilidad, elasticidad, y tamaño del poro, al
momento de realizar el gel es indispensable saber el porcentaje de acrilamida en el gel ya que
este determina el rango de peso molecular en (kDa) a separar [81] (tabla 4).
Tabla 4. Rango de separación de proteínas, según el porcentaje de acrilamida [81]
Porcentaje Rango peso molecular (kDa)
7.5 22-500
10 15-300
12 10-200
15 10-45
20 5-40
La polimerización de la acrilamida (figura 16) se obtiene por la adición de catalizadores como
el persulfato de amonio (PSA) generando radicales libres que catalizan la reacción de
polimerización y junto a ello tetrametiletilendiamina (TEMED) que aumenta la generación
de radicales libres por el PSA [81].
El SDS desnaturaliza por completo las proteínas y rompe las interacciones no covalentes que
determinan la estructura terciaria y cuaternaria, uniéndose una molécula de SDS por cada dos
aminoácidos de la cadena. Los grupos alifáticos dodecil se colocan en el interior, mientras
que los grupos sulfato en la superficie y todos los complejos SDS-proteína toman carga neta
negativa [79]. La fuerza iónica del sistema tampón debe mantenerse a un nivel adecuado para
garantizar la solubilidad de la muestra y suficiente capacidad amortiguadora, por lo general
se utiliza una solución o buffer de Tris-HCl.
Para obtener un alto poder de resolución se utiliza el sistema electroforético discontinuo,
donde el gel está formado por dos geles de distinta porosidad y pH, en la parte superior se
encuentra el gel compactador y en la parte inferior el gel separador [79].
41
Figura 16. Polimerización de poliacrilamida. Recuperado de:
https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/polyacrylamide-matrix
Una vez se realiza la electroforesis SDS-PAGE, se separa el gel de los vidrios y se visualiza
con un colorante, el más utilizado es el azul de Coomassie con el que se pueden observar
0.1-0.5 μg de proteína por banda, otro método de tinción es con sales de plata que debido a
su sensibilidad logra detectar hasta 0.1 ng de proteína por banda [82]. Una vez teñido el gel de
poliacrilamida, la imagen que se obtiene es un conjunto de bandas coloreadas sobre el gel.
Su análisis permite identificar el número mínimo de componentes (bandas) de cada muestra
(figura 17).
Figura 17. a. electroforesis en gel discontinuo de poliacrilamida con SDS; b. luego de la
electroforesis las proteínas se visualizan con azul de coomassie. Recuperado y modificado
de: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/polyacrylamide-matrix
42
8. METODOLOGÍA
8.1. DELIMITACIÓN Y ÁREA DE ESTUDIO
Para el estudio se escogieron las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645
irradiadas con 60Co. Se pretende evaluar la expresión de proteínas de choque térmico sHsp’s
(OsHsp16.9, OsHsp18, OsHsp26.7), Hsp70, Hsp90 en las tres variedades por medio del
sometimiento a estrés por alta temperatura en condiciones de cultivo hidropónico, haciendo
uso de las técnicas qRT-PCR y SDS-PAGE.
El proyecto se desarrolló en las instalaciones del laboratorio de Biología Molecular, ubicado
en la sede B de la facultad de Ciencias y Educación de la Universidad Distrital Francisco
José de Caldas.
8.2. PRE GERMINACIÓN
La pre-germinación y germinación de las semillas de Oryza Sativa se realizó siguiendo el
protocolo de Cañate y Novoa [3]. En la fase de pre-germinación se dispusieron 30 semillas en
una caja de Petri que contiene previamente papel humedecido con agua y posteriormente se
llevaron al fitotrón donde la temperatura óptima fue de 28°C y una humedad del
70%, durante 7 días o hasta que se evidencio el desarrollo de la radícula. Una vez culminada
esta fase, las semillas estaban listas para el proceso de germinación.
8.3. MEDIO DE CULTIVO YANG XIAO´ER
Para el crecimiento de las plantas se utilizó el medio de cultivo Yang Xiao´er. Para el
desarrollo óptimo de las plantas el pH del medio debe estar entre 5.60 a 6.00, la composición
y concentraciones para un 1L de solución se presentan en la tabla 5:
Tabla 5. Composición nutricional para un litro de cultivo líquido r..Yang Xiao´er.
ID Reactivo Wt (g) Stock
(mol/L) Stock Elemento
Concentración
del elemento mL
A NH4NO3 80.04 0.715 57.29 g/L N 1.43 mmol/L 1
B NaH2PO4. 2H2O 156.01 0.16 24.81 g/L P 0.32 mmol/L 1
C K2SO4 174.25 0.2 34.50 g/L K 1.32 mmol/L 3.3
D CaCl2. 2H2O 147.03 0.5 73.52 g/L Ca 1.0 mmol/L 1
E MgSO4. 7H2O 246.48 0.82 202.11 g/L Mg 1.64 mmol/L 1
F
MnCl2. 4H2O 197.92 5.0 989.6 mg/L Mn 9.1 µmol/L
1 (NH4)6
. Mo7O24
.
4H2O
1235.8
6 0.075 92.689mg/L Mo 0.52 µmol/L
H3BO3 61.83 1.90 1117.47 mg/L B 18 µmol /L
43
8.4. GERMINACIÓN
Una vez pre-germinadas las semillas, se trasladó cada uno de los genotipos a una pl aca de
PCR, estas fueron puestas sobre una solución nutritiva de medio Yang para que floten sobre
ella, de tal forma que solo las radículas queden sumergidas en el medio de cultivo. Cada tres
días se realizó el cambio de medio.
El procedimiento se realizó en una cámara de crecimiento “fitotron” marca Binder donde se
mantuvieron las plantas durante 8 horas de oscuridad a una temperatura de 20°C y 16 horas
de luz a 28°C y una humedad relativa del 70%, durante cuatro semanas donde alcanzaron el
estadio de plántula.
8.5. ESTRÉS TÉRMICO
Los tres genotipos de Oryza Sativa (Fedearroz 473 (F473), Fedearroz Mocarí (Mocarí) y
Linea avanzada 1645 (Lv 1645) en estadio de plántula fueron sometidos a un estrés térmico
por un día entre las 11:00 am y las 3:10 pm, para ello se realizaron tres tratamientos térmicos:
uno control (TC; 28°C), uno con estrés moderado (T1; 35°C) y otro con estrés alto (T2;
42°C) [3], el fitotrón que se utilizó a lo largo del proyecto es de marca Binder, este permitió
programar los diferentes tratamientos con las variaciones de luz, temperatura y humedad
relativa requeridos.
Tabla 6.Condiciones de estrés térmico para cada uno de los tratamientos (TC, T1 y T2)
8.6. DISEÑO DE CEBADORES
En el diseño de los cebadores para el desarrollo de la qRT-PCR se utilizaron las secuencias
de “Rice Genome Annotation Project [83]”. En el caso de Hsp16.9, la secuencia utilizada fue
>LOC_Os01g04270.1 [84], para Hsp18, se empleó la secuencia >LOC_Os01g08860 [85], y
para la Hsp26.7 se utilizó la secuencia >LOC_Os03g14180.1 [86], cada gen correspondiente
al gen que codifica a la proteína de interés. Por otro lado para el diseño de cebadores para las
secuencias de Hsp70 y Hsp90 se utilizaran los propuestos por Cañate y Novoa[3]. (Anexo 1)
ZnSO4. 7H2O 287.56 1 287.66 mg/L Zn 0.15 µmol /L
CuSO4. 5HO 249.68 0.2 49.93 mg/L Cu 0.16 µmol /L
G FeCl3. 6H2O 270.3 Fe 36 µmol /L 1
Tiempo de
estrés
Hora toma
de muestra
Temperatura °C
Luz
%
Humedad
relativa TC T1 T2
11:00 am -
3:10 pm
E1: 11:10 am 28 35 42 Completa 70%
E2: 1:10 pm 28 35 42 Completa 70%
E3: 3:10 pm 28 35 42 Completa 70%
44
Los cebadores que fueron escogidos para llevar a cabo el estudio fueron realizados en
Integrated DNA Tecnologies (IDT) [87]. (Tabla 7).
Tabla 7. Secuencias de cebadores para los genes de interés realizados en Integrated DNA
Tecnologies (IDT).
Gen Secuencia Primer Tm Pb
Hsp16.9 >LOC_Os01g04270.1 F 5’-TACCACCGCTGTGTTGAAAG-3 63
104 R 3’-TCTCGTGACTCTCATCCTTATCC-5’ 68
Hsp18 >LOC_Os01g08860.1 F 5’- AGGAGGAGTCGTGCAAGTA-3’ 62
106 R 3’-CGATGGTCTTGGGCTTCTT-5’ 62
Hsp26.7 >LOC_Os03g14180.1 F 5’-GAGGATGCGGTTCGACAT-3’ 62
105 R 3’-TCGCCCTCCTCCTTCTT-5’ 62
Hsp70 X67711.2 F 5’-CGTCTCATTGGCAGGAGGTT-3’ 57
446 R 3’-TCTTCACCACCAAGATGGGT-5’ 55.6
Hsp90 AB037681 F 5′CACTCTACAGCAACAAGGAC-3′ 53.1 459 R 5′-CACGTACTCCT-TGGCTTCAT-3′ 54.4
8.7 EXTRACCIÓN DE ADN
Se realizaron seis extracciones de ADN en plántulas de Mocarí, traídas de Saldaña – Tolima,
haciendo uso del Ultra clean plant DNA Isolation Kit de MoBio (Anexo 2). Posteriormente
se cuantificaron las muestras. (Anexo 3).
8.8 PCR CONVENCIONAL
A partir de las extracciones de ADN obtenidas, se realizó una PCR convencional para
amplificar los genes de interés haciendo uso del kit (Anexo 4). A continuación se presentan
las cantidades de cada reactivo.
Tabla 8. Volúmenes para PCR para un tubo /muestra
Compuesto 1 Tubo (µl)
Agua 7.75
Buffer 1.25
MgCl2 0.625
DNTP´s 0.25
Primer Foward 0.75
Reverse 0.75
Taq 0.25
ADN 1
Total 12.5
45
Las condiciones utilizadas para la PCR se presentan en la tabla 9.
Tabla 9. Programa PCR en tiempo real para Hsp70, Hsp90 y sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18,
Hsp26.7)
No. de ciclos Proceso Temperatura (°C) Tiempo
1 Desnaturalización inicial 94 1 min.
40 - 45
Desnaturalización 94 30 s
Unión del primer
Hsp 16.9 57.6
45 s
Hsp 19 57
Hsp 26.7 61.6
Hsp 70 59.5
Hsp 90 59
Extensión 72 1 min
1 Incubación 4 2 min
Una vez terminada la PCR se realizó electroforesis en geles de agarosa al 1.5%. Cada gel se
corrió durante 50 minutos a 120V y 200 mA con el fin observar la amplificación de cada gen
en el gradiente de temperatura propuesto.
8.7. EXTRACCIÓN DE ARN
Se realizó la extracción de ARN de cada uno de los genotipos durante cada tratamiento, para
ello se pesó 2 gr de muestra vegetal de hoja y se macero con nitrógeno líquido, posterior a
esto se tomaron 0.5 gr de muestra de material vegetal macerado y se empleó el protocolo de
extracción de ARN UltraClean Plant RNA Isolation K de Mo – Bio (Anexo 5). La
extracción de ARN se realizó entre las 11:00 am hasta las 3:10 pm, por lo cual se obtuvieron
3 muestras de ARN para tener en total 6 muestras para genotipo en cada tratamiento. A
continuación, se presenta el cronograma de extracción. Las extracciones se realizaron por
duplicado.
Tabla 10. Cronograma de extracción de ARN para un día
Tratamiento Temperatura Max. (°C) Hora de extracción ARN
TC 28
11:10 am; 1:10 pm; 3:10 pm. T1 35
T2 42
8.8. qRT- PCR
A partir de las muestras de ARN de cada tratamiento y genotipo se procedió a realizar la
qRT-PCR mediante el KIT iScript one-step RT-PCR kit with SYBR® Green (Anexo 6). A
continuación, se presentan las cantidades de cada reactivo del kit para un tubo/muestra, las
cuales fueron modificadas por OrjuelaD, Martin D (2012) [90].
46
Tabla 11. Volúmenes para qRT-PCR para un tubo /muestra
Compuesto 1 Tubo (µl)
Agua libre RNasa 3.32
iSCRIPT 0.24
Syber Green Reaction Mix 6
Primer Foward 0.72
Reverse 0.72
ARN 1
Total 12
El programa para la PCR en tiempo real se realizó teniendo en cuenta las condiciones de la
PCR convencional.
Tabla 12. Programa PCR en tiempo real para Hsp70, Hsp90 y sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18,
Hsp26.7)
No. de ciclos Proceso Temperatura (°C) Tiempo
1 Desnaturalización inicial 94 1 min.
40 - 45
Desnaturalización 94 30 s
Unión del primer
Hsp 16.9 57.6
45 s
Hsp 19 57
Hsp 26.7 61.6
Hsp 70 59.5
Hsp 90 59
Extensión 72 1 min
1 Extensión final 72 7 min.
1 Incubación 4 2 min
8.9. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES
Se extrajo proteínas totales de cada uno de los genotipos durante cada tratamiento, para ello
se tomaron 0.5 g de tejido vegetal y se realizó la lisis celular con nitrógeno líquido,
posteriormente se adiciono buffer de glicina (glicina, 2-mercaptoetanol, glicerol, NaOH)
a 4°C para la extracción de proteínas, se homogenizo y se incubo durante 1 hora a 4°C, luego
se centrifugo a 4°C durante 30 minutos con 14000 rpm, finalmente se separó el sobrenadante
y se almaceno a 4°C. La extracción de proteínas totales se realizó entre las 11:10 am hasta
las 3:10 pm, por lo cual se obtuvieron 3 muestras de proteínas totales para cada tratamiento
y genotipo. A continuación se presenta el cronograma de extracción.
47
Tabla 13. Cronograma de extracción de proteínas totales para un día
Tratamiento Temperatura
Max. (°C)
Hora de extracción de
Proteínas totales
TC 28
11:10 am; 1:10 pm; 3:10 pm. T1 35
T2 42
8.10. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL
La cuantificación de proteínas totales se hizo por el método de Bradford, utilizando como
patrón Albumina Sérica Bovina (BSA).
8.10.1. Cuantificación por Bradford
Para la cuantificación por Bradford se realizó una curva patrón a partir de Albumina sérica
bovina (BSA), la curva y las muestras se prepararon de acuerdo a la tabla 14.
Tabla 14. Concentraciones para la preparación de la curva de calibración con BSA y las
muestras [89]
Buffer
Glicina Blanco
Patrón
20
mg/dL
Patrón
40
mg/dL
Patrón
60
mg/dL
Patrón
80
mg/dL
Patrón
100
mg/dL
Patrón
120
mg/dL
Muestra
H2O 100 L 100 L 840 L 670 L 500 L 340 L 170 L 0 L
Patrón 120
mg/dL
160 L 330 L 500 L 660 L 830 L 100 L
Muestra 1 100 L
Reactivo
Bradford
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Una vez preparados los patrones, se dejó a temperatura ambiente y se midió la Absorbancia
a 595 nm frente al blanco. El color es estable 1 hora.
8.11. SDS-PAGE
La separación de proteínas se realizó por medio de electroforesis, utilizando geles de
poliacrilamida al 12.5%, tiempo de corrida 130 minutos a 100V y 43mA. La visualización
del gel se utilizó la tinción con azul de coomassie (Anexo 7).
48
Tabla 15. SDS-PAGE 12.5% para proteínas de alto peso molecular
Reactivo Concentración Volumen 4 mL Volumen 2 mL
Agua Destilada 1250 L 1040 L
Acrilamida + Bisacrilamida
Poliacrilamida 30 % 1650 L 400 L
Tris HCl pH 8.8 1,5 M 1000 L -
Tris HCl pH 6.8 1 M - 500 L
SDS 10 % 40 L 20 L
(PSA) 10% 40 L 20 L
TEMED 4 L 2 L
8.12. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO
El proyecto tendrá un Diseño Factorial Completamente al Azar (DCA), debido a que
cualquier número de tratamientos y cualquier número de réplicas pueden ser usados, en este
caso se realizaran dos replicas, ya que las unidades experimentales se mantendrán
homogéneas. Por otra parte el análisis estadístico es simple porque se espera que todos los
tratamientos tengan igual número de réplicas y se trata como un análisis balanceado.
49
9. RESULTADOS Y ANÁLISIS
9.1. Estandarización de primer’s
Para la estandarización de primer’s se utilizaron plántulas de campo de la especie Oryza
sativa – vr. Mocarí, traídas de Saldaña – Tolima (Colombia); con el fin de corroborar la
elaboración optima de los primer’s e identificar la presencia de los genes de interés sin la
formación de dímeros. Para verificar lo anterior se realizaron 6 extracciones de ADN, PCR
convencional y electroforesis en geles de agarosa (1.5%).
Para el desarrollo de la PCR convencional se realizaron los cálculos respectivos para
determinar la temperatura de anillamiento de los genes de interés; sin embargo, al
contrastarlos con los datos obtenidos de la literatura y del programa Integrated DNA
Tecnologies, se observaron diferencias significativas; por lo tanto se realizó la PCR con un
gradiente de temperatura de 57°C a 62.8°C y de esta manera definir la temperatura más
apropiada para cada juego de primer (tabla 15).
9.1.1. Gen Hsp 16.9
Figura 18. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 16.9 en Gel Doc XR
System Bio Rad, amplificado por PCR. Actina (Ac); 1: 57ºC; 2:57.6ºC; 3:58.2ºC; 4: 59.1ºC;
5:60.2ºC; 6:61,6ºC; 7:62.8ºC; Marcador Hyperlader IV (M). Tomado por: Autoría propia
Arce R, Martínez C (2016).
De acuerdo a los valores teóricos de temperatura se realizó la PCR con un gradiente de
temperatura de 57ºC a 62.8ºC. En la figura 19 se puede apreciar que la banda con mejor
característica está ubicada en el carril 2 y presenta una temperatura de anillamiento de 57.6
°C. La cual fue escogida para realizar la qRT-PCR.
Ac. 1 2 3 4 5 6 7 M
50
9.1.2. Gen Hsp 18
Figura 19. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 18 en Gel Doc XR System
Bio Rad, amplificado por PCR. 1: 57ºC; 2:57.6ºC; 3:58.2ºC; 4: 59.1ºC; 5:60.2ºC; 6:61,6ºC;
7:62.8ºC; Marcador Hyperlader IV (M); Actina (Ac). Tomado por: Autoría propia Arce R,
Martínez C (2016).
De acuerdo a los valores teóricos de temperatura se realizó la PCR con un gradiente de
temperatura de 57ºC a 62.8ºC. En la figura 20 se puede apreciar que la banda con mejor
característica está ubicada en el carril 1, ya que aunque ninguno presenta dímeros es la que
se ve más pronunciada en comparación con las muestras de los demás carriles, en especial
las muestra 6 y 7. La muestra del carril 1 presenta una temperatura de anillamiento de 57°C.
La cual fue escogida para realizar la qRT-PCR.
9.1.3. Gen Hsp 26.7
De acuerdo a los valores teóricos de temperatura se realizó la PCR con un gradiente de
temperatura de 57ºC a 62.8ºC. En la figura 20 se puede apreciar que la banda con mejor
característica está ubicada en el carril 6 ya que las demás bandas (1,2,3,4) presentan dímeros
y la 7 es muy tenue; por lo tanto la temperatura de anillamiento es de 61.6°C. La cual fue
escogida para realizar la qRT-PCR.
Para los primer’s correspondientes a Hsp 70 y Hsp 90 se utilizaron las temperaturas de
anillamiento estandarizadas por Cañate y Novoa (2013); siendo estas de 59°C.
1 2 3 4 5 6 7 M Ac. 100 pb
51
Figura 20. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 26.7 en Gel Doc XR
System Bio Rad, amplificado por PCR. 1: 57ºC; 2:57.6ºC; 3:58.2ºC; 4: 59.1ºC; 5:60.2ºC;
6:61,6ºC; 7:62.8ºC; Marcador Hyperlader IV (M); Actina (Ac). Tomado por: Autoría propia
Arce R, Martínez C (2016).
a) b)
Figura 21. a) Amplificación de los primer’s por PCR, visualización en Gel Doc XR System
Bio Rad. 1) gen Hsp 16.9; 2) gen Hsp 18; 3) gen Hsp 26.7; 4) Marcador Hyperladder IV; 5)
gen Hsp 70; 6) gen Hsp 90. b) Marcador de peso molecular Hyperladder IV. Tomado por:
Autoría propia Arce R, Martínez C (2016).
En la figura 21 se observa como las muestras sembradas amplificaron y se ubicaron en sus
bandas respectivas de acuerdo a su peso molecular (pb). Hsp 16.9 con un peso de 104 pb,
Hsp 18 con 106 pb, Hsp 26.7 con 105 pb, Hsp 70 con 476 pb y Hsp 90 con 459 pb. La
información anterior se resume en la tabla 16.
1 2 3 4 5 6 7 M Ac.
1 2 3 M 4 5
Dímeros
100 pb
500 pb
100 pb
52
Tabla 16. Temperatura de anillamiento y pb para los primer’s de interés
Primer
Temperatura de
anillamiento
teórica (°C)
Temperatura de
anillamiento Integrated
DNA Tecnologies (IDT)
(°C)
Temperatura de
anillamiento
experimental (°C)
Pares de
bases
(pb)
Hsp
16.9
F 60 F 63 57.6 104
R 62 R 68
Hsp 18 F 58 F 62
57 106 R 58 R 62
Hsp
26.7
F 56 F 62 61.6 105
R 54 R 62
Hsp 70 F 60 F 57
59 476 R 60 R 55.6
Hsp 90 F 62 F 53.1
59.5 459 R 60 R 54.4
9.2. Tasa de germinación
Para cada tratamiento y variedad se dispuso de 120 semillas repartidas en 3 cajas de Petri
(figura 22). En los tres tratamientos se utilizaron en total 360 semillas por cada variedad. En
la tabla 14 se muestran los porcentajes de germinación para cada genotipo; siendo la variedad
Fedearroz Irradiada la que mayor porcentaje de germinación tuvo, con un 90%, seguida de
Fedearroz 473 y Línea Avanzada 1645 con un 85.5% y 85% respectivamente. Por el
contrario, Mocarí y Mocarí Irradiada tienen la menor tasa de germinación de 2.7% y 2.5%,
obteniendo de esta manera el material vegetal preciso para el desarrollo del trabajo. Las
semillas de Mocarí y Mocarí irradiada estuvieron durante cinco años en el banco de semillas
de Saldaña – Tolima, lo que pudo afectar la calidad de la semilla si las condiciones de
almacenamiento no fueron las adecuadas. No obstante, los factores que afectan la
germinación de las semillas se dividen en internos y externos. La latencia puede ser generada
por procesos metabólicos lentos, originados por una baja humedad o alteración de la
temperatura interna necesaria para el desarrollo óptimo de los procesos fisiológicos, o por
presencia de sustancias inhibidoras en la envoltura de la semilla como compuestos fenólicos.
Para romper la latencia se recomienda realizar diferentes procesos tales como dejar las
semillas durante un tiempo considerable en agua, someterlas a temperatura de 45°C a 50°C
por cinco días o sumergirlas en ácido nítrico. Para la finalidad del trabajo las semillas se
dejaron en agua durante 2 días, y no se sometieron a tratamiento térmico ni químico ya que
de esta manera se estaría induciendo un estrés a la semilla desde su germinación.
53
a.
b.
c. d.
Figura 22. a. semillas sembradas en cajas de Petri; b. 40 semillas de cada variedad por
caja; c. brote de raíz en la semilla, d; germinación de la semilla. Tomado por: Autoría
propia Arce R, Martínez C (2016).
Tabla 17. Porcentajes de germinación de las 3 variedades
Variedad Semillas
sembradas
Semillas
germinadas
Porcentaje
Germinación (%)
F 473 360 308 85.5
F 473 i 360 324 90
Mocarí 360 10 2.7
Mocarí i 360 9 2.5
LV 1645 360 306 85
Lv 1645 i 360 80 22.2
9.3. Características fenotípicas
Se realiza un análisis de las características fenotípicas que presentaron cada una de las
variedades en los diferentes momentos de estrés en los tres tratamientos.
9.3.1. Características fenotípicas en el Tratamiento control (TC)
Las variedades de arroz Fedearroz 473, Fedearroz 473 Irradiada, Mocarí (M), Mocarí
Irradiada (MI), Línea avanzada 1645, Línea Avanzada 1645 Irradiada se mantuvieron a 28°C.
Para este tratamiento se realizaron tres extracciones E1: 11:10 am; E2: 1:10 pm y E3: 3:10
pm.
Tabla 18. Comparación del crecimiento de los genotipos F473, Mocarí, Lv 1645 control e
irradiadas, en las tres extracciones del tratamiento control.
Extracción F473 F473i Mocarí Mocarí
irradiada Lv 1645
Lv 1645
irradiada
E1
Hoja cm 13 12 11.5 15 13.25 14
Tallo cm 6.5 5.75 5 6 6.25 4
Raíz cm 7 4.75 7.5 7 7.5 8
E2 Hoja cm 12.6 13 15 14 14.5 14
Tallo cm 6 5.5 6 6 6 4
54
Raíz cm 6 5 7 5 7 7
E3
Hoja cm 12.5 13.5 13 14 12.5 13
Tallo cm 5.5 5 6 6 7 5
Raíz cm 7.5 5 6.7 6 7 6.5
En el momento de extracción de ARN durante el tratamiento control se midió la longitud de
cada una de las plantas a usar, se tomaron datos como la longitud de la hoja bandera, el tallo,
y la raíz (tabla 18). No se presentaron diferencias significativas en cuanto a la altura de la
planta entre las variedades en cada momento de extracción, aun así, Mocarí y Lv1645
irradiadas y control fueron más altas que F473 irradiada y control con una diferencia entre 1
y 2 cm puesto que esta última es una variedad que se caracteriza por presentar porte bajo.
Tabla 19. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento control.
Tomado por: Autoría propia Arce R, Martínez C (2016).
Variedad E1 E2 E3
F 473
Figura 23
Figura 24
Figura 25
F 473
irradiad
a
Figura 26
Figura 27
Figura 28
55
Mocarí
Figura 29
Figura 30
Figura 31
Mocarí
irradiad
a
Figura 32
Figura 33
Figura 34
LV1645
Figura 35
Figura 36
Figura 37
56
LV1645
irrariada
Figura 38
Figura 39
Figura 40
En el TC a 28°C durante las tres extracciones (tabla 19), no se observaron alteraciones
relevantes a nivel morfológico, debido a que esta temperatura es la apropiada para el
crecimiento normal de la planta y por lo tanto no se encuentra bajo estrés térmico. Las
características como el color de la hoja y el tamaño de la planta no tuvieron cambios
significativos durante el tiempo en el que se realizaron las extracciones. Como consecuencia
de la radiación emitida se generaron procesos de mutación en la coloración de la hoja en las
variedades irradiadas de Mocarí y Lv 1645. Mocarí irradiada durante todo el proceso de
crecimiento presento despigmentación a lo largo de la lámina de la hoja lo que se conoce
como maculata (figura 33) y Línea avanzada 1645 irradiada (figura 39) presenta
despigmentación en las puntas de las hojas, y líneas blancas longitudinales conocido como
estriata[22]. Según estudios de La Federación Nacional de Arroceros (FEDEARROZ), en su
boletín 489[36], se refiere a Fedearroz 473 y Mocarí como plantas termo tolerante y termo
resistente respectivamente y Lv 1645 como susceptible a altas temperaturas en zonas costeras
del país, donde la temperatura es demasiado alta. Por otro lado, en las pruebas de germinación
y crecimiento realizadas en el laboratorio a condiciones normales de temperatura (28°C) y
humedad (70%) Lv 1645 sin irradiar presento mejores características que Fedearroz 473 y
Mocarí; debido a su porte, hoja vigorosa, tallo grueso y raíces fuertes, lo que permitió
escogerla como biotipo para realizar las curvas estándar de la qRT-PCR. Es importante
aclarar que en el T1 y T2 no se tomaron en cuenta plantas de cada variedad sin irradiar, puesto
que la finalidad del trabajo es mirar la expresión de los genes que codifican dichas proteínas
en plantas que han sido expuestas a radiación con 60Co.
9.3.2. Características fenotípicas en el Tratamiento 1 (T1)
Las plántulas de arroz Fedearroz 473 Irradiada, Mocarí Irradiada y Línea Avanzada 1645
Irradiada, fueron sometidas a estrés a 35°C de 11:00 am a 3:10 pm. Para este tratamiento se
realizaron tres extracciones E1: 11:10 am; E2: 1:10 pm y E3: 3:10 pm.
57
Tabla 20. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento 1. Tomado por:
Autoría propia Arce R, Martínez C (2016).
Variedad E1 E2 E3
F 473
irradiada
Figura 41
Figura 42
Figura 43
Mocarí
irradiada
Figura 44
Figura 45
Figura 46
LV1645
irrariada
Figura 47
Figura 48
Figura 49
Durante el T1 (35°C) (tabla 20) en la E1 no se presentaron grandes cambios a nivel
morfológico en cada una de las plantas (Figura 41,44,47); transcurridas dos horas de estrés
en la E2 del mismo tratamiento se observaron pequeños cambios en cada una de las
variedades. En F473 (figura 42) algunas de las hojas laterales comienzan a quemarse como
mecanismo de defensa para proteger la hoja bandera; en Mocarí (figura 45) las hojas
presentaron necrosis apical, deshidratación tomando una apariencia seca y a doblarse debido
al aumento de temperatura y Lv 1645 (figura 48) presento necrosis apical en mayor
proporción que Mocarí. Transcurridas cuatro horas del estrés, en la E3 las plantas de cada
una de las variedades conservaron las características que presentaron durante la E2.
58
9.3.3. Características fenotípicas en el Tratamiento 2 (T2)
Las plántulas de arroz Fedearroz 473 Irradiada, Mocarí Irradiada y Línea Avanzada Irradiada
fueron sometidas a estrés a 42°C de 11:00 am a 3:10 pm. Para este tratamiento se realizaron
tres extracciones E1: 11:10 am; E2: 1:10 pm y E3: 3:10 pm.
Tabla 21. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento 2. Tomado por:
Autoría propia Arce R, Martínez C (2016).
Variedad E1 E2 E3
F 473i
Figura 50
Figura 51
Figura 52
Mocarí
irradiada
Figura 53
Figura 54
Figura 55
LV1645
irrariada
Figura 56
Figura 57
Figura 58
59
En el T2 (42°C) (tabla 21) en la E1 no se observan cambios morfológicos considerables en
F473 y Lv 1645 (Figura 50, 56), en cambio en Mocarí las hojas laterales se doblan y algunas
toman una coloración naranja en la punta de la hoja, esto puede ser debido a una deficiencia
de magnesio [19] porque aumenta el ángulo que forman la vaina y la lámina foliar. En la E2 la
variedad F473 (figura 51) evidencio necrosis apical en comparación con la E2 del T1, junto
a ello las hojas laterales se comienzan a quemar como mecanismo de protección de la hoja
bandera en mayor cantidad en relación con el T1; las hojas de Mocarí presentan una
deshidratación significativa al punto de necrosis foliar (figura 54) y Lv 1645 presenta
necrosis apical en mayor cantidad que el T1, y manchas en las hojas producto de la
temperatura. Al finalizar el tratamiento, es decir transcurridas cuatro horas de estrés (E3) no
varía de manera relevante las condiciones de cada una de las variedades de estudio.
9.3.4. Crecimiento de las tres variedades en los tratamientos
En la tabla 22, se presenta el crecimiento de los genotipos F473, Mocarí y Lv 1645 irradiadas
en las tres extracciones de los TC, T1 y T2. Para cada caso se midió la longitud de la hoja, el
tallo y la raíz.
Tabla 22. Comparación del crecimiento de los genotipos F473, M, Lv 1645 irradiadas, en
las tres extracciones del tratamiento TC, T1, T2.
Extracción F473 irradiada Mocarí irradiada LV 1645 irradiada
TC T1 T2 TC T1 T2 TC T1 T2
E1
Hoja cm 12 12.5 12 12,7 13 12,7 13,4 14 14
Tallo cm 5.75 6.5 5.75 6 6.2 6 4 6 4
Raíz cm 4.75 4.5 4.75 7 4 7 8 5 8
E2
Hoja cm 13 11.5 13 14 12.5 14 14 14 13.6
Tallo cm 5.5 5.7 5.5 6 6.8 6 4 6.5 4
Raíz cm 5 4 5 5 4.5 5 7 6.4 7
E3
Hoja cm 12,8 13.2 13.5 14 13,7 14 13 13 13
Tallo cm 5 6.2 5 6 7 6 5 6 5
Raíz cm 5 3.8 5 6 4.7 6 6.5 4.8 6.5
Se realizaron mediciones de la longitud de la hoja, ya que esta era el órgano vegetativo del
cual se extraería el ARN para el trabajo, por lo tanto se pretendía mirar si durante el tiempo
de estrés las plantas podían presentar variaciones en su tamaño. De acuerdo a la gráfica 1, se
puede observar que no hay diferencias relevantes entre el tamaño de las hojas, estas están en
un rango de 12 a 14 cm de largo, lo que permite inferir que el tiempo de estrés (4 horas) al
que fueron sometidas las plantas no influyo en el tamaño de las mismas. Además se corrobora
que Fedearroz es una planta de porte bajo en comparación con Mocarí y Lv 1645, durante
todos los tratamientos es la que menor tamaño presenta siendo este entre 11.5 y 13.2 cm;
Mocarí y Lv1645 oscilan entre 12.7 y 14 cm, cerca de 2 cm por encima del tamaño de F473
60
Gráfica 1. Comparación del crecimiento foliar de F473, Mocarí y Lv 1645 en los tres
tratamientos.
9.4. Extracción ARN
Las extracciones de ARN con replica se realizaron de acuerdo a la metodología planteada,
siendo tres extracciones para cada variedad por tratamiento. Las muestras de ARN se
cuantificaron en el espectrofotómetro NANODROP 2000/2000c thermo scientific (Anexo 8)
con el fin de escoger las extracciones de mejor calidad que serían utilizadas para la curva
estándar y muestras problema para la qRT-PCR. Para determinar las muestras de mejor
calidad, se tuvieron en cuenta parámetros como la relación 260/280 que evalúa la
contaminación por proteínas y la relación 260/230 que evalúa la contaminación por sales y
otros interferentes. Para que una muestra de ARN se considere pura la relación 260/280 debe
esta estar entre 2.0 y 2.2; y la relación 260/230 debe ser mayor a 1.5. Las muestra problemas
fueron normalizadas a 100ng/µL, con la finalidad de observar si en la misma cantidad de
ARN había o no diferencias en la expresión de cada uno de los genes.
Gráfica 2. Cuantificación de una muestra de
ARN de Lv 1645
61
9.5. Curva melting
Aunque el SBYR Green es uno de los reporteros fluorescentes más utilizados, debido a su
bajo costo, la principal desventaja es que puede unirse a cualquier molécula de ADN de doble
cadena, incluyendo dímeros de primer´s [75]. Por tal razón, se realizó una qRT-PCR por gen,
para verificar que los primer´s escogidos amplificaran el gen diana sin la formación de
dímeros, lo cual puede observarse mediante la curva melting (gráfica 3). Cada uno de los
genes de estudio Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70, Hsp90, presentaron un solo pico lo que
indica que solo está amplificando una región, correspondiente al gen de interés para cada
caso.
a.
b.
c.
d.
e.
Gráfica 3. Curva melting. a) Hsp90; b) Hsp70; c) Hsp26.7; d) Hsp18; e) Hsp16.9.
62
Cada uno de los genes estudiados presentan una temperatura melting diferente, para Hsp16,9
es de 80C, Hsp18 87C, Hsp26,7 84,5C, Hsp70 83C, Hsp90 de 80C.
9.6. Cuantificación absoluta
Se realizó una qPCR-RT con las muestras de las tres variedades en los tres tratamientos por
cada gen. Se hizo una cuantificación absoluta para cada uno de los genes, lo que permitió
evaluar la expresión de los genes de estudio.
9.6.1. Gen HSP90
a.
b.
Gráfica 4. a. curva de amplificación estándar de Hsp90; b. curva estándar de Hsp90
63
En la Gráfica 4a se presenta la amplificacion del gen en la muestra utilizada; se puede apreciar
que el ciclo umbral (Ct) es inversamente proporcional a la concentracion de ARN. Por lo
tanto la muestra de mayor concentracion necesitara menor cantidad de ciclos que una muestra
de menor concentracion de ARN. En la Gráfica 4b se representa la curva estandar realizada
a partir de las diluciones, con nueve puntos, presentando un buen coeficiente de correlacion
de 0.995, lo que brinda una confiabilidad al momento de colocar las muestras problemas.
Se realizo una curva estandar tomando como patron una muestra de ARN de Lv 1645 con
una concentracion inicial de 260 ng/µL, se realizaron 9 diluciones en serie con un factor de
dos.
9.6.1.1. Expresion de Hsp90 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645.
a.
b.
Gráfica 5. Expresion de Hsp90 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar
64
Tabla 23. Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E1.
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260,0 24,49
Estándar 2 130,0 25,44
Estándar 3 65,0 27,01
Estándar 4 32,5 28,71
Estándar 5 16,3 29,63
Estándar 6 8,1 31,15
Estándar 7 4,1 32,9
Estándar 8 2,0 34,42
Estándar 9 1,0 36,35
TC
F473 112,7 25,88
M 101,6 26,1
LV1645 208,9 24,56
T1
F473 202,3 24,63
M 214,3 24,51
LV1645 239,3 24,27
T2
F473 150,3 25,27
M 145,5 25,33
LV1645 208,4 24,57
Se realizó una extracción de ARN (E1), a los 10 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, en los tres tratamientos (TC, T1 y T2) las cuantificaciones
obtenidas para el estándar y las muestras problema se presentan en la tabla 23.
En la Gráfica 5a. se presenta la curva estándar con nueve muestras, partiendo de una
concentración conocida y 8 diluciones, con un coeficiente de correlación de 0.996 lo que
indica una buena relación entre la curva estándar para determinar la concentración de las
muestras problema. Como se puede observar en la Gráfica 5b, el estándar 1, es detectado a
partir de 24,49 ciclos, siendo esta la de mayor concentración y el estándar 9 es detectado a
partir de 36,35 ciclos siendo la de menor concentración. Con respecto a las muestras
problemas en el TC (28 °C), la variedad que presenta mayor expresión del gen que codifica
la proteína Hsp90 es Lv1645 con un SQ de 208,9 con un Ct de 24,56, seguido de F473 y
Mocarí con un SQ de 112,7 (Ct de 25,88) y 101,06 (Ct de 26,1) respectivamente, ubicándose
dentro de la curva estándar.
En el T1 (35 °C), se observa una sobre expresión de este gen en cada una de las variedades,
las muestras problema salen de la curva estándar, por lo que requieren de menor cantidad de
ciclos para ser detectados. Al igual que en el tratamiento control TC el tratamiento 1 Lv 1645
es la variedad que presenta mayor expresión con un SQ de 239,3 (Ct24,27) seguido de Mocarí
y F473 con un SQ cada uno de 214,3 (Ct 24,51) y 202,3 (Ct 24,63).Por ultimo en el
65
tratamiento 2 (T2), en comparación con el tratamiento control (TC) y el Tratamiento 1 (T1),
la expresión de este gen transcurridos 10 minutos del estrés disminuye, sin alcanzar al
tratamiento control; es decir F473 en el T2 en la primera extracción disminuye su expresión
(SQ de 150,3 y Ct 25,27) con respecto al T1 pero es superior al TC, Mocarí (M) disminuye
su expresión en el T2 pero es mayor en comparación al TC (SQ de 145,5 y Ct de 25,33) y en
el caso de LV1645 el SQ disminuye en el T2 llegando a la similitud, mas no a la igualdad del
TC (SQ de 208,4 y Ct de 24,57).
9.6.1.2. Expresion de Hsp90 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645.
a.
b.
Gráfica 6. Expresion de Hsp90 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
66
Se realizó una segunda extracción de ARN (E2), a 130 minutos del estrés por alta temperatura
en cada una de las variedades, en los tres tratamientos (TC, T1 y T2), las cuantificaciones
obtenidas para el estándar y las muestras problema se presentan en la tabla 24. En la Gráfica
6a. se presenta la curva estándar con nueve muestras, partiendo de una concentración
conocida y 8 diluciones, con un coeficiente de correlación de 0.996 lo que indica una buena
relación entre la curva estándar para determinar la concentración de las muestras problema.
Tabla 24.Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E2.
Como se puede observar en la Figura 6b, el estándar 1, es detectado a partir de 24,49 ciclos,
siendo esta la de mayor concentración y el estándar 9 es detectado a partir de 36,35 ciclos
siendo la de menor concentración. Con respecto a las muestras problemas en el TC (28 °C),
la variedad que presenta mayor expresión del gen que codifica la proteína Hsp90 es Mocarí
con un SQ de 153,5 con un Ct de 25,22 seguido de F473 y Lv 1645 con un SQ de 150,7 (Ct
de 25,26) y 53,8 (27,46) respectivamente, ubicándose dentro de la curva estándar. En el T1
(35 °C), se observa una sobre expresión de este gen en las muestras de F 473, se presente una
disminución en la expresión en la variedad Mocarí, y Lv 1645 mantiene constantes los niveles
de expresión al compararlos con el TC. A diferencia del Tratamiento control (TC) las
variedades F473 y Lv 1645 aumentaron su expresión con un SQ de 325,1 (Ct de 23,62) y
60,8 (Ct de 27,2) respectivamente, la variedad Mocarí por el contrario disminuyo su
expresión en este tratamiento significativamente con un SQ de 135,5 a 56,2.
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260,0 24,49
Estándar 2 130,0 25,44
Estándar 3 65,0 27,01
Estándar 4 32,5 28,71
Estándar 5 16,3 29,63
Estándar 6 8,1 31,15
Estándar 7 4,1 32,9
Estándar 8 2,0 34,42
Estándar 9 1,0 36,35
TC
F473 150,7 25,26
M 153,5 25,22
LV1645 53,8 27,46
T1
F473 325,1 23,62
M 56,2 27,36
LV1645 60,8 27,2
T2
F473 217,8 24,47
M 34,5 28,41
LV1645 14,6 30,25
67
Por ultimo en el tratamiento 2 (T2), en comparación con el tratamiento control (TC) y el
tratamiento control (T1), la expresión de este gen transcurridos 130 minutos del estrés
disminuye, es decir F473 en el T2 en la segunda extracción disminuye su expresión (SQ de
217,8 y Ct 24,47) con respecto al T1 pero es superior al TC, Mocarí (M) disminuye su
expresión en el T2 es menor que en el TC (SQ de 34,5 y Ct de 28,41) y en el caso de LV1645
el SQ disminuye en el T2 significativamente su expresión con un SQ de 14,6 con Ct 30,25.
9.6.1.3 Expresion de Hsp90 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645.
a.
b.
Gráfica 7. Expresion de Hsp90 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
68
Se realizó una tercera extracción de ARN (E3), a 250 minutos del estrés por alta temperatura
en cada una de las variedades, en los tres tratamientos (TC, T1 y T2), las cuantificaciones
obtenidas para el estándar y las muestras problema se presentan en la tabla 25. En la Gráfica
7a. se presenta la curva estándar con nueve muestras, partiendo de una concentración
conocida y 8 diluciones, con un coeficiente de correlación de 0.996 lo que indica una buena
relación entre la curva estándar para determinar la concentración de las muestras problema.
Como se puede observar en la Figura 7b, el estándar 1, es detectado a partir de 24,49 ciclos,
siendo esta la de mayor concentración y el estándar 9 es detectado a partir de 36,35 ciclos
siendo la de menor concentración. Con respecto a las muestras problemas en el TC (28 °C),
la variedad que presenta mayor expresión del gen que codifica la proteína Hsp90 es Mocarí
con un SQ de 211,3 con un Ct de 24,53 seguido de Lv 1645 y F473 con un SQ de 147,9 (Ct
de 24,53) y 48,1 (Ct de 27,7) respectivamente, ubicándose dentro de la curva estándar. En el
T1 (35 °C), se observa una sobre expresión de este gen en las muestras de F 473 y Mocarí
mientras existe una disminución en la expresión en la variedad Lv 1645, las muestras están
dentro de la curva estándar. A diferencia del Tratamiento control (TC) las variedades F473 y
Mocarí aumentaron su expresión con un SQ de 211,3 (Ct de 24,53) y 207,5 (Ct de 24,57)
respectivamente; la variedad Lv 1645 por el contrario disminuyo su expresión en este
tratamiento significativamente con un SQ de 81,7 con un Ct de 26,57.
Tabla 25. Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E3.
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260,0 24,49
Estándar 2 130,0 25,44
Estándar 3 65,0 27,01
Estándar 4 32,5 28,71
Estándar 5 16,3 29,63
Estándar 6 8,1 31,15
Estándar 7 4,1 32,9
Estándar 8 2,0 34,42
Estándar 9 1,0 36,35
TC
F473 48,1 27,7
M 211,3 24,53
LV1645 147,9 25,3
T1
F473 211,3 24,53
M 207,5 24,57
LV1645 81,7 26,57
T2
F473 201,4 24,64
M 91,0 26,33
LV1645 175,4 24,93
69
Por ultimo en el tratamiento 2 (T2), en comparación con el tratamiento control (TC) y el
tratamiento 1 (T1), la expresión de este gen transcurridos 250 minutos del estrés disminuye,
es decir F473 en el T2 en la tercera extracción disminuye su expresión (SQ de 201,4 con un
Ct de 24,64) con respecto al T1 pero es superior al TC, Mocarí (M) disminuye su expresión
en el T2 (SQ 91,0 con Ct de 26,33) pero mayor que TC y en el caso de LV1645 el SQ
aumenta en el T2 con relación a TC y T1 con una expresión de SQ de 175,4 y Ct de 24,93.
9.6.1.4. Relación de la expresión de Hsp90 en las tres extracciones, en cada tratamiento
en las tres variedades
Gráfica 8. Comparación de la Expresión Hsp90 de las variedades en los tres tratamientos
El gen Hsp90 se encuentra ubicado en el cromosoma 6 y codifica para proteína de choque
térmico denominadas “chaperonas moleculares” ya que se une a proteínas desnaturalizadas
para prevenir su mal plegamiento o agregación [52], desempeña funciones cruciales en la
señalización celular, el control del ciclo celular y en el mantenimiento de la integridad del
proteoma y la homeostasis de las proteínas. En las plantas, Hsp90s son necesarios para el
crecimiento normal de la planta y el desarrollo [47]. En plantas existen siete tipos de proteínas
de Hsp90, cuatro ubicadas en el citosol, una en el retículo endoplasma tico, una en la
mitocondria y una en los cloroplastos. Es una proteína dependiente de ATP y actúa en
conjunto con otras chaperonas. Estudios demuestran que este tipo de proteínas suelen actuar
en las últimas etapas de plegado del sustrato [51] y su producción incrementa bajo diferentes
tipos de estrés, entre ellos el estrés por altas temperaturas..
En la gráfica 8 se presenta una relación de la expresión del gen que codifica la proteína Hsp90
en las tres variedades en los tres tratamientos.
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
350,0
FTC FT1 FT2 MTC MT1 MT2 LVTC LVT1 LVT2
SQ
Fedearroz 473 Mocari Linea avanzada
Expresion HSP90 de las variedades en los tres tratamientos
E1
E2
E3
70
A los 10 minutos de estrés térmico la variedad F473 presenta un incremento a 35°C con
respecto al tratamiento control pero su producción disminuye a los 42°C. Por otro lado se
observa que al aumentar el tiempo de exposición de esta variedad al estrés térmico por 130
minutos la expresión del gen aumenta de manera considerable en cada uno de los
tratamientos, presentándose el valor más alto a 35°C con un SQ de 335; en los tres
tratamientos al aumentar el tiempo hasta 250 minutos la expresión del gen disminuye, en el
tratamiento control el valor disminuye por debajo de la E1, pero a 35 y 42°C los valores son
cercanos a la E1 del mismo tratamiento.
La variedad Mocarí a diferencia de F473 no presenta el mismo patrón en los tres tratamientos.
Como se observa en la gráfica 8, los niveles de expresión a 28°C aumenta de manera
proporcional, es decir hay un aumento de 50 copias entre la E1, E2 y E3. Al someter esta
variedad a una temperatura de 35°C, los niveles de expresión a los 10 minutos aumentan por
encima de 200 copias en comparación con la E1 del TC, sin embargo el nivel de expresión a
los 250 minutos disminuye por debajo del valor control y vuelve a aumentar al incrementar
el tiempo de exposición al estrés térmico alcanzando los niveles de expresión a los 10 minutos
del tratamiento 1. En el tratamiento 2 (42°C) se presenta el mismo patrón que en el
tratamiento 1 pero con valores inferiores, incluso los niveles de expresión de la E2 y E3 son
los más bajos para este gen en la variedad Mocarí.
La variedad Lv 1645 tiene un patrón similar en los tres tratamientos, ya que el nivel de
expresión de este gen a los 10 minutos de estrés es el más alto en los tres tratamientos, siendo
muy similares en el TC y T2, y aumentando de manera mínima en el T1; los valores
expresados a los 130 minutos son los más bajos, mostrando valores similares entre el TC y
el T1 y el más bajo se ubica en el T2; por último la cantidad de copias en la extracción 3 se
ubica por encima de la E2 pero por debajo de la E1. De acuerdo a la gráfica 8 no se observa
una diferencia considerable entre la expresión de este gen en las diferentes temperaturas de
estrés.
La variedad que mayor niveles de expresión presenta en los tres tratamientos es F473, en
Mocarí y Lv 1645 no hay una diferencia marcada entre los tres tratamientos. Estudios
realizados de este gen en Oryza sativa variedad Nipponbare por Liu et al., cuando la planta
se somete a estrés a 37°C durante dos horas de exposición no hay niveles significativos en
la expresión de Hsp90 en hoja, no obstante, al incrementar la temperatura hasta 42 y 50°C
los niveles de expresión aumentaron significativamente [91]. En el 2012 en la investigación
realizada por Chandel [10] en seis variedades de arroz a 37, 42 y 48°C, se evidencia que los
niveles de expresión más altos se generan a 37°C, pero no sobrepasan de manera significativa
los valores presentados en las otras temperaturas; en cinco de seis variedades los niveles de
Hsp90 disminuyen a los 42 y 48°C. En estudios realizados por Cañate y Novoa [3] en las
variedades F473, Mocarí y Lv 1645 a 28, 35 y 42°C pero con diferentes tiempos de estrés,
se encuentra que las plántulas al estar sometidas a un tiempo de cinco días al estrés térmico
generan un incremento en la expresión de este gen a 42°C. De acuerdo a esto se esperaría
que al aumentar la temperatura los niveles de expresión de este gen aumenten en los
71
diferentes momentos de estrés en cada variedad, no obstante la única variedad en la que se
genera es en F473 a los 130 minutos de estrés a 35°C, como ocurre en el estudio de Chandel.
9.6.2. Gen Hsp70
a.
b.
Gráfica 9. a. curva de amplificación estándar de Hsp70;
b. curva estándar de Hsp70.
En la Grafia 9a se presenta la amplificacion del gen en la muestra utilizada; se puede apreciar
que el ciclo umbral (Ct) es inversamente proporcional a la concentracion de ARN. Por lo
tanto la muestra de mayor concentracion necesitara menor cantidad de ciclos que una muestra
72
de menor concentracion de ARN. En la Gráfica 9b se representa la curva estandar realizada
a partir de las diluciones, con nueve puntos, presentando un buen coeficiente de correlacion
de 0.996, lo que brinda una confialidad al momento de colocar las muestras problemas.
9.6.1.1. Expresion de Hsp70 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645.
a.
b.
Gráfica 10. Expresion de Hsp70 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
73
Se realizó una extracción de ARN (E1), a los 10 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, en los tres tratamientos (TC, T1 y T2) las cuantificaciones
obtenidas para el estándar y las muestras problema se presentan en la tabla 26. En la Gráfica
10a. se presenta la curva estándar con nueve muestras, partiendo de una concentración
conocida y 10 diluciones, con un coeficiente de correlación de 0.996 lo que indica una buena
relación entre la curva estándar para determinar la concentración de las muestras problema.
Como se puede observar en la Figura 10b, el estándar 1, es detectado a partir de 21,76 ciclos,
siendo esta la de mayor concentración y el estándar 9 es detectado a partir de 31,37 ciclos
siendo la de menor concentración. Con respecto a las muestras problemas en el TC (28 °C),
la variedad que presenta mayor expresión del gen que codifica la proteína Hsp70 es Lv1645
con un SQ de 146,2 con un Ct de 22,32 seguido de F473 y Mocarí con un SQ de 143,9 (Ct
de 22,35) y 112,2 (Ct de 22,75) respectivamente, ubicándose dentro de la curva estándar.
En el T1 (35 °C), se observa una sobre expresión de este gen en cada una de las variedades,
las muestras problema salen de la curva estándar debido a la sobreexpresión, por lo que
requieren de menor cantidad de ciclos para ser detectados. A diferencia del tratamiento
control TC en el tratamiento 1 F473 es la variedad que presenta mayor expresión con un SQ
de 426.6 (Ct 20,06) seguido de Mocarí y Lv 1645 con un SQ de 388,2 (Ct 20,75) y 233,9 (Ct
21,57) respectivamente. Por ultimo en el tratamiento 2 (T2), en comparación con el
tratamiento control (TC) y el Tratamiento 1 (T1), la expresión de este gen disminuye, sin
alcanzar los valores del tratamiento control; es decir F473 en el T2 en la primera extracción
disminuye su expresión con un SQ de 274,8 y Ct 21,31 con respecto al T1 pero es superior
al valor del TC, Mocarí (M) disminuye su expresión en el T2 pero es mayor en comparación
al TC (SQ de 145,5 y Ct de 25,33) y en el caso de LV1645 el SQ disminuye en el T2
obteniendo un valor cercano al del TC (SQ de 208,4 y Ct de 24,57).
9.6.1.2. Expresion de Hsp70 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645.
a.
74
b.
Gráfica 11. Expresion de Hsp70 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
Se realizó una extracción de ARN (E1), a los 130 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, en los tres tratamientos (TC, T1 y T2) las cuantificaciones
obtenidas para el estándar y las muestras problema se presentan en la tabla 27. En la Gráfica
11a. se presenta la curva estándar con nueve muestras, partiendo de una concentración
conocida y 10 diluciones, con un coeficiente de correlación de 0.996 lo que indica una buena
relación entre la curva estándar para determinar la concentración de las muestras problema.
Como se puede observar en la Figura 11b, el estándar 1, es detectado a partir de 21,76 ciclos,
siendo esta la de mayor concentración y el estándar 9 es detectado a partir de 31,37 ciclos
siendo la de menor concentración.
Con respecto a las muestras problemas en el TC (28 °C), la variedad que presenta mayor
expresión del gen que codifica la proteína Hsp70 es F473 con un SQ de 158,9 con un Ct de
22,19 seguido de Mocarí y Lv 1645 con un SQ de 144,5 (Ct de 22,34) y 36,6 (Ct de 24,55)
respectivamente, ubicándose dentro de la curva estándar. En el T1 (35 °C), se observa una
sobre expresión de este gen en cada una de las variedades, exceptuando la variedad Mocarí,
las muestras problema están dentro de la curva estándar y algunas salen debido a la
sobreexpresión, por lo que requieren de menor cantidad de ciclos para ser detectados.
Al igual que en el tratamiento control TC en el tratamiento 1 F473 es la variedad que presenta
mayor expresión con un SQ de 479,7 (Ct 20,41) seguido de Mocarí que disminuye su
expresión SQ de 116,7 (Ct 22,68) y Lv 1645 con un 57,4 (Ct 2,83) respectivamente. Por
último en el tratamiento 2 (T2), en comparación con el tratamiento control (TC) y el
Tratamiento 1 (T1), la expresión de este gen disminuye exceptuando la variedad Mocarí que
aumenta su expresión con un SQ de 302,7 y un Ct de 21,15 por lo que se expresa más en este
tratamiento que en TC y T1; por otra parte la variedad F473 es la variedad con mayor
75
expresión con un SQ de 368,1 y un Ct 20,83 sobrepasando el valor del TC y T1; por otra
parte la variedad Lv 1645 aumenta su expresión en el T2 con un SQ de 104,7 y Ct de 22,86.
Tabla 26. Concentración de Hsp70 en estándar y muestras problema en la E1
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260.0 21.76
Estándar 2 130.0 22.29
Estándar 3 65.0 23.68
Estándar 4 32.5 24.52
Estándar 5 16.3 25.66
Estándar 6 8.1 26.8
Estándar 7 4.1 28.36
Estándar 8 2.0 23.32
Estándar 9 1.0 30.39
Estándar 10 0.5 31,37
TC
F473 143.9 22,35
M 112.2 22,75
LV1645 146.2 22,32
T1
F473 426.6 20,06
M 388.2 20,75
LV1645 233.9 21,57
T2
F473 274.8 21,31
M 338.8 20,97
LV1645 193.6 21,87
9.6.1.3 Expresion de Hsp70 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473,
Mocarí, Lv1645.
a.
76
b.
Gráfica 12. Expresion de Hsp70 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
Se realizó una extracción de ARN (E1), a los 250 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, en los tres tratamientos (TC, T1 y T2) las cuantificaciones
obtenidas para el estándar y las muestras problema se presentan en la tabla 28.
En la Gráfica 12a. se presenta la curva estándar con nueve muestras, partiendo de una
concentración conocida y 10 diluciones, con un coeficiente de correlación de 0.996 lo que
indica una buena relación entre la curva estándar para determinar la concentración de las
muestras problema. Como se puede observar en la Figura 12b, el estándar 1, es detectado a
partir de 21,76 ciclos, siendo esta la de mayor concentración y el estándar 9 es detectado a
partir de 31,37 ciclos siendo la de menor concentración.
Con respecto a las muestras problemas en el TC (28 °C), la variedad que presenta mayor
expresión del gen que codifica la proteína Hsp70 es Mocarí con un SQ de 245,5 con un Ct
de 21,49 seguido de Lv 1645 y F473 con un SQ de 187,5 (Ct de 21,92) y 41,6 (Ct de 24,35)
respectivamente, ubicándose dentro de la curva estándar. Al igual que en el tratamiento
control TC en el tratamiento 1 Mocarí es la variedad que presenta mayor expresión con un
SQ de 426,6 (Ct 20,6) seguido de F473 y Lv 1645 con un SQ cada uno de 357,3 (Ct 20,88)
y 202,3 (Ct 23,1). Para F473 y Mocarí los valores presentan sobreexpresión por lo cual salen
de la curva estándar. Por ultimo en el tratamiento 2 (T2), en comparación con el tratamiento
control (TC) y el Tratamiento 1 (T1), la expresión de este gen transcurridos 250 minutos del
estrés disminuye en las variedades F473 y Mocarí pero en Lv 1645 aumenta; aun asi, la
variedad Mocarí es la que mayor valor obtiene en el T2 con un SQ de 323,6 y Ct 21,4, pero
con relación al T1 disminuye su expresión, la variedad F473 obtiene un SQ de 292,4 con un
Ct de 21,1 y relacionándolo con el T1 se conserva una disminución en la expresión del gen
entre los dos tratamientos, y Lv 1645 un SQ de 220,3 con un Ct de 21,66.
77
Tabla 27. Concentración de Hsp70 en estándar y muestras problema en la E3
9.6.1.4. Relación de la expresión de Hsp70 en las tres extracciones, en cada tratamiento
en las tres variedades
Gráfica 13. Comparación de la Expresión Hsp70 de las variedades en los tres tratamientos
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
600,0
FTC FT1 FT2 MTC MT1 MT2 LVTC LVT1 LVT2
SQ
Fedearroz 473 Mocari Linea avanzada
Expresión HSP70 de las variedades en los tres tratamientos
E1
E2
E3
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260.0 21.76
Estándar 2 130.0 22.29
Estándar 3 65.0 23.68
Estándar 4 32.5 24.52
Estándar 5 16.3 25.66
Estándar 6 8.1 26.8
Estándar 7 4.1 28.36
Estándar 8 2.0 23.32
Estándar 9 1.0 30.39
Estándar 10 0.5 31.37
TC
F473 41.6 24,35
M 245.5 21,49
LV1645 187.5 21,92
T1
F473 357.3 20,88
M 426.6 20,6
LV1645 90.4 23,1
T2
F473 292.4 21,2
M 323.6 21,4
LV1645 220.3 21,66
78
La familia Hsp70 es una de las familias más amplias, en arroz cuenta con 32 genes que
codifican proteínas de esta familia. Estos pueden encontrarse en todos los cromosomas,
excepto el 4, 7 y 10, localizándose en compartimiento como el núcleo, citoplasma,
cloroplasto, mitocondria y retículo endoplasmático [41]. El gen Hsp70 que se escogió para el
estudio se encuentra ubicado en el cromosoma 1 y al igual que el gen Hsp90, codifica para
proteínas de choque térmico denominadas “chaperonas moleculares”. En animales es la
chaperona de mayor abundancia. Es una proteína dependiente de ATP y en asociación con
diversos cofactores realiza diversas funciones, incluyendo plegamiento de proteínas,
translocación a través de membranas de orgánulos y desagregación de agregados [52].
En la gráfica 13 se presenta una relación de la expresión del gen que codifica la proteína
Hsp70 en las tres variedades en cada uno de los tratamientos. La variedad F473 en el
tratamiento control a los 10 y 130 minutos de estrés presenta niveles similares de expresión
con un valor cercano a 160 copias, su expresión se ve disminuida a los 250 minutos de
exposición. En los T1 y T2 los niveles de expresión en los tres momentos de extracción
aumentan considerablemente frente al TC; esta variedad presenta la mayor expresión de este
gen a los 130 minutos de estrés a 35°C.
En la variedad Mocarí en el tratamiento control se presenta un incremento gradual entre las
tres extracciones, siendo la más alta la extracción 3 con un SQ de 250 copias. A 35°C los
niveles más altos se sitúan a los 10 y 250 minutos, presentando el valor más bajo en la E2 de
dicho tratamiento, incluso alcanza el valor de la expresión E1 del TC; a 42°C esta variedad
presenta un SQ promedio de 315 copias en los tres momentos de exposición a estrés térmico,
esta variedad no presenta un patrón en la expresión de este gen como si lo presenta F473 y
Lv1645.En comparación con F473 y Mocarí, Lv1645 es la variedad que presenta los niveles
más bajos de expresión. En esta variedad la expresión a los 10 y 250 minutos son las más
altas en los tres tratamientos y la expresión a los 130 minutos es la más baja; a pesar de que
si hay un aumento a los 35 y 42°C con respecto al tratamiento control no es un valor relevante.
En un estudio realizado por Zhang (2009) [92] en Hevea brasiliensis, se sometieron plantas a
8, 25 y 42°C, al realizar el análisis de la PCR-RT se encontró que los niveles de expresión de
Hsp70 aumentaron considerablemente a la hora del estrés a 42°C, mientras que a 25°C se
mantuvo constante la expresión de dicho gen. Lo que indica que a temperaturas altas como
42°C este gen se expresa en esta especie; sin embargo en plántulas de arroz la expresión más
alta se originó en el tratamiento 1, es decir a 35°C, difiriendo del tiempo dependiendo de la
variedad. Al igual que en la variedad Hevea brasiliensis los valores más bajos se presentan
en el tratamiento control (28°C), por lo cual la planta a esta temperatura no se encuentra bajo
estrés térmico. En el trabajo realizado por Cañate y Novoa [3] en las mismas variedades, se
encuentra que la mayor expresión de este gen se genera en el tratamiento 2 (42°C), aun así
no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos en cada una de las
variedades, en contraste con el trabajo realizado se encuentran diferencias en los patrones de
expresión ya que las plántulas de este estudio fueron sometidas a radiación con 60Co.
79
9.6.2. Gen HSP26.7
a.
b.
Gráfica 14. a. curva de amplificación estándar de Hsp70;b. curva estándar de Hsp70
Se realizo una curva estandar tomando como patron una muestra de ARN de Lv1645 con una
concentracion inicial de 260 ng/µL, se realizaron 10 diluciones en serie con un factor de dos.
En la Grafia 14a se presenta la amplificacion del gen en la muestra utilizada; se puede
apreciar que el cicloumbral (Ct) es inversamente proporcional a la concentracion de ARN.
Por lo tanto la muestra de mayor concentracion necesitara menor cantidad de ciclos que una
muestra de menor concentracion de ARN. con nueve puntos, presentando un buen coeficiente
de correlacion de 0.996, lo que brinda una confialidad al momento de colocar las muestras
problemas.
80
En la gráfica 14b se representa la curva estandar realizada a partir de las diluciones con nueve
puntos, presentando un buen coeficiente de correlación de 0.996, lo que brinda una
confiablidad al momento de colocar las muestras problemas.
9.6.1.1. Expresion de Hsp26,7 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645.
a.
b.
Gráfica 15. Expresion de Hsp26,7 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
81
Se realizó una extracción de ARN (E1), a los 10 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, las cuantificaciones obtenidas para el estándar y las muestras
problema se presentan en la tabla 29. En la gráfica 15a se presenta la curva estándar con
ocho muestras de concentración conocida, con un coeficiente de correlación de 0.986 lo que
indica una buena relación para determinar la concentración de las muestras problema. Como
se puede observar en la gráfica 15b, el estándar 1, es detectado a partir de 24.05 ciclos,
siendo esta la de mayor concentración y el estándar 8 es detectado a partir de 31.18 ciclos
siendo la de menor concentración.
Tabla 28. Concentración de Hsp26.7 en estándar y muestras problema en la E1
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260.0 24.05
Estándar 2 130.0 24.5
Estándar 3 65.0 25.46
Estándar 4 32.5 26.83
Estándar 5 16.3 27.54
Estándar 6 8.1 28.99
Estándar 7 4.1 30.62
Estándar 8 2.0 31.18
TC
F473 180 24.1
M 153 24.38
LV1645 85 25.31
T1
F473 508 22.45
M 753 21.81
LV1645 278 23.42
T2
F473 839 21.64
M 923 21.49
LV1645 445 22.66
Con respecto a las muestras problemas en el TC (28°C), la variedad que presenta mayor
expresión del gen que codifica la proteína Hsp26.7 es F473 con un SQ de 180 con un Ct de
24.1, seguido de Mocarí y Lv1645 con un SQ de 153 y 85 respectivamente, ubicándose
dentro de la curva estándar.
A 35°C (T1), se observa una sobre expresión de este gen en cada una de las variedades, por
lo cual las muestras problema salen de la curva estándar, ya que requieren de menor cantidad
de ciclos para ser detectados. A diferencia del tratamiento control, en el tratamiento 1 Mocarí
es la variedad que presenta mayor expresión con un SQ de 753 seguido de F473 y Lv 1645
con un SQ cada uno de 508 y 278 copias.
82
A 42°C (T2), en comparación con el tratamiento 1, la expresión de este gen transcurridos 10
minutos del aumenta al aumentar la temperatura; donde F473 tiene un SQ de 839, Mocarí
923 y Lv 1645 de 445 copias.
9.6.1.2. Expresion de Hsp26.7 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645.
a.
b.
Gráfica 16. Expresion de Hsp26,7 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
83
Se realizó una extracción de ARN (E2), a los 130 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, las cuantificaciones obtenidas para el estándar y las muestras
problema se presentan en la tabla 30.
En el tratamiento control (28°C), las muestras del gen que codifican la proteína Hsp26.7 no
se ubican en la curva estándar , siendo Mocarí la que mayor expresión presenta con un SQ
de 251, seguido de F473 con 188 copias y Lv 1645 con 36 copias presentando el valor más
bajo y siendo el único ubicado en la curva estandar. En el tratamiento 1 a 35°C hay un
aumento considerable en la expresión de este gen en la variedad F473 con un SQ 804; por
otro lado, en la variedad Mocarí y Lv 1645 la expresión de este gen aumento pero no con la
misma magnitud que F473, para Mocarí y Lv1645 aumento en promedio 40 copias. A 42°C,
la expresión de F473 disminuye, siguiendo el patrón que presento en la E1. Por otro lado,
Mocarí y Lv 1645 aumentaron su expresión superando la concentración de las muestras
estándar con un SQ de 533 y 931 respectivamente, siendo Lv 1645 la que presento el valor
más alto.
Tabla 29.Concentración de Hsp26.7 en estándar y muestras problema en la E2
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260.0 24.05
Estándar 2 130.0 24.5
Estándar 3 65.0 25.46
Estándar 4 32.5 26.83
Estándar 5 16.3 27.54
Estándar 6 8.1 28.99
Estándar 7 4.1 30.62
Estándar 8 2.0 31.18
TC
F473 188 24.04
M 251 23.58
LV1645 36 26.68
T1
F473 804 21.71
M 298 23.3
LV1645 79 25.43
T2
F473 769 21.78
M 533 22.37
LV1645 931 21.45
84
9.6.1.3 Expresion de Hsp26,7 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645.
a.
b.
Gráfica 17. Expresion de Hsp26,7 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
Se realizó una extracción de ARN (E3), a los 250 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, las cuantificaciones obtenidas para el estándar y las muestras
problema se presentan en la tabla 31.
En el tratamiento control (28°C), la variedad Mocarí es la que presenta una mayor expresión
del gen que codifica la proteína Hsp18, con un SQ de 248, seguido de Lv 1645 y F473 con
un SQ de 116 y 92 respectivamente. En el tratamiento 1 (35°C) aumenta considerablemente
85
la expresión de este gen en F473 con 593 copias y Mocarí con 685 siendo la más alta, pero
disminuye en la variedad Lv 164 hasta unSQ de 53. En el tratamiento 2 a 42°C la expresión
de F473, Mocarí y Lv 1645 aumentan por encima de 300 copias en comparación con el T1.
La expresión de este gen para F473 y Mocarí a los 250 minutos de estrés incremente con el
aumento de la temperatura.
Tabla 30.Concentración de Hsp26.7 en estándar y muestras problema en la E3
9.6.1.4. Relación de la expresión de Hsp26,7 en las tres extracciones, en cada tratamiento
en las tres variedades
El gen que Hsp26.7 se encuentra en el cromosoma 3 y codifica para la proteína de choque
térmico small que se ubica en los cloroplastos. Esta proteína a diferencia de la Hsp70 y Hsp90
no requiere de ATP para su funcionamiento, por lo cual se dice que es independiente de ATP.
Así mismo se clasifica en las small heat shock protein (sHsp), debido a su bajo peso
molecular de 26kDa. Esta proteína es de gran importancia porque actúa como co-chaperona
formando complejos proteicos con proteínas como Hsp70, Hsp90 y Hsp100. Junto a ello
diferentes estudios han demostrado que este tipo de proteínas confieren tolerancia a las
plantas bajo deferentes tipos de estrés abiótico como altas y bajas temperaturas, salinidad,
ABA [10].
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260.0 21.76
Estándar 2 130.0 22.29
Estándar 3 65.0 23.68
Estándar 4 32.5 24.52
Estándar 5 16.3 25.66
Estándar 6 8.1 26.8
Estándar 7 4.1 28.36
Estándar 8 2.0 23.32
Estándar 9 1.0 30.39
Estándar 10 0.5 31.37
TC
F473 92 25.18
M 248 23.6
LV1645 116 24.82
T1
F473 593 22.22
M 685 21.97
LV1645 53 26.06
T2
F473 839 22.08
M 783 21.75
LV1645 387 22.88
86
Gráfica 18. Comparación de la Expresión Hsp26.7 de las variedades en los tres
tratamientos.
El gen que Hsp26.7 se encuentra en el cromosoma 3 y codifica para la proteína de choque
térmico small que se ubica en los cloroplastos. Esta proteína a diferencia de la Hsp70 y Hsp90
no requiere de ATP para su funcionamiento, por lo cual se dice que es independiente de ATP.
Así mismo se clasifica en las small heat shock protein (sHsp), debido a su bajo peso
molecular de 26kDa. Esta proteína es de gran importancia porque actúa como co-chaperona
formando complejos proteicos con proteínas como Hsp70, Hsp90 y Hsp100. Junto a ello
diferentes estudios han demostrado que este tipo de proteínas confieren tolerancia a las
plantas bajo deferentes tipos de estrés abiótico como altas y bajas temperaturas, salinidad,
ABA [10].
En la gráfica 18 se presenta una relación de la expresión del gen que codifica la proteína
Hsp26.7 en las tres variedades de estudio en cada uno de los tratamientos.
La variedad F473 en el TC presenta una baja expresión en los tres momentos de estrés, con
un SQ promedio de 150 copias, se observa una sobreexpresión a medida que aumenta la
temperatura. Al aumentar la temperatura hasta 35°C y 42°C la expresión de este gen aumento
hasta 700 copias en cada uno de los momentos de estrés; así mismo se ve que el valor de
expresión más alto corresponde a los 10 minutos del T2 y a los 130 minutos del T1. A
temperatura de 42°C los niveles de expresión a los 10, 130 y 250 minutos son los más altos
en comparación con los demás tratamientos.
Mocarí al igual que F473 tiene los niveles de expresión más bajos a 28°C, con un promedio
de 220 copias en las tres extracciones. La expresión de este gen en la variedad Mocarí es
semejante a la variedad F473 ya que esta aumenta al aumentar la temperatura; en los
tratamientos a 35 y 42°C los niveles más altos corresponden a los 10 y 250 minutos de estrés
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
600,0
700,0
800,0
900,0
1000,0
FTC FT1 FT2 MTC MT1 MT2 LVTC LVT1 LVT2
SQ
Fedearroz 473 Mocari Linea avanzada
Expresión HSP26 de las variedades en los tres tratamientos
E1
E2
E3
87
y disminuye a los 130 minutos de exposición en el T1 y T2. Los SQ más altos se exponen en
el T2, alcanzando un SQ de 900 copias.
En la variedad Lv 1645 no se presenta un cambio significativo en los valores del SQ entre el
tratamiento control y tratamiento 1; se observa una sobreexpresión a 42°C siendo la
expresión más alta a los 250 minutos de estrés con un SQ alrededor de 900 copias muy similar
al de la variedad Mocarí.Al comparar la expresión del gen Hsp26.7 en las tres variedades se
puede inferir que la variedad F473 y Mocarí son las que mayor niveles presentan ya que Lv
1645 lo hace únicamente a temperaturas extremas como es el caso del T2 (42°C).
En el estudio realizado por Chandel [10], de las seis variedades de arroz, solo una presento
niveles altos en las tres temperaturas (37, 42, 48°C), las demás variedades tuvieron incluso
los niveles más bajos para este gen en comparación con genes como Hsp 16.9, Hsp90,
Hsp17.7 y Hsp18. En un estudio realizado por Xinhai Chen en el 2014 [93], se hizo uso de tres
variedades de Oryza sativa en estadio de plántula y antesis: Nipponbare, Azucena
(susceptible al calor) y Co39 (Tolerante al calor), se aprecia que los niveles de expresión de
Hsp26.7 en cada una de estas variedades aumento conforme lo hacia la temperatura pero en
mayor proporción en la antesis que en el estadio de plántula; al contrastar los niveles a 28°C
y 42°C los valores fueron significativos a las 12 horas de estrés, transcurridos las 24 horas
de estrés la producción de ARN disminuyo para cada variedad. Otras investigaciones
realizadas por Sarkar [94], muestran que los niveles de este gen aumentan de manera
considerable cuando la planta de arroz es sometida a temperaturas demasiado altas hasta los
50°C, cuando se encuentra a 37 y 42°C hay incremento pero en comparación a la temperatura
control no es significativa como ocurre a 50°C; esto mismo es lo que sucede en la variedad
Lv 1645, que aumenta sus niveles a 42°C mientras que a 28 y 35°C los niveles se mantienen
constantes.
9.6.4. Gen Hsp18
a.
88
b.
Gráfica 19. a. curva de amplificación estándar de Hsp18; b. curva estándar de Hsp18
Se realizo una curva estandar tomando como patron una muestra de ARN de Lv 1645 con
una concentracion inicial de 260 ng/µL, se realizaron 9 diluciones en serie con un factor de
dos.En la Grafia 19a se presenta la amplificacion del gen en la muestra utilizada; se puede
apreciar que el ciclo umbral (Ct) es inversamente proporcional a la concentracion de ARN.
Por lo tanto la muestra de mayor concentracion necesitara menor cantidad de ciclos que una
muestra de menor concentracion de ARN.
En la Gráfica 19b se representa la curva estandar realizada a partir de las diluciones, con
nueve puntos, presentando un buen coeficiente de correlacion de 0.988, lo que brinda una
confialidad al momento de colocar las muestras problemas.
9.6.4.1. Expresion de Hsp18 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645.
a.
89
b.
Gráfica 20. Expresion de Hsp18 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
Se realizó una extracción de ARN (E1), a los 10 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, las cuantificaciones obtenidas para el estándar y las muestras
problema se presentan en la tabla 32.
En la gráfica 20a se presenta la curva estándar con nueve muestras de concentración
conocida, con un coeficiente de correlación de 0.989 lo que indica una buena relación para
determinar la concentración de las muestras problema. Como se puede observar en la gráfica
20b, el estándar 1, es detectado a partir de 25.71 ciclos, siendo esta la de mayor concentración
y el estándar 9 es detectado a partir de 34.38 ciclos siendo la de menor concentración.
Con respecto a las muestras problemas en el TC (28°C), la variedad que presenta mayor
expresión del gen que codifica la proteína Hsp18 es Lv 1645 con un SQ de 221.8 con un Ct
de 25.45, seguido de F473 y Mocarí con un SQ de 210.4 y 180.7 respectivamente, ubicándose
dentro de la curva estándar.
A 35°C (T1), se observa una sobre expresión de este gen en cada una de las variedades, por
lo cual las muestras problema salen de la curva estándar, ya que requieren de menor cantidad
de ciclos para ser detectados. A diferencia del tratamiento control, en el tratamiento 1 Mocarí
es la variedad que presenta mayor expresión con un SQ de 602.6 seguido de F473 y Lv 1645
con un SQ cada uno de 456.0 y 242.1
A 42°C (T2), en comparación con el tratamiento 1, la expresión de este gen transcurrido 10
minutos del estrés disminuye; incluso, en el caso de F473 y Lv 1645 el SQ es menor en
comparación al Tratamiento control.
90
Tabla 31. Concentración de Hsp18 en estándar y muestras problema en la E1
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260,0 25,71
Estándar 2 130,0 26,44
Estándar 3 65,0 27,21
Estándar 4 32,5 28,09
Estándar 5 16,3 29,29
Estándar 6 8,1 30,45
Estándar 7 4,1 31,66
Estándar 8 2,0 33,11
Estándar 9 1.0 34.38
TC
F473 210,4 25,53
M 180,7 25,78
LV1645 221,8 25,45
T1
F473 456,0 24,31
M 602,6 23,86
LV1645 242,1 25,31
T2
F473 156,0 26,01
M 299,2 24,97
LV1645 143,9 26,14
9.6.4.2. Expresion de Hsp18 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645.
a.
91
b.
Gráfica 21. Expresion de Hsp18 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
Tabla 32.Concentración de Hsp18 en estándar y muestras problema en la E2
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260,0 25,71
Estándar 2 130,0 26,44
Estándar 3 65,0 27,21
Estándar 4 32,5 28,09
Estándar 5 16,3 29,29
Estándar 6 8,1 30,45
Estándar 7 4,1 31,66
Estándar 8 2,0 33,11
Estándar 9 1.0 34,38
TC
F473 218,3 25,47
M 260,0 25,2
LV1645 127,6 26,32
T1
F473 749,9 23,52
M 155,6 26,01
LV1645 78,7 27,09
T2
F473 293,1 25,01
M 542,0 24,03
LV1645 498,9 24,17
92
Se realizó una extracción de ARN (E2), a los 130 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, las cuantificaciones obtenidas para el estándar y las muestras
problema se presentan en la tabla 33.
En el tratamiento control (28°C), las muestras del gen que codifican la proteína Hsp18 se
ubican en la curva estándar , siendo Mocarí la que mayor expresión presenta con un SQ de
260, seguido de F473 y Lv 1645 con un SQ de 218.3 y 127.6 respectivamente.
En el tratamiento 1 a 35°C hay un aumento considerable en la expresión de este gen en la
variedad F473 con un SQ 749.9; en la variedad Mocarí y Lv 1645 la expresión de este gen
disminuyo en comparación con el tratamiento control. A 42°C, la expresión de F473
disminuye, siguiendo el patrón que presento en la E1. Por otro lado, Mocarí y Lv 1645
aumentaron su expresión superando la concentración de las muestras estándar con un SQ de
542.0 y 498.9 respectivamente.
9.6.4.3 Expresion de Hsp18 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645.
a.
93
b.
Gráfica 22. Expresion de Hsp18 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
Se realizó una extracción de ARN (E3), a los 250 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, las cuantificaciones obtenidas para el estándar y las muestras
problema se presentan en la tabla 34.
Tabla 33. Concentración de Hsp18 en estándar y muestras problema en la E3
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260,0 25,71
Estándar 2 130,0 26,44
Estándar 3 65,0 27,21
Estándar 4 32,5 28,09
Estándar 5 16,3 29,29
Estándar 6 8,1 30,45
Estándar 7 4,1 31,66
Estándar 8 2,0 33,11
TC
F473 79,8 27,07
M 339,6 24,77
LV1645 156,0 26,01
T1
F473 403,6 24,5
M 571,5 23,95
LV1645 101,2 26,69
T2
F473 327,3 24,83
M 375,8 24,62
LV1645 0,0 NA
94
En el tratamiento control (28°C), la variedad Mocarí es la que presenta una mayor expresión
del gen que codifica la proteína Hsp18, con un SQ de 339.6, seguido de Lv 1645 y F473 con
un SQ de 79.8 y 156.0 respectivamente. En el tratamiento 1 (35°C) aumenta
considerablemente la expresión de este gen en F473 y Mocarí, pero disminuye en la variedad
Lv 1645, siguiendo el patrón de la extracción 2. En el tratamiento 2 a 42°C la expresión de
F473 y Mocarí disminuyen siguiendo el patrón de la extracción 1 y 2, en el caso de Lv 1645
no se presenta un valor asociado al Ct y SQ probablemente fue un error al momento de
sembrar la muestra de ARN no logro mezclarse con la mix.
9.6.4.4. Relación de la expresión de Hsp18 en las tres extracciones, en cada tratamiento
en las tres variedades.
El gen Hsp18 se localiza en el cromosoma 1 y codifica para la proteína de choque térmico
Hsp18, al igual que la hsp26.7 se clasifica como sHsp. Esta proteína hace parte del grupo de
HspCII, que se encuentran en el citoplasma, es una proteína independiente de ATP y está
relacionada con la respuesta ante el estrés abiótico en plantas, co-ayudando a la protección
de proteínas necesarias en el metabolismo de cada planta.
En la gráfica 23 se presenta una relación de la expresión del gen que codifica la proteína
Hsp18 en las tres variedades en cada uno de los tratamientos. En la variedad F473 a los 10
minutos de estrés (E1) la expresión de este gen a 28°C es de 210 copias, su valor se ve
duplicado al aumentar la temperatura en el tratamiento 1, pero disminuye por debajo del valor
de 200 cuando es sometido a 42°C.
Gráfica 23. Comparación de la Expresión Hsp18 de las variedades en los tres tratamientos.
Al aumentar el tiempo de exposición a 130 minutos en el tratamiento control no se observa
un cambio considerable en la expresión de dicho gen, en el tratamiento 1 aumentó cerca de
300 copias por encima de la E1 en el T1, en el tratamiento 2 disminuye su valor a 293 copias.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
FTC FT1 FT2 MTC MT1 MT2 LVTC LVT1 LVT2
SQ
Fedearroz 473 Mocari Linea avanzada
Expresión HSP18 de las variedades en los tres
tratamientos
E1
E2
E3
95
Al culminar el tiempo de estrés, es decir, a los 250 minutos de exposición en el tratamiento
control y el tratamiento 1 los valores disminuyen en comparación con la extracción 1 y 2, a
diferencia del tratamiento 2 que es el valor más alto de este tratamiento para dicha variedad,
sobrepasando el valor expresado por la extracción 2 por 30 copias.
En la variedad Mocarí a los 10 minutos de estrés (E1) la expresión de este gen está por debajo
de 200 copias, siendo el valor más bajo de expresión en comparación con F473 y Lv 1645,
en el T1 este expresión aumenta en 400 copias para alcanzar un SQ de 602 siendo el más alto
de las tres variedades, al aumentar la temperatura hasta 42°C el nivel de expresión disminuye
300 copias. En la E2, es decir, a los 130 minutos de estrés en el tratamiento 1 es el que menor
valor presenta con un SQ de 155 y siendo el tratamiento 2 el que presenta el valor más alto
con un SQ de 542. A los 250 minutos de estrés la expresión más alta se presenta a 35°C con
un SQ de 571 y el más bajo en el tratamiento a 28°C con un SQ de 399 copias. Al comparar
los valores de esta variedad con F473 y Lv 1645, Mocarí es la que mayor expresión presenta
del gen que codifica la proteína Hsp18 al culminar el tiempo de estrés térmico.
En la variedad Lv 1645 no se presenta una variación significativa en los diferentes momentos
de estrés en el tratamiento control y tratamiento 1, por otro lado en el tratamiento la expresión
del gen en a los 130 minutos es menor que a los 10 minutos de estrés a los 28 y 35 C, pero
aumenta considerablemente a los 250 minutos del estrés. No se puede determinar el valor de
expresión a los 250 minutos, puesto que se presentó un error al momento de colocar la
muestra de ARN.
En el 2016 se hizo un estudio de la regulación fisiológica y de genes en raíces y hojas bajo
estrés por altas temperaturas en álamo [95], donde se encontró que los niveles del gen Hsp18
aumentaban conforme lo hacia la temperatura, lo cual le daba termotelarancia a la planta ya
que pueden evitar la desnaturalización de proteínas cuando hay un estrés abiótico como el
estrés térmico. En el trabajo de Chandel [10], en las seis variedades se presenta niveles de
expresión constante a 28, 37, 42 y 48°C, en la variedad NArgina22 y R-1389—RF-42 hay
un incremento de este gen a 42 y 48°C. Jiahn et al., sometió plantas de Oryza sativa a 28,
32,35, 38 y 41°C y evidenció que el gen Hsp18 se expresó únicamente a partir de 32°C con
un incremento moderado a 35, 38 y 41°C; así mismo sometió estas plantas a estrés a 41°C
durante 240 minutos y observó que al aumentar el tiempo de exposición los niveles de Hsp18
aumentaban [96]. En plantas de arroz [94], este gen comienza a expresarse a los 30 minutos de
estrés a 37°C, no se logra visualizar expresión en la temperatura control. Conforme aumenta
la temperatura, aumenta los niveles de expresión de manera moderada. A diferencia de los
estudios ya mencionados, en las variedades F473, Mocarí y Lv1645 se logra apreciar aunque
sea niveles bajos de expresión de este gen a 28°C (TC), se genera un incremento notable en
el tratamiento 1 (35°C) para F473 y Mocarí y un aumento en el tratamiento 2 (42°C) para las
tres variedades.
96
9.6.5. Gen Hsp16.9
a.
b.
Gráfica 24. a. curva de amplificación estándar de Hsp16.9; b. curva estándar de Hsp16.9
Se realizo una curva estandar tomando como patron una muestra de ARN de Lv 1645 con
una concentracion inicial de 260 ng/µL, se realizaron 8 diluciones en serie con un factor de
dos. En la Grafia 24a se presenta la amplificacion del gen en la muestra utilizada; se puede
apreciar que el ciclo umbral (Ct) es inversamente proporcional a la concentracion de ARN.
Por lo tanto la muestra de mayor concentracion necesitara menor cantidad de ciclos que una
muestra de menor concentracion de ARN.En la Gráfica 24b se representa la curva estandar
realizada a partir de las diluciones, con ocho puntos, presentando un buen coeficiente de
correlacion de 0.993, lo que brinda una confiabilidad al momento de ubicar las muestras
problemas.
97
9.6.5.1. Expresion de Hsp16.9 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645.
a.
b.
Gráfica 25. Expresion de Hsp16.9 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
Se realizó la curva estándar con 8 muestras, a partir de una muestra de concentración de
260ng/µL, aplicando un factor de 2 hasta obtener un estándar de 2.0 ng/µL. El estándar 1
siendo la muestra más concentrada presenta la menor cantidad de Ct con un valor de 27.25,
y la más diluida presenta mayor Ct siendo de 35.19. Se realizó una extracción de ARN (E1)
a los 10 minutos del estrés por alta temperatura en cada una de las variedades, las
98
cuantificaciones obtenidas para el estándar y las muestras problema se presentan en la tabla
35. A los 10 minutos de extracción en el tratamiento control (28°C), F473, Lv 1645 y Mocarí
presentan valores similares de expresión del gen que codifica la proteína Hsp16.9, siendo
2082, 1934 y 2000 respectivamente. Al aumentar la temperatura hay un incremento en la
expresión del gen en F473 y Mocarí, con un incremento de más de 1500 copias; en Lv 1645
hay un incremento pero no de la misma magnitud que F473 y Mocarí. Cuando aumenta la
temperatura a 42°C, la expresión del gen disminuye en las tres variedades, consecuencia de
la degradación del ARNm. Los SQ obtenidos en cada una de las muestras no se ubicaron en
la curva estándar, producto de la sobreexpresión que presenta este gen en la hoja de cada una
de las plántulas.
Tabla 34. Concentración de Hsp16.9 en estándar y muestras problema en la E1
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260,0 27,25
Estándar 2 130,0 27,94
Estándar 3 65,0 28,89
Estándar 4 32,5 30,68
Estándar 5 16,3 31,59
Estándar 6 8,1 32,7
Estándar 7 4,1 35,02
Estándar 8 2,0 35,19
TC
F473 2082 23,16
M 1934 23,29
LV1645 2000 23,23
T1
F473 3654 22,16
M 3721 22,13
LV1645 2109 23,16
T2
F473 3087 22,46
M 2272 23
LV1645 1930 23,29
99
9.6.5.2. Expresion de Hsp16.9 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645.
a.
b.
Gráfica 26. Expresion de Hsp16.9 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
Se realizó una extracción de ARN (E2) a los 130 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, las cuantificaciones obtenidas para el estándar y las muestras
problema se presentan en la tabla 36. Durante el tratamiento control (28°C) la variedad que
presenta mayor expresión es Mocarí con un SQ de 2683, seguido de F473 y Lv 1645 con
1914 y 1263 respectivamente. A medida que aumenta la temperatura incrementa la expresión
del gen en las tres variedades significativamente en F473 con 6048 copias, duplicando su
100
valor con respecto a la extracción 1; en el caso de Mocarí y Lv 1645 la expresión disminuye.
Cuando la temperatura alcanza los 42°C la expresión de F473 disminuye cerca de 1500
copias, pero en Mocarí y Lv 1645 aumentan, no obstante no sobrepasan el valor generado en
F473.
Tabla 35.Concentración de Hsp16.9 en estándar y muestras problema en la E2
9.6.5.3 Expresion de Hsp16.9 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645.
a.
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260,0 24,49
Estándar 2 130,0 25,44
Estándar 3 65,0 27,01
Estándar 4 32,5 28,71
Estándar 5 16,3 29,63
Estándar 6 8,1 31,15
Estándar 7 4,1 32,9
Estándar 8 2,0 34,42
Estándar 9 1,0 36,35
TC
F473 1914 23,31
M 2683 22,71
LV1645 1263 24,04
T1
F473 6048 21,27
M 2078 23,16
LV1645 538,9 25,56
T2
F473 4635 21,74
M 3796 22,09
LV1645 3808 22,09
101
b.
Gráfica 27. Expresion de Hsp16.9 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades
F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.
Se realizó una extracción de ARN (E3) a los 250 minutos del estrés por alta temperatura en
cada una de las variedades, las cuantificaciones obtenidas para el estándar y las muestras
problema se presentan en la tabla 37. A 28°C F473 es la variedad que presenta el nivel más
bajo de expresión, seguido de Lv 1645 y Mocarí presenta el mayor valor de expresión siendo
este SQ de 2811.
Tabla 36. Concentración de Hsp16.9 en estándar y muestras problema en la E3
TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct
Estándar
Estándar 1 260,0 24,49
Estándar 2 130,0 25,44
Estándar 3 65,0 27,01
Estándar 4 32,5 28,71
Estándar 5 16,3 29,63
Estándar 6 8,1 31,15
Estándar 7 4,1 32,9
Estándar 8 2,0 34,42
TC
F473 1129 24,24
M 2811 22,63
LV1645 1554 23,68
T1
F473 3256 22,36
M 4992 21,61
LV1645 709,3 25,07
T2
F473 3010 22,5
M 4461 23,29
LV1645 2650 22,73
102
Al someter las plántulas a estrés térmico de 35°C incremento la expresión del gen de la
varidedad F473 y Mocarí con un SQ de 3256 4992, pero Lv 1645 disminuyo el valor hasta
709.3 A 42°C bajo el nivel de expresión de F473 y Mocarí alrededor de 300 copias en cada
una, sin embargo en Lv 1645 aumento el nivel de expresión hasta 2650. Los datos obtenidos
en los tratamientos durante la extracción 3 no se ubicaron en la curva estándar debido a una
sobreexpresión del gen que codifica la proteína Hsp16.9.
9.6.5.4. Relación de la expresión de Hsp16.9 en las tres extracciones, en cada tratamiento
en las tres variedades
El gen Hsp16.9 se encuentra localizado en el cromosoma 1 y codifica para la proteína
Hsp16,9 que pertenece al grupo de sHsp CI (proteína citosolica). Ésta es una de las proteínas
más importantes en respuesta al estrés abiótico en plantas; está conformada por un
dodecaméro en su forma inactiva, una vez va a interactuar y ser parte del complejo de
proteínas que actúan en la respuesta al estrés presenta una conformación de dímeros lo que
le permite captar el sustrato para su posterior re naturalización. Al igual que Hsp26.7 y Hsp18
es una proteína independiente de ATP y actúa como co-chaperona de proteínas como Hsp70,
Hsp90 y Hsp100 [67].
Gráfica 28. Comparación de la Expresión Hsp16.9 de las variedades en los tres tratamientos.
Por lo tanto es uno de los genes de mayor interés y estudio en bioquímica y biología
molecular de plantas. En este caso se estudió la expresión del gen Hsp16, 9 en tres variedades.
La variedad F473 durante el tratamiento control (28°C) presenta una expresión promedio de
2000 copias a los 10 y 130 minutos de estrés, su valor disminuye a los 250 minutos cerca de
1000 copias. Los valores obtenidos en el tratamiento control son los más bajos en las tres
extracciones al momento de compararlos con los tratamientos 1 y 2. Tanto a 35 y 42°C se
observa un patrón similar en los tres momentos de extracción, ya que las E1 y E3 en ambos
tratamientos se ubican en el mismo nivel, es decir a 35°C estas expresiones están cerca de
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
FTC FT1 FT2 MTC MT1 MT2 LVTC LVT1 LVT2
SQ
Fedearroz 473 Mocari Linea avanzada
Expresión HSP16,9 de las variedades en los tres
tratamientos
E1
E2
E3
103
3500 copias, y a 42°C alrededor de 3000; siendo la extracción 2 la que sobresale en ambos
tratamientos aumentando considerablemente su expresión, para el tratamiento 1 se obtiene
un SQ de 6000 y en el tratamiento 2 de 4500 copias. En la variedad Mocarí se observan
diferencias tanto en los tratamientos como en los tiempos de extracción. A 28°C se observa
un aumento de expresión de este gen a medida que aumenta el tiempo de exposición, al
compararlos con el tratamiento 2 (42°C) se presenta la misma situación pero con valores de
SQ más altos que en el tratamiento control, en ambos tratamientos la diferencia entre los 130
y 250 minutos de estrés no es muy alto, siendo de 200 copias para el primer tratamiento y
1000 copias para el segundo. En el tratamiento 1 (35°C) se presenta una expresión más alta
a los 10 minutos de exposición que a los 130 minutos, se observa el valor más alto se observa
culminado el estrés con un SQ de 4992 copias.
Los niveles de expresión a 28°C y 35°C de Lv 1645 son los más bajos en comparación con
las demás variedades, se esperaría que al aumentar la temperatura los niveles de expresión
aumenten, en la E2 y E3 del tratamiento los niveles disminuyen con respecto al tratamiento
control. Los valores más altos para esta variedad se presentan en el tratamiento 2 es decir a
42°C, no obstante no alcanzan a superar los valores generados en las otras variedades.
En el estudio realizado en el 2004 por Guan et al. [96] en plantas de arroz no se observaron
niveles de expresión a 28 y 32°C, a 35°C comienza expresarse con niveles bastantes bajos,
pero a 38 y 41°C incrementa considerablemente con respecto a genes Hsp17.7 y Hsp18;
adicional a ellos se presenta un incremento a medida que aumenta el tiempo de exposición a
41°C, tal como ocurre en Lv 1645 en el T2 (gráfica 28). Para el 2009 el grupo de Sarkar[94]
estudio los niveles de expresión de diferentes genes en arroz, mostraba que los niveles del
gen Hsp16.9 aparecen a 37°C y aumentan con la temperatura, siendo el mayor nivel a los
50°C, lo cual concuerda con los estudios realizados por Jiahn. A diferencia de estos, en el
trabajo de Chandel [10] en el 2012 donde compara seis variedades de arroz, muestra que los
niveles de expresión se mantienen constantes en las variedades R-1389-RF-42 y Swarma, en
la variedad Dagad deshi y SL-62 los valores disminuyen a medida que aumenta la
temperatura, la variedad GP-145-103 no presenta ningún patrón de aumento o descenso, ya
que a 37°C tiene unos niveles de Hsp16,9 considerables, pero a 42°C estos niveles sobrepasan
los de la temperatura anterior y vuelve a disminuir a 48°C, la única variedad que incrementa
de manera considerable los niveles de este gen es Nagina 22. Igual ocurre con las variedades
F473, Mocarí y Lv 1645 (Gráfica 28), las tres plántulas tienen bajos niveles a 28°C, la
expresión más alta se presenta en F473 a los 130 minutos de estrés a 35°C y Lv 1645 es la
que menor de expresión presenta tanto para el tratamiento control y tratamiento 1; cada una
de las variedades difiere en los niveles de expresión de este gen.
104
9.8. Cuantificación relativa
Para confirmar si hay una sobre-expresión de los genes diana se realizó una cuantificación
relativa, usando como gen de referencia que amplifica para actina, debido a que su expresión
no varía sin importar la variedad y el tipo de estrés por temperatura al que esté sometido,
como gen calibrador se usó el estándar 2 que presentaba una concentración conocida de 150
ng/µL. Para realizar una cuantificación relativa se puede usar el método Livak conocido
también como el ΔΔCt, el ΔCt usando un gen de referencia y el método Pfaffl. Dichos
métodos no difieren en el resultado, por tal motivo se escogió el método Livak para comparar
la expresión del gen diana (target) con el gen de Actina (referencia) en cada una de las
muestras (test).
Para este método se requiere de tres pasos [97]:
1. Normalizar Ct(target) a Ct(gen de referencia)
2. Normalizar ΔCt de la muestra problema (test) al ΔCt del control
3. Calcular la proporción o diferencia
Para esto se utilizan cuatro ecuaciones
1. ∆𝐶𝑡𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 = 𝐶𝑡𝑡𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡.𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝐶𝑡𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎.𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
2. ∆𝐶𝑡𝑡𝑒𝑠𝑡 = 𝐶𝑡𝑡𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡.𝑡𝑒𝑠𝑡 − 𝐶𝑡𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎.𝑡𝑒𝑠𝑡
3. ∆∆𝐶𝑡𝑡𝑒𝑠𝑡 = ∆𝐶𝑡𝑡𝑒𝑠𝑡 − ∆𝐶𝑡𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
4. 2−∆∆𝐶𝑡
A partir de estas ecuaciones se determinó la relación entre el gen de referencia y cada uno
de los genes de estudio en las tres variedades, los resultados se presentan en la tabla 38.
Tabla 37. Cuantificación relativa de cada uno de los genes usando actina como gen de
referencia
Hsp16,9
Test Hsp16.9
Ct
Actina
Ct ΔCt (control) ΔCt (test) ΔΔCt
2- ΔΔCt
Control 27,94 24,53 3,41
F473 21,27 24,15 -2,88 -6,29 78,25
Mocarí 21,61 23,9 -2,29 -5,7 51,98
LV1645 22,09 24,12 -2,03 -5,44 43,41
Hsp18
Test Hsp18
Ct
Actina
Ct ΔCt (control) ΔCt (test) ΔΔCt
2- ΔΔCt
Calibrador 26,15 24,53 1,62
F473 23,52 24,15 -0,63 -2,25 4,76
Mocarí 23,86 23,9 -0,04 -1,66 3,16
LV1645 24,17 24,12 0,05 -1,57 2,97
Hsp26,7 Test ΔCt (test) ΔΔCt
105
Hsp26,7
Ct
Actina
Ct
ΔCt
(calibrador)
2- ΔΔCt
Calibrador 24,5 24,53 -0,03
F473 21,64 24,15 -2,51 -2,48 5,58
Mocarí 21,49 23,9 -2,41 -2,38 5,21
LV1645 21,45 24,12 -2,67 -2,64 6,23
Hsp70
Test Hsp70 Ct Actina
Ct ΔCt (control) ΔCt (test) ΔΔCt
2- ΔΔCt
Calibrador 22,29 24,53 -2,24
F473 20,41 24,15 -3,74 -1,5 2,83
Mocarí 20,6 23,9 -3,3 -1,06 2,08
LV1645 21,57 24,12 -2,55 -0,31 1,24
Hsp90
Test Hsp90 Ct Actina
Ct ΔCt (control) ΔCt (test) ΔΔCt
2- ΔΔCt
Calibrador 25,44 24,53 0,91
F473 23,62 24,15 -0,53 -1,44 2,713
Mocarí 24,51 23,9 0,61 -0,3 1,231
LV1645 24,27 24,12 0,15 -0,76 1,693
Los valores obtenidos para todos los genes en la cuantificación relativa fueron positivos lo
que permite inferir que hay un aumento en la expresión de cada gen con respecto a un control,
es decir frente a una muestra que no ha sido sometida a estrés por alta temperatura. Los datos
de la tabla 38 se muestran en la gráfica 29.
Gráfica 29. Cuantificación relativa de los genes Hsp16,9, Hsp18, Hsp26,7, Hsp70 y Hsp90
en las tres variedades.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
F473 Mocari Lv1645
Cu
an
tifi
caci
òn
rel
ati
va
Variedades
Cuantificación relativa de los cinco genes en las tres
variedades
Hsp16,9
Hsp18
Hsp26,7
Hsp70
HspH90
106
En la gráfica 29 se muestra que la variedad que presenta mayor expresión en cada uno de los
genes es F473, seguido de Mocarí y por ultimo Lv 1645. Así mismo el gen que codifica la
proteína Hsp16.9 es el que presenta mayor expresión entre 43 y 78 veces más con respecto
al control; seguido de Hsp26.7 que presenta valores similares en las tres variedades entre 5.2
y 6.2 más veces que el control. Hsp18 presenta un valor entre 3 y 4.7 siendo el valor más alto
en F473. Los genes que codifican las proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 son las
que presentan menor expresión al compararlas con los demás genes y los niveles más altos
se siguen expresando en F473, seguido de Mocarí y Lv 1645.
Las sHsp en este caso (Hsp16.9; Hsp18; Hsp26.7) son las más abundantes y diversas en
plantas, pueden incrementar su expresión cuando son sometidos a estrés hasta unas 200
veces, las otras proteínas como las de la familia Hsp70 y Hsp100 lo hacen solo 10 veces [98].
Lo que explica la alta expresión de los genes que codifican para Hsp16.9; Hsp18 y Hsp26.7
en las variedades F473, Mocarí y Lv 1645.
9.9. Análisis de la expresión de los genes por variedad
Se realizó un análisis de la expresión de los genes por cada variedad. Esto con la finalidad
de hacer una comparación entre los cinco genes de estudio en las diferentes condiciones de
temperatura (28, 35, 42°C) en los tres momentos de estrés térmico.
9.9.1. Variedad Fedearroz 473
La variedad Fedearroz 473 caracterizado por su porte bajo, buen vigor inicial, alto
macollamiento y alto potencial de rendimiento. Es una variedad que se cultiva en la zona del
Caribe seco, Caribe húmedo y el Centro del país, donde la temperatura oscila entre los 28 a
30°C, pero así mismo en ocasiones ha incrementado hasta los 34° y 36°C lo que puede afectar
el rendimiento en la producción de arroz en estas zonas del país.
En la gráfica 30 se presenta la expresión de cada uno de los genes de estudio a 28, 35 y 42°C
durante el periodo de estrés térmico. Se puede evidenciar que los niveles de expresión de
estos genes en el Tratamiento control (TC:28°C), son menores en comparación al tratamiento
1 (T1:35°C) y tratamiento 2 (T2:42°C) en los tres instantes del estrés por alta temperatura
(E1, E2, E3). La temperatura óptima para el establecimiento de la plántula de arroz es de 25
a 30°C. Por lo tanto en el tratamiento control (28°C) la planta se encuentra en condiciones
normales de temperatura para su óptimo desarrollo, por ende los niveles de expresión a los
10 y 130 minutos no presentan diferencias significativas entre los valores de cada uno de los
genes, transcurridos los 250 minutos (E3) se ve una disminución en cada uno de los genes
posiblemente a una degradación del ARN que codifica para dichas proteínas.
Cuando las plántulas de arroz se someten a temperaturas por encima de 35°C pueden
presentar alteraciones físicas como punta blanca, manchas cloróticas, y manchas en las hojas,
así mismo los procesos fisiológicos y bioquímicos se ven alterados. Dentro de estos cabe
mencionar la degradación de proteínas, generación de especies reactivas de oxigeno (ROS)
107
y prolongación de la fase S en el crecimiento celular, lo que provoca alteraciones fenotípicas,
malformaciones e incluso la muerte celular. Debido a ello las plantas buscan mecanismos de
defensa para hacer frente a este tipo de situaciones a las cuales están sujetas constantemente.
Uno de estos mecanismos es la producción de proteínas de choque térmico que actúan como
chaperonas moleculares, que se encargan de estabilizar y prevenir la agregación de las
proteínas y mantener su estado fundamental de manera que puedan replegarse y
reconformarse nuevamente [98]. Debido a esto, en el T1 es decir a 35°C se presenta un
incremento en los niveles de expresión en cada uno de los genes, llegando a duplicar el
número de copias a los 10 minutos del estrés térmico y a triplicarlo a los 130 minutos y
disminuye su expresión a los 250 minutos, producto de la degradación del ARN. En el T2
(42°C) hay un incremento de la expresión en cada gen comparado con el TC pero no alcanza
a superar los valores presentados en el T1. Como se puede observar en la gráfica 30 los genes
que presentan mayor expresión en esta variedad en orden creciente son Hsp18, Hsp26.7 y
Hsp16.9 denominadas como small heat shock protein (sHsp), ya que son proteínas que no
requieren de ATP para su funcionamiento y por lo tanto forman de manera inmediata grandes
oligomeros con las proteínas nativas para evitar su desnaturalización, una vez se establecen
estas conformaciones se unen a proteínas dependientes de ATP como las Hsp70 y Hsp90
para retornar a la proteína en su conformación inicial. Los niveles de Hsp70 y Hsp90
incrementan entre los tratamientos pero no de manera sustancial como se puede observar en
la tabla 38 de la cuantificación relativa, esto debido a que estas proteínas actúan como
chaperonas moleculares bajo cualquier tipo de estrés que presenta la planta.
Gráfica 30. Expresión de los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 en la variedad
F473 en el TC, T1 y T2
La cuantificación relativa muestra que la variedad F473 es la que mayor niveles de expresión
presenta en todos los genes frente a la variedad Mocarí y Lv 1645. Al relacionar los valores
absolutos y relativos con los datos fenotípicos presentados en cada uno de los tratamientos,
se puede afirmar que F473 es la variedad que presenta resistencia al estrés térmico por altas
0,0500,0
1000,01500,02000,02500,03000,03500,04000,04500,05000,05500,06000,06500,0
E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3
SQ
TC T1 T2
Expresión de Hsp en Fedearroz 473 en los tres
tratamientos
Hsp90
Hsp70
Hsp26,7
Hsp18
Hsp16,9
108
temperaturas, puesto que en el TC y pese a estar irradiada no presento manchas cloróticas en
la lámina ni en la punta de la hoja, en el T1 algunas hojas laterales se quemaron para proteger
la hoja bandera y hasta los 130 minutos del estrés en el T2 comienza a manifestar necrosis
apical, lo que indica que los altos niveles de expresión de estas proteínas en especial de las
sHsp están relacionadas con la respuesta al estrés térmico, lo que lo hace un genotipo
apropiado para sembrar en zonas del país donde se presente temperaturas altas.
9.9.2. Variedad Mocarí
La variedad Mocarí es un genotipo que se liberó en el 2010 al mercado nacional y desde
entonces se ha caracterizado por su alto vigor inicial, periodo vegetativo corto y buen
macollamiento. Es una variedad que se cultiva en la zona del Caribe seco, Caribe húmedo y
el Centro del país, donde la temperatura oscila entre los 28 a 30°C, pero si el cultivo se
encuentra en temporadas donde estas regiones alcanzan la temperatura máxima (superior a
35°C), su producción tiende a disminuir.
En la gráfica 31 se presentan los valores de cada uno de los genes en los diferentes
tratamientos para esta variedad. Es posible observar que los niveles de expresión de cada gen
aumentan a los 35 y 42°C de temperatura en comparación con el tratamiento control (28°C).
Al igual que en la variedad F473 los niveles más altos de expresión los presentan las proteínas
sHsp, en orden creciente Hsp18, Hsp26.7 y Hsp16.9. El gen Hsp16.9 alcanza valores hasta
de 5000 copias a los 250 minutos del tratamiento 1, es decir cerca de 4000 copias por encima
del TC; seguido de este se encuentra Hsp26.7 que presenta los valores más altos en la E1 y
E3 del tratamiento 2 con 200 copias por encima de los valores del T1 y 400 copias del TC.
Los niveles de expresión de la Hsp18 no varían significativamente entre el estrés a 35 y 42°C,
pero si son superiores en comparación de los niveles expresados a 28°C. Los niveles de la
Hsp70 y Hsp90 son los más bajos en esta variedad; aunque los valores de Hsp70 son más
altos que las Hsp90.
Al comparar los valores absolutos con los valores relativos, Mocarí es la variedad que
presenta niveles de expresión por debajo de F473 y por encima de Lv 1645 (Gráfica 29). Pese
a que las plántulas de Mocarí presentaron manchas cloróticas conocidas como maculata
debido a la radiación, también se vio alterado el fenotipo por la exposición a altas
temperaturas. A los 35°C (T1) se observó necrosis apical, y deshidratación en las hojas, al
igual que a los 10 minutos de estrés a 42°C (T2).
A causa de esto es posible clasificar esta variedad como resistente a altas temperaturas en un
rango de 35 a 38°C; es posible notar que hay altos niveles de expresión de los genes a 42°C,
sin embargo esta temperatura genera manchas adicionales en la lámina y punta de las hojas,
lo que puede conllevar a una muerte celular si se deja en tiempos prolongados a esta
temperatura ya que puede verse afectada el aparato fotosintético y por lo tanto el rendimiento
de los cultivos se vería afectado.
109
Gráfica 31. Expresión de los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 en la variedad
Mocarí en el TC, T1 y T2.
9.9.3 Variedad Línea avanzada1645
Línea avanzada 1645 es una variedad que presenta altos niveles de rendimiento, su
productividad merma en regiones como el Caribe seco, donde la temperatura a logrado
alcanzar los 36C.
En la gráfica 32 se presentan los valores de cada uno de los genes en los diferentes
tratamientos para esta variedad. Es posible observar que los niveles de expresión de los genes
en el tratamiento control (28C) son más altos en comparación al tratamiento 1 (35°C), lo cual
puede tener una relación directa con la tolerancia de esta variedad al estrés térmico por alta
temperatura. Los niveles máximos en cada uno de los genes se manifiestan en el tratamiento
2 es decir a 42°C.
Los niveles más altos de expresión se presentan en las sHsp: 16.9, seguido de Hsp26.7, Hsp18
los más bajos son correspondientes a Hsp70 y Hsp90. Al comparar los valores absolutos y
los valores relativos (Gráfica 29) de F473, Mocarí y Lv1645, esta última es el genotipo que
presenta los menores niveles de expresión en los cinco genes de estudio, lo que puede estar
relacionado con la resistencia al estrés térmico, ya que de acuerdo a los datos fenotipos
obtenidos durante los tratamientos, Lv 1645 pese a presentar líneas longitudinales de color
blanco en las hojas conocida como estriata y despigmentación en las puntas de las hojas como
consecuencia de la radiación, presento en los tres tratamiento necrosis apical y manchas en
las hojas en mayor proporción que Mocarí.
Debido a esto es posible clasificar esta variedad como susceptible a altas temperaturas, no se
recomiendo sembrar en zonas del país donde la temperatura sobrepase lo 30C dado que se
0,0500,0
1000,01500,02000,02500,03000,03500,04000,04500,05000,05500,0
E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3
SQ
TC T1 T2
Expresión de Hsp en Mocarí en los tres tratamientos
Hsp90
Hsp70
Hsp26,7
Hsp18
Hsp16,9
110
generan alteraciones en el fenotipo lo que conlleva una disminución en la producción de
arroz.
Gráfica 32. Expresión de los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 en la variedad
Lv1645 en el TC, T1 y T2.
Para realizar la lisis celular, se sometió el tejido foliar a maceración mecánica y nitrógeno
líquido; la extracción de proteínas totales se realizó de acuerdo a la metodología
planteada con la solución de Buffer Glicina.
9.10. Cuantificación de Proteínas totales
Se realizó una cuantificación de proteínas totales, haciendo uso del método colorimétrico de
Bradford. A continuación se presenta en la tabla 39 la absorbancia para la curva de
calibración y las muestras problema.
Tabla 38. Absorbancia de la curva patrón y las muestras del Tratamiento Control (TC),
Tratamiento 1 (T1) y del Tratamiento 2 (T2) en las tres variedades Fedearroz 473 (F473),
Mocarí y Línea Avanzada 1645 (Lv1645).
Absorbancia
Buffer Glicina 0
Blanco 0
Patrón 120 mg/dL 2,279
Patrón 100 mg/dL 2,051
Patrón 80 mg/dL 1,727
Patrón 60 mg/dL 1,451
Patrón 40 mg/dL 1,112
Patrón 20 mg/dL 0,789
Variedad Extracción Concentración
mg/dL
TRATAMIENTO
CONTROL
F473 1 32,71739857 1,005
F473 2 29,60591778 0,958
0,0400,0800,0
1200,01600,02000,02400,02800,03200,03600,04000,0
E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3
SQ
TC T1 T2
Expresión de Hsp en Linea Avanzada 1645 en los tres
tratamientos
Hsp90
Hsp70
Hsp26,7
Hsp18
Hsp16,9
111
F473 3 25,96482323 0,903
MOCARÍ 1 30,33413669 0,969
MOCARÍ 2 39,93338595 1,114
MOCARÍ 3 27,75226965 0,930
LV 1645 1 21,59550978 0,837
LV 1645 2 28,54669028 0,942
LV 1645 3 34,04143295 1,025
Variedad Extracción Concentración
mg/dL TRATAMIENTO 1
F473 1 44,76611143 1,187
F473 2 62,17716354 1,450
F473 3 56,88102601 1,370
MOCARÍ 1 55,35838648 1,347
MOCARÍ 2 55,62319335 1,351
MOCARÍ 3 52,04830053 1,297
LV 1645 1 74,2258764 1,632
LV 1645 2 53,63714178 1,321
LV 1645 3 60,05870853 1,418
Variedad Extracción Concentración
mg/dL TRATAMIENTO 2
F473 1 28,48048856 0,941
F473 2 43,50827877 1,168
F473 3 29,27490918 0,953
MOCARÍ 1 30,59894356 0,973
MOCARÍ 2 49,33403005 1,256
MOCARÍ 3 20,80108915 0,825
LV 1645 1 43,04486674 1,161
LV 1645 2 34,24003811 1,028
LV 1645 3 48,4734077 1,243
Con los datos obtenidos se procedió a realizar una regresión lineal, (gráfica 33), donde se
representa la curva estándar realizada a partir de 6 soluciones, presentando un coeficiente de
correlación con un R2 de 0,9971 acercándose al 1, lo que permite determinar la concentración
de proteínas totales en las diferentes muestras problemas con un alto grado de confiabilidad.
Gráfica 33. Curva estándar por método de Bradford.
y = 0,0151x + 0,5139
R² = 0,9971
0
1
2
3
0 20 40 60 80 100 120
Ab
sorb
an
cia
Concentración (mg/dL)
CURVA CONTROL BSA
112
9.10.1. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento Control
Se contrastaron los valores obtenidos de proteínas totales en el tratamiento control en la curva
patrón (gráfica 34). Todos los valores se ajustaron a la curva, presentando una concentración
entre 20 y 40 mg/dL. El menor y mayor valor corresponde a Lv1645 con 21,59 y 34,04
respectivamente.
Gráfica 34. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento control TC relacionados
con la curva estándar.
9.10.2. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento 1
Se cuantifico el contenido de proteínas totales en cada muestra para el tratamiento 1 (gráfica
35), de acuerdo a los datos obtenidos las muestras en este tratamiento, tienen una
concentración entre 40 y 70 mg/dL, siendo F473 E1 la de menos valor con 44,76 mg/dL y
Lv1645 E1 la de mayor concentración con 74,22 mg/dL.
Gráfica 35. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento 1 T1 relacionados con la
curva estándar.
y = 0,0151x + 0,5139
R² = 0,9971
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 20 40 60 80 100 120
Ab
sorb
an
cia
Concentración (mg/dL)
TRATAMIENTO CONTROL Vs CURVA CONTROL
BSA
y = 0,0151x + 0,5139
R² = 0,9971
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 20 40 60 80 100 120
Ab
sorb
an
cia
Concentración (mg/dL)
TRATAMIENTO 1 Vs CURVA CONTROL BSA
113
9.10.3. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento 2
Para el tratamiento 2, las muestras disminuyeron su concentración con respecto al tratamiento
1, acercándose algunas de las muestras a los valores obtenidos en el tratamiento control
(gráfica 36). El rango de concentración está entre 20 y 50 mg/dL. A 42°C Mocari es la
variedad que presento el menor y mayor valor, siendo de 20,80 mg/dL y 49,33 mg/dL.
Gráfica 36. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento 2 T2 relacionados con la
curva estándar.
9.11. SDS-PAGE
Para observar el perfil electroforético en cada uno de los tratamientos en las tres variedades,
se usaron geles de poliacrilamida discontinuos usando como desnaturalizante
sodiododecilsulfato; dichos geles fueron preparados a una concentración de 12,5% con la
finalidad de separar proteínas con peso molecular de un rango de 10 a 200 kDa [81], puesto
que las proteínas de interés Hsp16,9; Hsp18; Hsp26,7; Hsp70 y Hsp90 presentan pesos
moleculares de 16,9, 18, 27, 71 y 90 kDa respectivamente. Se utilizó el marcador de peso
molecular Dual Color Standards de Bio-Rad, que presenta un rango de 10 a 250 kDa.
De acuerdo a los datos obtenidos en la cuantificación de proteínas totales por el método de
Bradford, se normalizaron las diferentes muestras a 25mg/dL para poder comparar las bandas
proteicas entre las variedades en cada uno de los tratamientos.
9.11.1. Geles SDS-Page Tratamiento Control (TC)
En la figura 59 se presenta el perfil proteico para el tratamiento control (TC:28°C) , de las
variedades Fedearroz 473, Mocarí y Línea avanzada 1645 en los tres momentos de
extracción. En las tres variedades se presenta una alta presencia de proteínas con un peso
molecular de 50 kDa; las tres variedades presentan un perfil similar, pero con diferencias en
la intensidad en cada una de las bandas, siendo Mocarí la que menor cantidad de proteínas
presento con respecto a F473 y Lv1645. En las tres variedades se logra percibir 2 bandas
y = 0,0151x + 0,5139
R² = 0,9971
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 20 40 60 80 100 120
Ab
sorb
an
cia
Concentración (mg/dL)
TRATAMIENTO 2 Vs CURVA CONTROL BSA
114
entre 25 y 27 kDa. La variedad F473 presenta mayor intensidad en las bandas en la extracción
2 y 3 es decir a la 1:15 pm y 3:15 pm; por otro lado Mocarí presento menor cantidad de
proteínas en la última extracción; a diferencia de Lv1645 que presenta una intensidad similar
en los diferentes momentos de extracción.
kDa MP F1 F2 F3 M1 M2 M3 Lv1 Lv2 Lv3
250
150
100
75
50
37
25
Figura 59. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-PAGE con tinción azul de Comassie.
9.11.2. Geles de SDS-Page Tratamiento 1 (T1)
Se realizó un perfil proteico de las tres variedades para el tratamiento 1 (T1:35°C), (Figura
60). Al igual que en el Tratamiento control, en el tratamiento 1 se presenta una fuerte
concentración de proteínas con un peso molecular de 50 kD (C). Las variedades F473,
Mocarí, Lv 1645 presentan un perfil proteico similar, la intensidad de las bandas cambia de
una variedad a otra y de los momentos de extracción. Se logra observar bandas cercanas a 90
kDa, (A) 75kDa (B), 26 kDa (D) y 18 kDa (E).y 16 kDa (F), que pueden estar relacionadas
con los pesos moleculares de las proteínas de interés.
9.11.3. Geles de SDS-Page Tratamiento 2 (T2)
Se realizó un perfil proteico para el tratamiento 2 (T2: 42°C) para las tres variedades (figura
61). F473, Mocarí y Lv1645 presentan un perfil proteico similar, junto a ello tienen el mismo
patrón que el Tratamiento 1, pero con una intensidad mayor en cada una de las bandas. Al
igual que en el TC y T1, T2 presenta la banda característica de 50 kDa (C) Lv 1645 es la
variedad que presenta mayor intensidad, seguido de F473 y siendo Mocarí la que menor
visibilidad presenta. En las tres variedades se logran apreciar las bandas de interés, siendo de
90 kDa (A), 70 kDa (B), 26 kDa (D), 18 kDa (E) y 16 kDa (F). La variedad F473 y Mocarí
presentan la mayor cantidad de proteínas en la extracción 2, al contrario de Lv 1645 que
presenta una cantidad similar en las tres extracciones.
115
kDa MP F1 F2 F3 M1 M2 M3 Lv1 Lv2 Lv3
250
150
100
75
50
37
25
20
15
Figura 60. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-Page con tinción azul de Comassie.
kDa MP F1 F2 F3 M1 M2 M3 Lv1 Lv2 Lv3 250
150
100
75
50
37
25
20
15
Figura 61. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-Page con tinción azul de Comassie.
En los tres tratamientos se observa que la banda de mayor intensidad corresponde a 50 kDa
con relación al marcador de peso, siendo está correspondiente a proteínas glutelinicas que
constituyen entre el 70 y 90% de proteínas totales en arroz. La fracción glutelina está
constituida por dos polipéptidos alfa y beta, ambos unidos por puentes disulfuro.
Actualmente se han identificado seis genes que las codifican y permiten establecer una
A
B
C
D
E
F
A
B
C
D
E
F
116
clasificación en dos subfamilias: GluA y GluB de acuerdo a la secuencia de nucleótidos que
generan. Estas diferencias se trasladan a sus propiedades nutricionales ya que GluB contiene
mayor cantidad del aminoácido esencial lisina y a sus propiedades estructurales ya que
presentan diferencias en su grado de polimerización [99].
117
10. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO
La investigación tuvo un Diseño Completamente al Azar (DCA), el cual consiste en la
asignación de unidades experimentales de manera completamente aleatoria en cada uno de
los tratamientos (en este caso la unidad experimental fue cada una de las placas de PCR con
los genotipos). Debido a su aleatorización irrestricta, se utilizaron unidades experimentales
lo más homogéneas posibles, esto se logró manteniendo los individuos de cada genotipo
iguales condiciones (medio, humedad relativa, temperatura y edad) para de manera esta
disminuir el error experimental. La ecuación general que se utilizó en este Diseño Factorial
Completamente al Azar fue:
𝑿𝒊𝒋𝒌 = 𝝁 + 𝜶𝒋 + 𝜷𝒌 + 𝜸𝒋𝒌 + 𝜹𝒊𝒋𝒌
Los datos obtenidos de la aplicación del modelo estadístico fueron utilizados en los
análisis de resultados. Las figuras de comparación de variables estadísticas que se
muestran a continuación y fueron obtenidas del programa de análisis estadístico “R i386
3.4.0”, los valores generados por el programa que corresponden a cada gráfica.
Obteniendo el Modelo y Programa para realizar el análisis estadístico se resolver las hipótesis
para cada una de las comparaciones que se llevaron a cabo.
A. HIPÓTESIS DE VARIEDADES
Hipótesis nula (H0): el estrés por alta temperatura no genera diferencias en la expresión de
genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7)
Hsp70 y Hsp 90 en las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 irradiadas
con 60Co.
Hipótesis alterna (H1): el estrés por alta temperatura si genera diferencias en la expresión de
genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7)
Hsp70 y Hsp 90 en las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 irradiadas
con 60Co.
B. HIPÓTESIS DE TRATAMIENTOS
Hipótesis nula (H0): las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 no presentan
diferencias significativas en la expresión de genes que codifican las proteínas de choque
térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en los diferentes tratamientos
(TC, T1 y T2).
Hipótesis alterna (H1): las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 si
presentan diferencias significativas en la expresión de genes que codifican las proteínas de
118
choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en los diferentes
tratamientos (TC, T1 y T2).
10.1. ANÁLISIS DE DISTRIBUCIÓN DE LOS DATOS
Para la corroboración de las hipótesis planteadas se realizó un análisis estadístico descriptivo
evaluando la normalidad de los datos, se realizó un Histograma de Frecuencias y un Boxplot
con el fin de juzgar si estos proceden de una distribución y analizar la simetría para evaluar
mediante inspección visual la normalidad de las puntuaciones. Para determinar con un valor
numérico esta distribución de datos se realizó un test de Anderson-Darling con el objetivo de
certificar la normalidad o no de las variables.
10.2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DESCRIPTIVO
Los datos a analizar (ver anexo 9) se presentan en la figura X. Las variedades F 473, Lv 1645
y MOCARÍ tienen 45 datos, los tratamientos TC, T1 y T2 presentan 45 datos, y las
extracciones que fueron a distintas horas (11:10, 13:10 y 15:10) muestran al igual que los
anteriores 45 datos.
Figura 62. Conjunto de datos activos.
Los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 muestran un total de 27 datos para cada
uno. Por último el número de copias SQ presenta un mínimo de 0.0, en el 1st Cuartil con un
valor de 149.1, una mediana de 260, una media de 768.9, 3dr Cuartil de 697.4 y un valor
máximo de 6048.0.
10.2.1. Histograma
En la gráfica 37 se observa que el histograma presenta una distribución en forma de asimetría
positiva debido a que la concentración de los datos está dada hacia los valores inferiores y la
cola esta hacia los valores superiores.
119
Gráfica 37. Histograma de frecuencias contrastando el número de copias (SQ) con las
variedades F473, Lv 1645 y Mocarí.
10.2.2. BoxPlot
En la gráfica 38 se observa los BoxPlot que ofrece una representación gráfica en la que se
distinguen la tendencia central, la dispersión y la distribución de nuestros datos [100].
La asimetría del BoxPlot está dada por la posición de la mediana en la caja. Así, cuando la
línea que representa la mediana se situé en el centro de la caja estaremos ante una distribución
simétrica. Si se aproxima al Q3 la distribución será asimétrica negativa, y si se aproxima al
Q1, asimétrica positiva [100] lo cual es nuestro caso. La prolongación de los bigotes muestran
que no existe una equivalencia entre estos ya que el bigote inferior es de menor prolongación
que el bigote superior.
Curtosis, esta media queda representada en el BoxPlot por la relación entre la longitud de la
caja y la longitud de sus bigotes. Puesto que la caja representa el cuerpo central de los datos,
si es muy estrecha y sus bigotes son prolongados implica que los valores centrales están muy
concentrados o, lo que es lo mismo, la distribución es leptocúrtica [100].En nuestro caso sucede
lo contrario, la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos, es decir que es menor es el
grado de apuntamiento de la distribución.
120
Gráfica 38. a. BoxPlot contrastando SQ vs VARIEDADES. b. BoxPlot contrastando SQ
vs TRATAMIENTOS.
Con relación a los valores anómalos, estos son los que están excesivamente alejados del
cuerpo central de la distribución y que, por este motivo, no son representativos del conjunto
de datos. Para ello se toma como unidad de medida la propia longitud de la caja, es decir, el
IQR [100].
Los Outliers son aquellos valores que se alejan del cuerpo central de la distribución entre 1.5
y 3 veces el valor del IQR; gráficamente, un outlier es una puntuación que se situa entre “una
caja y media” y “tres cajas” de del cuerpo central de los datos [, 00].en nuestro análisis tenemos
como outliers los valores de 103 que corresponde a 3087 SQ, 60 a 3256 SQ, 58 a 3654 SQ,
73 a 3721 SQ y 134 a 3808 SQ.
Los valores anómalos extremos son aquello que se alejan del cuerpo central de la distribución
más de 3 veces del valor del IQR [100], que en la gráfica se observa a 59 que corresponde a un
SQ de 6048, 75 con un SQ 4992, 104 con SQ de 4635 y 120 con un SQ de 4461.
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente el BoxPlot nos da una distribución donde
los datos están concentrados en la caja y distribuidos en los bigotes, de manera asimétrica,
los datos con valores anómalos están generando en el BoxPlot la asimetría, pero no se sacaran
de los análisis ya que el interés de nuestra investigación son las sobreexpresiones de genes
que están representados en algunos de estos datos.
Las principales ventajas de los análisis de gráficas son la sencillez de interpretación, la
extensión a cualquier tipo de distribución y, en el caso de la distribución normal, la facilidad
de obtener el diagrama ya que está implementado en muchos paquetes estadísticos. Además,
no requieren muestras tan numerosas como algunos tests de normalidad.
121
10.2.3. Pruebas de significación
Debido a que el principal inconveniente de los análisis por gráficas es la subjetividad de la
interpretación visual, ya que al contrario de los tests de normalidad numéricos no se concluye
con una “p “ de probabilidad objetiva, por tal razón se procedió a realizar los test Anderson-
Darling.
Tabla 39. Pruebas de significación. Anderson-Darling
TEST VALOR TEST VALOR Pv
Anderson-Darling A = 19.817 p-value < 2.2e-16
La prueba Anderson-Darling es, en general, más potente que las pruebas χ2 de Pearson y la
de Kolmogorov-Smirnov; [101] es una prueba de bondad y ajuste, donde mide cuán lejos están
los puntos del grafico de la línea ajustada en un gráfico probabilistico (BoxPlot en nuestro
caso), el estadístico es una distancia al cuadrado ponderada de los puntos del grafico a la
línea ajustada con pesos mayores en las colas [103]. En particular, la prueba de Anderson-
Darling funciona mejor que cualquier otra, cuando hay casos extraordinarios o anómalos [101]
, por tal razón se escoge este test para determinar la distribución de los datos con un “p” valor.
La prueba de Anderson-Darling es una prueba omnibus EDF para la hipótesis compuesta de
normalidad. La estadística de prueba es
A = -n -\frac1n ∑_i=1^n [2i-1] [\ln(p_(i)) + \ln(1 - p_(n-i+1))],
Donde p _ (i) = Φ ([x _ (i) - \ overline x] / s). Aquí, Φ es la función de distribución acumulativa de la distribución
normal estándar, y \ overline x y s son la media y la desviación estándar de los valores de
los datos. El valor p se calcula a partir de la estadística modificada Z = A (1,0 + 0,75 / n +
2,25 / n ^ 2) \ según la Tabla 4.9 en Stephens (1986) [104].
Los valores p calculados a partir del estadístico ayudan a determinar qué modelo de
distribución se debe utilizar para un análisis de capacidad o un análisis de fiabilidad.
Las hipótesis para la prueba de Anderson-Darling son:
H0: Los datos siguen una distribución especificada.
H1: Los datos no siguen una distribución especificada.
El valor p para la prueba de Anderson-Darling es 2.2e-16 menor que el nivel de significancia
seleccionado (en este caso 0.05), por lo cual se concluye que los datos no siguen la
distribución especificada.
Teniendo en cuenta el histograma, el boxplot y el test de Anderson-Darling, llegamos a la
conclusión de que los datos no siguen una distribución específica o normal.
122
10.3. ANALISIS DE VARIANZA (ANOVA)
En ciertas situaciones experimentales, los grupos, muestras o unidades experimentales son
muy heterogéneas, debido a la presencia de factores genéticos, ambientales o de naturaleza
desconocida. Para estas situaciones el diseño de ANOVA más adecuado es el de bloques
aleatorizados. En un diseño de estas características, los individuos son agrupados en bloques,
contrayendo cada bloque una réplica de los tratamientos [104].
Por esta razón se realizó una prueba paramétrica de ANOVA con múltiples facetes, SQ
(número de copias), Gen (Hsp90, Hsp70, Hsp26.7, Hsp18 y Hsp16.9), tratamiento (TC, T1
y T2) y Variedad ( F473, MOCARÍ y Lv 1645) para la resolución de las hipótesis.
Figura 63. ANOVA de Bloques relacionando. SQ (número de copias), Gen (Hsp90,
Hsp70, Hsp26.7, Hsp18 y Hsp16.9), Tratamiento (TC, T1 y T2) y las Variedades (F473,
MOCARÍ y Lv 1645).
Según los niveles de significancia de la Figura X, observamos que entre la expresión de los
genes Hsp90, Hsp70, Hsp26.7, Hsp18 y Hsp16.9 si se generan diferencias significativas
debido a que el Pr es menor que el valor de significancia, es decir, Pr = 2.2e-16 < 0.001. Con
relación a los tratamientos TC, T1 y T2 se encuentra que existen diferencias significativas
entre ellos debido a que el Pr es menor que el valor de significancia, es decir, Pr = 4.235e-5
< 0.001. Por otro lado haciendo relación a la variedades estudiadas F473, MOCARÍ y Lv
1645 obtenemos que si existen diferencias significativas debido a que el Pr es menor que el
valor de significancia, es decir, Pr = 6.259e-5 < 0.001.
Observando las relaciones entre la expresión de cada gen y los tratamiento utilizados en el
experimento se observa que existen diferencias significativas entre cada uno de los
tratamientos con relación a la expresión del gen, debido a que el Pr es menor que el valor de
significancia, es decir, Pr = 0.0007537 < 0.001. Por otro lado teniendo en cuenta la relación
entre la expresión de los genes y la variedades del estudio tenemos que también existen
diferencias significativas ya que el Pr es menor que el valor de significancia, es decir, Pr =
123
0.0001765 < 0.001. Por ultimo teniendo en cuenta la relación entre los distintos tratamientos
utilizados y las variedades se observa que existen diferencias significativas debido a que el
Pr es menor que el valor de significancia, es decir, Pr = 0.0685944 < 0.1.
Por ultimo las relación entre los genes de estudio, los tratamiento a los que fue sometida cada
variedad y las variadas, se encuentran diferencia significativas entre sus medias debido a que
el Pr es menor que el valor de significancia, es decir, Pr = 0.0060544 < 0.01.
A continuación se presentan las gráficas de los BoxPlot, las gráficas básicas de diagnóstico,
el effect plot de cada relación.
En la gráfica 39 se observa los boxplot que ofrece una representación gráfica en la que se
distinguen la tendencia central, a la dispersión y la distribución de los datos de las variedades
utilizadas en nuestro experimento.
En la gráfica, se observa la relación entre las variedades objeto de estudio y los tratamientos.
La variedad F473 en el Q1 tiene valor de 209 y el Q3 con 704.4. Por lo tanto, el interior de
la caja contiene el 50% de los datos centrales de la muestra.
Gráfica 39. BoxPlot Variedades F473, MOCARÍ y Lv1645 vs Número de Copias (SQ).
La línea central representa el Q2 (327.3407) que coincide con la mediana de la distribución,
y la media con un valor 899.6649. El ancho de la caja es una medida de la variabilidad de
los datos, ya que se corresponde con el IQR (amplitud intercuartílica).Por tanto, cuanto
mayor sea la longitud de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100],
para F473 corresponde a un valor de 580.7655. La asimetría del boxplot está dada por la
posición de la mediana en la caja. La línea que representa la mediana se aproxima al Q1,
asimétrica positiva lo cual es nuestro caso. La prolongación de los bigotes muestran que
no existe una equivalencia entre estos ya que el bigote inferior es de menor prolongación
que el bigote superior. A nivel de curtosis, la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos,
124
es decir que es menor es el grado de apuntamiento de la distribución. Los Outliers en
nuestro análisis tenemos los valores marcados en la gráfica. Los valores anómalos
extremos son aquello que se alejan del cuerpo central de la distribución más de 3 veces del
valor del IQR [100], que se pueden observar bastantes en la gráfica.
Gráfica 40. BoxPlot Tratamientos TC (28 °C), T1 (35 °C) y T2 (42 °C) vs Número de
Copias (SQ).
Por otra parte la variedad Lv 1645 en el Q1 tiene valor de 189.7 y el Q3 con 406.7, por lo
tanto, el interior de la caja contiene el 50% de los datos centrales de la muestra. La línea
central representa el Q2 (187.4995) que coincide con la mediana de la distribución, y la media
con un valor 511.2233. El ancho de la caja es una medida de la variabilidad de los datos, ya
que se corresponde con el IQR (amplitud intercuartílica). Por tanto, cuanto mayor sea la
longitud de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100], para Lv 1645
corresponde a un valor de 359.3213. La asimetría del boxplot está dada por la posición de la
mediana en la caja. La línea que representa la mediana se aproxima al Q1, asimétrica positiva
lo cual es nuestro caso. La prolongación de los bigotes muestran que no existe una
equivalencia entre estos ya que el bigote inferior es de menor prolongación que el bigote
superior. A nivel de curtosis, la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos, es decir que
es menor es el grado de apuntamiento de la distribución. Los Outliers en nuestro análisis
tenemos los valores marcados en la gráfica. Los valores anómalos extremos son aquello que
se alejan del cuerpo central de la distribución más de 3 veces del valor del IQR [100]., que se
pueden observar bastantes en la gráfica.
Por ultimo para la variedad MOCARÍ en el Q1 tiene valor de 207 y el Q3 con 764.4. Por lo
tanto, el interior de la caja contiene el 50% de los datos centrales de la muestra. La línea
central representa el Q2 (323.5937) que coincide con la mediana de la distribución, y la media
con un valor 895.9213. El ancho de la caja es una medida de la variabilidad de los datos, ya
125
que se corresponde con el IQR (amplitud intercuartílica). Por tanto, cuanto mayor sea la
longitud de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100], para MOCARÍ
corresponde a un valor de 572.6382. La asimetría del boxplot está dada por la posición de la
mediana en la caja. la línea que representa la mediana se aproxima al Q1, asimétrica positiva
lo cual es nuestro caso. La prolongación de los bigotes muestran que no existe una
equivalencia entre estos ya que el bigote inferior es de menor prolongación que el bigote
superior. A nivel de curtosis, la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos, es decir que
es menor es el grado de apuntamiento de la distribución. Los Outliers en nuestro análisis
tenemos los valores marcados en la gráfica. Los valores anómalos extremos son aquello que
se alejan del cuerpo central de la distribución más de 3 veces del valor del IQR [100],
Por otro lado en la gráfica 40, se observa los boxplot que ofrece una representación gráfica
en la que se distinguen la tendencia central, al dispersión y la distribución de los datos de los
tres tratamientos utilizados en nuestro experimento.
En el TC tratamiento control, en el Q1 tiene valor de 96.6 y el Q3 con 352.1, por lo tanto, el
interior de la caja contiene el 50% de los datos centrales de la muestra. La línea central
representa el Q2 (180.3018) que coincide con la mediana de la distribución, y la media con
un valor 899.6649. El ancho de la caja es una medida de la variabilidad de los datos, ya que
se corresponde con el IQR (amplitud intercuartílica). Por tanto, cuanto mayor sea la longitud
de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100], para TC corresponde a
un valor de 134.7332. La asimetría del boxplot está dada por la posición de la mediana en la
caja, la línea que representa la mediana esta central por lo cual es simétrica. La prolongación
de los bigotes muestran que existe una equivalencia entre estos ya que el bigote inferior de
igual prolongación que el bigote superior. A nivel de curtosis, la caja es muy ancha y los
brazos muy estrechos, es decir que es menor es el grado de apuntamiento de la distribución.
Los Outliers en nuestro análisis tenemos los valores marcados en la gráfica. Los valores
anómalos extremos son aquello que se alejan del cuerpo central de la distribución más de 3
veces del valor del IQR [100], que se pueden observar bastantes en la gráfica.
Para el T1 tratamiento 1, en el Q1 tiene valor de 352.1 y el Q3 con 876.3, por lo tanto, el
interior de la caja contiene el 50% de los datos centrales de la muestra. La línea central
representa el Q2 (388.1504) que coincide con la mediana de la distribución, y la media con
un valor 859.8794. El ancho de la caja es una medida de la variabilidad de los datos, ya que
se corresponde con el IQR (amplitud intercuartílica). Por tanto, cuanto mayor sea la longitud
de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100], para T1 corresponde a un
valor de 483.1863 La asimetría del boxplot está dada por la posición de la mediana en la caja.
la línea que representa la mediana se aproxima al Q1, asimétrica positiva lo cual es nuestro
caso. La prolongación de los bigotes muestran que no existe una equivalencia entre estos ya
que el bigote inferior es de mayor prolongación que el bigote superior. A nivel de curtosis,
la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos, es decir que es menor es el grado de
apuntamiento de la distribución. Los Outliers en nuestro análisis tenemos los valores
marcados en la gráfica. Los valores anómalos extremos son aquello que se alejan del cuerpo
126
central de la distribución más de 3 veces del valor del IQR [100], que se pueden observar
bastantes en la gráfica.
Para el T2 tratamiento 2, en el Q1 tiene valor de 344.1 y el Q3 con 1026.4, por lo tanto, el
interior de la caja contiene el 50% de los datos centrales de la muestra. La línea central
representa el Q2 (338.8442) que coincide con la mediana de la distribución, y la media con
un valor 937.6092. El ancho de la caja es una medida de la variabilidad de los datos, ya que
se corresponde con el IQR (amplitud intercuartílica). Por tanto, cuanto mayor sea la longitud
de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100], para T2 corresponde a un
valor de 638.0876. La asimetría del boxplot está dada por la posición de la mediana en la
caja. La línea que representa la mediana se aproxima al Q1, asimétrica positiva lo cual es
nuestro caso. La prolongación de los bigotes muestran que no existe una equivalencia entre
estos ya que el bigote inferior es de mayor prolongación que el bigote superior. A nivel de
curtosis, la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos, es decir que es menor es el grado
de apuntamiento de la distribución. Los Outliers en nuestro análisis tenemos los valores
marcados en la gráfica. Los valores anómalos extremos son aquello que se alejan del cuerpo
central de la distribución más de 3 veces del valor del IQR [100], que se pueden observar
bastantes en la gráfica.
En la gráfica 4 1 tenemos, la gráfica de los residuos frente a los datos ajustados donde se
representa los residuos (diferencias entre el valor real y el valor ajustado/predicho) frente a
los valores ajustados. Si la regresión es simple (Y = a + bX), sería equivalente a un gráfico
de residuos frente a la variable independiente (X). por tal razón si un punto está relativamente
muy por encima o muy por debajo de la recta horizontal, es un valor atípico (aparecen
destacados en el gráfico con sendas etiquetas) [104] en nuestro caso corresponden a los puntos
59, 74 y 75 etiquetados por el programa los cuales corresponden a 59 = F473 en el
Tratamiento 1 la extracción de las 13:10 para la proteínas Hsp16.9 con un SQ de 6048, 74 =
MOCARÍ en el tratamiento 1 en la extracción de las 13:10 para la proteína Hsp16.9 con un
SQ de 2078 y 75 = MOCARÍ en el tratamiento 1 en la extracción de las 15:10 en la proteína
Hsp16.9 con un SQ de 4999.
La gráfica de los residuos tipificados frente a cuantiles teóricos (de una distribución
gausiana), en una hipótesis de los modelos de regresión habituales una hipótesis es que los
residuos tienen distribución gausiana (normal). El gráfico cuantil-cuantil diagnostica el
cumplimiento de esa hipótesis. En el caso perfecto, todos los puntos estarían en línea recta.
Las desviaciones de la recta suelen apreciarse en los puntos de los extremos. Los puntos que
más se desvían de la hipótesis aparecen destacados con sendas etiquetas identificativas [104]
por lo cual los puntos que se representan en la desviación de los datos son los mismos de la
gráfica anterior 54, 74 y 75.
Por otra parte en la gráfica de escala-posición, que se define como la raíz de valor absoluto
de residuo frente a valores ajustados, cabe destacar que, en contraste con la primera gráfica,
en ésta se toma el valor absoluto, para comparar la magnitud del residuo independientemente
127
del sentido arriba/abajo; y se toma la raíz cuadrada para disminuir la asimetría, que suele
dificultar la interpretación. Por lo anterior, puede facilitar la diagnosis de la
homoscedasticidad. Sin embargo, puede dificultar la diagnosis de linealidad, precisamente
por las trasformaciones a que se someten los residuos [104].
Gráfica 41. Básica de Diagnostico. 1. Residuos Frente a Ajustados. 2. Residuos
tipificados frente a cuantiles teórico. 3. Escala-posición: raíz de valor absoluto de residuo
frente a valores ajustados. 4. Residuos tipificados frente a palancaje.
Por último la gráfica de residuos tipificados frente a palancaje, es una medida de la influencia
que tiene un punto en el cálculo de los coeficientes del modelo. El palancaje se basa en la
aportación del punto a las varianzas de las variables independientes. Por tal razón los puntos
a la derecha de la gráfica tienen gran palancaje. Tales puntos poseen una influencia notable
si el residuo correspondiente se separa mucho del cero; en concreto, se suele considerar muy
influyente si supera la distacia de Cook igual a 1 (que se corresponde con una de las líneas
rojas de la gráfica). Los puntos notables aparecen destacados con su etiqueta [104] que en
nuestro caso son los puntos 54, 74 y 75, cabe destacar en esta gráfica podemos concluir que
el gen que codifica a la proteína Hsp16.9 tiene gran expresión y hace que los datos en
contraste con los demás genes no se mantengan en una linealidad lo cual da a comprender
que presenta gran expresión de este gen en respuesta al estrés térmico.
La Gráfica de efectos principales (gráfica 42) se utiliza con el fin de ver cómo uno o más
factores categóricos influyen en la respuesta continua. Donde se observa la influencia de los
tratamientos en las distintas variedades de lo cual tenemos como resultado que la variedad
que más influencia presenta en la expresión de genes que codifica a proteínas de choque
térmico (Hsp) es la variedad F473 seguida de la variedad MOCARÍ y Lv 1645. En relación
a las proteínas observamos que la que mayor expresión presenta en todas las variedades es
Hsp16.9 seguida de Hsp26.7, Hsp18, Hsp90 y Hsp70.
128
La variedad F473 en el tratamiento control a 28 °C observamos una expresión media para los
genes Hsp90, Hsp70, Hsp26.7 y Hsp18, y para Hsp16.9 observamos una gran expresión. En
el tratamiento 1 a 35 °C se observa un aumento en la expresión de Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7
y Hsp70 mientras Hsp90 se mantiene. Entre los parámetros de la media del tratamiento
control. En el tratamiento 2 42 °C observamos que la expresión de estos genes disminuye
excepto el gen Hsp26.7 el cual aumenta con relación al tratamiento control y 1.
Gráfica 42. Gráfica de efectos. Relación entre las medias de Variedad, Tratamiento y
Gen.
La variedad MOCARÍ en el tratamiento control observamos una expresión media para los
genes Hsp90, Hsp70, Hsp26.7 y Hsp18, y para Hsp16.9 observamos una gran expresión. En
el tratamiento 1 se observa un aumento en la expresión de Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7 y Hsp70
mientras Hsp90 se mantiene. Entre los parámetros de la media del tratamiento control. En el
tratamiento 2 observamos que la expresión de estos genes disminuye excepto el gen Hsp26.7
el cual aumenta con relación al tratamiento control y 1 y el gen Hsp16.9 que mantiene su
expresión.
La variedad Lv 1645 en el tratamiento control observamos una expresión media para los
genes Hsp90, Hsp70, Hsp26.7 y Hsp18, y para Hsp16.9 observamos una gran expresión. En
el tratamiento 1 se observa un aumento no significativo en la expresión de Hsp16.9, Hsp18,
Hsp26.7 y Hsp70 mientras Hsp90 se mantiene. Entre los parámetros de la media del
tratamiento control. En el tratamiento 2 observamos que la expresión de estos genes
disminuye excepto el gen Hsp26.7 el cual aumenta con relación al tratamiento control y 1.
En conclusión el aumento de la expresión del gen Hsp16.9 se da en el tratamiento 1 a en las
variedades F473 y MOCARÍ mientras en Lv 1645 existe la sobre expresión pero no de
manera significativa. Con relación a Hsp 26.7 tiene una expresión mayor en los el tratamiento
2 en las tres variedades de estudio. El gen Hsp18 mantiene una expresión no significativa en
sus medias entre el tratamiento control, aumenta en el tratamiento 1 pero se mantiene en el
129
tratamiento 2 en las tres variedades y los genes Hsp70 y 90 presentan cambios no
significativos en la expresión a los diferentes tratamientos.
10.4. CORROBORACIÓN DE HIPÓTESIS
Según el análisis anterior obtenemos los resultados necesarios para determinar que el
planteamiento de cada una de las hipótesis. Con relación a la hipótesis de variedades
rechazamos la hipótesis nula (H0): “el estrés por alta temperatura no genera diferencias en la
expresión de genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18,
Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645
irradiadas con 60Co” y aceptamos la hipótesis alterna (H1): “el estrés por alta temperatura si
genera diferencias en la expresión de genes que codifican las proteínas de choque térmico
sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en las variedades Fedearroz 473,
Fedearroz Mocarí y Lv 1645 irradiadas con 60Co”. Con relación a las hipótesis planteadas
según el tratamiento determinamos que rechazamos la hipótesis nula (H0): las variedades
Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 no presentan diferencias significativas en la
expresión de genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18,
Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en los diferentes tratamientos (TC, T1 y T2) y aceptamos la
hipótesis alterna (H1): “las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 si
presentan diferencias significativas en la expresión de genes que codifican las proteínas de
choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en los diferentes
tratamientos (TC, T1 y T2)”.
130
11. CONCLUSIONES
Los tres genotipos F473, Mocarí Lv 1645 no presentan diferencias significativas en el
crecimiento de las plántulas durante las cuatro horas de exposición al estrés térmico por altas
temperaturas (28, 35 y 42°C).
Una dosis de 60 Gy de 60Co genera alteraciones físicas en las variedades Mocarí y Lv 1645,
en la primera se produce despigmentación conocido como maculata y en la segunda se
originan líneas blancas longitudinales y despigmentación en las puntas de las hojas conocido
como estriata.
La expresión de proteínas de choque térmico (Hsp) en los tres genotipos incrementa a medida
que aumenta la temperatura como mecanismo de protección de la plántula frente alteraciones
que se puedan originar a nivel bioquímico, fisiológico y morfológico que comprometan el
crecimiento, desarrollo y rendimiento del cultivo.
En los tres tratamientos de las tres variedades, los niveles de expresión más altos
corresponden a las proteínas de choque térmico de bajo peso molecular (sHsp) Hsp16.9,
Hsp26.7 y Hsp18, alcanzando valores de hasta 6000 copias.
Los niveles de expresión más bajos los presentan las proteínas de choque térmico de alto
peso molecular Hsp70 y Hsp90, aunque su expresión incrementa al aumentar la temperatura
sus valores no sobrepasan de manera significativa los niveles de la muestra estándar utilizada.
Aunque las expresiones más altas en cada una de las variedades corresponden a sHsp
(Hsp16.9, Hsp18, hsp26.7) y los más bajos a Hsp70 y Hsp90, se encuentran diferencias en
los niveles de expresión de los cinco genes entre las variedades y los tratamientos.
La variedad con los niveles de expresión más altos es Fedearroz 473, seguido de Mocarí y el
más bajo lo presenta Línea avanzada 1645.
La expresión más baja se generó en el TC, e incrementando en el T1 y T2 de acuerdo al gen
y el genotipo.
La expresión de estos genes está relacionada con la tolerancia a altas temperaturas, siendo
Fedearroz 473 tolerante, Mocarí resistente y Línea avanzada 1645 susceptible a altas
temperaturas.
Las variedades F473, Mocarí, Lv 1645 presentan un perfil proteico donde la intensidad de
las bandas cambia de una variedad a otra y de los momentos de extracción. Se logra observar
bandas cercanas a 90 kDa, 75kDa, 26 kDa y 18 kDa y 16 kDa, que pueden estar relacionadas
con los pesos moleculares de las proteínas de interés.
131
Las tres variedades F473, Mocarí y Lv1645 presentan un perfil proteico, en el tratamiento 1
y en el tratamiento 2, pero con una intensidad mayor en cada una de las bandas. La variedad
Mocarí presenta menor cantidad de proteínas totales con respecto a F473 y Lv1645.
En el TC, T1 y T2 se presenta la banda característica de 50 kDa con el ración al marcador de
peso donde la variedad Lv 1645 presenta mayor intensidad, seguido de F473 y siendo Mocarí
la que menor visibilidad presenta.
En las tres variedades se logran apreciar las bandas de interés, siendo de 90 kDa, 70 kDa, 26
kDa, 18 kDa y 16 kDa. La variedad F473 y Mocarí presentan la mayor cantidad de proteínas
en la extracción 2, al contrario de Lv 1645 que presenta una cantidad similar en las tres
extracciones.
132
12. RECOMENDACIONES
Se recomienda para próximos proyectos:
1. Escoger variedades que presenten una tasa de germinación alta, lo que facilite el
proceso de germinación e investigación.
2. Evaluar la expresión de los genes (sHsp; Hsp16.9, Hsp18 y Hsp26.7) en diferentes
estadios de crecimiento de Oryza sativa a 28 y 35°C.
3. Se recomienda hacer una evaluación de los genes (sHsp; Hsp16.9, Hsp18 y Hsp26.7)
en diferentes estadios de crecimiento de Oryza sativa a 28 y 35°C en campo, ya que
de esta manera se pueden obtener valores más precisos teniendo en cuenta las
variables no controladas en fase campo, como humedad, cambios de temperatura,
adaptación a las tierras, uso de fertilizantes y demás.
4. Se recomienda evaluar la expresión de los genes (sHsp; Hsp16.9, Hsp18 y Hsp26.7)
en variedades de arroz Colombiano sin irradiar para así determinar las diferencias que
se presentan a diferentes temperaturas.
5. Se recomiendo realizar un perfil proteico en 2 dimensiones para revisar con exactitud
la expresión de la proteína de interés.
133
13. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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14. ANEXOS
Anexo 1. Secuencias de cADN y Primer’s
Gen: Hsp16.9
Cebador Secuencias Tm %G/C Pb
Forward 5’-TACCACCGCTGTGTTGAAAG-3’ 63 50 104
144
Reverse 3’-TCTCGTGACTCTCATCCTTATCC-
5’ 68 47.8
Secuencia CDS: >LOC_Os01g04270.1
ATGGCATCCGCCGCTGCGCCAGGGAGACCCGGCCTCTGCTGCGTCGTTGTGCTA
GTGGCCACCACAATGCTGGGAGACGTGCCCGCCACTGCATGGCCACCGTGCTG
CCGCCATGTCGAGGAGCCACATCTACCACCGCTGTGTTGAAAGATGGGAGAGA
GGTGCGGAGAGAGAAGTGCAGAGGGAAGGAAACAAGGCGGGAGGACAAAGA
GGATAAGGATGAGAGTCACGAGACTTAA
Gen: Hsp18
Cebador Secuencias Tm %G/C Pb
Forward 5’- AGGAGGAGTCGTGCAAGTA-3’ 62 52.8 106
Reverse 3’-CGATGGTCTTGGGCTTCTT-5’ 62 61.1
Secuencia CDS: >LOC_Os01g08860.1
ATGGAGAGCGCCATGTTCGGGCTGGAGACGCCGCTGATGACGGCGCTGCAGCA
CCTGCTCGACATCCCCGACGGCGAGGGCGGCGCCGCCGGGAAGCAGGGCGCG
ACCGGTGGCCCGACGCGTGCGTACGTGCGCGACGCCCGCGCCATGGCGGCGAC
CCCCGCCGACGTGAAGGATCTGCCCGGGGCGTACGCGTTCGTGGTGGACATGC
CTGGGCTCAAGTCCTCCGACATCAAGGTGCAGGTGGAGGAGGAGAGGCTGCTG
GTGATCAGCGGGGAGCGGCGGCGCGGCGGCGGGGAGGAGGAGAAGGAGGAGT
CGTGCAAGTACCTGCGGATGGAGCGGCGGATGGGCAAGTTCATGCGCAAGTTC
GTGCTCCCCGACAACGCCGACGTCGACAAGATCTCCGCCGTGTGCCAGGACGG
CGTGCTCACCGTCACCGTCGAGAAGCTCCCGCCGCCGGAGCCCAAGAAGCCCA
AGACCATCGAGGTCAAGGTCGCGTGA
Gen: Hsp26.7
Cebador Secuencias Tm %G/C Pb
Forward 5’-GAGGATGCGGTTCGACAT-3’ 62 55.6 105
Reverse 3’-TCGCCCTCCTCCTTCTT-5’ 62 58.8
Secuencia CDS: >LOC_Os03g14180.1
ATGGCTGCTCCATTCGCTCTCGTCAGCCGTGTCTCGCCAGCGGCGCGCCTCCCC
ATCCGCGCCGCCTGGAGGAGGGCGAGGCCGACGGTCGGGCTCCCGTCCTCGGG
GAGGGCCCGCCAGCTCGCCGTGGCCTCCGCGGCGCAGGAGAACAGGGACAAC
ACCGCCGTCGATGTCCACGTCAACCAGGACGGCGGGAACCAGCAGGGGAACG
145
CCGTGCAGCGCCGCCCGCGCCGCTCGTCGGCGTTGGACGGCATCTCCCCGTTCG
GCCTCGTGGACCCGATGTCGCCGATGCGGACGATGCGGCAGATGCTGGACACG
ATGGACCGGATTTTCGACGACGTCGCGCTGGGGTTCCCCGCCACGCCGCGGAG
GTCGCTGGCGACGGGGGAGGTGCGGATGCCGTGGGACGTCATGGAGGACGAC
AAGGAGGTGAGGATGCGGTTCGACATGCCGGGCCTGTCGCGGGAGGAGGTGA
AGGTGATGGTGGAGGACGACGCGCTCGTCACCGCGGGGAGCACAAGAAGGAG
GAGGGCGAGGGCGCGGAGGGCTCCGGCGACGGGTGGTGGAAGGAGCGCAGCG
TGAGCTCCTACGACATGCGGCTCGCGCTCCCCGACGAGTGCGACAAGAGCAAG
GTCCGCGCCGAGCTCAAGAGGCGTGCTGCTCGTCACCGTGCCCAAGACGGAGG
TGGAGCGCAAGGTCATCGACGTGCAGGTCCAGTAG
Gen: Hsp70
Cebador Secuencias Tm %G/C Pb
Forward 5’-CGTCTCATTGGCAGGAGGTT-3’ 57.0 55 446
Reverse 3’-TCTTCACCACCAAGATGGGT-5’ 55.6 50
Secuencia CDS: >X67711.2.
CCAAGCGTCTCATTGGCAGGAGGTTTAGCGATGCTTCTGTTCAGAGTGACATTA
AGCTCTGGCCCTTCAAGGTGATTGCTGGACCTGGTGACAAGCCTATGATTGTTG
TCCAGTACAAGGGTGAGGAGAAGCAGTTTGCTGCCGAAGAGATCTCCTCCATG
GTCCTCATCAAGATGCGTGAGATTGCTGAGGCCTACCTTGGCACCACCATCAAG
AATGCCGTTGTCACTGTTCCTGCCTACTTCAATGACTCCCAGAGGCAGGCCACC
AAGGATGCTGGAGTGATTGCTGGTCTCAATGTCATGCGCATCATCAACGAGCC
AACTGCTGCCGCTATTGCCTATGGTCTTGACAAGAAGGCCACAGCGTTGGTGA
GAAGAATGTCCTCATCTTTGACCTTGGAGGTGGTACCTTTGATGTTTCCCTCCTT
ACCATTGAGGAGGGTATCTTTGAGGTCAAGGCCACAGCTGGTGACACCCATCT
TGGTGGTGAAGATTTTGACAACCGCATGGTCAACCACTTTGTGCAAGAATTCAA
GAGGAAGAACAAGAAGGATATCACTGGCAACCCCAGGGCTCTCAGGAGGTTG
AGGACAGCTTGTGAGAGGGCGAAGAGGACCCTGTCCTCCACTGCCCAGACCAC
CATTGAGATCGATTCCTTGTATGAGGGCATCGATTTCTACTCAACCATCACCCG
TGCCAGGTTTGAGGAGCTCAACATGGATCTCTTCAGGAAGTGTATGGAGCCTGT
GGAGAAGTGCCTCAGGGATGCTAAGATGGACAAGAGCTCTGTTCATGATGTTG
TTCTTGTTGGTGGCTCCACTAGGATCCCGAGGGTGCAGCAGCTCCTGCAGGATT
TCTTCAACGGCAAGGAGCTTTGCAAGAACATCAACCCAGATGAGGCTGTTGCT
TATGGTGCTGCTGTCCAGGCTGCCATCTTGAGTGGTGAGGGCAACGAGAAGGT
CCAGGACCTCCTCCTGTTGGATGTTACCCCTCTTTCTCTCGGTTTGGAGACTGCT
GGTGGTGTCATGACCGTCTTGATCCCAAGGAACACCACCATTCCCACCAAGAA
GGAGCAGGTCTTCTCCACCTACTCTGACAACCAGCCTGGTGTGCTCATCCAGGT
TTATGAGGGTGAGAGGACCAGGACACGTGACAACAACCTGCTGGGCAAGTTTG
AGCTCTCTGGAATCCCTCCTGCTCCCAGGGGTGTTCCACAGATCACTGTTTGCT
146
TCGACATTGATGCCAATGGTATCCTGAACGTGTCTGCTGAGGACAAGACCACC
GGGCAGAAGAACAAGATCACCATCACCAACGACAAGGGCAGGCTCAGCAAGG
AGGAGATTGAGAAGATGGTCCAGGGGGCCGAGAAGTACAAGTCAGAGGATGA
GGAGCACAAGAAGAAGGTGGAGTCCAAGAACGCGCTGGAGAACTACGCCTAC
AACATGCGCAACACCATCAAGGATGAGAAGATCGCCTCGAAGCTCCCGGCAGC
GGACAAGAAGAAGATCGAGGATGCCATCGACCAGGCCACCAGTGGCTGGACG
GCAACCAGCTCGCTGAGGCTGATGAGTTCGATGACAAGATGAAGGAGCTGGAG
GGCATCTGCAACCCCATCATCGCCAAGATGTACCAGGGCGCTGGCGCGGACAT
GGCCGGCGGCATGGACGAGGACGATGCTCCCCCGGCTGGCGGCAGCGGTGCTG
GCCCCAAGATCGAGGAGGTCGACTAAGCGCCAAATTTGGTTAAAAACTTGGGC
ATGAGTTCGAAACCTACAGATTTGGGGCTGAACTTTGGTTAGGTGATCCGCGCT
TCAAGTTATCTTATTGCATTATCAGTGTCTCTTTATTAGTTGTGTTAAAAACTTG
GGGATTATGTGGTGCTATGGTACCTTTTGGTCTGTTTGGGCAGTCTATTTGAAG
AACTTCGTTGGGAGCTCTATTGATCTC
Gen: Hsp90
Cebador Secuencias Tm %G/C Pb
Forward 5′-CACTCTACAGCAACAAGGAC-3′ 53.1 50 459
Reverse 5′-CACGTACTCCT-TGGCTTCAT-3′ 54.4 50
Secuencia CDS: >AB037681
ATGCGCAAGTGGGCGCTCTCCTCCGCGCTCCTCCTCCTCCTCCTCACCACACTC
CCCGATCCAGCTAAGAAGCTCCAAGTCAATGCTGATGACAGCACTGATGAGTT
AGTTGATCCGCCGAAGGTAGAGGAGAAGATTGGTGGTGTTCCCCATGGCCTGT
CCACGGACTCTGAGGTTGTTCAGAGGGAGGCTGAGTCAATCTCGAGGAAGACC
CTCAGGAGCTCAGCGGAGAAATTTGAGTTCCAGGCTGAGGTGTCCAGACTCAT
GGACATCATCATCAACTCACTCTACAGCAACAAGGACATTTTCCTGAGGGAGC
TCATCTCCAATGCTTCTGATGCTTTGGACAAGATTAGGTTCCTGGTCTCACTGAT
AAGGAGGTTTTGGGCGAAGGTGACACTGCTAAGCTTGAAATCCAGATTAAGCT
GGATAAGGAGAAGAAGATTCTCTCCATTCGGGATAGGGGTATTGGTATGACCA
AGGAAGATCTCATTAAGAACCTTGGGACCATTGCCAAATCTGGAACTTCAGCTT
TTGTGGAAAAGGTGCAGACTGGGGGTGACCTCAATCTCATTGGGCAATTGGTG
TTGGTTTCTATTCAGTATACTTGGTTGCTGACTATGTTGAAGTGATCAGCAAGC
ACAATGACGACAAACGCATGTCTGGGAGTCCAAAGCTGATGGATCATTCGCTA
TCTCTGAGGATACATGGAATGAACCCCTGGGCCGTGGAACTGAAATAAGACTG
CACCTCCGAGATGAAGCCAAGGAGTACGTGGAAGAAGACAAGCTAAAGGATT
TGGTGAAGAAGTACTCTGAGTTCATCAATTTCCCCATTTACTTGTGGGCAACCA
AGGAGGTTGATGTGGAAGTGCCGCTGATGAGGATGAGTCAAGTGAATCAAGTG
147
AAGAAGAGGAATCATCCCCTGAGTCTACAGAGGAAGAAGAGACAGAAGAGGG
TGAAGAGAAGAAGCCCAAGACAAAGACAGTAAAGGAAACCACTACTGAGTGG
GAGCTTCTGAATGATGTGAAGGCTATATGGCTTCGTAGCCCTAAGGAGGTTACT
GAAGAAGAATACACAAAGTTTTACCACTCACTTGCTAAGGACTTTGGTGATGA
CAAGCCCTTGTCTTGGAGCCACTTCACTGCTGAGGGAGATGTTGAGTTCAAAGC
TTTGCTCTTTGTTCCTCCCAAGGCTCCACATGATCTCTATGAGAGTTACTACAAC
TCTAACAAGTCAAACCTTAAGTTGTATGTTAGAAGGGTTTCCATCTCTGATGAA
TTTGATGAGCTTCTTCCGAAGTATCTCAGCTTTTGAAGGGTCTCGTCGACTCGG
ACACATTGCCTCTCAATGTATCACGAGAAATGCTCCAACAACATAGTAGCCTG
AAGACCATCAAGAAGAAACTAATCCGCAAAGCTCTTGACATGATTAGAAAACT
TGCTGAGGAAGATCCTGATAGTACAGCAACAAAGATAAGACAGATGAAGAAA
AAAGTGCAATGGAGGAGAAAAAGGGCCAGTATGCCAAGTTCTGGAATGAGTTT
GGAAAATCAGTCAAGTTGGGCATCATTGAAGACGCAACTAACAGGAACCGTCT
TGCAAAGCTTCTGAGATTTGAAAGTACCAAGTCGGAAGGCAAACTTGCCTCTCT
TGATGAGTACATTTCAAGGATGAAGCAGGGCAGAAGGACATCTTTTACATTAC
CGGAAGCAGCAAGGAACAATTAGAGAAATCACCGTTCCTTGAGAGGCTAACCA
AAAAGAACTACGAGGTTATCTACTTCACTGACCCTGTTGACGAGTACTTGATGC
AATACCTCATGGACTACGAGGACAAGAAGTTCCAGAACGTCTCCAAGGAGGGT
CTCAAACTCGGCAAGGACTCTAAGCTCAAGGACCTCAAGGAGTCCTTCAAGGA
GCTGACCGACTGGTGGAAGAAGGCTCTTGACACCGAGAGCGTGGACTCGGTGA
GATCAGCAACCGGCTGAGCGACACCCCCTGCGTGGTGGTGACATCCAAGTACG
GGTGGAGCGCCAACATGGAGAAGATCATGCAGTCACAGACCCTCTCGGATGCC
AGCAAGCGGCGTACATGCGCGGCAAGAGGGTACTCGAGATCAACCCCAGGCA
CCCCATCATCAAGGAACTCCGTGACAAGGTCGCCCAGGACAGCGAGAGCGAGA
GCTTGAAGCAGACGGCGAAGCTGGTGTACCAGACGGCCCTCATGGAGAGCGGC
TTCAACCTCCCTGATCCCAAGGACTTCGCCTTCAGCATCTACAGGTCGGTGCAG
AAGAGCCTTGACCTGAGCCCCGACGCGGCCGTGGAAGAGGAAGAGGAGGTCG
AGGAGGCCGAGGTTGAAGAGAAGGAATCATCCAACATCAAGGAGGAGGCGGA
GCCGTCGTCGTATGATAAGGACGAGCTGTAG
148
Anexo 2. Protocolo de extracción de ADN en plantas
149
150
151
Anexo 3. Cuantificación de ADN
152
Anexo 4. Kit PCR
153
Anexo 5. Extracción de ARN en plantas
154
Anexo 6. Kit qRT-PCR
155
Anexo 7. Tinción con Azul de coomasie.
Retirar los vidrios de la cámara
Colocar en 100 mL de solución fijadora y con cuidado retirar los vidrios
Dejar el gel 30 minutos en la solución con agitación constante y conservar.
Descartar la solución fijadora y agregar 100 mL de solución tinción
Dejar el gel toda la noche bien tapado
Retirar la solución tinción
Agregar 100 mL de agua destilada y colocar en agitación constante por 30 minutos
Retirar el agua
Agregar ácido acético al 30% para desteñir por 30 minutos en agitación constante. Realizar
hasta que no se observe coloración, ni ruido en el gel.
Retirar el ácido acético y agregar 100 mL de solución por 15 minutos
Descartar y agregar solución secante por 10 minutos.
156
Anexo 8. Cuantificación extracciones de ARN
Anexo 9. Tabla Análisis Estadístico
"VARIEDAD" "TRATAMIENTO" "EXTRACCION" "GEN" "SQ"
"1" "F473" "TC" "11:10" "HSP90" 112.719745617551
"2" "F473" "TC" "13:10" "HSP90" 150.660706618674
"3" "F473" "TC" "15:10" "HSP90" 48.0839348449729
"4" "F473" "TC" "11:10" "HSP70" 143.879857825585
"5" "F473" "TC" "13:10" "HSP70" 158.854674859778
"6" "F473" "TC" "15:10" "HSP70" 41.5910610494022
"7" "F473" "TC" "11:10" "HSP26.7" 180.301774085957
"8" "F473" "TC" "13:10" "HSP26.7" 188.36490894898
"9" "F473" "TC" "15:10" "HSP26.7" 92.4698173938223
"10" "F473" "TC" "11:10" "HSP18" 210.377843976648
"11" "F473" "TC" "13:10" "HSP18" 218.2729911843
"12" "F473" "TC" "15:10" "HSP18" 79.7994687267977
"13" "F473" "TC" "11:10" "HSP16.9" 2082
"14" "F473" "TC" "13:10" "HSP16.9" 1914
"15" "F473" "TC" "15:10" "HSP16.9" 1129
"16" "MOCARÍ" "TC" "11:10" "HSP90" 101.62486928707
"17" "MOCARÍ" "TC" "13:10" "HSP90" 153.461698279929
"18" "MOCARÍ" "TC" "15:10" "HSP90" 211.348903983665
"19" "MOCARÍ" "TC" "11:10" "HSP70" 112.201845430196
157
"20" "MOCARÍ" "TC" "13:10" "HSP70" 144.543977074593
"21" "MOCARÍ" "TC" "15:10" "HSP70" 245.470891568503
"22" "MOCARÍ" "TC" "11:10" "HSP26.7" 152.756605823807
"23" "MOCARÍ" "TC" "13:10" "HSP26.7" 250.610925303211
"24" "MOCARÍ" "TC" "15:10" "HSP26.7" 247.742205763329
"25" "MOCARÍ" "TC" "11:10" "HSP18" 180.717412601093
"26" "MOCARÍ" "TC" "13:10" "HSP18" 260.015956316527
"27" "MOCARÍ" "TC" "15:10" "HSP18" 339.625272590409
"28" "MOCARÍ" "TC" "11:10" "HSP16.9" 1934
"29" "MOCARÍ" "TC" "13:10" "HSP16.9" 2683
"30" "MOCARÍ" "TC" "15:10" "HSP16.9" 2811
"31" "LV1645" "TC" "11:10" "HSP90" 208.929613085404
"32" "LV1645" "TC" "13:10" "HSP90" 53.8269782516289
"33" "LV1645" "TC" "15:10" "HSP90" 147.910838816821
"34" "LV1645" "TC" "11:10" "HSP70" 146.217717445672
"35" "LV1645" "TC" "13:10" "HSP70" 36.5594791613125
"36" "LV1645" "TC" "15:10" "HSP70" 187.499450806742
"37" "LV1645" "TC" "11:10" "HSP26.7" 85.310011401759
"38" "LV1645" "TC" "13:10" "HSP26.7" 36.3915036127207
"39" "LV1645" "TC" "15:10" "HSP26.7" 115.877735615513
"40" "LV1645" "TC" "11:10" "HSP18" 221.819641980022
"41" "LV1645" "TC" "13:10" "HSP18" 127.643880881134
"42" "LV1645" "TC" "15:10" "HSP18" 155.955250282695
"43" "LV1645" "TC" "11:10" "HSP16.9" 2000
"44" "LV1645" "TC" "13:10" "HSP16.9" 1263
"45" "LV1645" "TC" "15:10" "HSP16.9" 1554
"46" "F473" "T1" "11:10" "HSP90" 202.301917867827
"47" "F473" "T1" "13:10" "HSP90" 325.087297385435
"48" "F473" "T1" "15:10" "HSP90" 211.348903983665
"49" "F473" "T1" "11:10" "HSP70" 426.579518801593
"50" "F473" "T1" "13:10" "HSP70" 479.73344863669
"51" "F473" "T1" "15:10" "HSP70" 357.272838151929
"52" "F473" "T1" "11:10" "HSP26.7" 508.159442560561
"53" "F473" "T1" "13:10" "HSP26.7" 803.526122185617
"54" "F473" "T1" "15:10" "HSP26.7" 592.92532458
"55" "F473" "T1" "11:10" "HSP18" 456.036915951296
"56" "F473" "T1" "13:10" "HSP18" 749.894209332457
"57" "F473" "T1" "15:10" "HSP18" 403.645392967605
"58" "F473" "T1" "11:10" "HSP16.9" 3654
"59" "F473" "T1" "13:10" "HSP16.9" 6048
"60" "F473" "T1" "15:10" "HSP16.9" 3256
"61" "MOCARÍ" "T1" "11:10" "HSP90" 214.289060112006
"62" "MOCARÍ" "T1" "13:10" "HSP90" 56.2341325190349
"63" "MOCARÍ" "T1" "15:10" "HSP90" 207.491351745491
"64" "MOCARÍ" "T1" "11:10" "HSP70" 388.150365990648
"65" "MOCARÍ" "T1" "13:10" "HSP70" 116.680961706096
"66" "MOCARÍ" "T1" "15:10" "HSP70" 426.579518801593
"67" "MOCARÍ" "T1" "11:10" "HSP26.7" 753.355563733717
158
"68" "MOCARÍ" "T1" "13:10" "HSP26.7" 297.851642942919
"69" "MOCARÍ" "T1" "15:10" "HSP26.7" 685.488226452662
"70" "MOCARÍ" "T1" "11:10" "HSP18" 602.559586074358
"71" "MOCARÍ" "T1" "13:10" "HSP18" 155.596563160508
"72" "MOCARÍ" "T1" "15:10" "HSP18" 571.478636671868
"73" "MOCARÍ" "T1" "11:10" "HSP16.9" 3721
"74" "MOCARÍ" "T1" "13:10" "HSP16.9" 2078
"75" "MOCARÍ" "T1" "15:10" "HSP16.9" 4992
"76" "LV1645" "T1" "11:10" "HSP90" 239.331575640539
"77" "LV1645" "T1" "13:10" "HSP90" 60.8135001278718
"78" "LV1645" "T1" "15:10" "HSP90" 81.6582371358592
"79" "LV1645" "T1" "11:10" "HSP70" 233.883723865936
"80" "LV1645" "T1" "13:10" "HSP70" 57.4116462207328
"81" "LV1645" "T1" "15:10" "HSP70" 90.3649473722302
"82" "LV1645" "T1" "11:10" "HSP26.7" 277.971326775929
"83" "LV1645" "T1" "13:10" "HSP26.7" 79.2501330480472
"84" "LV1645" "T1" "15:10" "HSP26.7" 53.4564359396972
"85" "LV1645" "T1" "11:10" "HSP18" 242.102904673618
"86" "LV1645" "T1" "13:10" "HSP18" 78.7045789695099
"87" "LV1645" "T1" "15:10" "HSP18" 101.15794542599
"88" "LV1645" "T1" "11:10" "HSP16.9" 2109
"89" "LV1645" "T1" "13:10" "HSP16.9" 538.9
"90" "LV1645" "T1" "15:10" "HSP16.9" 709.3
"91" "F473" "T2" "11:10" "HSP90" 150.314196609002
"92" "F473" "T2" "13:10" "HSP90" 217.770977235316
"93" "F473" "T2" "15:10" "HSP90" 201.372424986239
"94" "F473" "T2" "11:10" "HSP70" 274.78941531024
"95" "F473" "T2" "13:10" "HSP70" 368.128973642531
"96" "F473" "T2" "15:10" "HSP70" 292.415237784334
"97" "F473" "T2" "11:10" "HSP26.7" 839.459986519398
"98" "F473" "T2" "13:10" "HSP26.7" 769.13044028661
"99" "F473" "T2" "15:10" "HSP26.7" 638.263486190549
"100" "F473" "T2" "11:10" "HSP18" 155.955250282695
"101" "F473" "T2" "13:10" "HSP18" 293.089324525032
"102" "F473" "T2" "15:10" "HSP18" 327.340694878838
"103" "F473" "T2" "11:10" "HSP16.9" 3087
"104" "F473" "T2" "13:10" "HSP16.9" 4635
"105" "F473" "T2" "15:10" "HSP16.9" 3010
"106" "MOCARÍ" "T2" "11:10" "HSP90" 145.545908058197
"107" "MOCARÍ" "T2" "13:10" "HSP90" 34.5143739335856
"108" "MOCARÍ" "T2" "15:10" "HSP90" 90.9913272632252
"109" "MOCARÍ" "T2" "11:10" "HSP70" 338.844156139202
"110" "MOCARÍ" "T2" "13:10" "HSP70" 302.691342810131
"111" "MOCARÍ" "T2" "15:10" "HSP70" 323.593656929628
"112" "MOCARÍ" "T2" "11:10" "HSP26.7" 922.571427154763
"113" "MOCARÍ" "T2" "13:10" "HSP26.7" 533.334895487621
"114" "MOCARÍ" "T2" "15:10" "HSP26.7" 783.429642766213
"115" "MOCARÍ" "T2" "11:10" "HSP18" 299.226463660819
159
"116" "MOCARÍ" "T2" "13:10" "HSP18" 542.000890401624
"117" "MOCARÍ" "T2" "15:10" "HSP18" 375.837404288445
"118" "MOCARÍ" "T2" "11:10" "HSP16.9" 2272
"119" "MOCARÍ" "T2" "13:10" "HSP16.9" 3796
"120" "MOCARÍ" "T2" "15:10" "HSP16.9" 4461
"121" "LV1645" "T2" "11:10" "HSP90" 208.449088309729
"122" "LV1645" "T2" "13:10" "HSP90" 14.5545908058197
"123" "LV1645" "T2" "15:10" "HSP90" 175.388050184176
"124" "LV1645" "T2" "11:10" "HSP70" 193.642196394661
"125" "LV1645" "T2" "13:10" "HSP70" 104.71285480509
"126" "LV1645" "T2" "15:10" "HSP70" 220.292646305346
"127" "LV1645" "T2" "11:10" "HSP26.7" 444.631267469109
"128" "LV1645" "T2" "13:10" "HSP26.7" 931.107875467831
"129" "LV1645" "T2" "15:10" "HSP26.7" 387.257644921617
"130" "LV1645" "T2" "11:10" "HSP18" 143.879857825585
"131" "LV1645" "T2" "13:10" "HSP18" 498.884487460012
"132" "LV1645" "T2" "15:10" "HSP18" 0
"133" "LV1645" "T2" "11:10" "HSP16.9" 1930
"134" "LV1645" "T2" "13:10" "HSP16.9" 3808
"135" "LV1645" "T2" "15:10" "HSP16.9" 2650