Expresión de genes implicados en el proceso de lipogénesis en Elaeis guineensis Jacq.y el híbrido OxG (Elaeis oleifera x Elaeis guineensis).

Carmenza Montoya1, María Camila Rodriguez Cruz1, Teresa Cuellar2, Edison Daza1, Iván M Ayala1, Norbert Billotte2, Hernán Mauricio Romero1,3.1. Programa de biología y mejoramiento de la palma de aceite – CENIPALMA. 2. Centro de Cooperación Internacional en Investigación Agronómica para el Desarrollo – CIRAD. 3.

Departamento de biología. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, Colombia. *E- mail: hromero@cenipalma.org

INTRODUCCIÓN

En el comercio de semillas oleaginosas, el aceite de palma se destaca porderivarse de un cultivo de naturaleza perenne, con la mayor producción detonelada por hectárea y una gran versatilidad para usos industriales y alimenticios.

Ahora, ¿es posible mejorar este escenario? ¿es posible diversificar la oferta apartir del recurso genético que reposa en la especie Elaeis guineensis Jacq? Aestas inquietudes una parte de las respuestas las ofrece el mejoramiento vegetal yla biotecnología, a través del estudio detallado de la cascada bioquímica,implicada en el proceso de formación de los diferentes ácidos grasos, y delensamblaje de cada molécula de triglicérido, es decir, la base de la composiciónquímica del aceite vegetal.

Detrás del proceso bioquímico están los genes que regulan y determinan losporcentajes finales en composición de grasas saturadas e insaturadas. Siendo así,el entendimiento de las diferencias de expresión de los genes claves en estas rutasmetabólicas marcarán las pautas para procesos de selección temprana encultivares de E. guineensis y del híbrido OxG. En este sentido, una gran ventajapara el desarrollo de metodologías de selección asistida por marcadores es que lacomposición química del aceite es una característica con alta heredabilidad y muypoco influenciada por el medio ambiente.

El objetivo de este trabajo es presentar el análisis de expresión de genesimplicados en el proceso de lipogénesis en E. guineensis y el híbrido OxG (Elaeisoleifera x Elaeis guineensis), trabajo desarrollado dentro del proyectocolaborativo OPGP-B (Oil Palm Genome Project, parte B), coordinado por elCIRAD (Francia), Neiker-Tecnalia (España) con la participación de CENIPALMA yempresas palmicultoras de Malasia e Indonesia.

METODOLOGÍA

1) Material vegetal: Ocho palmas E.guineensis de la colección de Angolade CENIPALMA y seis híbridos OxG(Coarí x La Mé).

2) Muestreo de frutos: Colecta de espigas en cinco (5)etapas de desarrollo del racimo: 60, 90, 120, 150 y 180días después de la polinización (ddp). 3) Conservación de tejido:

Conservación del tejido del mesocarpioen RNAlater® a -20°C para posteriorextracción de ARN y estudio deexpresión de genes.

4) Selección de genes: Síntesis decebadores para 13 genes claves enel estudio de los procesos delipogénesis en el género Elaeis, yareportados en literatura. Figuratomada de Yeap et al., (2017) (1).

6) Análisis estadístico de la expresión de genes entre especies y tiempos de desarrollo: Paraestimar la expresión relativa de cada gen se utilizó el método 2−ΔCt (3). Para comparar losresultados entre los tiempos de desarrollo entre especies, se utilizó la prueba no paramétrica U deMann Whitney y se consideró una diferencia estadísticamente significativa con un valor de p <0,05.Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para determinar si había diferencias estadísticamentesignificativas para el nivel de expresión génica entre dos o más etapas de desarrollo al interior decada especie.

RESULTADOS

Se obtuvo una amplificación exitosa en diez de los genes seleccionados y se muestran losresultados para cuatro de ellos (Figura 6 a 9). Los resultados de PCR en tiempo realmostraron que los frutos de E. guineensis de la colección silvestre de Angola deCENIPALMA presentaron una sobreexpresión en ocho de los diez genes, en comparacióncon los frutos del híbrido OxG.

Las tendencias de expresión de los genes fueron bastante similares para E. guineensis yel híbrido, pero se observan diferencias estadísticamente significativas en algunas etapasdel desarrollo del fruto. Sin embargo, E. guineensis mostró mayores diferencias a nivelestadístico entre sus etapas de desarrollo (resultados no mostrados).

Figura 6. Expresión relativa para el gen WRINKLED1 (WRI1) en tejido de mesocarpiopara E. guineensis e híbridos OxG. Cebadores reportados por Guerin et al., (2016)

Figura 8. Expresión relativa para el gen EgNF-YC2 en tejido de mesocarpio para E. guineensis e híbridos OxG. Cebadores reportados por Yeap et al., (2017)

Figura 7. Expresión relativa para el gen EgNF-YC2 en tejido de mesocarpio para E. guineensis e híbridos OxG. Cebadores reportados por Yeap et al., (2017)

Figura 9. Expresión relativa para el gen β-CT (ACCase) en tejido de mesocarpio para E. guineensis e híbridos OxG. Cebadores reportados por Montoya et al., (2013)

BIBLIOGRAFIA1. Yeap, W. C. et al. WRI1-1, ABI5, NF-YA3 and NF-YC2 increase oil biosynthesis in coordination with hormonal signaling during fruit development in oil palm. Plant J. 91, 97–113 (2017).2. Montoya, C. Etude du déterminisme génétique de la composition en acides gras de l’huile de palme du genre Elaeis (E. guineensis Jacq. et E. oleifera (H.B.K.) Cortés), par cartographie génétique et analysedifférentielle de gènes candidats. (2013).3. Schmittgen, T. D. & Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nat Protoc 3, 1101–1108 (2008).4. Baud, S. & Lepiniec, L. Regulation of de novo fatty acid synthesis in maturing oilseeds of Arabidopsis. Plant Physiol Biochem 47, 448–455 (2009).5. Tranbarger, T. J. et al. Regulatory mechanisms underlying oil palm fruit mesocarp maturation, ripening, and functional specialization in lipid and carotenoid metabolism. Plant Physiol 156, 564–584 (2011).6. Bourgis, F. et al. Comparative transcriptome and metabolite analysis of oil palm and date palm mesocarp that differ dramatically in carbon partitioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12527–32 (2011).7. Dussert, S. et al. Comparative transcriptome analysis of three oil palm fruit and seed tissues that differ in oil content and fatty acid composition. Plant Physiol. 162, 1337–58 (2013).8. Sasaki, Y. & Nagano, Y. Plant acetyl-CoA carboxylase: structure, biosynthesis, regulation, and gene manipulation for plant breeding. Biosci Biotechnol Biochem 68, 1175–1184 (2004).9. Guerin, C. et al. Gene coexpression network analysis of oil biosynthesis in an interspecific backcross of oil palm. Plant J. 87, 423–441 (2016).

DISCUSIÓNLos altos niveles de expresión de E. guineensis para la mayoría de los genes podríaexplicarse a través del porcentaje de aceite en el mesocarpio seco (datos no mostrados). Esasí como las muestras de E. guineensis utilizadas tienen una media de 78% mientras quelas muestras de OxG (Coarí x La Mé) tienen una media de 72%.

El gen WRI1 (Fig 6), que codifica para un factor de transcripción, se ha identificado comopromotor del flujo de carbono y su conversión en aceite durante la maduración de lasemilla, activando directamente los genes involucrados en la síntesis de ácidos grasos ycontrolando los genes para el ensamblaje y almacenamiento de triglicéridos (4). En palmade aceite se demostró que este gen se transcribe masivamente en el mesocarpio al iniciode la acumulación de aceite (5,6) y se han identificado tres genes parálogos de los cualesEgWRI1-1 y EgWRI1-2 se transcriben masivamente durante la deposición de aceite en elmesocarpio y el endospermo, respectivamente (7).

Este resultado confirma el mayor nivel de expresión de WRI1 en E. guineensis en lasprimeras etapas de desarrollo, principalmente por el pico de expresión a los 120 ddp (Fig6), periodo en el que arranca la maquinaria de síntesis de ácidos grasos (5).

Para E. guineensis fueron mayores los niveles de expresión de las cuatro subunidades de laenzima Acetil-CoA Carboxilasa (ACCase) (Fig 9) la cual es clave en la biosíntesis de ácidosgrasos y es considerada factor limitante de todo el proceso de lipogénesis (8).

La sobreexpresión de factores de transcripción como el EgNF-YC2 y el EgWRKY40 (Fig 7 y 8)en E. guineensis era predecible por su papel, ya reportado, en el aumento de la síntesis deaceite y regulación directa de la transcripción de genes involucrados en la lipogénesis deaceite en el mesocarpio (1,9) . Posiblemente, como resultado de un mayor proceso demejoramiento en comparación con los cultivares híbridos OxG.

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVASSe considera que la especie E. guineensis es un caso notable en el proceso de lipogénesisde aceite y que el éxito radica en los niveles de expresión de algunos genes en momentosmuy precisos de la formación del fruto.

Este estudio confirma información existente sobre expresión génica y redes deseñalización hormonal relevantes para la acumulación de aceite en el fruto y por primeravez, se genera información para el híbrido OxG.

Estos resultados son la base para el desarrollo de protocolos de laboratorio quepermitirán identificar y validar genes de forma rutinaria, y de esta manera, seleccionarpalmas promisorias para la producción de alto contenido de aceite en estadiostempranos. Además, se abren las puertas para futuros desarrollos en ingeniería genéticaque apunten a la generación de cultivares con proporciones específicas de ácidos grasos yde contenido de aceite.

AGRADECIMIENTOSLos autores agradecen a los socios del proyecto OPGP-B por permitir publicar estos resultados. Alfondo de Fomento Palmero (FFP) que financia la investigación de CENIPALMA. A los auxiliares decampo: José Antonio Guerrero y José Alberto Agamez quienes realizaron la colecta de frutos encampo. A los auxiliares del laboratorio de Biología Molecular: Jairo Enrique Tafur, Diana PatriciaRamos y Sandra Vidal quienes colaboraron con el registro y procesamiento de las muestras.

5) Extracción de ARN y amplificación de genes mediante PCR en tiempo real: Cuantificación delARN obtenido y conversión a cDNA. Visualización de la expresión relativa de cada gen por tiempode desarrollo y por especie. Se utilizó el gen de referencia TUA5 (Tubulina) (2).