UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE GENES DE

Mycobacterium tuberculosis DURANTE

LA INFECCIÓN A MACRÓFAGOS

Por

HUGO BRÍGIDO BARRIOS GARCÍA

Como requisito Para obtener el Grado de

DOCTOR EN CIENCIAS con Especialidad en Microbiología

Julio del 2006

ii

ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE GENES DE Mycobacterium tuberculosis

DURANTE LA INFECCIÓN A MACRÓFAGOS

Este trabajo fue realizado en la División de Biología Celular y Molecular del Centro

de Investigación Biomédica del Noreste, Instituto Mexicano del Seguro Social, en

Monterrey, Nuevo León y en la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad

Autónoma de Nuevo León en San Nicolás de los Garza, Nuevo León.

Directores de tesis:

Dr. Juan Manuel Alcocer González

Dr. Jorge Enrique Castro Garza

Para la realización de este trabajo de investigación y obtener el grado de Doctor en

Ciencias, se obtuvo apoyo de:

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

Beca Crédito No. 72010

Instituto Mexicano del Seguro Social

Becario No. 99090222

Fondo de Fomento a la Investigación-IMSS

IMSS-FOFOI FP-2001-030

IMSS-FOFOI FP-2005/9/I/494

iii

ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE GENES DE Mycobacterium tuberculosis

DURANTE LA INFECCIÓN A MACRÓFAGOS

Comité de la Tesis:

_____________________________________________________

Dr. Juan Manuel Alcocer González

Presidente

_____________________________________________________

Dr. Jorge Enrique Castro Garza

Secretario

_____________________________________________________

Dra. Norma Laura Heredia Rojas Vocal

_____________________________________________________

Dr. Ricardo Alberto Gómez Flores Vocal

_____________________________________________________

Dr. Lucio Vera Cabrera Vocal

iv

ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE GENES DE Mycobacterium tuberculosis

DURANTE LA INFECCIÓN A MACRÓFAGOS

Comité Académico de Doctorado

___________________________________________________________________

Subdirector de Estudios de Postgrado

v

AGRADECIMIENTOS

Quiero expresar mi agradecimiento al Dr. Jorge Castro, Asesor de mi tesis y al Dr.

Lucio Vera por haber enriquecido este proyecto, así como a los Doctores Juan

Manuel Alcocer, Norma Heredia y Ricardo Flores por las revisiones dadas al mismo.

Al Dr. Salvador Said y a todo el personal del Centro del Investigación Biomédicas

del Noreste por el apoyo brindado durante mi estancia.

A mis amigos del CIBIN, Silvia, Gloria y Julio quienes estuvieron cerca durante todo

el trayecto.

A mi equipo de trabajo del Laboratorio de Biología Celular y Molecular, en especial

a Delia y Pilar así como a Toño y Norma con quienes conviví cercanamente.

A mis amigos Gabriel y Javier por su apoyo incondicional.

Amanda e Hilda por que siempre creyeron en mí.

A todos a quienes de alguna forma contribuyeron a que pudiera ver finalizado este

proyecto.

vi

No es posible salir adelante

celebrando éxitos sino

superando fracasos

Dedicado:

A mi madre, Rosa, por todo su amor y sacrificios hechos por apoyarme.

A la memoria de mi padre, quien supo guiarme en los pocos años que lo tuve.

A mi familia por el apoyo moral que siempre me han brindado, especialmente

a mis hermanos Roxana y Javier.

A todos mis pequeños y grandes amores. . . .

Más que el brillo de la

victoria, nos conmueve la

entereza ante la

adversidad.

- Octavio Paz

vii

TABLA DE CONTENIDO

Sección Página

1. RESUMEN Y ABSTRACT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

2. INTRODUCCIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

3. HIPÓTESIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

4. OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

4.1 Objetivo general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

4.2 Objetivos específicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

5. ANTECEDENTES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

5.1 Epidemiología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

5.2 Característica de género Mycobacterium spp. . . . . . . . . . . . . . 6

5.3 Patogénesis de la tuberculosis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

5.4 Factores de virulencia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

5.5 Modelos para estudiar virulencia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

5.6 Planteamiento del problema. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

5.7 Justificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

5.8 Importancia del trabajo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

6. MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

6.1 Diseño experimental. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

6.2 Línea celular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

viii

6.3 Transformación de células THP-1 a macrófagos . . . . . . . . . . . . . 16

6.4 Evaluación de la viabilidad celular por ensayo de WST-1 . . . . . . 16

6.5 Cepas de Mycobacterium tuberculosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

6.6 Determinación de la densidad bacteriana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

6.7 Extracción de DNA genómico de micobacterias . . . . . . . . . . . . 17

6.8 Ensayo de citotoxicidad bacteriana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

6.9 Cuantificación de citotoxicidad por ensayo de TCV. . . . . . . . . . . . 18

6.10 Infección de macrófagos con cepas de M. tuberculosis y

recuperación de bacterias para la extracción de RNA . . . . . . . . . . 20

6.11 Extracción de RNA de micobacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

6.12 Extracción de RNA de macrófagos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

6.13 Electroforesis en gel de agarosa para RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

6.14 Determinación de la concentración del RNA . . . . . . . . . . . . . . . . 22

6.15 Selección de los genes para amplificar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

6.16 Producción de DNA complementario (cDNA). . . . . . . . . . . . . . . 25

6.17 Reacción en cadena de la polimerasa para obtener

los amplicones correspondientes a cada gene analizado . . . . . . . . 25

6.18 Electroforesis en gel de agarosa para DNA. . . . . . . . . . . . . . . . 25

7. RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

7.1 Densidad bacteriana de los cultivos congelados

de M. tuberculosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

7.2 Actividad citotóxica sobre cultivos celulares de células

THP-1 por cepas de M. tuberculosis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

7.3 Cuantificación de citotoxicidad por tinción con cristal violeta

(TCV), desarrollo y estandarización del método. . . . . . . . . . . . . . . . 30

ix

7.4 Cuantificación de la citotoxicidad producida por M. tuberculosis

mediante el ensayo del cristal violeta (TCV) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

7.5 Extracción del RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

7.6 Selección de los genes para amplificar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

7.7 Especificidad de los iniciadores diseñados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

7.8 Expresión de los genes analizados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

8. DISCUSIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

9. CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

10. LITERATURA CITADA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

11. APÉNDICE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

x

LISTA DE TABLAS

Tabla Página

1. Lista de iniciadores utilizados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2. Porcentaje de celular muertas = citotoxicidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3. Selección de genes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

4. Productos amplificados por PCR de los genes de M. tuberculosis. . . . 38

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1. Efecto citotóxico de M. tuberculosis dependiente de la

virulencia de las cepas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2. Efecto citotóxico de M. tuberculosis dependiente del

inóculo bacteriano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3. El número de células en cultivo determinó los

valores de absorbancia obtenidos utilizando el ensayo de TCV. . . . . . . . 31

4. Evaluación de citotoxicidad de Tritón X-100 sobre cultivos

de la línea celular THP-1 mediante el ensayo TCV. . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

5. RNA obtenido de los cultivos de micobacterias. . . . . . . . . . . . . . . . ... . 34

6. Expresión de genes de M. tuberculosis CDC1551. . . . . . . . . . . . . . . ... 39

1

1. RESUMEN

Los factores bacterianos responsables de la patogenicidad de M. tuberculosis no han

sido plenamente identificados. En este trabajo, se analizó el efecto citotóxico producido

por esta bacteria sobre macrófagos humanos en cultivo, así como la expresión de

algunos genes bacterianos que pudieran estar involucrados en el proceso de infección.

Monocapas en cultivo de la línea celular de monocitos humanos (THP-1) diferenciada a

macrófagos por inducción con forbol-miristrato-acetato (PMA) se infectaron con M.

tuberculosis cepas CDC1551, H37Rv y DR689, con una multiplicidad de infección

(MDI) de 10:1, 1:1 y 0.1:1 (bacterias:macrófagos). El efecto citotóxico se observó como

aglomeración celular y áreas de lisis. El daño dependió de la concentración del inóculo

y del tiempo de incubación. En infecciones realizadas con una MDI de 10:1, se observó

destrucción total de los cultivos a 24 h de incubación. Utilizando MDI menores se

observó un daño menor en el cultivo celular y aglomeración de células en varias zonas,

los cuales no se presentaron en los cultivos testigo. Las monocapas celulares infectadas

con una MDI de 1:1 y 0.1:1 conservaron parcialmente su integridad a las 72 h de

incubación. Para cuantificar el efecto citotóxico producido por M. tuberculosis, se

desarrolló un método colorimétrico basado en la característica particular de M.

tuberculosis de no absorber el cristal violeta. De esta manera la perdida de células en el

cultivo debido al efecto citotóxico se refleja cuantitativamente en las lecturas de

absorbancia. En base a los resultados de citotoxicidad se seleccionó la MDI de 1:1 para

realizar los estudios de expresión durante la infección. La extracción del RNA

bacteriano se realizó de bacterias obtenidas a los 7 días de crecimiento en medio de

cultivo Middlebrook 7H9, de bacterias cultivadas en medio RPMI completo o de

bacterias infectando macrófagos a las 2, 6 y 24 h de incubación. La selección de genes

para analizar su expresión se hizo tomando como base genes de M. tuberculosis

reportados como probables factores de virulencia o genes sin función definida en M.

tuberculosis pero con homología con factores de virulencia en otros patógenos. Los

genes seleccionados para buscar su expresión se nombraron de acuerdo a la

nomenclatura dada en http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/: MT0003,

MT0024, MT0040, MT0259, MT0655, MT0876, MT1524, MT3917 (erp), MT2783

(sigB), MT2415 (plcB) y MT2414 (plcC). El testigo de expresión constitutiva fue el

gene MT3989 (esat6), el cual se expresó en todas las condiciones analizadas. Como

testigo de expresión inducida durante la infección se seleccionó el gene MT2416 (plcA),

el cual se expresó de manera semejante a lo reportado previamente por otros autores.

Todos los genes a excepción del MT0259 se expresaron en todas las condiciones, pero

se observó variabilidad en la intensidad de las bandas lo que representa una posible

expresión diferencial que debe establecerse mediante métodos cuantitativos. El gene

MT0259 con función aparente de oxidoreductasa se expresó hasta las 24 h de incubación

tanto en medio de cultivo como en células infectadas pero no mostró expresión

determinada por RT-PCR a los 7 días de crecimiento en medio Middlebrook. Con estos

hallazgos, se concluyó que M. tuberculosis tiene un efecto citotóxico sobre la monocapa

de macrófagos cuantificable por la tinción con cristal violeta y que la bacteria expresa

selectivamente ciertos genes dependiendo de las condiciones del medio de cultivo.

2

ABSTRACT

M. tuberculosis virulence factors have not been completely identified. In this work, the

cytotoxic effect produced by M. tuberculosis on human macrophages and the expression

of specific bacterial genes during macrophage infection that may be involved in

mycobacterial virulence was analysed. THP-1 cells monolayers differentiated to

macrophages by phorbol myristate acetate (PMA) were infected with M. tuberculosis

strains CDC1551, H37Rv and DR689 with a variable multiplicity of infection (MOI):

10:1, 1:1 and 0.1:1 (bacteria:macrophage) and incubated at various time points.

Cytotoxicity was observed as areas of clearing and cell agglomeration and the effect was

dependent on bacilli inoculum and incubation time. MOI of 10:1 produced a complete

destruction of the cell monolayer after 24 h post-infection. Uninfected cultures kept their

integrity throughout the experiment. Cell monolayers infected with MOI’s of 1:1 and

0.1:1 were partially disrupted after 72 h post-infection. In order to measure the

cytotoxic effect, we developed an in vitro colorimetric assay based on M. tuberculosis

inability to absorbe crystal violet dye, such that any lost of cells caused by M.

tuberculosis in infected cultures would produce a change in absorbance values. Based

on the cytotoxicity results, the MOI of 1:1 was selected to recover bacteria, isolate their

RNA and perform the expression analysis. RNA was isolated from bacteria grown in

Middlebrook 7H9 medium after 7 days or in RPMI medium at 2, 6 and 24 h, as well as

RNA from bacteria infecting macrophages at the same time points. Selection of analysed

genes was based on genes reported as probable virulence factors of M. tuberculosis or

genes with undefined function in M. tuberculosis but having a nucleotide sequence

homologous to virulence genes from others pathogens. Selected genes for this study

were named according to the nomenclature given in

http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/: MT0003, MT0024, MT0040,

MT0259, MT0655, MT0876, MT1524, MT3917 (erp), MT2783 (sigB), MT2415 (plcB)

and MT2414 (plcC). Gene MT3989 (esat6) was used as control of constitutive

expression and gene MT2416 (plcA) as control of induced expression during infection.

Gene MT0259 with a putative oxidoreductase activity did not show expression after 7

days of growth in 7H9 medium as determined by RT-PCR. But, it did express when

cultivated in RPMI or during the macrophage infection at least till 24 h. All the rest of

the genes analysed were expressed in all the studied conditions. Although, variability

was observed on the intensity of bands, indicating a probable upregulation or

dowregulation of expression, it is necessary to make quantitative analysis to get

conclusive results. These findings indicate that M. tuberculosis has a cytotoxic effect on

macrophage monolayers, which can be measured by crystal violet dye and that M.

tuberculosis selectively express genes depending on culture conditions.

3

2. INTRODUCCIÓN

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa causada principalmente por el género

Mycobacterium tuberculosis. Esta enfermedad es bien conocida desde la antigüedad,

pero en los últimos años y especialmente, debido a la aparición del SIDA, se ha

producido un cambio radical en su epidemiología y existe una enorme preocupación en

todo el mundo por su nueva aparición y por e l incremento de resistencia a los fármacos

más importantes. La Organización Mundial de la Salud (OMS), manifestó que la

tuberculosis había adquirido carácter de urgencia mundial, por lo cual es importante

mantener y fortalecer los sistemas de control sobre la enfermedad.

Parte fundamental en la lucha contra la tuberculosis es el conocimiento de los

mecanismos de patogenicidad y de evasión de la respuesta inmune que ocurren durante

la infección. Los estudios realizados que proveen esta información permitirán disponer

de un mejor tratamiento contra la enfermedad así como mejores medidas de control y/o

prevención. En este trabajo se analizó el efecto citotóxico producido por M. tuberculosis

sobre macrófagos humanos en cultivo y la expresión de algunos genes bacterianos que

pudieran estar involucrados en el proceso de infección.

Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que M. tuberculosis tienen un

efecto citotóxico sobre la monocapa de macrófagos, el cual depende de la virulencia de

la cepa y está en función del inóculo usado y del tiempo de incubación. Esta actividad

biológica de M. tuberculosis sobre macrófagos humanos se cuantificó mediante un

método colorimétrico desarrollado en el laboratorio basado en la característica particular

de esta bacteria de no absorber el colorante cristal violeta.

El análisis de la expresión de genes específicos de M. tuberculosis mediante la

amplificación de cDNA obtenido del RNA de bacterias en medio de cultivo bacteriano

mostró que los genes seleccionados se expresaron semejantemente a cuando las bacterias

se obtuvieron después de infectar macrófagos humanos. La metodología usada en este

trabajo permitió observar ligeras diferencias en la intensidad de las bandas de los

amplicones en cada condición, lo que puede reflejar una expresión diferencial. Sin

embargo es necesario utilizar métodos cuantitativos para tener resultados concluyentes

al respecto. El gene MT0259 con posible función de oxidoreductasa se expresó en las

diferentes condiciones estudiadas excepto cuando se cultivó por 7 días en medio

Middlebrook. Este gene, muy posiblemente está relacionado con el metabolismo de la

bacteria y se requiere durante el crecimiento activo de la bacteria pero deja de expresarse

cuando esta llega a su fase estacionaria de crecimiento.

Estudios posteriores podrán cuantificar cada uno de los genes estudiados y establecer

su importancia en la infección de M. tuberculosis a células humanas. Así mismo se

podrá establecer la función real y la importancia del gene MT0259.

4

3. HIPÓTESIS

M. tuberculosis expresa diferencialmente factores relacionados con la virulencia

durante la invasión celular, los cuales pueden ser detectados en un modelo de infección

celular.

5

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General

Analizar la expresión de genes específicos de M. tuberculosis durante la infección in

vitro en macrófagos derivados de la línea celular THP-1.

4.2 Objetivos específicos

5.1 Analizar el efecto citotóxico de M. tuberculosis sobre macrófagos humanos

derivados de la línea celular THP-1.

5.2 Establecer un método colorimétrico para cuantificar el daño producido por M.

tuberculosis sobre monocapas celulares.

5.3 Seleccionar genes específicos con probable función de virulencia de M.

tuberculosis para analizar su expresión en las diferentes condiciones a

estudiar.

5.4 Determinar los ARN expresados durante la infección de las bacterias en los

macrófagos humanos derivados de la línea celular THP-1.

6

5. ANTECEDENTES

5.1 Epidemiología

La Organización Mundial de la Salud (OMS), declaró en abril de 1993 que la

tuberculosis había adquirido carácter de emergencia mundial. El incremento en la

incidencia de la tuberculosis se ha debido principalmente a una falla en los servicios de

salud y falta de atención a la enfermedad, al vínculo entre la tuberculosis y la infección

con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y a la aparición de cepas de M.

tuberculosis multidrogoresistentes. Cerca de la tercera parte de la población mundial

está infectada con el bacilo de la tuberculosis. Se calcula que la tuberculosis es

responsable de más del 6% de todas las muertes en el mundo (PAHO, 2004; Snider et

al., 1994; Sayler et al., 1994, Corbett y Raviglione, 2005).

Los datos más recientes muestran que aproximadamente de 7 a 8 millones de

personas en el mundo se enferman cada año de tuberculosis y alrededor de 2 millones de

personas mueren al año por causa de este padecimiento. Las muertes por tuberculosis

corresponden al 25% de la mortalidad evitable en países en desarrollo. El 95% de los

casos de tuberculosis y el 98% de las muertes causadas por esta enfermedad ocurren en

países en desarrollo y el 75% de estos casos ocurren en la población económicamente

productiva que oscila ente los 15-50 años de edad (PAHO, 2004).

Una persona con tuberculosis activa y sin tratamiento puede infectar un promedio de

10 a 15 personas cada año. Se ha estimado que, de no tomar las medidas adecuadas,

entre los años 2002 y 2020 en el planeta se infectarán cerca de 1000 millones de

personas, 150 millones padecerán la enfermedad y 36 millones morirán de tuberculosis,

(PAHO, 2004).

5.2 Característica de género Mycobacterium spp.

El género Mycobacterium incluye varias especies, unas son patógenas tanto para el

hombre como para los animales; otras son patógenas oportunistas y otras son

esencialmente saprófitas (Freeman, 1991; Jawetz, 1987). Dentro de las micobacterias

patógenas, Mycobacterium tuberculosis es la más representativa dentro del complejo

tuberculosis que incluye además, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum y M. microti

7

(Brock, 1987). Las micobacterias son bacilos delgados o ligeramente curvos, de 0.2 a

0.6 m de diámetro y de 1 a 4 µm de longitud; aparecen como células aisladas o

asociados en grupos pequeños y a veces en masas compactas en las que no se puede

distinguir cada bacilo individual (Koneman et al., 1992; Lenette et al., 1974; Baron,

1990). El bacilo de la tuberculosis es inmóvil y no forma esporas (Freeman, 1991;

Jawetz et al., 1987; Barón, 1990) y requiere de 15 a 22 horas para su replicación

(Koneman et al., 1992; Buchanan, 1984). La micobacterias no se tiñen con métodos

convencionales porque hay una resistencia notable a la penetración de los colorantes en

las células debido a la presencia de cantidades relativamente grandes de lípidos en la

pared celular, por lo que son llamados bacilos ácido-alcohol resistentes. Por su

naturaleza hidrofóbica, la pared celular no es accesible a sustancias hidrofílicas tales

como el cristal violeta por lo tanto M. tuberculosis no puede ser teñida con la tinción

regular de Gram resultando en gram neutral (no negativo – no positivo) o con una

apariencia de fantasmas (Lenette et al., 1974, Buchanan, 1984; Washington, 1981;

Wistreich y Lechtnam, 1989; Trifiro et al., 1990).

5.3 Patogénesis de la tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis es el agente causal de la tuberculosis humana. La

enfermedad se presenta en un curso crónico que ataca de manera primaria a los

pulmones, pero puede afectar cualquier órgano o tejido. Las micobacterias producen

reacciones inflamatorias focales granulomatosas. En el centro de éstas, frecuentemente

se observa una forma peculiar de necrosis caseosa (Robbins y Cotran, 1985; Levison,

1992; Hopewell y Jasmer, 2005); esta calcificación depende de la eficacia de la

respuesta inmune mediada por células, constituida por la llegada de células como

linfocitos T y macrófagos y en menor grado los neutrófilos y células asesinas naturales

(NK), las cuales pueden tener un efecto micobacteriostático (Dannenberg y Rook, 1994),

confiriendo un aislamiento de la zona de infección.

La habilidad de M. tuberculosis para mantener una infección crónica y causar

enfermedad en un subgrupo de sujetos infectados, depende de sus productos conocidos

como factores de virulencia, que capacitan al microorganismo para entrar y sobrevivir

indefinidamente dentro de las células fagocíticas mononucleares y por evadir los

mecanismos celulares antimicrobianos (Riley, 1995).

La respuesta a la infección por micobacterias es el ejemplo clásico de una respuesta

inmune mediada por células a un parásito intracelular facultativo. Las micobacterias,

dentro de las células fagocíticas, son capaces de evadir la respuesta humoral y

mantenerse viables por largos periodos de tiempo. Las células T toman parte en la

activación y regulación de lo macrófagos y subsecuentemente en el control del

crecimiento micobacteriano (Vanham et al., 1997).

M. tuberculosis persiste en los macrófagos dentro de un granuloma en los hospederos

infectados. En el granuloma se encuentran macrófagos, células gigantes, células T,

células B y fibroblastos. El microorganismo puede estar en un estado inactivo,

replicándose activamente pero limitado por la respuesta inmune, o metabólicamente

8

alterado con ciclos replicativos infrecuentes o limitados. La alteración de la respuesta

inmune puede resultar en la reactivación y replicación del bacilo, con necrosis o daño al

tejido pulmonar. La respuesta inmune es capaz de prevenir la enfermedad activa en la

mayoría de las personas, pero no elimina la infección (Kaufmann, 2001; Wigginton y

Kirschener, 2001).

Los factores de virulencia micobacterianos pueden causar un daño directo sobre las

células del hospedero o inducir en las células infectadas la expresión de productos

celulares como citocinas o enzimas líticas que pueden amplificar el daño de tejido en el

individuo (Rook y Bloom, 1994; Kuby, 1994).

Las especies patógenas de Mycobacterium spp. al ser internalizadas en los

macrófagos, residen inicialmente en una vacuola endocítica llamado fagosoma. Cuando

ocurren los ciclos fagosomales normales de la maduración, es decir, fusión fagosoma-

lisosoma, estas bacterias pueden encontrar un ambiente hostil que incluye pH ácido, los

intermedios reactivos del oxígeno (ROI), las enzimas lisosomales, y péptidos tóxicos,

que puede aumentar el daño en el tejido (Smith, 2003; Nathan y Hibbs, 1991); Sin

embargo, las micobacterias patógenas, tienen la capacidad de bloquear el proceso de

maduración que normalmente siguen los fagosomas; la presencia de la bacteria impide

que el pH del orgánelo descienda hasta alcanzar el grado de acidificación necesario para

la activación de los enzimas hidrolíticas. En tales circunstancias, a un pH de 6.2-6.3,

M. tuberculosis no sólo queda inaccesible a la acción lisosómica, sino que también pasa

a captar hierro vía transferrinas (Crowle et al., 1991; Deretic et al., 2004; Vergne et al.,

2005).

Algunos autores proponen que el daño tisular en la infección por M. tuberculosis se

debe principalmente a la respuesta inflamatoria generada por la infección y es mediada

por la activación de TNF- citotóxico (Flesch, 1990; Filley, 1991; Keane, 1997; Rojas,

1999; Kruys, 1992; Spira, 2003; Gil et al., 2004; Lasco et al., 2005). Estudios in vitro

también sugieren que la penetración a través del epitelio alveolar puede ocurrir tras la

inducción de TNF- en células infectadas llevando a una reducción en la barrera

bioeléctrica normal del epitelio alveolar (Zhang et al., 1997). Sin embargo, en pacientes

con tuberculosis y en un modelo murino, se ha observado necrosis pulmonar durante

estados avanzados de la enfermedad (Dannenberg y Rook, 1994) cuando el nivel de

TNF- en estos tejidos es bajo (Barnes et al., 1990; Hernández-Pando et al., 1997). Esto

sugiere que factores adicionales de la bacteria o del hospedero deben estar involucrados

en la destrucción del tejido en la tuberculosis.

Durante la respuesta inmune los macrófagos quedan expuestos a citocinas que los

llevan a un proceso de activación que permite que los fagosomas superen el bloqueo y

dejan a la bacteria bajo la acción hidrolítica del lisosoma. Así mismo, puede iniciarse un

proceso de muerte de las células infectadas y dar lugar a la formación del granuloma

característico de esta enfermedad (Kaufmann, 2001; Wigginton y Kirschener, 2001;

Smith, 2003).

La apoptosis inducida durante la infección por M. tuberculosis ha mostrado ser un

mecanismo de muerte celular para los mismos macrófagos y para otros tipos de células

inmunes cuando son puestas a interaccionar en el mismo modelo (Keane, 1997; Rojas,

1999; Durrbaum-Landmann, 1996; Klingler, 1997; Oddo, 1998). También la apoptosis

se ha observado en células epiteloides de granulomas en pacientes con tuberculosis

(Keane, 1997; Cree, 1987). De hecho, la apoptosis inducida por bacterias ha sido

9

propuesta como un importante mecanismo pro-inflamatorio, controlando el crecimiento

intracelular y previniendo la diseminación de la infección por otros patógenos

intracelulares (Zychlinsky y Sansonetti, 1997) y por lo tanto pudiera desempeñar un

papel importante en la patogénesis o control de la tuberculosis.

5.4 Factores de virulencia

La virulencia se define como la capacidad relativa de un patógeno de superar las

defensas del huésped. Designa el grado de poder letal de un microorganismo y se mide

por el número de gérmenes que se necesitan para matar animales de una especie

determinada en condiciones establecidas y en un período definido. La virulencia es un

fenómeno complejo que no sólo depende de la naturaleza genética del patógeno sino

también de la genética y la inmunología del hospedero (Folch, 1966; Jacobs y Bloom,

1994; Smith, 2003).

Un factor de virulencia es fácil de reconocer cuando es un componente que daña

directamente al hospedero o evade el sistema inmune, permitiendo sobrevivir al

patógeno. M. tuberculosis es un parásito intracelular que infecta y se multiplica

principalmente en fagocitos, aunque puede infectar células que no son fagocíticas

profesionales (Sephard et al., 1956; Bermudez et al., 1996; Mehta et al., 1996; Castro-

Garza et al., 2002). Se han hecho considerables esfuerzos en décadas pasadas para

identificar factores de virulencia. Se ha demostrado en modelos experimentales con

animales susceptibles que la infección con las cepas virulentas de laboratorio H37Rv y

Erdman, resulta en destrucción de tejido, diseminación dentro de órganos y muerte

(Dunn y North, 1995; Rhoades y Orme, 1997; Dorman et al., 2004).

M. tuberculosis es capaz de infectar, multiplicarse intracelularmente y producir

citotoxicidad a células en cultivo en la ausencia de muchos de los factores del hospedero

(Bermudez y Goodman, 1996; Mehta et al., 1996; Flynn et al., 1995; McDonough y

Kress, 1995). Estudios in vitro han demostrado que M. tuberculosis produce un efecto

citotóxico sobre neumocitos humanos o macrófagos que está relacionado con la

virulencia de las cepas; este efecto es independiente de TNF- y del crecimiento

micobacteriano en asociación con las células (Castro-Garza et al., 2002; Dannenberg y

Rook, 1994; McDonough y Kress, 1995; Mehta et al., 1996; Bermudez y Goodman,

1996; Silver et al., 1998; Birkness et al., 1999; Dobos et al., 2000).

Previo al conocimiento de la secuencia completa del genoma de M. tuberculosis, ya

se conocían tres factores de virulencia, el gene Kat G que codifica para la enzima

catalasa-peroxidasa, la cual proporciona protección frente a las especies reactivas de

oxígeno producidas por las células fagocíticas en las que crece (Stoeckle et al., 1993); el

gen mce, que codifica para un factor colonizador de macrófagos (Collins, 1996; Arruda

et al., 1993; Kumar et al., 2003); y el gen de un factor sigma, sig A, a nivel del cual se

dan mutaciones que conducen a la atenuación de la cepa (Berthet et al., 1998). En 1998

se publicó la secuencia completa del genoma de M. tuberculosis cepa H37Rv (Cole et

al., 1998) y a partir de entonces se han publicado varios reportes referentes a otros

factores de virulencia.

10

Entre los factores de virulencia de M. tuberculosis que se han descrito, está el

codificado por el gen eis que se ha relacionado con un aumento en la sobrevivencia

intracelular (Dahl et al., 2000), las proteínas de unión a fibronectina asociadas con

adhesión e invasión (Schorey et al., 1995), así como la esfingomielinasa y otras

hemolisinas que podrían desempeñar un papel importante en la degradación de la

membrana fagolisosomal (Johansen et al., 1996; King et al., 1993; Leao et al., 1995;

Vargas-Villarreal et al., 2003; Vera-Cabrera et al., 2003).

También se han reportado estructuras como la lipoarabinomanana manosilada

(ManLAM), un componente de la pared micobacteriana considerado un potente inductor

de la producción de TNF- por macrófagos (Chatterjee et al., 1992a; Chatterjee et al.,

1992b; Rojas et al., 2000).

Las proteínas de choque térmico y sulfolípidos inducen la liberación de citocinas

amplificando así el proceso de inflamación, sin embargo las proteínas de choque térmico

no tienen un papel definido en la virulencia de M. tuberculosis (Rook y Bloom, 1994).

Otro factor reportado es el de acordonamiento, el cual induce necrosis y destrucción de

tejido (Krahenbuhl, 1995).

Las fosfolipasas y esfingomielinasas son enzimas que hidrolizan fosfolípidos, lo que

podría facilitar la entrada bacteriana al macrófago degradando la membrana celular;

también se le ha atribuido actividad citotóxica y puede alterar los mecanismos de

señalización celular llevando a la muerte celular (Wheeler y Ratledge, 1991; King et al.,

1993; Thorson et al., 2001; Raynaud et al., 2002; Vera-Cabrera et al., 2003; Hernández-

Vera, 2003; Vargas-Villarreal et al., 2003; Vera-Cabrera et al., 2006).

Entre otros posibles factores de virulencia se encuentran ciertas proteínas de

almacenamiento, especializadas en la captación de factores de crecimiento, permitiendo

la persistencia del bacilo en un fagosoma carente de nutrientes; así por ejemplo, se han

identificado los genes bfrA y bfrB, que codifican para unas proteínas semejantes a la

ferritina que integran un sistema de captación de hierro (Gold et al, 2001).

5.5 Modelos para estudiar virulencia

Para poder conocer los factores o genes involucrados durante la patogenia de la

tuberculosis, se han reportado diferentes formas para estudiar el proceso de infección,

tales como modelos animales y cultivo de tejidos, usando principalmente macrófagos.

El estudio en animales podría ser más representativo porque pueden ser estudiadas todas

las etapas de la enfermedad, sin embargo el mantener los animales suele más caro y

laborioso debido al manejo y alimentación, además de mayores restricciones de tipo

ético que existen actualmente. Los modelos de cultivos de tejidos de mamífero son más

fáciles de manejar y dan resultados más rápidos (Smith, 2003). El uso de los modelos in

vitro nos proporciona ciertas ventajas como mantener un medio ambiente controlado,

caracterización y homogeneidad de la muestra. Por economía, permiten trabajar a gran

escala y en forma mecanizada. Además están bien justificados y son bien aceptados

desde el punto de vista de la ética (Freshney, 2000).

11

Debido a que los macrófagos alveolares humanos son difíciles de obtener,

generalmente se usan modelos de macrófagos que pueden ser de ratón o humano y

pueden ser tanto de cultivos primarios como de líneas establecidas. Los monocitos de

sangre periférica que son diferenciados en macrófagos son de los más usados en este

tipo de experimentos. Es también común el uso de la línea celular de monocitos

humanos THP-1, que pueden ser diferenciados a células fagocíticas, similares a

macrófagos por la adición de ésteres de forbol (Smith, 2003; Tsuchiya et al., 1980).

Algunos estudios han mostrado que los macrófagos THP-1 diferenciados son similares a

los macrófagos periféricos en la respuesta a la infección de M. tuberculosis (Stokes y

Doxsee, 1999).

El daño celular puede ser estimado o parcialmente cuantificado mediante el análisis

de los cambios morfológicos (redondeamiento celular y perdida de la integridad de la

monocapa) (Fisher et al., 1996; Daniel et al., 2004), estableciendo una escala del

porcentaje de células redondeadas y/o desprendidas (Read et al., 1974) o mediante un

conteo de las células degradadas por microscopía electrónica (McDonough y Kress,

1995). Sin embargo, estos procedimientos son semi-cuantitativos. Existen también

métodos cuantitativos más precisos, pero que requieren tiempos largos para ser llevados

a cabo, como la medición de la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) o

la medición de los complejos DNA-histonas por ELISA (Dobos et al., 2000;

Danelishvili et al., 2003).

La exclusión o inclusión de colorantes vitales no son métodos prácticos para modelos

de infección con M. tuberculosis por el manejo directo de las muestras. El uso de

marcadores radiactivos, aunque más sensible, incrementaría el nivel de bioseguridad, en

tanto que el uso de compuestos como MTT, WST-1 y otras sales de tetrasolio que son

reducidos por micobacterias (Gomez-Flores et al., 1995; Franzblau et al., 1998), así

como por macrófagos en cultivo (Ferrari et al., 1990) no serían adecuados para ser

usados en un modelo de infección in vitro como el nuestro, pues los datos obtenidos

serían dados tanto por la reducción del compuesto por las células como por las bacterias,

resultando en una imprecisión en los valores de absorbancia.

El cristal violeta (CV) es una tinción de trifenilmetano también conocida como

violeta de genciana. La aplicación más utilizada para esta tintura es la tinción de Gram,

la cual divide las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas.

Gillies en 1986 usó CV para determinar el número de células en cultivos de monocapa

en función de la absorbancia dada por el colorante tomado por las células. Desde

entonces, este método ha sido usado por modificaciones para varias aplicaciones. En

este trabajo se implementó un método para cuantificar el efecto citotóxico de M.

tuberculosis sobre monocapas de la línea celular THP-1.

Durante los últimos 10 años, los principales avances en el estudio de M. tuberculosis,

se han realizado en la innovación de técnicas en bacteriología molecular. Donde se

incluye la generación de vectores de transformación para su uso tanto en Escherichia

coli como en micobacterias no tuberculosis; protocolos de electroporación para incluir

esos plásmidos dentro de las micobacterias y cassettes de promotores, lo cual puede ser

usado para dirigir la expresión de genes clonados en las micobacterias (Mahan et al.,

1993; Mahan et al., 1995).

La identificación de genes que se expresan diferencialmente entre cepas atenuadas

contra cepas virulentas de M. tuberculosis es otra forma de entender los mecanismos de

virulencia y patogenicidad de tuberculosis. La hibridación sustractiva ha sido usada para

12

identificar y clonar genes que son expresados diferencialmente por las micobacterias al

crecer en medios de cultivo bajo diferentes condiciones o durante la infección de células,

aportando avances significativos que han permitido abordar el estudio de características

genéticas relacionadas con patogenicidad, factores de virulencia y las interacciones

hospedero-micobacteria (Rivera-Marrero et al., 1998; Manganelli et al., 1999; Rindi et

al., 1999; Fenhalls et al., 2002; Gaede et al., 2004; Chan et al., 2005). El estudio de la

inducción de la expresión de genes de M. tuberculosis durante la infección a macrófagos

humanos ha permitido identificar genes que se expresan exclusivamente bajo estas

condiciones y ha aportado un mejor conocimiento de los factores expresados durante la

infección en cultivos celulares (Silver et al., 1998; Smith et al., 1998; Torzón et al.,

2001; Wigginton y Kirschener, 2001; Mariani et al., 2000; Dubnau et al., 2002; Dubnau

et al., 2003; Raynaud et al., 2002; Danelishvili et al., 2003; Tullius et al., 2003; Chan et

al., 2005; Shi et al., 2005; Singh et al., 2005; Rachman et al., 2006).

Actualmente una de las técnicas más prometedoras para la investigación biomédica

es la proteómica, la cual consiste en designar la totalidad de proteínas codificadas por un

genoma. El término proteoma ha pasado de ser un concepto difuso y abstracto a ser un

término funcional asociado a una realidad material. Así pues, la proteómica es el estudio

en gran escala de las proteínas; lo más común es la separación de proteínas por

electroforesis de doble dimensión, y su identificación por espectrometría de masas

(Brodin et al., 2005); y métodos bioquímicos (Valdiosera, 2006). Actualmente el

término proteómica cubre gran parte, si no la totalidad, del análisis funcional de los

productos génicos (genómica funcional), desde la localización en gran escala o el

estudio de la expresión de miles de proteínas simultáneamente (Valdiosera, 2006). En el

caso de M. tuberculosis, para el cual se conoce la secuencia completa del genoma, ésta

metodología ayudará para establecer las funciones de las proteínas expresadas en

diferentes condiciones.

En general, para explicar la virulencia de las micobacterias, los genes que se han

tratado de identificar, son los implicados en la entrada, supervivencia y multiplicación

intracelular. Sin embargo, para M. tuberculosis no se conocen con exactitud todos los

factores específicos ni los mecanismos de acción que tienen la capacidad de producir

directamente o inducir el daño observado para causar enfermedad. Bajo estas premisas,

en este proyecto se analizó la interacción entre cultivos celulares y M. tuberculosis, y la

expresión de genes específicos durante la interacción bacteria-célula que pudieran estar

involucrados en la virulencia del microorganismo para aportar un mejor entendimiento

del mecanismo patogénico de M. tuberculosis y contribuir en el desarrollo futuro de

mejores estrategias preventivas (vacunas) y terapéuticas (medicamentos) para el control

de la enfermedad.

5.6 Planteamiento del problema

A pesar de encontrarnos en el siglo XXI, la tuberculosis mata a más personas adultas

que cualquier otra enfermedad infecciosa y constituye uno de los mayores retos de la

Salud Pública en el mundo. Es de gran importancia en la actualidad proveer de nuevos

13

conocimientos que nos permitan proponer nuevas y más efectivas medidas diagnósticas,

terapéuticas y preventivas para esta afección. Para el desarrollo de tales medidas es

necesario identificar los mecanismos y las moléculas implicados en ellos.

M. tuberculosis es un microorganismo que produce y/o induce daño celular, pero no

se había descrito un modelo cuantitativo que determinará diferencias en el daño

citotóxico producido por cepas de diferente virulencia, por lo que se desarrolló un

ensayo para cuantificar la variabilidad de la citotoxicidad producida por cepas de M.

tuberculosis en cultivos de macrófagos.

La identificación de genes que se expresan selectivamente durante la infección

celular permite determinar que productos génicos están involucrados en el proceso de

infección y ayudaría a determinar su función específica en la patogénesis de la

tuberculosis.

5.7 Justificación

De acuerdo a la OMS, la tuberculosis se ha incrementado considerablemente en los

últimos años y se estima que si no se hace algo para poder solucionar este problema,

habrá alrededor de 8 millones de personas cada año infectadas por causa de esta

enfermedad.

La capacidad de las micobacterias para inducir una infección, depende de la

virulencia que los microorganismos poseen genéticamente y de los genes que son

expresados bajo ciertas condiciones para entrar y sobrevivir indefinidamente dentro de

las células fagocíticas.

Se ha demostrado en modelos animales susceptibles que la infección con las cepas

virulentas H37Rv y Erdman de M. tuberculosis, resulta en destrucción de tejido,

diseminación dentro de órganos, por lo que consideramos importante tener una

herramienta para determinar cuantitativamente la citotoxicidad de cepas de M.

tuberculosis en un cultivo estandarizado in vitro y que corresponda al análisis visual por

microscopía de la citotoxicidad producida por las diferentes cepas de M. tuberculosis.

Se han hecho considerables esfuerzos en décadas pasadas para identificar factores de

virulencia de M. tuberculosis. Los descritos hasta ahora; dan un mejor entendimiento de

sus mecanismos de acción; sin embargo, no se han identificado plenamente todos los

factores genéticos que pudieran estar involucrados en la patogenia de la enfermedad y

que podrían ser determinados con diversas técnicas de estudio, principalmente tratando

de simular las condiciones a las que se enfrenta la bacteria durante la infección, tal como

el modelo de infección de monocapas celulares que se realizó en este trabajo.

De acuerdo a lo antes mencionado, es clara la necesidad de generar conocimiento

que nos permita identificar los mecanismos que utilizan las micobacterias para inducir

enfermedad y de esta forma formular nuevas medidas para el control de la enfermedad.

14

5.8 Importancia del trabajo

Con esta investigación, se aporta un modelo cuantitativo para comparar el efecto

citotóxico producido por cepas de M. tuberculosis con diferente virulencia en cultivos de

macrófagos. También se desarrolló un modelo para estudiar la expresión de genes

específicos durante la infección a cultivos de macrófagos, el cual puede ser usado con

otras líneas celulares como la línea de células epiteliales de pulmón A549.

Con estos modelos, podemos medir la citotoxicidad de diversas cepas, ya sean

aislados clínicos o cepas que han sido modificadas genéticamente llevando a la

atenuación de ciertos genes que pudieran estar involucrados en estos eventos y así

ampliar el conocimiento de estos microorganismos. En este trabajo determinamos que el

gen MT0253, con probable función de oxidoreductasa, se expresa durante la fase activa

de crecimiento tanto en cultivo como durante la infección a macrófagos, pero falta por

determinar su función en la patogénesis de la tuberculosis.

15

6. MÉTODOS

6.1 Diseño experimental

Para la realización de este trabajo dividimos el protocolo de investigación en 4

etapas: a) análisis de la actividad citotóxica, donde se analizó la integridad de los

cultivos por microscopía y se cuantificó la actividad por el ensayo de TCV; b)

estandarización y optimización del aislamiento de RNA de bacterias en medio de cultivo

y en interacción con macrófagos; c) producción de cDNA a partir del RNA obtenido en

la etapa previa; d) amplificación de genes bacterianos en las diferentes condiciones

estudiadas y seleccionados de acuerdo al criterio que se explica más adelante. El

análisis estadístico para los diferentes ensayos se describe en cada apartado

correspondiente en la sección de métodos o de resultados.

6.2 Línea celular

Se utilizó la línea celular de monocitos humanos THP-1; ésta se obtuvo originalmente

de un paciente con leucemia monocítica aguda (ATCC: TIB-202) (Tsuchiya et al.,

1980). Las células se mantuvieron en medio RPMI-1640 (GIBCO, Sparks, MD)

adicionado con 10% de suero fetal bovino (SFB) (GIBCO) y 1 mM de Piruvato de Sodio

(Sigma, St. Louis, MO), a 37º C en una atmósfera de 5% de CO2 en frascos de cultivos

de 25 cm2 (Corning, Acton, MA).

La línea celular de monocitos humanos THP-1 se diferencia y adquiere características

de macrófago cuando se cultiva en presencia de acetato de forbol mirístico (PMA)

(Calbiochem, La Jolla, CA) (Asseffa et al., 1993; Tsuchiya et al., 1980). Esta línea

celular ha sido ampliamente usada para el estudio de la virulencia de diferentes

microorganismos, incluyendo M. tuberculosis, (Shattock et al., 1993; Friedland et al.,

1993; Zhang et al., 1998; Lee y Horwitz, 1999; Tchou-Whong et al., 1999; Agranoff et

al., 1999; Kusner y Adams, 2000; Miller y Shinnick., 2000; Armitige et al., 2000;

Riendeau y Kornfeld, 2003).

16

6.3 Transformación de células THP-1 a macrófagos

Las células THP-1 se cultivaron en ausencia de piruvato de sodio por al menos 3

pases antes de iniciar el protocolo de transformación. Posteriormente, los cultivos de 4

días de crecimiento se centrifugaron a 200 Xg por 10 minutos a temperatura ambiente; el

medio usado se eliminó y se hizo un conteo celular en un hemocitómetro. La densidad

celular se ajustó a 5 x 105 células por mililitro con RPMI suplementado con 10 % de

suero fetal bovino (SFB). Al medio se le adicionó 1 µl/ml de forbol-miristrato-acetato

(PMA) 10 µM diluido en Dimetil Sulfoxido (DMSO) (Calbiochem). Se distribuyó 1 ml

de la suspensión celular en cada uno de los pozos de una microplaca de 24 pozos. Los

cultivos se incubaron a 37°C con 5 % de CO2 por 48 horas evitando movimientos por

ese tiempo y se lavaron con 2 ml de RPMI precalentado a 37ºC con movimientos

rotatorios suaves. El medio de lavado se descartó, se agregó 1 ml de RPMI con 10% de

SFB nuevo y se incubó otras 48 horas con las mismas condiciones. Al término de este

período las células transformadas en macrófagos estaban listas para infectarse.

6.4 Evaluación de la viabilidad celular por ensayo de WST-1

Antes de infectar los cultivos celulares, el número de células viables por pozo se

determinó usando una prueba de WST-1. WST-1 es una sal de tetrazolio que puede ser

reducida por deshidrogenadas de células vivas liberando un producto colorido que puede

ser medido espectofotométricamente a una longitud de onda de 545 nm. Los valores de

absorbancia tienen una relación linear con el número de células vivas; el promedio de

tres pozos por microplaca, se interpoló en una curva estándar de densidad celular y se

usó como el número de células por pozo para cada experimento independiente.

6.5 Cepas de Mycobacterium tuberculosis

Se utilizaron las cepas H37Rv, CDC-1551y DR-689 de M. tuberculosis. La cepa

H37Rv, desde su aislamiento en 1905, ha sido ampliamente utilizada en estudios

médicos y de investigación, ha conservado la virulencia, es sensible a los distintos

fármacos y susceptible de ser modificado genéticamente con facilidad (Cole, 1998;

Brosch, 1998; Philipp, 1996). La cepa CDC-1551 fue aislada en 1998 a partir de un

brote en una pequeña comunidad rural en Estados Unidos de América, la cepa aislada

con características de crecimiento que excedieron grandemente los de otros aislamientos

clínicos ha sido considerada una cepa más virulenta que H37Rv (Valway, 1998). Tanto

la cepa H37Rv como la CDC1551 fueron donadas por el Centro de Control de

17

Enfermedades en Atlanta, Georgia, Estados Unidos. La cepa DR-689 es un aislado

clínico de baja virulencia donada por el Laboratorio Nacional de Referencia para la

tuberculosis en Winnipeg, Canadá, esta cepa carece del locus completo de fosfolipasa C

y es reportada de baja citotoxicidad para células en cultivo (Hernández-Vera, 2003) y

por su perfil de RFLP pertenece al grupo Beijing (Vera-Cabrera et al., 2006).

Para obtener lotes de cultivos bacterianos estables a través de todo el estudio,

realizamos cultivos en volúmenes de 100 ml de medio Middlebrook 7H9 (Difco, Sparks,

MD) suplementado con ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa (OADC) (Becton

Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y 0.2 % de glicerol (J.T.Baker, Xalostoc, Edo. Méx.) a

37ºC con una atmósfera de 5% CO2. Los cultivos se realizaron en frascos tipo “roller

bottle” de 490 cm3 (Corning, Acton, MA) debido a la amplia superficie del cultivo lo

que permite un mejor intercambio de gases y un mejor crecimiento de la bacteria.

Después de 7 días de incubación, las bacterias se lavaron con medio Middlebrook 7H9

fresco con 0.2 % de glicerol y se resuspendieron en el mismo medio. La suspensión

bacteriana se distribuyó en viales de 1.5 ml en criotubos con tapón de rosca estériles y se

congelaron a –70ºC hasta su uso.

6.6 Determinación de la densidad bacteriana

En el transcurso de la semana posterior a la congelación se tomaron tres tubos para

determinar el número de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/ml). Los

tubos se agitaron en vórtex (Corning, Acton, MA) hasta que la suspensión se observó

homogénea con mínimos agregados bacterianos, se hicieron diluciones décuples por

triplicado desde 10–1 a 10–6 con medio Middlebrook 7H9 con glicerol y se sembraron en

cajas petri con 15 ml de agar Middlebrook 7H10 con OADC, dejándolas incubar por 21

días a 37ºC. Se observó que el tamaño de las colonias era homogéneo y se tomaron en

cuenta las cajas conteniendo entre 20 y 200 colonias para hacer el conteo. Los cálculos

se realizaron de acuerdo al factor de dilución para determinar el número de UFC/ml.

6.7 Extracción de DNA genómico de micobacterias

Las bacterias se cultivaron en 5 ml de medio Middlebrook 7H9 (Gibco, Sparks, MD)

por 14 días a 37ºC. Después de la incubación, el cultivo se centrifugó a 17,000 Xg

durante un minuto y el sedimento se transfirió a un tubo de plástico de 2.0 ml que

contenía una esfera de cerámica de ¼ y perlas de sílica que son parte del estuche de

extracción Fast DNA.Kit (BIO101, Inc., Carlsbad, Ca.). Los tubos conteniendo las

bacterias se centrifugaron a 17,000 Xg por 5 minutos y se retiró el sobrenadante dejando

aproximadamente 200 l de medio en el tubo. Posteriormente se agregó a cada tubo 1

ml de solución de extracción CLS-TC para después procesarlos en el aparato Fast-Prep

18

por 2 ciclos de 30 segundos a una velocidad de 5.0 m/seg, con intervalos entre ciclos de

2 minutos inmersos en hielo. Luego, los tubos se colocaron en hielo por 5 minutos y se

centrifugaron de nuevo a 17,000 Xg por 10 minutos. Se transfirieron 600 l del

sobrenadante a un tubo nuevo donde se le agregaron 600 l de matriz de captura del

estuche de extracción (Binding Matrix), los tubos fueron mezclados suavemente por

inversión e incubados a temperatura de laboratorio por 5 minutos. Los tubos se

centrifugaron a 17,000 Xg por un minuto y se eliminó el sobrenadante. La pastilla fue

resuspendida en 500 l en la solución del estuche de extracción denominada SEWS-M y

se centrifugó nuevamente a 17,000 Xg por un minuto para posteriormente eliminar el

sobrenadante y centrifugar por otros 10 segundos para remover todo el líquido residual.

Para eluír el DNA de la matriz de captura, esta se resuspendió en 100 l de agua

destilada y se dejó incubar por 3 minutos a temperatura de laboratorio; se centrifugó a

17,000 Xg y el sobrenadante obtenido conteniendo el DNA, fue almacenado a –20ºC

hasta su cuantificación y uso.

6.8 Ensayo de citotoxicidad bacteriana

Monocitos humanos THP-1 fueron transformados a macrófagos con PMA y

cultivados en microplacas como se describe anteriormente. Las microplacas de 24

pozos con 1 X 105 células por pozo, se infectaron con M. tuberculosis a diferente

multiplicidad de infección (MDI); las MDI utilizadas fue de 10:1, 1:1, 0.1:1

(bacterias/macrófagos) y se incubaron por tiempos variables como se describe para cada

experimento a 37°C en una atmósfera de 5% CO2. El total del inóculo bacteriano se

conservó en los cultivos celulares a lo largo de todo el experimento. El efecto citotóxico fue evaluado por integridad de los cultivos y búsqueda de daño

celular cada 24 horas mediante microscopía de contraste de fases, así como

cuantitativamente por el ensayo de tinción con cristal violeta (TCV) que describimos

adelante. Como cultivos testigos usamos cultivos celulares no infectados y observados a

los mismos intervalos de tiempo de incubación.

6.9 Cuantificación de citotoxicidad por el ensayo de tinción con cristal violeta

(TCV)

Como ya se ha mencionado, debido a la propia naturaleza lipídica de la pared de las

micobacterias, ésta no permite la penetración del cristal violeta. Tomando esta

característica como ventaja, desarrollamos este método para cuantificar específicamente

el daño producido por M. tuberculosis.

19

Evaluamos los valores de absorbancia obtenidos en monocapas de células THP-1

con diferente densidad conocida para tener una curva estándar relacionando el número

de células por pozo y el valor de absorbancia producido por el cristal violeta tomado por

las células.

Para probar el método con un agente citotóxico, usamos Tritón X-100, el cual es un

detergente aniónico que disuelve la membrana celular llevando la célula a la muerte. Se

utilizó Tritón X-100 a una concentración de 0.02 a 0.1%.

Para determinar la influencia de las micobacterias en los valores de absorbancia

producidos durante la infección se infectaron por triplicado cultivos de monocitos

humanos THP-1 transformados a macrófagos en microplacas de 24 pozos; se infectaron

con las cepas DR-689 y H37Rv de M. tuberculosis a una MDI hasta de 10:1

(bacterias:celulas) y se incubaron por 6 h en atmósfera de CO2 al 5 %, tiempo suficiente

para permitir la internalización de las bacterias, pero sin producir daño celular. Para

todos los demás casos donde se determinó la citotoxicidad, los cultivos se incubaron

hasta por 72 h. Como cultivo testigo de las buenas condiciones celulares se procesaron

3 pozos con cultivos no infectados para cada tiempo de incubación.

A los cultivos celulares infectados y testigo negativo, se les retiró el medio y se

fijaron con 500 µl por pozo de formalina neutra al 10 % o glutaraldehído al 1% por 24

horas a 4°C. La solución fijadora se retiró y se adicionaron 500 µl de solución acuosa de

cristal violeta al 0.1 % en cada pozo. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente

por 30 minutos con agitación suave. Los microplacas se lavaron por sumersión en un

recipiente con agua corriente por 15 minutos, se dejaron secar a temperatura ambiente

por no mas de 1 h y luego se adicionaron 500 µl de Tritón X-100 al 0.2 % a cada pozo,

incubando las microplacas por 30 minutos a temperatura ambiente con suave agitación

para disolver el colorante. Se tomaron 100 l de cada pozo y se transfirieron a un pozo

de una microplaca de 96 pozos y se determinó la absorbancia de cada muestra a una

longitud de onda de 600 nm en un lector de microplacas (Sigma Diagnostic, EIA Multi-

well reader M-2101, St. Louis, MO).

El análisis cuantitativo de la citotoxicidad sobre los cultivos infectados con M.

tuberculosis, se calculó luego de restar a cada valor de absorbancia el promedio de los

pozos blanco correspondiente a pozos tratados con el procedimiento de tinción pero sin

células. La citotoxicidad se definió como el porcentaje de muerte celular por la siguiente

ecuación:

Control D.O. – Muestra D.O

Porcentaje de Células muertas = X 100

Control D.O

Donde,

Control: cultivo no infectado;

Muestra: cultivo infectado con M. tuberculosis;

D.O.: Densidad óptica equivalente al valor de absorbancia.

20

6.10 Infección de macrófagos con cepas de M. tuberculosis y recuperación de

bacterias para la extracción de RNA

Cultivos de monocitos humanos THP-1 transformados a macrófagos en microplacas

de 24 pozos se infectaron con M. tuberculosis cepa CDC-1551 con una MDI de 1:1 y

se incubaron por 2, 6 y 24 h a 37°C en una atmósfera de 5% CO2 como se describió

anteriormente.

A cada tiempo de incubación, se retiró el medio de cultivo y se agregaron 0.5 ml de

agua destilada estéril a cada uno de los pozos para romper las células. Los cultivos se

incubaron por 5 minutos y se colectó todo el contenido de los pozos de cada tiempo de

infección en un tubo cónico de 50 ml de polipropileno (Labcon, San Rafael, CA.). Los

tubos se centrifugaron a 1000 Xg por 10 minutos a temperatura ambiente. Se descartó el

sobrenadante, mientras que el sedimento conteniendo las bacterias recuperadas tras la

infección a los macrófagos fue utilizado para la extracción de RNA como se describe en

detalle más adelante.

6.11 Extracción de RNA de micobacterias

Para la extracción de RNA bacteriano, la cepa CDC-1551 de M. tuberculosis se

incubó en medio 7H9 suplementado con OADC por 7 días a 37°C o en medio RPMI

suplementado con 10% de suero fetal bovino por 2, 6 y 24 h a 37°C con 5% de CO2.

También se realizó la extracción de RNA de las bacterias infectando macrófagos a los

tiempos de 2, 6 y 24 h de incubación.

El RNA de las bacterias crecidas en los medios de cultivo, como de las recuperadas

de los cultivos celulares fue aislado mediante el sistema FAST-PREP FP 120, BIO 101

Inc, utilizando el estuche FastRNA® Kit – Blue (BIO 101 Inc, Carlsbad, CA) siguiendo

el protocolo dado por el fabricante con algunas modificaciones para optimizarlo como se

describe a continuación. En un tubo con tapón de rosca de 2 ml conteniendo una matriz

de sílica para la ruptura de la pared de la micobacterias, se colocó una perla cilíndrica de

cerámica ¼´´ y se adicionaron 500 µl de CRSR-Blue, 500 l de PAR y 500 l de CIA. A

esta mezcla se adicionaron 200 l de suspensión bacteriana como máximo. El tubo

conteniendo la muestra se colocó en el equipo FAST-PREP y se procesó por 3 ciclos de

45 segundos a una velocidad de 6 m/seg con intervalos en hielo de 1 minuto. Al término

de los ciclos de lisis, se incubó en hielo por 5 minutos, se centrifugó a 17,000 Xg por 15

minutos y la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo eppendorf de 1.5 ml. Se

adicionaron 500 l de CIA a la fase acusa, se agitó por 10 segundos y se centrifugó a

17,000 Xg por 2 minutos para separar las fases. La fase superior se pasó a un tubo

nuevo teniendo mucho cuidado de no contaminar la muestra con la interfase, se

adicionaron 500 l de DIPS mezclando por inversión e incubando la mezcla por 2

minutos a temperatura ambiente. Luego se centrifugó a 17,000 Xg por 5 minutos para

21

obtener el RNA precipitado. El precipitado se lavó con 500 l de la solución SEWS,

centrifugando a 17,000 Xg y el sobrenadante se removió para dejar secar la muestra por

15 minutos. Finalmente la muestra de RNA aislado se disolvió en 50 l de SAFE. Para

eliminar restos de DNA en nuestra muestra, la sometimos a digestión con DNAsa (RQ1

RNAse-Free Dnase – Promega, Madison, USA) a una concentración de 1U/g de RNA

a 37°C por 30 minutos. La concentración de RNA fue estimada como se describe más

adelante.

Un método alternativo descrito por Mahenthiralingam (1998) y con modificaciones

realizadas en el laboratorio para aislar el RNA con mejores rendimientos fue utilizado:

las micobacterias se cosecharon por centrifugación a 3,000 Xg por 10 min.

Posteriormente se resuspendieron en 1-2 ml de Tween salino y se transfirieron a un tubo

de 2 ml para ser centrifugadas a 17,000 Xg por 1 min. Se removió el sobrenadante, se

añadió 1 ml de solución GEB y se resuspendió usando una micropipeta. Se transfirió 1

ml de la suspensión a los tubos del Fast-RNA kit, los cuales se sometieron en el equipo

Fast Prep (FP120, BIO 101 Inc., Carlsbad, CA) a 3 ciclos de lisis a velocidad de 6 m/seg

por 20 segundos con intervalos en hielo de 1 min. La muestra procesada se centrifugó a

17,000 Xg por 1 min y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. Para recobrar lo

que se quedó atrapado entre las perlas, se adicionaron 0.8 ml de cloroformo al tubo con

las perlas, se resuspendió y fue centrifugado a 17,000 Xg por 1 min. La fase acuosa se

recuperó y se juntó con el sobrenadante recobrado previamente. Se añadió 1 volumen de

fenol neutro:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se agitó hasta que se formó una

emulsión uniforme. Luego se centrifugó a 17,000 Xg por 3 min y se recuperó la fase

acuosa en un tubo nuevo, cuidando de no tomar nada de la interfase. Se adicionó 1

volumen de cloroformo a la fase acuosa y se agitó hasta formar una emulsión

homogénea y se centrifugó a 17,000 Xg por 1 min. La fase acuosa resultante fue

transferida a tres tubos nuevos (300 µl por tubo) y se adicionaron 3 volúmenes de etanol

al 95% (900 µl) previamente enfriado a –20°C; se mezcló por inversión y se colocaron

los tubos a –70°C por 30 min. Al término de este tiempo, la muestra se centrifugó a

17,000 Xg por 20 min. El sobrenadante se removió cuidadosamente y se añadieron 0.5

ml de etanol al 70%. La muestra se centrifugó brevemente, se retiró el etanol y se dejó

secar por 10 min (sin dejarla secar por completo para facilitar la resuspensión). El

precipitado se disolvió en 400 µl de GEB fresco. A partir de aquí se realizó un segundo

proceso de purificación, repitiendo los pasos descritos anteriormente, hasta dejar la

muestra luego del lavado con los alcoholes. El precipitado se solubilizó en 100 µl de la

solución de digestión para DNAsas (Promega, Madison, USA) por 10 min. Luego, se

añadieron 10 unidades de DNAse libre de RNAses y se incubaron por 1 h a 37° C. Para

remover las DNAsas, se colocaron 100 µl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y se

repitió nuevamente el proceso de purificación de RNA. El precipitado formado después

del paso del etanol se disolvió con agua-DEPC (diethil pirocarbonato) (de 10 a 50 µl) y

se almacenó a –70°C hasta su uso.

22

6.12 Extracción de RNA de macrófagos

El RNA de macrófagos se extrajo para utilizarlo como testigo negativo para las

reacciones de PCR. Se probaron cada uno de los pares de iniciadores diseñados para los

genes de interés de M. tuberculosis en reacciones de PCR con el RNA de macrófagos

para comprobar que no hubiera amplificación producida por alguna secuencia homóloga

presente en el RNA de los macrófagos y que pudiera dar falsos positivos en los ensayos

de infección en macrófagos. Se trabajó con la línea celular de monocitos humanos THP-

1 transformadas a macrófagos bajo las condiciones descritas previamente. La monocapa

se lisó con 100 l de agua destilada por 5 minutos; se recuperó la suspensión y se

mezcló con 1 volumen de Tween salino y se prosiguió con el protocolo alternativo de

extracción de RNA de Mahenthiralingam (1998) modificado ya descrito.

6.13 Electroforesis en agarosa para RNA

El RNA aislado fue visualizado en geles de agarosa al 1.5% en condiciones

desnaturalizantes. La agarosa se disolvió en solución MOPS 1X preparada con agua

DEPC adicionado con 0.66 M de formaldehído en un volumen final de 30 ml.

Diez microlitros de cada muestra fueron mezclados con 0.2 l de bromuro de etidio

(10 mg/ml) (Research Organic Inc., Cleveland, OH.) y 2 l de solución de carga 5X.

Las muestras se cargaron en el gel y se corrieron en una cámara de electroforesis

horizontal (E-C minicel, Holbrook, NY, USA) por 45 minutos con una fuente de poder

(Fotodyne., Ney Berlin, WI.) a 80 V; la visualización se hizo en un emisor de luz UV

(Fotodyne., Ney Berlin, WI.).

6.14 Determinación de la concentración de RNA

La concentración de RNA fue determinada en un espectrofotómetro UV/VIS marca

(Perkin Elmer, MBA 2000, Norwalk, CT). Se tomó 1 l de la muestra y se mezcló con

49 l de agua milli Q para quedar a una dilución de 1:50, se colocó en la celda y se

realizó la lectura de absorbancia a una longitud de onda de 260 nm.

23

6.15 Selección de genes

Se seleccionaron genes específicos de M. tuberculosis para analizar su expresión en

las diferentes condiciones que estudiamos. La selección se basó en dos criterios: a)

genes del género Mycobacterium que han sido sugeridos como probables factores de

virulencia, pero aún sin función determinada y b) genes de virulencia presentes en otros

microorganismos patógenos y que pudieran tener secuencias homólogas y por lo tanto

funciones similares en M. tuberculosis.

La búsqueda de información sobre los genes sugeridos como probables factores de

virulencia y la secuencia correspondiente a estos genes, se realizó en la página web

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html.

De los genes con función desconocida, pero con probable función en virulencia de

acuerdo a la base de datos del genoma micobacteriano se buscaron en el sitio de The

Wellcome Trust Sanger Institue http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/Genome

Page3.spl?database=gmt.

Los pares de iniciadores para amplificar secuencias específicas correspondientes a

los genes seleccionados por PCR, se diseñaron mediante el programa “Primer 3”

localizado en la pagina web http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_

www.cgi.

Para comprobar la especificidad de los iniciadores diseñados para cada uno de los

genes realizamos una búsqueda “Blast” en el genoma de M. tuberculosis en

http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis y en http://tigrblast.tigr.org/cmr-blast/

Los iniciadores de 14 genes seleccionados en base a una probable función de virulencia

(tabla 1) se sintetizaron por MWG, Biosource (Nivelles, Bélgica).

Los genes se identificaron de acuerdo a la nomenclatura dada en el sitio de TIGR.

Los genes a los cuales no se les ha definido función se identificaron como MT0003,

MT0024, MT0040, MT0259, MT0655, MT0876, MT1524. El resto de los genes

analizados son: MT3917 (erp), MT2783 (sigB), MT3989 (Esat6), MT1525 (InvB),

MT2416 (plcA), MT2415 (plcB), MT2414 (plcC).

MT3989 (Esat6) fue utilizado como control positivo de expresión constitutiva

(Dubnau y Smith, 2003; Pollock y Andersen, 1997; Mariani et al., 2000) y MT2416

(plcA), utilizado como control positivo de expresión inducible dentro de macrófagos

(Raynaud et al., 2002).

24

Nº Gene Nombre Iniciadores Tamaño

1 MT0003 S/I 5´-CCGAAGTACACGTGATGTGG- 3´

5´-GCGCAACACCCTCTCATATT- 3´

171

2 MT0024 S/I 5´-CCGAACTCGACATTCTCCAT- 3´

5´-GCCATACCGGTTATCACGTC- 3´

154

3 MT0040 S/I 5´-GTCATCACCTACCGCAACCT- 3´

5´-ATCCCAACGGGTCATACAGA- 3´

199

4 MT0259 S/I 5´-CAAAAACTGGGGACAGGTTC- 3´

5´-GACCTGGTTGACCCGTAAGA- 3´

155

5 MT0655 S/I 5´-ATCCGTTGCCGATATGGA - 3´

5´-GACCCGAATGATCTCCACAC- 3´

214

6 MT0876 S/I 5´-CGACTTCGAGCACTTTCTCC- 3´

5´-TACGTCGCTGGACAGCAATA- 3´

151

7 MT1524 S/I 5´-GCCAGGCTTCTGAATACGTG- 3

5´-CCCAGCAAACGAGTACAACA- 3´

161

8 MT3917 erp 5´-ATCCTCGGTGATCCAACACT- 3´

5´-GACGGCATTAGCACACCTTT- 3´

152

9 MT2783 sigB 5´-GGCATTCCAATCGACAAGAT- 3´

5´-CGGATGTCGGTGTGTAACAG- 3´

173

10 MT3989 esat6 5´-ATGACAGAGCAGCAGTGGAA- 3´

5´-GTCCCATTTTTGCTGGACAC- 3´

177

11 MT1525 invB 5´-AGGCCGTCGAATATGTGATT- 3´

5´-CGGCGTTGTACTGATCACC - 3´

204

12 MT2416 plcA 5´-ACTCCTCGGAATGTCACGTC- 3´

5´-TTCTCCTGCATCAGCAACAC- 3´

168

13 MT2415 plcB 5´-ACCTGCCCATTCACTACCTG- 3´

5´-TGTAGTGCTGCAGAGGTTGG- 3´

180

14 MT2414 plcC 5´-TAACGGGTATGTGGGCAGTT- 3´

5´-GAATGACGGATGTTCGGACT- 3´

172

Tabla 1. Lista de iniciadores utilizados. El nombre de identificación de cada gene

corresponde al dado por “The Wellcome Trust Sanger Institue” para el genoma de M.

tuberculosis cepa CDC-1551. (S/I = sin función definida).

25

6.16 Producción de DNA complementario (cDNA)

A partir del RNA obtenido de las micobacterias cultivadas en el medio 7H9 o RPMI-

1640, de las micobacterias recuperadas de los cultivos infectados y de RNA de los

macrófagos sin infectar, se sintetizaron los cDNA por la reacción de transcriptasa

reversa (RT).

La reacción de Transcriptasa Reversa se realizó con el sistema ImProm-II (Promega

A3800; Madison, USA). La mezcla de reacción incluyó 1 l de hexámeros al azar (0.5

g/l), 1 l de RNA micobacteriano (100 ng/µl) y 3 µl de agua libre de nucleasas. Se

colocó en el termociclador (PCR Sprint, Termo–Hybaid; Waltham, MA) a 70ºC por 5

minutos e inmediatamente después se colocaron en hielo por 5 minutos mínimo.

Durante este tiempo se preparó la mezcla de transcriptasa reversa: 5.5 l de agua libre

de nucleasas, 4 l de solución de trabajo 5x (Tris-HCl 250 mM pH 8.3, KCl 375 mM y

MgCl2 15 mM), 3 l de MgCl2 25 mM; 1 l de la mezcla de dNTPs (10 mM de cada uno

dATP, dTTP, dGTP, dCTP); 0.5 l de inhibidor de ribonucleasas (20 U/ l) y 1 l de

transcriptasa reversa (20 U/ l). Esta mezcla se adicionó a la preparación de RNA y se

colocó en el termociclador a 25ºC por 5 min, 42ºC por 1 hora y 70ºC por 15 min.

6.17 Reacción en cadena de la polimerasa para obtener los amplicones

correspondientes a cada gene analizado

La reacción en cadena de la polimerasa se realizó en 25 µl de mezcla conteniendo

14.4 l de agua Milli Q, 2 l de amortiguador de reacción 10X (KCl 500 mM, Tris-HCl

pH 8.3 100 mM, gelatina 10 g/ml); 1 µl de MgCl2 20X (30mM); 3.20 l de la mezcla

de dNTPs de 5 l, 3 l del DNAc obtenido en la transcripción reversa; 0.2 l de DNA

Taq polimerasa (5 U/l) (Amplificasa® ,Biotecsa, México D.F.) y utilizando 1.2 l (5

M) de cada par de los iniciadores mostrados en la tabla 1 en reacciones independientes.

Las condiciones de amplificación fueron: un tiempo inicial de desnaturalización de 6

minutos a 96°C seguido de 35 ciclos de 96, 55 y 72º C por 30 segundos para cada

temperatura y un tiempo final de extensión de 10 minutos a 72º C.

6.18 Electroforesis en agarosa para DNA

Los amplicones se observaron en geles de agarosa al 1.5 % preparado en Tris-Borato-

EDTA (TBE).

26

Se mezclaron 10 µl de cada muestra con 0.2 l de bromuro de etidio (10 mg/ml) y 2

l de solución de carga 5x (Ficoll 15% p/v, EDTA 6 mM pH 8.0, azul de bromofenol

0.25% y cyanol xileno 0.25 % en agua-DEPC). Las muestras se cargaron en el gel y se

corrieron en una cámara de electroforesis horizontal (Termo EC minicel, Waltham,

MA) por 45 minutos con una fuente de poder Fotodyne (New Berlin, WI.) a 80 V; la

visualización se hizo en un emisor de luz UV (Fotodyne). En cada gel se incluyó un

carril con 5 l del marcador de peso molecular para DNA de rango bajo pBR322

digerido con MspI (0.05 g/l) (Biotecsa, México).

27

7. RESULTADOS

7.1 Densidad bacteriana de los cultivos congelados de M. tuberculosis

Se congelaron los viales de los cultivos de las diferentes cepas de M. tuberculosis

para asegurarnos de mantener las cepas con las mismas características biológicas durante

todo el transcurso del proyecto. Estos cultivos conservados a -70°C se utilizaron para

realizar las infecciones de cultivos celulares, por lo que se determinó la densidad

bacteriana post-congelación como se describe en material y métodos. La densidad de los

cultivos de M. tuberculosis fueron: para la cepa H37Rv de 8.1 x 105 ufc/ml, para la cepa

CDC-1551 de 4.2 x 108 ufc/ml y para la cepa DR-689 1.8 x 108 ufc/ml. Estos datos

permitieron realizar las infecciones a los cultivos celulares con una densidad definida de

inóculo.

7.2 Actividad citotóxica sobre cultivos celulares de células THP-1 por cepas de M.

tuberculosis

La capacidad de diferentes cepas de M. tuberculosis para producir daño sobre los

cultivos de células THP-1 fue analizada. Se utilizaron diferentes inóculos y diferentes

tiempos de incubación. Se encontró que tanto la cepa CDC-1551, como la cepa H37Rv

produjeron un efecto citotóxico sobre las monocapas celulares. La cepa DR-689, con un

reducido efecto citotóxico (Hernández-Vera, 2003), causó un daño menor, observándose

estos cultivos con apariencia semejante a los cultivos no infectados. Este efecto dependió

del tiempo de incubación y del inóculo bacteriano utilizado. El efecto tóxico se manifestó

en los cultivos celulares infectados como agregación celular en varias zonas y áreas sin

células, lo cual no se observó en los cultivos testigo no infectados.

Se comparó el efecto citotóxico de las cepas de M. tuberculosis CDC-1551, H37Rv y

DR-689, inoculando células THP-1 transformadas a macrófagos a una MDI de 0.1:1

(bacteria:célula). La observación se realizó cada 24 horas por microscopía de contraste

de fases.

28

Como puede observarse en la figura 1, las monocapas de los cultivos testigos no

infectados se conservaron íntegros durante todo el experimento. Las células THP-1

infectadas con la cepa CDC-1551 mostraron una destrucción parcial a las 24 h de

incubación post infección y el efecto se incrementó con el paso del tiempo. A las 72 h

de incubación las zonas sin células aumentaron.

La cepa H37Rv produjo también un evidente daño sobre las células en cultivo, el cual

también estuvo relacionado con el tiempo de incubación. En la figura 1 puede

observarse las zonas de aglomeración celular, así como áreas sin células debidas a lisis.

En tanto, los cultivos infectados con la cepa DR-689 mostraron un daño menor aún

después de 72 h de incubación. Las imágenes obtenidas de estos cultivos fueron muy

similares a las de los cultivos no infectados.

Figura 1. Efecto citotóxico de M. tuberculosis dependiente de la virulencia de las cepas.

Monocapas de células THP-1 infectadas con las cepas de M. tuberculosis a una

multiplicidad de infección de 0.1:1 (bacteria:células). Recuadros A, B, C y D representan

cultivos a 24 h post infección; recuadros E, F, G y H cultivos a 72 h post infección. (A y E)

cultivos testigo sin infectar; (B y F) cultivos infectados con la cepa CDC-1551; (C y G)

cultivos infectados con la cepa H37Rv; (D y H) cultivos infectados con la cepa DR-689.

A B C D

E F G H

29

Figura 2. Efecto citotóxico de M. tuberculosis dependiente del inóculo bacteriano. Células

THP-1 infectados con M. tuberculosis CDC-1551 por 72 h con diferente multiplicidad de

infección (MDI). A) Cultivo testigo no infectado; B) Células infectadas con una MDI de

0.1:1 (bacteria:célula); C) Células infectadas con una MDI de 1:1 y D) Células infectadas

con una MDI de 10:1.

A B

C D

30

Cuando las células THP-1 se infectaron con la cepa CDC-1551 de M. tuberculosis a una

MDI de 10:1 (bacteria:célula) se observó una destrucción de los cultivos a las 24 h de

incubación. Inóculos menores de la misma cepa con una MDI de 1:1 y 0.1:1 produjeron un

menor daño sobre los cultivos celulares, con diferencias notablemente apreciables al

microscopio de luz. A las 72 h de incubación los cultivos infectados con una MDI de 1:1 y

0.1:1 presentaron una destrucción parcial con relación al inóculo (figura 2).

7.3 Cuantificación de citotoxicidad por el ensayo de TCV, desarrollo y

estandarización del método

De los valores de absorbancia obtenidos en monocapas de células THP-1

relacionando el número de células por pozo y el valor de absorbancia producido, se

obtuvo una relación lineal entre las dos variables (Fig. 3). El análisis de correlación y

regresión mostró una pendiente de 0.2019 con un valor de “r2” de 0.9465. El proceso de

fijación de los cultivos celulares con formalina o glutaraldehído no produjo cambios en

los valores de absorbancia obtenidos en los ensayos. Estos resultados confirman la

utilidad del ensayo de TCV para determinar la viabilidad o densidad de cultivos

celulares.

El detergente aniónico Tritón X-100 indujo un claro efecto como agente citotóxico; el

análisis de regresión y correlación de los datos da un valor a la pendiente de 2821.5 y

una “r2” de 0.9865 (Fig. 4).

31

Figura 3. El número de células en cultivo determinó los valores de absorbancia

obtenidos utilizando el ensayo de TCV. En el recuadro se puede ver una microplaca

donde se realizó el ensayo, cada columna de la microplaca corresponde a cada valor

promedio mostrado en la gráfica. Cada símbolo representa el valor promedio de 3

experimentos independientes hechos por triplicado.

0

0.4

0.8

1.2

0 1 2 3 4 5 6

NÚMERO DE CÉLULAS POR POZO (105)

AB

SO

RB

AN

CIA

600 n

m

32

Figura 4. Evaluación de citotoxicidad de Tritón X-100 sobre cultivos de la línea celular

THP-1 mediante el ensayo TCV. Cada símbolo representa el promedio de dos

experimentos hechos por triplicado.

0

20

40

60

80

100

0 0.04 0.08 0.12

TRITON X-100 [%]

PO

RC

EN

TA

JE

DE

CÉ

LU

LA

S M

UE

RT

AS

33

Para evaluar este método en la cuantificación del efecto citotóxico producido por M.

tuberculosis, se analizaron los valores de absorbancia producidos por M. tuberculosis

per se en el modelo de infección. Monocapas de células THP-1 se infectaron con un

número variable de micobacterias con una multiplicidad de infección (MDI) hasta de

10:1 (bacterias:celulas). Los cultivos infectados se incubaron por 6 horas para permitir

la internación de bacterias dentro de las células y entonces se realizó el ensayo de TCV.

En este punto inicial de la infección las micobacterias no han producido ningún efecto

sobre las monocapas. La lectura de la absorbancia para todas las diferentes densidades

bacterianas fueron muy similares y no hubo diferencias significativas por ANOVA una

vía (p ≤ 0.05). Este resultado sustenta el uso del ensayo de TCV para cuantificar la

citotoxicidad producida por M. tuberculosis debido a que los bacilos no son teñidos y no

producen valores de fondo de tal manera que los valores de absorbancia corresponden

únicamente a las células teñidas.

7.4 Cuantificación de la citotoxicidad producida por M. tuberculosis mediante el

ensayo de TCV

Comparamos cuantitativamente mediante el ensayo de TCV, la citotoxicidad

producida por M. tuberculosis cepas H37Rv y DR-689 sobre monocapas de células

THP-1. Los valores obtenidos son mostrados en la tabla 2.

Tiempo de

incubación

M. tuberculosis

DR-689 H37Rv

24 h 0 10.50

72 h 0 50.52

Tabla 2. Porcentaje de células muertas = citotoxicidad

34

Con los resultados de citotoxicidad se obtuvo la optimización del modelo celular de

infección con micobacterias. Se definió el inóculo y tiempo de incubación adecuados

para realizar los ensayos de recuperación del RNA de las bacterias infectantes y

analizar la expresión de algunos de los genes bacterianos en estas condiciones. Se

determinó que la MDI de 1:1 permitió una buena interacción de las micobacterias con

las células, produjo un efecto citotóxico parcial y permitió tener un número suficiente de

bacterias para realizar el análisis de expresión.

7.5 Extracción de RNA

La calidad y cantidad de RNA obtenida de los cultivos micobacterianos crecidos en

medio 7H9 o de las bacterias recuperadas de los cultivos infectados fue buena (Figura 5)

y suficiente para realizar los ensayos. Para realizar la producción de cDNA, la

concentración de RNA se ajustó a 100 ng/µl para todos los ensayos. Encontramos que

el método de Mahenthiralingam (1998) con las modificaciones realizadas en el

laboratorio produjo un RNA de mejor calidad y mayor pureza que el obtenido por el

método comercial del kit FastRNA® Kit–Blue.

Figura 5. RNA obtenido de los cultivos de micobacterias.

El RNA extraído y sometido a electroforesis en un gel de

agarosa desnaturalizante al 1.5 % a 80 volts y teñido con

bromuro de etidio. Las flechas muestran las bandas de

RNA obtenida durante nuestros ensayos.

35

7.6 Selección de genes para amplificar

A través de la búsqueda detallada en la sección de metodología, se seleccionó un

número limitado de genes que podrían ser analizados en el presente trabajo. De estos

genes, había algunos con información sobre su probable función en el metabolismo y/o

virulencia. En tanto para otros no se ha definido su función. Los genes están enlistados

en la tabla 3.

NOMBRE

GENE

REGISTRO

TIGR FUNCION

RT-

PCR

ahpC MT2503 Sobrevivencia macrófagos +

35 kDa MT2815 No identificada +

eis MT1184 Sobrevivencia intracelular +

erp MT3917 Atenuación de virulencia por disrupción de gene ND

rpoB MT0695 Resistencia a rifampicina +

rpoV MT3179 Desconocido -

esat6 MT3989 Desconocido, induce buenos niveles de inmunidad +

sigB MT2783 Control regulón de fase estacionaria. Resistencia a éstres +

sigA MT2777 Contribuyen a inicio de transcripción. Sobreviviencia celular +

invA MT1524 Hemolítica. Similar a p60 de Listeria +

invB MT1525 Hemolítica. Similar a p60 de Listeria +

mce –1 MT0178 Factor de colonización (Invasión celular) ND

mycP1 Proteína. Extracelular presente en membrana -

umaA2 MT0486 Ácido micólico sintasa. Infección persistente +

SN MT0003 Desconocida -

SN MT0024 Desconocida -

SN MT0040 Desconocida -

SN MT0259 Desconocida -

SN MT0655 Desconocida -

SN MT0876 Desconocida -

SN MT0876 Desconocida -

SN MT1524 Desconocida -

Tabla 3. Selección de genes. La búsqueda se realizó en las bases de datos de genes de

M. tuberculosis con probable función de virulencia reportada y con función no conocida.

36

De los genes enlistados en la tabla 3 se realizó una segunda selección para tener en el

ensayo, testigos positivos constitutivos y testigos de expresión inducible. En esta

segunda selección, se definieron los genes a ser analizados y se muestran en la tabla 1

junto con los iniciadores correspondientes para cada gene en la sección de material y

métodos.

7.7 Especificidad de los iniciadores diseñados

Para comprobar que había un sólo amplicón para cada gen específico, el análisis de

homología de estos genes con el genoma micobacteriano se realizó mediante una búsqueda

Blast en los sitios, http://www.sanger.ac.uk y http://tigrblast.tigr.org. Solo se encontró un

sitio homólogo en todo el genoma de M. tuberculosis para cada uno de los iniciadores, el

cual correspondió específicamente al gene blanco para el cual fue diseñado cada par de

iniciadores, por lo que cada par de iniciadores produciría un solo amplicon a partir de M.

tuberculosis.

Para corroborar que los iniciadores habían sido diseñados correctamente y probar que

no hubiera amplificaciones inespecíficas se probaron todos los iniciadores, indicados en

la tabla 1, con DNA producto de las extracciones de bacterias crecidas en medios de

cultivo, obteniendo amplificación de todas ellas. En todos los casos se obtuvo un solo

amplicon del tamaño esperado para cada par de iniciadores (Tabla 4).

Para corroborar que la posible presencia de cDNA proveniente de las células THP-1

no produjera falsos positivos en la reacción de PCR a partir de las bacterias recuperadas

tras la infección, se realizó un proceso de amplificación con cada par de iniciadores

descritos en la tabla 1 usando como templado el cDNA producto de la extracción de

RNA del cultivo de las células THP-1. No obtuvimos amplificación de ninguno de ellos;

con esto se descartó posibles productos debidos a contaminación de RNA de macrófagos

en nuestros ensayos.

7.8 Expresión de genes analizados

Se obtuvo cDNA a partir del RNA total obtenido de las micobacterias cultivadas por

7 días en medio Middlebrook 7H9, así como de las bacterias cultivadas en medio RPMI

completo, y de las bacterias recuperadas tras la infección a macrófagos a los tiempos de

incubación de 2, 6 y 24 h. La amplificación de las secuencias de los genes seleccionados

se realizó con los pares de iniciadores enlistados en la tabla 1.

A partir del RNA obtenido de las micobacterias crecidas en el medio de cultivo

RPMI a los tiempos de incubación de 2, 6 y 24 h se obtuvieron amplicones de la

longitud esperada para los siguientes genes: MT0003, MT0024, MT0040, MT0655,

MT0876, MT1524, MT3917 (erp), MT2783 (sigB), MT3989 (Esat6), MT2416 (plcA),

37

MT2415 (plcB), MT2414 (plcC) y MT0259, como se muestra en la tabla 4. Cuando se

analizó la expresión de estos mismos genes en micobacterias incubadas por 7 días se

encontró que estos mismos genes también se expresaron con excepción del gene

MT0259, del cual no se obtuvo amplicon correspondiente al gene. El gene MT0259

corresponde a una proteína con probable función de oxidoreductasa.

La expresión de los genes de las micobacterias durante las infecciones a los

macrófagos a tiempo de 2 h de incubación, fue evidenciado por los amplicones

correspondientes a los genes MT0003, MT0024, MT0040, MT0259, MT0655, MT0876,

MT1524, MT3917 (erp), MT2783 (sigB) y el gene MT3989 (esat6). En este tiempo de

incubación la banda observada correspondiente al gene MT0024 presentó una mayor

intensidad que a las 6 y 24 h. También a este tiempo de incubación de 2 h, la intensidad

de la banda del gene MT2416 (plcA), fue mayor que las bandas correspondientes a los

genes MT2415 (plcB) y MT2414 (plcC). La intensidad de las bandas de los amplicones

a las 24 h de incubación fue mayor para la mayoría de los genes a excepción de los

mencionados previamente (Fig. 6; tabla 4).

El gene testigo de expresión constitutiva MT3989 (esat6) se expresó en todas las

condiciones estudiadas. El gene testigo inducible MT2416 (plcA) se expresó como se

esperaba a mayor intensidad en las primeras horas de infección y disminuyó al paso del

tiempo, estos resultados concuerdan con los antecedentes de Reynaud et al., 2002.

38

Nº Registro

TIGR

Nombre

Gene I-2 I-6 I-24 R-2 R-6 R-24 Mdd

Tamaño

Amplicon

1 MT0003 S/I + + + + + + + 171

2 MT0024 S/I + + + + + + + 154

3 MT0040 S/I + + + + + + + 199

4 MT0259 S/I + + + + + + - 155

5 MT0655 S/I + + + + + + + 214

6 MT0876 S/I + + + + + + + 151

7 MT1524 S/I + + + + + + + 161

8 MT3917 erp + + + + + + + 152

9 MT2783 sigB + + + + + + + 173

10 MT3989 esat6 + + + + + + + 177

11 MT2416 plcA + + + + + + + 168

12 MT2415 plcB + + + + + + + 180

13 MT2414 plcC + + + + + + + 172

Tabla 4. Productos amplificados por PCR de los genes de M. tuberculosis cepa

CDC1551 con probable función de virulencia reportada y aquellos con función no

conocida. La reacción de PCR se realizó a partir del cDNA obtenido de M. tuberculosis

infectando macrófagos por 2 h (I-2), 6 h (I-6) o 24 h (I-24), así como de micobacterias

cultivadas en medio RPMI completo por 2h (R-2), 6 h (R-6) o 24 h (R-24) o en medio

Middlebrook 7H9 completo por 7 días (Mdd). El tamaño del amplicon está dado en pb.

39

Fig. 6. Expresión de genes de M. tuberculosis CDC1551. Amplicones de genes de

cDNA proveniente del RNA micobacteriano obtenido de bacterias crecidas en medio de

cultivo 7H9 por 7 días o bacterias incubadas en RPMI-1640 o recuperadas después de

infectar macrófagos humanos a las 2, 6 y 24 h. Como marcador de peso molecular se

utilizó pBR322 digerido con MspI (Biotecsa). Valores en pb.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Cultivo 7H9 (7 días)

Infección 2 h

Infección 24 h

Infección 6 h

RPMI 2 h

RPMI 24 h

RPMI 6 h

307 pb 242 201 160

171 154 199 155 214 151 161 152 173 177 168 180 172

003 024 040 259 655 876 1524 3917 2783 3989 2416 2415 2414

erp sigB esat6 plcA plcB plcC

Tamaño del amplicon (pb):

Nomenclatura Sanger de gene (MT):

Nombre de gene:

307 242 201 160

307 242 201 160

307 242 201 160

307 242 201 160

307 242 201 160

307 242 201 160

40

8. DISCUSIÓN

A pesar de los grandes avances en el conocimiento de la biología de M. tuberculosis

obtenido en los últimos 100 años, no se han esclarecido todos los factores que están

involucrados en la virulencia de la bacteria. M. tuberculosis no posee factores de

virulencia únicos o particularmente relevantes como los conocidos en otras bacterias

patógenas como por ejemplo Clostridium botulinum que produce una de las toxinas más

potentes y letales responsable del botulismo, o la de C. tetani que produce la

tetanopasmina (Henry, 1917). También podemos citar la hialuronidasa de

Staphylococcus aureus (Rautela y Abramson, 1973), la toxina eritrogénica producida

por los bacterias del genero Streptococcus spp (Stock, 1939) y las enterotoxinas

termolábil (LT) y termoestable (ST) de Escherichia coli (Karch et al., 2005; Kunkel y

Robertson, 1979).

En el mecanismo patogénico de M. tuberculosis están involucrados múltiples factores

bacterianos que interactúan en forma muy compleja con las células del hospedero.

Generalmente el hospedero es capaz de inclinar la balanza a su favor y controlar la

infección, sin embargo si el balance se rompe el bacilo puede replicarse y causar daño

tisular ya sea por productos propios de la bacteria o por una inducción de la respuesta

inmune que en su intento de controlar la infección lesiona los tejidos.

Para el estudio del mecanismo patogénico de M. tuberculosis se han utilizado tanto

modelos in vivo como modelos in vitro. Los modelos de animales de experimentación

son muy útiles porque permite estudiar todas las etapas de la infección, además de que

dan una información más cercana a lo que ocurre en el humano, sin embargo el

mantener los animales es costoso y laborioso debido al manejo y a la alimentación,

aunado al problema de las restricciones éticas que hay en la actualidad. Por otro lado los

modelos in vitro utilizan cultivos de diversas líneas celulares que resultan ser más fáciles

de trabajar manteniéndolas en un medio ambiente controlado, suelen ser más

económicos y proporcionan suficiente información válida que puede ser utilizadas para

descifrar el mecanismo de patogénesis micobacteriano. Dentro de los modelos in vitro

están los que utilizan cultivos de macrófagos, los cuales constituyen la primera línea de

defensa natural contra M. tuberculosis o neumocitos que son células del epitelio

pulmonar donde generalmente inicia la infección.

Con estos modelos se ha logrado obtener información muy valiosa sobre productos

bacterianos o actividades biológicas de M. tuberculosis que pueden estar involucrados

con la virulencia de la bacteria. Birkness et al. (1999) y luego independientemente

Bermudez et al. (2002) examinaron eventos tempranos de la infección por M.

tuberculosis y de la translocación de las bacterias en una bicapa celular artificial que

41

recuerda el epitelio pulmonar. Trabajos de infección a monocapas macrófagos, se han

enfocado a analizar el papel de genes específicos como la fosfolipasa C en la virulencia

de M. tuberculosis (Raynaud et al., 2002, Hernández-Vera, 2003). Otros trabajos como

los de Riendeau y Kornfeld (2003) y Danelishvili et al. (2003) reportaron daño a

cultivos celulares por inducción de apoptosis a células THP-1 en respuesta a la infección

por micobacterias. Dobos et al., en el 2000, reportaron que durante la infección de

células epiteliales de pulmón de la línea A549 con M. tuberculosis la necrosis celular

precede a la apoptosis y es la principal causante del daño sobre las monocapas celulares.

En ensayos similares se ha determinado que la citotoxicidad para células epiteliales de

pulmón es una virulencia asociada al fenotipo de M. tuberculosis como lo reportó

McDonough et al. (1995).

En este estudio se determinó el grado de citotoxicidad producido por tres diferentes

cepas de M. tuberculosis sobre una monocapa de células y se analizó la expresión de

algunos genes bacterianos durante la infección celular que pudieran estar involucrados

en la virulencia de M. tuberculosis.

Se utilizó la línea celular de monocitos humanos THP-1, los cuales pueden ser

diferenciados a macrófagos cuando se adiciona PMA al cultivo. Los monocitos de la

línea THP-1 crecen en suspensión pero, al diferenciarse se adhieren a las cajas de cultivo

y adquieren características semejantes a macrófagos primarios tanto en morfología como

en fisiología (Asseffa A, 1993) y se han utilizado en diversos estudios como modelo de

infección in vitro con M. tuberculosis (Shattock et al., 1993; Friedland et al., 1993;

Zhang et al., 1998; Lee y Horwitz, 1999; Tchou-Whong et al., 1999; Agranoff et al.,

1999; Kusner y Adams, 2000; Miller y Shinnick, 2000; Armitige et al., 2000; Riendeau

y Kornfeld, 2003).

Para los ensayos de citotoxicidad su usaron diferentes cepas de M. tuberculosis: a)

H37Rv, cepa virulenta de referencia (Cole et al., 1998; Brosch et al., 1998; Philipp et

al., 1996); b) CDC-1551, cepa considerada más virulenta que H37Rv (Valway et al.,

1998, Bishai et al., 1999), c) DR-689, es un aislado clínico proveniente del Laboratorio

Nacional de Referencia para la tuberculosis en Winnipeg, Canadá. Esta cepa carece del

locus completo de fosfolipasa C en forma natural y es reportada de baja citotoxicidad

para células en cultivo (Hernández-Vera, 2003), por lo que resultaba un buen testigo de

infección de baja virulencia para comparar contra el efecto citotóxico producido por las

cepas virulentas H37Rv y CDC-1551.

En los ensayos de infección de la monocapa de los macrófagos THP-1, las cepas

H37Rv y CDC-1551 tuvieron actividad citotóxica a las 24 horas post infección cuando

se infectó a una MDI de 10 bacterias por cada célula. La destrucción del cultivo fue casi

completa. En cambio la cepa DR-689 no produjo efecto visible a la monocapa del

cultivo. Estas observaciones confirman trabajos previos, donde también se evaluó la

infección de macrófagos con cepas de M. tuberculosis con diferencia en su virulencia

(Silver et al., 1998; Raynaud et al., 2002; Dobos et al., 2000; Danelishvili et al., 2003;

Keane et al., 1997; Zhang et al., 1998; Hernández-Vera, 2003).

Al disminuir la MDI (1:1 y 0.1:1), el efecto producido por las cepas H37Rv y CDC-

1551 en los cultivos fue menor. El efecto se manifestó como aglomeración celular y

pérdida parcial de la integridad de la monocapa, sin embargo se podían observar áreas

sin aparente daño. Los cultivos infectados con la cepa DR689 con el mismo inóculo no

mostraron daño en la monocapa de macrófagos.

42

Con la finalidad de determinar cuantitativamente el efecto citotóxico observado, se

desarrolló un método colorimétrico basado en la tinción con el colorante cristal violeta.

Gillies (1986) usó este colorante para cuantificar el número de células en una monocapa

celular como una función de los valores de absorbancia del colorante tomado por las

células. El método ha sido utilizado con modificaciones para un variado número de

aplicaciones relacionadas con la determinación de citotoxicidad o muerte celular de

compuestos químicos, de medicamentos o de toxinas de microorganismos patógenos

(Lee et al., 2004; Shaik et al., 2004; Rothman, 1986; Li et al., 2004), así como para

cuantificar viabilidad (Harhaji et al., 2004; Thomas et al., 2004) o proliferación celular

en diferentes condiciones (Qu et al., 2004; Zivadinovic et al., 2005). Utilizando

concentraciones variables del agente citolítico Tritón X-100, se demostró que el efecto

puede ser cuantificado mediante el ensayo de TCV (Fig 4).

Debido a la particular naturaleza lipídica de la pared de las micobacterias, el cristal

violeta no es absorbido por las micobacterias, lo cual resultó ser una gran ventaja para la

cuantificación de la citoxicidad producida por M. tuberculosis, ya que los cambios

producidos en los valores de absorbancia en cultivos infectados con M. tuberculosis son

dados solo por la diferencia en el número de células como lo se demostró al infectar un

número constante de células con diferente número de bacterias y no obtener diferencia

significativa en los valores de absorbancia obtenidos de acuerdo al análisis de

correlación y regresión que mostró una pendiente de 0.2019 con un valor de “r2” de

0.9465. (Fig. 3). En un previo estudio, Takii et al. (2002), utilizó TCV para una

búsqueda de agentes antituberculosos y su toxicidad en la línea celular MRC-5 de

fibroblastos de pulmón de humano infectados con M. tuberculosis H37-RV. Sin

embargo la citotoxicidad bacteriana fue medida sólo por liberación de LDH.

De acuerdo a los datos obtenidos, se puede concluir que las cepas virulentas H37Rv y

CDC-1551 tuvieron un efecto citotóxico sobre la monocapa de los macrófagos, a

diferencia de la cepa DR689 que produjo un daño mínimo a los cultivos celulares a las

72 h post-infección, no visible al microscopio, pero si evidenciado por el ensayo TCV.

Estos resultados indican que M. tuberculosis produce un efecto citotóxico sobre células

en cultivo y que la citotoxicidad está relacionada a la virulencia de la cepa. Estos

hallazgos concuerdan con los resultados obtenidos con otras cepas de M. tuberculosis y

reportados por otros autores (Silver et al., 1998; Raynaud et al., 2002; Dobos et al.,

2000; Danelishvili et al., 2003; Keane et al., 1997; Zhang et al., 1998; Hernández-Vera

et al., 2003).

En este trabajo se demostró que el ensayo de TCV determina cuantitativamente la

citotoxicidad producida por M. tuberculosis en una monocapa de células THP-1. Los

resultados de este trabajo, sostienen el uso de TCV como un método rápido, sensible y

confiable para cuantificar la citotoxicidad de M. tuberculosis y para comparar

diferencias en actividad entre cepas que podría estar relacionada a la virulencia. El uso

de este método para modelos de infección con otras especies de micobacterias deberá ser

establecido, ya que biofilms producidos por M. avium pueden ser teñidos con cristal

violeta (Carter et al., 2003) y cambios en la morfología de las colonias alteran las

propiedades bioquímicas de la pared de M. avium, conduciendo a cambios en la

permeabilidad celular que reducen el paso de sales de tetrazolio y colorantes (Kansal et

al., 1998).

43

En 1998 se publicó la secuencia completa del genoma de M. tuberculosis cepa

H37Rv (Cole et al., 1998), y al poco tiempo en el 2002 se dio a conocer la secuencia

genómica de la cepa CDC-1551 (Fleischmann et al., 2002). El genoma micobacteriano

tiene una longitud de 4,411,529 pares de bases (pb) para H37Rv y de 4,403,836 pb para

CDC-1551, lo que representa todo un potencial de información a descifrar entre todo el

repertorio de genes; aquellos que son claves para la virulencia, patogénesis,

supervivencia, latencia y posibles blancos contra los que se pueden diseñar nuevos

fármacos. Se estima que el genoma de M. tuberculosis, con un contenido importante en

citosina/guanina (65.5%) relativamente constante a lo largo de toda la secuencia, alberga

alrededor de 4000 genes (3924 ORFs identificados), y llama la atención por la elevada

proporción de su capacidad codificante destinada a la expresión de enzimas implicadas

en lipogénesis y lipólisis. De hecho, pocas bacterias son capaces de sintetizar una gama

de moléculas lipofílicas tan variada como M. tuberculosis. Por otro lado, el genoma de

M. tuberculosis difiere respecto al resto de bacterias por poseer dos familias de proteínas

ricas en glicina (PE y PPE), cuya estructura repetitiva proporciona una fuente importante

de variabilidad antigénica; se calcula que un 10% de la capacidad codificante de M.

tuberculosis va destinado a esta familia multigénica, cuyos genes se hallan organizados

en forma de cluster (Cole et al., 1998; Rilova-Barrusio, 2006).

Se han reportado diferentes formas para estudiar genes de las micobacterias, entre las

que podemos mencionar técnicas de inactivación de genes con el interés de

reemplazarlos dentro del genoma (Balasubramanian et al., 1996; Aldovini et al., 1993;

Collin et al., 1995; Lee, et al., 1991; Kalpana et al., 1991); la inactivación de genes

dirigida, cuando se conoce la secuencia de algún gene de interés y se quiere bloquear la

acción para conocer su efecto (Berthet, 1998; Hinds et al., 1999; Azad et al., 1996,

Husson et al., 1990; Arruda et al., 1993); la inactivación de genes en forma global cuyo

principio es la inserción de DNA extraño, usualmente elementos transponibles que se

insertan aleatoriamente dentro de algunos sitios en el genoma de la bacteria (Camacho et

al., 1999; Karlin, 2001; McFadden, 1996; Armitige et al., 2000). El uso de

complementación génica también ha sido usado para identificar genes de virulencia, en

estos estudios se usan genomas de microorganismos avirulentos como receptores para

genes que pueden codificar para algún factor de virulencia (Hinshelwood y Stoker,

1992; Collins et al., 1995; Lee et al., 1991). El uso de las técnicas mencionadas

anteriormente para el estudio de la genética de M. tuberculosis tiene ya identificados

algunos genes que son importantes para la virulencia o algunas propiedades fisiológicas,

sin embargo el uso de técnicas para identificar genes que son diferencialmente

expresados bajo varias condiciones incluyendo infecciones a macrófagos y comparados

con genes expresados bajo otras condiciones, nos permite tener una mayor oportunidad

de identificar nuevos genes que pudieran tener un impacto en la patogenia de la

enfermedad (Silver et al., 1998; Smith et al., 1998; Torzón et al., 2001; Wigginton et al.,

2001; Mariani et al., 2000; Dubnau et al., 2002; Dubnau et al., 2003; Raynaud et al.,

2002; Danelishvili et al., 2003; Tullius et al., 2003).

El análisis genómico de M. tuberculosis nos ha provisto de una gran fuente de

información, referente a bases moleculares de la patogenia; sin embargo, durante la

evolución, las estructuras de la proteínas son generalmente mucho mas conservadas que

sus secuencias, por lo que considerar en un futuro estudios con proteómica, podría

favorecer el entendimiento de esta enfermedad (Brodin et al., 2005).

44

En el presente estudio se evaluó la expresión de algunos genes que pudieran estar

relacionados con la virulencia de M. tuberculosis en un modelo in vitro de infección a

macrófagos. El estudio fue dirigido a un grupo de genes de M. tuberculosis que ha sido

reportado con probable función de virulencia y a un segundo grupo de genes con función

desconocida en M. tuberculosis, pero cuya secuencia nucleotídica tiene homología con

genes que están relacionados con virulencia en otros microorganismos. Esta información

se obtuvo a través de una búsqueda exhaustiva de información en el sitio de la Biblioteca

“National Center for Biotechnology Information”

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html) y en los sitios de “The Wellcome Trust

Sanger Institue” (http://www.sanger.ac.uk/) y “The Institute for Genomic Research”

(http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/Genome), estos últimos son los dos organismos

que llevaron a cabo la secuenciación del genoma de M. tuberculosis.

En nuestro modelo de infección, encontramos que la infección de células THP-1 con

la cepa CDC-1551 a una MDI de 1:1 destruía parcialmente los cultivos a las 24 h pero se

mantenía un gran porcentaje de la monocapa. Por ello consideramos que este inóculo

era el adecuado para recuperar un número suficiente de bacterias y extraer su RNA en

buena cantidad para analizar la expresión genética en las diferentes condiciones

estudiadas.

Uno de los puntos críticos de este tipo de trabajo, es el disponer de buena cantidad y

calidad de RNA para los ensayos. Dubnau et al., en 2002, extrajeron RNA de

micobacterias a 1, 6, 24, 48 y 72 h y para validar su método de inducción génica

utilizaron el gene micobacteriano hspX que codifica para una proteína semejante a -

cristalina y su expresión se induce cuando la bacteria se encuentra dentro de macrófagos.

Ellos encontraron que a 1 h de incubación su expresión no había aumentado más de dos

veces, lo cual contrasta grandemente con el pico máximo de expresión a las 6 h con un

aumento de la expresión de 336 veces. A las 24, 48 y 72 h, la cantidad de mRNA

aumentó, en relación con la basal, alrededor de 100 veces. Basados en estos resultados

previos se decidió realizar la extracción de RNA a las 2, 6 y 24 h y el RNA obtenido de

cada tiempo se usó para los ensayos de RT-PCR.

En este trabajo se estudiaron tres diferentes condiciones experimentales en las cuales

M. tuberculosis podría expresar selectivamente algunos genes: a) bacterias cultivadas en

el medio Middlebrook 7H9, el cual es el medio comúnmente usado para el cultivo de

micobacterias; b) bacterias cultivadas en medio RPMI completo, el cual es el medio

donde se cultivan las células THP-1, y c) bacterias infectando cultivos de macrófagos

derivados de la línea THP-1 en medio RPMI. De esta manera se podría reconocer la

expresión constitutiva, es decir los genes que se expresan constantemente sin ser

alterados por cambios en el medioambiente y la expresión inducida de los genes que se

expresan solo en ciertas condiciones y bajo ciertos estímulos.

El gene MT3989 (esat 6) de M. tuberculosis se conoce por codificar para una

proteína que es un antígeno inmunodominante (Andersen et al., 1995; Boesen et al.,

1995) e induce buenos niveles de protección en animales inmunizados (Kamath et al.,

1999; Lee and Horwitz, 1999). Este gene se seleccionó como testigo de expresión

constitutiva por ser parte estructural de la micobacteria y por producirse tanto en medios

de cultivo como en macrófagos humanos (Dubnau y Smith, 2003; Pollock JM y

Andersen P, 1997; Mariani et al., 2000). En todos los ensayos hechos se observó la

expresión de este gene, por lo que comprobamos que es un buen testigo de expresión

constitutiva.

45

El gene MT2416 (plcA) de M. tuberculosis se utilizó como control positivo de

expresión inducida dentro de macrófagos. De acuerdo a lo publicado por Raynaud et al.,

2002, el análisis de RT-PCR mostró que la expresión de este gene está fuertemente

sobre-regulado durante las primeras 24 h de infección a macrófagos y baja notoriamente

su expresión después de las 48 h de incubación, pero manteniendo sus niveles de

expresión a un nivel basal, por lo menos hasta las 72 h.

En nuestro caso, los resultados obtenidos muestran una banda más intensa,

correspondiente a este amplicon, durante las primeras horas de infección a macrófagos y

va disminuyendo al paso del tiempo, lo que indica una sobre-expresión de este gen en

los tiempos iniciales de la infección. Resultados similares se obtuvieron con los genes

MT2415 (plcB) y MT2414 (plcC), estos resultados concuerdan con los publicados por

Raynaud et al,. 2002. Estos genes codifican para fosfolipasa C, enzimas que son

relevantes para la virulencia de M. tuberculosis. Dentro de sus actividades biológicas

pueden hidrolizar casi cualquiera de los fosfolípidos celulares y esto podría facilitar la

entrada a la célula al desestabilizar la membrana celular. También se le ha atribuido

actividad citotóxica y sus productos de hidrólisis pueden alterar los mecanismos de

señalización celular llevando a la muerte celular (Songer, 1997; Wheeler, 1991; King et

al., 1993; Vera-Cabrera et al., 2003; Hernández-Vera, 2003; Vera-Cabrera et al., 2006).

Mutaciones de estos genes en M. tuberculosis disminuyeron la capacidad citotóxica

sobre macrófagos y produjeron menos granulomas (Smith et al., 1995; Hernández-Vera,

2003, Raynaud et al., 2002).

En este trabajo se analizó la expresión de los genes MT0003, MT0024, MT0040,

MT0259, MT0655, MT0876, MT1524, MT3917 (erp), MT2783 (sigB), MT2415 (plcB)

y MT2414 (plcC); esta nomenclatura corresponde a “The Wellcome Trust Sanger

Institue” http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/GenomePage3.spl?database=gmt.

El análisis de expresión del RNA obtenido de M. tuberculosis a las 2, 6 y 24 horas de

infección en macrófagos derivados de las células THP-1 y de M. tuberculosis incubadas

en medio de cultivo RPMI completo, mostró la expresión del gene MT0259, pero no se

observó expresión de este gene a los 7 días de cultivo en medio de cultivo Middlebrook

7H9. Para los otros genes analizados se observó que se expresaron en todas las

condiciones estudiadas, y aunque hay variaciones en la expresión detectadas por la

diferente intensidad de la banda del amplicon producido, sería necesario un método

cuantitativo como “northern blot” o aún mas definitivo como RT-PCR en tiempo real

que nos permita observar estas pequeñas diferencias y poder determinar con exactitud

las variaciones cuantitativas de la expresión durante todos las variantes del experimento.

Esto ocurre con algunos otros genes estudiados en modelos de infección donde se

expresan diferencialmente en las fases tempranas de la interacción celular para luego

volver a su nivel de expresión basal (Raynaud et al., 2002). En este estudio, no se

observó la expresión del gene MT0259 en la fase tardía de crecimiento en el medio de

cultivo, al parecer es necesario en las fases tempranas del crecimiento pues se expresó al

menos hasta las 24 h. Las condiciones de crecimiento o estrés también pueden causar

expresión de algunos genes, tal es el caso de los genes pcKA, aceA y 7 genes fad, los

cuales se sobreregularon por tratamiento con SDS (Manganelli et al., 2001).

De acuerdo a la información en los sitios de Sanger y TIGR el gene MT0259, tiene

una probable función de oxidoreductasa, involucrada en metabolismo intermediario

central. Dado que no se detectó la expresión del gene MT0259 en la fase de crecimiento

46

tardía, sería importante analizar en que momento se dejó de expresar y tratar de

determinar que función juega en determinadas fases de crecimiento.

Como se ha mencionado, se han desarrollado muchos trabajos en la búsqueda de

factores de virulencia de M. tuberculosis, sin embargo, a pesar de los esfuerzos hechos,

aun se debe incidir en definir la función de un gran número de genes de esta bacteria que

pudieran estar relacionados con su virulencia y nos ayuden a establecer nuevas

estrategias para el control de la enfermedad.

Este trabajo permitió desarrollar un modelo in vitro para monitorear y cuantificar el

efecto citotóxico sobre una monocapa de macrófagos humanos derivados de la línea

celular THP-1 por diferentes cepas de M. tuberculosis y también permitió obtener RNA

micobacteriano producido en diferentes condiciones y tiempos para poder hacer un

análisis de expresión diferencial que nos ayude a detectar genes de M. tuberculosis

expresados selectivamente dependiendo de las condiciones a las que se sometan y que

estén involucrados en virulencia o metabolismo. Así mismo se identificó al gene

MT0259, con probable función de oxidoreductasa, como un gene del metabolismo

bacteriano que se expresa durante el crecimiento activo de M. tuberculosis. La

metodología usada en este proyecto o similar a ésta facilitará identificar genes relevantes

en la virulencia de M. tuberculosis para luego comprobar su papel en modelos de

infección a células en cultivo.

47

9. CONCLUSIONES

Mycobacterium tuberculosis tiene un efecto citotóxico dependiente de la

virulencia de las cepas sobre la monocapa de macrófagos humanos derivados de

la línea celular THP-1.

El método de tinción de cristal violeta cuantifica la citotoxicidad producida en

cultivos celulares infectados con Mycobacterium tuberculosis.

El uso de técnicas para analizar expresión diferencial nos permite analizar los

genes involucrados en virulencia o metabolismo durante la infección de

macrófagos humanos derivados de la línea celular THP-1 por Mycobacterium

tuberculosis.

M. tuberculosis expresa selectivamente genes dependiendo de las condiciones de

cultivo en el que se encuentre.

El gene MT0259, con probable función de oxidoreductasa, parece ser un gene

del metabolismo bacteriano que se expresa en las primeras fases de crecimiento

activo de M. tuberculosis.

48

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11. APÉNDICE

11.1 Preparación de medios y soluciones

Acetato de sodio 3 M, pH 6.0: 2.46 g de acetato de sodio en 10 ml de agua-DEPC.

Ajustar pH a 6.0.

Agua-DEPC (diethil pirocarbonato): 0.1% (v/v) DEPC en agua deionizada. Esterilizar

por autoclave para inactivar el DEPC.

Bromuro de etidio: bromuro de etidio 10 mg/ml en agua-DEPC.

Buffer de extracción (GEB): 59 g de tiocianato de guanidina y 1 g de N-lauryl-

sarcosina en 50 ml de agua-DEPC. 0.83 ml de Acetato de sodio 3M, pH 6.0 y aforar a

100 ml con agua-DEPC. Inmediatamente antes de usar, colocar en un tubo estéril 5 mg

de ditiotreitol (DTT) y agregar 5 ml de la solución de guanidina-sarcosina para dar una

concentración de DTT de 1.5 mg/ml.

Etanol grado analítico: etanol al 70 y 95 % en agua-DEPC. La solución al 95 %

deberá estar enfriada a –20°C para una rápida precipitación de los ácidos nucleicos.

Medio Middlebrook 7H10 AGAR (Difco). Agregar 19 g de Medio Middlebrook 7H10

a 900 ml de agua destilada con 5 ml de glicerol (J.T.Baker), calentar y dejar hervir por 1

minuto; esterilizar por 10 minutos a 121º C, dejar enfriar a 55ºC y adicionar 100 ml de

OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa) (Becton Dickinson). Distribuir 15

ml a cajas de petri.

Medio Middlebrook 7H9 (Difco). Agregar 4.7 g de Medio Middlebrook 7H9 a 900 ml

de agua destilada con 2 ml de glicerol (J.T.Baker), esterilizar por 10 minutos a 121º C,

dejar enfriar y adicionar 100 ml de OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa)

(Becton Dickinson).

63

MOPS 10x: 200 mM de MOPS (3-[N-Morpholino]propanessulfonic acid) (Research

Organic Inc, Inc., Cleveland, OH.) 50 mM de NaOAc (Acetato de Sodio, SIGMA, St.

Louis, MO), 10 mM de EDTA pH 8 (Ethylenediaminetetraacetic acid) (Research Organic

Inc), disuelto en 0.1% de agua DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) (Sigma Cat. D-5758).

Solución de carga (stock 5X): Ficol15% p/v, EDTA 6 mM, pH 8.0, azul de bromofenol

0.25% y cyanol xileno 0.25 % en agua-DEPC.

Solución de digestión de Dnasa: preparar 100 ml de una solución 10 mM de MgCl2

(95.21 mg), 20 mM de Tris-HCl (242 mg) pH 8.0; tratarlo con DEPC igual que el agua.

Solventes orgánicos: Phenol neutro:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 v/v).

TBE (Tris HCl/Borato 45 mM, EDTA 1 mM). 54 g de Tris base, 27.5 g de ácido bórico,

20 ml de EDTA 0.5 M, pH 8.0; disolver en 1 litro.

Tween Salino: NaCl 0.8% (p/v) en Tween-80 al 0.05% en agua (v/v)

RESUMEN CURRICULAR

Hugo Brígido Barrios García

Candidato para el Grado de

Doctor en Ciencias Acentuación en Microbiología

Tesis: ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE GENES DE Mycobacterium tuberculosis

DURANTE LA INFECCIÓN A MACRÓFAGOS.

Campo de estudio: Ciencias de la Salud

Lugar y Fecha de Nacimiento: 26 de enero de 1970

Nombre de los padres: Brígido Barrios Ahumada y Rosa S. García Hernández.

Educación: 1) Médico Veterinario y Zootecnista. 1992. Universidad Autónoma de

Tamaulipas. 2) Especialidad en Diagnóstico en Bacteriología y Micología

Veterinaria. 1994. Universidad Nacional Autónoma de México. 3) Maestría en

Ciencias Veterinarias: Microbiología. 1998. Universidad Nacional Autónoma

de México.

Experiencia profesional: 1) Centro de Investigación Biomédica del Noreste, IMSS;

Programa de Retención de Investigadores, royecto: “Epidemiología molecular

de la tuberculosis pulmonar en el área metropolitana de Monterrey”; Monterrey

N.L., México. Agosto de 2004 - agosto de 2005. 2) Centro de Investigación

Biomédica del Noreste, IMSS; Becario de Investigación; Investigación básica

relacionada con M. tuberculosis. Monterrey N.L., México. Septiembre 2000 -

febrero de 2004. 3) Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. Becado de

Estudios de Doctorado en Ciencias; Facultad de Ciencias Biológicas, UANL;

febrero de 2001 - enero de 2003. 4) Biotecnologías Universitarias S.A.,

Producción de reactivos y servicios en Biología Molecular, 1998. 5) Facultad

de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM; Profesor de laboratorio en

la materia de Bacteriología y Micología; México DF. 1997 -1998. 6) Consejo

Nacional de Ciencia y Tecnología. Becado de Estudios de Maestría en

Ciencias; Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM; septiembre

de 1995, agosto de 1997. 7) Escuela Secundaria Diurna Federal Nº 321; Turno

matutino, 30 horas. México DF., Ciclo Escolar 1994-1995.

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capítulos de libro.