BIOSEGURIDAD El trabajo en el laboratorio de microbiologa mdica debe ser considerado de alto riesgo para todo el personal de laboratorio, debido al manejo de diferentes tipos de muestras clnicas (muestras de tejidos, sangre y otros fluidos biolgicos) potencialmente contaminadas con patgenos microbianos y de cultivos de microorganismos obtenidos a partir de tales muestras clnicas. Para minimizar este riesgo existe un plan de bioseguridad que usted debe seguir rigurosamente. Recomendaciones generales para los alumnos durante el desarrollo de las actividades prcticas El uniforme y la pechera es de uso obligatorio, le protege del material infeccioso, de reactivos y colorantes entre otros.

Los alumnos deben asistir con una presentacin adecuada al trabajo del laboratorio, con el pelo tomado y las manos con las uas cortas

Todos los artculos personales, como bolsos, tiles y maletines, deben ser guardados fuera del rea de laboratorio

Deben lavarse las manos peridicamente, cada vez que entren en contacto con material infeccioso y siempre que se haga abandono del rea del laboratorio (ver tcnica del lavado de manos gua bsica)

Se debe evitar tocarse, frotarse o rascarse con las manos las diferentes partes del cuerpo mientras se permanezca en el laboratorio. Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas diariamente e inmediatamente despus de que ocurra algn derrame de material infeccioso (muestras clnicas o cultivos)

Esta rotundamente prohibido pipetear con la boca.

Esta prohibido comer, beber o fumar en el rea de laboratorio. Tampoco est permitida la aplicacin de cosmticos en el rea de laboratorio.

Las agujas y cualquier otro material cortopunzante debe ser descartado en cajas de material resistente y con tapa. Todos los procedimientos con muestras clnicas y cultivos microbianos deben ser realizados muy cuidadosamente de manera que se reduzca al mximo la formacin de aerosoles, particularmente en la estriacin de placas, al destapar recipientes conteniendo muestras clnicas y cultivos microbianos, y al pipetear o centrifugar material infeccioso. Cuando alguna persona tenga cortes o lesiones en la piel de las manos debe vendarse adecuadamente y utilizar guantes protectores en todo su trabajo en el laboratorio. Se deben utilizar guantes protectivos cuando sea inevitable el contacto con material infeccioso o cuando se trabaje en el nivel de bioseguridad 3

Cada alumno tendr un puesto en el mesn de trabajo, el cual debe mantenerse limpio y ordenado. Adems ser responsable del microscopio y del material que se le asigne

En caso de ruptura de tubos o placas conteniendo un cultivo, avise de inmediato al docente

NOTA: Frente a un derrame: Lavado. Primero se eliminan los restos groseros de cristal, plstico, agar, etc., en un recipiente para ser autoclavado, despus se lava con abundante agua y un detergente acuoso y a continuacin se inicia la desinfeccin. Hay que tener en cuenta que cualquier sustancia orgnica (agar sangre, restos de peptona, etc.) es extraordinariamente bloqueante de la capacidad oxidativa del hipoclorito sdico y de la capacidad de actuacin de los iodforos; por ello, la norma es primero limpiar y despus desinfectar. Desinfeccin. Se emplear un desinfectante preferentemente lquido. Los ms tiles en el laboratorio son: 1. Hipoclorito sdico (presentacin comercial 5% y se diluye a 0.5% diariamente) De eleccin para suelos, cermicas, etc. No debe usarse en superficies metlicas. Se vierte haciendo un crculo alrededor del derrame, o mejor sobre papel absorbente, y se deja actuar 20 minutos. 2. Iodforo. Se utiliza a la dilucin indicada por el fabricante. Adecuado en superficies metlicas. 3. Alcohol etlico al 70%. 4. Productos detergentes desinfectantes, de fcil manejo, no corrosivo, no irritante,

especialmente activo en presencia de materia orgnica y que cambia de color cuando deja de

ser activo ej. Dextran

ETAPAS DEL DIAGNSTICO MICROBIOLGICO Introduccin. El diagnstico de las enfermedades infecciosas, se basa en el estudio de los sntomas y signos clnicos, as como en la demostracin de la presencia del agente etiolgico, de sus productos o de la reaccin que este ha dejado en su contacto con el sistema inmune del individuo. El Laboratorio de Microbiologa Clnica tiene como principal objetivo entregar al mdico informacin relevante para el diagnstico y tratamiento de un paciente, como tambin para que pueda aplicar medidas preventivas. Desde que el Mdico solicita el examen hasta que recibe la informacin con el resultado, se realiza una serie de acciones bien definidas las cuales, deben estar sujetas al control de calidad y constituyen las fases del diagnstico microbiolgico. Cada integrante del equipo de salud, debe ser responsable de realizar su trabajo dentro de las normas de eficacia y eficiencia y con la mayor rapidez de respuesta, procurando minimizar o eliminar los errores. Fases del diagnstico microbiolgico: Existen tres etapas en la generacin de los resultados, por el laboratorio clnico:

i) FASE PRE-ANALTICA, comprende: Solicitud del examen por parte del Mdico. Esta orden debe tener todos los datos demogrficos del paciente, el diagnstico clnico, examen solicitado y tipo de muestra, tratamiento antibitico, fecha y hora de toma de muestra

Indicaciones para preparacin del paciente.

Toma de muestra: La informacin diagnstica que el laboratorio de Microbiologa puede proporcionar, depende de la calidad de la muestra recibida. Una muestra mal tomada, en escasa cantidad o mal transportada, determinara un posible fallo en la recuperacin del agente patgeno, induciendo errores en el diagnstico, como tambin en un tratamiento inadecuado del enfermo. .Requisitos para obtencin de una muestra de buena calidad: .Indicaciones claras al paciente

.Tcnica asptica

.Cantidad adecuada

.Envase apropiado ( estril, limpio, protegido de la luz)

.Rotulada correctamente

.Representativa del cuadro clnico

.Previa a la terapia antibitica

.Debe ser transportada rpida y adecuadamente al laboratorio, con la orden de examen correspondiente. Transporte Las muestras recolectadas en tubos estriles sin medio de transporte, deben ser enviadas al laboratorio, a la brevedad. Como normativa de bioseguridad, las muestras deben transportarse al laboratorio, dentro de unidades trmicas, sin hielo o unidad refrigerante, a excepcin de los aspirados nasofarngeos

para pesquisa de virus respiratorios. Las muestras deben ser trasladadas en gradillas que permitan mantener los contenedores en forma vertical para evitar derrames. Medios de transporte. El uso de medios de transporte se hace necesario para impedir la desecacin de la muestra, asegurando la viabilidad de la bacteria, sin multiplicacin significativa de los microorganismo existentes, sobre todo si son escasos, a la vez que impiden el crecimiento exagerado de otra flora bacteriana no deseada, desde el momento de la obtencin de la muestra hasta su posterior estudio. Los medios de transporte ms frecuentemente utilizados son los de Stuart, Amies, usados para muestras de secreciones y Cary Blair, para coprocultivo. Almacenamiento. -Muestras para virus: en refrigerador, salvo sangre, mdula sea. -Muestras para hongos: en refrigerador, salvo LCR, piel, pelo, uas, vaginal y balano-prepucial. -Muestras para anaerobios: a Temperatura ambiente. -Muestras para micobacterias: en refrigerador, salvo contenido gstrico. -Muestras para cultivo bacteriolgico: a) A temperatura ambiente: mdula sea, lquidos estriles (pleural, peritoneal, articular,...), muestras oculares, muestras de cavidad oral, heridas, abscesos, fstulas, adenopatas, del tracto genital, y biopsias. b) En refrigerador: orinas, heces, catteres. c) En estufa: hemocultivos, LCR, placas y tubos inoculados. Recepcin y registro de datos Verificar que los datos de la solicitud de examen, la muestra y el cdigo de barras coincidan. (Datos demogrficos - nombre, edad, sexo, procedencia, Orden de Trabajo, Tipo de muestra) Registro en el sistema informtico o manualmente en libros para tal efecto Distribucin de las muestras El laboratorio clnico debe tener instrucciones precisas escritas en un Manual de toma de muestras y aplicar criterios de rechazo de muestras.

Criterios De Rechazo De Una Muestra Muestras sin orden, con datos incompletos o discordantes

- Muestras derramadas, o rotas,...

- Envase y/o volumen inadecuados

- Muestras sin medio de transporte adecuado.

ii) FASE ANALTICA: En esta fase es de gran importancia el recurso humano, capacitado y bien entrenado, los reactivos y los equipos de laboratorio, controlados y calibrados. El Laboratorio de Microbiologa clnica tiene un rol fundamental en la identificacin de bacterias en una muestra determinada. El anlisis microbiolgico de una muestra, por lo general sigue la siguiente secuencia:

a) Observacin directa al microscopio b) Cultivo c) Identificacin fisiotaxonmica (pruebas bioqumicas o batera bioqumica) d) Estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos

La observacin directa de la muestra teida con Gram entrega informacin sobre su contenido bacteriano. Es de gran utilidad, sobre todo, en casos de infecciones graves en las cuales el resultado de la observacin orienta al mdico para iniciar tratamiento emprico, a la espera del resultado de los cultivos de la muestra. Los cultivos permiten observar la morfologa de las colonias bacterianas en un medio determinado. Ambos estudios orientativos se complementarn con los anlisis de identificacin del microorganismo (gnero y especie) mediante pruebas o bateras bioqumicas y el tratamiento del paciente con un agente antimicrobiano se orienta con las pruebas de susceptibilidad Un Laboratorio clnico debe tener instrucciones precisas escritas en un Manual de procedimientos donde se define paso a paso el correcto desarrollo de las tcnicas del laboratorio, el mantenimiento y calibracin de los equipos utilizados, un programa de control de calidad interno y externo, para la deteccin y correccin de los errores analticos posibles III) FASE POSTANALTICA.

Incluye:

Validacin de los resultados

Informe del laboratorio en el formato establecido

Puntualidad en la entrega del resultado

Confidencialidad de la informacin de los resultados.

Aviso de valor crtico

Registro de incidentes

Respaldo de informacin

Responsabilidad del Microbilogo frente al mdico, al paciente y las autoridades sanitarias.

Almacenamiento de las muestras

Eliminacin de muestras

CONTROL DE CALIDAD El control de calidad en el laboratorio tiene como objetivo, que el producto final del trabajo tenga un grado aceptable de seguridad, de conformidad con los lmites establecidos. Debido a que la mayora de los resultados en microbiologa son producto de interpretaciones y evaluacin de reacciones bioqumicas de seres vivos, donde la capacidad y experiencia del evaluador tienen un gran valor, los clculos de coeficientes de variacin y desviaciones estndares que son parte de funciones analticas, tienen poca aplicacin en el laboratorio de microbiologa. Es por ello que algunos expertos consideran que el control de calidad en microbiologa es mas un arte que una ciencia. El control de calidad en resumen, es un elemento vital en el laboratorio, ya que ayuda en la confiabilidad de las pruebas, su reproducibilidad, asegura la calidad de los materiales, reactivos y equipos empleados, mejora la auto confianza del personal, detecta fallas que pueden reflejarse en el informe de resultados y en general provee un entorno de excelencia en todos los aspectos del trabajo. 1. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por eficiencia o calidad, mediante la inoculacin de microorganismos cuyo comportamiento conocemos, tanto para reacciones positivas como negativas. Puede utilizarse para ello cepas bacterianas domsticas o cepas control comerciales ( ATCC ). Pruebas bsicas de control de calidad de medios preparados: a. Ph b. Esterilidad c. Capacidad de crecimiento y reaccin d. Estabilidad Criterios de rechazo de los medios preparados: a. Rajadura del plato o envase. b. Rajadura en la superficie del medio. c. Variaciones en el volumen del medio. d. Hemlisis. e. Cristales en el medio. f. Presencia de burbujas. g. Presencia de cogulos. h. Cambio del color normal. i. Contaminacin. j. Falla en la inhibicin de microorganismos saprfitos.

EVALUACION DE LA EFICIENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS :

MEDIO DE CULTIVO ORGANISMO CONTROL REACCION ESPERADA

TSI E. coli cido/cido

TSI Shigella flexnerii alcalino/cido

TSI Pseudomona aeruginosa alcalino/alcalino

MIO Proteus mirabilis movilidad positiva

MIO K. pneumoniae movilidad negativa

Citrato de Simmons K.pneumoniae color azul. Crece

Citrato de Simmons E. coli color verde. No crece.

Caldo de urea (o Agar) Proteus mirabilis Rojo-Morado. Positivo.

Caldo de urea E. coli color Naranjao amrillento. Negativo.

Agar sangre Estr.Betahem.Grupo B Crece. Betahemlisis.

Agar sangre S. pneumoniae Crece. Alfahemlisis.

Agar sangre K.pneumoniae Crece. No hemoltico.

McConkey E. coli Crece. Colonias moradas.

McConkey Proteus sp Crece. Colonias claras.

McConkey Estafilococos No crece.

EMB E. coli Brillo metlico

EMB Proteus sp colonias Claras

SS agar Salmonella sp Crece. Colonias claras con H2S

SS agar E. coli No crece.

OF medio E. coli Amarillo ambos tubos. ferrmentador

OF medio Pseudomona sp Un tubo amarillo. Oxidativo

OF medio Moraxella sp Ningn tubo amarillo. Inerte

Lysina decarboxylasa Citrobacter freundii alcalino/cido H2S +

Lysina decarboxylasa Proteus vulgaris Rojo/cido H2S -

Lysina decarboxylasa Salmonella arizonae Alcalino/alcalino H2S +

Bili-Esculina Streptococcus mitis Incoloro

Bili-Esculina Enterococcus faecalis Negro

Caldo Malonato Klebsiella pneumoniae Azul

Caldo Malonato E. coli No cambia el color

NaCl 6.5% Streptococcus mitis No crece

NaCl 6.5% Enterococcus faecalis Crece

Sabouraud-Dextrosa agar Levaduras Crece

Sabouraud-Dextrosa agar Dermatofitos Crece

Sabouraud-Dextrosa agar Estafilococos Crece

Caldo Cerebro-Corazn Flora mixta Crece

Tioglicolato Flora mixta Crece

Control de calidad de los suplementos : Es importante tener en cuenta que los suplementos de los medios de cultivo, pudieran confrontar problemas de eficiencia o inhibicin, ya que como todo producto pudiera no haber sido almacenado y/o transportado adecuadamente. Solo el uso rutinario de los medios de cultivo preparados con stos suplementos, pudieran darnos la alarma de problemas en los mismos. Muchos suplementos son lbiles al calor, por ello se aaden al medio despus de la esterilizacin para evitar su deterioro. Los medios preparados con la mezcla inhibidora VCN , deben ser utilizados dentro de los 8 das siguientes a su preparacin ya que la eficacia de la mezcla decrece muy rpidamente. La misma advertencia es aplicable a los frascos de VCN rehidratados, por lo que conviene guardarlos congelados si no se va a usar de inmediato. No sobrepasar los 15 das. En el caso de la sangre para la preparacin del agar sangre, es importante cada vez que se reciba un nuevo lote, anotar su apariencia, observar por presencia de cogulos, hemlisis, nmero de lote, fecha de recibo y expiracin, hacerle una determinacin de hemoglobina, la cual debe medir entre los 13.0 - 15.0 g/dl, y por supuesto se debe tomar con una jeringuilla una pequea muestra del vial para sembrarla en agar sangre y tioglicolato para determinar su esterilidad. Tambin se debe examinar el agar sangre preparado con sangre, por adecuada formacin de hemlisis, especialmente utilizando Estreptococos hemolticos. 2. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS: Un elemento fundamental en el trabajo diario del laboratorio, lo constituyen los reactivos, tanto comerciales como de preparacin domstica, que son utilizados en la caracterizacin de microorganismos. Estos reactivos merecen una especial atencin, toda vez que fallas en su funcionamiento pueden generar en identificaciones equivocadas. Por ello, se recomienda correr controles diarios con las bacterias tipo y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto almacenamiento de los reactivos, metodologa de la prueba y tiempo de lectura. Es recomendable que los reactivos comerciales sean examinados inmediatamente cuando se abre un nuevo lote o vial y llevar un registro de su funcionamiento.

REACTIVO MICROORGANISMO REACCION ESPERADA

Coagulasa Staphylococcus aureus Cogulo. Coagulasa positiva

Coagulasa Cepa ATCC 25923 Cogulo. Coagulasa positiva

Coagulasa Stafilococcus epidermidis Inerte. Coagulasa negativa

Oxidasa Pseudomona aeruginosa Negro. Oxidasa positiva

Oxidasa E. coli Inerte. Oxidasa negativa

Catalasa Staphylococcus sp Burbujas. Catalasa positiva

Catalasa Streptococcus sp Inerte . Catalasa negativa

Betalactamasa S. aureus ATCC 29213 Rojo. Positiva

Betalactamasa H. influenzae ATCC 10211 Inerte. Negativa

Optoquina S. pneumoniae Halo de >/= 12 mm

ONPG E. coli Amarillo. Positivo

ONPG Proteus sp Incoloro. Negativo

Kovacs E. coli Anillo rojo. Indol positivo

Kovacs S.pneumoniae Incoloro. Indol negativo

Cloruro frrico Proteus sp Verde. Fenilalanina positivo

Cloruro frrico E. coli Incoloro.Fenilalanina negativo

Sobres de Anaerobiosis Bacteroides sp Crecimiento en Anaerobiosis

Suero para tubos germinales Candida albicans Tubos germinales positivo

3. CONTROL DE CALIDAD DE LOS REACTIVOS UTILIZADOS PARA TINCIONES: La clasificacin correcta de las bacterias de acuerdo a las reacciones bioqumicas, dependen de la pureza, reactividad y estabilidad de los reactivos. La concentracin de las soluciones por efecto de la evaporacin de los solventes o las variaciones introducidas en los mtodos recomendados, puede afectar los resultados de modo adverso. Este es el caso de las tinciones para diferenciar bacterias por su reaccin al Gram y la morfologa bacteriana, tintes para cpsulas, esporas, etc.

El control de calidad de stos tintes debe realizarse primero con cada nuevo lote preparado; luego basta con un control cada semana para mantener un grado de seguridad apropiado en su uso. En el caso de la tincin de Gram, sin lugar a dudas una de las herramientas ms importantes del microbilogo, se recomienda tener especial cuidado con la mezcla de alcohol-acetona para decolorar la placa. Es posiblemente ste reactivo el que produce mayores problemas ya sea por decoloracin excesiva o por dbil decoloracin de los microorganismos. Es tambin la etapa de la tincin de Gram en la que el tiempo de exposicin es ms determinante. Para facilitar el control de los tintes, se recomienda preparar placas con microorganismos aislados en el trabajo rutinario, utilizando cepas frescas, tomando en cuenta aquellos que pudieran ser ms tiles segn la tincin a evaluar. Algunos ejemplos son:

TINCION MICROORGANISMO REACCION ESPERADA

Gram Estafilococo sp Morado. Gram-Positivo.

Gram E. coli Rosado. Gram-Negativo.

Gram Mezcla de ambos Mezcla de ambas colores.

Zielh-Neelsen Mycobacterium sp Rosadas. BAAR positivo

Zielh-Neelsen E. coli Azul. BAAR negativas.

Kellung S. pneumoniae Deteccin de cpsula positiva

Kellung E. coli Deteccin de cpsula negativa

Verde malaquita Clostridium sp Espora de color verde. Resto de la clula rosada.

Verde malaquita E. coli Clula completa rosada.

4. CONTROL DE CALIDAD DE ANTISUEROS: El mundo de la microbiologa ha sido inundado cada vez ms por productos comerciales hechos con el objetivo de detectar agentes etiolgicos de enfermedades en el menor tiempo posible, con el mayor grado de especificidad , sensibilidad y algunos de ellos con la intencin de eliminar el cultivo bacteriano como nica forma diagnstica. Estos sistemas actan algunos con solo la muestra del paciente y otros requieren de la cepa aislada o detectan sus metabolitos. Estos sistemas se han convertido en un arma imprescindible para el microbilogo y en muchos casos dan confianza en la seguridad del diagnstico y en otras se utilizan en la deteccin de microorganismos difciles de cultivar.

Estos productos para la deteccin directa del espcimen o la cepa bacteriana, son considerados exmenes bacterianos y no test serolgicos. En forma general estos kit deben ser probados cada vez que se recibe un nuevo lote y cada vez que se utilicen, se le deben correr sus controles positivo y negativo que vienen con cada kit. Consideraciones generales en el uso de antisueros : a) Los sistemas son para uso exclusivo de diagnstico in vitro. b) Conservar todos los reactivos en refrigeracin. c) Anotar la fecha en que se abre el kit. d) No congelar los reactivos. e) No utilizar los reactivos si se sospecha deterioro de los mismos, tales como si se observa cambio de color, autoaglutinacin en el envase, no producen la reaccin esperada con los controles respectivos, reactivos contaminados o con signos de evaporacin. f) El personal de laboratorio calificado, debe utilizar las tcnicas aspticas y las precauciones habituales para protegerse de los agentes infecciosos. g) Nunca pipetear con la boca las muestras y/o los reactivos. h) No utilizar reactivos de lotes diferentes. i) No utilizar los reactivos despus de la fecha de caducidad. j) Despus de sacar los reactivos de la refrigeradora, dejarlos a temperatura ambiente antes de utilizar. k) Todos los productos inoculados deben ser considerados como potencialmente infecciosos. l) No volver a utilizar las tarjetas desechables, despus de haber sido utilizadas. m) Algunas pruebas deben estar precedidas por su apropiado cultivo, aislamiento y pruebas bioqumicas preliminares, antes de realizar mtodos serolgicos y una identificacin final. n) Al terminar la prueba, todo el material sucio y productos inoculados deben ser sometidos a esterilizacin por autoclave, incinerados o sumergidos en un desinfectante germicida adecuado, antes de su eliminacin. ) La interpretacin de los resultados debe ser hecha por personal calificado, que tomar en cuenta el contexto clnico, el origen de la muestra, los aspectos macro y microscpico y su experiencia. o) Aglutinacin por Antgenos de Estreptococos: Un test positivo est indicado por la aparicin de una aglutinacin ntida de ltex en 2 minutos en un crculo, lo cual permite la identificacin de grupo. No tomar en cuenta las aglutinaciones dbiles que pudieran aparecer en otros crculos. Una aglutinacin intensa en varias suspensiones de ltex, representa una mezcla de grupos o una cepa autoaglutinable. Volver a hacer el aislamiento de la colonia y el test de ltex. Una vez a la semana verificar la reactividad de las suspensiones bacterianas. Para ello seguir las indicaciones del fabricante y reemplazar la cepa a analizar, por el control positivo. Debe aparecer una aglutinacin en cada suspensin ltex.

Tambin la especificidad del test se puede analizar utilizando cepas control como el Streptococcus pyogenes ATCC 19615 seguir la tcnica sin emulsionar colonias en la enzima de extraccin, o mezclar los reactivos de ltex con una gota de NaCl 0.15 mol/l. No debe aparecer aglutinacin en las suspensiones de ltex. Pueden aparecer resultados falsamente negativos si se estudia una cantidad insuficiente de colonias

Cuando se utiliza el mtodo de deteccin directa de antgenos en muestras del tracto respiratorio superior, hay que tener en cuenta la baja sensibilidad del test, por lo que todo resultado negativo debe ser seguido por su correspondiente cultivo para verificar. p) Aglutinacin por Salmonella sp : Sea estricto en el tiempo de la reaccin. Miembros del grupo Salmonella estn antignicamente relacionados a Citrobacter y Arizona. Antgenos de stos microorganismos tienen estructuras compartidas, por lo que puede haber reacciones cruzadas.

Por esto es importante que la prueba de aglutinacin para Salmonella solo se realice a aquellas cepas que muestran patrn bioqumico del gnero Salmonella. 5. CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS MEDIANTE DISCO: Hemos querido resaltar los aspectos de control de calidad de la prueba de sensibilidad a los antibiticos por difusin simple en agar, utilizando discos de sensibilidad, ya que es la prueba de mayor utilidad en nuestro medio. Es importante tener presente que sta prueba a sido designada exclusivamente para examinar microorganismos de rpido crecimiento, utilizando la normativa NCCLS M2-A6 , volumen 13, nmero 24. Este mtodo no es til para organismos fastidiosos, de crecimiento lento o para anaerobios. El mtodo de difusin simple en agar es sin lugar a dudas el sistema de mayor uso para la realizacin de la sensibilidad bacteriana. Hay que tener en cuenta el gran valor de sta prueba en la deteccin temprana de multiresistencia, escogencia y valoracin de un antibitico frente a un microorganismos patgeno, proteccin de infeccin, estudios epidemiolgicos, etc . La prueba de sensibilidad a los antibiticos consta de varios elementos que deben ser tenidos en cuenta: El medio de cultivo, inoculo, incubacin, lectura e interpretacin y el reporte. Control de calidad del medio de cultivo:

Utilizar agar de Mueller-Hinton.

La calidad del agua es determinante, ya que la misma debe estar libre de iones metlicos. Las variaciones de cationes divalentes, principalmente calcio y magnesio, afectar los resultados con aminoglicsidos, tetraciclina y colistina, cuando se prueban ante cepas de Ps. Aeruginosa. Un contenido excesivo en catin, reducir la zona de inhibicin, mientras que un escaso contenido en catin, puede dar un inaceptable aumento en el tamao de la zona.

Servir en placas Petri de 100 x 15 mm, con una profundidad de 4 a 5 mm

Aproximadamente se utilizan 25 cc para platos de 100 mm

Volmenes mayores de medio provocan disminucin en el tamao del halo de inhibicin, y volmenes menores halos ms pequeos.

Se deben seguir las normas generales establecidas para almacenamiento del medio de cultivo.

Las placas Petri deben ser colocadas en la incubadora para secarlas de restos de agua producto de la condensacin, antes de ser utilizadas para no diluir el inoculo bacteriano.

Control de calidad de los discos de sensibilidad: Las metas de un programa de control de calidad van destinadas a monitorear: La precisin y exactitud del procedimiento de la prueba de susceptibilidad, el comportamiento de los reactivos utilizados en la prueba y la actuacin de las personas que llevan a cabo las pruebas y sus resultados. 1. Los discos deben ser almacenados a un temperatura entre 20 y +8C. Algunos discos, especialmente los de antibiticos -lactmicos deben guardarse congelados a -20C. Solo los viales en uso deben mantenerse a temperatura de refrigeracin. 2. Al sacarlos del refrigerador para su uso, espere a que los viales alcancen la temperatura ambiente por 1 a 2 horas. 3. Siempre utilice primero los viales con fecha de caducidad ms prxima. 4. Siempre que un cartucho a sido extraido del paquete, ste debe guardarse en un desecador que cierre perfectamente. 5. Cuando se utilice el aparato dispensador que contiene los discos deber mantenerse siempre refrigerado. 6. Los discos son colocados en el medio a una distancia de ms de 24 mm del centro de uno al centro del otro. 7. Procurar no colocar discos de antibiticos bactericidas (Ej. Penicilina, Cefalosporinas, Aminoglicsidos, Vancomicina) al lado de antibiticos bacteriostticos (Ej. Cloranfenicol, Tetraciclina, Sulfonamidas) para evitar el antagonismo antibitico. 8. Colocar las placas en la incubadora dentro de los 15 primeros minutos despus de su aplicacin. 9. Para verificar el estado de los discos de sensibilidad, utilice cepas control ATCC, las cuales son seleccionadas por su estabilidad gentica y por su utilidad en el mtodo utilizado. Estas cepas se corren como una muestra ms y se correlaciona el tamao de los halos de inhibicin con las medidas expresadas en los Manuales NCCLS M2-A6. Entre las cepas ATCC (American Type Culture Collection ) recomendadas estn:

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Haemophilus influenzae ATCC 49247 y 49766

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226

Escherichia coli ATCC 25922 y 35218

(La E coli 35218 como organismo de control para combinaciones con inhibidor de betalactamasa, como aquellos que contienen cido clavulnico, sulbactam o tazobactam).

Staphylococcus aureus ATCC 25923 y 29213

Pseudomona aeruginosa ATCC 27853

Enterococcus faecalis ATCC 29212 ( Para ser utilizado con discos de alto contenido de Aminoglicsidos ).

EL ESTANDAR McFARLAND :

La densidad de la turbidez del Estndar McFarland deber ser verificada utilizando un espectrofotmetro con direccin de luz de 1 cm y cubetas adecuadas para determinar absorbancia. Para realizar el control de un estndar McFarland de 0.5, la absorbancia deber leer entre 0.08 a 0.10 a una longitud de onda de 625 nm.

La suspensin de Sulfato de Bario deber transferirse en alcuotas de 4 a 6 ml dentro de tubos con rosca. Estos tubos debern guardarse a temperatura ambiente en un lugar fresco y oscuro.

Antes de ser usados, los patrones debern agitarse para una adecuada homogenizacin.

Mensualmente los patrones son descartados y vueltos a preparar, o en su defecto se debe comprobar su densidad.

Habituales causas de error en la prueba con disco: a. Error administrativo en la transcripcin de los datos del control de calidad. b. Lectura errnea al medir el dimetro de la zona. c. Contaminacin u otros cambios en la cepa control. d. Suspensin del inculo demasiado fuerte o demasiado dbil. e. Mala agitacin del estndar McFarland o estndar daado. f. Incorrecta temperatura, tiempo o atmsfera de incubacin. g. Perdida de la potencia del disco durante su transporte, su manejo o su almacenaje en el laboratorio. Control de calidad de la lectura e interpretacin:

Cuando se va a determinar la sensibilidad del S. pneumoniae a la Penicilina, utilizar un disco de Oxacilina de 1 g. Las cepas de S. Pneumoniae con zonas de Oxacilina de >/- a 20 mm son susceptibles a penicilina ( CIM

Cuando se trata de Sulfonamidas, los microorganismos deben desarrollarse por varias generaciones antes de que ocurra inhibicin, por lo que se hace caso omiso del crecimiento leve, al igual que de un vestigio de proliferacin dentro del halo de inhibicin.

Si se observan colonias dentro de un halo de inhibicin, deber confirmarse la pureza de la cepa y repetir la prueba.

La difusin ( " swarming ") de los Proteus sp no es inhibida por todos los antibiticos, por lo que no se toma en cuenta.

Ocasionalmente se pueden observar varis colonias esparcidas por una zona de inhibicin. Este fenmeno es constante para la Serratia sp y la Polimixina. Las colonias se considerarn significativas y la cepa resistente

Solo es necesario probar una Tetraciclina y sus resultados son equivalentes a la Tetraciclina, Minociclina, Doxiciclina.

Los resultados obtenidos con al Polimixina, pueden aplicarse a la Colimicina. Su halo es pequeo debido a su pobre difusin en agar.

Se ha informado que algunas cepas de Providencia sp dan resultados de sensibilidad falsos con discos de Cefprozil , las cepas de ste gnero no deben analizarse ni informarse con ste disco.

Los Estafilococos resistentes a la Meticilina, Oxacilina o Nafcilina, tambin puede ser informados como resistentes a la Penicilina, Cefalosporinas , carbapenem y combinaciones de inhibidores de betalactamasa, a pesar de su aparente sensibilidad in vitro, lo cual no se refleja in vivo.

La Cefalotina puede utilizarse para representar Cefalotina, Cefradina Cefaclor y Cefadroxil

Los datos de sensibilidad al cido nalidxico, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Sulfonamidas y Trimethoprim, se aplican solamente a cepas aisladas de infecciones urinarias.

El disco de Sulfisoxazol puede ser usado para representar cualquiera de las Sulfonamidas disponibles.

En cepas de Salmonella y Shigella, solo Ampicilina, una Quinolona y Trimethoprim/sulfametoxazol deben ser probados e informados de rutina en heces. Adems el Cloranfenicol y una cefalosporina de tercera generacin deben ser probados e informados en cepas de Salmonella sp extraintestinal.

En cepas de Salmonella sp y Shigella sp, los aminoglicsidos y las cefalosporinas de primera y segunda generacin, pueden aparecer como activos in vitro pero no son efectivos clnicamente y no deben ser informados como susceptibles.

La prueba de la betalactamasa predice la resistencia a la Penicilina, Ampicilina y Amoxicilina.

Las cefalosporinas pueden aparecer activas in vitro contra Listeria sp, pero no son efectivas clnicamente y no deben ser informadas como susceptibles.

Los Enterococos sp las cefalosporinas, los aminoglicsido ( Excepto por resistencia de nivel alto ), Trimethoprim/sulfametoxazole y la Clindamycina, pueden aparecer activos in vitro pero no son efectivos clnicamente y stas cepas no deben informarse como susceptibles.

La susceptibilidad y resistencia a Azitromicina, Claritromicina y Diritromicina puede ser interferida por la prueba de Eritromicina.

Solo los resultados de las pruebas de Ampicilina, una cefalosporina de tercera generacin, el Cloranfenicol y Meropenem deben ser informados de rutina en todas las cepas aisladas de H. influenzae aisladas de sangre y LCR de pacientes con infecciones severas.

Los resultados de las pruebas de susceptibilidad con Penicilina, Cefotaxime o Ceftriaxone, Meropenem y Vancomicina, deben ser informados de rutina en cepas de S. pneumoniae aisladas de sangre y LCR de pacientes con infecciones severas como meningitis y bacteremia.

Verificacin de antibiogramas atpicos: a. Examine primero por errores de trascripcin. b. Reexamine la placa de sensibilidad. c. Evalu reportes previos del paciente para observar su patrn de sensibilidad anterior. d. Repita los test de identificacin y sensibilidad a los antibiticos. Condiciones sugeridas que requieren verificacin del resultado de Sensibilidad a los antibiticos:

S. aureus resistente a Oxacilina.

S. pneumoniae resistente a Penicilina.

Cefalosporinas de amplio espectro (Cefotaxime, Ceftriaxone ) resistente para S. pneumoniae.

Streptococcus viridans penicilina resistente o intermedio, aislados de reas estriles del cuerpo.

Estafilococos o Enterococos resitentes a la Penicilina o intermedio.

Enterococos con altos niveles de resistencia a la Gentamicina aislados de reas striles del cuerpo.

Klebsiella sp o E. coli con potencial espectro de betalactamasa. ( Ej. Resistente a Ceftazidime ).

Bacilos Gram negativos no fastidiosos resistentes a Gentamicina- Tobramicina-Amikacina.

S. maltophilia resistente a Trimethoprim-Sulfametoxazole.

H. influenzae Ampicilina resistente y betalactamasa negativa.

Un aislamiento para el cual el antibiograma es atpico para la especie.

Ampicilina y/o Cefalotina susceptible para Enterobacter sp, Citrobacter freundii, Serratia marcescen y Ps. Aeruginosa.

Klebsiella sp sensible a Ampicilina.

Bacilos Gram negativos Imipenem resistentes o intermedio, excepto S. maltophilia.

Bacilos Gram negativos Ciprofloxacina resistente, excepto S. maltophilia o B. cepacia.

PATRON DE RESISTENCIA ESPERADA PARA ALGUNOS MICROORGANISMOS:

MICROORGANISMO RESISTENCIA ESPERADA

Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Morganella, Providencia, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Serratia, Yersinia.

Ampicilina

Citrobacter freundii, Enterobacter, Cefazolin, Cefalotina

Morganella, P. Vulgaris, P. penneri,Providencia, Serratia, Yersinia. Klebsiella

Ticarcilina

C. freundii, Enterobacter, Serratia. Cefoxitin, Cefotetan

C. freundii, Enterobacter, P. vulgaris, Serratia. Cefuroxime

Citrobacter, Enterobacter, Serratia .Amoxicilina/cidoclavulnico Ampicilina/Sulbactam

Acinetobacter baumannii Ampicilina, Cefazolin,

Burkholderia cepacia Cefalotina, Cefoxitin, Cefotetan,

Ps.aeruginosa,Aeromonas Stenotrophomonas maltophilia.

Cefmetazole.

Acinetobacter baumannii Ticarcilina, Mezlocilina, Piperacilina.

B. cepacia, S. maltophilia, Gentamicina

Ps. aeruginosa Trimethoprim-Sulfametoxazole.

S. maltophilia Imipenem, Meropenem.

6. CONTROL DE CALIDAD DE EQUIPOS Y MATERIALES DE TRABAJO: Objetivo: Todos los instrumentos utilizados en el laboratorio clnico, deben estar amparados por un programa de control de calidad y de mantenimiento preventivo, basados en las instrucciones del fabricante y los procedimientos establecidos. Programa de mantenimiento: Un programa de mantenimiento preventivo es esencial para asegurar la exactitud y longevidad del instrumento. El chequeo peridico recomendado es importante para minimizar el dao o la necesidad de servicio y reparacin. El Director del laboratorio es responsable por el programa general, recayendo en el jefe de la seccin la responsabilidad primaria en su rea de trabajo. Un listado de los equipos debe incluir: nombre, marca, modelo, nmero de serie, fecha de recibo y nmero de inventario de la institucin.

Un registro debe incluir el mantenimiento preventivo, periodicidad de la inspeccin y fallas del instrumento. Manual de Instrucciones del Uso del Instrumento: Estos Manuales deben estar incluidos en el Manual de Operaciones del instrumento, redactados en forma clara, en el idioma de los usuarios, inclusive la documentacin del entrenamiento del personal. Cada protocolo debe incluir precauciones de seguridad y los procedimientos de limpieza y cuidado del instrumento. Los Manuales deben incluir instrucciones bsicas para resolver problemas menores y un rcord de incidencias, que incluye el tipo de problema, los pasos tomados para resolverlo y la accin correctiva para evitarlo en el futuro. Calibracin del Instrumento : Los equipos que requieren un exacto nivel de precisin para obtener un resultado seguro, requieren de una calibracin peridica. La fecha de la calibracin, frecuencia y resultado, deben ser mantenidos en un libro dentro del laboratorio. Control de Calidad: Todo equipo debe ser evaluado por un programa de Control de Calidad en base a las instrucciones del proveedor y las regulaciones internas del laboratorio. Debe mantenerse un libro de todo lo realizado al respecto, con el nombre del instrumento, fecha, resultado y comentarios. Referencias y Lectura Suplementaria: Idealmente el laboratorio guardar en un flder toda literatura extra que se obtenga sobre un equipo, sus accesorios, materiales, estudios forneos sobre su funcionamiento, etc. a) INCUBADORAS:

Controle diariamente la temperatura de las incubadoras, antes de sacar las placas y anote en una hoja control el resultado.

Observe el termoregulador por cualquiera alteracin en su posicin preestablecida.

Coloque las muestras, placas y tubos, en una posicin segura.

Un papel de filtro humedecido con agua en el fondo de la incubadora, es adecuado para mantener la humedad requerida.

Las incubadoras de CO2 requieren medir el nivel de gas diariamente.

El jefe de seccin debe ser notificado cuando una incubadora falla en mantener el rango de temperatura aceptable.

Observe macroscpicamente las placas Petri para observar desecacin.

En incubadoras de CO2, se puede colocar un cultivo de N. gonorrhoeae ATCC 43069 , subcultivandola cada da, para observar su ptimo crecimiento, ya que es un microorganismo que necesariamente requiere CO2 para crecer.

Todas las incubadoras deben ser limpiadas mensualmente y llevar un registro de mantenimiento preventivo.

b) AUTOCLAVES:

PROCEDIMIENTO POR

CORRIDA DIARIO SEMANAL MENSUAL

Examine Temperatura y Presin X

Utilice Indicadores de Esterilizacin

X

Registro de uso, fecha, temperaturas, presin

X

Chequeo del nivel de agua X

Uso de Indicadores biolgicos de Esterilidad

X

Limpieza del Interior y Exterior. X

Limpieza del drenaje y sellos

X

c) CAMARAS DE SEGURIDAD :

a) Apague la lmpara Ultravioleta antes de comenzar a trabajar. b) Prenda el blower 15 minutos antes de utilizar. c) Observe que no se obstruye el flujo de aire. d) Si hay derrame dentro de la cabina, limpie con un desinfectante apropiado,

manteniendo apagada la cabina. e) Evite el uso de mecheros de flama dentro de la cabina. f) Lleve un control de la medida del flujo de aire. g) Lleve un control de la calibracin del flujo de aire. h) Lleve un control del remplazo de los filtros. i) Compruebe los sistemas de alarma de funcionamiento. j) La superficie interior de la mesa de trabajo de la cabina, puede ser cultivada

semanalmente para detectar contaminacin. k) Desinfecte la cabina antes y despus de utilizar. l) No utilice las cabinas biolgicas para hacer mezclas de sustancias qumicas y viceversa. m) Cuando trabaje en la cabina, evite la entrada brusca de aire y el uso innecesario de las

puertas del rea. d) GENERADORES DE AMBIENTE - SISTEMA GasPak

a) Mantenga los generadores de gas a temperatura ambiente y el sobre sellado. b) Mantenga los catalizadores en lugar seco, a temperatura ambiente y las bolsas

sellados. c) Mantenga los indicadores de anaerobiosis a temperatura de refrigeracin ( 2-8C ). d) El tiempo de generacin de la atmsfera dentro de la jarra es de 30 minutos.

e) El indicador de anaerobiosis cambia de color azul a blanco dentro de la jarra en 4 a 5 horas.

f) Una evidencia sugestiva de ambiente anaerobio, es el cambio de color a rojo vino del agar sangre.

g) Algunos microbilogos utilizan un agar inoculado con Clostridium novyi B (ATCC 19402) como indicador de ambiente anaerobio, ya que el mismo es anaerobio estricto.

h) Los catalizadores de Paladio, pueden ser regenerados colocndolos en horno a 160 C por 2 horas.

i) Control biolgico de crecimiento:

Cepa ATCC Resultado

Cl. perfringes13124 Crece

Micrococcus luteus 9341 No crece

Campylobacter jejuni 33291 Crece

e) REFRIGERADORES:

a) Control diario de la temperatura. b) Coloque las placas Petri en posicin invertida con la tapa hacia abajo. c) Mantenga la temperatura entre 4 8 C. d) Utilice refrigeradoras que no hacen escarcha. e) No coloque medios de cultivo aun ligeramente calientes dentro de la refrigeradora. f) Evite abrir con frecuencia la puerta de la refrigeradora. g) Lleve un registro de problemas de funcionamiento, causa y solucin. h) No guarde alimentos en refrigeradoras para especmenes clnicos.

f) MICROSCOPIOS:

CUIDADOS Y MANTENIMIENTO DIARIO MENSUAL SEMESTRAL

Limpieza del aceite de objetivos, condensador, etc

X

Apagar la fuente de luz

X

Colocar cobertor contra el polvo

X

Limpieza de Ocular, condensador, diafragma con lquido de limpieza de lentes

X

Limpieza y ajuste del sistema ptico

X

Limpieza y ajuste del sistema lumnico

X

Limpieza y lubricacin del sistema mecnico

X

g) CENTRFUGAS:

ELEMENTO POR CORRIDA

DIARIO SEMANAL MENSUAL

Verificar tubos por rajaduras

X

Verificar por restos de vidrio o lquido dentro del portatubo o las copas

X

Verificar para balance de cada lote

X

Verificar por la temperatura de funcionamiento ( Refrigeradas )

X

Limpieza de cualquier derrame

X

Limpieza de la olla del rotor

X

Limpieza externa

X

Desinfeccin de la olla del rotor

X

Problemas y Limitaciones: 1. Vibracin a. Chequear por balance apropiado. b. Chequear tamao de los tubos. c. Mirar si la centrfuga est sobre una superficie plana. 2. Rotura a. Chequear tamao de los tubos. b. Balance correcto. c. Verificar el interior de los portatubos 3. Desprendimiento de tapas: a. Utilice tapas de rosca. b. Si no es posible, use Parafilm sobre los tapones de caucho. c. Siempre que sea posible utilice tubos de plstico.

No centrifuge grandes volmenes de lquidos inflamables, los cuales pueden producir vapores que pueden incendiarse durante la operacin del equipo.

La concentracin de materiales infecciosos para cultivo puede realizarse en el rea rutinaria de cultivo, siempre y cuando los tubos estn bien cerrados.

No colocar las tazas o los portatubos en el horno o autoclave para descontaminar.

Evitar utilizar para la limpieza soluciones que contengan cloro o sal, ya que son altamente corrosivas.

7. CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA: El agua destilada utilizada en la preparacin de medios de cultivos y para reconstituir reactivos, debe tener un control de calidad bsico que incluye los parmetros qumicos y bacterianos. Control de Calidad Qumico: Este control puede ser realizado teniendo en cuenta una gran variedad de parmetros a evaluar, tales como: Ph Conductividad Olor Color aparente Turbidz Alcalinidad Dixido de carbono Dureza Iones Cationes Metales pesados Sin embargo, dadas las limitaciones para realizar un estudio profundo, recomendamos el siguiente mtodo sencillo y apropiado para determinar la calidad del agua, aparte de la determinacin de su Ph ( 5.0 5.5 ). Para determinar calidad: Reactivos: a) Solucin Acuosa de Nitrato de plata ( NO3Ag )

NO3Ag 5.1 g

Agua destilada 300 ml b) cido Ntrico Mtodo: Colocar en un vaso qumico limpio :

10 ml de agua destilada a examinar

2 gotas de cido ntrico

1 ml de Solucin de NO3Ag Evaluacin: El agua deber continuar completamente clara. Si aparece una ligera turbidez blanquecina, indicar que la calidad es deficiente.

(Ref: manual de Tcnicas Bsicas OPS/OMS N 439, pag. 58) Control de Calidad Microbiolgico del Agua destilada:

Agregar 1 ml de agua destilada a examinar, a un tubo de Tioglicolato.

Agregar 1 ml de agua destilada a examinar a un plato de agar sangre.

Incubar a 35.5 C por 4 das.

Llevar un libro de registro del control de calidad del agua.

D. EL CEPARIO : Los sistemas de Validacin son los procesos que se requieren para asegurar que los parmetros de funcionamiento de los test, tanto comerciales como los de uso domsticos, son los esperados y las pruebas pueden ser utilizadas como mtodos de diagnstico en el laboratorio. La mayora de los procedimientos en Microbiologa Clnica, dependen de que los microorganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener sus caractersticas morfolgicas , fisiolgicas y que sean tpicas y reproducibles. Para ayudar en este control, las Cepas Estndar de Control de Calidad, son un componente esencial de un proceso de validacin. Existen varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad. Algunos ejemplos son:

ATCC : American Type Culture Collection- Rockville, USA

NCIC : National Collection of Industrial Bacteria- Survey, Inglaterra

JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism- Japn

CCTM : Coleccin Nacional Lille, Francia

RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Mosc, Rusia.

NCIB : Coleccin Nacional industrial Aberdeen, Escocia

DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Gottinger, Alemania. As, la E. coli ATCC 25922 es igual a la DSM 1103 y a la NCIB 12210. Los organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o sistemas de identificacin, generalmente son estipulados por los fabricantes o bien escogidos por el usuario. Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATCC y si son cepas domsticas, es necesario tener un historial del organismo que incluye nombre, rea de aislamiento, reacciones bioqumicas y patrn de sensibilidad a los antibiticos, forma de almacenaje, fecha de ltimo transplante, etc En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos especficos:

Caractersticas tpicas.

Caractersticas estables.

Reproducibilidad 1. MTODOS DE CONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS: Los mtodos de conservacin de las cepas estndar de control de calidad, deben asegurar que las mismas mantengan sus caractersticas tpicas y que puedan ser reproducidas despus. El medio utilizado para su conservacin debe mantener un mnimo de mutaciones. Estas mutaciones pueden evitarse permitiendo tambin el mnimo crecimiento del microorganismo y aportando ptimas condiciones ambientales para su sobre vivencia, con el menor nmero de subcultivos

Para una mejor clasificacin de los mtodos de conservacin de cepas, los dividiremos en tres categoras: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo diario.

A) CULTIVOS STOCK: Estos representan el verdadero " Banco de Cultivos" . Estos son mantenidos en un sistema cerrado de conservacin, minimizando su actividad gentica y fisiolgica, para evitar su potencial mutacin. Los dos ms importantes mtodos para conservacin en Stock, son la Liofilizacin y el Ultracongelamiento.

LIOFILIZACION: Se hace una suspensin fuerte de un cultivo puro y joven en

leche estril o similar, y se coloca en tubos con rosca y se siguen las instrucciones del aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un simple bomba de vaco, hasta un sofisticado sistema. Durante este proceso evitar que el cultivo se derrame dentro el aparato liofilizador y la formacin de aerosoles Este sistema tiene la ventaja de ser el que permite la sobrevivencia por un mayor periodo de tiempo y mayores facilidades para el transporte de las cepas.

ULTRACONGELAMIETO: Hacer una suspensin fuerte de la colonia pura en

caldo Brucella conteniendo 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en pociones de 0.5 ml en pequeos tubos con rosca y coloque en lo profundo del congelador a -45C. Tambin se puede utilizar la modificacin de Ultracongelamiento en Nitrgeno lquido, que consiste en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato especficamente designado para el mantenimiento de cepas en nitrgeno lquido. Ambos sistemas preservan las bacterias por largos periodos de tiempo.

B) CULTIVOS SEMISTOCK: Este trmino se refiere al mantenimiento de cultivos por un periodo intermedio entre el relativamente permanente cultivo en Stock y el cultivo de cepas control para el trabajo diario. De las 5 tcnicas listadas a continuacin, solo la de congelamiento es utilizable para el mantenimiento de cepas de anaerobios.

a) Congelamiento en congelador convencional :

Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre-10 a 25C. Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la ultracongelacin y son colocados en el congelador. El mtodo permite la sobrevivencia de bacterias y levaduras en algunos casos por aos y en la mayora de las veces por al menos de 6 a 12 meses.

b) Cultivo en CTA:

Se preparan tubos con rosca conteniendo Cistena-Tripticasa y Soya agar. Inocular el cultivo puro y joven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en refrigeracin, si es posible en la oscuridad. Microorganismos menos delicados sobreviven bien por un ao y los fastidiosos por 6 meses.

c) Secado en discos con gelatina:

Este mtodo es conocido tambin como mtodo Stamp en honor de su creador. Corte pequeos crculos de papel encerado y colquelo en una placa Petri de vidrio. Esterilice en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presin.

Prepare una suspensin de caldo nutriente con 10% de gelatina en polvo (Peso por Volumen) y 0.25% de cido ascrbico (P x V) y dispense en tubos con rosca y esterilice en autoclave. Haga una suspensin fuerte de un cultivo puro y joven y coloque una gota del mismo con una pipeta estril sobre uno de los discos de papel acerado estril en una placa Petri. Con una pinza estril, transfiera el disco a un desecador de vaco conteniendo Penaxido de fsforo. Evacue el desecador con la bomba de vaco. Cuando el disco est seco, aspticamente introducir en un tubo estril con tapa de rosca y colocar en el refrigerador. Para hacer un subcultivo del disco, aspticamente retire un crculo de papel con las colonias y colocarlo en un tubo conteniendo un caldo de cultivo e incubar por 24 horas a 35C y luego hacer transplante a agar sangre e incubar nuevamente.

d) Conservacin en medio de cultivo inclinado con aceite mineral:

Es un mtodo especialmente utilizado para hongos, pero es til tambin para algunas bacterias. En el caso de los hongos, se utiliza un cultivo joven y bien esporulado en un medio de cultivo inclinado, tal como agar de Sabouraud-dextrosa. Cubrir completamente con aceite mineral estril. El aceite debe ser esterilizado a 15 libras de presin por 45 minutos, para asegurar su esterilidad absoluta. Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la llama de un mechero o incinerador y remueva una porcin visible de crecimiento con una asa estril larga o una aguja. Este mtodo permite la sobrevivencia por muchos aos. Si el mtodo se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar de Cerebro-Corazn o agar Mueller-Hinton suplementados con hemoglobina al 2% e Isovitalex al 1%. Los medios se sirven en tubos con rosca. Se esterilizan y luego se les hace coagular en forma inclinada. Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a 35C por 24 horas, tomando en cuenta sus requerimientos de oxgeno. Luego las cepas son cubiertas con aceite mineral estril, hasta 1 cm por encima del final del inclinado. Los cultivos son viables por 2 aos a temperatura ambiente.

e) Mantenimiento en tierra estril:

Es utilizado primeramente para hongos y bacterias esporuladas. Esterilice en autoclave tierra suelta en tubos con rosca a 15 libras de presin por 1 hora. Haga una suspensin fuerte del microorganismo joven y esporulado y colquelo en el tubo con tierra estril. Deje secar y colocarlo en un refrigerador.

C) CULTIVOS DE TRABAJO DIARIO: Los cultivos control para el trabajo diario, son una forma conveniente para realizar el control de calidad de pruebas de uso frecuente y que requieren una lectura comparativa al momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y oxidasa, entre otras. Para ste propsito se utilizan cultivos de 24 horas y son transplantados diariamente.

Bacterias resistentes: Tal es el caso de Estafilococos y Enterobacteriaceas. Se transfiere una colonia joven de un cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar nutritivo inclinado e incubar por un mnimo de tiempo tal que haya crecimiento. Guardar en refrigerador. Los cultivos para trabajo diario, son transferidos a otros tubos de agar inclinado cada mes por un intervalo de 6 meses. Despus de ste tiempo, se debe volver a hacer otro pase del cultivo stock.

Bacterias delicadas : Los cultivos de trabajo diario de organismos delicados como N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae, S. pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados como agar chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser colocados en refrigeracin. Despus de una serie de 6 transplantes consecutivos, se debe preparar otro cultivo para uso diario a partir de la cepa en stock.

Bacterias anaerbicas: Los cultivos para trabajo diario de la mayora de las bacterias anaerbicas, pueden ser mantenidos en medio de carne cocida o en Tioglicolato con 0.5% de carbonato de sodio adicionado despus de esterilizar por autoclave. Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente.

Hongos: Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con agar Sabouraud o sustituto. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta que haya crecimiento, y ocurra la esporulacin, para luego ser colocados en refrigeracin. Los cultivos de trabajo deben ser transferidos cada 2 meses. Pasado ste tiempo se debe preparar otro cultivo de trabajo a partir de la cepa en stock.

Cultivos de trabajo comerciales: Son preparados por casa comerciales utilizando cepas conocidas como la ATCC. Estas son estables en refrigeracin por un ao. Tal es el caso de Bact-Chek de Roche Diagnostics, Bactrol Disk de Difco, entre otras.

Para reactivar las cepas se colocan en un caldo nutritivo como el caldo de Tripticasa y Soya e incubados por 24 horas a 35C. Luego se hace un transplante a un medio de enriquecimiento o a agar sangre.

2. MANTENIMIENTO DEL CEPARIO: Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que el mismo constituye una ayuda importante en la validacin de equipos, materiales, reactivos y habilidad del personal. Debe existir un programa metdico de transplantes de cepas , archivo de cada uno de los cultivos con sus caractersticas bioqumicas, sensibilidad a los antibiticos, origen de la cepa, mtodo de identificacin, fecha de siembra y prximo transplante, etc 3. CEPAS ATCC: En nuestro medio por situaciones muy especiales y altamente beneficiosas, podemos tener acceso a las cepas control del American Type Culture Collection ( ATCC ) , la coleccin ms grande e importante del mundo. Estas cepas bacterianas pueden ser utilizadas como control en una gran variedad de utilidades, lo cual nos permite conocer el grado de confiabilidad de los productos comerciales o elaborados en el laboratorio.

A continuacin algunas referencias de las cepas ATCC:

MICROORGANISMO ATCC MEDIO CARACTERSTICA

E. coli 25922 McConkey Colonia rosada

S.typhimurium 14020 McConkey Colonia incolora

P. mirabilis 12453 McConkey Colonia incolora

E. faecalis 29212 McConkey No crece

St. Pyogenes 19615 Agar sangre -hemlisis

St. pneumonia 6305 Agar sangre alfa-hemlisis

S. epidermidis 12228 Agar sangre no hemoltico

Candida albicans 60193 Agar sangre no hemoltica

Candida albicans 60193 Tubos germinales Positivo

Candida tropicalis 66029 Tubos germinales Negativo

S. aureus 25922 Manitol sal Colonia amarilla

S. epidermidis 12228 Manitol sal Colonia incolora

P. mirabilis12453 Manitol sal No crece

M. tuberculosis (TBC) 2577 Low-Jensen Crece. Incoloro

M. kansassi ( I ) 12478 Low-Jensen Crece. Amarillo + luz

M. scrofulaceum (II ) 19981 Low-Jensen Crece. Amarillo luz

intracellulare ( III ) 13950 Low-Jensen Crece. Incoloro

M. fortuitum ( IV ) 6841 Low- Jensen Crece. < 7 das.

E. coli 25922 Low-Jensen No crece

LISTADO DE CEPAS ATCC SUGERIDAS PARA CONTROL DE CALIDAD

MICROORGANISMO

Campylobacter jejuni ATCC 33290 Staphylococcus aureus ATCC 25923

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Staphylococcus aureus ATCC 29213

Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

Escherichia coli ATCC 35218 Steptococcus pyogenes ATCC 19615

Proteus vulgaris ATCC 8482 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305

Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Streptococcus faecalis ATCC 19433

Shigella sonnei ATCC 9290 Clostridium sporogenes ATCC 19404

Shigella sonnei ATCC 25911 Clostridium tertium ATCC 19405

Shigella flexnerii ATCC 12022 Clostridium novyi A ATCC 19402

Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Clostridium perfringes ATCC 3624

Haemophilus influenzae ATCC 49247 Fusobacterium nucleatum ATCC 25586

Haemophilus influenzae ATCC 49766 Bacteroides fragilis ATCC 23745

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Fusobacterium necrophorum ATCC 25286

Escherichia coli 0157:H7 ATCC 43894

4. CONTROL DE CALIDAD EXTERNO: Es recomendable que los laboratorios de microbiologa puedan participar en programas de evaluacin externa. Estos programas miden la capacidad del laboratorio para evaluar un desconocido y llegar a un resultado seguro. Los mismos consisten en la identificacin de muestras o microorganismos desconocidos en los cuales se debe informar del resultado de la identificacin, pruebas utilizadas para el diagnstico etiolgico y sensibilidad a los antibiticos. El Director del laboratorio debe escoger el programa que sea consistente con el nivel de calidad de su laboratorio. Generalmente estos desconocidos vienen con un abstracto clnico y son recibidos al menos 2 veces al ao. Los laboratorios que ofrecen stos programas invalidan aquellos laboratorios que fallan en responder el cuestionario, por lo que es necesario mantener un contacto muy especial para no perder ste beneficio. Los resultados de la evaluacin de los desconocidos deben ser discutidos por todo el personal antes de su informe al laboratorio generador del programa. 5. CERTIFICACIN DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA: Un nuevo concepto en la organizacin de los laboratorios es la acreditacin a Asociaciones especializadas que promueven la excelencia en la calidad de los servicios de sus miembros. Esta calidad est enfocada no solo en los aspectos tcnicos, sino tambin en los administrativos, racionalizacin de recursos, planificacin gerencial, costos de operaciones, calidad de servicio al cliente, es decir, un enfoque de Calidad Total. En Latinoamrica algunas asociaciones de laboratorios han creado comits de acreditacin para laboratorios pblicos y privados. El enfoque moderno en un mundo en que las distancias se han acortado y los conceptos de globalizacin son una realidad, la acreditacin proporciona a los miembros la posibilidad de comunicarse mejor con otros laboratorios del mundo, lo cual permite un intercambio de experiencias en metodologas, compra de equipos, entrenamiento de personal, etc

Los problemas legales y altos costos de operaciones, han obligado a los grandes laboratorios a encontrar un modelo an ms complejo de aseguramiento de la calidad, con el fin entre otros, de bajar costos. La Organizacin Internacional de Estndares ha desarrollado una gua llamada ISO 9000 que establece un flujograma de trabajo en los programas de aseguramiento de la calidad y unifica los diferentes actividades del control de calidad. La categora apropiada para los laboratorios clnicos en general es el ISO 9002 el cual comprende 18 elementos de control. Para que un laboratorio pueda ser certificado bajo la norma ISO, debe cumplir con todos los elementos del estndar. En stos casos un equipo de Aseguramiento de la Calidad implementa las medidas en cada una de las rea con el fin de que cuando se est listo, pueda pasar las pruebas a que es sometido todo el sistema por parte de auditores certificados. La obtencin de sta certificacin ISO 9002 es el mximo galardn a la excelencia en control de calidad en los laboratorios clnicos. BIBLIOGRAFA Koneman, Diagnstico Microbiolgico, 6 ta edicin 2006. Perea, enfermedades infecciosas y Microbiologa Clnica. http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/ http://www.monografias.com/trabajos/mmbiologia/mmbiologia.shtml

ACTIVIDADESA DESARROLLAR EN EL LABORATORIO SEMANA DEL 5 AL 7 DE AGOSTO 2014 1. Los alumnos evaluarn la eficiencia de los medios de cultivo preparados (mnimo 2)

MEDIO DE CULTIVO ORGANISMO CONTROL REACCION ESPERADA

TSI E. coli cido/cido

TSI Shigella flexnerii alcalino/cido

TSI Pseudomona aeruginosa alcalino/alcalino

MIO Proteus mirabilis movilidad positiva

MIO K. pneumoniae movilidad negativa

Agar sangre Estr.Beta-hem. Crece. Betahemlisis.

Agar sangre Streptococcus gama- hem Crece. Alfahemlisis.

Agar sangre K.pneumoniae Crece. No hemoltico.

McConkey E. coli Crece. Colonias moradas.

McConkey Proteus sp Crece. Colonias claras.

McConkey Estafilococos No crece.

OF medio E. coli Amarillo ambos tubos. ferrmentador

OF medio Pseudomona sp Un tubo amarillo. Oxidativo

Lysina decarboxylasa Proteus vulgaris Rojo/cido H2S -

Lysina decarboxylasa Salmonella spp. Alcalino/alcalino H2S +

Bili-Esculina Streptococcus mitis Incoloro

Bili-Esculina Enterococcus faecalis Negro

Sabouraud-Dextrosa agar Levaduras Crece

Sabouraud-Dextrosa agar Estafilococos Crece

Caldo Cerebro-Corazn Flora mixta Crece

Tioglicolato Flora mixta Crece

2. Los alumnos evaluarn la eficiencia de los reactivos (mnimo 2)

REACTIVO MICROORGANISMO REACCION ESPERADA

Coagulasa Cepa ATCC 25923 Cogulo. Coagulasa positiva

Coagulasa Stafilococcus epidermidis Inerte. Coagulasa negativa

Oxidasa Pseudomona aeruginosa Negro. Oxidasa positiva

Oxidasa E. coli Inerte. Oxidasa negativa

Catalasa Staphylococcus sp Burbujas. Catalasa positiva

Catalasa Streptococcus sp Inerte . Catalasa negativa

Kovacs E. coli Anillo rojo. Indol positivo

Kovacs S.pneumoniae Incoloro. Indol negativo

Cloruro frrico Proteus sp Verde. Fenilalanina positivo

Cloruro frrico E. coli Incoloro.Fenilalanina negativo

Sobres de Anaerobiosis Bacteroides sp Crecimiento en Anaerobiosis

Suero para tubos germinales Candida albicans Tubos germinales positivo

3. Los alumnos evaluarn los tintes (mnimo 2)

Gram Staphylococcus sp Morado. Gram-Positivo.

Gram E. coli Rosado. Gram-Negativo.

Gram Mezcla de ambos Mezcla de ambas colores.

Verde malaquita Clostridium sp Espora de color verde. Resto de la clula rosada.

Verde malaquita E. coli Clula completa rosada.

4. Los alumnos evaluarn los antisueros para Streptococcus spp. Aglutinarn Streptococcus grupo A y Grupo B. 5. Los alumnos evaluarn un antibiograma