CLASE NUCLEO INTERFASICO

Los eucariontes tienen un nucleo verdadero. Cario significa nucleo. Me voi a refererir a la organización del nucleo de las células eucariontes. El nucleo se define como compartimiento celular en el cual esta contenido el material genético. Este compartimiento mas q ser un lugar en el q esta almacenada la información genética, debe expresarse en el fenotipo de la celula, debe nacer una interaccion citoplasma- nucleo, nucleo-citoplasma de manera q esa información se traduzca en proteínas, en interacciones, etc. Si ustedes toman una celula y la miran al microscopio y se les preguntara si la celula es eucarionte o procarionte utds deberían como criterio el buscar si es que tiene o no tiene una envoltura nuclear, un compartimiento definido por un limite que es la envoltura nuclear. Sin embargo si bien este es el criterio de clasificación, no es el único que define la diferencia de una cel procarionte y una eucarionte. Me gustaría que utds visualizaran entonces al nucleo como uno de los estados del sistema genético de los eucariontes. Una cel procarionte contiene también material genético sin embargo éste se encuentra asociado a proteínas pero no esta en un compartimiento definido. Y se supone q a lo largo de la evolución por una invaginación de la mb plasmática externa se genero el compartimento interno q hoy dia llamamos nucleo. Ese compartimento esta rodeado por un limite q conocemos como el nombre de envoltura nuclear puesto qe esta formado por dos membranas una mb nuclear externa y otra interna. Si uno mira al microscopio el nucleo de la cel eucarionte aparece como una estructura central, esférica y con distintos tamaños pero aprox ocupa un tercio del tamaño celular. Cuando observo al microscopio de luz se ven las células q están en cel epitaliales de mucosa bucal, la cel son transparentes y el nucleo por lo mismo que tienen un gran contenido de agua no se distingue demasiado bien, de manera q cuando se le tiñe uno puede distinguirlo perfectamente, sin embargo, si uno lo mira al microscopio, se fijan q es difícil identificar o la envoltura nuclear o el contenido del nucleo. Nos damos cuenta si, qe esta rodeado de un limite, cuando se visualiza con microscopio de fluorescencia en el q se ha realizado una tinción de prot del citoesqeleto, podemos ver lo mismo q antes pero un poquito mas grande pero no distinguimos precisamente su estructura. En cambio cuando nos vamos al microscopio electrónico, la fuente de luz son los electrones, que tienen muy poquita masa, de manera q cualquier muestra que tenga un grosor muy grande detiene los electrones y ustedes no tienen imagen por lo tanto es necesario ver estructuras muy finitas. De manera que la miscroscopia electrónica dio mas info pero no mucha mas q la q había dado el microscopio de luz. Y fue posible descubrir que el nucleo esta rodeado por una envoltura nuclear, estructura q esta formada por una mb nuclear interna y otra externa, y en ciertos puntos se fusionan las dos membranas generando puntos de comunicación. Entre las dos membranas esta el espacio perinuclear. Cada una de estas mbs es una bicapa de fosfolipidos. La mb nuclear externa además, como se aprecia perfectamente en la microfotografía, se ven como pelotitas q corresponden a los ribosomas y se continua o tiene comunicación con el RER.

¿Qué es lo q hay adentro del nucleo? Cromatina, y la cromatina contiene el material genético, osea, tiene DNA condensado y además contiene proteínas de carácter básico llamadas histonas, es decir, la cromatina es el agregado molecular entre DNA unido a las histonas. Desde hace mucho se sabia q la cromatina estaba constituida de DNA y proteínas histonicas. El DNA es un acido y se asociaba con mucha facilidad a las histonas de carácter básico, sin embargo, no era fácil responder como era la asociación entre estos 2 elementos y al observar el nucleo en MET q era el instrumento óptico q permitia ver con mayor resolución, no se descubrían tampoco como era esta organización. Si ustedes miran aca este es el nucléolo y esta es la cromatina, podíamos descubrir al ver esta imagen cual era la relación entre el DNA y las proteínas histonicas, o como se esperaba que

fuera la cromatina? La molecula de DNA es alargada, entonces se esperaba que la cromatina, y con otras series de evidencias, fuera una fibra, fuera fibrilar, sin embargo, cuando se miraba con el MET, no se veía así. El instrumento no era el problema pero el método q se empleaba obligaba a q se tuviera una sección fina del nucleo. Por lo tanto si adentro del nucleo estaba esta fibra de cromatina, al seccionar el nucleo en una muy delgada capa ¿q se obtendría? Puntos, y eso es lo q se ve en la microfotografía.

Entonces, si bien el instrumento tenia un harto poder de resolución, no era la forma adecuada de ver la cromatina y su estructura fibrilar, y cuando uds ven estos puntos juntos corresponde a cromatina condensada y cuando ven estas zonas claras hacen un acto de fe de q es cromatina descondensada pero utds no ven cromatina ni condensada ni descondensada solo ven los puntos mas cercanos o los puntos mas lejanos q corresponden a la sección fina de una estructura fibrilar. Entonces q se les ocurriría hacer si no es posible en una sección fina descubrir una estructura fibrilar? Con fluorescencia? Pero con fluorescencia en un preparado de este tipo igual tendrías la fibra cortada, suponiendo q la fibra es fibra. Como demostrarías q hay fibras?, q es lo q buscas en verdad, buscar entender como está esta fibra. En una celula en cultivo, con el metodo de fluorescencia, si tu haces con anticuerpos anti-histonas, supongamos q usaste un anticuerpo con un flurocromo azul, verías esto ¿resolverías lo de la fibra? No. A este nivel de resolución no ves fibras de cromatina. En el metodo de anticuerpo, el anticuerpo reconoce algo q esta y q es específico.

El metodo radioautografico funciona en una cel viva y q este en síntesis, entonces la cel al sintetizar una molecula, tu le das un elemento radiactivo especifico q es constituyente de esa mol. Por ej, si estas realizando síntesis de prot, tu le colocas un aá radiactivo, luego entonces si la cel esta sintetizando una prot q necesita ese aá radiactivo, lo va a incorporar, y tu vas a detectar como radioactivan esas prot. Si bien es un método muy relevante no sirve para lo q estamos viendo. Y se podria hacer esto mismo con las histonas? Si se podria, pero q requisito tendrían las histonas radiactivas que uds han puesto a la celula, para que las incorporara? Q este replicando en DNA, y si me creen q la cromatina esta formada por DNA e histonas cuando se duplica el DNA también se incorporan nuevas histonas. Entonces en esa condición celular si habría incorporación de histonas radiactivas y tendríamos una cromatina radiactiva. Entonces el método radioautografico significa detectar q estructura quedo radiactiva.

Pero la pregunta es como descubriríamos la estructura de la cromatina, no si esta o no replicando el DNA. Entonces necesitamos resolver si es que efectivamente la estructura es fibrilar y en una sección fina no me resulta posible. Entonces cual es la otra alternativa? No cortarlo. Y como lo hago? Una celula viva en un medio hipotonico se infla hasta q se rompe, y lo primero q sucede es q se rompe el citoplasma y si la hipotonía es mas drástica se puede romper el nucleo, la envoltura nuclear, y obtendríamos un derrame del contenido q tenia el nucleo pero sin cortarlo. Y eso fue a lo q algunos investigadores se les ocurrió y entonces obtuvieron el contenido del nucleo y lo observaron en el Microscopio electrónico y allí entonces obtuvieron una imagen q se parece bastante mas a una fibra, se ve como una cosa gruesa, pero al observarlo con mas detenimiento notaron q aquí se veía como una subestructura, como q no habían llegado a aquella estructura q era la esencial, la básica. Y entonces entregaron soluciones salinas de mayor fuerza ionica q disgregan las proteínas q puedan estar allí sostenidas. Y cuando hicieron eso encontraron q esta fibra gruesa q acabo de mostrarles se podía desagregar en esta otra fibra, y sorprendemente en vez de encontrar un cordel o una fibra constante en diámetro se encontraron con esta estructura, en q habían como especies de esferitas unidas entre si por un pegamento. A esta estructura, relativamente esférica, se le denomino nucleosoma y lo q esta entremedio y también entorno al nucleosoma es

DNA. Esta corresponde a la fibra básica de cromatina y se pudo demostrar q cada una de estas nucleosomas o esferas contenía un conjunto de histonas y q el DNA dicurria por sobre este conjunto. Entonces cada nucleosoma estaba compuesto por un core central de histonas. El conjunto de histonas q hay en cada nucleosoma es de 8 (octamero) y se habla q esas 8 son 2 tetrameros porq están repetidas 2 veces cada una de las 4 histonas. Entonces las histonas se llaman H2A, H2B, H3 y H4. Y fue muy sorprende descubrir q el DNA no estaba rodeada de histonas, sino q por el contrario, el DNA rodeaba a las histonas. Si el DNA, q tiene la información génica, estuviera cubierto por histonas, estaría muy protegido pero también seria inaccesible. Entonces el descubrir esta estructura, no solamente es relevante por la estructura sino q porque era un camino mas cercano para comprender como es q se podía producir la expresión génica, el q pudiéramos conocer la información q contenía el DNA al interior del núcleo.

Esta q esta aquí entonces q es como cuencas de un collar, algunos mas observadores, notaron q en realidad había una tendencia de q se viera como un zig-zag entre los nucleosomas y observaron también que junto con esta disgregación de las fibras de cromatinas se producía el desprendimiento, la solubilizacion de la histona H1, de manera q en una fibra real de nucleosomas el DNA nunca estaba desnudo, no había entre un nucleosoma y otro un segmento de DNA q estuviera desnudo xq en la fibra existía la histona H1 q unia nucleosomas contiguos y q cubria el DNA q estaba entre un nucleosoma y el siguiente. Entonces en esta representación, cada uno de los tetrámeros, el octamero de histonas el DNA q da dos giros alrededor de cada nucleosoma comprendiendo 146 pares de bases nucleotidicas y entre uno y otro nucleosoma se encuentra aquí la histona H1. A la estructura q se forma con el octamero de histonas, el DNA enrollado sobre ellas y la histona H1 constituyen lo se conoce como la fibra básica de cromatina y tiene un ancho de 10 nm, q es el ancho del nucleosoma. Todas las estructuras nucleares en donde participa la cromatina van a partir de esta organización básica q es la fibra nucleosomica. En el nucleo entonces vamos a tener la fibra básica de cromatina, pero esta fibra básica experimenta mas condensación en distintos niveles. El siguiente es un nivel en el q se van enrollando como en un solenoide, como en un rizo y forma lo q se conoce como la fibra solenoidal q tiene un espesor de 30 nm. En el nucleo cual de ellas están presentes? Ambas. La fibra solenoidal es la primera q se obtuvo, y q esta presente en el nucleo. En el nucleo entonces, acá tenemos la envoltura nuclear, hacia el interior del nucleo va a ver cromatina y esa cromatina va a tener distintos niveles de compactamiento, por lo tanto el DNA se encuentra enrollado, en q nivel? En un primer nivel en la fibra básica de cromatina y en un sgte nivel en la fibra solenoidal. De manera que esta organización permite q si en un momento dado de existe en una región génica la necesidad de la celula

de q esa expresión ocurra aquí no se requiere q toda la cromatina se descondense, sino q puede solamente en este sector cambiar de fibra solenoidal a fibra básica y hacer accequible el DNA q allí este contenido.

La dimensión del DNA es de una longitud muchísimo mayor de la del diámetro del nucleo, por lo tanto, aunque la cromatina este descondensada como en la fibra básica, el DNA ……… un grado de compactación por el enrollamiento q tiene. Si tuviéramos la longitud de un lápiz de fibra básica tendríamos aprox 7 veces de long del DNA allí comprometido. Y eso permite explicar porque en un diámetro nuclear de aprox de 10 um puede caber 1,80 metros de DNA como el q tiene nuestra cel eucarionte.

Continuando con esta organización tenemos aquí la mb nuclear externa mas el ribosoma, la mb nuclear interna y por dentro de la mb nuclear interna en toda la superficie de ella existen tres proteínas q forman un polímero proteico q se conoce como Lamina. Entonces la Lamina es una prot q recubre toda la mb nuclear interna en toda la superficie interna del nucleo. Cual es su funcion? Esta cromatina q describíamos como fibrilar hasta el interior del nucleo, tiene puntos de apoyo, esta parcialmente suelta. La cromatina es tremendamente dinámica en el nucleo, sin embargo, tiene ciertos puntos de unión, y uno de esos puntos es a esta lamina q se conoce como carioesqueleto periférico del nucleo y es el esqueleto q sustenta parcialmente la cromatina. Particularmente la cromatina no esta condensada, aquí, pudiendo ver luz hacia el interior del nucleo. Porque no es relevante esta unión? Porque vamos gestando en nuestro concepto de nucleo una organización de esta cromatina, no solamente en la relación de todas las DNA, sino q de disposición de la cromatina hacia el interior del nucleo, y porque en este sistema genético en que en un momento esta organizado como nucleo y en otro deja de estarlo cuando vieron la división celular, las prot laminas tienen un rol fundamental; 1) sustentan parcialmente la cromatina, 2) contribuyen a la forma esférica q tiene el nucleo y 3) su fosforilacion hace posible q se desarme la envoltura nuclear cuando va a ocurrir la división celular, y también son las prot laminas las q participan en rearmar el nucleo cuando termina la división celular. Por lo tanto entonces estas prot tienen un rol fundamental en la dinámica del nucleo. ¿Cómo es q las prot laminas sustentan la cromatina? La lamina es como una malla, un polímero insoluble de la unión de 3 prot laminas, y esta unida a través de esta prot transmembrana y de esta otra prot, entonces la cromatina q ahí esta dibujado una parte de una cromatina en q esta unida la lamina y a esta prot. Y eso permite entonces q en la dinamina del nucleo, pueden haber sectores q estén sujetos y otros q estén sueltos hacia el interior del nucleo, y q cuando se desarme el nucleo se desagrege esa organización celular.

El nucleo es uno de los estados de organización del material hereditario, vamos a tener en una celula q no esta en división, el nucleo, cromatina y luego cuando esta

celula se divida vamos a tener el huso mitótico, y aca vamos a ver los cromosomas en metafase, si este fuera una celula humana, ¿Cuántos cromosomas debieran haber en esta metafase? 46 cromosomas. Esta estructura de cromosomas es la mayor compactación de lo mismo q tenemos acá. Uds siempre se enredan donde hay cromatina y donde hay cromosomas. Primero cromosomas es la cromatina compactada. Entonces cuando una celula se va a dividir, no es q surjan los cromosomas mágicamente, sino q se hacen aparentes pero ya estaban presentes, por lo tanto, si aquí nosotros sacaramos las fibras de cromatina, cuantas deberíamos sacar? 46. Y van a ver unas de mayor longitud y otras de menor dependiendo del tamaño de los cromosomas. Entonces aquí ha sido muy difícil, por la dinámica q les mostraba, descubrir la organización de la cromatina y mas aun, identificar a los cromosomas, porq la cromatina de ellos esta descondensada, parcialmente o menos parcialmente pero nunca tan compacta como esta acá. Entonces no es fácil identificar el número de cromosomas. Este estado del material genético y en q esta como cromatina en el nucleo, y en el q hay cromosomas pero están descondensados, es el estado funcional, aquí hay expresión génica. En cambio en esta otra fase, es una fase de distribución donde no hay expresión génica, se distribuye el material genético y se retoma la funcion nuclear de expresión génica una vez q se reconstituyen en la telofase los nuevos nucleos, los nucleocitos. Es muy fundamental esta fase xq aquí es donde esta la actividad principal del material hereditario, la transcripción. La replicación q suele ser para uds la principal actividad q tiene el DNA, es un fenómeno q es muy relevante pero va a estar presente en las cel q están es proliferación. La mayor parte de sus cel están con nucleo. Las células q están en proliferación circulan en un ciclo donde están las etapas de mitosis, replicación del DNA, G1 y G2. Pero la gran mayoría de sus cel no están en ciclo proliferativo, sino q salen principalmente de G1 y se encuentran en un estado G0 de diferenciación. Por ej las cel del páncreas, las del hígado, las neuronas, las cel musculares, las del hueso, todas esas están en un periodo no proliferativo, diferenciadas y realizando expresión génica, relevando parte de la info q contienen los genes propios de esa celula.

Una de las preocupaciones una vez q se resolvió como era la estructura de la cromatina, y q se sabia q cada cel contiene en su nucleo el mismo numero de cromosomas q se relevan en la metafase, era saber como están puestos los cromosomas. Y en muchas representaciones los cromosomas se ven como entremezclados incluso algunos los describen como una “plato de tallarines”, en cambio, cuando se emplearon métodos que identificaban con distintos colores a los distintos cromosomas y luego se les situaba en el nucleo se encontró q ellos no estaban entremezclados, sino q ocupaban territorios discretos. En el nucleo de fibroblastos de pollo fue en el primer organismo en q se obtuvo esta imagen, sin embargo, cuando se repitió no hace muchos años un experimento similar en una cel humana se encontró el mismo resultado. Los cromosomas están formando territorios discretos, incluso, los cromosomas homologos no están juntos, están gral separados. Si x ej en un mismo organismo tomamos células hepaticas y las comparamos con cel pancreáticas o renales, vamos a encontrar q los nucleos no son exactamente iguales, entonces se superpone a los territorios de cada cromosoma el fenómeno de expresión génica, q va a ser distinto en un tipo cel q en otro, y eso va a estar relacionado con la condensación de la cromatina. Entonces la distribución de los cromosomas al interior del nucleo es ocupando territorios discretos pero eso no significa que aquí este condensada la cromatina y forme una especia de peñasco cada cromosoma, q lo hace imposible de interactuar con otros. Recuerden uds q la organización q tienen los cromosomas en el nucleo favorece la expresión de los genes, no la explosión de esa información. Cuando se realizo un experimento q las metodologías permitieron hacerlo, lo q esta teñido en azul es todo el DNA y esta revelado solo el cromosoma 7. Se ven dos cuerpos xq el otro seria el cromosoma homologo del 7 (somos diploides). Y después se ve una región mas bien roja, se esta revelando con un método especifico una región génica dentro del cromosoma 7. Y q se revela en la imagen sgte, aca repito lo mismo q vimos antes, el cromosoma 7 con un gen, y aca la dif entre este

nucleo y este otro, esqe este gen fue estimulado a hacer transcrito. Y entonces se observa en esta imagen, aquí esta un cromosoma 7 y aquí esta el otro, y aquí vemos los puntos génicos, entonces una interpretación es decir q se solto ese gen de donde estaba el cromosoma, sin embargo, la interpretación correcta es q la cromatina donde esta en ese gen q participa de la transcripción, hace un “loop”, se descondensa y accede al centro del nucleo. Entonces la transcripción o expresión génica ocurre hacia el centro del nucleo y allí participan una serie de proteínas q forman lo q se llama la matriz interna del nucleo, q no es un esqueleto rigido, sino q son proteínas q participan en la actividad transcripcional del nucleo y q se van a a agregar o desagregar dependiendo de los territorios q se van a transcribir. Entonces es muy distinta la matriz interna del nucleo q el carioesqueleto periférico formado por la lamina. Y este es un muy bonito ej de cómo una región génica puede estar condensada y silente, sin expresarse, y luego cuando se expresa en transcripción, se descondensa la cromatina donde esta ese gen y accede al centro del nucleo donde esta la maquinaria transcripcional, y eso esta sucediendo en los distintos nucleos. Entonces si se compara un nucleo con otro vamos a tener variaciones xq va a depender de que genes y en que cuantía están siendo expresados. Y por eso vamos a ver una fisonomía nuclear distinta entre un tipo celular y otro.

Interactuan o no las regiones génicas de un cromosoma y otro?. Cuando se explica q los cromosomas ocupan territorios discretos se tiende a pensar que quedan sin interactuar con otro, y eso no ocurre asi. Aquí esta ilustrado un cromosoma, otro y otro. Este tiene un gen A, un gen B y un gen C. Y ellos pueden interactuar formando x ej aquí un sector de transcripción conjunta. Y este otro puede participar de una región de condensación y de silencio génico. Puede quedar excluido de la transcripción y eso ocurre en las cel muy diferenciadas, en q hay territorios cromosómicos q quedan condensados, se van a la periferia y quedan silentes. Y otros que acceden al centro del nucleo. Entre estos territorios en q interactúan genes de un cromosoma y de otro, hay uno muy particular en el nucleo, el nucléolo. El nucléolo es un territorio nuclear en donde esta ocurriendo tal actividad transcripcional en la síntesis de ribosomas q forma un territorio q podemos verlo. Primero se pensó q era como un nucleo chiquitito y por eso se le llamo nucléolo. Sin embargo es un territorio donde hay una gran actividad transcripcional, generalmente con la concurrencia de los genes ribosomales de mas de un cromosoma. Entonces si recuerdan una imagen al principio, donde se veía un tremendo sector negro q correspondía al nucléolo y q se ve muy bien en el microscopio de luz también, ese un sector donde esta ocurriendo la síntesis de ribosomas y participan ahí, desde el punto de vista de los genes, los genes ribosomales q son muy abundantes en varios sectores del genoma. En los cromosomas homologos, uno es de origen paterno y otro de origen materno. Ambos van a tener la misma secuencia de genes pero no necesariamente la misma acción. Por ej. Cromosomas homologos q contienen los grupos sanguíneos, el de origen paterno podria indicar el gen grupo A y el otro el grupo B, o podrían ambos ser grupo A, entonces existe una gran complejidad de interacción. Podría entonces estar interactuando los genes alelos en su expresión como podrían no estarlo, podrían estar apagados o encendidos (transcribiendo o no transcribiendo). Y se ha descubierto en el análisis del genoma en su conjunto y como están puestos los genes q algunos genes codificantes de prot q tienen relación con la funcion están juntos, en la misma hebra de DNA y q cuando acceden hacia el centro del nucleo son transcritos todos ellos, lo cual favorece la eficiencia del sistema, y entre ellos x ej las hemoglobinas. Entonces la interaccion no es solo y necesariamente entre cromosomas homologos. Van a ver q muchos de los elementos q regulan el q un gen se transcriba mas o menos, provienen a veces de otros sectores de otros cromosomas q no son homologos y q regulan la actividad transcripcional. Si usaramos el método radioautografico en una celula viva y en el nucleo tuviéramos cromatina condensada y descondensada hacia el interior, donde debería detectarse la marca radioactiva si estoy colocando un precursor de la síntesis de RNA, donde debería yo ver que se incorpora ese RNA marcado? Teóricamente donde hay una transcripción y donde debería verlo en el nucleo? Las marcas radioautograficas deberían quedar en el centro, y

eso fue lo q se hizo, por eso se pudo demostrar q en esta cromatina como en los cromosomas de aquí no hay transcripción. Y en el nucléolo habría marca? Si ya que el nucléolo es casi pura transcripción.

Como se relaciona el nucleo con el resto de la celula. Este esquema tomado del Alberts revela 3 sistemas de comunicación en la celula. Lo q esta señalado en verde a través del transporte de vesículas, lo q esta en azul a través de una membrana y lo q esta en rojo es a través de una puerta, una esclusa, y eso es lo q ocurre entre el nucleo y el citosol. Es decir esta envoltura nuclear no es atravesada por elementos q van o vienen del nucleo, solo es entran y salen elementos del nucleo a través de los poros. Y estos poros q se producían en donde había una fusión de la mb nuclear externa con la interna, no es un agujero de libre transito, sino q existe un conjunto de proteínas dispuestos en cada uno de estos poros que dan lugar a lo q se conoce como COMPLEJO DE PORO y q va a ser el regulador de lo q entra y sale. Entonces en este transito del nucleo al citoplasma van a ver una serie de moléculas de grandes dimensiones o de pequeñas dimensiones q van a estar transitando. Cuales intuyen uds q deberían ir al nucleo? Histonas por ej, cuando ocurre la replicación del DNA se necesitan unas histonas, o sea tienen q haber histonas y xq tienen q ir desde el citoplasma al nucleo? Porque se sintetizan en el citoplasma. Que otra proteína? Las DNAs Polimerasas si es una cel q esta en replicación o RNAs Polimerasas si es una q esta en transcripción. Y del nucleo al citoplasma? Los RNAs trancritos como el mRNA o los rRNA q van como subunidades, estructuras de grandes dimensiones y peso molecular. Los microRNA funcionan en el interior del nucleo y regulan la transcripción y participan en otros procesos.

Esta es una imagen del Microscopio electrónico q da una especie de idea como una “huella” q se ven en la envoltura nuclear. Y con distintos métodos a permitido suponer cual es la organización q tiene cada uno de estos complejos de poros. Y como muchas veces van a ver se representa por un modelo, Samir Patel lo represento de esta manera, es decir, reunieron toda la info q existía respecto al tamaño y estructura del Complejo de Poro y lo representaron de esta manera. Hacia el

nucleo existiría este cantillo, aquí tienen la mb nuclear externa e interna y aca esta el citoplasma. Estas proteínas q están aca participarían en regular el tránsito hacia el nucleo, o desde el nucleo hacia el citoplasma. Y esta es con microscopia electrónica de Barrido, q se le asignan colores y q se ve esta estructura como en roseta de cada uno de los complejos de poros. Aquí tienen otra imagen donde tenemos las estructuras q componen la porción anular del Complejo de Poro, estas fibrillas, y el canasto q hace prominencia hacia el nucleoplasma.

Como es el pasaje de sustancias? Estructuras pequeñas de menos de 10 nm, en general pueden difundir si la gradiente de concentración le es favorable. Pero en general y si recuerdan todos los elementos q Uds han mencionado son mas grandes q esas dimensiones, por lo tanto, es un proceso energético q requiere la activación de estas proteínas, el ingreso o el pasaje. Y como será? Sera solo un problema de tamaño o de cargas? Si tenemos todo el citoplasma y se están sintetizando distintas proteínas, el destino nuclear es simplemente un fenómeno de azar? De q llegue aca y sea pequeña y pase o de que sea grande y le ayude a pasar? No hay selectividad? Si la hay. Entonces les presento un experimento muy antiguo q se realizo en

ovocitos, y q mostraba lo sgte: hay una prot cuyo nombre es nucleotransclina(?) aquí representada por unas colas azules y por una cabezita roja, entonces cuando se colocaba esta prot marcada por radioactividad en el citoplasma, se veía q rápidamente se dirigía al nucleo, o sea, era una prot nuclear. Entonces se realizo una proteólisis, una ruptura de esta prot quedando las dos porciones separadas, se volvieron a marcar prot en estas cel y se observo q una parte de la prot quedaba en el nucleo y la otra porción se dirijia la nucleo. Se podía concluir q había algo o alguna informacion en esa porción de la prot q hacia q se vaya al nucleo y esa info no estaba en la otra porción. Entonces esto hizo sospechar q en la estructura de la propia proteína estaba alguna señal de destino nuclear, algo q le indicaba al resto del citoplasma q esas proteínas eran de destino nuclear.

Y otro experimento realizado bastante dp por Calderon y colaboradores, consistió en lo sgte: tenían una prot q era nuclear, en la secuencia de aá de esta prot iban alterando ciertos aá y observaban si la prot se dirijia al nucleo o no. Y observaron q cuando existe esta sec de aá la prot es capaz en su totalidad de dirigirse al nucleo, y lo q estamos viendo aquí brillante corresponde a los nucleos q están revelados por la presencia de prot q eran brillantes. Vieron q era critica esta secuencia dentro del conjunto de aá de la prot, xq cuando alteraban aunque fuera uno de los aá de la secuencia, se quedaba la prot en el citoplasma. Entonces a esa sec de aá q precisaba el destino nuclear de una prot, se le llamo SECUENCIA SEÑAL DE LOCALIZACION NUCLEAR. Y en la configuración q tiene una prot q es sintetizada en el citoplasma, en una o mas partes de esta prot se hace aparente esta sec q indica destino nuclear. Si lo q hicieron los investigadores es cierto, q experimento se les ocurre uds para hacer mas genérica la sec y decir esta sec da destino nuclear a cualquier prot? Lo q hicieron los investigadores fue tomar un prot de una celula procarionte q no era nuclear y colocarle la sec de destino nuclear y la proteína se dirigió al nucleo. Entonces se pudo demostrar q existía un señalización hacia el nucleo, asi como lo había en los distintos compartimientos en el citoplasma y este trafico entre el citoplasma y el nucleo era regulado, tenia un destino la prot q estaba señalada. Y mas adelante se demostró q algunas prot entraban al nucleo y quedaban retenidas en el interior. Y esta info molecular solamente es para lo q entra al nucleo o también para lo q sale del nucleo? Entre los elementos mas relevantes q salen del nucleo, son el producto de la expresión génica, es decir, x ej un mRNA, y éste, como todos los RNAs, tiene una configuración q esta asociado a proteinas, entre las prot q se asocian a un mRNA es numerosa, sin embargo, destaco alguna prot q tienen q ver con la salida de este mRNA desde el nucleo. El RNA es una ribonucleoproteina xq esta formada por RNA mas proteínas de grandes dimensiones y existen proteínas q son receptores nucleares de exportación y q se van a unir precisamente a las prot del complejo de poro señalando la salida de estas ribonucleoproteinas aca en el interior de la celula. Entonces no solamente van a haber señales de las prot q ingresan y señales de las prot q salen, sino q van a haber prot desde el interior del nucleo y desde el citoplasma q van a colaborar a q este proceso pase, salida o ingreso, exportación o importacion. Y lo van hacer de una manera muy eficiente, de manera q en muy pocos minutos va a salir este RNA y se van a recuperar las prot q participaron en la salida. En la salida del mRNA como ribonucleoproteina hacia el exterior, generalmente el mRNA cambia la configuración, acuérdense q todas estas moléculas tienen tridimensionalidad, están en un medio hidratado, pero además las prot del complejo de poro modifican estas ribonucleoproteinas de manera que puedan pasar de modo eficiente por el complejo de poro.

En esta imagen tenemos la envoltura nuclear, la lamina y la cromatina, no esta el citoplasma. Esta representación solo alude a q en el nucleo la cromatina esta mayoritariamente descondensada y se condensa en forma intensa cuando ocurre la división celular. Entre esta etapa y la otra, obviamente ocurre replicación del DNA y fosforilacion de la lamina y eso hace q se desagrege la envoltura nuclear, y los cromosomas queden en el citoplasma sin el nucleo polarizado. Y luego cuando termina anafase y sobreviene la telofase a partir de estas mismas laminas cuando las membranas se vuelven a reorganizar en todos los cromosomas, la envoltura nuclear y el nucleo en su completitud y se recupera la prioridad funcional del nucleo.

Entonces aquí vamos a hacer una generalidad sobre la condensación de la cromatina y la expresión génica. Habiamos llegado desde el DNA con las histonas, fibra básica de cromatina, de la fibra nucleosomica o fibra básica de cromatina podíamos tener la fibra solenoidal, hasta aquí podía estar presente en el nucleo interfasico. Pero cuando la cel se va a dividir para llegar entonces a esta parte, esta cromatina de aca experimenta mas niveles de condensación. Entonces de la fibra solenoidal pasamos a una FIBRA PLEGADA, y de ésta a la cromatide de un cromosoma ¿en este cromosoma hay fibra básica de cromatina? Si. Aquí el DNA se encuentra compactado del orden de 7000 veces, o sea, es de una magnitud de compactación en q es totalmente ineficiente. ¿aquí solo hay enrollamiento de la fibra básica, solo tngo DNA y las histonas? Debe haber mas proteínas xq no es mágico q haya interaccion moleculares q permitan q este enrollamiento se vaya produciendo. Y eso le preocupo a un científico hace muchos años, tomo un cromosoma Nº1 humano q es el mas grande del cariotipo y extrajo todas las histonas. Si no hubieran las prot y saco las histonas me quedo con puro DNA, pero no paso eso. Se encontró una estructura formada por estas prot q remedan la forma de ese cromosoma. Esas prot contribuyen al armado del cromosoma, y se llaman PROTEINAS DE ANDAMIAJE. Son como un esqueleto del cromosoma q mantienen condensada a la cromatina.

Aquí tenemos un nucleo y en el cual hay un nucléolo y otro nucléolo. Empieza a venir la división celular, se condensa la cromatina, se van abriendo los cromosomas, se van separando, y aquí están los genes ribosomales, se empieza a armar el nucleo, aquí ya tenemos los nucleos y a cualquier de estos sectores génicos se recupera la actividad nucleonar. Entonces ese es el ciclo q va a ocurrir entre un nucleo q se le llama el interfase, xq esta organizado por envoltura nuclear y este lio divisional en q hay cromosomas.

En un periodo de embriogénesis van a tener sucesivas multiplicaciones celulares. La cromatina va a estar en general descondensada, pero en la medida q va ocurriendo la diferenciación celular, la cromatina se va compactando, se van compactando ciertos territorios, ¿cuales quedaran activos? En embriogénesis, en la medidad q van surgiendo las distintas líneas celulares, cada una va tornándose especifica hacia una funcion, eso se llama diferenciación y va ocurriendo entonces q las prot q conforman esas células van siendo mas especificas, y eso conlleva también a q se silencien territorios cromosómicos, pero hay unos q van quedar activos necesariamente en todas las células, y esos se van a ir al centro. Ej una neurona va a tener los genes q codifican para los neurotransmisores y una celula pancreática no va a tener esos genes. Y van a tener algo en común la cel pancreática con la neurona en cuanto actividad génica? No se olviden q todas su células tiene el mismo genoma (el conjunto de genes, toda la info genética) Creen q en una cel hepática, neuronal, muscular tienen algunos genes en común q estén activos? Todas ellas van a necesitar ribosomas, es una funcion genérica, el sistema genético funciona con la síntesis de proteínas, por lo tanto va a ser común a todas esas células el necesitar proteínas, y por lo tanto, sintetizar ribosomas. Algunas cel van a necesitar una cantidad mayor xq van a tener una demanda mayor de prot y de ribosomas, y otras menor, pero todas ellas van a necesitar tener ribosomas funcionales. Que otro ej de genes comunes funcionales? La RNA polimerasa xq están haciendo transcripción, entonces necesitan esas células q se incorpore al nucleo, pero ¿xq no podríamos pensar q la celula ya hizo acopio de todas la RNApol q necesitaba en el nucleo, entonces esa cel neuronal ya tiene en su nucleo la RNApol y la cel pancreática tmbien? Porque la cel esta constantemente produciendo prot y dp las van DEGRADANDO. Entonces estas células van a tener genes distintos q se van a expresar y q las van hacer células, pero van a tener genes comunes q van hacer q el sistema en celular funcione, xq esas cel requieren de expresión génica y síntesis de proteínas, no solo xq esas prot son necesarias, sino xq hay un constante recambio. A los genes q son comunes a los distintos tipos celulares y q mantienen a la celula se les llama HOUSE-KEEPING GENS o genes mantenedores de la casa. Y los otros genes q se van a expresar en una celula especial y no en otra son los GENES TEJIDO-ESPECIFICO. Y todo esto con un genoma q es igual pero q tiene esta diferenciación en la expresión. Esta imagen muestra como junto con este fenómeno de expresión diferencial se va produciendo q cierto sectores de la cromatina se van condensando, y eso es un reflejo de q esos van

quedando silentes. Y en la medida en q una celula va diferenciándose mas va teniendo grandes territorios q están condensados y q ya no transcriben, tienen los genes pero no los ocupan. Y este es un ej, esta el mismo segmento de DNA que aquí hay un gen, y este gen esta perdido o activo y van haber una serie de prot regulatorias q va a ser factores de transcripción, activan las transcripción. Por el contrario cuando estas prot no participan la expresión de ese gen es muy escasa, y aun mas, si se retira el DNA ese gen ya no se transcribe, se apaga, cuando ese fenómeno ocurre xq hay una gran METILACION del DNA, q es un cambio químico del DNA, se agrega sobre esa metilación un conjunto de prot, y eso es lo q va a producir esta condensación de la cromatina, una intensa región del genoma q va quedando inactivo. En algunos casos la heterocromatina se hace sinónimo a cromatina condensada, sin embargo la heterocromatina tiene un DNA especifico q subyace a la condensación, es una cromatina condensada especial. Cada cromosoma tiene un DNA con distintos genes en su longitud total entonces se va a dar como en la globalidad de un nucleo, aquí representado el nucleo con tres cromosomas distintos lo sgte: en el cromosoma de arriba está representado un gen 1, en el cromosoma de abajo el 2 y el 3. Tamos suponiendo q estos 3 genes se están expresando, entonces vamos a tener en el gen 1 un producto de la transcripción q es un mRNA q va a salir del nucleo al citoplasma, q va a ser leído por los ribosomas y va a dar lugar a una prot de secreción y q sale de la cel. El gen 2 va a dar lugar tambien a un mRNA, q va a salir como ribonucleoproteina x el complejo de poro, q va a ser traducido por ribosomas del citoplasma, pero va a quedar la proteína en el citoplasma. Y el gen 3 va a dar lugar tambien a un mRNA q va ser traducido y va a formar parte de la mitocondria. Entonces son tres genes distintos q coincidieron en ese momento en expresarse, pero van a dar lugar a prot distintas, eso va produciendo la diferenciación de las células de su funcion. Entonces un cromosoma va a tener distintos genes q se van a prender o se van a apagar en el tiempo, a esa regulación de la expresión génica en el tiempo, se le conoce como TEORIA DE LA EXPRESION GENICA DIFERENCIADA, q significa q las distintas cel teniendo todo el genoma regulan su expresión según el tipo celular y en el tiempo. Eso va a dar lugar a cel q tienen distintas funciones y pueden interactuar entre ellas.

OVEJA DOLLYFue un organismo clonado. ¿q es lo normal en nosotros y en una oveja, como se produce un organismo diploide? Con el papa y la mama xD, cada uno nos aporta genoma haploide y nos hace hacer un organismo diploide. El fundamento biológico para pensar q el clonamiento pueda resultar esa saber q cualquier celula somatica, aunque este diferenciada, conserva toda la información genética de la celula original a la q provino. Tenemos una celula somatica, en el caso de la Dolly era una celula de la glandula mamaria, de esa celula se tomo el nucleo, xq sabemos q tiene toda la info genética. Y dp los investigadores necesitaban a alguien q hiciera q esa información llegara a ser una oveja, un sistema celular q la desarrolle. Y eso lo hace el citoplasma del ovocito de la oveja nodriza, no se sabe bien como, pero el citoplasma del ovocito es capaz hacer que esa información llegue a ser un organismo completo. Y hay otra oveja q es la q participa aportando su utero para el desarrollo del organismo clonado.