CARACTERIZACION DE

LAS PROTEINAS:

PESO MOLECULAR.

DETERMINACION DE LA

ESTRUCTURA PRIMARIA.

ELECTROFORESIS.

V = E z / f v: velocidad de migración de la molécula en

un campo eléctrico. E: intensidad de campo eléctrico, z:

carga neta de la proteína. f = 6phr es el coeficiente fr iccional.

h (eta) es la viscosidad del medio y r es el radio de la partícula.

Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones nativas

(PAGE) o en presencia de SDS (SDS-PAGE).

Isoelectroenfocado (IEF): Separación por punto isoeléctr ico

(pI) .

Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D -

PAGE): IEF en una primera dimensión, SDS-PAGE en la

segunda.

ISOELECTROENFOCADO: Separación por pI.

Las proteínas se corren en un gradiente de pH preformado, que se obtiene

sometiendo a electroforesis previa una mezcla de polianfolitos (polímeros

pequeños con múltiple carga) con diferentes valores de pI. En A se carga

la muestra y se aplica el voltaje, con lo cual las proteínas migrarán hasta

llegar al valor de su pI, donde, al no tener carga neta, quedarán

enfocadas, lo que se observa en B.

DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS PROTEINAS.

M r = masa molecular relativa (por ejemplo, 50,000)

Masa molecular: Por ejemplo 50,000 daltons (50 kDa) .

A) Proteína nativa:

1) Ultracentrifugación.

2) Filtración por gel.

3) Espectrometría de masa.

B) Subunidad:

1) Electroforesis en gel de poliacrilamida en

presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE).

ULTRACENTRIFUGACION.

Fc= fuerza centrífuga. r =

radio del rotor.

w = velocidad angular. w2r = campo centrífugo. = volumen específicoparcial ( inversa de la densidad de la proteína) .

m’ (masa efectiva) es menor que m (masa real) porque el flúido

desplazado ejerce una fuerza opuesta (1– r) .

f= coeficiente fr iccional de la partícula = 6phr , donde h es laviscosidad del medio y r el radio de la partícula.

v = Fc / f = m(1– r) w2r / f

s = coeficiente de sedimentación (unidades 10 -13 seg = 1 Svedberg) .

s = v / w2r = m (1 – r) / f

La velocidad de sedimentación (v) depende en parte de la masa de la

partícula; tambien depende de su forma (una partícula compacta

tiene un valor de f menor que el de una alargada); una partícula

densa se mueve mas rápido que una menos densa porque su valor

de (1– r) es menor; y depende tambien de la densidad de la solución

(r) : si r es < 1, se hunde; si es > 1, flota y si es = 1 no se desplaza.

Ultracentrifugación zonal (en gradiente)

La solución de proteína se corre en un gradiente de densidad (por ejemplo,

sacarosa), con proteínas de s conocido como marcadoras.

Peso molecular

de subunidad:

Determinacion

por SDS-PAGE

ESPECTROMETRIA DE

MASA: SUS APLICACIONES

EN LA DETERMINACION DE

PESOS MOLECULARES DE

PROTEINAS Y EN LA

SECUENCIACION DE

PEPTIDOS.

Espectrometría de Masa

• La Espectrometría de Masa es una tecnica quepermite determinar la masa de moléculas pormedio de la medida de la relacion masa/carga (m/z).

• La medida de masas moleculares involucra laproduccion, separación y detección de ionesmoleculares en fase gaseosa.

•Cada molécula puede originar iones moleculares

con distinto número de cargas ( y distintas m/z).

Un espectrómetro de masa consiste de tres módulos:

1) Fuente de iones.

2) Analizador de masas.

3) Sistema de detección y adquisición de datos.

Técnicas actuales para trabajo biológico:

1) MALDI-ToF MS (desorción/ionización por laser asistida por

matriz, combinada con análisis de masas por tiempo de vuelo)

2) ES/MS (ionización por electrospray combinada con análisis de

masas por cuadrupolo)

La solución a analizar se pasa a través de una

aguja hipodérmica mantenida a un alto

potencial. Se forma un cono de gotitas muy

finas, altamente cargadas, que irradian de la

punta de la aguja. Se evaporan rápidamente,

pasando las moléculas a analizar a la fase

gaseosa. Si son moléculas grandes se

producen iones con cargas múltiples.

ES/MSGENERACION DE IONES MOLECULARESIONIZACION POR ELECTROSPRAY

(ESI MS)

Aqueous

solution

This ionization method arises in the attempt to couple the LC to MS

The effect of vacuum, temperature and curtain gas causes the formation of

increasingly smaller drops until the molecule is fully desolvated in vacuum.

Sir Geoffrey Taylor (1964). "Disintegration of Water Droplets in an Electric Field". Proc. Roy. Soc. London. Ser. A 280 (1382): 383.

dripping,

burst,

pulsating,

cone-jet

1914, John Zeleny

What is the ionization mechanism in ESI?

No tolerant to the presence of salts, surfactants, inorganic acids, TFA no so

good for sensitivity, (regularly desalting steps are required, acetic and formic

acids are used in the mobile phase).

Lord Rayleigh, 1882

ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES

MOLECULARES.

ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES

MOLECULARES

Los iones se dirigen al vacío del espectrómetro de

masa de cuadrupolo a través de un orificio o capilar

calentado. El cuadrupolo consta de cuatro barras

metálicas paralelas que generan un campo eléctrico

oscilatorio. Los iones se separan en este campo:

sólo los de una determinada m/z se dejan pasar a

una determinada amplitud y frecuencia de

oscilación de los potenciales eléctricos aplicados a

las barras, y llegan al detector.

Quadrupole Mass Analyzer

From: http://www.chem.vt.edu/chem-ed/ms/quadrupo.html

Ion transmitted along the quadrupole in

an stable trajectory

Ions do not have an stable trajectory

and is ejected from the quadrupole

•Limited mass range (4 000 Da).

•Were the first mass analyzer to

be coupled to ESI.

radiofrequency

DC: Direct current

(Corriente continua)

RF: Radio frequency

GENERACION DE IONES MOLECULARES

Pseudocristales mixtos de una matriz (p.ej.: ácido 3,5-

dimetoxi-4-hidroxicinámico). Se los irradia con un pulso

de laser. La sublimación rápida de los cristales lleva a la

formación de iones moleculares protonados en fase gaseosa.

MALDI-ToF MS

ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES MOLECULARES.Se aceleran a una energía cinética de aprox. 25 KeV y se los

deja volar a través de una distancia fija sin campo eléctrico.

Teniendo energía cinética idéntica, los iones chicos se

mueven más rápido que los grandes y llegan antes al

detector. M/z se determina a partir del tiempo de vuelo,

comparando con standards.

(desorción/ionización por laser asistida por matriz, combinada con

análisis de masas por tiempo de vuelo)

Camera

Laser

Sample

plate

Pumping Pumping

Beam guide

Timed ion selector Reflector

Linear

detectorExtraction

gridsReflector

detector

ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROMETRO DE MASA

MALDI-TOF

Espectrometro

de masa,

MALDI-ToF

MALDI es una fuente de ionización pulsada

• La muestra se mezcla con un matriz

que absorbe fuertemente en el UV.

• La matriz absorbe energía del laser

llevando a que se volatilicen tanto la

matriz como la muestra.

• Las moléculas ionizadas de la matriz

transfieren un protón a la muestra.

• Los iones de la muestra son entonces

acelerados recorriendo el tubo de vuelo

para analizar su masa (TOF MS).

MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization.

Matrix : Analyte

1000:1 – 10000:1

Excess of

MatrixEasy Sample

prep:

•Dried droplet

•Layered method

Nd:YAG (355nm)

N2 laser (337 nm)

Ionization by

laser (pulses

1-5nsec

but….high

potency: kW

MW).

Compatible

with TOF

analyzers

Highly efficient

ionization

method

Matrices absorb strongly l of the laser irradiation

cold matrix

hot matrix

La relación masa a carga de un ion es proporcional al cuadrado

de su tiempo de vuelo.

t = Tiempo de vuelo

L = Longitud recorrida por los iones

dentro del analizador

m = Masa

K = Energía cinética del ion

z = Número de cargas en el ion

2

22

L

Kt

z

m

MALDI-MS

1. Los espectros de MALDI-MS son muy simples, en general sólo

se observan iones con una sola carga: (M+H)+ o (M-H)-.

2. Es un método de ionización muy eficiente, y tiene alta

sensibilidad para el análisis de biomoléculas y biopolímeros.

3. Es ideal para el análisis de mezclas de péptidos trípticos para la

identificación de proteínas por PMF, peptide mass fingerprinting.

4. Es un análisis de high throughput (permite el análisis de un

número grande de muestras en corto tiempo).

5. Es compatible con el analizador de masa de tiempo de vuelo.

6. La intensided del laser puede inducir fragmentaciones que

permiten obtener información estructural (secuencia).

SECUENCIACION

DE PEPTIDOS Y

PROTEINAS

¿Cuales son lo objetivos de la secuenciación de péptidos?

• Comparar estructuras primarias de diferentes proteínas paraestablecer relaciones evolutivas (actualmente, se hace mayormenteusando secuencias traducidas de secuencias de nucleótidos).

• Obtener una secuencia de péptido de una proteína desconocidaproveniente de un organismo cuyo genoma no está secuenciado; estopermitirá la síntesis de oligonuclótidos degenerados para identificary clonar el gen que la codifica.

•Confirmar la identidad de una proteína sospechada a partir de unexperimento de PMF.

•Identificar modificaciones post-traduccionales.

.

SECUENCIACION DE PROTEINAS Y PEPTIDOS.

Para secuenciar una proteína siempre se debe partir de la proteína

purificada. La purificación puede consistir en obtener la proteína

pura en un tubo, a través de los métodos de purificación ya

mencionados, o, aún si no está completamente homogénea, como

una banda discreta en un gel de SDS-PAGE.

Para secuenciar una proteína siempre se la debe fragmentar para

obtener péptidos de menor tamaño, secuenciables por distintos

procedimientos.

Tanto para secuenciar por el método de Edman como por

espectrometría de masa, debe comenzarse con estos tres pasos:

1) Desnaturalizar, con urea por ejemplo, y reducir los puentes

disulfuro.

2) Bloquear los grupos –SH, con iodoacetamida por ejemplo.

3) Fragmentar la proteína en péptidos mas pequeños, usando dos

métodos diferentes (por ejemplo, digestiones con tripsina y BrCN)

SECUENCIACION DE PROTEINAS Y

PEPTIDOS.

1) Método de Edman:

Previa separación de los péptidos por

HPLC en fase reversa, secuenciarlos

químicamente por reacción con el reactivo

de Edman (isotiocianato de fenilo), en un

secuenciador automático.

Pasos a seguir para secuenciar una proteína pura

por el método de Edman.

1) Desnaturalizar, con urea por ejemplo, y reducir los puentes disulfuro.

2) Bloquear los grupos –SH, con iodoacetamida por ejemplo.

3) Fragmentar la proteína en péptidos mas pequeños, usando dos

métodos diferentes (por ejemplo, digestiones con tripsina y BrCN)

4) Separar los péptidos obtenidos por el primer método por HPLC en fase

reversa (RP-HPLC).

5) Tratar cada péptido purificado con el reactivo de Edman, isotiocianato

de fenilo, en un secuenciador automático.

6) Identificar los residuos de aminoácidos por RP-HPLC de los derivados

de feniltiohidantoína (PTH-aminoácido) on line en el secuenciador.

7) Hacer lo mismo con los péptidos obtenidos por el segundo método de

ruptura de la proteína.

8) Armar la secuencia por superposición de los péptidos obtenidos por

ambos métodos.

MDH-1

MDH-2

LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE

TRYPANOSOMA CRUZI

La reacción del PITC con el amino terminal se hace en un medio básico,

dando un feniltiocarbamil-péptido (PTC-derivado). Este se separa por

acidificación con ácido trifluoroacético (TFA) como un derivado cíclico de

aminotiazolinona (ATZ-aminoácido) el cual se extrae con acetato de etilo y se

convierte en el PTH aminoácido con TFA 25 % en agua. Este es transferido on

line a la columna de RP-HPLC, que lo identifica.

El Procise Protein Sequencing System de Applied Biosystems

Está compuesto por 4 módulos integrados: el Secuenciador propiamente dicho, el Microgradient Delivery

System, el detector de UV de longitud de onda variable, y la computadora equipada con Procise control

software y SequencePro software. El sistema controla la entrega precisa de hasta 12 solventes y reactivos

diferentes. Incluye el cartucho de reacción, donde se obtiene el primer derivado (feniltiocarbamato del

residuo N-terminal) y luego por acidificación el ATZ-derivado, el frasco de conversión donde se lo transforma

en el PTH-derivado, que luego se transfiere a la columna de HPLC en fase reversa, donde se separan por el

gradiente de solvente, se lo detecta en el detector UV/VIS por su absorbancia y se lo identifica por el tiempo

de retención en la columna. La calibración se hace en base a una corrida con los PTH derivados de los 20

aminoácidos proteicos, además en algún caso de un derivado correspondiente a una modificación post-

traduccional que se quiere detectar.

1er.Ciclo

2

3er.

DEGRADACI

ON DE

EDMANREACCION DEL

RESIDUO N-

TERMINAL CON

ISOTIOCIANATO

DE FENILO

1er. Ciclo

2o. Ciclo

3er. Ciclo

Secuenciación

automática por

el Método de

Edman

(N-terminal de

la cruzipaína)

2) Espectrometría de masa:

Puede utilizarse para secuenciar péptidos o para identificar

proteínas.

2a) Secuenciación: Seleccionar un péptido determinado por

MS y fragmentarlo, obteniendo su secuencia a partir de las

masas de los fragmentos resultantes (CID, fragmentación en

cámara de colisión, o PSD, decaimiento después de la fuente de

iones)

2b) Identificación: Sin separar los péptidos, determinar la

masa de cierto número de los mismos por MS e identificar a la

proteína en los bancos de datos, por comparación con las masas

de digeridos virtuales de todas las proteínas ya secuenciadas. Se

conoce como peptide mass fingerprinting (PMF). Es óptimo

cuando el genoma del organismo de origen está completamente

secuenciado.

FRAGMENTACION DE LOS PEPTIDOS

C

O

N

H

COOHNH2

y¨n z´nxnC-terminal ions

bnan c”n

N-terminal

ions

Roepstorff, P., and Fohlmann J. Biomed. Mass Spectrom. 11, 601 (1984)

Jhonson R. S., Martin S. A., Biemann K., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes. 86, 137 (1988).

N C

N C

Un péptido cargado

puede ser fragmentado

en dos trozos de tres

maneras, que pueden

producir un par de iones

a y x, un par de iones b e

y, o un par de iones c y z.

Teóricamente la fragmentación puede tener lugar en cualquier

lugar de un péptido, y se espera un espectro que contenga todos

los posibles picos de iones.

En la práctica, debido a la fortaleza irregular de las ligaduras

en las diferentes posiciones, los diferentes iones aparecen con

distintas frecuencias.

Los mas abundantes son los iones y, los cuales a menudo

forman la serie completa en un espectro. Los siguientes en

frecuencia son los iones a y b, de los cuales muchos no se

observan. Los iones c, x y z se presentan mucho menos

frecuentemente. Adicionalmente, estos iones pueden formar

nuevos iones por pérdida de agua o de amonio.

SECUENCIACION POR ESPECTROMETRIA DE MASA

La ES/MS puede aplicarse directamente a la secuenciación de péptidos,

utilizando un ES MS/MS, es decir un espectrómetro de masa de electrospray en

tandem, que tiene dos analizadores de masa separados por una celda de

colisión, donde el péptido seleccionado se fragmenta y da iones “hijos” que se

separan en el segundo analizador y permiten determinar la secuencia.

Collision-induced dissociation (CID)

Es una técnica de fragmentación usada para obtener información

estructural. Se utiliza la colisión con las moléculas de un gas para obtener

la fragmentación de un ión seleccionado por su masa.