UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

MICROBIOLOGIA GENERAL II

METODOS DEESTUDIO Y DIAGNOSTICO VIRAL

ALUMNOS:ALDANA PEREZ LUCÍAHERNANDEZ BARRIENTOS FERNANDOMARTÍNEZ DÍAZ JOSÉ MANUEL GRUPO: 2752 SEMESTRE 2010-2

Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en:

DIRECTOS INDIRECTOS

Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnostico clínico se basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.).

INTRODUCCIÓN

Un elemento crucial para el diagnostico de un virus, cualquiera que sea el método empleado, es la toma y procesamiento de una muestra.

RECOLECCIÓN, TRANSPORTE Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Las mejores muestras por lo general son las que se obtienen en un estudio temprano de la enfermedad (dentro de las primeras 72hrs.), cuando el virus se excreta en concentraciones relativamente elevadas.

Las muestras pueden obtenerse a partir de:

Hisopados

ConjuntivalesGenitalesRéctalesMucosa oralLesiones cutáneas

Sangre Aspirado nasofaríngeoLavado bronquioalveolarExpectoración Orina Liquido cefalorraquídeo Materia fecalBiopsias

Los virus deben ser transportados en un medio de transporte que les provea estabilidad. Esto se obtiene agregando proteínas como puede ser la albúmina de bovino o gelatina.

Con el agregado de antibióticos y antifúngicos para prevenir el desarrollo de la flora bacteriana o fúngica. Además deben transportarse a 4°C , en recipientes estériles con tapa hermética.

Para virus de alta transmisibilidad como el de la Hepatitis B o el VIH , deberá colocarse el recipiente que contiene la muestra dentro de un contenedor metálico con tapa de rosca y rotularse como peligro biológico.

Son aquellos que detectan:

1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral).

2. La presencia de antígenos virales (técnicas inmunológicas): inmunofluorescencia (IF), enzimoinmunoanálisis (EIA), test de aglutinación.

3. La presencia de ácidos nucleicos virales (PCR, etc.).

4. El virus como partícula viral (microscopia electrónica).

PRINCIPALES TÉCNICAS. METODOS DIRECTOS

Desventajas oProceso lento, ya que demanda de días a semanas para la identificación. oProceso laborioso y caro. oRequiere el uso de sistemas de cultivo adecuados; ya que se necesitan varias líneas celulares para la detección optima del virus.

Los cultivos celulares son, pues, los biosustratos más corrientemente empleados para la propagación de los virus. Son obtenidos de órganos o de embriones de animales.

Aislamiento viral-cultivos celulares

Estas células obtenidas asépticamente se disocian tratándolas con una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspensión de células libres se colocan en la superficie plana de un recipiente de vidrio o plástico en donde las células se adhieren y multiplican formando una fina capa de células llamada monocapa celular.

Estas crecen en un medio de cultivo complejo que contiene albúmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer. Adicionándole también antibióticos adecuados para prevenir contaminación bacteriana.

Los cultivos celulares se dividen en:

Cultivos primarios Líneas celulares diploides Líneas celulares continuas Hemadsorción Hemaglutinación

DETECCION DE ANTÍGENOS

Son técnicas inmunológicas Se utilizan anticuerpos específicos

antivirales (IgG) Se marca la fracción Fc con una molécula

de isocianato de fluosceína, un isotopo radiactivo 1251 o una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina)

Inmunofluorescencia Directa

Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar.

Luego se agregan anticuerpos específicos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los antígenos víricos en el interior de las células.

La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana.

Inmunofluorescencia Directa

Se utilizar para una identificación rápida del virus directamente sobre la muestra células eluidas de un lavado nasal, o de

un hisopado nasofaríngeo Los anticuerpos monoclonales conjugados

con isotiocianato de fluoresceína pueden utilizarse para identificar el virus Respiratorio Sinciciai (VRS), Influenza A y B. Parainfluenza 1,2 y 3 y Adenovirus entre otros.

Test de aglutinación

Es un método simple, de un solo paso

Primero se fijan los anticuerpos antivirales específicos sobre eritrocitos o partículas de látex

Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica en la cual se investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno adecuado se encuentra presente.

Test de aglutinación

Usado para detectar antígeno de Rotavirus en heces y antígenos de Adenovirus.

Es una técnica rápida y barata.

Radioimnunoesayo (RIA)

Fue originalmente aplicado para identificar el antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) y el anticuerpo anti-HBsAg

Ha sido reemplazado por el ensayo inmunoenzimatico por que tiene mayor tiempo de conservación de los reactivos, su costo relativamente más bajo y la ausencia de residuos radioactivos

Enzimoinmunoanalisis (EIA)

Se basan habitualmente en la captura del antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida.

El antigeno viral se detecta mediante la adición de otro anticuerpo especifico conjugado con una enzima (peroxidasa o fosfatasa)

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Sondas de ácidos nucleicos: Se extraer secuencias específicas de un

fragmento de ADN por medio de las endonucleasas de restricción, se desnaturalizar y marcar, ya sea con una enzima o con un isótopo radioactivo.

Citomegalovirus, Papilomavirus y Epstein-Barr virus han sido identificados usando sondas de ácidos nucleicos.

Determinación de ácidos nucleicos virales por sonda sintética

Es un ensayo de hibridación molecular con sonda marcada, las hibridaciones pueden ser DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA

Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los ácidos nucleicos.

Posteriormente se añade un DNA marcado, complementario del DNA del virus y se incuba en condiciones para que se produzca la hibridación.

Determinación de ácidos nucleicos virales por sonda sintética

La muestra se pasa entonces por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada.

Dependiendo de como este marcada la sonda, se detecta la hibridación: Si está marcada con un isótopo radiactivo

se puede hacer una lectura en un contador gamma.

Si esta marcada con una enzima se detecta por una simple evaluación colorimétrica.

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

Nos permite obtener resultados positivos rápidos de muestras de materias fecales de pacientes con diarrea (Rotavirus, Adenovirus, Coronavirus y Calcivirus)

También en otras muestras, como líquido vesicular, biopsia de tejidos, verrugas, orina o suero es posible obtener resultados positivos, mediante coloración negativa.

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

Es posible observar la morfología de los viriones presentes en muestras clínicas

La limitación del método además del costo del microscopio, es que necesita de una alta concentración de viriones

METODOS INDIRECTOS

ENZIMOINMUNOANALISIS INDIRECTO (EIA) Versátil Relativamente económico Sencible Lectura objetiva (con instrumentos)

Enzimoinmunoanálisis Indirecto (EIA)

1) Los antígenos virales se inmovilizan sobre una fase sólida (policubetas),

2) Se agregan los sueros en estudio, 3) Se incuban, se lavan y 4) Se revela la reacción Ag-Ac por el

agregado de una Ig antiespecie conjugada con una enzima seguida de un sustrato apropiado para esta.

5) Se lee con un espectrofotometro

ELISA Permite identificar inmunocomplejos por

medio de enzimas unidas al antígeno o anticuerpo, estando uno de ellos adsorbido a un soporte sólido (placa de poliestireno). La reacción antígeno-anticuerpo se detecta mediante la utilización de un marcador que es una enzima conjugada químicamente al antígeno o anticuerpo (peroxidasa, fosfatasa), se añade un sustrato al cuál la enzima convierte de incoloro a un producto coloreado.

Inmunofluorescencia

Es una técnica histoquímica o citoquímica, útil para detectar y localizar antígenos en células o tejidos. Se utiliza un anticuerpo específico conjugado con un compuesto fluorescente dando como resultado un marcador sensible contra el antígeno.

Virus de la influenza

La presencia de anticuerpos en el citoplasma y superficie de las células infectadas

Inmunofluorescencia Indirecta

Se basa en la unión de anticuerpos a los antígenos virales expresados en la superficie y el citoplasma de células infectadas (fijadas en un portaobjetos). Útil para la determinación de anticuerpos antivirales en el suero del paciente. Se incuba el suero del paciente con las células infectadas y se agrega un anticuerpo anti-IgG humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

INMUNOFLORESCENCIA INDIRECTA

IFI: FLAVIVIRUS

IFI POSITIVA IFI NEGATIVA

Aglutinación en látex

La aglutinación de las partículas de látex recubiertas por un Ag específico permite la detección de Anticuerpos libres específicos para el Ag

Se basa en las interacciones Ag-Ac, donde la cantidad y especificidad de la reacción se evalúa por los cambios físicos inducidos tras la unión del anticuerpo específico con su antígeno correspondiente para formar inmunocomplejos.

TEST DE AGLUTINACIÓN

Western Blot (WB)

Con el uso combinado de electroforésis y ELISA puede determinarse la respuesta a una diversidad de proteínas específicas a patógenos.

Este procedimiento proporciona un medio específico para identificar reactividad de anticuerpos.

Western Blot (WB)

Se basa en la separación de los antígenos virales mediante una electroforesis en gel de SDS-PAGE (lo cual proporciona una carga negativa a la proteínas).

Las proteínas virales son sometidas a una electroforesis en geles de poliacrilamida. Como las proteínas están cargadas negativamente se separan con base a su peso molecular (las más grandes permanecen en la parte superior del gel y las menores migran hacia la base).

Western Blot (WB) Las proteínas se transfieren a un soporte

sólido (papel de nitrocelulosa, nylon), lo cual da una copia exacta del patrón del gel en la matriz.

La identificación de las proteínas a estudiar se realiza usando un ELISA indirecto. Las reacciones se leen como positivas cuando una línea de precipitación o color se forma en el peso molecular correcto para una proteína particular.

PRODUCCION DE ANTICUERPOS IN VITRO Revela la presencia de anticuerpos

antivirales producidos in vitro a partir de los linfocitos B extraídos de sangre total, lo que indicaria que el sistema inmune del paciente ha sido estimulado por el virus.

ELECCIÓN DE UNA PRUEBA DIAGNOSTICA 1) SENSIBILIDAD proporción de

personas con la infección que reaccionaron positivamente en la prueba diagnostica realizada.

2) VALOR PREDICTIVO Es la probabilidad de tener la enfermedad dado el resultado del test

3) ESPECIFICIDAD Es la proporcion de personas sin la infección o enfermedad que reaccionan como negativos

REFERENCIAS 1. Brock, D. Clínica y Diagnóstico

Microbiológico. Biología de Microorganismos. Prentice Hall, 1988. New Jersey. 13: 488-489.

2. Carballal, G.; Oubiña, J. Diagnóstico Virológico. Virología Médica. El Ateneo, 1994. Bs As, Argentina. 6: 73-100.

3. Chans, G. Aplicaciones de las Nuevas Técnicas de Biología Molecular al estudio de Bacterias y Virus. Etiopatogenia Microbiológica. Vol. 2. Librería Medica Editorial. 19:289-301.