aproximación a la caracterización de la expresión de genes

TESINA PARA OPTAR POR EL GRADO DE

LICENCIADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

Aproximación a la caracterización de la expresión de

genes implicados en la vía de señalización de IGF en el

desarrollo temprano de Austrolebias charrua

Ignacio Darwin González Alayón

Orientadora: María José Arezo

Co-orientador: Nicolas Gabriel Papa

Laboratorio de Biología Molecular de Organismos Acuáticos - Sección

Biología Celular, Facultad de Ciencias

Diciembre de 2019

Agradecimientos

A mi tutora María José Arezo; por abrirme las puertas del laboratorio, permitirme y

ayudarme a desarrollar las ideas de este trabajo, y acompañarme en todo el proceso.

A mi cotutor Nicolás Papa, quien me ayudó durante todo el trabajo experimental,

enseñándome la disciplina necesaria para el trabajar en el laboratorio

Al Laboratorio de Biología Molecular de Organismos Acuáticos - Sección Biología

Celular (Facultad de Ciencias) por hacer posible la realización de este trabajo.

A los miembros del Tribunal, Dr. Flavio Zolessi y Dr. Uriel Koziol, por aceptar la

evaluación de mi tesina de grado.

A mis padres Stella y Darwin, y a mi hermana Leticia porque fueron el pilar más

importante durante estos 5 años de estudio.

A mis compañeros de laboratorio Hellen Schlueb y Daniel Blanco, con los que

compartí el día a día, hicieron que todo el trabajo realizado fuera mucho más ameno.

A mi novia Irene, quien siempre estuvo atenta y dispuesta a escucharme a lo largo de

estos años.

A todos los amigos que hice en esta facultad durante estos años; con quienes

compartimos clases, ratos de estudio y de distensión, que hicieron de esta etapa una

de las mejores de mi vida. Especialmente a Hellen Schlueb, Laura Herrera y Martín

Figares, con los que compartí un proyecto PAIE que me motivó a trabajar con los

Peces Anuales.

Índice

Resumen……………………………………………………………………………………..1

Introducción…………………………………………………………………………………2

Objetivos…………………………………………………………………………………...11

- Objetivo general

- Objetivos específicos

Materiales y Métodos…………………………………………………………………….12

- Obtención y mantenimiento de adultos de A. charrua en el laboratorio húmedo

de experimentación animal………………………………………………………..12

- Obtención, cultivo e inducción de embriones a diapausa 1…………………….13

- Métodos moleculares………………………………………………………………13

1) Extracción de ARN total y estimación de su calidad…………………….14

2) Síntesis y evaluación del ADN copia……………………………………..16

3) Diseño de los cebadores para igfbp-1 e igf1r…………………………….17

4) Ajuste de condiciones de amplificación de los cebadores y amplificación

in vitro de los genes de interés……………………………......................18

5) Purificación de productos de PCR para secuenciación…………………19

6) Secuenciación y análisis de las secuencias……………………………..19

Resultados y Discusión………………………………………………………………….21

1) Integridad y concentración del ARN obtenido……………………………………21

2) Evaluación del ADN copia…………………………………………………………23

3) Ajuste de condiciones de amplificación de los cebadores diseñados para igfbp-

1 e igf1r………………………………………………………………………………24

4) Análisis de expresión de igf1r y análisis comparativo de las secuencias

obtenidas……………………………………………………………………………26

5) Análisis de expresión de igfbp-1 y análisis comparativo de las secuencias

obtenidas……………………………………………………………………………33

Conclusiones……………………………………………………………………………...43

Perspectivas……………………………………………………………………………….45

Referencias bibliográficas………………………………………………………………47

1

Resumen

Los peces anuales son un grupo de teleósteos dulceacuícolas que habitan en charcos

temporales de América y África, que se secan generando la muerte de toda la

población juvenil y adulta. Por consiguiente, la supervivencia de las poblaciones

depende completamente de la resistencia de los embriones a la estación seca y su

eclosión al llegar la estación lluviosa, cuando los charcos se inundan. Su principal

adaptación a estas estresantes condiciones, es la posibilidad de detener el desarrollo

embrionario reversiblemente en tres estadios específicos (diapausas): durante una

fase única de estos peces de dispersión de las blastómeras profundas (diapausa 1),

en el embrión somítico (diapausa 2) y previo a la eclosión (diapausa 3). Estas

detenciones se caracterizan por una disminución importante del metabolismo,

crecimiento y proliferación celular. Pueden ser inducidas tanto por factores endógenos

(genéticos y epigenéticos) como por señales que indican estrés ambiental. Se han

comenzado a comprender los mecanismos moleculares involucrados en la decisión

de entrada o escape de la diapausa 2 en el pez anual sudamericano Austrofundulus

limnaeus, con evidencia creciente que indica un importante rol de la vía de

señalización de IGF (Insulin-like Growth Factor) en la regulación de diapausas en

organismos de diversos linajes evolutivos. Sin embargo, no se conoce si esta vía de

señalización está involucrada en la regulación de la diapausa 1.

En este trabajo se realizó la identificación y una primera aproximación al perfil de

expresión de dos genes implicados en la vía de IGF (Igfbp-1 e Igf1r) en el desarrollo

temprano del pez anual sudamericano Austrolebias charrua, mediante amplificación

por PCR en tiempo final. Los resultados obtenidos indican que igf1r se expresa desde

el estadio de las primeras células hasta el estadio de reagregado (gástrula temprana).

Con los cebadores diseñados para igfbp-1 se obtuvieron tres amplicones, el de menor

tamaño (500 pb) resultó ser el esperado y se evidenció su expresión en todos los

estadios analizados, mientras que el de 700 pb podría tratarse de un ARNlnc que se

expresa en ambos fenotipos de diapausa 1 y en epibolia (80 a 100%). Este fragmento

podría tratarse de un marcador molecular de embriones en diapausa 1 o con señales

de inducción a la misma.

2

Introducción

Los peces anuales (Cyprinodontiformes, Aplocheilidae) comprenden un grupo

polifilético de teleósteos de agua dulce con ciclo de vida corto (Myers 1952; Berois y

col., 2012), de 3 a 10 meses dependiendo de la especie y las condiciones de los

charcos temporales de América y África en los que habitan (Parenti, 1981; Blazek y

col., 2013; Dominguez-Castanedo y col., 2013). Estos charcos, representan un

ambiente efímero para estos peces, ya que se encuentran inundados durante la

estación lluviosa y se secan por completo durante la estación seca. En la fase de

sequía ocurre la muerte de toda la población adulta y juvenil, por lo tanto la clave para

la supervivencia de estos peces radica en sus embriones resistentes a la desecación.

Estos embriones permanecen enterrados en el sustrato desarrollándose hasta el

momento en el que el charco se vuelve a inundar, lo que genera las condiciones para

que los alevines eclosionen, alcancen la madurez sexual en unas pocas semanas y

así generen una nueva progenie (figura 1) (Vaz-Ferreira y col., 1964; Wourms, 1972

a-c; Arezo y col., 2005).

Figura 1. Imagen representativa del ciclo de vida de los peces anuales modificada de Berois

y col., 2012. A) Charco temporal (hábitat de estos peces) durante la estación lluviosa en la

que los adultos se reproducen. Macho y hembra adultos de Austrolebias charrua se muestran

como representantes de esta fase del ciclo. B) Charco temporal durante la estación seca. Se

muestra un embrión pre eclosión representando esta fase del ciclo.

Los peces anuales presentan varias características en común con otros teleósteos

como Danio rerio (pez cebra) y Oryzas latipes (medaka), que han sido ampliamente

estudiados y ofrecen grandes ventajas como modelos en investigación, entre ellas:

oviparidad, transparencia de los embriones, largos períodos de reproducción y

A B

3

facilidad de mantenimiento y manejo en condiciones de acuario (revisado por Berois

y col., 2012).

A nivel del desarrollo, los embriones de estos peces al igual que el de otros teleósteos,

presentan un clivaje meroblástico discoidal, que da lugar a tres capas de células que

posteriormente realizan la epibolia (figura 2), éstas se diferencian desde el vitelo a la

superficie en: la capa sincicial vitelina, un grupo de células mediales denominadas

blastómeras profundas (forman todas las estructuras del embrión) y la capa sincicial

envolvente hacia la superficie (protege osmóticamente al embrión) (Trinkaus, 1993;

Kimmel y col., 1995).

Figura 2. Esquema representativo de las primeras etapas del desarrollo de los peces anuales,

modificado de Naumann y Englert, 2018. A) Estadio de blástula temprana. B) Estadio de

blástula tardía. C) Comienzo de la epibolia. D) Epibolia temprana, comienzo de la dispersión

de las blastómeras profundas. Bs, blastómeras; C, corion; BsP, blastómeras profundas; CSE,

capa sincicial envolvente; Ep, espacio perivitelino; Cs, cavidad de segmentación; V, vitelo;

CSV, capa sincicial vitelina.

4

Es importante destacar que, previo al comienzo de la epibolia en D. rerio el promedio

de blastómeras es de 4000 (Marrable, 1965), mientras que para embriones de peces

anuales se han registrado números mucho menores de blastómeras en este estadio:

de 200 a 1000 para Austrofundulus (Wourms, 1972b), de 50 a 350 en Nothobranchius

(Van Haarlem, 1983) y 100 en Austrolebias viarius (Arezo y col., 2005). En este

sentido, se ha demostrado que el tiempo de las primeras divisiones celulares en

Nothobranchius furzeri es mayor al de otros teleósteos no anuales. Sin embargo, la

perdida de sincronía y activación del genoma cigótico se observa luego de la quinta

división, por lo que las primeras divisiones presentan fases S y M de mayor duración

con respecto a las de otros teleósteos no anuales (Dolfi y col., 2014).

Además, el desarrollo embrionario de los peces anuales es particularmente

interesante porque posee dos características que lo diferencia del resto de los

teleósteos no anuales. En primer lugar, poseen una fase de dispersión y posterior

reagregación de las blastómeras profundas que separa espacial y temporalmente la

epibolia de la internalización del endomesodermo (Wourms, 1972a). En los peces

teleósteos no anuales las blastómeras profundas comienzan a internalizarse durante

la epibolia, migrando a través de una estructura denominada escudo embrionario que

actúa como organizador (Trinkaus, 1984). La segunda particularidad, es la posibilidad

de experimentar detenciones reversibles en tres momentos particulares a lo largo del

desarrollo (diapausas): durante la fase de dispersión de las blastómeras profundas

(diapausa 1), en el embrión somítico (diapausa 2) y en la etapa de pre eclosión

(diapausa 3) (figura 3) (Peters, 1963; Wourms, 1972 a, c; Arezo y col. 2005). Estas

tres diapausas son fisiológicamente distintas, ya que reaccionan de manera diferente

ante las mismas claves ambientales (Wourms, 1972c; Peters, 1963).

La diapausa es un tipo de criptobiosis que se define como una detención

predeterminada del desarrollo en estadios específicos, conducida por un programa

interno particular de expresión génica (revisado por Martin y Podrabsky, 2017). Puede

ser inducida tanto por factores endógenos (claves genéticas y epigenéticas) como

exógenos (diferentes señales ambientales) (Podrabsky y Hand, 2015; Podrabsky y

col., 2016b).

5

Figura 3. Estadios de diapausa (D) por los que pueden transcurrir los embriones de los peces

anuales desde la fecundación hasta la eclosión. Las imágenes corresponden a embriones de

Austrolebias charrua en diferentes estadios en los que se pueden instalar las diapausas: fase

de dispersión (DI), embrión somítico (DII), embrión pre eclosión (DIII). Modificado de Berois y

col., 2014.

La diapausa ha sido ampliamente estudiada en insectos, pero se han descrito y

estudiado en una gran variedad de metazoarios (incluso en mamíferos) (revisado por

Martin y Podrabsky, 2017). En la mayoría de los casos, la diapausa embrionaria está

relacionada con la capacidad de disminuir el metabolismo, crecimiento y proliferación

celular ante ciertas señales que indican estrés ambiental (Yamashita y Hasegawa,

1985; Levels y col., 1986; Podrabsky y Hand, 1999; Hand y col., 2016), aunque han

sido reportadas algunas excepciones a esta regla (Reynolds y Hand, 2009)

La capacidad de los embriones de peces anuales de censar las señales ambientales

(como temperatura, nivel de oxígeno y fotoperiodo, entre otras) y responder a éstas

mediante la entrada o no en diapausa es lo que permite su supervivencia en un

ambiente sumamente estresante e impredecible, como lo es el de los charcos

temporales, en los que están sometidos a condiciones de desecación, hipoxia/anoxia

y radiación UV (Wourms, 1972a-c; Podrabsky y col., 2016a).

La diapausa 1 puede ser inducida por bajas temperaturas, condiciones de hipoxia y

señales hidrosolubles secretadas por peces adultos (Inglima y col., 1981; Arezo y col.,

2005). Esta diapausa podría ser interpretada como un mecanismo de escape a

condiciones ambientales severas durante un estadio insensible del desarrollo según

Wourms (1972b). En concordancia con esta hipótesis, se ha observado que los

embriones de Austrofundulus limnaeus (pez anual sudamericano de la familia

Rivulidae) son altamente resistentes a la radiación ultravioleta durante la fase de

dispersión de las blastómeras profundas (Wagner y Podrabsky, 2015a). Sin embargo,

6

estas células no serían totipotentes durante la dispersión como postulaba Wourms

(1972b), ya que algunas blastómeras estarían expresando marcadores de

diferenciación celular como vasa (marcador de línea germinal en vertebrados) (Arezo

y col., 2016), aunque sí conservarían características de pluripotencialidad (Wagner y

Podrabsky, 2015b). Hasta el momento existe un único trabajo dedicado

exclusivamente a la diapausa 1, en el que se describen dos fenotipos diferentes

(diapausas 1A y 1B) en embriones de Austrolebias charrua y Austrolebias viarius,

inducidas en un 100 % mediante condiciones de hipoxia/anoxia y presencia de adultos

a 19°C (Arezo y col., 2017), pero no se conoce aún su perfil fisiológico y metabólico

(Martin y Podrabsky, 2017).

La diapausa 3 sería la única diapausa que ha sido descrita como obligatoria, ya que

en condiciones de laboratorio los embriones de todas las especies de peces anuales

que se han estudiado transcurren por esta diapausa (revisado por Martin y Podrabsky,

2017). A diferencia de lo que sucede en diapausa 1, la hipoxia podría representar una

señal de escape de la diapausa 3 (Martin y Podrabsky, 2017). En embriones de A.

limnaeus el metabolismo y ritmo cardíaco decrecen progresivamente en esta etapa,

en comparación con embriones del mismo estadio inducidos a eclosionar (Levels y

col., 1986; Podrabsky y Hand, 1999; Thompson y Orti, 2016). En un trabajo reciente,

se encontraron 945 genes diferencialmente expresados al comparar entre el

transcriptoma de alevines recién eclosionados y el de embriones en diapausa 3 de la

especie anual Nematolebias whitei, muchos de ellos relacionados al metabolismo

celular, el ritmo cardíaco y el ciclo circadiano (Thompson y Orti, 2016).

La gran mayoría de los datos acerca de la diapausa en peces anuales han sido

obtenidos a partir de estudios de embriones en diapausa 2 de A. limnaeus (Podrabsky

y col., 2016a; Podrabsky y col., 2017), en los que se ha demostrado una importante

disminución del metabolismo celular (Podrabsky y Hand, 1999), encontrándose las

células en fase G1/G0 del ciclo celular (Meller y col., 2012). Además, los embriones

en diapausa 2 son altamente resistentes a condiciones de hipoxia/anoxia, desecación

y radiación ultravioleta, lo que resultaría clave para su supervivencia cuando se

encuentran enterrados en el sustrato del fondo del charco (Podrabsky y Hand, 1999;

Podrabsky y col., 2007; Podrabsky y col., 2011; Anderson y Podrabsky, 2014; Wagner

y Podrabsky, 2015a).

7

Recientemente se han realizado importantes avances para comprender los

mecanismos celulares y moleculares involucrados en la entrada o escape de los

embriones de A. limnaeus a diapausa 2. En este sentido, se ha observado que los

embriones escapan a la diapausa 2 al exponerlos a bajas concentraciones de

vitamina D3 en condiciones de inducción a diapausa. La vitamina D3 actuaría a través

del receptor nuclear de la vitamina D (VDR) que se encuentra expresado en el período

ventana donde ocurre la decisión de entrada o escape de esta diapausa (Romney y

col., 2018). Además, al inhibir la síntesis de vitamina D3 se induce la diapausa 2 en

embriones de A. limnaeus y un estadio similar a la diapausa en embriones de D. rerio

(que no presentan detenciones en el desarrollo) (Romney y col., 2018). Este

mecanismo de control de la diapausa parece ser conservado evolutivamente, ya que

el receptor homólogo a VDR está involucrado en la regulación de estadios de

diapausa en el nematodo Caenorhabditis elegans y en Drosophila melanogaster

(Antebi y col., 2000; Emerson y col., 2009).

La activación de la vía de señalización de IGF (Insulin-like Growth Factor) implica el

aumento del metabolismo, crecimiento y proliferación celular (figura 4) (LeRoith y col.,

2001). Según evidencia creciente, se encuentra fuertemente regulada a la baja en

estadios de diapausa de metazoarios de varios linajes evolutivos, entre los que

aparecen representados los insectos, crustáceos y nemátodos (Sim y Denlinger.,

2013; Podrabsky y Hand, 2015; Hand y col., 2016). En C. elegans, es conocido que

la vía de señalización de insulina/IGF y otras vías implicadas en el desarrollo de la

diapausa (como TGF-beta y GMP cíclico) convergen y son reguladas por DAF-12

(homólogo de VDR en este gusano) (Fielenbach y Antebi, 2008). Esto concuerda con

la evidencia obtenida en A. limnaeus, donde se observó que el bloqueo farmacológico

de Igf-1r (principal receptor de la vía de IGF) genera un estadio muy similar al de

embriones detenidos en diapausa 2 (Woll y Podrabsky, 2017).

Las Igfbps (Insulin-like Growth Factor Binding Proteins) son pequeñas proteínas

capaces de unirse con alta afinidad a Igf-1 e Igf-2 regulando sus funciones de

múltiples maneras, ya sea potenciando o inhibiendo su acción (revisado por Duan y

Xu, 2005). Trabajos realizados en embriones de oveja y de pez cebra, demuestran

que se induce la expresión de igfbp-1 en respuesta a condiciones de hipoxia. La

acción de esta proteína impide la unión de los ligandos de IGF a su receptor, lo que

genera un retraso del desarrollo en estas condiciones (McLellan y col., 1992; Kajimura

8

y col., 2005: Kamei y col., 2008; Kamei y col., 2011). Este mecanismo podría estar

evolutivamente conservado en restringir la acción estimulante del crecimiento de IGF

en condiciones estresantes para el desarrollo, ya que se ha observado que igfbp-1 se

encuentra sobreexpresado en respuesta a inanición, hipoxia, estrés y daño celular en

diversidad de vertebrados (revisador por Kajimura y Duan, 2007).

Figura 4. Esquema representativo y simplificado de la vía de señalización de IGF, modificado

de Griffeth y col., 2014. Los receptores que activan esta vía son Igf-1r (el principal), el receptor

de insulina (Insr) y receptores híbridos entre estos. Estos son receptores tirosina quinasa

heterotetraméricos (dos subunidades α extracelulares y dos β intracelulares unidas por

puentes disulfuro) (Maures y col., 2002). La unión del ligando (Igf-1, Igf-2 o Insulina) en el

dominio extracelular provoca la autofosforilación de las tirosinas del dominio intracelular, lo

que provoca la activación de dos principales cascadas de señalización: la vía de las MAP

quinasas y la vía de PI3K-Akt-mTOR, que en conjunto generan un aumento del metabolismo,

crecimiento y proliferación celular (Coolican y col., 1997; Imai y Clemmons., 1999; Pozios y

col., 2001).

Si bien se han logrado múltiples avances en diapausa 2, hasta el momento no se

conocen cuáles son los mecanismos moleculares que regulan la entrada o escape de

9

la diapausa 1 en los peces anuales. Los antecedentes mencionados, nos llevaron a

plantear la hipótesis de que la regulación de la vía de señalización de IGF podría estar

jugando un rol importante en la decisión de entrada o escape de la diapausa 1 en la

especie de pez anual Austrolebias charrua. Se enfatiza particularmente en la posible

acción de Igfbp-1 como modulador de esta vía, debido a que esta diapausa puede ser

inducida por condiciones de hipoxia/anoxia como ya fue mencionado.

El género Austrolebias (Cyprinodontiformes: Rivulidae) comprende 42 especies que

se encuentran distribuidas en las cuencas de la “Plata-Paraná” y “Patos Merín”

(revisado por Loureiro y col., 2016). Austrolebias charrua es una especie compartida

con el sur de Brasil que se encuentra en los “Bañados del Este” en nuestro territorio

(Costa y Cheffe, 2001), considerado Sitio Ramsar y Reserva de Biosfera (PROBIDES,

1999).

Para comenzar a trabajar en la hipótesis mencionada, en este trabajo se realizó una

primera caracterización de la expresión de igfbp-1 e igf1r (importantes en la vía

señalización de IGF y su regulación) en diferentes estadios del desarrollo temprano

de A. charrua. Se utilizó la técnica de RT-PCR en tiempo final, en búsqueda de

posibles diferencias de expresión de estos dos genes (de tipo presencia/ausencia)

entre embriones en diapausa 1A, 1B y embriones no inducidos a diapausa 1 de

estadios previos y posteriores a la misma. Los estadios del desarrollo analizados

fueron: 1 a 16 células (ARN materno, previo a la transición de la blástula media), 80

a 100% de epibolia (dispersión de las blastómeras profundas, en migración celular

activa, previo al ingreso a una posible diapausa 1) (Arezo y col., 2005), diapausa 1A

y 1B (inducidas por el método reportado en Arezo y col., 2017), y reagregado I y II

(fase activa del desarrollo embrionario, etapa posterior a la diapausa 1 pero previo a

la internalización del endomesodermo) (Pereiro y col., 2017) (figura 5).

10

Figura 5. Embriones de Austrolebias charrua en diferentes estadios del desarrollo utilizados

para el análisis de expresión de tipo presencia/ausencia realizado en este trabajo. A) Estadio

de 1 célula. C, citoplasma; Pn, pronúcleos; Epv, espacio perivitelino; Co, Corion. Modificado

de Arezo y col., 2005 B) Estadio de 8 células C) Epibolia, blastómeras profundas con

morfología triangular/romboidal en dispersión activa. D) Diapausa 1A, células dispersas y

redondeadas. E) Diapausa 1B, células redondeadas formando pequeños grupos. F)

Reagregado de tipo II (según Pereiro y col., 2017), las células comienzan a agregarse previo

a la internalización del endomesodermo. Se señalan con flechas las blastómeras profundas

y con asterisco (*) el reagregado. Modificado de Arezo y col., 2017.

11

Objetivos

Objetivo general

Estudiar la expresión de los genes igf1r e igfbp-1 en el desarrollo temprano del pez

anual Austrolebias charrua comparando entre embriones inducidos a diapausa 1 (en

condiciones de hipoxia y presencia de adultos) y embriones no inducidos en diferentes

estadios.

Objetivos específicos

1) Aproximación a las técnicas de colecta de peces anuales en el campo y

reconocimiento de su hábitat natural.

2) Reproducción, obtención y cultivo de embriones de Austrolebias charrua.

3) Reconocimiento de los diferentes estadios del desarrollo embrionario en peces

anuales.

4) Inducción de diapausa 1 en función de la presencia de adultos e hipoxia a 19°C.

5) Aproximación a las técnicas de extracción, amplificación e identificación de

ácidos nucleicos (PCR, electroforesis en gel de agarosa).

6) Diseño y ajuste de condiciones de amplificación de cebadores específicos para

los genes igf1r e igfbp-1.

7) Análisis del patrón de expresión de los genes igf1r e igfbp-1, mediante RT-PCR

a tiempo final en embriones de dos grupos experimentales: detenidos en

diapausa 1 y no inducidos en diferentes estadios.

8) Secuenciación de los amplicones obtenidos y realización de análisis

comparativos con las secuencias obtenidas.

12

Materiales y Métodos

Obtención y mantenimiento de adultos de A. charrua en el laboratorio húmedo

de experimentación animal.

Los adultos reproductivos de A. charrua se obtuvieron, principalmente, de la colecta

de ejemplares en el campo durante el año 2018 (La Coronilla, Departamento de

Rocha, Uruguay: 33°53'47.38"S, 53°30'53.48"O) (figura 6). Además, se sumaron a

éstos, ejemplares obtenidos a partir de la eclosión de embriones generados en

condiciones de laboratorio por reproducción de parejas colectadas en el campo en el

2017, provenientes del mismo charco mencionado anteriormente. Los peces de

campo y los eclosionados en condiciones de acuario no se cruzaron entre sí.

Figura 6: A) Mapa físico de Uruguay, en el que se marca con un círculo rojo la zona donde

se colectaron los ejemplares adultos de Austrolebias charrua. B) Charco inundado en “La

Coronilla” departamento de Rocha (Uruguay), a partir del que se colectaron los ejemplares

adultos.

El mantenimiento de estos peces se realizó en peceras de 20 litros, que fueron

llenadas con agua obtenida mediante filtración por ósmosis reversa y reconstituida

con sal marina (Tetra Marine Salt Pro, 300 μS, pH 7-7,5) con continuo burbujeo de

aire y recambio constante de agua mediante un sistema de recirculación que abarcó

a todas las peceras. Se les proporcionó alimento una vez al día, que en etapa de

alevines y juveniles consistió en larvas nauplio de Artemia spp., y microgusanos

(Panangrellus redivivus). Mientras que durante la etapa adulta los principales

13

alimentos fueron Lombriculus variegatus, Tubifex spp. y Daphnia magna (Papa y col.,

2016).

La colecta y el mantenimiento de los ejemplares adultos, se realizó según lo

establecido en el protocolo avalado por la Comisión de Ética en el Uso de Animales

(CEUA) de la Facultad de Ciencias. Exp. 240011-001 205-16.

Obtención, cultivo e inducción de embriones a diapausa 1

Los embriones fueron obtenidos a partir del desove natural de tríos (1 macho y 2

hembras) y cuartetos (1 macho y 3 hembras) reproductivos, aislados en diferentes

peceras con contenedores llenos de esferas de vidrio (500 μm de diámetro Thomas

Scientific, Swedesboro, NJ). Luego de un elaborado cortejo, macho y hembra se

entierran en el sustrato (proporcionado por las esferas vidrio) para depositar y

fecundar sus huevos (Vaz-Ferreira y col., 1964; Papa y col., 2016).

Los embriones fueron colectados tamizando las esferas de vidrio de cada pecera con

una malla que los retiene, lo que permitió recogerlos con pipeta Pasteur y depositados

en placas de Petri con agua de acuario (Papa y col., 2016), para luego ser observados

y diagnosticados (según viabilidad y estadio) utilizando lupa binocular y microscopio

óptico de campo claro Olympus Vanox. Posteriormente, los embriones se cultivaron

a 19°C en placas multipocillos y de Petri separados por estadio con solución de

Yamamoto (NaCl 7,5 g; KCl 0,2 g; CaCl2. 2H2O 0,3 g; pH 7,3 en 1L; Yamamoto, 1967),

estos fueron continuamente evaluados hasta que se encontraron en alguno de los

estadios necesarios para el análisis posterior. De esta manera, se lograron obtener

los embriones entre 1 y 16 células, en epibolia entre 80 y 100% y en reagregado (I y

II) según Arezo y col. (2005).

Un grupo de los embriones en el estadio entre 1 y 16 células obtenidos en cada

recolección, fueron inducidos a diapausa 1 utilizando frascos con turba que luego se

introdujeron en una pecera con adultos a 19°C, este sistema altamente hipóxico

(prácticamente anóxico) y con señales provenientes de los adultos asegura un 100%

de inducción a diapausa 1, según Arezo y col. (2017).

Métodos moleculares

La técnica de RT-PCR en tiempo final fue la utilizada para realizar el análisis de

expresión, ya que permite evidenciar la presencia o ausencia de cierto ARN

14

mensajero (ARNm) mediante la amplificación in vitro (con cebadores diseñados de

forma específica para una región del gen a analizar) a partir de ADN copia (ADNc)

obtenido por retrotranscripción de muestras de ARN total de cada estadio del

desarrollo a analizar (Mullis y col., 1987; Potter y col., 2003).

Esta técnica no tiene un costo demasiado elevado y se utiliza de manera rutinaria en

el laboratorio, lo que permite obtener resultados rápidamente luego de diseñar y

ajustar las condiciones de amplificación de los cebadores para los genes de interés.

Además, mediante este abordaje, es posible purificar los amplicones obtenidos para

su secuenciación.

1) Extracción de ARN total y estimación de su calidad

A medida que fueron obtenidos los embriones de cada estadio se fijaron y

homogeneizaron (utilizando émbolo para tubos eppendorf) en el reactivo comercial

Trizol Reagent (Invitrogen), en una relación de 50 μL de trizol por embrión. Estas

muestras fueron almacenadas a -20°C hasta el momento de la extracción del ARN

total.

Para dicha extracción, se siguieron las recomendaciones del fabricante. Se

descongelaron las muestras a temperatura ambiente y se agruparon, de manera que

se generaron grupos de 3, 9, 10 y 20 embriones para generar triplicados de cada uno

de los estadios mencionados (ver tabla 1). Se les agregó cloroformo (0,2 mL cada 1

mL de Trizol) y se agitó durante 15 segundos. Se centrifugó a 12.000g, 10 minutos a

4°C para la separación de fases. Se procedió a extraer cuidadosamente la fase

acuosa que contenía el ARN, a la que se le agregó 0,5 mL de isopropanol cada 1mL

de Trizol y se centrifugó nuevamente a 12.000g durante 5 minutos a 4°C, el

isopropanol contenía 20 μg/mL de Dextrano (Sigma) para mejorar la visualización del

precipitado. El precipitado obtenido fue lavado con 1 mL de etanol 75% centrifugando

a 12.000g 5 minutos a 4°C y secado en bloque térmico a 60°C. Por último, el ARN fue

resuspendido durante 10 minutos en bloque térmico a 60°C y por vigoroso pipeteo en

un volumen de entre 10 y 20 μL de agua libre de nucleasas (Armesco).

15

Tabla 1: Muestras utilizadas para la extracción del ARN total, se indican los estadios

analizados, el número de embriones de cada una, el volumen de Trizol empleado en la

fijación, el volumen final de ARN total extraído y la cantidad estimada de ARN utilizado en la

reacción de retrotranscripción. Los valores de cantidad de ARN indicados con * fueron

calculados a partir del valor de concentración de ARN obtenido en el BioAnalyzer, los valores

sin * fueron calculados a partir del valor de concentración obtenido en el NanoDrop

(probablemente sobrestimados).

Muestra (estadio) N° de embriones Trizol (μL) ARN total (μL)

ARN en RT (ng)

M1 (1 a 16 células) 20 1000 20 600

M2 (1 a 16 células) 10 500 10 295

M3 (1 a 16 células) 20 1000 20 274

E1 (Epibolia) 20 1000 20 889

E2 (Epibolia) 10 500 10 1045

E3 (Epibolia) 10 500 10 611

DIA1 (Diapausa 1A) 9 450 15 38 *

DIA2 (Diapausa 1A) 9 450 15 64 *

DIA3 (Diapausa 1A) 9 450 15 50 *

DIB1 (Diapausa 1B) 9 450 15 66 *

DIB2 (Diapausa 1B) 9 450 15 88 *

DIB3 (Diapausa 1B) 3 150 15 18 *

R1 (Reagregado I y II) 20 1000 20 378



Se estimó la concentración y evaluó la pureza de cada extracción mediante el índice

de A260/A280, ambos valores obtenidos en el espectrofotómetro NanoDrop Liter

(Thermo). Se evaluó la integridad del ARN mediante la electroforesis de 4 μL de

muestra en 3 μL de tampón de carga para ARN (Formamida 70%, Azul de Bromofenol

0,1%) en un gel de agarosa 1% a 77 V durante 35 minutos en tampón TAE (Tris-

Acetato-EDTA) 1X y 0,5% GelRed (Biotum). La visualización y registro fotográfico de

los geles se realizó en un transiluminador UV.

16

Las muestras de ARN de diapausa 1A y 1B utilizadas en este trabajo fueron

proporcionadas por mi cotutor Nicolás Papa, ya que, aunque sí se realizó la inducción

de embriones a diapausa 1, estos fueron utilizados en su totalidad para otros trabajos

importantes en el laboratorio. La concentración de estas muestras fue determinada

mediante BioAnalyzer (Agilent) y no se determinó su pureza mediante el índice de

A260/A280.

2) Síntesis y evaluación del ADN copia

Se obtuvo el ADN copia (ADNc) mediante la retrotranscripción de los ARNm de cada

muestra, utilizando la enzima retrotranscriptasa SuperScript III (Invitrogen) y

cebadores oligo dT (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. Se incubó

durante 5 minutos a 65°C (para eliminar estructuras secundarias del ARN) una mezcla

de: ARN total (entre 10 pg y 5 μg, ver tabla 1) 1 μL de oligo dT 50 μM (Invitrogen), 1

μL de dNTPs (10 mM) y agua libre de nucleasas (Armesco) hasta completar 13 μL.

Se colocó esta mezcla en hielo durante 1 minuto (hibridación de los cebadores oligo

dT) y luego se adicionaron: 4 μL de solución tampón 5X, 1 μL de DTT (0,1 M), 1 μL

de RNasaOUT (inhibidor de ARNasas; Invitrogen) y 1 μL de la enzima

retrotranscriptasa. Para finalizar, la reacción se produjo en el termociclador Multigene

II (Labnet International, Inc.) a 50°C durante 1 hora y se inactivó la enzima a 70°C

durante 15 minutos.

El control de la correcta síntesis de ADNc y posible contaminación con ADN genómico

se realizó mediante PCR en tiempo final con cebadores diseñados para una región

codificante del gen de la β-actina (de expresión constitutiva) del pez cebra (Danio

rerio) (número de acceso del GenBank AF057040; Barralo y col., 1999), previamente

validado para A. charrua (tabla 2) (Arezo y col., 2014).

Las reacciones de amplificación fueron realizadas en el Termociclador Multigene II

(Labnet), utilizando las siguientes condiciones de ciclado: para comenzar 5 minutos

de desnaturalización inicial a 94°C; seguido de 32 ciclos de 30 segundos de

desnaturalización a 94°C, 30 segundos de hibridación a 55°C y 1 minuto de extensión

a 72°C; por último 7 minutos de extensión final a 72°C. La mezcla de reacción fue

preparada previo a la siembra del ADNc molde, de manera que (por cada tubo de

reacción) contenía: 10,4 μL de agua (Armesco), 1,5 μL de tampón 10X, 0,6 μL de

Cloruro de Magnesio (50 mM), 0,3 μL de dNTPs (10 mM), 0,5 μL de cada cebador (10

17

μM) y 0,2 μL de enzima Taq DNA polimerasa 5 U/μL (Invitrogen). Luego esta mezcla

fue dividida en cada uno de los tubos de reacción y se le agregó 1 μL del ADNc molde

a evaluar, a excepción del control negativo al que se le agregó 1 μL de agua, realizado

para detectar posibles contaminantes en los reactivos de la mezcla de reacción.

Tabla 2: Cebadores utilizados en las reacciones de amplificación del gen de la β-actina, se

indica la secuencia en sentido 5´-3´, el largo en nucleótidos y la temperatura de hibridación

(Tm) correspondientes.

Oligonucleótido Secuencia Largo (nt) Tm (°C)

Beta-actina-RSA-1 5´ GCCGGTTTTGCTGGAGATGAT 3´ 21 70

Beta-actina-RSA-2 5´ ATGGCAGGGGTGTTGAAGGTC 3´ 21 70

Los productos de amplificación de cada muestra fueron analizados mediante

electroforesis a 77 V durante 35 minutos, en la que se sembró una mezcla de 5 μL

del producto de amplificación y 3 μL de tampón para ADN en cada carril de un gel de

agarosa al 1,5%, tampón TAE 1X y 0,5% GelRed (Biotum). La visualización y registro

fotográfico de los geles se realizó en un transiluminador UV.

3) Diseño de los cebadores para igfbp-1 e igf1r

El diseño de los cebadores para los genes de interés (igf1r e igfbp-1) se realizó

mediante el programa “Primer Blast” del NCBI (Untergasser y col., 2012; Ye y col.,

2012). Se utilizó como molde una región codificante de estos dos genes, específicas

de A. charrua, obtenidas a partir del transcriptoma de referencia (Gajardo y col., en

preparación) mediante la realización de un BLAST (Basic Local Alignment Search

Tool) en el programa CLC Genomics Workbench 10.1.1

(www.qiagenbioinformatics.com), en el que se utilizaron secuencias de igf1r e igfbp-1

de A. limnaeus (pez anual cercano filogenéticamente) como molde para la búsqueda.

Las secuencias de A. limnaeus utilizadas se buscaron de forma manual en el

GenBank (códigos de acceso: XM_014020417.1 para igfbp-1 y XM_014026878.1

para igf1r).

Los cebadores fueron analizados utilizando el software libre Oligo Analyzer

(http://www.uku.fi/~kuulasma/OligoSoftware), el que permitió escoger los pares de

cebadores con menor probabilidad de generar horquillas, homodímeros y/o

heterodímeros para enviar a sintetizar a la empresa coreana Macrogen (tabla 3).

http://www.qiagenbioinformatics.com/

18

Tabla 3. Cebadores utilizados en las reacciones de amplificación de los genes igfbp-1 e igf1r,

se indica la secuencia en sentido 5´-3´, el largo en nucleótidos y la temperatura de hibridación

(Tm) correspondientes.

Oligonucleótido Secuencia Largo (nt) Tm (°C)

IGFRbF4 5´ CAGGGCTCGTTTGGTATGGT 3´ 20 60,5

IGFRbR4 5´ ACACATCCGCATCAGCTCAA 3´ 20 58,4

IGFbpF5 5´ CCTGAACCCATCCGCTGTT 3´ 19 59,5

IGFbpR5 5´ GCCTTGCTTGTCACAGTTGG 3´ 20 60,5

4) Ajuste de condiciones de amplificación de los cebadores y amplificación

in vitro de los genes de interés

El ajuste de las condiciones de amplificación de los cebadores correspondientes a

igfbp-1 fue realizada mediante la amplificación de ADNc obtenido a partir de muestras

de ARN extraído de hígado de hembra adulta de A. charrua, proporcionadas por mi

cotutor Nicolás Papa. La elección de este tejido fue debido a que se ha reportado que

en peces adultos la principal fuente de esta proteína es el hígado (revisado por

Kajimura y Duan, 2007). En el caso de los cebadores para igf1r se utilizaron muestras

de ADNc del estadio embrionario de reagregado para el ajuste de las condiciones de

amplificación, debido a que este gen se expresa durante la gastrulación embriones

de otros peces teleósteos (revisado por Wood y col., 2005).

Se llevaron a cabo varios ensayos de amplificación con estos cebadores en el

Termociclador Multigene II (Labnet) para el ajuste de las condiciones de amplificación.

En estas reacciones se utilizó una mezcla de reacción idéntica a la descrita en el

punto previo y un ciclado similar, pero con algunas modificaciones. Se utilizaron

diferentes temperaturas de hibridación, entre 56°C y 59°C con un tiempo de 45

segundos para ambos pares de cebadores. El tiempo de extensión fue de 1 minuto y

30 segundos, y el de extensión final de 10 minutos, ya que el amplicón esperado era

de mayor tamaño que el de la β-actina para ambos genes. Ambos pares de cebadores

funcionaron de manera similar en todas las condiciones de hibridación a las que se

los sometió.

Para el análisis de expresión de tipo presencia/ausencia, se realizaron ensayos de

amplificación con los cebadores diseñados para igfbp-1 e igf1r por triplicado,

19

utilizando como molde ADNc obtenido a partir de la retrotranscripción de cada una de

las muestras de ARN total listadas en la tabla 1. La temperatura de hibridación

seleccionada para ambos pares de cebadores fue de 57°C en todas las reacciones

de amplificación que se realizaron en el Termociclador Multigene II (Labnet).

Los productos de cada una de las reacciones de amplificación se analizaron mediante

electroforesis a 77 V durante 35 minutos, en las que se sembró una mezcla de 5 μL

del producto de amplificación y 3 μL de tampón para ADN en cada carril de un gel de

agarosa al 1,5%, tampón TAE 1X y 0,5% GelRed (Biotum). Realizando la

visualización y registro fotográfico de los geles en un transiluminador UV.

5) Purificación de productos de PCR para secuenciación

Se realizó la reamplificación por triplicado de muestras de diapausa 1A, diapausa 1B

y reagregado, en las que se habían observado las bandas de interés para ambos

genes. Luego se realizó una electroforesis a 77 V en gel de agarosa 2%, tampón TAE

1X y GelGreen 0,5% (Biotum), para mejorar la resolución de las bandas de los

amplicones. Este colorante presenta la ventaja de que se visualiza en transiluminador

de luz azul, lo que permitió recortar las bandas de manera más segura (sin exposición

a la luz ultravioleta) mediante el uso de pipetas Pasteur estériles. Posteriormente los

distintos recortes de banda fueron purificados con el GFX PCR DNA Gel Band

Purification kit (GeneralElectric).

6) Secuenciación y análisis de las secuencias

Los productos de amplificación obtenidos para ambos pares de cebadores se

enviaron a secuenciar al “Servicio de Secuenciación del Instituto Pasteur de

Montevideo” (secuenciador automático 3500 Genetic Analyzer Applied Biosystems)

con ambos cebadores de cada par (IGFRbF4 e IGFRbR4 para igf1r, IGFbpF5 e

IGFbpR5 para igfbp-1; ver tabla 3). Las secuencias obtenidas fueron editadas de

forma manual con el programa Mega X (https://www.megasoftware.net; Kumar y col.,

2018). Luego de la edición se realizó la búsqueda de secuencias nucleotídicas

homólogas en la base de datos de secuencias del NCBI (GenBank), mediante el

algoritmo de megaBLAST para la búsqueda de secuencias altamente similares

(Altschul y col., 1990).

https://www.megasoftware.net/

20

Posteriormente se realizó un análisis comparativo entre las secuencias obtenidas

junto a las 25 secuencias con mayor homología encontradas en el GenBank para

cada gen mediante el BLAST y las secuencias de ARNm de D. rerio correspondientes

a cada gen buscadas de forma manual en la misma base de datos. Se utilizó el

método de múltiples alineamientos CLUSTALW del programa MEGA X

(https://www.megasoftware.net; Kumar y col., 2018) para alinear las secuencias de la

matriz de datos. A partir de los alineamientos se realizaron los análisis filogenéticos

con el método de “unión de vecinos” (distancia p) (Saitou y Nei, 1987), basado en el

número de diferencias entre las secuencias de la matriz de datos. El soporte

estadístico de los nodos generados en cada uno de las filogenias fue obtenido

aplicando el método de “boostrap” (Felsenstein, 1985) con 1000 réplicas.

En el análisis realizado para igfbp-1 se agregaron a la matriz de datos las secuencias

encontradas de forma manual en el GenBank para los mensajeros de las Igfbps 2 a 6

de A. limnaeus y Kryptolebias marmoratus. Estas especies de peces son las más

cercanas filogenéticamente a A. charrua para las que existe información de estas

secuencias en la base de datos. En cuanto al análisis realizado para igf1r, se

agregaron a la matriz de datos las secuencias de ARNm encontradas de forma

manual en el GenBank para las dos isoformas del receptor de insulina de D. rerio

(insra e insrb), que se utilizaron como grupo externo para enraizar el árbol filogenético

construido.

Por último, se realizaron dos alineamientos con el método de múltiples alineamientos

CLUSTALW en el programa MEGA X (Kumar y col., 2018) que incluyeron las

secuencias obtenidas para igf1r o igfbp-1, la secuencia del transcriptoma de

referencia de igf1r o igfbp-1 y una o dos secuencias de otro teleósteo con las que se

compararon las secuencias obtenidas. A partir de estos alineamientos se realizó la

traducción de las secuencias nucleotídicas a secuencia aminoacídica de igf1r e igfbp-

1, con las que se realizó la búsqueda de dominios de proteína conservados en la base

de datos del NCBI mediante la realización de un BLASTp. Además, los alineamientos

fueron exportados y convertidos a formato clustal en el programa CLUSTAL X (Larkin

y col., 2007), lo que permitió evidenciar el grado de conservación de las secuencias

obtenidas mediante la comparación con secuencias de otros teleósteos que se

incluyeron en los alineamientos.

https://www.megasoftware.net/

21

Resultados y Discusión

1) Integridad y concentración del ARN obtenido

La integridad del ARN total extraído a partir de los grupos de embriones de diferentes

estadios del desarrollo embrionario temprano y de hígado de hembra adulta de A.

charrua, fue evaluada mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5 % (figura

7).

Figura 7: Electroforesis en geles de agarosa 1,5% de los ARNs totales obtenidos de hígado

y diferentes estadios embrionarios de A. charrua, donde es posible visualizar los ARNs

ribosomales 28s y 18s en todas las muestras y los ARNs de transferencia en algunas de ellas.

MPB: Marcador de Pares de Bases. H: Hígado de hembra adulta. M: ARN materno (1 a 16

células) E: Epibolia 80 a 100% DIA: Diapausa 1A. DIB: Diapausa 1B. R: Reagregado (I y II).

En la parte inferior se muestran imágenes del estadio del desarrollo al que corresponde cada

carril (fig. 5).

Se presenta una serie de extracciones en la que se puede evidenciar que las muestras

de ARN total obtenidas presentan muy buena integridad, ya que es posible observar

los ARNs ribosomales 28s (4718 nucleótidos) y 18s (1874 nucleótidos) como bandas

discretas. Además, en algunas muestras se observa una banda entre 65 y 110

nucleótidos correspondiente a los ARNs de transferencia, así como también un

sombreado a lo largo del carril que indica la presencia de ARNs mensajeros (figura

7).

Estos resultados permitieron realizar la retrotranscripción de los ARNs totales

obtenidos, ya que no se evidenció degradación. Sin embargo, es importante

22

mencionar que no se lograron observar los ARNs ribosomales en todas las muestras

presentadas en la tabla 4, por lo que no fue posible conocer la integridad del ARN de

todas las muestras utilizadas para la retrotranscripción mediante esta metodología.

De todas maneras, sí se logró obtener ADNc de todas ellas, por lo que probablemente

no se hayan logrado observar en el gel los ARNs ribosomales de algunas muestras

debido a que presentaban una baja concentración de ARN total.

Tabla 4. Muestras utilizadas para la retrotranscripción. Se indica el estadio o tejido de partida

de cada una, la concentración estimada por el NanoDrop (valores probablemente

sobrestimados) y la pureza en cuanto a contaminación con proteínas (índice de A260/280).

Las muestras para las que se obtuvo su concentración en el BioAnalyzer se marcan con un

asterisco (*)

Muestra (estadio) Concentración (ng/μL) Pureza (A260/A280)

M1 (1 a 16 células) 200,0 1,60

M2 (1 a 16 células) 36,9 1,64

M3 (1 a 16 células) 34,2 1,33

E1 (Epibolia) 111,1 1,38

E2 (Epibolia) 209,0 1,78

E3 (Epibolia) 76,4 1,87

DIA1 (Diapausa 1A) 19,0 *



DIB1 (Diapausa 1B) 33,0 *



R1 (Reagregado I y II) 252,0 1,20



14H4 (Hígado) 1963,8 1,79

Se estimó la concentración y pureza del ARN (índice de A260/A280) de cada muestra

mediante las medidas proporcionadas por el NanoDrop. Estos datos, en conjunto con

la evaluación de la integridad de los ARNs, permitieron escoger las mejores muestras

para la realización de la retrotranscripción, presentadas en la tabla 4.

23

2) Evaluación del ADN copia

Es necesario evaluar la síntesis y calidad del ADNc obtenido con respecto a la posible

presencia de contaminación con ADN genómico de las muestras de ARN de partida

que no puede ser detectado en una simple electroforesis de los ARNs. Con este doble

propósito, se realizó la amplificación in vitro de un fragmento codificante de la β-actina

(de expresión constitutiva), seguido de la visualización de los productos de

amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa (figura 8). Se utilizaron

cebadores diseñados para una región de aproximadamente 400 pares de bases (pb)

de este gen en D. rerio y validados en A. charrua (Arezo y col., 2014) de tal manera

que, la región codificante amplificada contiene un intrón. De esta manera, si existía

presencia de ADN genómico (ADNg) en las muestras, probablemente se observaría

un amplicón de aproximadamente 700 pb además del de 400 pb esperado.

Figura 8: Electroforesis en gel de agarosa 1,5% de los productos de amplificación obtenidos

con los cebadores para β-actina a partir de ADNc de una réplica biológica de cada uno de los

estadios del desarrollo a analizar e hígado de hembra adulta. MPB: Marcador de Pares de

Bases. M: ARN materno (1 a 16 células) E: Epibolia 80 a 100% DIA: Diapausa 1A. DIB:

Diapausa 1B. R: Reagregado (I y II). H: Hígado de hembra adulta. C-: Control negativo (sin

molde de ADNc). En la parte inferior se muestran imágenes del estadio del desarrollo al que

corresponde cada carril (fig. 5).

En todas las muestras analizadas se observó una banda de aproximadamente 400

pb, correspondiente al producto de amplificación generado a partir de ADNc.

Asimismo, en ninguna muestra se visualizó una banda de 700 pb (figura 8). Este

24

resultado, permitió concluir que el ADNc obtenido a partir de cada una de las muestras

era de buena calidad y probablemente no presentaba contaminación con ADNg, por

lo que eran confiables para continuar con el análisis de expresión de los genes de

interés. De todas maneras, para confirmar que las muestras no presentaban

contaminación con ADNg se debería haber realizado una reacción de amplificación

para todas las muestras de ARN total sin previa síntesis de ADNc.

3) Ajuste de condiciones de amplificación de los cebadores diseñados

para igfbp-1 e igf1r

Previo al análisis de expresión, se realizó el diseño y ajuste de las condiciones de

amplificación de cebadores específicos para una región codificante de 513 y 726 pb

de igfbp-1 e igf1r respectivamente de A. charrua. El diseño de los cebadores fue

posible mediante el uso de secuencias obtenidas a partir del transcriptoma de

referencia de A. charrua (Gajardo y col., en preparación) que presentaron homología

con secuencias de peces cercanos filogenéticamente para estos dos genes.

El ajuste de las condiciones de amplificación de los cebadores para igfbp-1 fue

realizado utilizando como molde ADNc de hígado de hembra adulta para diferentes

ensayos de PCR, en los que la temperatura de hibridación fue desde los 56°C a los

59°C. El amplicón esperado de 513 pb, corresponde a la banda de mayor intensidad

observada en la figura 9. Sin embargo, se obtuvieron dos amplicones no esperados

de 600 y 700 pb aproximadamente, que no fueron eliminados por el aumento de la

temperatura de hibridación, como puede observarse en la figura 9. Al no haber una

diferencia aparente en los productos obtenidos en cada ensayo, podría proponerse

que posiblemente los tres productos de amplificación obtenidos fueron específicos

para el par cebadores diseñados.

25


a partir de ADNc de hígado de hembra adulta con los cebadores diseñados para igfbp-1 a

diferentes temperaturas de hibridación. MPB: Marcador de Pares de Bases.

Se intentó ajustar las condiciones de amplificación del par de cebadores diseñados

para igf1r con el mismo ADNc de hígado de hembra adulta empleado para los

cebadores de igfbp-1. Sin embargo, no se logró obtener el amplicón esperado (figura

10).

En otros peces teleósteos se ha demostrado la expresión de igf1r en el tejido muscular

y las gónadas del adulto, así como también en varios estadios embrionarios, siendo

particularmente importante en la determinación temprana del eje dorso-anterior en D.

rerio (Eivers y col., 2004; Wood y col., 2005). Debido a estos antecedentes se

procedió a ajustar las condiciones de amplificación del par de cebadores para igf1r

mediante la utilización del ADNc de una de las muestras de embriones en estadios

de reagregado, ya que es en este estadio del desarrollo de A. charrua cuando

comienzan a establecerse los diferentes ejes embrionarios desde el organizador

(Pereiro y col., 2017).

En este caso únicamente se probaron dos temperaturas de hibridación diferentes para

el ajuste (56°C y 58°C), ambas condiciones permitieron obtener un único amplicón

con el tamaño esperado (aproximadamente 700 pb) (figura 10). Este resultado

sugiere que este receptor de IGF no se expresa en el tejido hepático de A. charrua,

lo que representa un resultado novedoso de este trabajo.

26


a partir de ADNc de hígado de hembra adulta y reagregado con los cebadores diseñados

para igf1r a diferentes temperaturas de hibridación. MPB: Marcador de Pares de Bases. R3:

Reagregado (muestra 3).

4) Análisis de expresión de igf1r y análisis comparativo de las secuencias

obtenidas.

El análisis de expresión de tipo presencia/ausencia para ambos genes se realizó

mediante ensayos de PCR en tiempo final por triplicado para cada uno de los estadios

analizados.

A partir de los cebadores diseñados para igf1r se obtuvo el amplicón de 726 pb

esperado en todos los estadios del desarrollo temprano de A. charrua analizados

(incluso en diapausas 1A y 1B) en las tres réplicas biológicas, en la figura 11 se

muestran los resultados para una de las réplicas biológicas.

Este gen codifica para el principal receptor de las señales de Igf-1 e Igf-2, importantes

en el crecimiento y proliferación celular (Pozios y col., 2001; Maures y col., 2002).

Además, en el pez anual A. limnaeus se ha evidenciado que al inhibir este receptor

los embriones ingresan a un estadio similar a la diapausa 2 (Woll y Podrabsky, 2017).

Por lo tanto, este patrón de expresión evidenciado en todos los estadios del desarrollo

temprano de A. charrua sugeriría que los embriones se encuentran censando

constantemente la presencia de la señal de los ligandos de IGF, por lo que estarían

27

en condiciones de establecer una respuesta a esta señal, que podría determinar la

entrada o el escape de la diapausa 1.


con los cebadores para igf1r a partir del ADNc de una réplica biológica de cada uno de los

estadios analizados. MPB: Marcador de Pares de Bases. M2: ARN materno (1 a 16 células)

E2: Epibolia 80 a 100% DIA2: Diapausa 1A. DIB2: Diapausa 1B. R2: Reagregado (I y II). C-:

Control negativo (sin molde de ADNc). En la parte inferior se muestran imágenes del estadio

del desarrollo al que corresponde cada carril (fig.5).

Los datos obtenidos por mi cotutor Nicolás Papa, a partir del transcriptoma para

diferentes estadios y condiciones de desarrollo de A. charrua (distintos a los

analizados en este trabajo), confirman los resultados obtenidos en el presente trabajo,

ya que se observa la expresión de igf1r en el desarrollo temprano de A. charrua en

los estadios y condiciones analizadas (figura 12) (Papa y col., no publicado).

En Oncorhynchus mykiss (trucha arcoíris), se ha observado que un aumento

fisiológico en los niveles de Igf-1 o Insulina (que se puede unir con menor afinidad a

Igf-1r), provoca una disminución en la expresión de igf1r (Banos y col., 1997;

Chauvigné y col., 2003). Los datos del transcriptoma muestran que en condiciones de

inducción a diapausa 1 existe una mayor expresión de igf1r en comparación con el

promedio registrado, así como una menor expresión de este gen sin condiciones de

28

inducción a diapausa 1 y en el estadio post diapausa 1 (figura 12). Por lo tanto, estos

datos sugieren que podrían existir menores niveles de señalización por alguno de los

ligandos de este receptor en condiciones de inducción a diapausa 1, en la que los

embriones tendrían una mayor sensibilidad a cualquier aumento o disminución de

este tipo de señales de crecimiento.

Figura 12: Análisis de los niveles de expresión de igf1r obtenidos a partir de los valores de

expresión en RPKM (secuencias por kilo base de transcripto por millón de secuencias mapeadas)

normalizados por la media de expresión del transcripto. Ilustración gráfica obtenida por

programa IDEP 9.0 (http://bioinformatics.sdstate.edu/idep/) (realizado por mi cotutor Nicolas

Papa, Papa y col., no publicado). Los estadios analizados corresponden a: 1 a 16 células

(Materno), 72 horas post fecundación sin condiciones de inducción a diapausa 1 (NoInd), 72

hs. post fecundación en condiciones de inducción a diapausa 1 (IndDI) y embriones post

diapausa 1 activados durante 3 horas (PosDI). Los datos del transcriptoma se obtuvieron

mediante secuenciación Ilumina Hiseq 2500 con lecturas pareadas de 150 pb a partir de una

librería poliA.

En pez cebra se ha demostrado que la señal de los ligandos de IGF a través del

receptor Igf-1r es necesaria para inducir la expresión de genes como cordina y

goosecoid (Eivers y col., 2004), importantes en el desarrollo de los ejes embrionarios

y típicamente expresados en el organizador (Gilbert, 2000). Curiosamente, el gen

cordina se expresa desde el comienzo del desarrollo en A. limnaeus (Wagner y

Podrabsky., 2015b), así como en A. charrua según estudios realizados recientemente

en nuestro laboratorio (Blanco y col., no publicado), por lo que la expresión temprana

de igf1r podría ser una vía de inducción de la expresión temprana de estos genes del

organizador, que también podrían tener un rol (exclusivo en peces anuales) en la

decisión de entrada o escape de la diapausa 1.

Para confirmar que la banda de 726 pb obtenida con los cebadores diseñados para

igf1r se trataba efectivamente de un fragmento del ARNm que codifica para este

receptor, se enviaron a secuenciar amplicones purificados a partir de muestras de los

estadios de diapausa 1A, diapausa 1B y reagregado. Las secuencias obtenidas

fueron editadas de forma manual, de manera que se eliminaron los extremos (donde

http://bioinformatics.sdstate.edu/idep/

29

la secuencia no se encontraba bien resuelta) y se corrigió la definición de algunos

sitios utilizando la información aportada por el cromatograma generado en el Servicio

de Secuenciación del Instituto Pasteur de Montevideo para cada amplicón.

Las secuencias editadas se incluyeron en un alineamiento junto con los cebadores y

la secuencia de igf1r del transcriptoma de referencia a partir de la que se diseñaron.

Este alineamiento evidenció que las secuencias obtenidas eran tan similares a la

secuencia del transcriptoma de referencia (como se esperaba) que se encontraron

únicamente dos polimorfismos sinónimos (no modificaban la secuencia aminoacídica)

(figura 13).

Figura 13. Alineamiento realizado mediante el algoritmo de CLUSTALW con la secuencia del

transcriptoma de referencia para igf1r, los cebadores diseñados para este gen y las

secuencias de los amplicones obtenidos con estos cebadores a partir de muestras de:

diapausa 1A (DIA1), diapausa 1B (DIB2) y reagregado (R1) (marcadas con una barra roja).

Los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) se señalan con flechas rojas apuntando hacia

la secuencia del transcriptoma de referencia.

Con el fin de determinar las relaciones evolutivas entre las secuencias aisladas y

algunas de las secuencias para igf1r reportadas en peces se realizó un análisis

30

comparativo utilizando el algoritmo de “unión de vecinos” basado en el número de

diferencias y distancia p. Este análisis evidenció que el amplicón obtenido se trataba

efectivamente de un fragmento de ARNm que codifica para el receptor Igf-1r en A.

charrua, debido a que las secuencias obtenidas son muy similares a la secuencia del

transcriptoma de A. charrua a partir de la que se diseñaron los cebadores y

secuencias de mensajeros que codifican para este receptor en dos especies de peces

de la familia Rivulidae (A. limnaeus y K. marmoratus), con un apoyo de boostrap

superior a 70 en estos nodos (figura 14).

Figura 14: Árbol filogenético construido utilizando el algoritmo de “unión de vecinos” (1000

réplicas de boostrap como soporte estadístico) a partir de una matriz de datos generada

mediante el alineamiento de las secuencias obtenidas por secuenciación con los cebadores

diseñados para igf1r (señaladas con una llave roja), secuencias de ARNm de este gen que

presentaron homología con las secuencias obtenidas y secuencias de ARNm del receptor de

insulina (insr) de Danio rerio importadas desde la base de datos del GenBank. Los nodos con

un apoyo de boostrap menor a 50 fueron colapsados.

31

Se han identificado dos isoformas distintas de Igf-1r en D. rerio (Igf-1ra e Igf-1rb) a

diferencia de los mamíferos en los que solo existe una, estos parálogos tienen una

estructura general muy similar, pero una sorprendentemente baja similitud

aminoacídica entre ellos (69,8 %), lo que sugiere una duplicación ancestral de este

gen (Maures y col. 2002; Wood y col., 2005). Además, la evidencia apunta a que estas

isoformas se encontrarían en todos los peces teleósteos (Wood y col, 2005), por lo

que probablemente se encuentren también en A. charrua. Sin embargo, mediante

esta aproximación no se logró identificar para cuál de las dos isoformas de Igf-1r

codifican las secuencias de A. charrua obtenidas, ya que en la filogenia no se observó

una mayor cercanía a ninguna de las secuencias de D. rerio pertenecientes a cada

isoforma (figura 14). Esto sugiere que los cebadores posiblemente fueron diseñados

para una región muy conservada entre igf1ra e ig1rb.

Para confirmar si los cebadores diseñados amplifican una región conservada del gen

y por lo tanto importante para la función del receptor, se procedió a realizar un

alineamiento de las secuencias obtenidas junto con secuencias de igf1ra e igf1rb de

D. rerio y la secuencia del transcriptoma de referencia a partir de la que se diseñaron

los cebadores. Este alineamiento evidenció que la secuencia aminoacídica traducida

a partir del marco de lectura abierto de la secuencia nucleotídica, presentaba un alto

grado de similitud con la secuencia aminoacídica traducida de ambas isoformas de

Igf-1r presentes en D. rerio (figura 15). Este resultado logró demostrar que la región

del gen amplificada está muy conservada a lo largo de la evolución, ya que D. rerio

se encuentra alejado filogenéticamente de A. charrua con respecto a otros teleósteos

(Zou y col. 2012).

32

Figura 15. Alineamiento traducido realizado mediante el algoritmo CLUSTALW con la

secuencia de igf1r del transcriptoma de referencia, las secuencias de los ARNm de igf1ra e

igf1rb de D. rerio y las secuencias de los amplicones de igf1r obtenidos a partir de muestras

de: diapausa 1A (DIA1), diapausa 1B (DIB2) y reagregado (R1). Los sitios conservados en

todas las secuencias (totalmente conservados) se marcan con un asterisco en la parte inferior

(*), los sitios fuertemente conservados se indican con dos puntos (:) y los sitios débilmente

conservados con un punto (.).

Con el objetivo de conocer qué dominio de Igf-1r se amplificó con los cebadores

diseñados, se realizó un BLASTp en la base de datos del NCBI a partir de la secuencia

aminoacídica. El resultado obtenido, reveló que la secuencia amplificada se trata de

un fragmento que codifica para el dominio tirosina quinasa catalítico intracelular de

Igf-1r, importante para la función de este receptor, ya que la fosforilación de las

tirosinas en este dominio en respuesta a la unión del ligando de IGF es lo que

desencadena las cascadas de señalización, como se muestra en la figura 4 (Pozios

y col., 2001) (figura 16)

33

Figura 16. Resultado del BLASTp realizado en la base de datos del NCBI con las secuencias

aminoacídicas traducidas en el marco de lectura abierto a partir de las secuencias

nucleotídicas del amplicón de 726 pb obtenido con los cebadores diseñados para igf1r.

5) Análisis de expresión para igfbp-1 y análisis comparativo de las

secuencias obtenidas.

A diferencia de igf1-r, los resultados obtenidos con los cebadores diseñados para

igfbp-1 son algo más complejos, ya que se logró observar la presencia de tres bandas

en diferentes estadios del desarrollo (figura 17). La banda esperada, corresponde a

la de menor tamaño (500 pb), que se expresa en todos los estadios analizados.

Mientras que las bandas de 700 pb (observada específicamente en diapausas y

epibolia) y 600 pb (observada únicamente en reagregado) no eran esperadas según

el diseño de cebadores realizado.

En la tabla 5 se resumen los resultados obtenidos para las tres réplicas biológicas

realizadas. La misma evidencia que estos resultados no fueron totalmente

reproducibles ya que en dos de las réplicas biológicas no se observó ninguna banda

para los estadios de 1 a 16 células y reagregado. Esto pudo deberse a que la cantidad

de molde de ADNc era baja en esas muestras, encontrándose cercano a límite de

detección de la PCR en tiempo final.

34


con los cebadores para igfbp-1 a partir del ADNc de una réplica biológica de cada uno de los

estadios analizados y de hígado de hembra adulta como control positivo. MPB: Marcador de

Pares de Bases. M2: ARN materno (1 a 16 células) E2: Epibolia 80 a 100% DIA2: Diapausa

1A. DIB2: Diapausa 1B. R2: Reagregado (I y II). C+: Control positivo (hígado de hembra

adulta). C-: Control negativo (sin molde de ADNc). En la parte inferior se muestran imágenes

del estadio del desarrollo al que corresponde cada carril (fig. 5).

El resultado más reproducible obtenido (duplicado), fue que la banda de mayor

tamaño se observa únicamente en los estadios de diapausa (1A y 1B) y en el estadio

previo a ésta (epibolia 80 a 100 %). Este resultado indica que podría tratarse de un

marcador molecular para embriones en diapausa 1 y/o con señales de inducción a la

misma. Cabe destacar que los grupos de embriones en epibolia podrían tener

embriones con señales de inducción y sin señales de inducción a diapausa 1, lo que

explicaría la presencia de esta banda en dos de las réplicas biológicas para este

estadio. Esta hipótesis surge a partir de datos de análisis transcriptómicos de

expresión diferencial entre embriones sometidos a señales de inducción de diapausa

1 durante 72 horas post fecundación (inducción 72 horas, 20-30% de epibolia) y

cultivados sin señales de inducción durante 72 horas post fecundación (sin inducción

72 horas). Los datos muestran que, en el grupo inducción 72 horas, existen cerca de

700 genes que muestran expresión diferencial exclusiva (Papa y col. no publicado).

35

Tabla 5: Resumen de los resultados obtenidos en las distintas réplicas biológicas a partir de

la amplificación in vitro utilizando los cebadores diseñados para igfbp-1. La X indica presencia

y el - ausencia de la banda para cada una de las muestras. A su vez las bandas que fueron

purificadas y enviadas a secuenciar están indicadas con la letra (S).

Muestra (estadio) Banda de 500 pb Banda de 600 pb Banda de 700 pb

M1 (1 a 16 células) - - -

M2 (1 a 16 células) X - -

M3 (1 a 16 células) - - -

E1 (Epibolia) X - X

E2 (Epibolia) X - X

E3 (Epibolia) - - -

DIA1 (Diapausa 1A) X - X

DIA2 (Diapausa 1A) X (S) - X (S)

DIA3 (Diapausa 1A) X - X

DIB1 (Diapausa 1B) X (S) - X

DIB2 (Diapausa 1B) X (S) - X (S)

DIB3 (Diapausa 1B) X - -

R1 (Reagregado I y II) - - -

R2 (Reagregado I y II) X (S) X (S) -

R3 (Reagregado I y II) - - -

14H4 (Hígado) X X X

Se procedió al recorte de las bandas del gel y purificación de los amplicones obtenidos

para su posterior secuenciación, a partir de diferentes estadios que se detallan en la

tabla 5.

Se obtuvieron cuatro secuencias a partir de la secuenciación de amplicones de 500

pb para igfbp-1, correspondientes a las muestras de diapausa 1A (DIA2), diapausa

1B (DIB1 y DIB2) y reagregado (R2). Estas secuencias fueron editadas manualmente

tal como ya se describió para las secuencias de igf1r, para luego ser incluidas en un

alineamiento junto con los cebadores y la secuencia de igfbp-1 del transcriptoma de

referencia a partir de la que se diseñaron. Este alineamiento mostró que las

secuencias obtenidas eran tan similares a la secuencia del transcriptoma de

36

referencia (como se esperaba) que se encontraron únicamente tres polimorfismos

sinónimos (figura 18).


transcriptoma de referencia para igfbp-1, los cebadores diseñados para este gen y las

secuencias de los amplicones obtenidos con estos cebadores a partir de muestras de:

diapausa 1A (DIA2), diapausa 1B (DIB1 y DIB2) y reagregado (R2). Los polimorfismos de

nucleótido simple (SNPs) se señalan con una flecha roja apuntando hacia la secuencia del

transcriptoma de referencia.

El análisis filogenético realizado evidenció que las secuencias obtenidas presentan

mayor similitud con secuencias de ARNm de igfbp-1 de diversas especies de peces,

siendo las más cercanas las correspondientes a dos especies de rivúlidos, seguidas

en cercanía por secuencias de ARNm de este gen correspondientes a peces del orden

Cyprinodontiformes. Las secuencias con menor similitud corresponden a otras Igfbps

que se incluyeron en el análisis (figura 19). Esto permitió confirmar que el amplicón

de 513 pb obtenido se trataba efectivamente de una región codificante para Igfbp-1

de A. charrua.

37

Figura 19: Árbol filogenético construido utilizando el algoritmo de “unión de vecinos” (1000

réplicas de boostrap como soporte estadístico) a partir de una matriz de datos generada

mediante el alineamiento de las secuencias obtenidas a partir del amplicón de 500 pb con los

cebadores diseñados para igfbp-1 (señaladas con una llave roja), secuencias de ARNm de

este gen importadas desde las base de datos del GenBank y secuencias de ARNm para las

Igfbps 2 a 6 importadas desde la misma base de datos. Los nodos con un apoyo estadístico

menor a 50 fueron colapsados.

Además, se evidenció que la secuencia de ARNm de D. rerio correspondiente a la

isoforma igfbp-1b presenta mayor similitud con las secuencias obtenidas que la

isoforma igfbp-1a, con un buen apoyo estadístico de boostrap. Por lo tanto, la banda

de 500 pb obtenida probablemente se trate de un fragmento del mensajero de igfbp-

38

1b de A. charrua. En D. rerio se ha identificado que la expresión de igfbp-1a e igfbp-

1b es inducida en respuesta a hipoxia durante el desarrollo embrionario temprano y

tardío respectivamente (Kamei y col., 2008). En A. charrua, los resultados obtenidos

muestran que igfbp-1b se estaría expresando durante todo el desarrollo temprano (ver

figura 17 y tabla 5).

Con el objetivo de analizar el grado de conservación de las secuencias amplificadas,

se realizó un alineamiento que incluyó las secuencias obtenidas y una de las

secuencias de ARNm predicho de Kryptolebias marmoratus (pez sudamericano de la

familia Rivulidae) (código de acceso en el GenBank XM_017422409.1) que fue la que

evidenció mayor similitud en el análisis filogenético realizado (figura 20).

Figura 20. Alineamiento traducido realizado mediante el algoritmo CLUSTALW con la

secuencia de igfbp-1 del transcriptoma de referencia, la secuencia del ARNm predicho para

igfbp-1 de K. marmoratus y las secuencias de los amplicones de 500 pb para igfbp-1

obtenidas a partir de muestras de: diapausa 1A (DIA2), diapausa 1B (DIB1 y DIB2) y

reagregado (R2). Los sitios conservados en todas las secuencias (totalmente conservados)

se marcan con un asterisco (*), los sitios fuertemente conservados se indican con dos puntos

(:) y los sitios débilmente conservados con un punto (.).

Las secuencias aminoacídicas traducidas a partir del marco de lectura abierto de las

secuencias nucleotídicas evidenciaron que la región del gen amplificada se encuentra

parcialmente conservada, ya que se observan aminoácidos que no son conservados

entre A. charrua y K. marmoratus a pesar de que son cercanos filogenéticamente

(ambos pertenecen a la familia Rivulidae) (figura 20).

39

El BLASTp realizado en la base de datos de proteínas del NCBI a partir de las

secuencias obtenidas traducidas, reveló que una parte de la región amplificada del

gen codifica para un dominio conservado de unión a IGF, característico de la

superfamilia de proteínas Igfbps (figura 21)

Figura 21. Resultado del BLASTp realizado en la base de datos del NCBI con las secuencias

aminoacídicas traducidas a partir de las secuencias nucleotídicas del amplicón de 513 pb

obtenido con los cebadores diseñados para igfbp-1.

Con respecto a la banda de 600 pb, se purificó y se envió a secuenciar una de las

muestras de reagregado (R2, ver tabla 4). La secuencia obtenida fue de buena

calidad en los extremos, regiones conservadas respecto a las secuencias de 500 pb.

Sin embargo, una región del centro de la secuencia de aproximadamente 88 pb no

logró resolverse debido a que el cromatograma no presentaba información para una

única secuencia. La reamplificación de productos de PCR realizada con el fin de

obtener suficiente cantidad de producto para secuenciar pudo haber aumentado la

amplificación inespecífica y/o el número de copias de otras posibles secuencias

específicas amplificadas, lo que no permitió resolver la región central de la secuencia.

Podrían existir diferentes ARNs con algunas regiones comunes y otras divergentes

que generarían amplicones de tamaños similares. Esta posibilidad encuentra su

fundamento en el hecho de que igfbp-1 presenta al menos dos copias en el genoma

de todos los teleósteos (revisado por García de la Serrana y Macqueen, 2018),

existiendo la posibilidad de que en Austrolebias haya aún más, dado que el tamaño

40

de su genoma es el doble que el del resto de los rivúlidos debido a una gran

abundancia de transposones y retrotransposones (García y col., 2015).

Por último, se enviaron también a secuenciar dos amplicones purificados a partir de

la banda de 700 pb observadas en diapausa 1A y 1B (muestras DIA2 y DIB2, ver

tabla 5). Se obtuvieron dos secuencias, que luego de realizar la edición como ya se

describió anteriormente, presentaron buena calidad. Sin embargo, algunas regiones

de las secuencias (en particular de la correspondiente a DIA2) no lograron resolverse

completamente, ya que el cromatograma también evidenció la presencia de más de

una secuencia amplificada (figura 22).


transcriptoma y del genoma de referencia para igfbp-1, los cebadores diseñados para este

gen y las secuencias de los amplicones de 700 pb obtenidos con estos cebadores a partir de

muestras de: diapausa 1A (DIA2) y diapausa 1B (DIB2) (marcadas con una barra roja). Los

nucleótidos no resueltos aparecen como una N. Los polimorfismos de nucleótido simple

(SNPs) y la inserción de cuatro nucleótidos se señalan con flechas rojas.

Las secuencias mencionadas, presentaron homología con secuencias de ARNm de

igfbp-1 al realizar el megaBLAST en el GenBank. Sin embargo, el porcentaje de

cobertura resultó muy bajo para todas las secuencias encontradas. Ante este

resultado, se realizó un BLAST contra el genoma y transcriptoma de referencia de A.

41

charrua (Gajardo y col., en preparación), utilizando el programa CLC Genomics

Workbench 10.1.1 (www.qiagenbioinformatics.com). En el genoma se encontró una

secuencia con alta homología y porcentaje de cobertura que no se encontró presente

en el transcriptoma de referencia. Se procedió a descargar esta secuencia para

incluirla en un alineamiento que incluyó, además: las dos secuencias obtenidas y la

secuencia de transcriptoma de referencia a partir de la que se diseñaron los

cebadores (figura 22).

El alineamiento reveló que dos grandes regiones de 93 y 114 pb del amplicón de 700

pb, corresponden a secuencias de intrones del gen (ver figura 22 y esquema de la

figura 23). Al traducir la secuencia nucleotídica a secuencia aminoacídica, se

evidenció que estos intrones contienen codones de terminación en el marco de lectura

abierto, por lo que las secuencias obtenidas no serían codificantes. A partir de este

resultado, en los siguientes párrafos se plantean diferentes hipótesis en cuanto a la

identidad del fragmento de 700 pb obtenido con los cebadores diseñados para igfbp-

1.

Figura 23: Esquema representativo del alineamiento realizado con las secuencias obtenidas a partir de la purificación del amplicón de 700 pb (secuencia DIB2 y secuencia DIA2) en conjunto con la secuencia que presentó mayor homología en el BLAST con el genoma de referencia (A. charrua igfbp-1 G) y la secuencia del transcriptoma de referencia con la que se diseñaron los cebadores (A. charrua igfbp-1 T).

En primer lugar, existe la posibilidad es que las muestras de diapausa 1 y epibolia en

las que se evidenció esta banda existiera contaminación con ADNg. Esto es muy poco

probable debido a que no se evidenció amplificación a partir de ADNg (banda de 700

pb) en el control realizado con los cebadores para β-actina (ver figura 8, sección 2).

En segundo lugar, podría tratarse de un transcripto que genere una proteína trunca al

ser traducido a nivel ribosomal, por lo que el posible mensajero podría estar siendo

activamente degradado por la maquinaria celular de “Nonsense-mediated mRNA

decay” (NMD), que representa un importante punto de regulación postranscripcional

(Schoenberg y Maquat, 2012).

http://www.qiagenbioinformatics.com/

42

En tercer lugar, es posible que se trate de un pre ARNm de localización nuclear que

no habría transcurrido por el proceso de corte y empalme de intrones. Estos

mensajeros podrían encontrarse estabilizados en procesos de corte y empalme

alternativo (Hicks y col., 2006), que curiosamente aumentan en la diapausa 2 de A.

limnaeus, ya que se observa un mayor número de transcriptos con corte y empalme

alternativo en esta diapausa (Romney y Podrabsky, 2017).

Por último, se podría sugerir que se trata de un ARN largo no codificante (ARNlnc)

con extremo 3´ poli A. Este tipo de ARNs podrían tener diversas funciones

regulatorias, entre las que se destaca la posibilidad de actuar en la remodelación de

la cromatina, tanto para el silenciamiento como para la activación transcripcional de

ciertos genes, y posibles funciones de regulación postranscripcional (revisado por

Rinn y Chang, 2012). Existe evidencia en A. limnaeus, que indica que ciertos micro

ARNs (otro tipo de ARNs no codificantes) estarían regulando de alguna manera las

trayectorias de escape y entrada a diapausa 2 (Romney y Podrabsky, 2018).

Asimismo, en larvas de la especie de abeja Tetrapedia diversipes, se han encontrado

numerosos ARNlnc putativos en el estadio previo a la diapausa y durante la misma

(Araujo y col., 2018).

Según los resultados obtenidos en el análisis de expresión de tipo presencia/ausencia

(ver figura 17 y tabla 5), este ARNlnc putativo podría estar jugando un rol

determinante en la decisión de entrada o escape a la diapausa 1, ya que se expresa

específicamente en diapausa 1 (A y B) y en el estadio previo (epibolia entre 80 y

100%), constituyendo un posible marcador molecular para embriones en diapausa 1

o con señales de inducción a la misma. Encontrar el mecanismo mediante el cual

actuaría este ARNlnc putativo sería algo complejo, dada la dificultad para determinar

la identidad y función de estos ARNs a partir su secuencia nucleotídica (revisado por

Reynolds, 2019). Sin embargo, resulta de interés abordar su estudio ya que podría

encontrarse relacionado a la regulación de la expresión de igfbp-1.

Determinar la identidad del fragmento de 700 pb amplificado con los cebadores de

igfbp-1 y confirmar que se trata de un marcador molecular de esta diapausa sería de

gran importancia para validar el fenotipo de diapausa 1B descrito a nivel morfológico

en Arezo y col., 2017

43

Conclusiones

En el presente trabajo se logró amplificar un fragmento de aproximadamente 720 pb

mediante el diseño y ajuste de condiciones de amplificación de un par de cebadores

diseñados para igf1r a partir de una secuencia disponible para este gen en el

transcriptoma de referencia de A. charrua. El análisis comparativo realizado permitió

determinar que el amplicón obtenido codifica para un fragmento del dominio tirosina

quinasa catalítico de la cadena β intracelular de una de las isoformas del receptor Igf-

1r de A. charrua. A su vez, el análisis de expresión de tipo presencia/ausencia permitió

concluir que igf1r se encuentra expresado en todos los estadios del desarrollo

temprano analizados, incluso previo a la activación del genoma cigótico (contribución

materna).

A diferencia de los cebadores diseñados para igf1r, con los diseñados para igfbp-1 se

obtuvieron tres amplicones de 500, 600 y 700 pb aproximadamente. El amplicón de

500 pb demostró ser el esperado según el análisis comparativo realizado. Además,

este análisis permitió concluir que este amplicón probablemente se trate de un

fragmento del ARNm de igfbp-1b, una de las isoformas de este gen presentes en los

teleósteos, que al igual que igf1r se encuentra expresado en todos los estadios

analizados.

Con respecto al amplicón de 600 pb, la secuencia obtenida no logró resolverse por

completo, posiblemente por la presencia de otras secuencias que fueron amplificadas

y presentaban regiones comunes en sus extremos. Este amplicón se observó en una

de las réplicas biológicas de reagregado y en hígado de hembra adulta.

El análisis comparativo de las secuencias obtenidas del amplicón de 700 pb sugiere

que se trata de una secuencia no codificante muy similar al gen de igfbp-1 reportado

en el genoma de referencia de A. charrua, que incluye dos intrones que estarían

siendo retenidos. Por lo tanto, podría tratarse de un pre ARNm, un mensajero que

codificaría para una proteína trunca o un ARNlnc con extremo 3´ poli A. El análisis de

expresión en los estadios analizados, evidenció que este amplicón de 700 pb se

expresa únicamente en diapausa 1A, 1B y en el estadio previo a que se pueda instalar

esta diapausa (epibolia 80 a 100%). Este resultado es de gran relevancia, ya que este

44

amplicón podría constituir un marcador molecular de embriones en diapausa 1 o con

señales de inducción a la misma, lo que permitiría validar el fenotipo de diapausa 1B.

45

Perspectivas

La secuencia del amplicón de 600 pb obtenido con los cebadores diseñados para

igfbp-1 en una muestra de reagregado no logró resolverse como ya se explicó

previamente, por lo que en un futuro trabajo sería necesario clonar este amplicón en

un vector plasmídico con el objetivo de analizar clones que contengan fragmentos

únicos que permitan obtener una resolución adecuada de la secuencia.

Para descartar completamente la posibilidad de que el fragmento de 700 pb obtenido

se trate de amplificación a partir de ADNg, sería necesario realizar un ensayo de

amplificación in vitro utilizando como molde cada una de las muestras de ARN total a

partir de las que se obtuvo este amplicón sin el paso previo de retrotranscripción.

Además, se podría diseñar una sonda específica para determinar, por hibridación in

situ fluorescente en embriones enteros, en qué compartimiento celular se encuentra

el posible transcripto para el que se obtuvo el amplicón. Esto permitiría comenzar a

definir si se trata de un pre ARNm (se encontraría en el núcleo) o un ARN no

codificante que genere una proteína trunca (estaría siendo traducido en el

citoplasma). Sin embargo, con este abordaje no se podría descartar la posibilidad de

que se trate de un ARNlnc, ya que estos pueden tener funciones en el núcleo o

citoplasma.

Con el fin de determinar si existen diferencias de expresión para igf1r entre los

estadios analizados, sería interesante diseñar cebadores específicos para este gen

que amplifiquen una región de entre 100 y 200 pb, tamaño óptimo para realizar un

análisis de expresión cuantitativa mediante RT-qPCR. Además, sería necesario incluir

en el análisis grupos de embriones en condiciones de inducción a diapausa 1 a las 72

horas post fecundación (inducción 72 horas) y no inducidos a diapausa 1 a las 72

horas post fecundación (sin inducción 72 horas).

Los resultados obtenidos con los cebadores diseñados para igfbp-1, plantean la

necesidad de diseñar pares de cebadores específicos para los amplicones de 500 y

700 pb obtenidos, que amplifiquen una región de entre 100 y 200 pb. Estos cebadores

permitirían realizar análisis de expresión cuantitativa por RT-qPCR en los estadios

analizados en este trabajo. Como en el caso anterior, sería necesario agregar las

condiciones de 72 horas de inducción y sin inducción a diapausa 1. Realizar este

46

análisis sería particularmente importante para el amplicón de 700 pb con el objetivo

de confirmar si se trata de un marcador molecular de embriones en diapausa 1A y 1B

o con señales de inducción a la misma.

También sería interesante diseñar cebadores que permitan amplificar

específicamente regiones de entre 100 y 200 pb para los genes igf-1, igf-2 e insulina,

con el objetivo de realizar RT-qPCR para conocer si existen diferencias de expresión

cuantitativa de estos genes en el desarrollo temprano de A. charrua, comparando

entre embriones inducidos y no inducidos a diapausa 1.

Por otra parte, sería de gran importancia diseñar sondas específicas para igfbp-1 e

igf1r con la información de secuencia aportada en este trabajo, que permitan

evidenciar que células se encuentran expresando estos ARNs mensajeros mediante

hibridación in situ fluorescente en embriones enteros. Esto es particularmente

importante para igf1r, ya que podría tener un rol en la determinación del organizador.

Por último, con el objetivo de determinar de forma funcional si la vía de IGF se

encuentra involucrada en la inducción a diapausa 1, se podría realizar el bloqueo

farmacológico de Igf-1r mediante la utilización del inhibidor BMS-754807 (droga que

bloquea específicamente a Igf-1r) y observar qué porcentaje de embriones ingresan

en diapausa 1 en comparación con un control.

47

Referencias bibliográficas

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