UNIVERSIDAD NACIONAL AUNTONOMA DE MEXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS ZARAGOZAMICROBIOLOGÍA GENERAL II

Práctica 4

MICROCULTIVO

Equipo 9

Morales Cedillo Italia

Escobar Blanco Luis

Torres Cabrera Blanca Estela

1. El alumno entenderá que elmicrocultivo es una técnica eficazpara identificar y clasificar un hongofilamentoso.

2. El alumno al término de la prácticaserá capaz de realizar la técnica demicrocultivo.

MICROCULTIVO.

• Permite la observación de las estructurasmicroscópicas de hongos filamentosos que sedistinguen con facilidad sin distorsión,alteración o rompimiento de las mismas, estopasa cuando el hongo se desarrolladirectamente debajo del cubreobjetos.

• Forma parte de las pruebas para identificargénero y especie.

•Técnica de emparedado

•Técnica de gota pendiente

•Técnica de montaje húmedo

•Técnica de cinta adhesiva

•Técnica de Rivalier

Técnica de emparedado

• Con esta técnica se tienen dos planos de enfoque.

Método

• a) Sobre una caja de Petri con medio de cultivo, se deposita de 5 a 8 fragmentos del hongo por estudiar

• B) Se introducen en el agar de 4 a 6 cubreobjetos estériles de 22 * 22 mm en un ángulo aproximado de 45 °.

• c) Se cierra la caja y se incuba durante 7 a 15 días a 25°C

• d) Cuando el cultivo ha alcanzado su madurez se retira un cubreobjetos de la caja y se coloca sobre un portaobjetos, sobre el cual previamente se ha depositado una gota de azul de algodón.

• e) Se deposita una gota de azul de algodón sobre el cubreobjetos y se cubre con otro cubreobjetos de 24 * 40 mm.

• f) Se repite el procedimiento con los demás cubreobjetos contenidos en la caja de cultivo.

Técnica de gota pendiente

Es útil para seguir la evolución

completa de un hongo.

Se emplea para observar la germinación de las esporas

Método• 1) Se toma un anillo de vidrio de unos dos centímetros

de diámetro, con bordes bien pulidos, altura de 1 cm aproximadamente.

• 2) Se flamea el anillo y se toca uno de sus bordes con luten de R.de Noyer o parafina, haciéndole adherir a un portaobjeto esterilizado

• 3) Luego se introduce una gota de agua esterilizada en la cámara así formada. Con fin de conservar la humedad del cultivo.

• 4) Acto seguido se junta su otro borde con vaselina y se le pone encima el cubreobjeto, que lleva en su centro el medio de cultivo con el hongo en suspensión, Se puede usar en vez de este dispositivo un portaobjeto excavado.

Técnica de montaje húmedo

• Es un viejo método rápido para preparar colonias de hongos para examen microscópico.

Método1.- Con un aguja doblada se toma una pequeñaproporción de la colonia a estudiar incluyendo unapequeña proporción del agar subyacente.

2.- La muestra debe tomarse de un sitio intermedioentre el centro y la periferia de la colonia.

3.- Este pequeño fragmento de colonia y el agar desostén se transfieren a un portaobjetos el cual contieneuna gota de lactofenol azul de anilina y se cubre con uncubreobjetos.

4.- Se presiona la preparación con la goma de borrar deun lápiz

METODO VENTAJAS DESVENTAJAS

Montaje Húmedo •Preparación rápida

y fácil

•Es suficiente para

la identificación de

muchos hongos.

•Dificultad para

conservar la

continuidad entre las

esporas, estructuras

con frutos e hifas

debido al riguroso

tratamiento.

La solución de lactofenol azul sirve como tinción y además el fenol mata la porción de cultivo que se examina. Disminuyendo las posibilidades de infección en el laboratorio.

Técnica de cinta adhesiva o Scotch

Método que puede considerarse como el más simple, económico y adecuado para la identificación de hongos

VENTAJAS DESVENTAJAS

Cinta Scotch Es superior a los

montajes por

disección porque

se conserva la

yuxtaposición

original de

esporas y

segmentos de las

hifas.

Si la cinta no se

presiona bien

firmemente sobre la

superficie de la

colonia, la muestra

puede no ser la

adecuada.

Técnica de Rivalier

• Es una técnica de microcultivo que permite evidenciar de forma clara las estructuras morfológicas en su arreglo y disposición natural.

• Se realiza para la identificación de cultivos o bien, para preparar material de enseñanza

Método

• a) Sumergir un portaobjetos estéril en medio de cultivo a 56°C.

• b) Colocar el portaobjetos sobre un caballete en una caja de petri

• c) Inocular el centro del portaobjeto con el hongo a estudiar

• d) Depositar en la caja de Petri 10 ml de agua destilada estéril, sin mojar el cultivo

• e) Incubar a 25°C en la oscuridad

• f) Cuando el cultivo alcance su madurez, desprender el exceso de agar y secar en la estufa a 37 °C durante 24 horas

• g) Sumergir la preparación en colodión ligero.

• h) Escurrir el exceso de colodión y dejar secar durante 24 horas en posición horizontal

• Preparación del colodión

-Colodión oficial (sin aceite de ricino) 1ml

-Alcohol absoluto 2ml

-Éter sulfúrico 2ml

METODOLOGIA DEL MICROCULTIVO.

1. Colocar un trozo circular de papel filtrosobre el fondo de una caja de Petri estéril.Colocar un par de varillas de vidrio cortadasapropiadamente para que entren en la cajaencima del papel filtro, para sostener unportaobjetos.

2. Colocar un cilindro de agar de dextrosa papao agar Sabouraud sobre la superficie delportaobjetos.

3. Inocular los bordes del cilindro de agaren tres o cuatro lugares con una pequeñaporción de la colonia a estudiar, mediante unasa recta o la punta de una aguja dedisección.

4. Calentar un cubreobjeto con suavidad,pasándolo con rapidez por la llama de unmechero Bunsen y colocarlo de inmediatodirectamente sobre la superficie del cilindrode agar inoculado.

5. Colocar 5 mL dé glicerina-agua en la base dela caja Petri, suficiente para saturar el papel.Tapar la placa e incubar el conjunto atemperatura ambiente o a 30ºC, durante 3 a7 días.

6. Diariamente se debe revisar el crecimientodel hongo, para verificar si ya esta madura lacolonia. Si se decide que esta completa lamaduración del cultivo se le agrega de 1 a 3mL de formaldehído al 10% o fenol, 30 min.antes de la manipulación del microcultivo.

7. Una vez inactivadas las esporas, se retira consumo cuidado el cubreobjetos y se coloca enun portaobjetos que tiene una o dos gotasde azul de algodón de lactofenol. Se observaa seco débil y a seco fuerte.

8. Al portaobjetos se le quita el agar y sedeposita en un vaso con fenol al 10% alportaobjetos ya sin agar se le aplica una odos gotas de azul de algodón de lactofenol yse le coloca un cubreobjetos y se observa almicroscopio.

UTILIDAD DE LOS REACTIVOS.Agua-glicerina. Se utiliza para humectar lapreparación y así evitar la desecación.Formaldehído o fenol al 10%. Son agentesfungicidas que desnaturalizan sus proteínas,ocasionando daño a la membrana celular.Desventajas.No es idónea para un diagnostico rápido.

Ventajas.Permite observar las estructuras de los hongos

filamentosos en forma casi intacta.

Macroconidias y microconidias

TALOSPORAS

Artrosporas

Geotricum candidum.

Aleuriosporas

Trichophyton sp

BLASTOSPORAS

Clamidosporas

Aureobasidium sp.Hifas y clamidiosporas oscuras

(40x)

Candida albicans

• DICTIOSPORAS

Alternaria sp. Presencia de poroconidios o porosporas en

cadenas (40x)

Ulocladium sp. (40x)

Penicillum sp.

Genero Aspergillus

Aspergillus fumigatus

Aspergillus flavus

Aspergillus niger

Alternaria sp

Curvularia sp.

Curvularia lunata

Mucor sp.

Rhizopus sp.

Rhizopus sp.

Absidia sp.

Fusarium sp.

Genero Trichophyton

Trichophyton mentagrophytes

Genero Trichophyton

Trichopyton rubrum

Epidermophyton

Epidermophyton floccosum

BIBLIOGRAFIA.

• Bonifaz Alejandro, Micología Médica Básica,Méndez Editores, México, D.F., 1994

• Koneman R., Micología Prácticas delaboratorio, Editorial Panamericana, Argentina,1993.

• Arenas, Roberto. Micología Medica.Interamericana McGraw-Hill. México 1993.

• López Martínez Rubén, Micología Médica(Procedimientos para el Diagnostico de Laboratorio),Editorial Trillas, México, 2006