práctica nro 5 diagnóstico de las micosis sistemicas
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PRÁCTICA NRO 5: DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS
OBJETIVOS:
Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:
Establecer las diferencias macroscópicas y microscópicas de los
diferentes agentes de micosis sistémicas.
Interpretar las pruebas inmunológicas empleadas para el diagnóstico
de las micosis sistémicas.
HISTOPLASMOSIS:
Producida por el hongo dimórfico Histoplasma capsulatum, con sus dosvariedades: H. capsulatum var. capsulatum e H. capsulatum var. duboisii . La
primera produce micosis sistémica en el hombre y animales, es endémica en
Ámerica del Norte, Central y del Sur; mientras que la variedad duboisii está
limitada a África Central.
H. capsulatum var capsulatum habita en suelos con alto contenido de
nitrógeno, asociado con excremento de pájaros y murciélagos, penetra al
organismo por vía inhalatoria. La primoinfección es pulmonar pudiendo ser:
asintomática o subclínica y la asintomática que se subdivide en: pulmonar aguda,
pulmonar crónica y diseminada, en pacientes inmunocomprometidos.
Diagnóstico:
Muestra: Dependerá de la forma clínica que presente el paciente. Esputo,
lavado broncoalveolar, médula ósea, sangre, biopsias, exudados de lesiones
mucosas y cutáneas, material de ganglios linfáticos, LCR y otros líquidoscorporales.
Examen directo:
Extendidos coloreados con Giemsa o Wright.
Coloraciones histológicas (HE, PAS, plata-metnamina).
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Calcofluor.
Por ser las levaduras de H. capsulatum muy pequeñas no pueden ser
reconocidas en fresco o con KOH.
Al examen directo se observan blastoconidias ovaladas de 2-3 m,
intracelulares, generalmente con una sola gema (Figura 28); por efecto de algunas
coloraciones ocurre una retracción de la membrana citoplasmática que le da
apariencia de una cápsula. En los pacientes con SIDA, las blastoconidias pueden
observarse extracelularmente debido a la multiplicación intracitoplasmática
excesiva, causando la destrucción del fagocito.
En los cortes histológicos, la pared del hongo se tiñe débilmente con HE
pero se destaca con PAS y plata metenamina (Figura 29). Se observan
blastoconidias intracelulares y otras libres por la ruptura del fagocito, rodeadas por
una reacción granulomatosa, con predominio de células epitelioides y gigantes.
Cult ivo:
Se realiza sobre agar sangre, Sabouraud o extracto de levadura. Para verificar
el dimorfismo de H. capsulatum, el cultivo se incuba tanto a temperatura ambiente
Figura 28: Blastoconidias (B) de Histoplasmacapsulatum en el interior de una célulafagocitica (F). Observe el núcleo del fagocito(NF). Extendido coloreado con Giemsa.
www.scielo.org.ar/.../abcl/v39n4/4a09f2.jpg
Figura 29: Blastoconidias (B) de Histoplasmacapsulatum. Coloración histológica Plata-metenamina.pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-
6.htm
http://pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-6.htmhttp://pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-6.htmhttp://pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-6.htmhttp://pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-6.htm
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como a 37 ºC. La identificación del H. capsulatum se hace en su fase micelial
(temperatura ambiente), formando colonias blancas y algodonosas en los medios
de cultivo. En el microcultivo se observan hifas tabicadas, microconidias y
macroconidias tuberculadas, que identifican el agente etiológico. (Figura 30)
El cultivo es el método más específico para establecer definitivamente el
diagnóstico. Sin embargo tiene poca sensibilidad en la mayoría de las formas
clínicas de histoplasmosis y tarda entre 1 y 5 semanas por lo que se hace
necesario la implementación de otras pruebas diagnósticas como lo son las
inmunológicas.
Estudio Inmuno lógico
Inmunidad celular: se estudia con la aplicación, por vía intradérmica, de 0,1
c.c. de histoplasmina, en la cara anterior del antebrazo. La lectura se realiza a las
48 horas, siendo positiva con la presencia de una induración igual ó mayor de 5
mm de diámetro. La IDR con la histoplasmina es de poco valor diagnóstico, sólo
indica contacto con el hongo.
DIBUJO
Figura 30: Macroconidias tuberculadas (M) ymicroconidias (m) de Histoplasma capsulatum.Observadas en cultivo en lámina, coloreadas con azulde lactofenol. http://alsubs.blogspot.com/
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Inmunidad humoral: Se pueden determinar tanto anticuerpos como
antígenos circulantes. La técnica más usada es la IDD donde pueden ser
observadas dos bandas de identidad, una banda “M” y una “H”. La banda M es la
que se encuentra con mayor frecuencia y es evidencia presuntiva de infecciones
iniciales o de infección pasada (esta banda persiste rara vez después de 3 a 6
meses de la recuperación clínica del paciente). La banda “H” aparece con menor
frecuencia que la “M”, usualmente indica la presencia de una enfermedad clínica
activa, sin embargo su ausencia no excluye la histoplasmosis activa. Esta banda
tiende a desaparecer con la curación del foco infeccioso.
PARACOCCIDIOIDOMICOSIS:
Es causada por el hongo dimórfico Paraccocidioides brasiliensis, constituye
una de las micosis sistémicas más importante de la América Latina. Hasta la fecha
se desconoce el hábitat del hongo, sólo ha sido aislado de tierras en contadas
ocasiones y en forma ocasional ha sido asilado de alimentos para perros y deheces de pingüinos; sin embargo el consenso general señala el suelo de áreas
endémicas como el nicho ecológico.
Afecta principalmente a hombres adultos entre 30 y 60 años de edad,
trabajadores de la tierra, que se infectan por vía inhalatoria, por lo que la
BANDA “H”
BANDA
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primoinfección ocurre en los pulmones, desde donde se disemina a otros órganos.
La menor frecuencia de casos en mujeres parece estar relacionada con factores
hormonales.
Se describen las siguientes formas clínicas:
Infección subclínica asintomática.
Enfermedad, se subdivide en:
Juvenil
Crónica del adulto (Figura 31)
Residual
DIAGNÓSTICO
Muestra: dependerá de la forma clínica que presente.
Esputo o lavado broncoalveolar
Exudado de ulceras en mucosas y el piel
Material purulento de nódulos linfáticos
Biopsias
Figura : Forma crónica del adulto. Lesiones (L) enpaladar ocasionadas por P. brasiliensis. Foto cortesíaProfa. Leyla Humbría.
L
L
Figura 31: Forma crónica del adulto. Lesiones (L) en paladarblando ocasionadas por P. brasiliensis. Foto cortesía Profa.Leyla Humbría.
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Orina
LCR y otros líquidos corporales.
Examen directo:
En fresco, entre lamina y laminilla
KOH al 10% con o sin tinta
Negro de clorazol
Calcofluor
Coloraciones histológicas (PAS, HE, plata-metenamina)
Se observan blastoconidias de diferentes tamaños, entre 3-40 µm de diámetro,
redondeadas, de pared gruesa y refringente, con inclusiones citoplasmáticas.
Característicamente se observan células multigemantes, llamadas de timón de
barco, unidas entre sí directamente o a través de un pequeño puente
citoplasmático. Además de las formas multigemantes, es posible ver cadenas de
blastoconidias o células con gemación única o solitarias (Figura 32).
Figura : Levadura (L) multigemante de P. brasiliensis observada en examen directo con KOH al 10%. Fotocortesía Profa. Leyla Humbría.
L DIBUJO
Figura 32: Levadura (L) multigemante de P.brasiliensis observada en examen directocon KOH al 10%. Foto cortesia Profa. LeylaHumbría.
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En las biopsias, la observación del hongo es más fácil con la coloración de
plata-metenamina y PAS que con HE (tiñe mal la pared del hongo). Se observan
una respuesta tisular mixta, característica de una micosis crónica, con formación
de microabcesos y granulomas. El hongo suele encontrarse asociado con las
células gigantes multinucleadas del granuloma, donde exhibe sus características
descritas anteriormente, excepto las inclusiones intracitoplasmáticas y la
refringencia de la pared.
Cult ivo:
Se realiza en agar Sabouraud adicionado o no de antibióticos y
cicloheximida. Se incuba a temperatura ambiente y a 37 ºC para demostrar su
dimorfismo. P. brasiliensis es de crecimiento lento.
A temperatura ambiente, en el anverso, crece como un moho de color
blanco o crema y en el reverso de la colonia muestra un color marrón claro. Al
microscopio, en un cultivo en lámina, se observan hifas delgadas con artroconidias
y clamidosporas intercalares y terminales. Este tipo de crecimiento es de escaso
valor diagnóstico.
A 37 ºC se forman colonias blanquecinas, de aspecto cerebriforme, que al
ser observadas al microscopio demuestran la presencia de levaduras
multigemantes que permiten la identificación definitiva del hongo (Figura 33).
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Estudio inm unológico
Inmunidad celular: se estudia con la aplicación de 0,1 c.c. de
paraccoccidioidina, vía intradérmica en la cara anterior del antebrazo. Se aplican
simultáneamente un antígeno control (PPD) y la histoplasmina, para evaluar
posibles reacciones cruzadas. La lectura se realiza a las 48 horas, considerándose
positiva una induración igual ó mayor de 5 mm de diámetro (Figura 34).
Figura : Cultivo levaduriforme deP. brasiliensis
. Agar Sabouraud.Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.
P
Figura 33: Cultivo levaduriforme de P. brasiliensis. Agar Sabouraud.Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.
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La IDR con paraccoccidioidina carece de valor diagnóstico, sólo indica
contacto previo con el hongo. Esta prueba se hace negativa en estados anérgicos,
de pronóstico reservado, por lo que su aplicación se recomienda cuando se desee
evaluar las condiciones inmunológicas del paciente, para hacer seguimiento
después del tratamiento y para estudios epidemiológicos.
Inmunidad humoral:
En los casos de paracoccidioidomicosis pulmonar crónica unifocal, en los
cuales se hace difícil una toma de muestra clínica representativa que facilite la
observación del hongo con un examen directo, la IDD es recomendada por su
simplicidad y efectividad diagnóstica. Esta prueba detecta anticuerpos de tipo IgGen un 93% de los casos activos y puede utilizarse de forma cuantitativa para
determinar aumento o disminución de anticuerpos circulantes durante el
seguimiento de tratamiento del paciente.
Figura : Resultados de la aplicación de la pruebaintradérmica con histoplamina (H) y paracoccidioidina(P). Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.
H P
Figura 34: Resultados de la aplicación de la prueba intradérmicacon histoplasmina (H) y paracoccidioidina (P). Foto cortesíaProfa. Leyla Humbría
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dimórficos pertenecientes al género Coccidioides: Coccidioides immitis conocido
como la especie Californiana, y la recién nombrada especie no Californiana,
Coccidioides posadasii. La fase saprofítica de estos microorganismos se
desarrolla en la tierra de áreas endémicas; parte del suroeste de los Estados
Unidos, México, Centro y Suramérica; y la infección en humanos, así como en
varias especies de animales, se adquiere principalmente por vía inhalatoria.
En Venezuela, las áreas endémicas de esta micosis se localizan en la
región noroccidental, en las zonas áridas y semiáridas de los estados Falcón, Lara
y Zulia.
Se considera como principal mecanismo de infección la inhalación de lasartroconidias presentes en el suelo, las cuales se desprenden al moverse la tierra
seca, o bien, se desplazan con las corrientes de aire. La infección depende de la
exposición al hongo en un área endémica; afecta a cualquier edad o sexo y es
más frecuente en campesinos, soldados, arqueólogos, entre otros. Los casos se
pueden incrementar después de temblores de tierra, épocas de sequías, así como
cambios en el suelo (altas concentraciones de sales eliminan flora microbiana
competitiva), migraciones de individuos susceptibles y la humedad relativa del
suelo y aire.
Coccidioides posadasii e immitis producen un espectro amplio de
manifestaciones clínico-patológicas que van desde una infección asintomática a
una enfermedad pulmonar primaria, enfermedad cutánea primaria, enfermedad
pulmonar progresiva y la diseminación extrapulmonar que puede ser aguda,
crónica, o progresiva (Figura 36). La severidad de la infección va a depender delos mecanismos de defensa del huésped, tamaño del inóculo y, posiblemente, de
factores específicos de la virulencia o de resistencia del hongo.
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DIAGNÓSTICO
Muestra:
Esputo Lavado bronquioalveolar
Exudados de lesiones en mucosas y piel
Biopsias
Material purulento
Sangre
Médula ósea
LCR y otros líquidos corporales.
Examen directo:
En fresco entre lamina y laminilla
KOH al 10-20%, con o sin tinta
Coloraciones histológicas (PAS, HE, Plata-metenamina)
Figura : Lesión en nariz de un paciente concoccidioidomicosis diseminada. Foto cortesía Profa.Dilia Martinez.
Figura 36: Lesión en nariz de un paciente concoccidioidomicosis diseminada. Foto cortesía Profa. DiliaMartinez.
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Calcofluor.
Se observan esférulas de 10 a 80 µm, con pared doble y refráctil y endosporas
de 2 a 5 µm (Figura 37).
Cult ivo:
El método definitivo para confirmar el diagnóstico de CDM es el aislamiento
del hongo a partir del espécimen clínico. Coccidioides spp crece fácilmente en la
mayoría de los medios de cultivo utilizados en los laboratorios clínicos. En medio
Sabouraud con o sin antibiótico, a temperatura ambiente, al tercer día se observan
colonias glabra, después vellosas y luego francamente algodonosas, de color
blanco grisáceo o amarillento (Figura 38). Microscópicamente se observan hifas
delgadas y septadas con artrosporas o artroconidias rectangulares de 2 por 4 ó 3
por 6 µm (Figura 39). La forma micelial de Coccidioides spp representa un alto
riesgo de infección al personal del laboratorio debido a que es altamente
Figura : Examen directo con KOH% de muestra clinica proveniente de lesión en nariz.Se observan esférulas (E) rotas y completas, con endosporas (e) en su interior y
libres. Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.
E
e
E
E
e
e
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Figura 37: Examen directo con KOH al 20% de muestra clínica proveniente de lesión en nariz deun paciente con coccidiodomicosis diseminada. Se observan esférulas (E) rotas y completas,con endosporas (e) en su interior y libres. Foto cortesía Profa. Leyla Humbria.
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contagiosa, por lo que los cultivos deben ser manipulados únicamente dentro de
campanas de bioseguridad clase II.
Estudio inmunológico:
Inmunidad celular: Se realiza la IDR utilizando antígenos fúngicos, que en el
caso de coccidioidomicosis, pueden ser de dos tipos: la coccidioidina, obtenida de
la fase micelial o saprófita y la esferulina, constituida por la pared de las esférulas.
Figura : Cultivo micelial (temperatura ambiente) en tubo de Coccidioides posadasii . Se observa una colonia de color blanco, algosonosas. Fotocortesía Profa. Leyla Humbría.
Figura 39. Artroconidias de Coccidioides immitis de uncultivo en forma micelial (preparación con azul deLactofenol). Fragmentación del micelio (M) en esporas(artroconidias) rectangulares. Preparación con Azul deLactofenol, 1200 X. tomado de: Restrepo M., A. Rev. Acad.Colomb. Cienc. 2006; 30 (116):367-386.
Figura 38: Cultivo micelial (temperatura ambiente) en tubo de Coccidioides immitis o posadasii . Se observa una colonia de color blanco, algodonosa. Foto cortesia Profa.Leyla Humbría.
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El antígeno se inyecta en volumen de 0,1 c.c., por vía intradérmica, en la cara
anterior del antebrazo y la reacción se observa a las 48 horas. Se considera
positiva si se obtiene una induración igual ó mayor de 5 mm. de diámetro. Debido
a que los preparados antigénicos contienen antígenos específicos y antígenos
comunes a otros hongos, se pueden observar reacciones positivas en pacientes
con histoplasmosis y paracoccidioidomicosis.
La IDR se utiliza básicamente en estudios epidemiológicos para investigar
la existencia de infección subclínica en una población y rara vez como orientación
diagnóstica, ya que una reacción positiva de 5 mm o más significa que la
respuesta inmunitaria del paciente está intacta y sólo señala exposición al agente.
Por el contrario, una reacción negativa no necesariamente excluye infección y sepuede observar en pacientes con CDM diseminada, lo que indica un estado de
anergia de la respuesta inmunitaria celular. La IDR se considera una prueba
auxiliar en el diagnóstico, pronóstico y valoración del estado inmunitario del
paciente con CDM. Es positiva 2 a 3 semanas después del inicio de los síntomas y
puede persistir durante años. En pacientes sintomáticos la positividad a la IDR se
considera de buen pronóstico; mientras que su negatividad se traduce en una
inadecuada respuesta celular, anergia y por lo tanto, mal pronóstico.
Inmunidad humoral: Consiste en la detección de anticuerpos específicos
contra Coccidioides immitis o posadasii en suero o LCR (en sospecha de
meningitis). Su presencia confirma el diagnóstico, siempre y cuando los resultados
obtenidos se correlacionen con los aspectos epidemiológicos, clínicos e
histopatológicos del paciente.
La técnica más usada es la IDD, en donde se detectan la formación de
varias bandas, especialmente la “F” establece el diagnóstico en un 93% de los
pacientes con formas activas. Una banda específica entre la muestra del paciente
y el pozo de antígeno para Coccidioides spp.es evidencia presuntiva de
coccidioidomicosis activa o reciente. Algunos individuos continúan la producción
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de anticuerpos detectables por periodos significativos (más de 1 año) después de
la recuperación clínica de la enfermedad activa. Una prueba negativa no excluye
la enfermedad. Existen reacciones cruzadas con H. capsulatum y P. brasiliensis,
pero a títulos menores que los exhibidos con los antígenos homólogos.
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