estudio de asociación de los genes que codifican para los
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Estudio de asociación de los genes que codifican para los receptores Muscarínicos M2 y M3 en pacientes asmáticos
Por Luis Angel Muñoz Téllez
Asesorado por la Dra. Silvia Jiménez Trabajo realizado en el INMEGEN (Instituto Nacional de Medicina Genómica)
Introducción El Asma El asma se define como un trastorno inflamatorio crónico de las vías respiratorias
que se caracteriza por episodios de tos, disnea, opresión torácica y estertores
sibilantes, debido a la obstrucción de las vías aéreas por la presencia de edema,
sobreproducción de moco, descamación de las células epiteliales, contracción del
músculo liso e inflamación de la mucosa. La gravedad de los síntomas puede
variar de un paciente a otro y la respuesta al tratamiento puede diferir aún entre
individuos con síntomas similares (Baeza et al. 2003 Barraza et al.). De hecho, en
un intento por mejorar el diagnóstico y tratamiento del paciente con asma, un
grupo de investigadores formaron la Iniciativa Global para el Manejo del Asma
(GINA) y establecieron que de acuerdo con la gravedad de las manifestaciones
clínicas y los valores del volumen espiratorio forzado en 1 segundo (FEV1), esta
patología se podía clasificar en: a) intermitente leve, b) persistente leve, c)
persistente moderada y d) persistente grave; y de acuerdo con su perfil
inmunológico en: a) intrínseca o no atópica y b) extrínseca o atópica, que se
caracteriza por una respuesta tipo Th2 y se documenta por la presencia de
pruebas inmunogénicas cutáneas positivas o elevación de los niveles de
inmunoglobulina E (IgE) en suero. El asma extrínseca ocupa del 50-90% de todos
los casos y es más frecuente en niños (Barraza, Bayley et al, 2004). El diagnóstico
clínico del asma se establece demostrando una obstrucción reversible de las vías
respiratorias en forma espontánea o después de dos inhalaciones de un agonista
beta- adrenérgico, el cual se documenta por un incremento mayor al 12% del FEV1
(Barraza).
En general el tratamiento del asma incluye:
1. El uso de broncodilatadores, con lo que se busca la relajación del músculo
liso de los bronquios, a fin de tener una luz mayor en el interior del bronquio
y por ende un mejor flujo de aire.
2. El uso de antiinflamatorios, es esencial para disminuir o frenar el daño en el
tejido del interior de la luz del bronquio que a su vez genera una
hiperrespuesta inmunológica.
Otros tipos de tratamiento utilizados son:
3. El uso de anticolinérgicos, que inhiben la actividad de la acetilcolina, la cual
estimula la contracción del músculo liso en los bronquios, esto se logra
bloqueando los receptores muscarínicos que están en músculo liso a fin de
que la acetilcolina Induzca la contracción muscular. Así mismo se ha
observado la interacción acetilcolina con receptores muscarínicos
inhibiendo la producción de moco en el interior de los bronquios (Fenech,
2001).
4. La utilización de la inmunoterapia, mediante la aplicación de vacunas de
manera repetida, a fin de lograr la tolerancia contra ciertos antígenos
(Rodríguez 2005).
5. El uso de antihistamínicos, que bloquean los receptores de histamina, los
cuales están relacionados con la inflamación y otras características
alérgicas.
Estos son algunos de los tipos de tratamiento con los que un paciente asmático
puede ser tratado en México, de acuerdo a los expedientes proporcionados de
varios pacientes asmáticos del hospital 1ro de Octubre en la Ciudad de México,
aún con este dato se conoce la implementación de otros tipos de tratamientos
utilizados como todos aquellos que previenen las crisis, como las medidas
ambientales, y los cambios de hábitos por parte de los pacientes y familiares.
Generalmente estos tratamientos se utilizan a lo largo de su vida, dependiendo la
gravedad con la que el paciente se presente, para tal motivo como anteriormente
se comento existen diferentes grados de clasificación para el nivel de crisis
asmáticas, con sus correspondientes métodos al administrar los fármacos (Tabla
1).
El objetivo en cada paciente es alcanzar el control con el mínimo tratamiento
(Pocket,1998, Naberan, 1998, Global, 1995, Scotish, 1998), y para tal motivo es
por lo pronto necesario probar diferentes maneras de aplicación, que
anteriormente han proporcionado buenos resultados en otros pacientes, y esto es
debido precisamente a un componente genético, individual, y propio de cada
persona.
TRATAMIENTO EN ADULTOS Y NIÑOS MAYORES DE 5 AÑOS
PREVENTIVOS A LARGO PLAZO DE RESCATE PERSISTENTE GRAVE Medicación diariamente:
• Corticoides inhalados, 800-2000 mcg o más*
• Broncodilatadores de acción larga: beta-2 agonistas inhalados o en tabletas o solución y/o teofilinas de liberación sostenida.
• Corticoides orales a largo plazo.
Broncodilatadores de acción corta: beta-2 agonistas de acción corta a demanda de síntomas.
PERSISTENTE MODERADA
Medicación diaria: • Corticoides inhalados, (500 mcg* y
si es necesario, • Broncodilatadores de larga acción:
beta-2 agonistas inhalados u orales, teofilinas de liberación sostenida.
• Considerar añadir anti-leukotrienos, especialmente en pacientes sensibles a la aspirina y para prevenir broncoespasmo inducido por ejercicio.
Broncodilatadores de acción corta a demanda de síntomas, no excediendo 3-4 veces al día.
PERSISTENTE LEVE Medicación diaria: • Corticoides inhalados, 200-500
mcg*, o cromoglicatos o nedocromil o teofilinas de liberación sostenida.
• Los anti-leukotrienos pueden ser considerados.
Broncodilatadores de acción corta: beta-2 agonistas inhalados a demanda de síntomas, no excediendo de 3-4 veces al día.
INTERMITENTE LEVE No necesarios Broncodilatadores de acción corta: beta-2 agonistas de acción corta a demanda de síntomas, menos de una vez en semana.
La intensidad del tratamiento dependerá de la severidad del ataque.
Beta-2 agonistas o cromoglicatos antes del ejercicio o exposición a alergenos.
Tabla 1 Clasificación en el asma con sus tratamientos correspondientes en periodos a largo plazo y de rescate
Aunque muchos de los mecanismos bioquímicos y moleculares involucrados en la
génesis del asma aún se desconocen, se sabe que su etiología es multifactorial,
donde los factores genéticos junto con los ambientales juegan un papel
fundamental. La participación de los genes en el desarrollo de asma está bien
fundamentada, ésta tiene una heredabilidad hasta del 79% y de hecho, el riesgo
de los familiares de primer grado a padecer la enfermedad es de 4-5 veces mayor
que en la población general (Bel, 2004, Bentley, 1993).
Ya para 1860 Salter había descrito el carácter hereditario del asma, mediante su
observación en grupos familiares en donde vió un gran numero de casos en las
historias familiares de pacientes asmáticos, mas adelante estas observaciones
encuentran soporte en diversos estudios realizados por otros investigadores en
otras partes del mundo como tal es el caso del estudio ISAAC en España en
donde se observó que un nacido de madre asmática, tenía mayor probabilidad de
desarrollar asma, con respecto a uno nacido de una madre normal (Garcia, 2004);
los factores ambientales juegan un papel muy importante en la crisis asmática,
debido a que en la mayoría de los casos son estos los que desencadenan las
crisis; por lo tanto la interacción entre factores genéticos y ambientales están en
estrecha relación a diferentes medidas en los pacientes asmáticos.
La activación de muchos tipos celulares diferentes (linfocitos T y B, eosinofilos,
células dendríticas, etc.) y moléculas (citocinas y mediadores intracelulares) en
espacio y en tiempo (fases temprana y tardía, remodelación, etc), muestra lo
complejo y heterogéneo de la etiopatogénesis del asma (Boris, 1995, Carroll,
1997, Collins, 1998). Una de las principales metas de la investigación en este
campo es dilucidar los factores genéticos involucrados en la susceptibilidad y
variación de la historia natural de esta entidad, así como entender las diferencias
intra e interpoblacionales.
GENES Y ASMA
Frecuentemente los resultados arrojados de la investigación de los factores
genéticos en asma son derivados de la combinación del análisis de estudios de
ligamiento y de asociación. Estos estudios han permitido la indentificación de
regiones cromosómicas que muestran ligamiento con asma: 5q23-31, 6p24-21,
11q13-21, 12q21-24, 13q12-14, y 20q13, en donde se localizan genes que
codifican para proteínas que por su función, juegan un papel importante en la
fisiopatología de la enfermedad (genes candidatos) (Collins, 1998). En algunos
estudios, polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) en estos genes han
mostrado asociación con asma.
Los genes que por su efecto en la génesis del asma ha recibido especial interés
son de tres tipos: a) aquellos que contribuyen al desarrollo de la enfermedad
(genes de susceptibilidad), b) los relacionados con la evolución y la gravedad
(genes modificadores) y c) los de respuesta al tratamiento (Cookson, 2000).
Dentro del grupo de genes de susceptibilidad y modificadores se incluyen aquellos
que codifican para proteínas involucradas en los procesos inflamatorios, en la
síntesis de IgE y en la respuesta inmune, como por ejemplo los de citocinas Th2
(IL-4, IL-13 y sus receptores), complejo principal de histocompatibilidad (HLA),
factor de necrosis tumoral (TNFa), transductor de señales y activador del factor de
transcripción 6 (STAT6), metaloproteasa ADAM33, etc (Global, 1995). Por su parte
en el grupo de genes involucrados en la respuesta al tratamiento se incluyen
aquellos que codifican para receptores y metabolizadores de drogas como el
receptor beta2-adrenérgico (ADRB2), 5-lipoxigenasa (ALOX5), leucotrieno
sintetasa (LTCC4S) y el gen receptor de glucocorticosteroides (GCCR) (Cookson,
2000, Daniela, 1996), pero también existen genes que se encargan de transcribir
para un tipo de receptores colinérgicos, conocidos también como receptores
muscarínicos, que muestran relación en la enfermedad (Costello, 1998).
Los receptores muscarínicos, se encuentran en la membrana de las células del
músculo liso y sistema nervioso, existen hasta ahora 5 tipos de receptores
muscarínicos, estos son M1, M2, M3, M4, y M5, los receptores M2 y M3,
localizados en el músculo liso de los bronquios; el receptor M2 se localiza en la
membrana de la terminal sináptica de modo presináptico, el efecto que se produce
al unirse la acetilcolina es de retroalimentación negativa, esto quiere decir que al
haber bastante acetilcolina entre la terminal sináptica y el músculo liso, el receptor
M2 reconoce a la acetilcolina y promueve la inhibición de la secreción de
acetilcolina por parte de la terminal sináptica, esto se debe a que estos receptores
se encuentran asociados a proteínas G de membrana, que en el caso de M2 al
unírsele la acetilcolina se produce la inhibición de la actividad de la
adenilatociclasa que mediante un segundo mensajero (cAMP) inhibe la secreción
de la acetilcolina (Xingguang, 2005, Fenech, 2004). Por otra parte el receptor M3
se encuentra en la membrana de el músculo liso de modo postsinaptico, y también
este receptor se encuentra acoplado a una proteína G (Gq/11) y cuando este
receptor reconoce a la acetilcolina se produce un cambio de conformación
desencadenando una serie de señales que concluyen en la contracción muscular
por parte del músculo liso de las vías aéreas (Fig. 1) (Chilvers, 1990). Estos
receptores son codificados por sus genes, M2 se encuentra en el cromosoma
7q35, el tamaño de la secuencia que traduce para la proteína es de 1.4 kb,
compuesto de seis exones y cinco intrones, aunque sólo en el exón 6 es donde se
encuentra la región que se traduce (Fig. 2), el M3 se encuentra en el cromosoma
1q43, con un tamaño en la secuencia que traduce para el receptor de 1.77 kb,
compuesto de 8 exones y siete intrones, aunque es únicamente en el intron 8 en
donde se encuentra la región que traduce para el receptor (Fig. 3)(Fenech 2001).
Fig. 1 El receptor M3 localizado en la membrana del músculo liso (Amarillo), interacciona con la acetilcolina lo que permite la activación de la proteína G, que a su vez activa a la PLC la cual hidroliza a PIP2 obteniéndose IP3 y DAG, IP3 regula la concentración de calcio intracelular, y el calcio se acopla a los complejos CaM y MLCK, dirigiéndose a los filamentos de actina, y de este modo promoviendo la contracción.
PLC= fosfolipasa C PIP2= fosfatidil inositol difosfato IP3= Inositol trifosfato DAG= diacilglicerol
Fig. 2 Gen M2, de arriba abajo, A) Representación del cromosoma 7, B) Representación esquemática del gen CHRM2 con 6 exones en donde el ultimo exón es que codifica para la proteína del receptor,(CDS=Codificant strand) C) Región que traduce del gen.
Fig. 3 Gen M3, de arriba abajo, A) representación del cromosoma 1, B) representación esquemática del gen CHRM3, con 8 exones en donde el último exón es que codifica para la proteína del receptor, C) Región que traduce del gen
A)
B)
C)
A)
C)
B)
Cuando el receptor M3 reconoce a agentes anticolinérgicos, como es el caso del
bromuro de ipratopio, el cual es un fármaco utilizado para contrarrestar los efectos
del asma con efecto potenciador junto con algún anticolinérgico, o en caso de que
el paciente presente intolerancia o alergia a los adrenérgicos, la acción de la
acetilcolina se ve inhibida y por ende la contracción muscular no ocurre,
permitiendo un mayor paso de aire a través de las vías aéreas, precisamente
mediante este conocimiento, se han caracterizado diferentes agonistas y
antagonistas específicos para cada receptor muscarínico, permitiendo diferentes
estudios para poder observar el efecto de estos receptores en pacientes
asmáticos, tal es el caso de la pilocarpina, la cual inhibe la contracción del
músculo liso en los pacientes normales sin embargo falla en el caso de los
pacientes asmáticos (Fenech, 2001, Costello, 1998).
Generalmente los estudios sobre receptores muscarínicos se encuentran
relacionados con problemas de dependencia o problemas relacionados a efectos
neurológicos, en el 2005 se publica un articulo en donde se menciona la utilización
de 6 marcadores para el gen de M2, en estudios sobre dependencia al alcohol, las
drogas y desordenes afectivos, estos marcadores están identificados de la
siguiente manera sobre el gen M2, rs978437, rs1455858, rs1824024, rs324640,
rs324650 y rs6962027 y localizados en los intrones del gen, y muestran una
cosegregación característica tanto en población europeo americanas y
afroamericanas (Xingguang 2005), en la actualidad se desconoce el
comportamiento en la población amerindia, y menos relacionada a una
enfermedad como el asma, en este mismo articulo se hace mención de otro
polimorfismo visto en la región 3 UTR del gen, reconocido como rs8191992, en el
cual ya se ha encontrado asociación con los niveles de IQ, y una mayor depresión
en mujeres (Comings 2002, 2003), y que sin embargo no se analiza en bloque con
los anteriores 6 polimorfismos.
A la fecha se han descrito cerca de un ciento de genes asociados al asma, sin
embargo estos resultados muchas veces no son reproducibles en todas las
poblaciones (Carroll, 1997)..
Justificación El asma es la enfermedad crónica más común en la infancia, cuyo costo social y
económico hacen de ella un problema de salud pública. La prevalencia de esta
entidad se ha incrementado sustancialmente en las últimas décadas; actualmente
afecta cerca de 300 millones de individuos en el mundo. En México, los estudios
epidemiológicos estiman que la prevalencia del asma en la población general varía
desde el 6.8-20%, dependiendo de la región geográfica. En los Estados Unidos el
tratamiento del asma absorbe el 1% del presupuesto total de salud (Hoffjan, 2003).
Aunque en nuestro país no existen datos precisos sobre los costos de atención de
este padecimiento, un estudio realizado en el 2003 por Ceballos y cols. (Holgate,
1999), mostró que el manejo del asma en un Hospital de segundo nivel generó un
gasto de cerca de $17.6 millones pesos en tres años. Es importante señalar que la
prevalencia y la severidad de esta patología son variables entre los diferentes
grupos étnicos; sin embargo el incremento en su incidencia y mortalidad, es una
observación mundial y México no es la excepción (Homa, 2000).
Existen fuertes evidencias de que la susceptibilidad a padecer asma es debido a
factores genéticos, que junto con los ambientales, son los responsables del
desarrollo de esta entidad. En los últimos años se han identificado numerosos
SNPs localizados en genes involucrados en la respuesta inmune e inflamatoria
que muestran una fuerte asociación con la susceptibilidad a desarrollar la
enfermedad, con determinadas características clínicas de ésta o con la respuesta
al tratamiento. Sin embargo, se ha demostrado que el número y la importancia
relativa de estos genes es muy heterogéneo entre los diferentes grupos étnicos, lo
que, junto con el medio ambiente, pueden ser los determinantes en la variabilidad
de la gravedad del cuadro clínico y de la prevalencia de la enfermedad, así como
de la diversidad en la respuesta al tratamiento intra e interpoblacional que se ha
observado (Barraza). Por otra parte, parece ser que en el niño asmático el
componente genético es mayor que en el adulto, lo que explica que en el primero,
la manifestación de la enfermedad sea más temprana y más grave.
En México existen pocos estudios de SNPs implicados en la susceptibilidad del
asma, y aún menos en niños, a pesar de que la población pediátrica representa la
muestra ideal para el estudio de los factores genéticos implicados en esta
patología. Esta población tiene la ventaja de contar con ambos padres en la
mayoría de las familias, lo que permite realizar estudios de asociación basados en
familias utilizando la prueba de desequilibrio de transmisión (TDT), la cual es ideal
para determinar la asociación entre un marcador en un locus de interés (SNPs) y
una enfermedad compleja, ya que a diferencia de los estudios de asociación de
casos y controles, evita las falsas asociaciones comúnmente observadas por
estratificación.
Ahora bien con respecto a nuestro estudio especifico se ha descrito en la literatura
como es que el sistema parasimpático es el encargado de la secreción de
acetilcolina en el músculo liso de las vías aéreas superiores (traquea y bronquios),
en el botón sináptico de las raíces parasimpáticas que inervan a las vías aéreas
superiores se encuentran los receptores muscarínicos M2 que regulan la
secreción de la acetilcolina en una sinapsis con el músculo liso de estas vías,
provocando su contracción al unirse al receptor M3; primeramente se ha visto que
la contracción muscular en personas asmáticas se lleva a efecto en las vías
superiores, justamente en donde localizamos las inervaciones del sistema
parasimpático; segundo, otros estudios han mostrado que en pacientes asmáticos
tenemos una gran cantidad de Eosinófilos, y estos mediante la unión tejido
específico y secreción de sustancias como la “Mayor Basic Protein” (MBP)
ocasionan la perdida de la función de M2 en modelos animales primeramente, y
después se comprobó en personas, y tercero, en análisis entre casos y controles
se observo que los pacientes asmáticos tienen perdida de la función del receptor
M2 a diferencia de los normales (4,18). Además se ha visto que la perdida de la
función en un receptor puede estar afectada por polimorfismos en el gen que la
codifica, por lo que el conocimiento de estas variaciones en nuestra población, nos
darán un mayor entendimiento de nuestras variaciones ancestrales, y como es
que estas puedan estar influyendo en la enfermedad del asma (Pelaia, 2004). En
el 2001, se publicó un artículo concerniente a la búsqueda de polimorfismos en la
región que traduce para los receptores muscarínicos M2 y M3 en una población de
Malta, el resultado fue que para el receptor M2 se localizaron 4 polimorfismos,
mientras que para M3 no se localizó ninguno (Fenech, 2001). Hasta ahora no
existía un dato estadístico aquí en México, que nos diera indicios de qué
polimorfismos se encuentran en nuestra población.
Objetivo Objetivo general Identificar polimorfismos en los genes M2 y M3 asociados con asma en pacientes
pediátricos mexicanos
Objetivos particulares a) Identificar polimorfismos localizados en la región del les genes CHRM2 y
CHRM3 que traduce para los receptores M2 y M3 respectivamente.
b) Determinar si existe asociación entre los polimorfismos identificados en
pacientes con asma comparándolos con individuos sanos.
Hipótesis Los genes CHRM2 y CHRM3 están involucrados en la etiología del asma. Desarrollo Material y Método Se desarrollo un estudio de casos y controles con las características de ser
transversal, observacional, descriptivo y retrospectivo. Para este trabajo se
tomaron muestras de sangre periférica de pacientes asmáticos y muestras
sanguíneas de controles, los criterios utilizados para la selección son los
siguientes:
Criterios de inclusión Casos:
Pacientes mexicanos > 5 y < 16 años con dx clínico y funcional de asma
(espirometría)
Controles:
Individuos sanos >18 años sin antecedentes de asma o alergia.
Criterios de exclusión Casos:
Pacientes con diagnóstico de cualquier otra enfermedad crónica
concomitante (Fibrosis Quística, Tuberculosis, Fibrosis pulmonar, etc.).
Controles:
Individuos con antecedentes de asma, atopia o cualquier otro tipo de
enfermedad crónica de vías respiratorias.
Además se excluyeron:
*Pacientes y controles con enfermedades infectocontagiosas y
*Temporalmente fueron excluidos a los pacientes y a los familiares transfundidos
en los últimos tres meses.
Análisis Molecular En Total para nuestro trabajo se utilizaron un total de 412 sujetos de los cuales
300 fueron controles normales y 112 pacientes asmáticos, los pacientes fueron
captados en diferentes instituciones publicas de salud de la ciudad de México
como son el hospital 1ro de Octubre y el instituto nacional de pediatría; de cada
muestra se siguió un protocolo de extracción de DNA del kit de extracción Quiagen
proporcionado por el proveedor; después de su extracción se procedió a
cuantificar el DNA mediante espectrofotometría y se evaluó su integridad mediante
geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio, para después realizar
diluciones a 50 ng/µl por cada muestra. En un volumen de 100 µl.
Secuenciación automática Para identificar nuevos SNP´s en los genes CHRM2 y CHRM3 se secuenciaron
100 muestras de pacientes y 100 de controles.
Para el análisis de las regiones traducibles de los genes se diseñaron 5 pares de
primers, mediante el programa de primer Express, los primer flanqueaban
fragmentos de entre 400 y 600 pb (Fig 4 y 5)
1
2
3
4
5
A)
Fig. 4 Diseño de primers de la región que traduce para la proteína A) Diagrama que esquematiza la posición de los primers en la secuencia, B) Tabla en donde se muestran los primers y sus secuencias, el tamaño de los fragmentos que flanquean, de aproximadamente 500 pares de bases para el gen M2.
B)
A)
Las condiciones de amplificación que fueron adecuadas son (tabla 2):
M2 (1M2, 2M2) (3M2,4M2) (5M2,6M2), (7M2,8M2), (9M2,10M2)
M3 Todos los pares de primers IX IX IX
MgCl2 1.5 µl 2 µl 2.5 µl Gold Buffer 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl
dNTP´s 1 µl 1 µl 1 µl Primer forward 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl Primer reverse 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl
Taq Pol 0.4 µl 0.4 µl 0.4 µl DNA 2 µl 2 µl 2 µl H2O 16.6 µl 16.1 µl 15.6 µl
Total 25 µl 25 µl 25 µl
Tabla 2 En la parte superior se observan los primers utilizados para cada condición en su respectiva columna, en la parte media por columna se detallan las condiciones del mix, y en la fila de abajo se indica el total en µl, del compuesto para PCR.
De acuerdo a las tablas anteriores se estandarizaron las mejores condiciones para
cada uno de los pares de primers, después de lo cual se realizo la amplificación de
los fragmentos, siguiendo los programas indicados en las tablas 3 y 4, estas
Fig. 5 Diseño de los primers para los fragmentos del gen M3 A) Representación de la región que traduce para el receptor, B) Tabla que muestra la secuencia de los primers y el tamaño de los fragmentos que flanquea.
B)
amplificaciones se realizaron por duplicado, a fin de poder obtener un concentrado
mayor para el proceso de secuenciación, la verificación de la integridad de cada
muestra y su tamaño aproximado a 500 pb se verifico mediante un gel de agarosa
a 2.5 % tanto en pacientes como en controles. (Fig. 6).
Tiempo Ciclos Temperatura Desnaturalización 10 min 1 95 ºC DesnaturalizaciónAlineación Extención
20 seg 30 seg 30 seg
35 95 ºC 60 ºC 72 ºC
Extención 7 min 1 72 ºC Almacenamiento Ө Ө 4 ºC Tabla 3 Programa de PCR utilizado para los primers (1M2,2M2), (3M2,4M2), y todos los primers para M3. Tiempo Ciclos Temperatura Desnaturalización 10 min 1 95 ºC DesnaturalizaciónAlineación Extención
30 seg 60 seg 60 seg
35 95 ºC 62 ºC 72 ºC
Extención 7 min 1 72 ºC Almacenamiento Ө Ө 4 ºC Tabla 4 Programa de PCR utilizado para los primers (5M2,6M2), (7M2,8M2), y (9M2,10M2).
Después de la amplificación de las muestras, se procedió a su purificación,
siguiendo las indicaciones del protocolo provisto en el kit de purificación PCR
Quiagen, con el fin de erradicar cualquier proteína o molécula que pudiera
interferir en el proceso de secuenciación. La secuenciación fue realizada mediante
el kit de secuenciación automatizada de applied biosystems. La secuenciación
consiste en un proceso de PCR modificado en donde se adicionan al mix aparte
de dNTPs comunes, un tipo de dNTPs conocidos como ddNTPs
(Dideoxinucleotidos)(Fig. 7) que a diferencia de los dNTPs interrumpen el proceso
de elongación en el PCR, a diferentes longitudes de amplificación, dándonos una
gran cantidad de fragmentos de diferentes tamaños, con un ddNTP final marcado
con un fluorocromo especifico, dependiendo si es A,T,G, ó C. Las muestras se
desplazan a través de un capilar, y un lector láser lee los espectros de
fluorescencia emitidos, de acuerdo al tamaño del fragmento, esta información es
transmitida a una computadora e interpretada por un software conocido como
secuence scanner (Fig. 8),
Fig. 6 Gel de agarosa, en la parte superior pacientes y en la inferior los controles, todas las muestras están por duplicado
Fig. 8 Bases de la secuenciación automatizada, basada en la utilización de ddNTPs marcados con fluorocromos distintos y leídos por láser e interpretados por software especializado.
Fig. 7 La característica de los ddNTPs es que en el carbón 3 poseen una molécula de hidrogeno en lugar de un grupo hidroxilo común de los dNTPs.
Los resultados de estas secuenciaciones están representados por graficas, con
distintos picos caracterizados por colores que representan al nucléotido en la
posición especifica en la secuencia deseada (Fig. 9), por un lado la secuenciación
se realiza en sentido forward y por el otro lado en sentido reverse para después
comparar las secuencias mediante la alineación de estas.
Fig. 9 Muestra de un Electroferograma de secuenciación
La alineación fue realizada utilizando el software lasergen (seqman), y en el
mismo escaneamos toda la secuencia buscando variaciones en la secuencia total,
de manera automática así como manual, (Fig. 10).
Fig. 10 Alineación, y unión de las secuencias para su análisis, mediante seqman Análisis de discriminación alélica mediante el método fluorescente de la 5’ exonucleasa (TaqMan®). Para cada ensayo de discriminación alélica se diseñaron 2 sondas específicas
marcadas en el extremo 5’ con fluorocromos diferentes denominados reporteros
(VIC para el alelo 1 y FAM para el alelo 2), y en el extremo 3’ con un fluorocromo
llamado “quencher” (TAMRA). La sonda TaqMan híbrida con su secuencia
homóloga sólo cuando una región es 100% complementaria, por lo que, con ésta
es posible identificar diferencias de una sola base. Así, cuando se registra una
emisión de fluorescencia derivada de un fluorocromo específico se trata de un
homocigoto para el alelo 1 o 2 y cuando se observan ambos, entonces se trata de
un individuo heterocigoto (Fig. 11) Por lo tanto, dado que las condiciones de
astringencia utilizadas durante la reacción sólo permitieron la hibridación de la
sonda específica para el polimorfismo presente, fue posible diferenciar un alelo del
otro. mediante un lector de placas de 96 muestras y discriminación alélica,
podemos conocer el genotipo para cada paciente en los polimorfismos específicos
ya identificados (Fig. 12).
Las condiciones químicas y de amplificación para el análisis de polimorfismos
mediante TaqMan se basaron en las especificaciones del proveedor (Applied
Biosystem).
Fig. 11 Técnica de taqman en donde la sonda identifica la secuencia con la variante y luego esta sonda es degradada, emitiendo su correspondiente fluorescencia
Polimorfismos de susceptibilidad Para identificar a los polimorfismos de susceptibilidad a asma, se compararon las
frecuencias de los polimorfismos estudiados en la población de casos con los
controles. La presencia de diferencias estadísticamente significativas fue evaluada
mediante una prueba de x2.
Resultados En el estudio se incluyeron un total de 412 sujetos de los cuales 300 son controles
de entre los que tenemos 173 femeninos y 127 masculinos; además tenemos 112
pacientes asmáticos de entre los cuales tenemos 39 femeninos y 73 masculinos,
los pacientes fueron captados en diferentes instituciones publicas de salud de la
ciudad de México como son el hospital 1ro de Octubre y el instituto nacional de
Fig. 12 Mediante discriminación alélica identificamos el genotipo para cada paciente, la emisión de la fluorescencia de la sonda VIC (rojo) y la sonda FAM (azul) o la combinación de ambas sondas (Verde), los NTC corresponden a controles que no emiten fluorescencia
pediatría; el banco de controles utilizado proviene de el instituto nacional de
pediatría, todos pacientes mexicanos, de acuerdo a sus expedientes.
Secuenciación El análisis de secuenciación no muestra ningún polimorfismo para los genes M2 y
M3, en la región que transcribe para la proteína, en el gen M2 se observa solo un
polimorfismo, localizado en la región 3UTR (Fig. 13).
Taqman El análisis de este polimorfismo mediante Taqman, evidenció que estos
polimorfismos se encontraban en HWE, además el estudio de casos y controles
mostró diferencias estadísticamente significativas (Cuadro 1).
Fig. 13 Se muestra el polimorfismo identificado en la región 3 UTR tanto en la secuencia forward como en la reverse
Cuadro 1 La comparación de los genotipos entre casos y controles si es estadísticamente significativa, al igual que en el caso del alelo A, con un OR mayor a 1 lo que hace pensar que este es un alelo de susceptibilidad para el asma.
Debido a la localización de este polimorfismo, pensamos que este posiblemente
esta relacionado a la estabilidad del RNAm. En el gen M2 ya se habían descrito 6
marcadores a lo largo de toda la secuencia (Fig. 14, Tabla 5) uno de estos estaba
cercano al polimorfismo que habíamos localizado además se sabe que estos
marcadores cosegregan, por lo que se decidió estudiarlos a cada uno, para este
fin se diseñaron las sondas de cada uno de los marcadores a fin de utilizarlos en
taqman, y de esta manera identificar la frecuencia y asociación con la enfermedad
de cada alelo por marcador, los resultados se ven expresados en los cuadros 2 y
3.
Fig. 14 Los 6 Polimorfismos descritos en el gen M2 están marcados por las flechas
Localización Nº polimorfismo Intrón 3 rs978437 Intrón 3 rs1455858 Intrón 4 rs1824024 Intrón 5 rs324640 Intrón 5 rs324650 3 UTR rs6962027 Tabla 5 De arriba abajo se colocan los polimorfismos tanto su localización como su nombre o numero asignado, que en la figura 14 van en orden de izquierda a derecha por cada flecha
Cuadro 2
Cuadro 2 y 3 Se observan para cada uno de los números de polimorfismos, primero en el recuadro donde observamos el numero de izquierda a derecha tenemos a los genotipos observados, seguidos de la frecuencia observada, y su porcentaje con respecto primero a pacientes y luego a controles, en la cuarta columna tenemos el valor de X2 que describe a la p que en la quinta columna nos describe si existe diferencia significativa entre pacientes y controles, en la fila de alelo encontramos los alelos , después sus frecuencias primero en pacientes después en controles el valor de X2 que describe a la p que nos indica si existe diferencia significativa de ese alelo con respecto al otro, y al final el valor de OR que nos ayudar a deducir si este alelo de riesgo confiere susceptibilidad o protección.
El resultado visto que se ve, es que en todos los polimorfismos se muestran
diferencias significativas entre pacientes y controles, y que de manera muy
general uno de los alelos de cada polimorfismo al parecer confiere riesgo de
susceptibilidad ala enfermedad. El comportamiento semejante nos confirma su
cosegregación, por lo que metimos estos datos en el software de haploview para
analizar los datos obteniendo lo siguiente: (Cuadro 4 y 5)
Cuadro 4 al parecer todos los polimorfismos cosegregan, de acuerdo al valor porcentual que se observa en los recuadros rojos.
Cuadro 5 En la parte superior se observa la posición de los 7 polimorfismos analizados, en la parte de abajo los bloques observados, con sus frecuencias, en donde solo 2 presentan diferencias significativas, y uno presenta susceptibilidad a la enfermedad. Podemos ver que en verdad existe un haplotipo que muestra asociación con la
enfermedad de acuerdo al valor de P y OR. El haplotipo asociado a la enfermedad
es AGTAAAA.
Discusión Conclusiones Las evidencias sugieren que las regiones que traducen para las proteínas de los
receptores M2 y M3 no son polimórficas, sin embargo será necesario analizar
otros polimorfismos localizados a lo largo del gen M3 para verificar si también este
gen esta asociado con asma, por lo pronto el haplotipo AGTAAAA de los
polimorfismos ya descritos en el gen M2 muestran una fuerte asociación de
susceptibilidad en pacientes asmáticos, ahora se sugiere realizar análisis de
expresión para saber como es que este haplotipo interfiere en la expresión del
RNAm.
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