Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica

Diagnóstico

21.

Editores:

CoordinaAutores:

microbiológico de lasmicosis y estudios de

sensibilidad a losantifúngicos

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I

Emilia Cercenado y Rafael Cantón

dor: Ignacio Gadea GironésManuel Cuenca EstrellaIgnacio Gadea GironésEstrella Martín MazuelosJavier Pemán GarcíaJosé PontónJuan Luis Rodríguez Tudela

ISBN: 84-611-3540-7

II

INDICE DEL DOCUMENTO CIENTIFICO1. Introducción2. Consideraciones clínicas

2.1. Micosis superficiales y cutáneas2.2 Micosis subcutáneas2.3. Micosis tropicales endémicas2.4. Criptococosis2.5. Aspergilosis2.6. Candidosis2.7. Otras micosis oportunistas2.8. Estudios de sensibilidad

3. Recogida de la muestra4. Transporte5. Manejo6. Procesamiento de la muestra

6.1. Preparación de las muestras6.1.1. Tejidos6.1.2. Esputo y secreciones respiratorias6.1.3. Líquidos orgánicos (LCR, pleural, peritoneal, articular, etc.)6.1.4. Fragmentos ungueales6.1.5. Orina 6.1.6. Biopsias

6.2. Exámen directo6.1.1. Observación macroscópica6.2.2 Observación microscópica

7. Selección de medios y condiciones de incubación7.1. Clasificación7.2. Preparación7.3. Control de calidad7.4. Soporte7.5. Almacenamiento7.6. Elección de los medios de cultivo7.7. Incubación

8. Identificación8.1. Hongos filamentosos8.2. Levaduras

8.2.1. Identificación convencional8.2.2. Medios comerciales basados en la asimilación de nutrientes, en pruebas enzimáticas o

inmunológicas9. Informe de los resultados10. Estudios de sensibilidad

10.1. Recogida, transporte y conservación de la muestra10.2. Manejo de la muestra a su recepción en el laboratorio10.3. Procesamiento de la muestra10.4. Selección de medios y condiciones de incubación. Cultivos10.5. Criterios para la interpretación de los resultados10.6. Procedimientos adicionales a realizar en situaciones especiales10.7. Información de los resultados10.8. Métodos rápidos aceptados para la determinación de la sensibilidad a antifúngicos10.9. Procedimientos no aceptables

11. Métodos de diagnóstico rápido. Técnicas no convencionales11.1. Transporte, manejo y conservación de la muestra11.2. Criterios para interpretación de resultados11.3. Descripción de las diferentes indicaciones

11.3.1. Diagnósticos de la criptococosis11.3.2. Diagnósticos de la aspergilosis11.3.3. Diagnóstico de la candidosis

11.4. Detección de componentes no antigénicos11.5. Información de los resultados11.6. Procedimientos no aceptados

12. Bibliografia

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DOCUMENTOS TÉCNICOS

1. PNT-MIC-01. Exámen microscópico con hidróxido potásico2. PNT-MIC-02. Exámen microscópico con blanco de calcoflúor3. PNT-MIC-03. Exámen microscópico con tinta china4. PNT-MIC-04. Tinción argéntica rápida (Gomori-Grocott modificada)5. PNT-MIC-05. Diagnóstico micológico por cultivo convencional6. PNT-MIC-06. Identificación de levaduras mediante medios de cultivo cromogénicos7. PNT-MIC-07. Identificación de levaduras mediante sistemas enzimáticos8. PNT-MIC-08. Identificación de levaduras mediante asimilación de nutrientes. Métodos comerciales9. PNT-MIC-09. Identificación de levaduras mediante criterios inmunológicos10. PNT-MIC-10. Pruebas de diagnóstico rápido y no convencional de las micosis invasoras11. PNT-MIC-11. Pruebas de sensibilidad a los antifúngicos. Microdilución en caldo12. PNT-MIC-12. Pruebas de sensibilidad a los antifúngicos. Método de difusión en agar; E-test y difusión con

discos (fluconazol y voriconazol)

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Procedimientos en Microbiología ClínicaRecomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

21. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS MICOSIS Y ESTUDIOS DESENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS. 2006

Coordinador: Ignacio Gadea Gironés

Autores: Manuel Cuenca EstrellaIgnacio Gadea Gironés

Estrella Martín MazuelosJavier Pemán GarcíaJosé PontónJuan Luis Rodríguez Tudela

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1. INTRODUCCIÓNDurante las últimas décadas, el aumento en la

prevalencia de las infecciones fúngicas ha sidoconstante, relacionado fundamentalmente con elincremento de pacientes inmunocomprometidos ycon el uso generalizado de antimicrobianos, lautilización de inmunosupresores, maniobrasdiagnósticas invasoras y la implantación dealimentación parenteral.

Junto a estas micosis invasoras, que podríamosllamar oportunistas, coexisten otras micosis, quepodríamos considerar primarias, causadas porhongos muy adaptados para la supervivencia en lostejidos infectados. Algunas de ellas se comportancomo micosis profundas, y se caracterizan porque sedistribuyen en determinadas zonas geográficas,donde resultan endémicas. Otras, ubicuas, secaracterizan por afectar a piel y mucosas: se trata delas dermatomicosis y candidosis de las mucosas.Con menos frecuencia, se encuentran las micosissubcutáneas, caracterizadas por la agresividad localy poca tendencia a la diseminación a distancia, y quesuelen contar con antecedentes traumáticos quejustifican la inoculación del hongo.

El cultivo sigue siendo el “gold standard” deldiagnóstico microbiológico, ya que permite laidentificación del agente etiológico y la realizacióndel estudio de sensibilidad. Sin embargo, no estáexento de inconvenientes: la necesidad de obtenermuestras por métodos invasores, la posiblecontaminación de la muestra, su dificultad paradiferenciar fácilmente entre infección y colonización,la baja sensibilidad que presenta y su lentitud para eldiagnóstico.

En los últimos años se han desarrollado nuevastécnicas diagnósticas independientes del cultivo conla intención de mejorar la sensibilidad y reducir eltiempo necesario para realizar el diagnóstico. Lasprincipales técnicas podemos clasificarlas de lasiguiente manera: a) detección en sangre deantígenos y/o anticuerpos, y b) detección de otroscomponentes fúngicos. Algunas de estas técnicas sehan convertido en herramientas básicas en ellaboratorio de Microbiología Clínica para eldiagnóstico de las infecciones fúngicas invasoras,como la detección del antígeno capsular deCryptococcus neoformans, la detección de antígenogalactomanano en pacientes con aspergilosisinvasora, la detección de antígeno manano,anticuerpos anti-manano y anticuerpos anti-miceliopara el diagnóstico de la candidosis invasora, y porúltimo, la detección de otros componentes fúngicosno antigénicos, como el (1→3)-β-D-glucano, para ladetección de las infecciones fúngicas invasoras engeneral (excepto criptococosis y mucormicosis).Junto a estos métodos rápidos, que podríamosdenominar no convencionales, coexisten métodosclásicos que permiten el diagnóstico rápido, enocasiones permitiendo la diferenciación entrecolonización e infección, si bien con bajasensibilidad. Nos referimos a los distintos métodosde tinción, incluyendo las preparaciones histológicas.

En la última década se han desarrollado variosmétodos para realizar pruebas de sensibilidad in vitroa los antifúngicos. Estas técnicas han mostrado unabuena reproducibilidad inter-laboratorio y ciertacapacidad para detectar la resistencia in vitro a estosfármacos, por lo que la mayoría de los expertoscreen que las pruebas de sensibilidad a losantifúngicos tienen utilidad clínica. Existen variosmétodos de referencia para realizar estas pruebascon levaduras y con hongos filamentosos. Los másdifundidos son los del CLSI estadounidense (Clinicaland Laboratory Standards Institute, antiguo NCCLS),aunque otras sociedades e instituciones también handesarrollado métodos de referencia, como elEUCAST, European Committee on AntibioticSusceptibility Testing perteneciente a la SociedadEuropea de Microbiología Clínica y EnfermedadesInfecciosas (ESCMID).

Las pruebas de sensibilidad a los antifúngicosestán basadas en las técnicas de microdilución encaldo, que se desarrollaron para conocer la actividadin vitro de los antibacterianos. Estas técnicasdeterminan la CMI (concentración mínima inhibitoria),que se obtiene calculando porcentajes de inhibiciónrespecto a un control de crecimiento. Los estándaresincluyen recomendaciones para la conservación, lapreparación y la interpretación de las pruebas, asícomo un sistema para controlar la calidad de losresultados. La introducción de estas técnicas produjoun cambio cualitativo en los estudios de sensibilidada los antifúngicos. Por primera vez se disponía demétodos reproducibles para detectar la resistencia invitro a estos antimicrobianos, por lo que se podíaevaluar su utilidad clínica. La aplicabilidad prácticade una técnica de determinación de sensibilidadreside en la fiabilidad de sus resultados; si estos noson reproducibles no pueden establecerse puntos decorte que guíen las recomendaciones terapéuticas.Además, la aparición de estos estándares hapermitido diseñar y validar varios métodos dedifusión en agar y técnicas comerciales para realizarpruebas de sensibilidad a los antifúngicos, quepueden utilizarse para detectar la resistencia a losazoles, particularmente la resistencia a fluconazol enlevaduras, que es el reto asistencial más destacableen este campo. En el presente documento tambiénse describen los procedimientos de referencia másutilizados en la actualidad para realizar estaspruebas de sensibilidad. Además, se recogen lastécnicas comerciales que se podrían utilizar, dada subuena correlación con los métodos de referencia.

2. CONSIDERACIONES CLÍNICASLas infecciones fúngicas pueden causar un gran

número de entidades clínicas, con manifestacionesvariadas que dependen del lugar de infección y deltipo de paciente. En general, podrían clasificarsesegún un criterio de profundidad, en superficiales,cutáneo-mucosas, subcutáneas y profundas(endémicas y oportunistas). Son las micosisprofundas oportunistas las que han adquirido unprotagonismo especial en los últimos tiemposdebido, entre otros motivos, al aumento de

DOCUMENTO CIENTÍFICO

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incidencia, gravedad y trascendencia del diagnósticoprecoz, a lo que habría que añadir la dificultad paradiferenciar la colonización de la infección invasora. Elaumento significativo de las infecciones fúngicassistémicas oportunistas es debido, entre otrascausas, a las medidas de soporte vital, al aumentodel uso de antibióticos de amplio espectro, a laimplantación de material protésico, a la terapia concorticoides y, en general, cualquier tipo deinmunosupresión (terapéutica o adquirida). Sin eltratamiento adecuado, la mortalidad de lasinfecciones fúngicas sistémicas es muy alta, lo queunido a los costes de hospitalización que este tipo deinfecciones genera, las convierten en entidades degran trascendencia en la práctica diaria en el mediohospitalario.

El diagnóstico micológico tradicional, basado enel cultivo, se caracteriza por su lentitud y, en el casode las micosis sistémicas, por su baja sensibilidad ypor la necesidad de obtener muestras por métodosinvasores. El hemocultivo, por ejemplo, es, sin lugara duda, un buen método diagnóstico de las micosissistémicas; pero requiere incubación prolongada yposee una sensibilidad global de alrededor del 50%en el caso de la infección producida por levaduras,que en el caso de la aspergilosis invasora no llega al10%. Sigue siendo, sin embargo, el método deelección para el diagnóstico de las micosissuperficiales y mucocutáneas. En los últimos años sehan desarrollado nuevas técnicas diagnósticasindependientes del cultivo con la intención demejorar la sensibilidad y reducir el tiempo necesariopara realizar el diagnóstico. El papel del laboratoriode microbiología es de gran importancia, siendofundamental para la elección de un tratamientoadecuado la identificación del agente causal de lainfección.

2.1. MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTANEASEstas micosis incluyen infecciones muy

frecuentes que afectan al estrato córneo de la piel, ala epidermis y a los anejos cutáneos: pelo y uñas.Son infecciones que constituyen una parteimportante de las consultas dermatológicas y cuyodiagnóstico de elección sigue siendo el examendirecto y el cultivo de las muestras de piel y anejoscutáneos.

2.2 MICOSIS SUBCUTÁNEASEstán causadas por hongos ambientales

inoculados directamente en el tejido celularsubcutáneo mediante un traumatismo. Presentanuna agresividad local variable. Característicamenteno se diseminan a distancia. Entre ellas se incluyenla cromoblastomicosis, esporotricosis, micetomas yuna serie de cuadros raros: rinosporidiosis,entomophtoramicosis y lobomicosis. El diagnósticode estas infecciones suele realizarse por examenmicroscópico directo y cultivo. En algunas de ellas,como la lobomicosis, el hongo causal no ha podidocultivarse y el diagnóstico es histológico.

2.3. MICOSIS TROPICALES ENDÉMICASConforman un grupo de infecciones cuyos

agentes causales acumulan una serie decaracterísticas curiosas: 1) presentan dimorfismo detemperatura, 2) son patógenos primarios, 3) causanpatología diseminada, incluso en pacientes noinmunocomprometidos, 4) tienen una distribucióngeográfica característica. Aunque pueden afectar aindividuos inmunocompetentes, las infecciones enpacientes inmunodeprimidos son más frecuentes ygraves. El diagnóstico se realiza por unacombinación de métodos convencionales: histología,cultivos y serología; y no convencionales, como ladetección de antígenos específicos en sangre y orina(histoplasmosis).

2.4. CRIPTOCOCOSISLa criptococosis es una enfermedad infecciosa

generalmente sistémica que afecta a animales y alhombre, sobre todo en situaciones deinmunosupresión. La criptococosis se adquiere porvía inhalatoria. El hongo responsable es unalevadura capsulada, que posee gran afinidad por elsistema nervioso central, siendo lameningoencefalitis la presentación clínica máshabitual. Otras presentaciones menos frecuentes sonlas afectaciones cutánea, ocular, ósea, articular y dela próstata, entre otras, que suelen ser consecuenciade una criptococosis diseminada. La criptococosisadquirió una importancia mayor coincidiendo con laaparición de la infección por el VIH, previamente erauna complicación característica de los pacienteshematológicos. Con la introducción de lostratamientos antirretrovirales de alta eficacia, lacriptococosis ha vuelto a su situación de micosisrara.

2.5. ASPERGILOSISLas aspergilosis son un amplio y heterogéneo

grupo de enfermedades oportunistas causadas porhongos filamentosos del género Aspergillus. Tieneun ciclo biológico muy simple, con alta capacidad deesporulación y por ello alcanza altas concentracionesde conidias en el aire. La inhalación continua deconidias por el hombre no supone en condicionesnormales ningún problema, ya que son eliminadasmuy eficazmente por los diferentes mecanismos dedefensa. Existen presentaciones clínicas de diferentegravedad, siendo las formas viscerales ydiseminadas de extrema gravedad y evoluciónaguda, principalmente en pacientes que presentanneutropenias graves y prolongadas. Todas ellasexigen un diagnóstico y tratamiento precoces.

2.6. CANDIDOSISLas levaduras del género Candida poseen una

amplia distribución y pueden originar infecciones dedistinta localización y gravedad, generalmenteasociado a factores predisponentes por parte delhuésped, por lo que se las considera patógenosoportunistas. La infección endógena tiene granimportancia y suele suceder a la colonización dediferentes localizaciones del paciente predispuesto.

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Las manifestaciones clínicas más frecuentes son lacandidosis superficial, estomatitis crónica, candidosismucocutánea, vulvovaginitis, y en ocasiones cuadrosmás graves con manifestaciones de diseminación enel paciente crítico o inmunocomprometido,apareciendo como entidades características, lacandidosis diseminada, candidemia, endoftalmitis yperitonitis.

2.7 OTRAS MICOSIS OPORTUNISTASConstituyen un grupo muy heterogéneo de

enfermedades que tienen en común la situación delpaciente, la gravedad y la relativa dificultad dediagnóstico. Por otra parte, el diagnóstico etiológicoes muy importante, pues la respuesta a los distintosantifúngicos varía con las especies implicadas. Eneste grupo se incluyen: pneumocistosis, fusariosis,penicilinosis, zigomicosis, pseudalescheriasis,pitosis, infecciones por Dipodascus capitatus,trichosporonosis, infecciones por Scedosporiumprolificans y otras. Algunas de estas infecciones sediagnostican con mas facilidad, porque los hongoscrecen en abundancia de muestras accesibles, comoocurre en la infección por Penicillium marneffei,mientras que otras requieren procedimientos muyinvasores y cierta dosis de fortuna.

2.8. ESTUDIOS DE SENSIBILIDADExiste una cierta controversia sobre la utilidad

clínica de las pruebas de sensibilidad a losantifúngicos. La mayoría de los expertos coincidenen señalar que los estudios de sensibilidad no sonnecesarios en todos los enfermos, ya que lainformación epidemiológica establece cuál puede serel tratamiento empírico más adecuado. Otrosespecialistas opinan que estas pruebas deberíanrealizarse en todas las cepas procedentes deinfecciones profundas, particularmente cuando seaíslan en hemocultivos o en muestras tisulares. Portanto, es difícil decidir cuándo se deben realizarestas pruebas por parte de un laboratorio asistencial.Quizá deberían hacerse rutinariamente en cepasprocedentes de enfermos en los que se ha producidoun fracaso terapéutico, en casos de pacientes quehan recibido profilaxis o tratamiento antifúngicoprevio, y en cepas pertenecientes a especies pocofrecuentes, de las que se desconoce su espectro desensibilidad in vitro. En estos casos, el estudio desensibilidad puede ayudar a elegir la mejoralternativa terapéutica. Tampoco debe olvidarse quelas personas que suelen desarrollar micosis gravesson pacientes debilitados, con enfermedadescrónicas o con inmunodepresión. En estos casos, eldiagnóstico y el manejo de la infección fúngica esmuy complicado, por lo que los resultados de losestudios de sensibilidad deben considerarse comoun dato más a la hora de tratar la infección, un datoque debe integrarse entre las variables a tomar enconsideración cuando nos enfrentamos a unamicosis.

3. RECOGIDA DE LA MUESTRAPara alcanzar el éxito en el diagnóstico

micológico partiendo de una sospecha clínica, esfundamental realizar adecuadamente la recogida dela muestra a partir de la lesión, su correctamanipulación para mantener la viabilidad del agenteetiológico y evitar posibles contaminaciones en sutransporte y procesamiento, la siembra de la mismaen los medios idóneos y a la temperatura adecuada,así como la identificación e interpretación correcta delos aislamientos. Únicamente con el procesamientoadecuado se puede recuperar el hongo claramenteasociado con el proceso infeccioso. A la hora devalorar un crecimiento fúngico hay que tener siemprepresente la necesidad de diferenciar un “aislamientosignificativo” de otros que no lo son, ya que no es lomismo identificar una especie fúngica quediagnosticar una micosis.Consejos generales para optimizar la recogida de lasmuestras:

1. Debe disponerse de un protocolo de recogida demuestras que será actualizado periódicamente.

2. Es responsabilidad del médico asegurar unacorrecta recogida y envío en condicionesadecuadas de las muestras, funciones que nodeben ser delegadas en personal no cualificado.

3. Es necesario recoger las muestrasasépticamente, utilizando contenedores estériles,remitirlas al laboratorio antes de 2 horas ysembrarlas lo antes posible.

4. La muestra debe recogerse antes de instaurar eltratamiento y siempre de la parte activa de lalesión (cuando se sospecha una micosispulmonar es preferible una muestra respiratoriaque un hemocultivo).

5. Se debe evitar la utilización de hisopos siempreque el tipo de lesión lo permita, pues estáncontaminados frecuentemente con microbiotabacteriana. Sin embargo, algunas muestras(conducto auditivo, faringe, vagina, cérvix) nopueden ser recogidas de otra forma.

6. Las muestras de lesiones cerradas y abscesossuelen presentar un gran rendimiento. Debenaspirarse con jeringa y transferirse a uncontenedor estéril con solución salina, prestandoatención a la recogida de gránulos, si loshubiese.

7. El raspado de lesiones de piel y faneras puederealizarse con distintos materiales; los másutilizados son bisturí, moqueta o cepillo.

8. En situaciones que requieran un estudioepidemiológico, debe establecerse la necesidadde una recogida de muestras ambientales,familiares o animales.

9. El recipiente de recogida se identificará con losdatos del enfermo (nombre y localización), ydebe protegerse para que no se rompa en sutransporte al laboratorio.

10. Las muestras deben ir acompañadasobligatoriamente del volante de petición paraMicrobiología. En el cual, al menos, debehacerse constar la siguiente información: datosdel paciente (nombre y apellidos, número de

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historia clínica, fecha de nacimiento y sexo);datos clínicos (orientación diagnóstica,tratamiento antimicrobiano, enfermedad de basey antecedentes de interés); datos del médicosolicitante.

11. Al laboratorio se le debe informar de lasospecha de presencia de hongos peligrosos.También si se sospecha la presencia de hongoscon requerimientos especiales, Malassezia spp,por ejemplo, así como de viajes u origen depaciente.

Los envases para la recogida de lasmuestras pueden variar según el tipo de muestra arecoger y transportar:

- Tubos estériles con tapón de rosca: LCR yotros líquidos biológicos.

- Frascos estériles de boca ancha con tapónde rosca: orinas, esputos, heces,fragmentos de tejidos, etc.

- Torundas o hisopos de algodón estériles: Seusan para tomar muestras de superficies yorificios corporales (exudados, secreciones).

- Jeringas estériles: sólo se admiten cuandosu volumen no permita transferir la muestra aun medio de transporte adecuado.

- Frascos de hemocultivo para líquidosbiológicos.

- Placas de Petri estériles.

4. TRANSPORTETodas las muestras deben enviarse al laboratorio

rápidamente, sin conservantes. Las muestras debentransportarse en un recipiente estéril, humidificado ya prueba de vertidos; sin embargo, las muestrasdermatológicas pueden transportarse en unrecipiente seco (placa de Petri, papel de fotografíanegro, entre dos portas). En general, no debenintroducirse en medios de transporte, a no ser quesea fácil retirar la muestra del medio. Las muestrasen que se sospeche la presencia de dermatofitos uhongos dimórficos se conservarán a temperaturaambiente, nunca refrigerados. Los raspadoscorneales y hemocultivos deben sembrasedirectamente en el medio de cultivo adecuado. Siesto no fuera posible, se usarán medios detransporte adecuados o se conservaran a 4 ºC.

Las condiciones de transporte y almacenamientovienen reflejadas en la tabla 1, considerando ciertasvariaciones según el agente probable.

5. MANEJOTodas las muestras deben manejarse como si

tuvieran microorganismos potencialmente peligrosos.Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, yantes de procesarse, debe someterse a unainspección previa para asegurarse que ha sido bienseleccionada, recogida y transportada. Se rechazaráen los siguientes casos: a) muestra no identificada,b) transporte inadecuado o demasiado prolongado,c) muestra derramada, d) cantidad insuficiente oinadecuada. En todos estos casos se contactará conel médico solicitante para pedir nueva muestra osolucionar el problema de la misma.

6. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRAPara realizar un buen diagnóstico micológico es

importante que la muestra se recoja y se transporteen condiciones idóneas y que no se demore sucultivo. Aunque hay pocos estudios sobre ladisminución de la viabilidad de los hongos atemperatura ambiente o por la acción del hielo seco,es conocida la dificultad de recuperar Rhizopusarrhizus en muestras en las que se demora el cultivo,y también, la pérdida de viabilidad de algunoshongos por la desecación, temperatura elevada (>37ºC) o baja (<10 ºC), sobrecrecimiento bacteriano,presencia leucocitos, etc. La refrigeración puedecomprometer el aislamiento de hongos dermatofitos,Malassezia spp. e H. capsulatum. Las muestras queestán potencialmente contaminadas con microbiotabacteriana (muestras de piel, aspirados trans-traqueales, aspirados de oído interno, muestras deconjuntiva) deben enviarse a temperatura ambiente.

En términos generales, los procedimientosutilizados en el laboratorio de bacteriología sonadecuados para el cultivo de hongos, pero hay quetener en cuenta que, habitualmente, la cargamicrobiana es inferior en el caso de los hongos conrespecto a las bacterias. Esto obliga a recoger mayorcantidad de muestra para obtener un rendimientoóptimo. Las muestras inaceptables no debenprocesarse y el facultativo debe ser informadoinmediatamente. Todo laboratorio debe distribuir porescrito las normas de rechazo de muestras.Consejos generales para optimizar el procesamientode muestras

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra escorrecto.

2. Registrar toda la información necesaria quepudiera afectar a la calidad de la muestra y querepresente interés diagnóstico (aspecto, color,olor, consistencia, coágulos, etc.), así como todolo relacionado con su recogida, transporte yconservación.

3. Durante el procesamiento, deben seguirse todaslas medidas de seguridad necesarias, tanto parael personal como para la muestra.

4. El procesamiento debe llevarse a cabo tanpronto como sea posible para garantizar laviabilidad del hongo, utilizando el medio decultivo y la temperatura de incubación másadecuada.

5. La recuperación de los hongos es imprescindiblepara su identificación y la realización de pruebasde sensibilidad.

6. El tipo de procesamiento y los medios utilizadosdependen de las características de cadamuestra.

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Tabla 1. Muestras más comunes, etiología más probable, recogida y transporte

Muestra Hongo probable Recogida y transporteTiempo y

temperatura detransporte y

conservaciónNotas

Abscesossubcutáneos

Aspirar con jeringa y aguja.Transporte anaerobio oinoculación directa ≥ 1 ml.

≤ 24 h, temperaturaambiente (TA).

Muestra de la basede la lesión y pareddel absceso

Biopsias Levaduras, hongosfilamentosos.Siempre que sesospeche micosisprofunda.

Usar estrictas condiciones deasepsia y tomar la muestra de lazona central de la lesión.Colocar la muestra en un tubo ofrasco estéril con suerofisiológico estéril nobacteriostático para prevenir ladesecación.

≤ 24 h, TA.Almacenar a 4 ºC.

Sospecha dezigomicetos yhongos dimórficos,procesarinmediatamente.Biopsias obtenidaspor Punch: puedenutilizarse para laslesiones de piel.

Catéter Candida spp.Malassezia spp.

5 cm. distales colocarlos encontenedor estéril.

No estandarizadoactualmente.

Conjuntival yexudadolacrimal

Tomar la muestra con torundaestéril de algodón o alginatocálcico, humedecida en mediode cultivo o suero fisiológicoestéril, frotar la zona lesionadasuavemente e introducir latorunda en el medio detransporte.

Si se dispone de losmedios de cultivo espreferible hacer lainoculacióndirectamente.

Corneal,raspado

C. albicans,C. neoformans.Hongosfilamentososmuchas especies(Aspergillus spp.,Fusarium spp.;Paecilomyces spp.,Penicillium spp.,hongosdematiáceos)

Inocular directamente en elmedio y en el porta, medianteraspado con espátula.Obtención de la muestra por eloftalmólogo en quirófano;después de raspar varias vecesla córnea con un asa de Kimurao con bisturí, se debe sembraren placa Petri en X o en Cclavando el asa en el agar. Otraparte de la muestra se fija enportaobjetos para el estudioanatomopatológico

Se puede guardar atemperaturaambiente si seretrasa su envío allaboratorio.

Sembrar tocandocon ambos lados dela espátuladibujando una C enel medio.

Espaciosinterdigitales

Dermatofitos Limpiar la zona con alcohol al70%.Raspar con un bisturí estéril ydepositar en placa de Petriestéril.En el caso de que hayaexudado, tomar con torunda.

El transporte deestas muestras debeser inmediato.Conservación deestas muestras: atemperaturaambiente mejor quea 4ºC, ya quealgunos dermatofitosno sobreviven a larefrigeración.

No usar torundas,excepto cuando lalesión sea purulentao se encuentre enzonas húmedas dela piel o enmembranasmucosas. Si la tomase hace contorunda, el examendirecto no es válidoy el cultivo no serátodo lo óptimo quesería deseable.

Gránulossubcutáneos

Gránulo blanco:Acremoniumfalciforme,Acremonium recifei,Aspergillus nidulans,Neotestudina rosatii,Pseudoallesheriaboydii;

Recoger pus, exudado, biopsia,y drenaje de tractos sinuosos.Lavar los gránulos con soluciónsalina que contenga antibióticos.

≤ 24 h, TA. Granos o gránulosen eumicetoma.

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Gránulo negro:Exophialajeanselmei,Leptosphaeriasenegalensis,Madurella grisea,Madurellamycetomatis,Pyrenochaetaromeroi

Heces Sólo se recomiendaen caso decandidosisdiseminada.

Si las heces son formes,homogenizar con suerofisiológico estéril. Para eldiagnóstico de infeccionesfúngicas del tractogastrointestinal es más útil tomarmuestras de biopsia.

Transporteinmediato.Almacenamiento a 4ºC.

Herida Levaduras,micetomas,actinomicosis yesporotricosis

Muestra aspirada de la parteprofunda y transporte en jeringasin aguja.Remitir en contenedor estéril

Transporteinmediato.

Muestra del margenactivo.Si la muestra serecoge por cirugía,remitir también unaporción de la pareddel absceso.Si se utiliza hisopo,deberían remitirsevarios.

Lentes decontacto:

Siempre que sea posible enviarla lente al laboratorio, si no esposible prescindir de la lente,frotar con torunda la superficiede contacto corneal.

Almacenamiento a 4ºC.

Líquidointraocular

Endoftalmitis ycelulitis orbitaria

Las muestras tienen querecogerse por el oftalmólogo enel quirófano, mediante punción yaspiración del fluido. Si lamuestra es muy densa serecoge con bisturí y se coloca encontenedor de boca anchaestéril. También se recomiendainoculación directa en losmedios de cultivo y lapreparación de dos o máspreparaciones para tinción.

≤ 24 h TA. Si es lavadointraocular,centrifugar antes desembrar.

Líquidosestériles (LCR,pleural,peritoneal...)

Candida spp.H. capsulatum, C.neoformans

Tras la preparación adecuada dela zona, obtener el líquido conjeringa en condiciones deesterilidad.Transferir a tubo estéril.Recoger como para bacterias, almenos 2 ml en contenedorestéril.

Procesamientoinmediato. ≤ 24h,TA. Nunca refrigerar.

El aspirado obiopsia cerebralpueden sernecesarios

Médula ósea Histoplasmosis,candidosis,criptococosis.(C. neoformans,H. capsulatum)

Preparar para incisión quirúrgica.Lisis centrifugación.Medio apropiado en la cabeceradel enfermo

Como la sangre. Si se usa unsistemaautomatizado,revisar las normasdel fabricante.

Oído externo Aspergillus niger,Aspergillus flavus

Girar con firmeza el hisopo en elcanal externo.

<2 h, TA<24 h, 4ºC

Oral Candida spp.,Paracoccidioidesbrasiliensis

Tomar con hisopo de la lesiónactiva; enjuagar con soluciónsalina para Candida. Medio de

≤ 24 h, TA Medio selectivopara levaduras.

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transporte para el hisopo ocontenedor estéril.

Orina Sospecha decandidosis urinaria,candidosisdiseminada ycriptococosis.LevadurasC. neoformans, C.immitis,H. capsulatum,B. dermatitidis.

Primera orina de la mañana encontenedor estéril. Orinaobtenida por sondaje. Orinapostmasaje prostático.Volumen necesario entre 10 y 50ml.

≤ 15 min, TA ≤ 24 h, 4 ºC

Usar la orina de laparte media de lamicción. Puedeutilizarse paradetección deantígeno deHistoplasma.

Pelos Sospecha de tiña dela cabeza:Trichophyton spp.Microsporum spp.(tinea capitis)

Limpiar la lesión con alcohol al70% o con agua destiladaestéril.Seleccionar el área, arrancar conpinzas al menos 10-12 pelosfrágiles que estén fragmentados,o que presenten fluorescencia ala lámpara de Wood y recogerescamas.En niños con exudado puede serútil frotar con un hisopo.

Contenedor seco.Si se hace conhisopo sembrardirectamente.≤ 72 h, TA.

Depositar en unaplaca Petri estéril.Para el transporteno usar tubos quemantengan lahumedad, favoreceel sobrecrecimientobacteriano.

Piel lampiña Sospecha deinfección pordermatofitos ycandidosis cutáneaTrichophyton spp.E. floccosumMicrosporum spp.Candida spp.Sporothrix schenkii

Desinfectar con alcohol de 70%.Raspar el borde de la lesión conun escarpelo, bisturí o porta. Lamuestra debe tomarse de laparte periférica de la lesión queva a ser donde van a estar loshongos en su fase proliferativa,mientras que en el centro de lalesión la mayoría de estoshongos pueden ser no viables.

Colocar una gota deagua sobre la lesiónpara evitar que lasescamas “vuelen”.Directamente sobreel medio o encontenedor estéril oentre dos portas.≤ 72 h, TA.

La humedad,favorece elsobrecrecimientobacteriano.

Piel lampiña,pitiriasisversicolor

Malassezia spp. Adherir cinta adhesiva (scotch)de varias zonas de la piel paraobservación directa almicroscopio.

Raspar variaslesiones de la pielsobre placa Petri.

Respiratorias:esputo,aspiradotraqueal,aspiradobronquial,lavadobroncoalveolar

Micosis profundas(blastomicosis,candidosis,coccidiomicosis,histoplasmosis,aspergilosis,mucormicosis...) yactinomicosis(actinomicosis,nocardiosis) delocalizaciónpulmonar.Levaduras, hongosfilamentosos.

Recoger 3 esputos en 3 díasconsecutivos.La recogida del esputo es igualque en el diagnóstico bacteriano.Puede ser obtenido porexpectoración espontánea obien inducido, este último esmuy útil para el diagnóstico deneumonía por Pneumocystisjiroveci.La utilidad de esta muestra vienecondicionada por su “calidad” enfunción del número de leucocitospolimorfonucleares e histiocitosen la muestra, igual que en elcaso de investigación debacterias, excepto cuando sebuscan hongos dimórficospatógenos primarios comoHistoplasma capsulatum,Coccidioides immitis,Blastomyces dermatitidis,Paracoccidioides brasiliensis, yPenicillium marneffei, en cuyocaso el esputo es válido “per se”.Cuando sea posible lavado

Contenedor estéril>1 ml.≤ 2 h, TA / ≤ 24 h, 4ºC

Esputo de 24 h noes aceptable. Loshongos dimórficossobreviven pocotiempo. Requierenprocesamientoinmediato.Hacer lasextensiones paratinciones de Gram,Giemsa.

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broncoalveolar, cepilladobronquial.

Sangre Cuando sesospechacriptococosis,candidosis,histoplasmosisdiseminada y otrasfungemias(Fusarium spp.,Scedosporium spp.,Paecilomyces spp.,Aspergillus spp.).Candida spp.,Malassezia spp., C.neoformans, H.capsulatum.

Desinfectar la zona concompuesto iodado.Lisis centrifugación.Sistemas automatizados.Medios bifásicos de infusióncerebro-corazón.Extraer la máxima cantidad desangre recomendada.

≤ 24 h, TA. La mayoría de lasCandida spp. sepuede recuperar enlos hemocultivos. Sise usa un sistemaautomatizadodeterminar quéhongos se puedendetectar. Para loshongos dimórficos:lisis centrifugación.Puede detectarseantígenocriptocócico, deHistoplasma oAspergillus.

Seno nasal Recoger el contenido del senoquirúrgicamente. Inoculardirectamente o transportar enuna gasa estéril húmeda.

≤ 24 h, TA.

Uñas Sospecha deonicomicosis.Trichophyton spp.EpidermophytonfloccosumMicrosporum spp.Candida spp.ScopulariopsisbrevicaulisOtros hongosfilamentosos de másdifícil interpretación.

Desinfectar con alcohol 70%.Lesiones dorsales: raspar lasuperficie y desecharla, recogerla parte profunda.Lesiones subungueales odístales: recoger los residuos dedebajo de la uña con bisturí,eliminando las primerasporciones y cortar la uña conunas tijeras estériles yposteriormente raspar con unbisturí estéril la parte inferior dela uña.Lesiones periungueales: tomarescamas o exudado.

Depositar la muestraen placa Petri estérilo en tubo. ≤ 72 h, TA.

La humedad,favorece elsobrecrecimientobacteriano.

Vaginal C. albicans, C.glabrata, Candidaspp.

Como para bacterias. Medio de transporte. <24 h, TA orefrigerado

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6.1. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRASPara optimizar tanto la observación microscópica

como el cultivo, es necesario preparar la muestra,aunque algunas se pueden inocular directamente sinque sea necesaria su manipulación previa. Todas lasmuestras deben observarse macroscópicamente yseleccionar la parte más representativa. Buscándoseen los tejidos las zonas con pus, caseificación onecrosis.6.1.1.Tejidos. Deben ser troceados e inoculados enpequeños trozos en el medio de cultivo con el fin defacilitar el crecimiento o la penetración de algunoscolorantes como el blanco de calcoflúor. Lautilización de homogenizadores no está aceptada yaque puede destruir a los hongos no septados. Eltroceado puede realizarse con tijeras o bisturí, elproceso puede realizarse en una placa de Petriañadiendo unas gotas de agua destilada estéril.6.1.2. Esputo y secreciones respiratorias. Elesputo y las secreciones respiratorias claramentepurulentas, hemáticas o caseificadas puedensembrarse directamente en los medios de cultivo.Las fluidas deben concentrarse por centrifugación(1500xg durante 10 minutos) desechando elsobrenadante y sembrando el sedimentoresuspendido en solución salina. Cuando la muestrasea muy viscosa habrá que fluidificarla, sin diluirlaexcesivamente, usando un agente mucolítico, comoN-acetil cisteína al 0,5% o ditioeritritol, (mezclada conigual volumen de la muestra y dejándola actuar atemperatura ambiente hasta que se consiga lafluidificación), posteriormente puede concentrarse lamuestra por centrifugación.6.1.3. Líquidos orgánicos (LCR, PLEURAL,PERITONEAL, ARTICULAR, etc.) Debenconcentrase por centrifugación (1500-2500xgdurante 10 min.) o filtración (0,2 µm de poro),siempre que haya suficiente cantidad. Sembrar elsedimento. Estas muestras pueden requerir unprocesamiento especial, o sembrarse directamenteen el medio de cultivo.6.1.4. Fragmentos ungueales. Se troceanprogresivamente con un bisturí y se pulverizan.6.1.5. Orina. No está claro qué recuento delevaduras en orina es significativo. Para algunos, unrecuento ≥ 103 UFC/ml sería indicativo de patología;pero algunos autores sostienen que cualquierrecuento sería válido, sobre todo si se acompaña designos de enfermedad. Por ello, se puede hacer lasiembra directamente para recuento (igual que parabacterias, con un asa calibrada) o bien centrifugar ysembrar el sedimento.6.1.6. Biopsias. Cortar con escarpelo en pequeñasfracciones de 1 mm, sobre todo si no hay sospechade ningún hongo en concreto o si la sospecha es deun mucoral. En el caso de sospecha de Histoplasma,hay que macerar y homogeneizar el tejido, como enel caso de investigación de bacterias. Hacerimprontas para tinciones. Contar también con elestudio anatomopatológico.

6.2. EXAMEN DIRECTOEl diagnóstico definitivo de la mayoría de las

micosis requiere el aislamiento e identificación delhongo a partir del cultivo, lo que supone confrecuencia, varios días o semanas de dilación. Lasmuestras para estudio micológico deben examinarsetanto macroscópica como microscópicamente. Elmétodo más rápido para la detección de estructurasfúngicas en una muestra clínica es el examenmicroscópico de la misma. Este examen puedeaportar, en ocasiones, un diagnóstico definitivo(pitiriasis versicolor) y en otras, un diagnóstico desospecha previo a la confirmación definitiva porcultivo. Por lo tanto, es un procedimiento que deberíarealizarse en todos los laboratorios ya que utilizatécnicas sencillas, permitiendo un cultivo mejordirigido, seleccionando los medios más apropiados.Sin embargo, si la muestra es escasa, el cultivo debeser prioritario. Las técnicas moleculares comienzan aser una realidad y permitirán un diagnóstico másrápido que el cultivo, si bien están menosdesarrolladas que para las bacterias o los virus.6.2.1. Observacion macroscopica. Las muestras,antes de ser procesadas, tienen que observarsemacroscópicamente, en busca de material caseoso,purulento, hemorrágico, necrótico o gránulos.6.2.2.- Observacion microscopica. El examenmicroscópico directo de una muestra clínicacorrectamente tomada es el medio más simple yrápido de detectar una infección fúngica. Cuando loselementos fúngicos están presentes en númerosuficiente se puede establecer una orientacióndiagnóstica presuntiva, en ocasiones definitiva, y enpocos minutos informar al clínico, lo cual permitirá lainstauración temprana de una terapia antifúngica,siendo éste uno de los factores esenciales en elpronóstico de las micosis en los pacientesinmunocomprometidos.La microscopía sigue siendo una de las herramientasmás antiguas y útiles del micólogo clínico. Confrecuencia los hongos tardan en desarrollar lasestructuras conidiógenas características para suidentificación definitiva. Por lo tanto, es de granutilidad que a la vez que se inoculan los medios decultivo, se realicen las técnicas microscópicas que,en tiempo real (menos de 10 min), puedan orientarde forma preliminar la etiología del proceso.El examen microscópico directo proporciona undiagnóstico definitivo si se observan elementosfúngicos patognomónicos: cápsula de Cryptococcusneoformans, células fumagoides encromoblastomicosis, levaduras pequeñasintracelulares de Histoplasma capsulatum,quistes/ascas típicos de P. jiroveci, levaduras conbrotes de base ancha de Blastomyces dermatitidis,levaduras con gemación multipolar en rueda detimón de Paracoccidiodes brasiliensis o las esférulasde Coccidiodes immitis. En algunos casos, eldiagnóstico microscópico puede ser la únicaevidencia de infección fúngica y, en otros, sunegatividad puede sustentar la interpretación deaislamientos como contaminantes. La escasez de lamuestra es, en la práctica, la única razón para no

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efectuar la observación microscópica en beneficiodel cultivo. El examen microscópico puede tambiénorientar la técnica de cultivo (medios, temperatura,tiempo de incubación, precauciones especiales debioseguridad) e, incluso, su inutilidad por tratarse depatógenos enigmáticos no cultivables comoRhinosporidium seeberi, Lacazia loboi oPneumocystis jiroveci.

Los métodos usados para la visualización fúngicadifieren en algunos aspectos de los de las bacterias;el mayor tamaño de los hongos hace, generalmente,innecesarios la tinción de frotis secos; en su lugarson más utilizadas las preparaciones directas enfresco con o sin líquidos de montaje y clarificación.La observación microscópica se realiza con bajoaumento, seguida de alto aumento en seco y, si esnecesario, con aceite de inmersión. Las dos formasobservadas habitualmente son levaduras y/oelementos miceliares. La mayoría de los hongos sepueden detectar sin tinción, en la mayor parte de lasmuestras clínicas como esputos, orinas, exudados yLCR, usando siempre que sea posible microscopiade contraste de fases. No obstante, se handesarrollado una serie de tinciones (tinta china,Giemsa, argénticas, agentes quimiofluorescentes,etc.) para mejorar la sensibilidad de la técnica. Lastécnicas microscópicas directas son de gran utilidaden el estudio de muestras clínicas de pacientes conmicosis que afectan a la piel y mucosas, perotambién son muy útiles en el diagnóstico de micosissubcutáneas y profundas.

Son múltiples las técnicas de observaciónmicroscópica para el diagnóstico de las micosis. Seutilizan montajes húmedos, tinciones fijas y diversastécnicas histológicas para las muestras de tejidos. Enlos montajes húmedos, la adición de KOH y dimetil-sulfóxido (DMSO) permiten la clarificación de lamuestra, mientras que la adición de glicerol, mejorala conservación de las estructuras fúngicas. Lasensibilidad de las diferentes técnicas en montajehúmedo es semejante, aunque la observaciónrequiere menos experiencia en el caso de lastinciones basadas en métodos fluorescentes. Deentre las tinciones fijas e histológicas, las tincionesargénticas y el PAS son las más adecuadas para laobservación de estructuras fúngicas. En la tabla 2 seresumen las técnicas que se pueden utilizar.

Los procedimientos de preparación de loscolorantes y los diferentes métodos de tinción sedesarrollan en los documentos técnicoscorrespondientes de este procedimiento (PNT-MIC-01, PNT-MIC-02, PNT-MIC-03, y PNT-MIC-04).

Las limitaciones y los problemas del examenmicroscópico también deben tenerse en cuenta:

a.- Un examen directo negativo nunca descartauna infección fúngica. La sensibilidad de latécnica puede estar entre 103_105 elementosfúngicos por ml y puede depender del lugaranatómico, tipo de paciente, tinción y experienciadel observador.b.- El examen microscópico puede originar falsospositivos al confundirse ciertas estructuras conelementos fúngicos (linfocitos lisados que se

confunden con C. neoformans en la tinción continta china, fibras de colágeno o del hisopo quese confunden con elementos fúngicos, gotas degrasa con levaduras en gemación, etc.). Estosposibles errores pueden minimizarse con unsegundo examen o con la experiencia delobservador.c.- El examen microscópico debe realizarse, almenos, en todas las muestras con alta sospechade micosis; aunque lo ideal sería realizarlosiempre que fuese posible.d.- Posee una relativamente baja sensibilidaddiagnóstica.e.- En la mayoría de los casos, no es posibleidentificar la especie fúngica.

f.- No permite la realización de estudios desensibilidad a los antifúngicos.

7. SELECCIÓN DE MEDIOS Y CONDICIONES DEINCUBACIÓN

El objetivo fundamental de la utilización de losmedios de cultivo es optimizar el crecimiento de losmicroorganismos. En los medios de cultivomicológicos, los antimicrobianos se utilizan tantopara inhibir el crecimiento bacteriano como el deotros hongos ambientales.

7.1. CLASIFICACIÓNAtendiendo a su composición, los medios de

cultivo pueden ser generales, enriquecidos,selectivos, diferenciales y especializados:

Generales: El más característico y clásico es elagar glucosado de Sabouraud (AGS). Se utilizacomo medio de cultivo general yfundamentalmente para la realizar la descripciónde las características morfológicas de la mayoríade los hongos.Enriquecidos: Se utilizan especialmente enmicosis sistémicas endémicas (histoplasmosis,blastomicosis), para la recuperación de la faselevaduriforme. Un ejemplo de estos medios es elagar cerebro-corazón con sangre (BHI).Selectivos: Son medios que favorecen elcrecimiento de los microorganismos deseadosimpidiendo el de otros. Los componentes másutilizados como agentes selectivos sonantibacterianos (cloranfenicol, gentamicina,penicilina, estreptomicina) y también inhibidoresde hongos como la cicloheximida que esespecialmente útil en las muestras cutáneas yrespiratorias para el diagnóstico de micosissistémicas endémicas.Diferenciales: Se utilizan para ayudar a laidentificación del hongo basada en la aparienciade éste en dicho medio, merced a la adición dedeterminados componentes como por ejemplosustancias cromógenas, o indicadores de pHcomo en el DTM.

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Tabla 2. Exámenes microscópicos más frecuentes

En fresco: Tinciones:-KOH-KOH + tinta Parker-KOH + blanco calcoflúor-Tinta china(Cryptococcus)

-KOH, KOH + tinta Parker, KOH + blanco calcoflúor: uso general.-Giemsa: uso general.-PAS: uso general.-Tinciones argénticas: uso general.-Fontana Masson: Pneumocystis, dematiáceos.

Especializados: Son aquellos medios quecontienen algún componente (por ejemplo, ácidocafeico) destinado a aislar un agente concreto(C. neoformans), favorecer la identificación deciertas especies (por ejemplo, el medio deCzapeck), u obtener estructuras de reproducciónsexual (por ejemplo, agar acetato, agar patata-zanahoria).

7.2. PREPARACIÓNLa buena calidad de los medios es indispensable

para conseguir el aislamiento y la identificación delos hongos; por lo tanto, cuando se utilicen medioscomerciales es necesario tener en cuenta la garantíaque aporta el proveedor y la calidad de ladistribución. Cuando se prepara un mediodeshidratado deben seguirse rigurosamente lasinstrucciones del fabricante, evitando errores en laforma de disolverlos o suspenderlos, en latemperatura y duración de la esterilización para queno se afecte la calidad del producto final. Algunosantibióticos deben añadirse al medio una vezesterilizado y a la temperatura adecuada, para queno se inactiven por las altas temperaturas de laesterilización.

7.3. CONTROL DE CALIDADPara asegurar la correcta utilización de los

medios, deben controlarse periódicamente suscaracterísticas más importantes: apariencia,esterilidad, pH y funcionamiento. El funcionamientose puede evaluar utilizando las cepas de controladecuadas para cada medio (ver PNT-MIC-05).

7.4. SOPORTEEl soporte habitual para los medios de cultivo en

Micología suelen ser tubos de cristal o placas dePetri (90 mm). Los tubos tienen la ventaja desoportar incubaciones prolongadas y aumentan laseguridad en el caso de sospecha de micosisendémicas. Si se utilizan tubos, deben incubarse enposición horizontal las primeras 24 horas para que elinóculo no se concentre en el fondo. Los tubosdeben de ser de boca más ancha que los habitualesen bacteriología, porque en ellos, las colonias no sonfáciles de aislar. Si los tubos utilizados son de tapónde rosca, el cierre debe mantenerse parcialmenteabierto para garantizar las mejores condicionesatmosféricas. Cuando se eligen placas, esconveniente que contengan 40 ml de medio paraevitar que se sequen, y deben cerrarse con cintaadhesiva para que no se abran involuntariamente,

protegiendo al personal de los hongos patógenos yevitando la contaminación con hongos externos. Elprecintado debe ser permeable al aire, ya quecuando el aire circula libremente se favorece laproducción de pigmento y la superficie del agar seseca, permitiendo el desarrollo de micelio aéreo yesporas.

7.5. ALMACENAMIENTOLos medios se deben guardar refrigerados a 2-8ºC.Para mejorar su conservación y prevenir ladesecación, es aconsejable invertir las placas eintroducirlas en bolsas de plástico. Las placas dePetri suelen conservarse en buen estado unos tresmeses, mientras que los medios semisólidos olíquidos en tubo de tapón de rosca se conservanbien hasta 6 meses. Sin embargo, ciertos medios, alcontener sustancias inestables (antibióticos,vitaminas, sangre, etc.), no se conservan en buenestado tanto tiempo. También hay que tenerpresente que algunos componentes de ciertosmedios pueden verse afectados por la luz, por lo queestos medios deben almacenarse en contenedoresopacos. Como norma general, todos los mediosdeben utilizarse antes de la fecha de caducidadindicada por el fabricante y, antes de su utilización,deben atemperarse, durante unos minutos, atemperatura ambiente.

7.6. ELECCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVOLos medios más utilizados en el cultivo de hongos

son: agar Sabouraud glucosa (AGS), habitualmentecon la modificación de Emmons, con cloranfenicol ycon/sin actidiona; agar infusión cerebro corazón(BHI) con o sin sangre de cordero al 5%, con o sinantibacterianos; agar inhibidor para mohos (MIA); yagar patata glucosa (APG). Sin embargo, los hongostambién pueden crecer en medios no selectivos,incluidos la mayoría de los medios bacteriológicos, sise incuban el tiempo suficiente. La elección y elnúmero de medios a utilizar están condicionados porel coste, la disponibilidad y las preferenciaspersonales, pero siempre se deben incluir medioscon antibacterianos y sin ellos. La incorporación decicloheximida (actidiona), inhibidor de muchoshongos considerados contaminantes, ayudaespecialmente en las micosis de la piel, aunquepueda inhibir algunos patógenos fúngicosimportantes; por ello, debe utilizarse siempre encombinación con otro medio sin cicloheximida.

Los medios de cultivo más empleados enmicología pueden agruparse en dos categorías en

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función de su utilidad: aislamiento e identificación.Para el aislamiento, la utilización de 3-4 mediosprácticamente cubre todas las necesidades: AGScon/sin antimicrobianos; un medio con cicloheximiday agar infusión cerebro corazón, para las micosissistémicas endémicas. Para la identificación, puedeser necesario un número mayor de medios quedependerá del número de muestras, las etiologíasmás probables en la zona geográfica, lasposibilidades del laboratorio y el nivel diagnósticoesperable según el tipo de centro.7.6.1. Agar Czapek Dox: se utiliza en el cultivo dehongos saprofitos, especialmente Aspergillus spp. yPenicillium spp. Es el medio de referencia para laidentificación de Aspergillus spp.7.6.2. Agar de patata glucosa (APG): es un medioutilizado para la estimulación de la formación deconidias, en la preparación de inóculos de hongosmiceliales y en la estimulación de producción depigmentos: rojo en Trichosporum rubrum, rosasalmón en Microsporum audouinii y amarillo enMicrosporum canis. Se utiliza con frecuencia enmicrocultivos para observar las característicasmorfológicas.7.6.3. Agar de Staib. Agar semillas de níger(Guizottia abyssinica): utilizado para aislarCryptococcus spp. y C. neoformans. Este último es elúnico que posee fenol oxidasa, que le permite laformación de un pigmento similar a la melanina apartir del ácido cafeico, un catecol, que posee lasemilla. El cloranfenicol lo convierte en medioselectivo. Existen medios semisintéticos queincorporan el ácido cafeico y evitan la utilización deesta semilla.7.6.4. Agar Dixon modificado: utilizado en el cultivode Malassezia spp. Puede modificarse añadiendocloranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida.7.6.5. Agar glucosado de Sabouraud modificadopor Emmons: es el medio estándar para elaislamiento, esporulación y conservación de muchoshongos. Su pH y la concentración de glucosafavorecen la esporulación.7.6.6. Agar infusión de cerebro corazón: puedeutilizarse como medio enriquecido para facilitar elcrecimiento de C. neoformans a partir de muestrasestériles como el LCR y el mantenimiento de la faselevaduriforme de algunas micosis sistémicas, ya seacon sangre o sin ella. En general, está indicado parael aislamiento de una gran variedad de patógenos,incluyendo levaduras, mohos y bacterias comoNocardia. Enriquecido con sangre de carnero al10%, se utiliza para el aislamiento de todos loshongos, incluyendo los hongos dimórficos. Puedenañadirse antibacterianos (cloranfenicol y/ogentamicina) para convertirlo en selectivo. Enalgunas ocasiones también puede completarse concicloheximida (facilita el aislamiento de Histoplasmacapsulatum y Blastomyces dermatitidis).7.6.7. Agar inhibidor de mohos: es un medioenriquecido que contiene cloranfenicol ogentamicina, pero no actidiona. Se utiliza en elaislamiento de hongos sensibles a la cicloheximida(Cryptococcus, zigomicetos, etc.) a partir de

muestras contaminadas. Permite el desarrollo de lamayoría de los mohos y de las levaduras.7.6.8. Agar Leeming y Notman (ALN): utilizado enel cultivo de Malassezia spp. Puede modificarseañadiendo cloranfenicol o bien cloranfenicol ycicloheximida.7.6.9. Agar Sabouraud con cicloheximida ycloranfenicol: es un medio selectivo utilizado para elaislamiento de hongos patógenos a partir demuestras muy contaminadas con hongos saprofitos ybacterias. Se utiliza fundamentalmente en elaislamiento de dermatofitos y hongos dimórficos.Inhibe algunas especies de hongos de interésmédico (Candida no albicans, Aspergillus,zigomicetos, C. neoformans, etc.).7.6.10. Agar Trichophyton (1 a 7): son siete mediosque se utilizan en la identificación de especies deTrichophyton basándose en sus requerimientosnutricionales.7.6.11. Agar urea de Christensen: se utiliza en laidentificación de algunos dermatofitos,especialmente Trichophyton rubrum de Trichophytonmentagrophytes y de algunas levaduras (C.neoformans).7.6.12. Medios cromogénicos para levaduras:contienen diversos sustratos enzimáticos que estánunidos a compuestos cromogénicos. Muy útil para elestudio de levaduras.7.6.13. Dermatophyte test medium: medio utilizadopara el aislamiento de dermatofitos en muestras muycontaminadas, proporcionando una identificaciónpresuntiva. Los dermatofitos producen alcalinización,virando el medio de amarillo a rojo. Algunasbacterias y algunos hongos también pueden produciralcalinización. Debido a que se trata de un mediocoloreado, no es un medio útil para la caracterizaciónde los pigmentos producidos por los dermatofitos.La cicloheximida inhibe muchos de los hongossaprofitos.7.6.14. Agar harina de maíz con/sin Tween 80: seutiliza en el cultivo y diferenciación de especies deCandida basándose en las características miceliales.El Tween 80 se incorpora para demostrar laformación de clamidoconidias. Si se le añaden 10 gde glucosa puede utilizarse en la diferenciación de T.rubrum y T. mentagrophytes basándose en laproducción de pigmento.

7.7. INCUBACIÓNLa temperatura óptima de crecimiento de la

mayoría de los hongos patógenos es 30 ºC. Sinembargo, Sporothrix schenckii es una excepción,crece más rápido a 27–28 ºC. Hay laboratorios queutilizan la temperatura ambiente en lugar de 30ºC,pero no es recomendable, ya que los cambios detemperatura son notables entre el día y la noche enla mayoría de los laboratorios. La temperatura de37ºC no se recomienda por dos razones principales:1) muchas muestras contienen abundantes bacteriasque crecen muy bien a esta temperatura; 2) algunoshongos crecen mal a esta temperatura o no crecen,especialmente los hongos que infectan la piel. Nohay ventaja en incubar simultáneamente a 30°C y a

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37°C. La temperatura de 37°C debe reservarse parahongos dimórficos o algún hongo que se desarrollemejor a esta temperatura. No obstante, también esnecesaria una estufa a 37°C para verificar latolerancia a esta temperatura. Sin embargo, utilizar37°C para el aislamiento del estadio levaduriformede Histoplasma o Blastomyces no aporta ventajas y,además, son morfológicamente indistinguibles deotras levaduras. Los cultivos de hongos debenincubarse durante 3-4 semanas antes de serdesechados, y no deben desecharse cuando se aíslaun hongo, sino que debe completarse el periodo deincubación. Sin embargo, hay muestras que sepueden eliminar antes (por ejemplo, exudadovaginal), a los 7 días, cuando se realizan cultivoshabituales.

8. IDENTIFICACIÓN8.1. HONGOS FILAMENTOSOS

Cuando el crecimiento detectado corresponda aun hongo filamentoso, la identificación se hará: 1)examen macroscópico de la colonia: forma, color,textura, velocidad de crecimiento y reverso. 2) Si elhongo tiene abundantes formas de reproducción seemplea la técnica del scotch o papel de celofán, queconsiste en tocar la superficie de la colonia con lacinta adhesiva y colocarla sobre un porta, en el quese ha depositado una gota de azul de lactofenol yobservar al microscopio. Mejora ostensiblemente lavisión microscópica si se añade, además, una gotade azul de lactofenol sobre el celofán y se depositaun cubre sobre ella.

Cuando no se puede conseguir una buenaobservación de las formas de reproducción por lastécnicas anteriores, es necesario hacer unmicrocultivo. Esta técnica consiste en depositarsobre un porta un trozo de agar de Sabouraud, o delmedio recomendado según el género de hongofilamentoso que se presume, de 1 cm2 de superficieaproximadamente, en cuyos extremos se inocula elhongo problema (en profundidad). Posteriormente sele coloca un cubre encima y se incuba en cámarahúmeda a 25ºC hasta observar crecimiento;entonces se toma el cubre, que es donde se handepositado las formas de reproducción, y se colocasobre un porta que lleva una gota de azul delactofenol y se observa al microscopio.

Los criterios de identificación sonfundamentalmente morfológicos basados en lapresencia de estructuras de reproducción sexual,estructuras de reproducción asexual y característicasespeciales de las hifas, cuya descripción excede lospropósitos de este documento y que pueden serconsultados en atlas micológicos. En ocasiones, laidentificación se complementa con pruebasbioquímicas, como la investigación de la ureasa, quediferencia T. mentagrophytes (positivo) de T. rubrum(negativo).

Todavía limitada a determinados laboratoriosespecializados, pero en continuo desarrollo, está laidentificación molecular de los aislamientos fúngicos,basada en los mapas de restricción de fragmentosdel operón ribosomal, digeridos con un panel de

enzimas de restricción, que permite la elaboración deárboles filogenéticos.

8.2. LEVADURASLa identificación de la especie de toda levadura

aislada en sangre o en cualquier otro líquido corporalestéril está plenamente justificada. También esconveniente la identificación de las levaduras deotras procedencias, sobre todo cuando ocurre deforma reiterada en diferentes muestras clínicas delmismo paciente, y siempre que se asuma que setrata de un organismo responsable de patología.

La mayoría de los organismos levaduriformescrecen fácilmente en un gran número de medios decultivo usados rutinariamente en el laboratorio demicrobiología (agar sangre, agar chocolate, agarCled, etc.). Sin embargo, el AGS, con o sinantibióticos añadidos, es el medio de aislamiento porexcelencia para la identificación de levaduras. En elmedio AGS las colonias de levaduras suelen sercompletas, ligeramente abombadas o planas, deconsistencia mantecosa, lisa o rugosa, con olordulzón agradable, volviéndose más pastosas amedida que la colonia envejece. Por lo general, lascolonias de levaduras no desarrollan micelio aéreo,aunque en ocasiones pueden aparecerprolongaciones aracneiformes en la periferia de lascolonias.8.2.1. Identificación convencional. Si se visualizacrecimiento en cualquier medio que sugieraposibilidad de levaduras, se realiza una extensión enfresco. Si en la misma se observan levaduras, seprocede a la identificación mediante subcultivo a unmedio cromogénico, de los que hay varioscomercializados. En el caso que no se trate deninguna de las especies que este medio identifica, seprocede a hacer la identificación medianteauxonograma de carbono preparado en el propiolaboratorio, o mediante alguno de los métodoscomerciales basados en él. La identificaciónbioquímica debe completarse con una identificaciónmorfológica mediante un subcultivo al medio agarharina de maíz con o sin Tween 80.Si se observa un micelio aéreo definido, debeconsiderarse la posibilidad de que se trate de unhongo dimórfico o de ciertas especies de levadurasque pueden formar micelio verdadero comoGeotrichum, Dipodascus o Trichosporon. Una coloniade aspecto y consistencia mucoide sugiere laformación de cápsulas y puede ser el paso inicialpara la identificación de C. neoformans. Las coloniasde color rojo–anaranjado o naranja, de aspectocremoso o rugoso son características de lasespecies del género Rhodotorula (rhodo: rojo), colorque manifiesta esta levadura por su riqueza encarotenoides.8.2.1.1. Otros medios diagnósticos complementarios

- Prueba del tubo germinal o filamentaciónprecoz: el tubo germinal es una extensiónfilamentosa de la levadura, sin estrechamiento ensu origen, cuyo ancho suele ser la mitad de lacélula progenitora y su longitud tres o cuatroveces mayor que la célula madre. Sólo C. albicans,

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y en menor medida C. dubliniensis, son capacesde producir verdaderos tubos germinales; sinembargo, otras especies como C. tropicalis puedenproducir pseudohifas precoces de aspecto similar alos tubos germinales pero con una zona deconstricción característica adyacente a la célulamadre, por lo que esta prueba es útil paradiferenciar C. albicans y C. dubliniensis del restode las especies de Candida.

Falsos negativos: aproximadamente un 5% decepas de C. albicans dan negativa la prueba delos tubos germinales. Si se utiliza un inóculodemasiado abundante de levaduras, tambiénpueden obtenerse falsos resultados negativos.Metodología: 1) emulsionar una porción de lacolonia aislada en 0,5 ml de suero humano, decaballo o de conejo. 2) Incubar a 35ºC durante 2horas. 3) Depositar una gota de la emulsiónsobre un portaobjetos limpio y desengrasado,colocar un cubre-objetos y visualizar a 100 X,400 X ó 1000 X.Interpretación: La prueba es positiva si sevisualizan tubos germinales.

- Detección de ureasa: una levadura con reacciónpositiva a la prueba de la ureasa es sugestiva depertenecer al género Cryptococcus.Concretamente, las cepas de C. neoformanscomienzan a provocar cambio de color a las 2horas de incubación a 35ºC en un tubo de urea deChristensen inoculado con una colonia del aisladosospechoso. Esta prueba también puede utilizarsepara diferenciar Trichosporon (ureasa positiva) deGeotrichum (ureasa negativa).- Prueba de la enzima nitrato-reductasa: lacapacidad de C. neoformans de reducir nitratos anitritos es una prueba de utilidad cuando sepretende identificar esta levadura.

Procedimiento: 1) pasar la punta de un hisopopor la superficie de 2-3 colonias aisladas de uncultivo de 48-72 horas de crecimiento encualquiera de los medios habituales. 2) Incubarel tubo con el hisopo a 45ºC durante 10 min. 3)Sacar el hisopo y agregar al tubo 2 gotas de alfa-naftilamida y 2 gotas de ácido sulfanílico. 4)Reintroducir el hisopo en el tubo para queabsorba los reactivos.Interpretación: el desarrollo inmediato de uncolor rojo indica una reacción positiva.

- Prueba de la fenol-oxidasa: C. neoformansproduce fenol-oxidasa, una enzima necesaria parael metabolismo de la 3,4-dihidroxifenilanina(DOPA) y otros compuestos fenólicos en la síntesisde la melanina. Esto se evidencia por laproducción de un pigmento marrón oscuro o negroalrededor de la colonia de C. neoformans en elmedio que contenga catecoles, como el ácidocafeico, o el medio preparado con semillas deníger (Guizotia abyssinica).

Interpretación: el desarrollo de una pigmentaciónmarrón oscura alrededor del crecimiento escaracterístico de C. neoformans.

8.2.2. Medios comerciales basados en laasimilación de nutrientes, en pruebasenzimáticas o inmunológicas.

- AUXACOLOR: en la galería Auxacolor (Bio-Rad)la asimilación se visualiza por el cambio de unindicador de pH. Además, incorpora una prueba deresistencia a la actidiona y otra para la detecciónde la actividad fenol-oxidasa de C. neoformans.- Sistema UNI-YEAST-TEK: el sistema Uni-YeastTek (Remel) está constituido por una placa plásticacon múltiples compartimentos que contienen unmedio con agar para la asimilación diferencial desiete hidratos de carbono. También incorpora unacubeta central con agar harina de maíz-Tween 80para determinar el crecimiento micelial y laproducción de clamidosporas. Además, estáprovisto de agar urea, agar para la asimilación yreducción de nitratos y de un caldo con extracto decarne al 2,6% (con 0,05% de glucosa) para realizarla prueba del tubo germinal.- API 20 C AUX : la galería API 20 C AUX(bioMérieux) se compone de 20 cúpulas consustratos deshidratados que permiten realizar 19pruebas de asimilación. Las cúpulas se inoculancon un medio mínimo semisólido y las levadurassólo se reproducen si son capaces de utilizar elsustrato correspondiente. Permite identificar untotal de 34 especies diferentes. La lectura de estasreacciones se hace por comparación con uncontrol de crecimiento y la identificación seobtiene, a partir de un código numérico, medianteun catálogo analítico o un programa informático.- Galería ID 32 C: la galería ID 32 C (bioMérieux)está compuesta por diferentes pruebas deasimilación y por una base de datos especialmenteadaptada. Permite identificar 63 especiesdiferentes de organismos levaduriformes orelacionados y puede ser utilizada manualmente obien de forma automatizada mediante los sistemasATB Expresión o mini API. La galería se componede 32 cúpulas: 29 contienen cada una un sustratocarbonado deshidratado, 1 es el control negativo, 1detecta la sensibilidad a la cicloheximida y la últimaes una prueba colorimétrica para la esculina.- Sistema Vitek 2: el sistema Vitek 2 (bioMérieux)es un sistema totalmente automático para ladetección del metabolismo fúngico que puedeidentificar levaduras y organismos afines en tansólo 15 horas. Está basado en tecnología defluorescencia y se compone de las tarjetas deanálisis con 63 pocillos, una consola satélite parala recogida de información, un módulo incubador,un módulo principal donde se procesa lainformación gracias a un software de análisis y unsistema experto avanzado. Permite la identificaciónde 51 especies diferentes, incluida C. dubliniensis,y, al igual que los sistemas semiautomáticos,requiere pruebas adicionales (fundamentalmentemorfológicas) en caso de baja discriminación.- Sistema Biolog YT MicroPlate: el sistemaBiolog YT MicroPlate (Biolog) permite laidentificación de organismos levaduriformesmediante 94 pruebas bioquímicas, llegando a

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identificar hasta un total de 267 especies diferentespertenecientes a 53 géneros.- Rapid Yeast Identification Panel MicroScan: elRapid Yeast Identification Panel MicroScan (DadeBehring) es un método automatizado para laidentificación rápida de 40 especies de levaduras yotros microorganismos afines. Se basa en lautilización de pruebas convencionales ycromogénicas en una placa de microdilución de 96pocillos que utiliza 27 sustratos deshidratados.- RapID Yeast Plus System: el RapID Yeast PlusSystem (Innovative Diagnostic Systems) es unsistema compuesto por un panel de 18 pocillos;cada uno contiene un sustrato convencional ocromogénico que detecta la asimilación decarbohidratos, ácidos orgánicos o aminoácidos, asícomo la hidrólisis de la urea y de ácidos grasos.Permite identificar hasta 43 especies diferentes delevaduras.- Fungiscreen 4H: Fungiscreen 4H (BIO-RAD) esun sistema basado en el estudio del perfilenzimático de algunas levaduras, permitiendoidentificar en 4 horas C. albicans, C. glabrata, C.tropicalis y C. neoformans. La utilización desustratos deshidratados por las enzimas fúngicasse manifiesta por un cambio de color, ya seaespontáneamente o después de añadir un reactivode revelado.- BICHRO-LATEX ALBICANS (Fumouze): es unmétodo para la identificación rápida de aislados deC. albicans por aglutinación de partículas de látexutilizando un anticuerpo monoclonal específico deC. albicans. La prueba se realiza con dos reactivosdistintos: a) bolas de látex recubiertas conanticuerpos monoclonales que reaccionanespecíficamente con el antígeno de C. albicanslocalizado en su pared celular, y b) un agentedisociante que permite la exposición al antígeno.- KRUSEI-COLOR (Fumouze): es un método parala identificación de aislamientos de C. krusei poraglutinación de partículas de látex, mediante unanticuerpo monoclonal específico que reaccionaespecíficamente con el antígeno localizado en supared. El kit contiene un reactivo Krusei-color y 5portaobjetos.- BICHRO-DUBLI (Fumouze): es un método parala identificación rápida de C. dubliniensis basadoen la coaglutinación de blastosporas de estaespecie con partículas de látex recubiertas conanticuerpos monoclonales, el cual permite ladetección específica de un antígeno de C.dubliniensis localizado en la superficie de la célula.La emulsión de colonias de C. dubliniensis en elreactivo Bichro-Dubli revela una coaglutinación,visible a simple vista, entre las blastosporas queportan el antígeno y las partículas de látexsensibilizadas con anticuerpos monoclonales,aglutinados azules que progresivamente seextienden hacia la periferia, formando un bordeazul alrededor de un área central roja/rosa.

9. INFORME DE LOS RESULTADOSEl diagnóstico micológico no acaba con el

aislamiento y la identificación del agente causal.Finaliza cuando la información sobre el mismo llegaal conocimiento del médico responsable delpaciente. Esta última etapa del procedimientodiagnóstico no es menos importante que lasanteriores, por lo que deben cuidarse al máximotodos los detalles de la misma.

- Observación microscópica: debe informarseen el día ya que aporta una importante ayuda alclínico; sus pacientes pueden salir de la consultade dermatología con un diagnóstico presuntivo(dermatofitosis), que habrá que confirmar con elcultivo, o definitivo (pitiriasis versicolor). Otrasobservaciones positivas permiten una orientaciónterapéutica (mucormicosis, aspergilosis, etc.). - Cultivo: el cultivo negativo se informa,generalmente, a las cuatro semanas deincubación, con las excepciones citadas en eltiempo de lectura. La prolongación de laincubación después de tres semanas aportapoca información adicional y, dependiendo delsistema de lectura, puede suponer unasobrecarga de trabajo que hay que valoraradecuadamente en cada laboratorio. Los cultivospositivos se informan de la misma manera que laobservación microscópica en el momento en elque se disponga del crecimiento. Cuando elsignificado del aislamiento del hongo sea dudosoo se requieran aislamientos sucesivos, debehacerse constar así en el informe.

En todo informe escrito debe figurar si es un informeprovisional o un informe definitivo.En los aislamientos poco habituales, un pequeñoresumen de las características del hongo puede serfundamental para el manejo clínico.

10. ESTUDIOS DE SENSIBILIDAD10.1. RECOGIDA, TRANSPORTE YCONSERVACION DE LA MUESTRA

Todo el proceso de recogida de muestras,transporte y conservación de las cepas/muestrassigue los procedimientos habituales del laboratoriode microbiología. Obviamente, la forma deprocesamiento de las cepas dependerá de si elestudio de sensibilidad se realiza para aportarinformación terapéutica en un caso individual o si sehace diferido en el tiempo con el objetivo de obtenerinformación epidemiológica en nuestro medio.

10.2. MANEJO DE LA MUESTRA A SURECEPCIÓN EN EL LABORATORIO

Las especies fúngicas en las que se realizanestudios de sensibilidad están clasificadas en elgrupo-2 desde el punto de vista de la bioseguridad,por lo que no deben manejarse en condicionesespeciales. Si las pruebas de sensibilidad se hacenpara conocer la mejor alternativa terapéutica en unenfermo concreto, deberían realizarse de formarápida, intentando ofrecer una información útil para elmanejo del enfermo. Esta capacidad de respuestarápida sólo suelen tenerla las instituciones sanitarias

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que hacen las pruebas de forma habitual. En loslaboratorios en los que se hacen estudiosepidemiológicos diferidos, las cepas debenconservarse siguiendo procedimientos habituales.Pueden mantenerse alrededor de ocho semanas a4ºC en un subcultivo en medios para hongos comoagar Sabouraud o agar patata glucosado. Si se van aconservar durante más tiempo deben emplearse laliofilización, medios de congelación comerciales,glicerol, leche, agua destilada u otrosprocedimientos, según especies y posibilidades dellaboratorio. Si se van a remitir las cepas/muestras aun laboratorio de referencia, debe utilizarse unsistema de envío homologado, que cumpla lanormativa europea sobre transporte de muestras ycepas clínicas. El envío debe acompañarse de unimpreso o volante con información para identificar lamuestra, indicando el nivel de bioseguridad que debeaplicarse en su procesamiento.

10.3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRAEl procesamiento de las cepas a las que se les va

a hacer el estudio de sensibilidad no requiereconsideraciones especiales. En las muestrascutáneas, de mucosas o de exudados esconveniente asegurarse de que no existe un cultivomixto, con varias especies fúngicas. En el caso delas levaduras, los agares cromogénicos puedenayudar a distinguir las infecciones mixtas.

Para preparar el inóculo debe partirse siempre deun subcultivo fresco de la cepa en cuestión. Nodeben utilizarse subcultivos más antiguos ni prepararel inóculo a partir de reservas de levaduras oconidias refrigeradas o congeladas. Los subcultivospara preparar el inóculo se realizan en medioshabituales para hongos.

10.4. SELECCIÓN DE MEDIOS Y CONDICIONESDE INCUBACIÓN. CULTIVOS

Los medios de cultivo necesarios para hacer laspruebas de sensibilidad dependerán del método quese siga. En general son medios sintéticos definidos,como el RPMI con o sin glucosa. Se deben hacerpruebas de esterilidad del medio así como demedida del pH, que debe situarse alrededor de 7,0 +0,3. En caso contrario, los antifúngicos puedenperder parte de su capacidad inhibitoria. Losantifúngicos deben obtenerse en forma de sustanciavalorada solicitándolos al laboratorio que los produceo en aquellos casos en los que sea posible,adquiriéndolos a través de un distribuidor acreditado.Debe conocerse el número de lote, potencia, fechade caducidad y condiciones de conservación. Lasformulaciones preparadas para uso clínico no debenemplearse, pueden tener excipientes oformulaciones indeseables.

Los métodos de referencia describen conprecisión todo el proceso de preparación desoluciones madre de los antimicrobianos, de lasplacas o tubos con concentraciones decrecientes,del inóculo, de la forma de inoculación y de lectura.Se aconseja realizar recuentos en placa a partir de

las suspensiones inoculadas para comprobar que nose han cometidos errores en la preparación delinóculo. Deben incluirse cepas control (ver PNT-MIC-05) en todas las pruebas para poder validar losresultados. Si se decide utilizar un método comercialdeben seguirse fielmente las instrucciones delfabricante. Las condiciones de incubación no sonespeciales. Generalmente se cultivan en atmósferanormal, a 30 ó 35ºC, durante 24-72 horas,dependiendo del método y de las especies fúngicas.

10.5. CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIÓN DELOS RESULTADOS

Una de las finalidades de los estudios desensibilidad in vitro es la detección de lasresistencias de los microorganismos a losantimicrobianos y, de esta forma, poder predecir laresistencia clínica. Sin embargo la correlación entrelos resultados de las pruebas de sensibilidad in vitroa los antifúngicos y la respuesta al tratamiento de losenfermos con micosis no es muy buena, por lo queno existen unos criterios claros para suinterpretación. El CLSI ha establecido puntos decorte para interpretar los resultados de estaspruebas con fluconazol, itraconazol, fluorocitosina yvoriconazol (tabla 3). Estos puntos de corte sólo sonaplicables en infecciones por levaduras y tienen unautilidad clínica limitada. Se basan en datosfarmacocinéticos, estudios realizados en pacientescon candidosis orofaríngeas y datos de pacientescon infecciones profundas. En la mayoría de losestudios sobre candidosis orofaríngea, se observafalta de respuesta clínica a los azoles cuando seemplean estos antifúngicos para tratar infeccionespor cepas que presentan CMIs elevadas, >16 mg/lpara el fluconazol y >0,25 mg/l para el itraconazol.Sin embargo no se ha encontrado una correlacióntan clara en las infecciones profundas. Las causasde esta incoherencia residen en las numerosasvariables que influyen en la respuesta al tratamientoy en la complejidad de los enfermos que presentanmicosis invasoras. Los estudios de correlación enpacientes con infecciones profundas se hanrealizado sin estratificación por enfermedad de basee incluyendo pocas cepas con resistencia in vitro.Otros comités como el EUCAST van a proponerpuntos de corte en breve, que serán muy similares alos del CLSI y también de utilidad limitada. Otros expertos prefieren interpretar los resultadosde estas pruebas con variables farmacodinámicas.Los cocientes entre la concentración plasmática o elárea bajo la curva (AUC) y la CMI se estánempezando a emplear como factores predictivos dela respuesta a los antifúngicos.

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Tabla 3. Puntos de corte para interpretar las pruebas de sensibilidad en levaduras, según el CLSI estadounidense.Datos en mg/l.

Antifúngico SensibleSensible

dependiente dela dosis

Intermedio Resistente

Fluconazol < 8 16-32 - > 64

Itraconazol < 0,125 0,25-0,5 - > 1

Voriconazol < 1 2 - > 4

Flucitosina < 4 - 8-16 > 32

Así para fluconazol, un cociente AUC/CMI >25 seasocia con índices de respuesta superiores al 90%,mientras que un cociente <6,5 reduce la probabilidadde respuesta al 57%. Basándose en estas cifrasdeberían emplearse dosis de 800 mg al día, paratratar una infección por una cepa que presenta unaCMI de fluconazol de 32 mg/l. Los estudios decorrelación con anfotericina B se encuentran enfases menos avanzadas de desarrollo. Sólo se haencontrado una cierta correlación entre el fracasoterapéutico y CMIs >2 mg/l en modelos murinos decandidosis diseminada. Respecto a los hongosfilamentosos debe señalarse que no existen puntosde corte para interpretar las pruebas de sensibilidad.No obstante, en los últimos años se han comunicadofallos terapéuticos con itraconazol en infeccionesproducidas por cepas de Aspergillus con CMI de >8mg/l. Para anfotericina B, algunos autores hancomprobado que cepas de Aspergillus spp. y deRhizopus spp. se comportan como resistentes enmodelos animales, cuando tienen una CMI deanfotericina B > 2 mg/l.

10.6. PROCEDIMIENTOS ADICIONALES AREALIZAR EN SITUACIONES ESPECIALES

Una de las principales limitaciones de las actualespruebas de sensibilidad a los antifúngicos es que noson aplicables a todas las especies. Los hongos decrecimiento lento como Cryptococcus, Geotrichum,Trichosporon y muchas especies filamentosas nocrecen bien en los medios de cultivo recomendadospara hacer estudios de sensibilidad, lo que influyesobre la fiabilidad de la CMI, disminuyendo suutilidad terapéutica. Por ello se han propuestomodificaciones para hacer pruebas con estasespecies, como cambios en el medio de cultivo, elinóculo, el pH, la molaridad o incubaciones enagitación continua. Ninguna de estas modificacionesha sido validada, por lo que si se decide utilizarlas,los resultados deberían ser interpretados conprudencia.

10.7. INFORMACIÓN DE LOS RESULTADOSLos resultados de los estudios de sensibilidad a

los antifúngicos deben informarse como los de otrosantibiogramas, dando el valor de la CMI. En caso deutilizar el método del CLSI, podría informarse comosensible o resistente, siguiendo los puntos de corterecogidos en la tabla 3. Sin embargo, dadas laslimitaciones antes expuestas sobre la correlación deestas pruebas con la clínica, se aconseja que loslaboratorios que realicen estas pruebas desensibilidad mantengan una relación estrecha conlos médicos que las solicitan, individualizando cadacaso y colaborando en la toma de decisionesterapéuticas. En caso de realizar estudiosepidemiológicos periódicos, se debería informar atoda la institución sanitaria sobre la distribución deespecies y el perfil de sensibilidad, lo que ayudaría aelegir los tratamientos empíricos más adecuados.

10.8. METODOS RÁPIDOS ACEPTADOS PARA LADETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD AANTIFÚNGICOS

La determinación de la CMI por técnicas dedilución en caldo no es un método aplicable paralaboratorios clínicos que deben hacer estudios desensibilidad a diario, que sufren la presión asistencialy que deben ofrecer información rápida para quetenga utilidad terapéutica. Por ello se handesarrollado técnicas de difusión en agar, como ladescrita en el documento M44-A del CLSI, y métodoscomerciales con la intención de ofrecer unaalternativa rápida, práctica y barata para realizarestudios de sensibilidad a los antifúngicos.

El documento M44-A recoge un procedimiento dedifusión sencillo y práctico, validado para realizarestudios con fluconazol y voriconazol, que utilizadiscos cargados con el antimicrobiano. El medio decultivo recomendado es Mueller-Hinton con un 2%de glucosa y con azul de metileno, ya que parecemejorar la lectura de las placas, al aumentar lanitidez de los halos de inhibición. En lo que se refierea los métodos comerciales, debe destacarse quepara que un procedimiento de este tipo pueda ser

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utilizado en los laboratorios asistenciales tiene queexistir una buena correlación entre la técnica dereferencia y la comercial, ya que en teoría, los puntosde corte sobre sensibilidad o resistencia seestablecen con las técnicas de referencia. Si unatécnica comercial no se correlaciona con la dereferencia, no debería emplearse en los laboratoriosasistenciales, ya las que recomendacionesterapéuticas pueden tener escasa credibilidad.Existen varios métodos comerciales que handemostrado una buena correlación con losestándares de referencia. Esta correlación es aunmás apreciable con los azoles, fármacos para losque se han descrito la mayor parte de lasresistencias. Por tanto, los laboratorios asistencialespueden emplear estos métodos para detectar confiabilidad y rapidez la resistencia a los azoles, sobretodo la resistencia in vitro a fluconazol en levaduras.Entre los métodos comerciales que puedenemplearse en un laboratorio clínico destacan lastécnicas de difusión en agar con discos o tabletas deantifúngicos como el NeoSensitabs (A/S Rosco) o elBIOMIC V3 (Giles Scientific Inc.), un método delectura automatizado para las pruebas realizadassiguiendo la técnica M44-A del CLSI. Otro método dedifusión es el E-test (AB Biodisk), que consiste enuna tira de plástico con un gradiente deconcentraciones del antifúngico, lo que permite queel resultado incluya la CMI. Otras técnicas incorporanuna adaptación de la microdilución en caldo con osin colorantes como el Sensititre YeastOne (TREKDiagnostic Systems Ltd.), el Fungitest (Bio-Rad) y elATB Fungus 2 (bioMerieux). Todas ellas hanmostrado una fiabilidad elevada para detectar laresistencia a fluconazol. Otras galerías comercialesmenos evaluadas, pero que también podríanutilizarse son el ASTY (Kyokuto PharmaceuticalIndustrial Co), el Mycostandard (InstitutPasteur,Paris, France), el Mycototal (Behring Diagnostic), elCandifast (International Microbiol) y el IntegralSystem Yeasts (Liofilchem Diagnostics). Por último,un enfoque novedoso es automatizar la lectura delas placas de microdilución mediante una cámara devideo y un programa informático. Esta técnica es laque incorpora el sistema WIDER I (Soria Melguizo),que también ha mostrado una gran fiabilidad en ladetección de resistencias en levaduras.

10.9. PROCEDIMIENTOS NO ACEPTABLESDeben considerarse como inaceptables todos los

resultados obtenidos mediante modificaciones novalidadas de las técnicas de referencia. Los cambiosen el inóculo, los medios de cultivo o el método delectura pueden tener efectos notables sobre la CMI,alterando la fiabilidad del resultado. Debe evitarsetoda modificación salvo que se realice un procesocomparativo de estandarización. Tampoco debenrealizarse pruebas de sensibilidad sin incluir cepascontrol, pues es el único modo de validar losresultados. Estos no deben aceptarse si las CMIs delas cepas control no coinciden con los recogidos porlos estándares. Debe evitarse realizar pruebas desensibilidad con preparados comerciales de los

antifúngicos, ya que los excipientes y otrassustancias presentes en la formulación puedenmodificar los resultados obtenidos in vitro. Laspruebas deben realizarse con sustancia valorada. Esaconsejable que todo el procedimiento de laspruebas esté sometido a un control de calidadriguroso de los antifúngicos, lotes de medios y otrosreactivos, así como de las cepas control. No debenutilizarse reactivos sin validar o sin conocer su fechade caducidad. Por último, si se va a utilizar unmétodo comercial, deben seguirse estrictamente lasrecomendaciones del fabricante. Variaciones en elprotocolo pueden alterar significativamente losresultados de la prueba, reduciendo su aplicabilidad.

11. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO.TÉCNICAS NO CONVENCIONALES11.1. TRANSPORTE, MANEJO Y CONSERVACIÓNDE LA MUESTRA

Las técnicas de diagnóstico rápido que hemosdenominado no convencionales suelen utilizar elsuero y el LCR como muestras de elección. Todaslas muestras deben enviarse rápidamente allaboratorio. La conservación de las muestras tambiénes importante que se realice adecuadamente,mediante refrigeración o congelación, dependiendodel tipo de determinación y la periodicidad con quese realice. Por último es importante realizar unaseroteca con los sueros procesados, que será elreflejo de la situación clínica del paciente en esemomento para poder confirmar posibles resultadosatípicos o dudosos. El suero y el LCR puedenalmacenarse a 2-8ºC si se van a procesar en lasprimeras 24 h. Si la determinación solicitada se va ademorar por más tiempo se recomienda lacongelación, a -80ºC, si es posible. El procesamientode la muestra va a depender de la determinaciónsolicitada y de la técnica que se vaya a realizar, porlo que se recomienda seguir fielmente lasinstrucciones del fabricante, si se trata de un “kit”.Para más información consultar el documentotécnico correspondiente (PNT-MIC-10).

11.2. CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIÓN DERESULTADOS

Es importante recordar que, aunque lasensibilidad y especificidad absolutas sonparámetros que debemos considerar en cadatécnica, los valores predictivos positivo y negativo,que variarán en función de la población estudiada,son los más importantes en la práctica clínica.También destacar que el laboratorio de microbiologíaha de emitir un informe que interprete el conjunto deresultados obtenidos en el estudio de cada muestra.

11.3. DESCRIPCIÓN DE LAS DIFERENTESINDICACIONES11.3.1.- Diagnóstico de la criptococosis

La detección de antígeno capsular en líquidosorgánicos y especialmente en líquido cefalorraquídeoes de especial interés ante la sospecha de meningitiscriptocócica. Ello se debe en gran parte a la rapidez,sencillez técnica y especificidad de la prueba que

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permite el diagnóstico, en 10-15 minutos, deaproximadamente el 99% de las meningitiscriptocócicas y el 67% de las criptococosisdiseminadas, mientras que el cultivo e identificaciónde C. neoformans puede requerir varios días.Habitualmente se utilizan dos tipos de técnicas, unacualitativa y otra cuantitativa. La técnica cualitativa seemplea para diagnosticar nuevos casos decriptococosis o para confirmar reinfecciónespecialmente en el paciente infectado por el VIH. Latécnica consiste en la detección de antígenocapsular criptocócico, que es de naturalezapolisacarídica, mediante anticuerposmonoespecíficos dirigidos frente a él y unidos apartículas de látex. La aglutinación de las partículasde látex tras la reacción antígeno-anticuerpo sedetecta a simple vista. Esta técnica emplea comocontrol de aglutinación (látex de control) partículasde látex con inmunoglobulinas inespecíficas deconejo con el fin de detectar reacciones positivasfalsas y así aumentar la especificidad de la técnica.La técnica cuantitativa se emplea habitualmente parael seguimiento de la evolución de pacientes yadiagnosticados mediante el título de antígenocapsular presente en la muestra clínica, quegeneralmente es suero o LCR. Es útil para conocerla eficacia del tratamiento antifúngico aplicado.11.3.2. Diagnóstico de la aspergilosis11.3.2.1. Detección del antígeno. La detección degalactomanano, un antígeno específico del géneroAspergillus, se considera la posibilidad másinteresante para el diagnóstico de la aspergilosisinvasora en pacientes neutropénicos. La detecciónde galactomanano mediante un ELISAcomercializado, Platelia Aspergillus de Bio Rad,permite el diagnóstico de la aspergilosis invasora conuna especificidad del 89,6 % y una sensibilidad del87,5 %. Esta prueba es más sensible que el látexPastorex Aspergillus y en algunos estudios se hademostrado que es positiva antes de que aparezcala sintomatología clínica. Actualmente se hanmodificado los puntos de corte establecidos,unificando el criterio americano y el europeo, yfacilitándose de esta manera los estudioscomparativos sin modificarse la especificidad ysensibilidad de la técnica.

En la ultima década se ha avanzado mucho en lacaracterización de los antígenos de A. fumigatus (elagente etiológico más importante). Entre los cientosde antígenos descritos se ha conseguido caracterizar4 de los más importantes: la catalasa CAT1 (90 kDa),la dipeptidildipeptidasa también llamadaquimotripsina (79 kDa), la restrictocina (18 kDa) y elgalactomanano (residuo polisacarídico unido adistintas proteínas). Los dos primeros sonfuertemente inmunogénicos y se utilizanampliamente para la detección de anticuerpos. En laaspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) sedetectan anticuerpos anti A. fumigatus específicos dela clase IgG en casi el 100% de los casos.11.3.2.2. Detección de anticuerpos. La detección deanticuerpos frente a organismos del géneroAspergillus en el suero es, desde hace muchos años,

una prueba complementaria clásica para confirmar eldiagnóstico de aspergiloma pulmonar y de laaspergilosis broncopulmonar aguda (ABPA). Lastécnicas empleadas han sido muy diversas, siendo lamás clásica la inmunodifusión (ID) en sus diferentesvariantes y modificaciones. Sin embargo, estastécnicas clásicas disponibles comercialmentepresentan una serie de problemas:

i) Falta de estandarización en los procedimientosde extracción de los antígenos de Aspergillus,debido a los medios de cultivo empleados, lascondiciones de incubación (tiempo deincubación, temperatura, etc.) y a losprocedimientos de extracción y purificación.

ii) Variabilidad antigénica generada por estasmismas causas, que origina una falta deconcordancia en los resultados obtenidos por losdiferentes laboratorios y reacciones cruzadasentre diferentes especies de Aspergillus o conotros hongos.

Se pueden utilizar varias técnicas para poner enevidencia la presencia de anticuerpos específicosfrente a Aspergillus en pacientes con aspergilomapulmonar. Las más utilizadas se basan en lainmunoprecipitación y detectan la formación delíneas de precipitación llamadas precipitinas que seforman por la reacción antígeno-anticuerpo. Haynumerosas variantes de esta técnica, pero las dosmás ampliamente empleadas son la inmunodifusión(doble difusión, técnica de Ouchterlony) y lacontrainmunoelectroforesis, que es una aceleraciónde la anterior utilizando campos eléctricos.11.3.3. Diagnóstico de la candidosis11.3.3.1. Detección de antígeno. A pesar del grannúmero de antígenos estudiados, la detección deantígeno en pacientes con candidosis invasora no hapermitido solucionar el problema diagnóstico quepresenta esta micosis y no existe una pruebaaceptada universalmente. La detección de mananopor ELISA es más sensible y especifica que poraglutinación de partículas de látex. Lacomercialización de pruebas para la detección deantígenos de Candida debería de haber facilitado eldiagnóstico serológico de la candidosis invasora aldisponerse de pruebas estandarizadas, sin embargo,los resultados obtenidos hasta el momento son pocoesperanzadores. Dado que la antigenemia en lospacientes con candidosis invasora es transitoria, esposible que se necesite la combinación de técnicasque detecten diferentes antígenos o epitopos paraaumentar la sensibilidad diagnóstica.11.3.2.2. Detección de anticuerpos. En los últimosaños, se ha cuestionado la utilidad de la detecciónde anticuerpos anti-Candida en pacientes concandidosis invasora debido a que puede presentardos limitaciones importantes:

i) La detección de títulos altos de anticuerpos enpacientes que están solamente colonizados porCandida.ii) La respuesta de anticuerpos puede estarretrasada, reducida o no existir en pacientesinmunodeprimidos.

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Sin embargo, estos problemas podrían resolverseeligiendo los antígenos apropiados y utilizandotécnicas lo suficientemente sensibles para detectartítulos bajos de anticuerpos. Las pruebascomercializadas actualmente detectan anticuerposcontra el manano y la enolasa y los antígenos delmicelio de C. albicans. Estas pruebas debenutilizarse para estudiar muestras seriadas delpaciente, lo que permite analizar la evolución de lostítulos de anticuerpo y su correlación con los datosclínicos y microbiológicos. La detección simultáneade manano y anticuerpos anti-manano mejoraostensiblemente la sensibilidad y especificidad en eldiagnóstico de candidosis invasora.

11.4. DETECCIÓN DE COMPONENTES NOANTIGÉNICOS

La detección de componentes no antigénicosliberados por los hongos durante la infección es otraposibilidad en el diagnóstico de las micosis. Estaposibilidad es más reciente que la detección deanticuerpos y antígenos y se encuentra endesarrollo. Actualmente se basa en la detección deD-arabinitol, (1→3)-β-D-glucano y ADN. El D-arabinitol es un metabolito producido por C. albicans,C. tropicalis, C. parapsilosis y C. kefyr que puededetectarse mediante cromatografía gas-líquido omediante una técnica enzimática comercializada enJapón. Se han detectado niveles elevados de D-arabinitol en pacientes con candidosis invasora y sumonitorización se ha mostrado útil en el seguimientode estos pacientes. La técnica presenta falsospositivos en pacientes con insuficiencia renal o entratamiento con esteroides y suele ser necesarioajustar las concentraciones de D-arabinitol conrespecto a las de creatinina o L-arabinitol. El D-arabinitol también puede detectarse en orina. Ladetección de (1→3)-β-D-glucano en plasma es otraposibilidad diagnóstica en las micosis producidas porCandida, Aspergillus, Pneumocystis y otros hongos.No es eficaz para la detección de C. neoformans,Mucorales, Trichosporon y basidiomicetos, engeneral. El ser humano carece de glucanasas paradigerir (1→3)-β-D-glucano y por tanto su eliminaciónes lenta. Existen varias pruebas comercializadaspara la detección (1→3)-β-D-glucano, siendo elFungitell® (anteriormente denominada Glucatell®,Associates of Cape Cod) la más recientementecomercializada y la que puede obtenerse en nuestropaís. Las pruebas para detectar (1→3)-β-D-glucanopueden presentar falsos positivos en pacientessometidos a hemodiálisis con aparatos que tenganmembranas de acetato de celulosa, o en tratamientocon albúmina, inmunoglobulinas, algunos agentesanticancerosos y sulfamidas. La aparición de nuevastécnicas moleculares abre un nuevo camino en eldiagnóstico de la infección fúngica, la detección deácidos nucleicos. Se utilizan métodos de hibridacióny amplificación convencionales junto a nuevossistemas de PCR a tiempo real (Light Cycler). Elinconveniente fundamental de dichas técnicas es elelevado coste, la necesidad de personal

especializado, falta de pruebas normalizadascomerciales y la falta de estudios que demuestrenque tipo de muestra y procedimiento es el másindicado.

11.5. INFORMACIÓN DE LOS RESULTADOSEl laboratorio de microbiología no ha de ser un

emisor de datos cualitativos o cuantitativos de lasdeterminaciones realizadas, ha de emitir un informeque interprete el conjunto de dichos datos, sobretodo cuando aparezcan resultados dudosos o dedifícil interpretación. El microbiólogo ha de conocer lasituación clínica del paciente en estudio para de estamanera realizar una adecuada interpretación yrealizar una certera explicación. La mayoría de estosresultados serológicos han de ir acompañados deuna alta sospecha clínica y de la utilizaciónsimultánea de distintas técnicas para aumentar lasensibilidad diagnóstica. La realización de lastécnicas serológicas descritas anteriormente nosupone una gran demora a la hora de emitir elresultado, el único inconveniente es, en alguna deellas, la necesidad de procesar sueros seriados decada paciente, como es el caso del antígenogalactomanano y manano. Esto no es así en el casode la detección de antígenos capsulares deCryptococcus neoformans, en el que un únicoresultado positivo es suficiente para realizar eldiagnóstico.

11.6. PROCEDIMIENTOS NO ACEPTADOSNo se deben aplicar para el diagnóstico ensayos

fabricados en el propio laboratorio que no garanticenla adecuada calidad de los resultados. Se debenseguir las instrucciones del fabricante en los ensayoscomerciales y, en caso contrario, se deben notificarlos cambios que se produzcan en el procedimientonormalizado de trabajo. No deben ser aceptablesinformes que no sean inteligibles para el clínico o noquede reflejado claramente el ensayo que se harealizado con la adecuada interpretación.

12. BIBLIOGRAFIA1. Clinical Laboratory Standards Institute. Method for

Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing ofYeasts. Approved Guideline, M44-A. Wayne, Pa.2004.

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4. Cuenca-Estrella M. Infecciones por Candida spp.Infecciones superficiales y profundas, 8ª ed, vol. 68.Ediciones Doyma S.L., Barcelona. 2002.

5. Cuenca-Estrella M. Infecciones profundas por otroshongos patógenos humanos, 8ª ed, vol. 68.Ediciones Doyma S.L., Barcelona. 2002.

6. Cuenca-Estrella M, Moore CB, Barchiesi F, Bille J,Chryssanthou E, Denning DW, Donnelly JP, DromerF, Dupont B, Rex JH, Richardson MD, Sancak B,Verweij PE, Rodriguez-Tudela JL. Multicenter

22

evaluation of the reproducibility of the proposedantifungal susceptibility testing method forfermentative yeasts of the Antifungal SusceptibilityTesting Subcommittee of the European Committeeon Antimicrobial Susceptibility Testing (AFST-EUCAST). Clin Microbiol Infect 2003. 9:467-474.

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12. Gavaldà Santapau J, Ausina V. Infecciones porAspergillus, 8ª ed, vol. 68. Ediciones Doyma S.L.,Barcelona.2002

13. Gómez-López A, Aberkane A, Petrikkou E, MelladoE, Rodríguez-Tudela JL, Cuenca-Estrella M.Analysis of the influence of Tween concentration,inoculum size, assay medium, and reading time onsusceptibility testing of Aspergillus spp. J ClinMicrobiol 2005; 43:1251-1255.

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PNT-MIC-01EXAMEN MICROSCÓPICO CON HIDRÓXIDO POTÁSICO (KOH)

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ........................... La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-MIC-01Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Examen microscópico con hidróxidopotásico (KOH) Edición Nº 01 Página 2 de 3

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la realización del examen

microscópico con hidróxido potásico (KOH) demuestras clínicas para detectar la presencia deelementos fúngicos. Este procedimiento es aplicable atodos los laboratorios de microbiología clínica.

2. FUNDAMENTOEs una técnica sencilla que permite la observación

inmediata de la muestra clínica. Su utilidad en eldiagnóstico de las micosis superficiales y comoorientación diagnóstica en las micosis profundas eselevada. Es el medio de montaje de las muestrasclínicas más universalmente aceptado. Permiteclarificar todo tipo de muestras clínicas conabundantes células y restos celulares y así observarla morfología y la pigmentación fúngica. El KOHdisuelve más rápidamente los elementos celularesque los hongos (protegidos por la pared celular). Elefecto clarificador del KOH puede demorar desde 10minuntos hasta horas, en el caso de las muestras deuñas, y puede reducirse calentando ligeramente lapreparación. Se suelen utilizar dos concentraciones,una mayor, del 20-30% para uñas, y otra del 10%para el resto de muestras. Si no se utiliza concolorantes, las preparaciones deben estudiarse conun microscopio de contraste de fases o, en sudefecto, con uno convencional diafragmando elcondensador para aumentar el contraste.

Esta técnica es útil para la observación deescamas, pelos, uñas, exudados o biopsias. Laadición del glicerol previene la degradación de loselementos fúngicos, evita la formación de cristales yla deshidratación de la preparación entre porta ycubre, convirtiéndola en semipermanente. Lasolución de KOH/glicerol es la más utilizada.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de “Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología”, 2003.

4. MUESTRASCualquier tipo de muestra clínica: escamas, pelos,

uñas, exudados, secreciones respiratorias, líquidosorgánicos o biopsias.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS- KOH- Glicerol- Agua destilada

6. APARATOS Y MATERIALES- Portaobjetos- Cubreobjetos 20x20- Pipetas desechables- Microscopio de campo brillante

7. PROCESAMIENTO7.1. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE KOH AL10%- KOH 10 g.- Glicerol 20 ml.- Agua destilada 80 ml.- Añadir 10 g de KOH a 40 ml de agua destilada y

disolver completamente, luego añadir 20 ml deglicerol y, por último, añadir agua destilada hastacompletar 100 ml. Mezclar por agitación. La soluciónno debe almacenarse en un recipiente de vidrio, puesse pueden formar precipitados.

7.2. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA- Poner la muestra sobre el porta.- Añadir una gota de KOH.- Poner un cubre.- Calentar suavemente en mechero Bunsen o a 55ºC

durante algunos minutos. En el caso de uñas, dejartoda una noche en estufa de 55ºC (el calentamientofavorece la digestión de las células de la muestra,elimina las burbujas y la formación de cristales).

- Observar microscópicamente a bajo aumento (10x) yconfirmar con 40x. Las preparaciones negativas sepueden observar al día siguiente.

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN YEXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

- Los resultados positivos deben informarse: “seobservan estructuras fúngicas compatibles conhongo filamentoso” o “se observan estructurasfúngicas compatibles con levaduras”.

- Los resultados negativos deben informarse: “no seobservan estructuras fúngicas”.

9. RESPONSABILIDADESDeben estar descritas en el manual general de

organización del laboratorio de micología y en lasfichas de descripción de los puestos de trabajo. Elprocedimiento deberá llevarse a cabo por personalcualificado con un entrenamiento específico. Lasupervisión de la técnica y de los resultados emitidosdeberá realizarla el facultativo especialistaresponsable del laboratorio de micología.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiología

deberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de microbiología.

Es preferible que el montaje de las preparacionesse realice en una cabina de flujo laminar concapacidad de proteger al personal que manipula lamuestra.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLos problemas que presenta la interpretación de la

visualización microscópica directa tienen que ver,sobre todo con la experiencia del observador, dadoque ciertas estructuras presentes en la muestra

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Examen microscópico con hidróxidopotásico (KOH) Edición Nº 01 Página 3 de 3

(fibrina, gotas de grasa, células, etc.) pueden confundira observadores inexpertos.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Clinical microbiology procedures handbook. 2ª

edición. Editor HD Isenberg. 2005. American Societyfor Microbiology. Washington DC, USA.

2. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Jorgensen JH,Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology.8ªed. American Society for Microbiology. WashingtonDC. 2003.

3. Pemán J, Martín Mazuelos E, Rubio MC. (Eds). Guíapráctica de identificación y diagnóstico en MicologíaClínica. 2ª edición. Bilbao: Revista Iberoamericana deMicología, 2006.

PNT-MIC-02EXAMEN MICROSCÓPICO CON BLANCO DE CALCOFLÚOR

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ........................... La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-MIC-02Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Examen microscópico con blanco decalcoflúor Edición Nº 01 Página 2 de 3

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la realización del

examen microscópico con blanco de calcoflúor demuestras clínicas para detectar la presencia deelementos fúngicos. Este procedimiento es aplicable atodos los laboratorios de microbiología clínica.

2. FUNDAMENTOEs una técnica sencilla que permite la

observación inmediata de la muestra clínica. Suutilidad en el diagnóstico de las micosis superficialesy como orientación diagnóstica en las micosisprofundas es elevada.

El blanco de calcoflúor es un agente blanqueadorfluorescente que, en solución o aplicado a unsustrato, absorbe la radiación en el ultravioletacercano (350 nm) y emite la mayoría de la energíaabsorbida en la región azul del espectro visible (430nm). Presenta una gran afinidad por las unionesbeta-glucosídicas (glucanos, quitina, celulosa)presentes en los hongos y otros organismos, peroausentes en los tejidos de mamíferos. Su altaafinidad por la quitina, glucano y celulosa losconvierte en marcadores ideales de la estructurafúngica, ya sea en la muestra clínica como en elcultivo posterior. Se trata de un método diagnósticoen tiempo real (1-2 min). En el momento actual esuna herramienta difícilmente prescindible en loslaboratorios de micología.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de la

SEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de “Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología”, 2003.

4. MUESTRAS Cualquier tipo de muestra clínica: escamas, pelos,uñas, exudados, secreciones respiratorias, líquidosorgánicos o biopsias.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS- Blancophor P (Bayer Cat. nº C52349), Calcoflúor

White M2R o Fluorescent Brightener 28 (Sigma-Aldrich Cat. nº F3543, ICN Ref. nº 158067).

- Solución de KOH al 20%- Azul de Evans- Agua destilada

6. APARATOS Y MATERIALES- Portaobjetos- Cubreobjetos 20x20- Pipetas desechables- Microscopio de fluorescencia.- Sistema de iluminación: la intensidad de la

fluorescencia de los agentes blanqueadores no haceimprescindible el uso de una lámpara de vapor de

mercurio en el microscopio de fluorescencia, siendosuficiente una lámpara halógena.- Filtros: es imprescindible utilizar un sistema de

filtros adecuado ya que los filtros tradicionalmenteusados en laboratorio de microbiología (auramina-naranja de acridina-FITC) con un filtro excitadorcentrado en 470 nm son totalmente ineficaces conestos fluorocromos. El juego de filtros más ajustadoa los datos espectrales básicos de estas moléculassería un Ultravioleta UV (Exc: 330-380/EspDic:400/Bar: 420) que origina una fluorescencia delhongo azul-plata. Otra posibilidad es un Violeta V(Exc: 380-420/EspDic: 430/Bar: 450) aunque elhongo se vería de un color verdoso. El Azul-VioletaBV (Exc: 400-440/EspDic: 455/Bar: 470) tambiénsería útil, con la ventaja de que con este filtrotambién se excitan dos de los fluorocromos másutilizados en laboratorio de microbiología: auraminay naranja de acridina.

7. PROCESAMIENTO7.1. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DECALCOFLÚOR- Calcoflúor (0,05 g), azul de Evans (0,02 g), agua

destilada (50 ml).- Mezclar y calentar suavemente (añadir unas gotas de

NaOH al 50% para obtener la total disolución).- Almacenar a temperatura ambiente en oscuridad.

7. 2. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA- Colocar la muestra en un porta.- Añadir una gota de calcoflúor.- Añadir una gota de KOH al 20%.- Cubrir con un cubre.- Calentar suavemente el porta.

- Observar al microscopio de fluorescencia a 420 nma bajo aumento (10X y 40X).

- En el caso de frotis fijados, es conveniente teñirdurante 3 min, lavar con agua y montar, de estaforma se reducen la coloración de fondo y losartefactos.

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓNDE LOS RESULTADOS- Los resultados positivos deben informarse: “se

observan estructuras fúngicas compatibles conhongo filamentoso” o “se observan estructurasfúngicas compatibles con levaduras”.

- Los resultados negativos deben informarse: “no seobservan estructuras fúngicas”.

9. RESPONSABILIDADESDeben estar descritas en el manual general de

organización del laboratorio de micología y en lasfichas de descripción de los puestos de trabajo.

El procedimiento deberá llevarse a cabo porpersonal cualificado con un entrenamientoespecífico. La supervisión de la técnica y de losresultados emitidos deberá realizarla el facultativoespecialista responsable del laboratorio demicología.

PNT-MIC-02Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Examen microscópico con blanco decalcoflúor Edición Nº 01 Página 3 de 3

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiología

deberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de Microbiología.

Es preferible que el montaje de las preparacionesse realice en una cabina de flujo laminar concapacidad de proteger al personal que manipula lamuestra.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOA diferencia de otras técnicas de microscopía de

exámen directo, la alta intensidad de fluorescencia delblanco de calcoflúor y su escaso fading (escasapérdida de intensidad de fluorescencia) permite ladetección fúngica, desde mínimos aumentos y a plenaluz del día. Se trata, pues, de una técnica deaprendizaje rápido que no requiere de granexperiencia, pues los artefactos son fácilmentereconocidos.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Harrington BJ, Hageage GJ. Calcoflúor white: tips for

improving its use. Clin Microbiol Newslet 1991; 13:3-5.

2. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Jorgensen JH,Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology.8ªed. American Society for Microbiology. WashingtonDC. 2003.

3. Pemán J, Martín Mazuelos E, Rubio MC. (Eds). Guíapráctica de identificación y diagnóstico en MicologíaClínica. 2ª edición. Bilbao: Revista Iberoamericana deMicología, 2006.

4. Rüchel R, Behe M, Torp B, Laatsch H. Usefulness ofoptical brighteners in medical mycology. Rev IberMicol 2001; 18:147-149.

PNT-MIC-03EXAMEN MICROSCÓPICO CON TINTA CHINA

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ........................... La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-MIC-03Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Examen microscópico con tinta chinaEdición Nº 01 Página 2 de 2

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la realización del

examen microscópico con tinta china de muestrasclínicas para detectar la presencia de elementosfúngicos. Este procedimiento es aplicable a todos loslaboratorios de microbiología clínica.

2. FUNDAMENTOPara la detección de la cápsula polisacarídica

extracelular de algunos hongos se utilizansuspensiones coloidales de partículas de carbón. Esla técnica de tinción negativa más ampliamenterecogida en la literatura para poner de manifiesto lacápsula de Criptococcus neoformans. Muy útil parala búsqueda de esta levadura en LCR tras lacentrifugación y en otras muestras (lavadobroncoalveolar, biopsias).

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de “Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología”, 2003.

4. MUESTRASLCR, lavado broncoalveolar o biopsias.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS- Tinta china de buena calidad pues no todas son

adecuadas. Se puede añadir Thimerosal (Sigma) al0,3 % como conservante y una gota de detergentepara mantener las partículas de carbón ensuspensión.

6. APARATOS Y MATERIALES- Portaobjetos- Cubreobjetos 20x20- Pipetas desechables- Microscopio de campo brillante

7. PROCESAMIENTO7.1. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA- Colocar una gota de la muestra en un portaobjetos

limpio y desengrasado.- Añadir una gota de tinta china.- Mezclar evitando formar burbujas. Si la tinta es

demasiado oscura diluir con agua a 1/3. Lapreparación debe ser fina y su color marrón, nonegro. La cantidad de tinta no debe ser ni excesiva niescasa, ya que, en ambos casos, el riesgo deartefactos se incrementa. Es importante manipularcon cuidado el frasco de tinta evitando todo contactocon la muestra clínica que pueda contaminarlo y asíproducir falsos positivos.

- Cubrir con un cubre.- Observar al microscopio a bajo aumento (10X y 40X).

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN YEXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

- La presencia de formas redondas rodeadas de unhalo grande y transparente sobre un fondo negro sonsugestivas de C. neoformans.

- Los resultados positivos deben informarse: “seobservan levaduras capsuladas compatibles con C.neoformans”.

- Los resultados negativos deben informarse: “no seobservan estructuras fúngicas”.

9. RESPONSABILIDADESDeben estar descritas en el manual general de

organización del laboratorio de micología y en lasfichas de descripción de los puestos de trabajo.El procedimiento deberá llevarse a cabo por personalcualificado con un entrenamiento específico. Lasupervisión de la técnica y de los resultados emitidosdeberá realizarla el facultativo especialistaresponsable del laboratorio de micología.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiología

deberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de Microbiología.

Es preferible que el montaje de las preparacionesse realice en una cabina de flujo laminar concapacidad de proteger al personal que manipula lamuestra.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOAunque la técnica es muy rápida y sencilla, la

sensibilidad de la técnica es del 50% en pacientes noinfectados por el VIH y del 70-88% en los infectadospor el VIH con meningitis criptocócica.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Clinical microbiology procedures handbook. 2ª

edición. Editor HD Isenberg. 2005. American Societyfor Microbiology. Washington DC, USA.

2. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Jorgensen JH,Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology.8ªed. American Society for Microbiology. WashingtonDC. 2003.

3. Pemán J, Martín Mazuelos E, Rubio MC. (Eds). Guíapráctica de identificación y diagnóstico en MicologíaClínica. 2ª edición. Bilbao: Revista Iberoamericana deMicología, 2006.

PNT-MIC-04TINCIÓN ARGÉNTICA RÁPIDA(Gomori-Grocott modificada)

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ........................... La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-MIC-04Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Tinción argéntica rápida(Gomori-Grocott modificada)

Edición Nº 01 Página 2 de 3

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la visualización

microscópica de Pneumocystis jiroveci, aunquetambién pueden detectarse otros hongos, mediantetinción argéntica rápida. Este procedimiento esaplicable a todos los laboratorios de microbiologíaclínica.

2. FUNDAMENTOP. jiroveci sigue siendo de los pocos agentes

infecciosos que se resiste a ser cultivado. Aunque lasnuevas técnicas de biología molecular han resuelto suincierta situación taxonómica y ayudan a comprendersu biología y epidemiología, e incluso, permiten ladetección de genes de resistencia, su diagnósticotodavía recae en su visualización microscópica.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMCnº 1a de “Recogida, transporte y procesamientogeneral de las muestras en el laboratorio demicrobiología”, 2003.

4. MUESTRASEsputo inducido, aspirado bronquial, lavado

broncoalveolar o biopsia pulmonar.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS- Agente mucolítico (Ditiotreitol o N-acetil cisteína).- Agua destilada.- PBS.- Solución de ácido crómico al 10 %.- Metabisulfito sódico al 1%.- Solución de metenamina-nitrato de plata (20 ml de

metenamina al 3 %, 1 ml de nitrato de plata al 5 %,1,5 ml de borato sódico al 5 % y 17 ml de aguadestilada).

- Solución de cloruro de oro (III) al 1%.- Solución de tiosulfato sódico al 5%.- Solución de verde brillante en ácido acético glacial al

0,2%.- Entellán.

6. APARATOS Y MATERIALES- Portaobjetos- Cubreobjetos 20x50- Cubeta para tinciones- Vórtex- Centrífuga- Estufa de 37ºC- Microondas- Microscopio de campo brillante

7. PROCESAMIENTO7.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA- El adecuado procesamiento de las muestras es un

paso crítico en el diagnóstico microscópico de laneumocistosis.

- Esputo:- Añadir a 2-3 ml del esputo el mismo volumen deDitiotreitol al 0,3% (1,5 g en 500 ml aguadestilada).- Agitar e incubar 5 min a 37ºC.- Añadir un volumen igual de PBS y agitar hastaconseguir una buena mezcla.- Centrifugar a 1.500xg, 10 min.- Retirar el sobrenadante y resuspender elsedimento con 500 µL de PBS.Si no se ha eliminado todo el moco de la muestra,se repiten los pasos 1 y 2.

- Aspirado bronquial y LBA:- Centrifugar la muestra a 1.500xg, 10 min.- Retirar el sobrenadante.- Resuspender el sedimento en un pequeñovolumen de PBS hasta que la densidad delmaterial no sea excesiva.

- Tras la preparación y concentración, se puededepositar directamente una gota del sedimento en elcentro de un portaobjetos o utilizar 200 µL para lacitocentrífuga. Secar al aire y fijar con metanol.

7.2. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA- Cubrir el portaobjetos con la muestra fijada con una

solución de ácido crómico al 10%, dejando actuardurante 10 minutos. (Se puede acortar al utilizar unmicroondas durante 40 segundos).

- Lavar el portaobjetos con agua destilada.- Cubrir con una solución de metabisulfito sódico al 1%

durante 1 min.- Lavar con agua destilada e introducir el portaobjetos

en un recipiente donde se ha preparado previamente,justo en el momento de realizar la tinción, la soluciónde trabajo de metenamina-nitrato de plata.

- Tapar el recipiente e introducir en un microondas, al50% de su potencia, durante aproximadamente 60segundos (si el microondas no tuviese plato giratorio,debe pararse a los 30 segundos, girar el recipiente90º y volver calentar otros 30 segundos).Posteriormente, mantener la solución calientedurante 2 min (deberá tomar un color marrónoscuro). En caso de que no se disponga demicroondas, se puede utilizar un baño de agua a80ºC, donde se coloca el recipiente con la soluciónde teñido 6 min antes de colocar en el mismo elportaobjetos. Se mantiene en esas condicionesdurante otros 5 min, debiendo cambiar el color de lasolución, como en el caso anterior, de marrón anegro.

- Transcurrido el tiempo correspondiente, sacar elportaobjetos y lavar con agua destilada.

- Sumergir el portaobjetos en una solución de clorurode oro al 1% de 2 a 5 segundos; seguidamente, lavarcon agua destilada.

- Cubrir el portaobjetos con una solución de tiosulfatosódico al 5% durante 1 min. Lavar de nuevo conagua destilada.

- Cubrir con una solución al 0,2% de verde brillante enácido acético glacial durante 1 min. Lavar con aguadestilada, escurrir el portaobjetos y dejar secar.

PNT-MIC-04Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Tinción argéntica rápida(Gomori-Grocott modificada)

Edición Nº 01 Página 3 de 3

- Montar la preparación con cubreobjetos y Entellán.- Examinar la preparación a bajo aumento (20X, 40X)

y confirmar a 100X.

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓNDE LOS RESULTADOS

- La pared de los quistes de P. jiroveci se tiñenirregularmente de color gris-marrón, con aspecto deuva pasa.

- El interior de los quistes no se tiñe con esta tinción.- La presencia de formas redondeadas de color gris o

marrón oscuro con la pared engrosasda en forma dedoble coma es característica de P. jiroveci.

- Los resultados positivos deben informarse: “seobservan quistes de P. jiroveci”.

- Los resultados negativos deben informarse: “no seobservan quistes de P. jiroveci”.9. RESPONSABILIDADES

Deben estar descritas en el manual general deorganización del laboratorio de micología y en lasfichas de descripción de los puestos de trabajo.

El procedimiento deberá llevarse a cabo porpersonal cualificado con un entrenamientoespecífico. La supervisión de la técnica y de losresultados emitidos deberá realizarla el facultativoespecialista responsable del laboratorio demicología.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiología

deberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de Microbiología.

Es preferible que el montaje de las preparacionesse realice en una cabina de flujo laminar concapacidad de proteger al personal que manipula lamuestra.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLa tinción argéntica se realiza en aproximadamente 2

horas y requiere experiencia para distinguir la morfologíade P. jiroveci.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Clinical microbiology procedures handbook. 2ª

edición. Editor HD Isenberg. 2005. American Societyfor Microbiology. Washington DC, USA.

2. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Jorgensen JH,Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology.8ªed. American Society for Microbiology. WashingtonDC. 2003.

3. Pemán J, Martín Mazuelos E, Rubio MC. (Eds). Guíapráctica de identificación y diagnóstico en MicologíaClínica. 2ª edición. Bilbao: Revista Iberoamericana deMicología, 2006.

PNT-MIC-05DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO POR CULTIVO CONVENCIONAL

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ........................... La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-MIC-05Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Diagnóstico micológico por cultivoconvencional Edición Nº 01 Página 2 de 7

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la el diagnóstico de las

micosis mediante cultivo.Este procedimiento es aplicable a todos los

laboratorios de microbiología clínica. Sólo en el casode sospecha de micosis primaria endémica por hongosdimórficos, serán necesarias unas instalaciones deseguridad determinadas.

2. FUNDAMENTOEl cultivo es el método de referencia para el

diagnóstico de las micosis. Tiene el problema de lademora diagnóstica cuando se trata de hongos decrecimiento lento, y actualmente se complementacon otros procedimientos para el diagnóstico de lasmicosis invasoras. Todavía hoy es prácticamente elúnico método junto con los exámenes directos parael diagnóstico de las micosis superficiales y cutáneomucosas.

Según las necesidades, se utilizan diferentes tiposde medios de cultivo:

- Generales: no tienen inhibidores. El máscaracterístico y clásico es el agar glucosado deSabouraud (AGS), que se utiliza frecuentementepara la observación y descripción de lascaracterísticas morfológicas de la mayoría de loshongos.

- Enriquecidos: se utilizan especialmente enmicosis sistémicas endémicas (histoplasmosis,coccidioidomicosis, etc.), un ejemplo es el agarcerebro-corazón con sangre de carnero (BHI).

- Selectivos: son medios que favorecen elaislamiento de los microorganismos deseados,impidiendo el de otros. Los componentes másutilizados como agentes selectivos sonantibacterianos (cloranfenicol, gentamicina), ytambién inhibidores de hongos como lacicloheximida (actidiona), que es especialmenteútil en las muestras cutáneas y respiratorias, si sesospecha en estas últimas la presencia dehongos dimórficos.

- Diferenciales: se utilizan para ayudar a laidentificación del hongo según el aspecto queadquieren en ese medio: para ello se añadensustancias cromógenas e indicadores de pH: sonejemplo los agares cromógenos para eldiagnóstico/identificación de levaduras.

- Especializados: son aquellos medios quecontienen algún componente destinado a aislarun agente concreto o a favorecer suidentificación. Es el caso de los medios conextracto de Guizottia abyssinica que permiten elaislamiento e identificación de C. neoformans.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Documento científico de este procedimiento- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de “Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología”, 2003.- Procedimientos específicos mencionados en labibliografía de este PNT (punto 12).

4. MUESTRASEn el laboratorio de micología se diagnostican

infecciones de etiología fúngica de cualquierprocedencia. Las distintas muestras que se estudianson:

- Pelos- Uñas- Piel- Espacios interdigitales- Pus, exudados y drenajes- Muestras oculares- Muestras respiratorias- Líquidos estériles- Orina- Biopsias- Otras muestras.

Quedan excluidas en este apartado las muestras deexudado vaginal/cervical si se realizan la toma demuestras en una consulta específica y loshemocultivos, aunque los posibles aislamientosfúngicos obtenidos a partir de estas muestras debenser remitidos a este laboratorio de micología para suidentificación.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS- Dextrosa.- Sacarosa.- Ácido cafeico.- Peptona.- Agar.- Agua destilada.- Cloranfenicol.- Etanol 96%.- Acetona.- Actidiona/cicloheximida.- Azul de bromotimol.- Extracto de levadura.- Yeast carbon base.- Yeast nitrogen base.- Corn meal agar liofilizado.- Rice extract agar liofilizado.- Rojo fenol.- Fitona.- Base urea de Christensen.- HCl.- NaOH.- Gentamicina.- Clortetraciclina.- Placas de agar con sangre de carnero.

También se puede disponer de medios de cultivoscomerciales liofilizados o de tubos y placas conmedio de cultivo comercializado.

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Diagnóstico micológico por cultivoconvencional Edición Nº 01 Página 3 de 7

6. APARATOS Y MATERIALES- Incubador de 37 ± 2ºC con CO2.- Incubador de 30 ± 2ºC.- Incubador de 45 ± 2ºC- Asas bacteriológicas estériles.- Tubos de vidrio de boca ancha con tapón de rosca.- Placas de Petri estériles (referencia)- Autoclave.- Lavaplatos.- Pipetas Pasteur estériles.- Escobillones o torundas estériles.

7. PROCESAMIENTO7.1. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.7.1.1. Sabouraud dextrosa agar.

- Dextrosa ............... 40 g- Peptona................. 10 g- Agar ...................... 15 g- Agua destilada ...... 1000 ml

Ajustar pH a 5,6.Disolver los ingredientes mediante ebullición,dispensar en tubos y autoclavar 10 minutos a unaatmósfera de presión (121°C). Para la preparaciónde medios de cultivo en placas, disolveringredientes mediante ebullición, autoclavar 10minutos y dispensar en las placas con el espesorsuficiente para evitar la desecación.

7.1.2. Sabouraud dextrosa agar. Modificación deEmmons

- Dextrosa .................... 20 g- Peptona...................... 10 g- Agar ........................... 17 g- Agua destilada ......1000 ml

Ajustar pH a 6,9.Disolver los ingredientes mediante ebullición,dispensar en tubos y autoclavar 10 minutos a unaatmósfera de presión. Para la preparación de losmedios de cultivo en placas, disolver ingredientesmediante ebullición, autoclavar 10 minutos ydispensar en las placas con el espesor suficientepara evitar la desecación.

7.1.3. Sabouraud dextrosa agar. Modificación deEmmons con inhibidores.7.1.3.1. Solución madre de cloranfenicol:

- Cloranfenicol base.... 500 mg- Etanol ......................... 100 ml

7.1.3.2. Solución madre de actidiona/cicloheximida:- Cicloheximida ................. 5 g- Acetona ................... 100 ml

7.1.3.3. Sabouraud (Emmons) con cloranfenicol:Preparar como se especifica en el punto 7.1.2, peroañadir 10 ml de solución madre de cloranfenicol porlitro de medio antes de autoclavar.

7.1.3.4. Sabouraud (Emmons) con cloranfenicol yactidiona:Preparar como en el punto 7.1.3.3, pero añadiendo,además, 10 ml de solución madre de actidiona por litrode medio antes de autoclavar.7.1.4. Preparación de medio de auxonograma decarbono (para levaduras):

- Yeast Nitrogen base ......….......... 6,7 g- Agar ............................................. 20 g- Agua destilada........................... 1.000 ml

Disolver por ebullición y dispensar en tubos a razón de20 ml, autoclavar y almacenar a 4°C.7.1.5. Preparación de medio de auxonograma denitrógeno:

- Yeast carbon base …….…............. 12 g- Agar ............................................ 20 g- Agua ......................................... 1000 ml

Disolver por ebullición y dispensar en tubos a razón de20 ml, autoclavar y almacenar a 4°C.7.1.6. Preparación el medio agar harina de maíz(Corn meal agar, CMA):

- Corn meal agar ........………......... 8,5 g- Agua ............................................ 500 ml

7.1.7. Preparación del medio de arroz con Tween:- Rice extract (Referencia) ............ 12,5 g- Agua .......................................... 500 ml- Tween 80 .................................... 1,5 ml

Disolver por ebullición, dispensar en tubos tapón derosca a razón de 20 ml por tubo y autoclavar.7.1.8. DTM (Dermatophyte test medium):

- Fitona .................................................10 g- Dextrosa ............................................ 10 g- Agar ................................................. 20 g- Solución de rojo fenol ..................... 40 ml- HCl 0,8 M ........................................ 6 ml- Cicloheximida ................................. 0,5 g- Gentamicina (sulfato) ..................... 0,1 g- Clortetraciclina (clorhidrato) .......... 0,1 g- Agua destilada .............................1000 ml

- Disolver la dextrosa, la fitona y el agar por ebulliciónen baño.- Añadir 40 ml de la solución de rojo fenol (0,5 g de rojofenol en 15 ml de 15 ml de NaOH 0,1 N y completarhasta 100 ml con agua destilada), sin dejar de agitar.- Añadir el HCl sin dejar de agitar.- Disolver la gentamicina en 2 ml de agua y añadir almedio sin dejar de agitar.- Autoclavar a una atmósfera durante 10 minutos.- Dejar enfriar hasta aproximadamente 47°C.- Disolver la clortetraciclina en 25 ml de agua destiladaestéril en contenedor estéril y añadir al medio.- Dispensar en tubos estériles con tapón de rosca arazón de 30 ml por tubo. Conservar a 4°C.- El medio debe tener color amarillo y un pH final de5,5 ± 0,1.7.1.9. Caldo de fermentación para levaduras:

- Azul de bromotimol .................................... 0,04 g- Extracto de levadura .................................. 4,50 g- Peptona ...................................................... 7,50 g- Agua destilada ....................................1000,00 ml

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Diagnóstico micológico por cultivoconvencional Edición Nº 01 Página 4 de 7

7.1.9.1. Solución madre de carbohidratos:- Carbohidrato ............................................. 6 g- Agua destilada ................................... 100 ml

-Esterilizar mediante filtración por filtro de 0,22 µm detamaño de poro.- Disolver el azul de bromotimol en 3 ml de etanol 96%y añadir a los otros ingredientes.- Dispensar en alícuotas de 2 ml en tubos con tapón derosca.- Colocar una campana de Durham (boca abajo) encada tubo.- Autoclavar a una atmósfera durante 15 minutos.- Añadir 1 ml de cada uno de los diferentescarbohidratos a ensayar, un carbohidrato por tubo,lógicamente. Una vez añadido el carbohidrato, lostubos de caldo se pueden conservar en el refrigeradordurante un mes.7.1.10. Czapek dox:

- Sacarosa .................................................. 30 g- Nitrato sódico ........................................... 3 g- Fosfato dipotásico ................................... 1 g- Sulfato magnésico ................................... 0,5 g- Cloruro potásico ....................................... 0,5 g- Sulfato ferroso ......................................... 0,01 g- Agar .......................................................... 15 g- Agua destilada ...................................... 1000 ml

pH final 7,3Se disuelven los componentes por ebullición.Autoclavar 15 minutos a una atmósfera de presión(121°C) y dispensar asépticamente en las placas dePetri.7.1.11. Agar ácido cafeico:

- Glucosa ...................................................... 5 g- Sulfato amónico .......................................... 5 g- Fosfato potásico ......................................... 0,8 g- Sulfato magnéscio ...................................... 0,8 g- Ácido cafeico ............................................. 0,18 g- Solución de citrato férrico ............................ 4 ml- Agar ............................................................... 20 g- Agua destilada ...................................... 1000 ml

La solución de citrato férrico contiene 10 mg de citratoen 20 ml de agua.Mezclar todos los ingredientes, autoclavar durante 12minutos y dispensar en placas.7.1.12. Urea de Christensen:

- Base de la urea de Christense...................... 29 g- Agua destilada ........................................... 100 ml

Mezclar y esterilizar por filtración.- Agar ................................................................ 15 g- Agua destilada .......................................... 900 ml

Disolver por ebullición y esterilizar medianteautoclavado 15 min a 121°C.Cuando el agar está a una temperatura aproximada de50°C se añaden los 100 ml de la base de urea deChristensen. Mezclar y dispensar en tubos estériles.

7.2 SIEMBRA E INCUBACIÓN:No existe un único medio de cultivo de elección

para realizar todo el diagnóstico micológico, por lo quela sospecha clínica debe orientar sobre los medios autilizar.

El medio Sabouraud con cloranfenicol y actidiona yel medio DTM son ideales para el cultivo dedermatofitos. En este último, el viraje del pH a alcalinoayuda a reconocer a los dermatofitos. Para recuperarlevaduras y otros hongos filamentosos es necesarioincluir medios sin actidiona, como el Sabouraudcloranfenicol. Para el cultivo de Malassezia spp. seránnecesarios medios que contengan ácidos grasos.

Se recomienda la incubación a 30°C, pero laincubación a temperatura ambiente puede seraceptable. Se deben utilizar preferentemente loscultivos en tubo porque evitan la deshidratación ypresentan menos riesgo de dispersión deesporas/conidias. Los tapones de rosca no debencerrarse herméticamente, pues todos los hongos sonpredominantemente aerobios. El periodo de incubacióndebe ser de 4 semanas, salvo que sólo se intentenrecuperar levaduras de crecimiento rápido.

7.3. IDENTIFICACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS.7.3.1. Levaduras.

Se puede realizar una identificación presuntivamediante la utilización de medios cromógenos (verPNT-MIC-06 de este procedimiento) queprácticamente han desplazado la realización del testde filamentación precoz. Para la identificación definitivaes necesaria la descripción morfológica obtenida en unmedio como el agar harina de maíz o el agar arroz conTween 80. La identificación morfológica requiereexperiencia y se basa en la presencia de estructurasde hifas verdaderas, pseudohifas, blastoconidias,clamidoconidias y artroconidias. Con la descripciónmorfológica se suele obtener una identificación degénero y, en ojos expertos, pude ser suficiente para laidentificación de las especies de levadura másfrecuentes en el laboratorio de microbiología clínica.

La identificación se complementa utilizando laspruebas de asimilación de carbohidratos y compuestosnitrogenados, los denominados auxonogramas decarbono, y de la presencia de fenol oxidasa y, si estono fuera suficiente, se completaría con pruebas defermentación de carbohidratos.El método tradicional para realizar el auxonograma escomo sigue:

- Preparar medios libres de fuentes de carbono ode nitrógeno, como los descritos anteriormente.- Emulsionar la levadura a identificar en el medio,previamente fundido y enfriado a 40°C.- Dispensar la emulsión se dispensa en placas dePetri.- Cuando el medio esté solidificado, añadir discosimpregnados con diferentes carbohidratos onitrogenados, según se trate.- Anotar si hay presencia de crecimiento alrededorde los diferentes discos.

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Diagnóstico micológico por cultivoconvencional Edición Nº 01 Página 5 de 7

Los auxonogramas se pueden sustituir por diferentesmétodos comerciales que se pueden consultar en elPNT-MIC-06 de este procedimiento.Para las pruebas de fermentación se utiliza el mediode fermentación con carbohidratos dispensados concampanas de Durham. La fermentación de uncarbohidrato determinado se reconoce por laacumulación de gas en la campana que,eventualmente, puede hacerla ascender.En el caso de sospecha de C. neoformans, la levaduraa identificar se sembrará en medio con ácido cafeicopara la detección de fenol oxidasa, característica deesta especie, y que se reconoce por la parición decolonias pigmentadas (marrón).7.3.2. Hongos filamentosos. La identificación de los hongos filamentosos sefundamenta en la descripción de característicasmorfológicas en medios de cultivo que son diferentessegún la sospecha, así:

- El agar Sabouraud, formulación original, es elutilizado en la mayoría de las descripciones dehongos filamentosos y es el de referencia en losdermatofitos.- El Czapek Dox es el utilizado para la descripciónde Aspergillus y Penicillium.- Se requieren medios especiales para laestimulación de pigmentos, esporas sexuales yconidias de determinadas especies (consultar eldocumento científico y la bibliografía de estedocumento).- La producción de ureasa puede ser útil para ladiferenciación de determinados hongosdermatofitos.

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN YEXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

- Los cultivos se deben observar diariamente los 3primeros días desde la siembra. Seguidamente, seprocede a realizar una lectura semanal hasta quecumplan su periodo de incubación.

- Los aislamientos sospechosos se deben identificar anivel de especie, sobre todo si proceden de muestrassignificativas.

- Salvo los hongos claramente patógenos, losaislamientos de hongos potencialmentecontaminantes de muestras poco representativasdeben ser valorados complementariamente con losexámenes microscópicos directos, y considerar elanálisis de más muestras para la valoración deaislamientos repetidos.

- Se debe transmitir al clínico la sospecha sobre laimplicación patogénica de un aislamientodeterminado.

9. CONTROL DE CALIDADLos programas de “control de calidad” aseguran que lainformación generada por el laboratorio esreproducible y adecuada. Para ello, es imprescindiblecontrolar la esterilidad de los medios caseros, laeficacia para reproducir las pruebas para las que estándiseñados y documentar la validez de todos losmedios.

9.1. MEDIDAS GENERALESTodos los medios, soluciones y reactivos deben ser

etiquetados con el nombre, código de catálogo,número de lote y fecha de caducidad. Igualmente,debe anotarse la fecha de primera utilización.

Todos los medios se deben inspeccionar en cuantoal color, desperfectos, humedad y posiblecontaminación en el momento en que se reciben. Elresultado de esta inspección debe quedar reflejada enlas hojas del control de calidad.

9.2. CONTROL DE LA ESTERILIDAD DE LOSMEDIOS PREPARADOS EN EL PROPIOLABORATORIO- Al azar, seleccionar el 5% de las unidades de cadamedio preparado.- Incubar la mitad de ellas a 35ºC durante tres días. Elresto de las unidades se incuban a 25ºC durante tresdías.- Inspeccionar los cultivos diariamente.- Si el 5% o menos de las unidades cultivadasmuestran contaminación, el lote es aceptable para suuso. Las unidades utilizadas para esta prueba no sereutilizarán. Los resultados se documentarán en elformato adecuado.- Si más del 5% del total de unidades ensayadasmuestra contaminación, el lote se debe comprobar denuevo siguiendo el mismo método y si se confirmamás de un 5% de unidades contaminadas el lote debeser rechazado.

9.3. CONTROL DE LA IDONEIDAD DE LOS LOTES- Se debe realizar una evaluación de la idoneidad delos medios, soluciones y reactivos con cada nuevolote. Los medios comerciales que se adquieren yapreparados están exentos de este procedimiento ysólo se requiere la inspección macroscópica,etiquetado y control de la fecha de caducidad.- Los controles de calidad de los medios comercialesdeben ser facilitados por los fabricantes.- Todos los microorganismos utilizados para loscontroles de calidad se deben mantener congeladosa -70ºC por un tiempo indefinido. Para el trabajohabitual, los hongos se mantienen a temperaturaambiente subcultivándose cada tres meses,renovando las cepas cada año a partir de lasalícuotas congeladas.

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Diagnóstico micológico por cultivoconvencional Edición Nº 01 Página 6 de 7

9.3.1. Control de los diferentes medios.Test de filamentación:

1) Candida albicans (ATCC 14053) ....................... Control positivo2) Candida tropicalis (ATCC 13803) .................... Control negativo

Urea de Christensen:1) Cryptococcus neoformans (ATCC 32045)............ Control positivo (rosa)2) Candida albicans (ATCC 14053) ...................... Control negativo.3) Trichophyton mentagrophytes (UTMB 422) ........ Control positivo (rosa)4) Trichophyton rubrum (UTMB 417) ..................... Control negativo5) No inoculado ................................................. Medio amarillo. No reacción

Agar harina de maíz/agar arroz con y sin Tween1) Candida albicans (ATCC 14053) .................... Crecimiento2) No inoculado ................................................. No crecimiento

Sabouraud cloranfenicol1) Candida albicans (ATCC 14053) ....................... Crecimiento2) Escherichia coli ................................................ No crecimiento3) No inoculado ............................................... No crecimiento

Sabouraud cloranfenicol actidiona1) Trichophyton mentagrophytes (UTMB 422) .......... Crecimiento2) Aspergillus flavus (CDC B-15) …………………… Crecimiento escaso o no crecimiento3) No inoculado ..................................................... No crecimiento

Czapek dox1) Aspergillus flavus (CDC B-15)................................ Crecimiento2) No inoculado …………………................................ No crecimiento

Agar ácido cafeico1) Cryptococcus neoformans (ATCC 32045) ………. Crecimiento. Colonia pigmentada marrón2) Cryptococcus albidus. (ATCC 34140) ................... Crecimiento. Colonia no pigmentada3) No inoculado. .......................................................... No crecimiento

Fermentación glucosa (levaduras)1) C. albican (ATCC 14053) ....................................... Control positivo2) C. lypolytica (ATCC 9773) ..................................... Control negativo

Fermentación maltosa (levaduras)1) C. albicans (ATCC 14053) ………………………… Control positivo2) C. lypolytica (ATCC 9773) ..................................... Control negativo

Fermentación sacarosa (levaduras)1) C. tropicalis (ATCC 13803) ..................................... Control positivo2) C. albicans (ATCC 14053) ………………………….. Control negativo

Fermentación lactosa (levaduras)1) C. kefyr (ATCC 28838) ............................................. Control positivo2) C. albicans (ATCC 14053) ………………………….. Control negativo

Fermentación galactosa (levaduras)1) C. albicans (ATCC 14053) …………………………. Control positivo2) C. lypolytica (ATCC 9773) ....................................... Control negativo

Fermentación trehalosa (levaduras)1) C. albicans (ATCC 14053) ……………………………Control positivo2) C. lypolytica (ATCC 9773) ........................................Control negativo

Fermentación celobiosa (levaduras)1) C. lusitaniae.(ATCC 24347) ...................................... Control positivo2) C. tropicalis (ATCC 13803) ........................................ Control negativo

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Diagnóstico micológico por cultivoconvencional Edición Nº 01 Página 7 de 7

10. RESPONSABILIDADESDeben estar descritas en el manual general de

organización del laboratorio de micología y en lasfichas de descripción de los puestos de trabajo.

El procedimiento deberá llevarse a cabo porpersonal técnico cualificado con un entrenamientoespecífico. La supervisión de la técnica y de losresultados emitidos deberá realizarla el facultativoespecialista responsable del laboratorio demicología.

11. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiología

deberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de Microbiología.

Los aislamientos con sospecha de que pudieranser hongos dimórficos de nivel 3 de seguridad debenser trasladados, evitando la apertura de los tubos decultivo, a un laboratorio de seguridad, donde serealizará la identificación.

12. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLa identificación de hongos dimórficos queda

reducida a los laboratorios que dispongan deinstalaciones de seguridad para el manejo demicroorganismos de nivel 3.

La implicación de un número creciente de especiesfúngicas en infecciones oportunistas hacen que no sedisponga, en ocasiones, de la experiencia adecuadapara la identificación de determinadas especiespotencialmente patógenas. En estos casos, las cepassospechosas deberán ser remitidas a un centro dereferencia.

13. BIBLIOGRAFÍA1. De Hoog GS, Guarro J. 2000. Atlas of clinical fungi.Centralbureau voor Schilmmelcultures/ Universitat Roviray Virgili. Baarn and Delf, The Netherlands, UniversitatRovira y Virgili, Reus, Spain2. Larone DH. Medically important fungi. A guide toidentification. 1995. Third edition. ASM Press.Washington D.C.3. Merz WG, Roberts GD. 1999. Detection and recoveryof fungi from clinical specimens, p. 588-600. In R. H.Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology. AmericanSociety for Microbiology, Washington D.C.4. Pemán J, Martín Mazuelos E, Rubio MC. 2006. Guíapráctica de identificación y diagnóstico en MicologíaClínica, 2 ed. Revista Iberoamericana de Micología,Bilbao.

PNT-MIC-06IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS MEDIANTE

MEDIOS DE CULTIVO CROMOGÉNICOS

ELABORADO REVISADO Y APROBADOJefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ........................... La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-MIC-06Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Identificación de levaduras mediantemedios de cultivo cromogénicos

Edición Nº 01 Página 2 de 2

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la identificación de

levaduras del género Candida utilizando medios decultivo cromogénicos.

2. FUNDAMENTOLa identificación de la especie de toda levadura

aislada en sangre u otro líquido corporal estéril estáplenamente justificada. Sin embargo, debido a que laslevaduras forman parte de la flora normal de piel ymucosas, su aislamiento en muestras nasofaríngeas,esputo, lavados bronquiales, orina, raspados de uñas,muestras vaginales o heces puede cuestionar susignificado clínico. No obstante, el aislamientoreiterado en diferentes muestras clínicas del mismopaciente, es sugestivo de infección y requiere laidentificación de la especie causal.

Los medios de cultivo cromogénicos están diseñadospara el aislamiento e identificación de algunasespecies del género Candida tras su incubación a 30-37 ºC durante 24-48 horas. Su fundamento consiste enla detección de determinadas actividades enzimáticasde las levaduras mediante la hidrólisis específica de unsustrato cromogénico en presencia de un indicador dela enzima. Pueden utilizarse para aislamiento primarioo, con fines de identificación, después del aislamientode las levaduras en los medios convencionales. Sólodebería utilizarse como medio de aislamiento primarioen aquellas muestras con alta sospecha de micosispor levaduras. Uno de las principales ventajas de estosmedios es permitir diferenciar fácilmente los cultivosmixtos. Entre los más utilizados se encuentran:

CHROMAGAR CANDIDA (CHROMagar Company)identifica C. albicans (colonias verdes), C. tropicalis(azules), C. krusei (rosas secas) y C. glabrata (rosasmucosas).

COLOREX CANDIDA (BioMed) identifica C. albicans(colonias verdes), C. tropicalis (azules- grisáceas), C.glabrata (rosas oscuro) y C. krusei (rosas rizadas).

CANDIDA ID2 (bioMérieux) identifica C. albicans(azules).

CANDISELECT (BioRad) identifica C. albicans(azules).

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de “Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología”, 2003.

4. MUESTRASTodo tipo de de muestras clínicas: exudados,

secreciones respiratorias, líquidos orgánicos, orina,sangre, biopsias, etc.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS- Asas de siembra- Pipetas estériles

6. APARATOS Y MATERIALES- Estufa de 37ºC

7. PROCESAMIENTO Y REALIZACIÓN DE LATÉCNICA

- Inocular el medio de cultivo- Incubar 48 h a 37ºC- Examinar la coloración de las colonias

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN YEXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Identificar la especie en función del color de la colonia,siguiendo las indicaciones del fabricante.

9. RESPONSABILIDADESDeben estar descritas en el manual general de

organización del laboratorio de micología y en lasfichas de descripción de los puestos de trabajo.

El procedimiento deberá llevarse a cabo porpersonal cualificado con un entrenamientoespecífico. La supervisión de la técnica y de losresultados emitidos deberá realizarla el facultativoespecialista responsable del laboratorio demicología.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiología

deberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de microbiología.

Es preferible que la siembra de las muestras serealice en una cabina de flujo laminar con capacidadde proteger al personal que manipula la muestra.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLas colonias de levaduras con diferente color al

indicado por el fabricante del medio deben identificarsecon otra metodología (asimilación de nutrientes,sistemas enzimáticos, criterios inmunológicos, etc.)

12. BIBLIOGRAFÍA1. Clinical microbiology procedures handbook. 2ª edición.

Editor HD Isenberg. 2005. ASM. Washington DC, USA.2. Freydiére AM, Guinet R, Boiron P. Yeast identification

in the clinical microbiology laboratory: phenotypicalmethods. Medical Mycology 2001; 39:9-33.

3. Godoy P, Almeida LP, Lopes-Colombo A. Identificationof Candida albicans using the chromogenic mediumAlbicans ID. Rev Iberoam Micol. 2001; 18:197-199.

4. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Jorgensen JH,Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology.8ª ed.ASM. Washington DC. 2003.

5. Pemán J, Martín Mazuelos E, Rubio MC. (Eds). Guíapráctica de identificación y diagnóstico en MicologíaClínica. 2ª edición. Bilbao: Revista Iberoamericana deMicología, 2006.

6. Sahand IH, Moragues MD, Eraso E, Villar-Vidal M,Quindos G, Ponton J. Supplementation of CHROMagarCandida medium with Pal's medium for rapididentification of Candida dubliniensis. J Clin Microbiol2005; 43:5768-5770.

PNT-MIC-07IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS MEDIANTE

SISTEMAS ENZIMÁTICOS

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ........................... La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-MIC-07Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Identificación de levaduras mediantesistemas enzimáticos

Edición Nº 01 Página 2 de 2

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la identificación delevaduras utilizando sistemas enzimáticoscomercializados.

2. FUNDAMENTOLa identificación de la especie de toda levadura aisladaen sangre o en cualquier otro líquido corporal estérilestá plenamente justificada. Sin embargo, debido aque los organismos levaduriformes forman parte de laflora normal de piel y mucosas, el aislamiento delevaduras a partir de hisopos nasofaríngeos, esputo,lavados bronquiales, orina, raspados de uñas,muestras vaginales o heces puede cuestionar susignificado clínico. No obstante, el aislamientoreiterado de levaduras en diferentes muestras clínicasdel mismo paciente, es sugestivo de infección por elmicroorganismo aislado y requiere la identificación dela especie causal. En el mercado existen varios sistemas enzimáticospara la identificación rápida de Candida albicans(Bacticard Candida, Remel) y Candida glabrata(Glabrata RTTI, Fumouze), a partir de una coloniaaislada en cualquiera de los medios convencionales,en menos de 20 minutos.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMCnº 1a de “Recogida, transporte y procesamientogeneral de las muestras en el laboratorio demicrobiología”, 2003.

4. MUESTRASCualquier cultivo de levadura en medio sólido.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOSAsas de siembraPipetas estériles

6. APARATOS Y MATERIALESKit comercial de la técnica

7. PROCESAMIENTO7.1. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICASe deben seguir las instrucciones del fabricante

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓNDE LOS RESULTADOS

Identificar la especie en función del resultado de latécnica.

9. RESPONSABILIDADESDeben estar descritas en el manual general de

organización del laboratorio de micología y en lasfichas de descripción de los puestos de trabajo.

El procedimiento deberá llevarse a cabo porpersonal cualificado con un entrenamientoespecífico. La supervisión de la técnica y de losresultados emitidos deberá realizarla el facultativoespecialista responsable del laboratorio demicología.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiología

deberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de Microbiología.

Es preferible que la inoculación de estos sistemasse realice en una cabina de flujo laminar concapacidad de proteger al personal que manipula lamuestra.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLas indicadas por el fabricante para cada técnica

12. BIBLIOGRAFÍA1. Clinical microbiology procedures handbook. 2ª

edición. Editor HD Isenberg. 2005. American Societyfor Microbiology. Washington DC, USA.

2. Freydiére AM, Guinet R, Boiron P. Yeast identificationin the clinical microbiology laboratory: phenotypicalmethods. Medical Mycology 2001; 39:9-33.

3. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Jorgensen JH,Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology.8ªed. American Society for Microbiology. WashingtonDC. 2003.

4. Pemán J, Aparisi N, García-Esteban C, GobernadoM. Rapid identification of Candida glabrata using anew commercial kit. Rev Iberoam Micol 2004; 21:82-84.

5. Pemán J, Martín Mazuelos E, Rubio MC. (Eds). Guíapráctica de identificación y diagnóstico en MicologíaClínica. 2ª edición. Bilbao: Revista Iberoamericana deMicología, 2006.

PNT-MIC-08IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS MEDIANTE

ASIMILACIÓN DE NUTRIENTES. MÉTODOS COMERCIALES

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ........................... La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-MIC-08Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Identificación de levaduras medianteasimilación de nutrientes. Métodos

comerciales.Edición Nº 01 Página 2 de 2

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la identificación delevaduras utilizando sistemas de asimilación denutrientes comercializados.

2. FUNDAMENTOLa identificación de la especie de toda levadura

aislada en sangre o en cualquier otro líquido corporalestéril está plenamente justificada. Sin embargo,debido a que los organismos levaduriformes formanparte de la flora normal de piel y mucosas, elaislamiento de levaduras a partir de hisoposnasofaríngeos, esputo, lavados bronquiales, orina,raspados de uñas, muestras vaginales o heces puedecuestionar su significado clínico. No obstante, elaislamiento reiterado de levaduras en diferentesmuestras clínicas del mismo paciente, es sugestivo deinfección por el microorganismo aislado y requiere laidentificación de la especie causal.

En el mercado existen varios sistemas para laidentificación de levaduras mediante asimilación denutrientes a partir de una colonia aislada en cualquierade los medios convencionales. Se fundamentan en lautilización por separado de diferentes nutrientes,hidrocarbonados o nitrogenados apreciando elcrecimiento selectivo en presencia de los nutrientesnecesarios para su desarrollo.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de “Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología”, 2003.

4. MUESTRASCualquier cultivo de levadura en medio sólido.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS- Asas de siembra- Pipetas estériles

6. APARATOS Y MATERIALES- Kit comercial de la técnica- Estufa de 37ºC

7. PROCESAMIENTO7.1. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICASeguir las instrucciones del fabricante

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN YEXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Informar los resultados en función de la especieIdentificada.

9. RESPONSABILIDADESDeben estar descritas en el manual general deorganización del laboratorio de micología y en lasfichas de descripción de los puestos de trabajo.El procedimiento deberá llevarse a cabo por personalcualificado con un entrenamiento específico. Lasupervisión de la técnica y de los resultados emitidosdeberá realizarla el facultativo especialistaresponsable del laboratorio de micología.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiología

deberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de Microbiología.

Es preferible que la inoculación de los diferentessistemas se realice en una cabina de flujo laminarcon capacidad de proteger al personal que manipulala muestra.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOEstos métodos deben acompañarse de pruebas

adicionales (fundamentalmente morfológicas) para lacorrecta identificación de la especie (ver PNT-MIC-05de este procedimiento).

12. BIBLIOGRAFÍA1. Clinical microbiology procedures handbook. 2ª

edición. Editor HD Isenberg. 2005. American Societyfor Microbiology. Washington DC, USA.

2. Freydiére AM, Guinet R, Boiron P. Yeast identificationin the clinical microbiology laboratory: phenotypicalmethods. Medical Mycology 2001; 39:9-33.

3. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Jorgensen JH,Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology.8ªed. American Society for Microbiology. WashingtonDC. 2003.

4. Pemán J, Martín Mazuelos E, Rubio MC. (Eds). Guíapráctica de identificación y diagnóstico en MicologíaClínica. 2ª edición. Bilbao: Revista Iberoamericana deMicología, 2006.

PNT-MIC-09IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS MEDIANTE

CRITERIOS INMUNOLÓGICOS

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ........................... La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-MIC-09Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Identificación de levaduras mediantecriterios inmunológicos

Edición Nº 01 Página 2 de 2

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la identificación rápida delevaduras utilizando métodos inmunológicoscomercializados.

2. FUNDAMENTOLa identificación de la especie de toda levadura

aislada en sangre o en cualquier otro líquido corporalestéril está plenamente justificada. Sin embargo,debido a que los organismos levaduriformes formanparte de la flora normal de piel y mucosas, elaislamiento de levaduras a partir de hisoposnasofaríngeos, esputo, lavados bronquiales, orina,raspados de uñas, muestras vaginales o heces puedecuestionar su significado clínico. No obstante, elaislamiento reiterado de levaduras en diferentesmuestras clínicas del mismo paciente, es sugestivo deinfección por el microorganismo aislado y requiere laidentificación de la especie causal.

En el mercado existen varios sistemas para laidentificación rápida de levaduras mediante métodosinmunológicos a partir de una colonia aislada encualquiera de los medios convencionales. Sefundamentan en la técnica de aglutinación conpartículas de látex mediante anticuerpos monoclonalesespecíficos.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de “Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología”, 2003.

4. MUESTRASCualquier cultivo de levadura en medio sólido.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS- Asas de siembra- Pipetas estériles

6. APARATOS Y MATERIALES- “Kit” comercial de la técnica.

7. PROCESAMIENTO7.1. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICASeguir las instrucciones del fabricante.

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN YEXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Informar los resultados en función de la especieidentificada.

9. RESPONSABILIDADESDeben estar descritas en el manual general de

organización del laboratorio de micología y en lasfichas de descripción de los puestos de trabajo.

El procedimiento deberá llevarse a cabo porpersonal cualificado con un entrenamientoespecífico. La supervisión de la técnica y de losresultados emitidos deberá realizarla el facultativoespecialista responsable del laboratorio demicología.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiología

deberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de microbiología.

Es preferible que la técnica se realice en unacabina de flujo laminar con capacidad de proteger alpersonal que manipula la muestra.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLas indicadas para cada técnica por el fabricante.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Clinical microbiology procedures handbook. 2ª edición.

Editor HD Isenberg. 2005. American Society forMicrobiology. Washington DC, USA.

2. Freydiére AM, Guinet R, Boiron P. Yeast identificationin the clinical microbiology laboratory: phenotypicalmethods. Medical Mycology 2001; 39:9-33.

3. Marot-Leblond A, Beucher B, David S, Nail-Billaud S,Robert R. Development and evaluation of a rapid latexagglutination test using a monoclonal antibody toidentify Candida dubliniensis colonies. J Clin Microbiol2006; 44:138-142.

4. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Jorgensen JH,Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology.8ª ed.American Society for Microbiology. Washington DC.2003.

5. Pemán J, Martín Mazuelos E, Rubio MC. (Eds). Guíapráctica de identificación y diagnóstico en MicologíaClínica. 2ª edición. Bilbao: Revista Iberoamericana deMicología, 2006.

PNT-MIC-10PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO Y NO CONVENCIONAL DE LAS MICOSIS INVASORAS

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital ........................... La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-MIC-10Servicio de MicrobiologíaHospital�����������������..

Pruebas de diagnóstico rápido y noconvencional de las micosis invasoras Edición Nº 01 Página 2 de 5

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la realización del

diagnóstico de la infección fúngica invasorautilizando métodos independientes del cultivo. Se describe qué muestras son las más adecuadasen función de los microorganismos que se vayan adetectar y en función de la técnica que se vaya arealizar.

2. FUNDAMENTOEn muchas ocasiones, las precarias condiciones de

los pacientes con micosis sistémicas desaconsejanla obtención de muestras profundas o no permitenesperar el tiempo necesario para el aislamiento yposterior identificación del agente causal. Por ello, sehan desarrollado métodos alternativos al cultivo quepueden proporcionar al clínico información rápida yfiable ante la sospecha de una micosis invasora.Entre estos métodos destacan la detección deantígenos, anticuerpos y componentes fúngicos noantigénicos. Algunas técnicas serológicas ya se hanconvertido en herramientas básicas en el laboratoriode microbiología clínica actual, como la detección delantígeno capsular de Cryptococcus neoformans, ladetección de antígeno galactomanano en pacientescon aspergilosis invasora, la detección antígenomanano y/o anticuerpos anti-manano así como ladetección de anticuerpos anti-micelio para el estudiode la candidiasis invasora y de otros componentesno antigénicos [(1→3)-β-D-glucano] para el estudiode todas las micosis invasoras en general (exceptocriptococosis y mucormicosis).

Algunos de estos procedimientos están descritosen el Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 19 de �Técnicas rápidas de detección deantígeno�, 2005, en el PNT-TDA-07, por lo quereferimos al lector a dicho documento.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de �Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica�, 2000.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de �Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología�, 2003.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 19 de �Técnicas rápidas de detección deantígeno�. PNT-TDA-07: técnicas rápidas dedetección de antígeno en las micosis invasoras.2005.- Pemán J, Martín Mazuelos E, Rubio MC. (Eds).Guía práctica de identificación y diagnóstico enMicología Clínica. 2ª edición. Bilbao: RevistaIberoamericana de Micología, 2006.

4. MUESTRAS4.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE LAMUESTRA:Se recogerán según se indica en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 1a de

�Recogida, transporte y procesamiento general delas muestras en el laboratorio de microbiología�.PNT-RTP-01. 2003.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS:4.2.1. Tratamiento de muestras para la detecciónde Cryptococcus neoformans:

Seguir las instrucciones del fabricante. Elprocedimiento está descrito en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 19 de�Técnicas rápidas de detección de antígeno�. PNT-TDA-07: técnicas rápidas de detección de antígenoen las micosis invasoras. 2005..4.2.2.Tratamiento de la muestra para la detecciónde Aspergillus spp.:

Seguir las instrucciones del fabricante. Elprocedimiento está descrito en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 19 de�Técnicas rápidas de detección de antígeno�. PNT-TDA-07: técnicas rápidas de detección de antígenoen las micosis invasoras. 2005.4.2.3. Tratamiento de las muestras para ladetección de Candida spp.:4.2.3.1. Detección del antígeno manano:

Seguir las instrucciones del fabricante. Elprocedimiento está descrito en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 19 de�Técnicas rápidas de detección de antígeno�. PNT-TDA-07: técnicas rápidas de detección de antígenoen las micosis invasoras. 2005.4.2.3.2. Detección de anticuerpos anti-manano:

Seguir las indicaciones del fabricante.Brevemente, diluir el suero a estudiar realizando dosdiluciones sucesivas 1:81 (10 µl del suero + 800 µlde diluyente). Se realiza la misma operación con loscontroles positivo y negativo y se preparan loscalibradores para la realización de la curva patrón.4.2.3.3. Candida albicans. Detección de anticuerposanti-micelio:

Seguir las indicaciones el fabricante. Brevemente:La existencia de anticuerpos antimanano en la

mayoría de las personas hace que casi todos lossueros contengan anticuerpos que reaccionan con lasuperficie de las fases levaduriforme y micelial de C.albicans. Para poder observar la existencia deanticuerpos frente a la fase micelial (anticuerposantimicelio), el suero debe absorberse con levadurasde la especie C. albicans inactivadas porcalentamiento.

- Diluir el suero 1/4 mezclando 10 µl del suero y 30µl de PBS. Añadir 20 µl del suero diluido a untubo con 80 µl de absorbente. Agitar bien eincubar 60 min a temperatura ambiente en unagitador orbital.

- Centrifugar a 2.600 rpm 5 minutos y retirar elsobrenadante.

- Realizar diluciones seriadas del suero absorbidomezclando 30 µl del suero y 30 µl de PBS.

PNT-MIC-10Servicio de MicrobiologíaHospital�����������������..

Pruebas de diagnóstico rápido y noconvencional de las micosis invasoras Edición Nº 01 Página 3 de 5

4.2.3.4. Detección de otros componentes fúngicos:(1→3)-β-D-glucano:

Seguir las instrucciones del fabricante. Elprocedimiento está descrito en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 19 de�Técnicas rápidas de detección de antígeno�. PNT-TDA-07: técnicas rápidas de detección de antígenoen las micosis invasoras. 2005.4.2.4. Tratamiento de la muestra para la detecciónde Pneumocystis jiroveci:

Seguir las instrucciones del fabricante. Elprocedimiento está descrito en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 19 de �Técnicasrápidas de detección de antígeno�. PNT-TDA-07:técnicas rápidas de detección de antígeno en lasmicosis invasoras. 2005.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOSLos reactivos específicos están incluidos en losequipos comercializados.

6. APARATOS Y MATERIALESEl equipamiento necesario para la realización de las

técnicas descritas de detección de antígenocriptocócico, galactomanano, P. jiroveci, y manano deCandida, incluyendo el tratamiento de las muestras sedescribe en el Procedimiento en Microbiología Clínicade la SEIMC nº 19 de �Técnicas rápidas de detecciónde antígeno�. PNT-TDA-07: técnicas rápidas dedetección de antígeno en las micosis invasoras. 2005.- Material necesario para la detección de anticuerpos

anti-manano:- Pipetas de 20, 100 y 400 µl.- Tubos para realizar diluciones.- Agitador para tubos.- Baño o estufa para incubar las muestras a 37ºC.- Lavador de microplacas.- Lector de microplacas equipado con filtros de

450 y 620 nm.- Material necesario para la detección de anticuerpos

anti-micelio de Candida albicans:- Micropipetas de 5, 20 y 250 µl.- Pipetas Pasteur estériles.- Tubos o placas de microtitulación para realizar

diluciones seriadas.- Centrífuga para tubos Eppendorf que permita la

centrifugación a 2.000 rpm.- Agitador orbital para tubos.- Estufa para incubar las muestras a 37ºC.- Cámara húmeda.- Cubreobjetos.- Microscopio de fluorescencia.

- Material necesario para la detección de glucano:- Tampón de reconstitución Pyrosol.- Patrón (1→3)-β-D-glucano.- Agua destilada (libre de endotoxinas y β-

glucano).- KOH 0,25 N- KCl 1,2 N.- Microplaca de 96 pocillos.- Lector de microplacas con software apropiado.

7. PROCESAMIENTO7.1. DETECCIÓN DE ANTÍGENO CRIPTOCÓCICO:

Seguir las instrucciones del fabricante. Elprocesamiento está descrito en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 19 de �Técnicasrápidas de detección de antígeno�. PNT-TDA-07:técnicas rápidas de detección de antígeno en lasmicosis invasoras. 2005.

7.2. TÉCNICA PARA LA DETECCIÓN DEGALACTOMANANO:

Seguir las instrucciones del fabricante. Elprocesamiento está descrito en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 19 de �Técnicasrápidas de detección de antígeno�. PNT-TDA-07:técnicas rápidas de detección de antígeno en lasmicosis invasoras. 2005.

7.3.TÉCNICA DE DETECCIÓN DE CANDIDA SPP.:Seguir las instrucciones del fabricante. El

procesamiento está descrito en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 19 de�Técnicas rápidas de detección de antígeno�. PNT-TDA-07: técnicas rápidas de detección de antígenoen las micosis invasoras. 2005.7.3.1. Detección de manano:

Seguir las instrucciones del fabricante. Elprocesamiento está descrito en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 19 de �Técnicasrápidas de detección de antígeno�. PNT-TDA-07:técnicas rápidas de detección de antígeno en lasmicosis invasoras. 2005. 7.3.2. Detección de anticuerpos anti-manano ensuero:Seguir las instrucciones del fabricante. Brevemente:- Diluir el suero a estudiar realizando dos diluciones

sucesivas 1:81 (10 µl del suero + 800 µl dediluyente). Se realiza la misma operación con loscontroles positivo y negativo y se preparan loscalibradores para la realización de la curva patrón.

- Añadir 100 µl de cada uno de los sueros diluidos ensu pocillo. En pocillos diferentes, se añadentambién 100 µl de los sueros negativo y positivo,así como de los calibradores para la realización dela curva patrón.

- Cubrir los pocillos con plástico adhesivo y seincuban a 37ºC durante 60 minutos.

- Lavar los pocillos 4 veces rellenándolos cada vezcon 370 µl de la solución de lavado y secar lospocillos invirtiéndolos sobre papel de filtro.

- Añadir 100 µl del conjugado a cada uno de lospocillos.

- Cubrir los pocillos con plástico adhesivo e incubar a37ºC durante 60 minutos.

- Lavar los pocillos 4 veces rellenándolos cada vezcon 370 µl de la solución de lavado y secar lospocillos invirtiéndolos sobre papel de filtro.

- Añadir 200 µl de la solución de revelado a cadauno de los pocillos e incubar en la oscuridad, atemperatura ambiente, durante 30 minutos.

PNT-MIC-10Servicio de MicrobiologíaHospital�����������������..

Pruebas de diagnóstico rápido y noconvencional de las micosis invasoras Edición Nº 01 Página 4 de 5

- Añadir 100 µl de la solución de parada a cadapocillo, utilizando el mismo orden que se siguiópara añadir la solución de revelado.

- Limpiar el fondo de los pocillos y leer la densidadóptica a 450 nm utilizando un lector de placas. Estodebe hacerse dentro de los 30 minutos siguientes arealizarse la parada de la reacción.

7.3.3. Detección de anticuerpos anti-micelio deCandida albicans:Seguir las instrucciones del fabricante. Brevemente:La prueba es una técnica de inmunofluorescenciaindirecta que detecta anticuerpos frente a antígenosdel micelio de C. albicans y es últil en el diagnósticoy seguimiento de la candidiasis invasora. Tambiénpuede dar resultados positivos en infeccionesinvasoras por C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei,C. glabrata, C. guilliermondii y C. dubliniensis. Laexistencia de anticuerpos anti-manano en la mayoríade las personas hace que casi todos los sueroscontengan anticuerpos que reaccionan con lasuperficie de las fases levaduriforme y micelial de C.albicans. Para poder observar la existencia deanticuerpos frente a la fase micelial (anticuerpos anti-micelio), el suero debe de absorberse con levadurasde C. albicans inviables por calentamiento.- Dado que los portaobjetos de la prueba tienen 10

pocillos, se pueden estudiar ocho diluciones delsuero en un portaobjetos. Añadir 20 µl de cada unade las diluciones del suero (1/20, 1/40, 1/80, 1/160,1/320, 1/640, 1/1280 y 1/2560) a ocho pocillos delportaobjetos. En los dos pocillos restantes añadir20 µl de los sueros control positivo y negativoproporcionados con el sistema comercializado.

- Incubar durante 30 minutos a 37ºC en cámarahúmeda.

- Lavar tres veces con PBS y dejar secar al aire ocon una corriente de aire frío.

- Añadir 20 µl del anticuerpo secundario conjugadocon FITC a todos los pocillos e incubar durante 30minutos a 37ºC en cámara húmeda.

- Lavar tres veces con PBS y dejar secar al aire ocon una corriente de aire frío.

- Montar el portaobjetos con el líquido de montaje yexaminar con un microscopio de fluorescencia.

7.3.4. Detección del (1→→→→3)-ββββ-1D-glucano:Seguir las instrucciones del fabricante. El

procesamiento está descrito en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 19 de �Técnicasrápidas de detección de antígeno�. PNT-TDA-07:técnicas rápidas de detección de antígeno en lasmicosis invasoras. 2005.

7.4 CONTROL DE CALIDAD:Siguiendo las recomendaciones para el Control

de Calidad Interno en Microbiología Clínica (CCI-SEIMC) realizado por el grupo de la SEIMC(GEGMIC), para los reactivos comerciales, debesolicitarse al fabricante que disponga de un Sistemade Calidad reconocido y que facilite al laboratorio losdatos relativos a cada lote de reactivo. La mayoría delas técnicas comerciales disponen de controles

positivos y negativos para realizarlos cada vez quese utilice la técnica. Todos los centros debenparticipar también en los controles de calidadexternos (SEIMC).

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN YEXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

8.1. DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-MANANO:Lectura e interpretación de los resultados: preparar larecta patrón utilizando los resultados de loscalibradores. Calcular la concentración deanticuerpos anti-Candida de cada muestra porextrapolación de la densidad óptica en la curvapatrón. En cada realización la prueba debe servalidada de acuerdo a las densidades ópticas yrangos proporcionados por el fabricante. Lainterpretación de los resultados será la siguiente:

Resultado positivo: concentración superior a 10AU/ml.

Resultado intermedio: concentración entre 5 y 10AU/ml.

Resultado negativo: concentración inferior a 5AU/ml.

8.2. DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-MICELIO:Interpretación de los resultados: al observar lamuestra al microscopio, la fluorescencia puedelocalizarse en la silueta e interior de los tubosgerminales. Esta reactividad recibe la denominación1. Cuando sólo se ve positiva la silueta del tubogerminal, la reactividad recibe la denominación 0,8.Si la silueta de los tubos germinales es positiva, peroalgunos tubos germinales no se definen bien, lareactividad recibe la denominación 0,5. Si se apreciaque los tubos germinales son positivos, pero lareactividad es muy débil, se denomina 0,2.Finalmente, si ninguno de los tubos germinalespresenta fluorescencia, la reactividad se denomina 0.El título del suero será la última dilución del sueroque registre valores de intensidad de fluorescencia ≥0,8. Las levaduras no deben de presentarfluorescencia y aparecerán de color rojo. En el casode que las levaduras presenten fluorescencia, elsuero probablemente tiene títulos muy elevados deanticuerpos anti-manano y, por tanto, el sueroabsorbido la primera vez debe de absorberse denuevo y repetirse la prueba. La presencia deanticuerpos antimicelio a un título igual o superior a160 es compatible con una candidiasis invasora enun paciente inmunocompetente. Puedensersignificativos títulos menores en pacientesinmunocomprometidos. Si no se observan tubosgerminales fluorescentes la prueba se consideranegativa.

8.3. PARA EL RESTO DE DETECCIONES DEANTÍGENOEl procedimiento se encuentra descrito en elProcedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº

PNT-MIC-10Servicio de MicrobiologíaHospital�����������������..

Pruebas de diagnóstico rápido y noconvencional de las micosis invasoras Edición Nº 01 Página 5 de 5

19 de �Técnicas rápidas de detección de antígeno�.PNT-TDA-07: técnicas rápidas de detección deantígeno en las micosis invasoras. 2005.

9. RESPONSABILIDADESEl personal técnico de la sección será el

responsable de revisar las solicitudes estudiando laidoneidad de la muestra remitida con ladeterminación solicitada, del tratamiento de lasmuestras, de la realización de las técnicas y de lavalidación de los resultados en función de losresultados de los controles.

El facultativo especialista responsable de lasección, además de la supervisión de las tareascitadas, será responsable de mantener al día losprocedimientos, de la validación final de losresultados, su interpretación y el informe final de losmismos.

El personal debe conocer las ventajas ylimitaciones de las técnicas rápidas, así como elfundamento de todas las técnicas y delfuncionamiento de los aparatos. Además debe detrabajar en condiciones de máxima seguridadpersonal y ambiental.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO10.1. DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-MANANO:

Los sueros con concentraciones superiores a 20AU/ml deben diluirse 1:4 con el suero controlnegativo y volverse a estudiar. La concentraciónobtenida se multiplicará por cuatro.La presencia deanticuerpos anti-Candida es el resultado de unainfección presente o pasada. Una variaciónimportante en el título de anticuerpos anti-Candidapuede constituir una evidencia de infección activa porCandida y debe de confirmarse con los datos clínicosdel paciente. Un resultado negativo no excluye eldiagnóstico de candidiasis invasora en pacientesinmunocomprometidos, ya que su capacidad paraproducir anticuerpos puede estar disminuida. Se hademostrado la existencia de una complementariedadentre los títulos de anticuerpos anti-manano y lostítulos de manano, por lo que un suero de unpaciente con riesgo de desarrollar una candidiasisinvasora que no tenga manano puede tener títuloselevados de anticuerpos anti-manano y viceversa.

Reduciendo el punto de corte a 5 AU/ml, Prella etal (2005), han detectado manano en 22/28 pacientes(79%) con candidiasis invasora. Cuando losresultados de la detección de manano se combinaroncon los de la detección de anticuerpos antimanano,obtuvieron una sensibilidad de 89%, unaespecificidad del 84%, un valor predictivo positivo del86% y un valor predictivo negativo del 88%.

10.2. DETECCIÓN DE ANTICUERPOSANTIMICELIO:

Si se van a estudiar varios sueros, se debe probarprimero la dilución 1/20 de cada suero y titularposteriormente sólo los que sean positivos a esadilución.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLa detección de antígenos, anticuerpos y productos

de síntesis fúngica tiene sensibilidades yespecificidades que dependen de la población para laque se han diseñado los estudios y los resultados noson extrapolables para otras poblaciones.

Las técnicas de detección de manano yantimanano, utilizadas conjuntamente, mejoran lasensibilidad diagnóstica global, aunque su ésta siguesiendo insuficiente.

Las técnicas de detección de anticuerpos anti-micelio pueden resultar negativas en el caso depacientes con fungemia.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Clinical microbiology procedures handbook. 2ªedición. Editor HD Isenberg. 2005. American Society forMicrobiology. Washington DC, USA.2. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Jorgensen JH,Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology.8ª ed.American Society for Microbiology. Washington DC.2003.3. Odabasi Z, Mattiuzzi G, Estey E, Kantarjian H, SaekiF, Ridge RJ, Ketchum PA, Finkelman MA, Rex JH,Ostrosky-Zeichner L. ß-D glucan as a diagnostic adjuntfor invasive fungal infections: validation, cutoff,development, and performance in patients with acutemyelogenous leukemia and myelodysplastic syndrome.Clin Infect Dis 2004;39:199-205.4. Pazos C, Pontón J, del Palacio A. Contribution of(1→3)-β-D-glucan chromogenic assay to diagnosis andtherapeutic monitoring of invasive aspergillosis inneutropenic adult patients: a comparison with serialscreening for circulating galactomannan. J Clin Microbiol2005;43:299-305.5. Prella M, Bille J, Pugnale M, Duvoisin B, Cavassini M,Calandra T, Marchetti O. Early diagnosis of invasivecandidiasis with mannan antigenemia and antimannanantibodies. Diagn Microbiol Infect Dis 2005;51:95�101.

PNT-MIC-11PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS. MICRODILUCIÓN EN CALDO

ELABORADO REVISADO Y APROBADOJefe de Servicio

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01 Edición inicial

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DOCUMENTO TÉCNICO

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Prueba de sensibilidad a los antifúngicos.Microdilución en caldo Edición Nº 01 Página 2 de 8

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para realizar pruebas de

sensibilidad in vitro a los antifúngicos de levaduras yde hongos filamentosos, mediante técnicas demicrodilución en caldo.

Este procedimiento es aplicable a todos loslaboratorios de microbiología clínica que posean ladotación y experiencia adecuada para el manejo deestos microorganismos y de las técnicas dedeterminación de la sensibilidad in vitro de losmismos.

2. FUNDAMENTOExisten varias técnicas de referencia para realizar

pruebas de sensibilidad a los antifúngicos. Lastécnicas del CLSI y del EUCAST son las másdifundidas y de las que se disponen más estudios devalidación. Estas pruebas determinan la CMI de losantifúngicos mediante la dilución en caldo RPMI cono sin glucosa, frente a levaduras y hongosfilamentosos.

La realización de estas técnicas está indicada enaquellos casos en los que se crea que ladeterminación de la sensibilidad a los antifúngicospuede ayudar a elegir la mejor alternativaterapéutica. Estas pruebas son de especial utilidaden cepas procedentes de enfermos en los que se haproducido un fracaso terapéutico y en casos depacientes que han recibido profilaxis o tratamientoantifúngico previo. Además, pueden utilizarse pararealizar estudios epidemiológicos periódicos, queayuden a conocer la distribución de las especies y susensibilidad en una institución concreta, y de estaforma, establecer los tratamientos empíricos másadecuados.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de la

SEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.

- UNE-EN-ISO 15189-03. Medical Laboratories.Particular requirements for quality and competence.

- EUCAST-AFST 2003. Method for determination ofminimum inhibitory concentration (MIC) by brothdilution of fermentative species of yeasts. E. Dis 7.1CMI. 2003, 9:1-8.

- EUCAST-AFST 2006. Method for the determinationof Minimum Inhibitory Concentration (MIC) by BrothDilution of Aspergillus species. En prensa.

- CLSI M27-A2 2002. Reference method for brothdilution antifungal susceptibility testing of yeasts;approved standard.

- CLSI M38-A 2002. Reference method for brothdilution antifungal susceptibility testing offilamentous fungi.

4. MUESTRASEstas pruebas de sensibilidad pueden realizarse a

cepas de levaduras y hongos filamentosos cultivadasen medio sólido. Las cepas deben estar en cultivopuro. Se deben utilizar subcultivos de no más de 24-

48 horas para las levaduras y de no más de 5-7 díaspara los hongos filamentosos.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS- Caldo RPMI 1640 con L-glutamina y sin

bicarbonato.- Caldo RPMI 1640 con L-glutamina y sin

bicarbonato con 2% de glucosa (alternativo).- Ácido morfolinpropanosulfónico (MOPS).- Sustancia valorada de anfotericina B, fluorocitosina,

fluconazol, itraconazol, voriconazol, ketoconazol,caspofungina, micafungina, anidulafungina yposaconazol.

- Agua destilada estéril.- Solución salina 0,85% estéril.- Dimetilsulfóxido 100% (DMSO).- Placas de agar Sabouraud glucosado.- Tubos de agar patata glucosada.- Tween 20.- Criotecas y/o tubos para conservación de cepas- Escala de MacFarland.- Soluciones de verificación de pHmetro.

6. APARATOS Y MATERIALES- Incubador de 35 ± 2ºC.- pHmetro.- Neveras y congeladores.- Agitador de placas de microtitulación.- Espejo para lectura de placas.- Espectrofotómetro para lectura de placas de

microtitulación (alternativo).- Nefelómetro o espectrofotómetro para tubos.- Placas de microtitulación de 96 pocillos estériles

con fondo redondeado en “U”.- Placas de microtitulación de 96 pocillos estériles

con fondo plano (alternativo).- Agitador rotatorio Vórtex.- Tubos plástico estériles de 5 ml.- Tubos de cristal tipo Bijoux de 3 ml.- Filtros de 0,22 µm de diámetro de poro para

unidades de filtración.- Frascos de vidrio estériles con tapón de rosca y

capacidad de 250, 500 y 1000 ml.- Probetas de 250, 500 y 1000 ml de capacidad.- Unidades de filtración de 500 ml en plástico

autoclavables.- Barras magnéticas de agitación.- Hematocitómetros (Cámaras de Neubauer)

(alternativo).- Gradillas autoclavables para tubos de 5, 10 y 25 ml

de capacidad.- Cajas de plástico para puntas de micropipeta

autoclavables.- Cajas de plástico para incubación de las placas de

microdilución estériles.- Tubos de plástico de 50 ml tipo Falcon.- Pipetas Pasteur estériles.- Escobillones o torundas estériles.- Micropipetas de volumen variable uni y multicanal.- Puntas de micropipetas con filtro estériles.

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7. PROCESAMIENTOEn este apartado se hará una breve descripción de

las técnicas de referencia. No obstante, lasinstituciones que realicen estas pruebas debendisponer de los documentos en los que se describenlas técnicas de referencia, que pueden obtenerse enwww.nccls.org y en www.eucast.org.

7.1. REALIZACIÓN DE LAS PRUEBAS DESENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS CONLEVADURAS7.1.1. Preparación de los antifúngicos- Las soluciones iniciales de los antifúngicos deben

prepararse según la fórmula incluida en la figura 1,y deben obtenerse tomando en cuenta la potenciade la sustancia valorada y las concentraciones alas que se quieren preparar las placas para losestudios de sensibilidad.

Figura 1. Fórmula para preparación de lassoluciones madre de antifúngicos

-

-

Tabla 1. Resumen para la preparación de los antifúngicos en e

Antifúngico DisolventeConcentraciónsolución mad

mg/L

Anfotericina B DMSO 3.200

Fluorocitosina DMSO, 50:50acetona:agua o agua 12.800

Fluconazol Agua 12.800

Itraconazol DMSO 1.600

Voriconazol DMSO 1.600

Ketoconazol DMSO 1.600

Posaconazol DMSO 1.600

Caspofungina Agua 3.200

Micafungina Suero salino 0,85% 3.200

Anidulafungina DMSO 3.200

- Recordar que si se utiliza dimetilsulfóxido (DMSO),los tubos deben ser de vidrio.

- Habitualmente, no es necesario esterilizar lassoluciones, pero si se tienen dudas sobre laesterilidad de la misma, pueden utilizarse filtros demembrana. No deben emplearse otros materialesya que pueden absorber cantidades significativasdel antifúngico.

- Los viales con las soluciones madre puedenconservarse a una temperatura de -70ºC o inferior,pero no más de seis meses. Una vezdescongelados los viales no deben recongelarseotra vez.

7-

-

Volumen(ml) x Concentración (µg/ml)Peso(mg)= --------------------------------------------- Potencia(µg/mg)

Pesar, al menos, 100 mg de sustancia valorada enbalanza de precisión, para disminuir al máximo loserrores de pesado.

Las soluciones madre deben prepararse a unaconcentración 100 veces superior a la concentraciónmás elevada que se quiera incluir en el estudio desensibilidad. En la tabla 1 se muestran lasconcentraciones a las que se recomienda prepararcada antifúngico.

studios de sensibilidad

de lare en

Intervalos deconcentración

recomendados enmg/L

0,03-16

0,125-64

0,125-64

0,015-8

0,015-8

0,015-8

0,015-8

0,03-16

0,03-16

0,03-16

.1.2. Preparación de las placas de microdilución Las placas deben ser de microdilución, estériles,con 96 pocillos de fondo plano en caso de utilizar elmétodo EUCAST, y de fondo en “U” en caso deusar el del NCCLS.

El medio de cultivo recomendado es RPMI 1640con glutamina, sin bicarbonato y el pH debeajustarse a 7,0, en el caso de seguir el método delCLSI, y complementado con glucosa al 2%, encaso de utilizar el método del EUCAST. Seaconseja preparar el medio a doble concentración,ya que tras la adición del inóculo se produce unadilución a la mitad.

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- El medio debe esterilizarse mediante filtración confiltros de 0,22 µm de poro. Nunca debeautoclavarse

- Se recomiendan dos formas diferentes depreparación según el tipo de antifúngico.

- Preparación de placas de antifúngicos hidrofílicos:- De esta forma se preparan las placas de

fluconazol, de fluorocitosina, de caspofungina yde micafungina.

- Para obtener los intervalos expuestos en latabla 1, la solución madre debe diluirse 100veces en RPMI 2x (con o sin glucosa al 2%).

- Tras ello, se dispensan 200 µl de la solución detrabajo en la columna número 1 de la placa demicrodilución. Las columnas 2 a la 12 serellenan con 100 µl de RPMI 2x (con o singlucosa) sin antifúngico.

- A continuación, se toman 100 µl de la columna 1y se transfieren a la columna 2. Luego, setoman 100 µl de la 2 (que ahora tiene 200 µl) yse pasan a la 3, y así hasta llegar a la columna10.

- Los últimos 100 µl recogidos en la columna 10se desechan.

- En las columnas 11 y 12 no se dispensaantifúngico, se añaden 100 µl en cada pocillo deRPMI 2x (con o sin glucosa), ya que seutilizarán como control de crecimiento (CC) ycontrol de esterilidad (B).

- Preparación de placas de antifúngicos hidrofóbicos:- De esta forma se preparan las placas de

anfotericina B, itraconazol, ketoconazol,voriconazol, posaconazol y anidulafungina

- Se toma una alícuota de solución madre.- Se llenan 9 tubos más con 150 µl de DMSO.

Recordar que los tubos deben de ser de vidrio.- Se toman 150 µl de la solución inicial del

antifúngico y se hacen diluciones consecutivas1:2, en los 9 tubos.

- A continuación, se llenan 10 tubos tipo Falconcon 9,9 ml de RPMI 2x (con o sin glucosa).

- Se traspasan 100 µl de cada uno de los tuboscon diluciones dobles del antifúngico en DMSO,a los tubos Falcon con RPMI, obteniéndosediluciones 1:100 del antifúngico.

- Tras ello, se dispensan 100 µl en la primeracolumna de la placa de microdilución del primertubo Falcon, otros 100 µl en la segundacolumna desde el segundo tubo Falcon, otros100 µl en la tercera columna desde el tercertubo Falcon, y así, hasta la columna 10.

- En las columnas 11 y 12 se añaden 100 µl encada pocillo de RPMI 2x (con o sin glucosa) sinantifúngico.

- Las placas pueden almacenarse a -70ºC duranteseis meses, a excepción de las placas conequinocandinas que deben ser utilizadas antes dedos meses. Si se decide conservar a -20ºC, lasplacas no deben conservarse más de un mes,además las placas con polienos o conequinocandinas no deben conservarse a -20ºC. Las

placas deben mantenerse selladas en plástico opapel aluminio mientras estén congeladas.

7.1.3. Preparación del inoculo- Un día antes de hacer el estudio de sensibilidad,

las levaduras se subcultivan en agar glucosado deSabouraud o en agar glucosado de peptona. Seincuban 18-24 horas, a 35-37ºC. Si son levadurasde crecimiento lento como Cryptococcusneoformans, puede ser necesario un subcultivo de48 horas.

- El inóculo se prepara picando cinco coloniasdistintas, de 1 mm de diámetro, yresuspendiéndolas en 5 ml de agua destilada o desolución salina 0,85%.

- La suspensión se homogeniza con un agitador desobremesa a 2.000 rpm, durante 15 segundos.

- El inóculo se ajusta a un 0,5 McFarland (medianteescala, turbidímetro o espectrofotómetro) con aguadestilada o suero salino.

- Si se mide la densidad óptica en unespectrofotómetro a 530 nm (la densidad ópticaserá de 0,09-0,13), lo que equivale a unasuspensión de levaduras de 1-5 x 106 cfu/ml.

- Por último, se hace una dilución 1:10 en aguadestilada, preparando la suspensión de trabajo quetendrá 1-5 x 105 cfu/ml, en caso de seguir elmétodo EUCAST. Si se sigue el método del CLSI,se hacen tres diluciones 1:10, obteniéndose unasolución de trabajo de 1-5 x 103 cfu/ml.

- Deben hacerse recuentos periódicos en placa deagar glucosado de Sabouraud, para controlar lavalidez del tamaño del inóculo.

7.1.4. Inoculación e incubación de las placas- En cada placa pueden testarse hasta ocho cepas,

una por fila, recordando que en todas las placasdebería incluirse, al menos, una cepa control decalidad.

- Cada pocillo es inoculado con 100 µl de lassuspensiones de trabajo, por lo que todos lospocillos se diluyen a la mitad, de ahí la utilizacióndel RPMI a doble concentración.

- La columna 11 también es inoculada con 100 µl, yaque es el control de crecimiento.

- A la columna 12 se añaden 100 µl de aguadestilada, ya que es el control de esterilidad y elblanco.

- Las placas se incuban a 35-37ºC en estufa conambiente normal (sin CO2), durante 24-48 horas.Puede utilizarse un cámara húmeda si se desea.

- La lectura válida es la de 24 horas en el caso delEUCAST. Si se sigue el método del CLSI, lasplacas se leen a 24 y a 48 horas, siendo la lecturade 48 horas la que debe tomarse como válida,salvo excepciones.

- En caso de cepas que no crecen a 35-37º C,pueden hacer las pruebas a 30ºC, aunque debenvalidarse con cepas control de calidad y tomar losresultados con prudencia, ya que las pruebas no sehan estandarizado a esta temperatura.

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Prueba de sensibilidad a los antifúngicos.Microdilución en caldo Edición Nº 01 Página 5 de 8

7.1.5. Control de calidadEl control de calidad se realiza siguiendo de formasimilar al descrito en los documentos de referencia.- Se recomienda hacer controles de los lotes de

RPMI y del proceso de preparación de las placasde microdilución.

- Se recomienda mantener las cepas control decalidad a –70º C. Si se quieren manteneralmacenadas para uso frecuente, puedensubcultivarse en agar Sabouraud y conservar a 2-8º C, durante 15 días. Tras esas dos semanasdeben subcultivarse de nuevo.

- Las cepas control de calidad deben incluirsesiempre que se realicen pruebas de sensibilidad,para comprobar que sus CMIs están dentro delintervalo de control.

- Si tras repetir el test 20 veces en días distintos, laCMI de la cepa control no se incluye en el intervaloen más de una ocasión, debe analizarse todo elproceso en busca del error.

La tabla 2 incluye los valores de referencia para lascepas de control de calidad más utilizadas, segúnestos documentos.

Tabla 2: Intervalos de CMIs de las cepas control para los métodos de referenciaCandida parapsilosis

ATCC 22019 Candida krusei ATCC 6258Antifúngico CMIs obtenidas

por el EUCASTCMIs obtenidas

por el CLSICMIs obtenidas por

el EUCASTCMIs obtenidas por el

CLSI

Anfotericina B 0,12-0,50 0,50-4,0 0,12-1,0 1,0-4,0

Fluorocitosina 0,12-0,50 0,12-0,50 1,0-4,0 8,0-32,0

Fluconazol 1,0-4,0 1,0-4,0 16,0-64,0 16,0-128,0

Itraconazol 0,03-0,12 0,12-0,5 0,06-0,25 0,25-1,0

Voriconazol 0,03-0,12 0,03-0,25 0,03-0,25 0,12-1,0

Ketoconazol 0,03-0,12 0,06-0,50 0,06-0,25 0,25-1,0

Posaconazol 0,015-0,06 0,06-0,25 0,03-0,12 0,12-1,0

Caspofungina 0,50-2,0 0,50-4,0 0,12-0,50 0,25-1-0

Micafungina 0,50-2,0 0,50-4,0 0,12-0,50 0,25-1,0

Anidulafungina 0,50-4,0 1,0-8,0 0,03-0,25 0,06-0,50

7.2. REALIZACIÓN DE LAS PRUEBAS DESENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS CONHONGOS MICELIALES7.2.1. Preparación de los antifúngicosTodo el proceso de preparación de los antifúngicoses similar al descrito en el apartado de pruebas desensibilidad con levaduras.7.2.2. Preparación de las placas de microdiluciónEs similar al descrito para las levaduras7.2.3. Preparación del inóculo- Las cepas deben subcultivarse en tubos de agar

patata glucosada a 35ºC + 2ºC durante 3-7 días,según especie.

- Las colonias se cubren con la colonia se cubrirácon 5 ml de agua destilada estéril o de soluciónsalina 0,85% estéril.

- En caso de especies hidrofóbicas como Aspergillusspp., Paecilomyces spp., Penicillium spp.,Scopulariopsis spp. y Trichoderma spp., debenañadirse a los 5 ml de agua o de solución salina100 µl de Tween 20, para evitar la formación decúmulos de conidias.

- Raspar la colonia cuidadosamente con un hisopoestéril, agitar la suspensión durante 15 segundosen vórtex a 2000 rpm.

- Transferir esta suspensión a un tubo estéril.- Si se hace el método del EUCAST, las

suspensiones se examinan con unhematocitómetro (cámara de Neubauer), siguiendoprocedimientos habituales. Si se observan grancantidad de trozos de hifas, debe filtrarse lasuspensión con un filtro de 11 µm de diámetro, yrepetir el recuento. La suspensión se ajusta a 1-5 x105 ufc/ml.

- Si se sigue el método del CLSI, la suspensión seajusta con la ayuda de un espectrofotómetro entre0,09 y 0,17 de densidad óptica, según especies. Latabla 3 resume las densidades ópticas por especie.Esta densidad óptica equivale a entre 1 x 105 y 1 x106 cfu/ml. Tras ello, se hace una dilución 1:50,obteniéndose una suspensión final con 0,5-5 x 104

cfu/ml.

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Tabla 3: Densidad óptica y tamaños de inóculo según el documento M38-A del CLSI

Especies Nº observaciones Densidad óptica

Aspergillus flavus 105 0,09-0,11

Aspergillus fumigatus 104 0,09-0,11

Fusarium oxysporum 105 0,15-0,17

Fusarium solani 103 0,15-0,17

Pseudallescheria boydii 99 0,15-0,17

Rhizopus arrhizus 99 0,15-0,17

Sporothrix schenckii 50 0,09-0,11

Paecilomyces variotii 50 0,11-0,17

7.2.4. Inoculación e incubación de las placas- La inoculación es similar a la descrita en levaduras- Las placas se incuban a 35-37ºC en estufa con

ambiente normal (sin CO2), durante 72 horas.Puede utilizarse un cámara húmeda si se desea.

- La lectura a 48 horas es la que debe tomarse comoválida, salvo casos excepcionales, en los quepueden ser necesarios más días de incubaciónpara obtener la CMI.

- En caso de cepas que no crecen a 35-37ºC,pueden hacer las pruebas a 30ºC, aunque debenvalidarse con cepas control de calidad y tomar losresultados con prudencia, ya que las pruebas no sehan estandarizado a esta temperatura.

7.2.5. Control de calidadEl control de calidad es similar al descrito para laslevaduras, aunque pueden utilizarse otras cepascontrol, que viene recogidas en los documentos de losestándares.

8. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN YEXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

8.1. LEVADURAS8.1.1. Método eucast- Las placas deben leerse en un lector de placas de

microdilución, en el que se detecte la densidadóptica de los pocillos. La longitud de ondarecomendada es de 530 nm, al igual que alpreparar el inóculo, pero también puedenemplearse otras longitudes de onda. El valor dedensidad óptica de los pocillos de la columna 12(blanco) debe sustraerse siempre a las lecturas delresto de los pocillos.

- Las placas pueden agitarse si se desea antes de lalectura, pero al ser de fondo plano, no sueleformarse botón en el centro del pocillo, por lo que lalectura no necesita de homogenizado previo.

- Si el control de crecimiento no supera 0,2 dedensidad óptica, las placas deben reincubarse otravez y determinar la CMI a las 48 horas.

- Para los azoles, las equinocandinas yfluorocitosina, la CMI es la concentración más bajaen la que se observa una disminución en ladensidad óptica igual o superior al 50%, conrespecto a la del control de crecimiento.

- Para anfotericina B es la concentración más bajaen la que se observa una disminución en ladensidad óptica igual o superior al 90%, conrespecto a la del control de crecimiento.

- El EUCAST aun no ha propuesto los puntos decorte para interpretar los resultados de las pruebasde sensibilidad. Para definirlos, se están utilizandodistribuciones de CMIs de cepas clínicas, obtenidaspor la metodología EUCAST. Se observa como sedistribuye la población de cepas de cada una de lasespecies, y se define la población salvaje, es decir,aquellas cepas que no han desarrolladomecanismos de resistencia. Tras ello, losresultados se relacionan con los parámetrosfarmacocinéticos y farmacodinámicos de losantifúngicos. Para una mayor información consultaren www.eucast.org .

- En caso de utilizar el método EUCAST, lasrecomendaciones actuales para interpretar losresultados son considerar como resistentes in vitro,aquellas cepas que muestran una CMIsignificativamente más elevada que los miembrosde su especie. Así por ejemplo, CMIs de fluconazolpor encima de 16 mg/l o de anfotericina B porencima de 1 mg/l podrían considerarse comoresistentes in vitro.

8.1. 2. Método CLSI- Las placas se leen visualmente con ayuda de un

espejo invertido.- Las placas pueden agitarse antes de la lectura.- Para los azoles, las equinocandinas y

fluorocitosina, la CMI es la concentración más bajaen la que se observa una sustancial disminución enel crecimiento de la cepa, con respecto a la del

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control de crecimiento. Esta disminución sustancialsuele equivaler a un 80% de inhibición.

- Para anfotericina B es la concentración más bajaen la que se observa una inhibición total delcrecimiento de la cepa.

- Sólo existen puntos de corte para cuatroantifúngicos, recogidos en la tabla 4. Para otrosantifúngicos se aconseja seguir lasrecomendaciones expuestas en el apartado delEUCAST.

Tabla 4. Puntos de corte para interpretar las pruebas de sensibilidad en levaduras, según el CLSI estadounidense.Datos en mg/L

Antifúngico Sensible Sensible dependientede la dosis Intermedio Resistente

Fluconazol < 8 16-32 - > 64

Itraconazol < 0,125 0,25-0,5 - > 1

Voriconazol < 1 2 - > 4

Fluorocitosina < 4 - 8-16 > 32

8.2. HONGOS FILAMENTOSOSLas placas se leen de igual forma tanto por elmétodo del EUCAST como por el del CLSI.- Las placas se leen visualmente con ayuda de un

espejo invertido.- Para todos los antifúngicos, la CMI es la

concentración más baja en la que se observa unainhibición total del crecimiento de la cepa.

- Para las equinocandinas, se puede utilizar la CME(concentración mínima efectiva), que se definecomo la concentración en la que empiezan a versealteraciones microscópicas y/o macroscópicas de lacepa. Esta modificación no ha sido estandarizada ydebe tomarse con precaución, desde le punto devista clínico.

No existen puntos de corte por ninguno de los métodosexpuestos.

9. RESPONSABILIDADES- El procedimiento deberá llevarse a cabo por personal

técnico cualificado con un entrenamiento específico.- La supervisión de la técnica y de los resultados

emitidos deberá realizarla un facultativo especialistaresponsable del laboratorio de microbiología.

- Las responsabilidades deben estar perfectamentedescritas en el manual general de organización dellaboratorio de microbiología y en las fichas dedescripción de los puestos de trabajo.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO- Todos los procedimientos deben seguir las normas

de bioseguridad e higiene en microbiología, quedeben estar recogidas en un protocolo normalizadodel laboratorio.

- Se recomienda que estas técnicas sean realizadaspor laboratorios que tengan un número de cepaselevado. Montar estas técnicas a demanda, demodo esporádico, impide que pueda hacerse uncontrol efectivo de lotes, por lo que puedenproducirse errores.

- Cuando se hace lectura visual en pruebas conlevaduras, el error más habitual es interpretar elcrecimiento residual (trailing), que se observa con

fármacos fungistáticos como los azoles, comoauténtica resistencia. Esto sólo puede evitarse conexperiencia y formación previa.

- Si se tiene un número bajo de cepas es mejorutilizar técnicas de difusión o métodos comerciales,para conocer la sensibilidad a los azoles, y remitirla cepa a un centro de referencia.

- Con estas técnicas de difusión o comercialespuede darse información rápidamente, que puedeser de utilidad clínica. Esta rapidez no es posiblecon los métodos de referencia.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO- El método de microdilución en caldo queda casi

limitado a aquellos laboratorios que, además de laexperiencia suficiente, tengan un número elevadode aislamientos de hongos.

- Estas técnicas no son muy útiles para realizarpruebas con especies de levaduras de crecimientolento. Tampoco se pueden utilizar con especies dehongos filamentosos que no producenmicroconidias, como los dermatofitos, por lo quedeben realizarse adaptaciones o modificaciones delas mismas.

- La interpretación de los resultados debe hacersecon prudencia. No existen puntos de corte paramuchas especies y antifúngicos y, además, lacorrelación no es muy elevada entre las pruebas desensibilidad y la evolución clínica de pacientes conmicosis graves.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Clinical Laboratory Standards Institute. Referencemethod for broth dilution antifungal susceptibility testing offilamentous fungi. Approved standard, M38-A. 2002.Wayne Pa.2. Clinical Laboratory Standards Institute. Referencemethod for broth dilution antifungal susceptibility testing ofyeasts. Approved Standard, M27-A2. 2002. Wayne, Pa.3. Clinical Laboratory Standards Institute. Method forAntifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts.Approved Guideline, M44-A. 2004. Wayne, Pa.4. Cuenca-Estrella M, Gomez-Lopez A, Mellado E,Rodriguez-Tudela JL. Correlation between the procedure

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Prueba de sensibilidad a los antifúngicos.Microdilución en caldo Edición Nº 01 Página 8 de 8

for antifungal susceptibility testing for Candida spp. of theEuropean Committee on Antibiotic Susceptibility Testing(EUCAST) and four commercial techniques. Clin MicrobiolInfect 2005; 11:486-492.5. Cuenca-Estrella M, Moore CB, Barchiesi F, Bille J,Chryssanthou E, Denning DW et al. Multicenter evaluationof the reproducibility of the proposed antifungalsusceptibility testing method for fermentative yeasts of theAntifungal Susceptibility Testing Subcommittee of theEuropean Committee on Antimicrobial SusceptibilityTesting (AFST-EUCAST). Clin Microbiol Infect 2003; 9:467-474.6. Cuenca-Estrella M, Rodriguez-Tudela JL. Shouldantifungal treatments be based upon results of antifungalsusceptibility testing? Rev Iberoamer Micol 2002; 19:133-138.7. Espinel-Ingroff A, Barchiesi F, Cuenca-Estrella M, PfallerMA, Rinaldi M, Rodriguez-Tudela JL et al. International andmulticenter comparison of EUCAST and CLSI M27-A2broth microdilution methods for testing susceptibilities ofCandida spp. to fluconazole, itraconazole, posaconazole,and voriconazole. J Clin Microbiol 2005; 43:3884-3889.8. Gomez-Lopez A, Aberkane A, Petrikkou E, Mellado E,Rodriguez-Tudela JL, Cuenca-Estrella M. Analysis of theinfluence of Tween concentration, inoculum size, assaymedium, and reading time on susceptibility testing ofAspergillus spp. J Clin Microbiol 2005; 43:1251-1255.

9. Rex JH, Pfaller MA, Walsh TJ, Chaturvedi V, Espinel-Ingroff A, Ghannoum MA et al. Antifungal susceptibilitytesting: practical aspects and current challenges. ClinMicrobiol Rev 2001; 14:643-658.10. Rodriguez-Tudela J.L., Barchiesi F, Bille J,Chryssanthou E, Cuenca-Estrella M, Denning D et al.Method for the determination of minimum inhibitoryconcentration (MIC) by broth dilution of fermentativeyeasts. Clin Microbiol Infect 2003; 9:I-VIII.11. Rodriguez-Tudela JL, Cuenca-Estrella M, Rodero L,Carpintero Y, Gorgojo B. Influence of shaking on antifungalsusceptibility testing of Cryptococcus neoformans: acomparison of the NCCLS standard M27A medium,buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.Antimicrob Agents Chemother 2000; 44:400-404.12. Rodriguez-Tudela JL, Chryssanthou E, Petrikkou E,Mosquera J, Denning DW, Cuenca-Estrella M.Interlaboratory evaluation of hematocytometer method ofinoculum preparation for testing antifungal susceptibilitiesof filamentous fungi. J Clin Microbiol 2003; 41:5236-5237.

PNT-MIC-12PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS. Método de difusión en agar; E-test y difusión con

discos (fluconazol y voriconazol)

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Pruebas de sensibilidad a los antifúngicos.Método de difusión en agar; E-test y difusión

con discos (fluconazol y voriconazol)Edición Nº 01 Página 2 de 5

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para realizar pruebas de

sensibilidad in vitro a los antifúngicos, mediante lasdos técnicas de difusión en agar más utilizadas, latécnica comercial de E-test y el método de difusióncon discos de antifúngicos.

Este procedimiento es aplicable a todos loslaboratorios de microbiología clínica que posean ladotación y experiencia adecuada para el manejo deestos microorganismos y de las técnicas dedeterminación de la sensibilidad in vitro de losmismos.

2. FUNDAMENTOLa técnica de E-test consiste en unas tiras de

plástico inerte que incorporan un gradiente deconcentración de antifúngico. Cuando se depositansobre las placas de agar inoculadas con elmicroorganismo, el antifúngico difunde en el medio ytras una incubación a 35ºC, durante 24-48 horaspara Candida spp. y 48-72 horas para C. neoformansy hongos filamentosos, se determina la CMI, que esel punto de intersección de la elipse de inhibición decrecimiento con la tira de E-test. Parece ser elmétodo de elección para detectar las cepasresistentes a anfotericina B, usando el medio agarRPMI 1640 complementado con un 2% de glucosa.

El método de difusión con discos de antifúngicos esun procedimiento de difusión sencillo y práctico,validado para realizar estudios con fluconazol yvoriconazol (documento M44-A del CLSI), que sebasa en la técnica clásica de discos cargados conantimicrobiano y medida de los halos de inhibición. Elmedio de cultivo recomendado es Mueller-Hinton conun 2% de glucosa y con azul de metileno, ya queparece mejorar la lectura de las placas, al aumentarla nitidez de los halos de inhibición. Hasta la fechasólo se ha validado para estudios con levaduras

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de la

SEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.

- UNE-EN-ISO 15189-03. Medical Laboratories.Particular requirements for quality and competence.

- CLSI M44-A 2004. Method for Antifungal DiskDiffusion Susceptibility Testing of Yeasts. Approvedstandard.

- Manual de instrucciones y utilización de la técnicaE-test.

- EUCAST-AFST 2006. Method for the determinationof Minimum Inhibitory Concentration (MIC) by BrothDilution of Aspergillus species. En prensa.

- CLSI M38-A 2002. Reference method for brothdilution antifungal susceptibility testing offilamentous fungi.

4. MUESTRASEstas pruebas de sensibilidad pueden realizarseutilizando cepas de levaduras cultivadas en mediosólido. Las cepas deben estar en cultivo puro. Se

deben utilizar subcultivos de no más de 24-48 horaspara las levaduras.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS- Agar RPMI 1640 con L-glutamina y sin bicarbonato

con 2% de glucosa.- Ácido morfolinpropanosulfónico (MOPS).- Agar Mueller-Hinton con un 2% de glucosa.- Azul de metileno.- Tiras de E-test con antifúngicos.- Discos de fluconazol de 25 µg.- Discos de voriconazol de 1 µg.- Agua destilada estéril.- Solución salina 0,85% estéril.- Placas de agar Sabouraud glucosado (SDA).- Tubos de agar patata glucosada.- Tween 20.- Criotecas y/o tubos para conservación de cepas.- Escala de McFarland.- Soluciones de verificación de pHmetro.

6. APARATOS Y MATERIALES- Incubador de 35 ± 2ºC.- pHmetro.- Neveras y congeladores.- Nefelómetro o espectrofotómetro para tubos.- Agitador rotatorio Vórtex.- Tubos plástico estériles de 5 ml.- Tubos de cristal tipo Bijoux de 3 ml.- Filtros de 0,22 µm de diámetro de poro para

unidades de filtración.- Frascos de vidrio estériles con tapón de rosca y

capacidad de 250, 500 y 1000 ml.- Probetas de 250, 500 y 1000 ml de capacidad.- Unidades de filtración de 500 ml en plástico

autoclavables.- Barras magnéticas de agitación.- Gradillas autoclavables para tubos de 5, 10 y 25 ml

de capacidad.- Cajas de plástico para puntas de micropipeta

autoclavables.- Cajas de plástico para incubación de las placas de

microdilución estériles.- Tubos de plástico de 50 ml tipo Falcon.- Pipetas Pasteur estériles.- Escobillones o torundas estériles.- Micropipetas de volumen variable uni y multicanal.- Puntas de micropipetas con filtro estériles.

7. PROCESAMIENTO DE LA TÉCNICA DE E-testPara realizar esta técnica deben seguirse lasrecomendaciones recogidas en el Manual deInstrucciones del fabricante .

7.1. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO- El medio de cultivo recomendado es agar RPMI

1640 con glutamina, sin bicarbonato y a pH 7,0complementado con glucosa al 2%. Como sistemaamortiguador se utiliza MOPS 0,164 M.

- El medio debe esterilizarse mediante filtración confiltros de 0,22 µm de poro. Nunca debe

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con discos (fluconazol y voriconazol)Edición Nº 01 Página 3 de 5

autoclavarse. Por ello se recomienda supreparación a doble concentración que, al añadirigual volumen de una solución autoclavada de agar3% en agua destilada, quedará el medio a laconcentración de trabajo con un 1,5% de agar.

- El medio se dispensará en placas de Petri de 9 ó15 cm de diámetro.

- Pueden utilizarse como medios alternativos el agarcasitona modificado, el agar AM3 e incluso el agarMueller-Hinton 2% glucosa con azul de metileno(ver procedimiento de la técnica con discos).

7.2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO.- Para Candida spp. preparar una suspensión al 0,5

McFarland en solución salina (0,85 % de NaCl) apartir de un cultivo de 24 horas en SDA.

- Para C. neoformans, preparar una suspensión al 1McFarland en solución salina y a partir de un cultivode 48-72 horas en SDA.

- Para los hongos filamentosos se siguen lasrecomendaciones recogidas en los documentos dereferencia del CLSI y del EUCAST.

- A partir de estas suspensiones, inocular las placasde agar con una torunda sembrando en tresdirecciones.

- Dejar secar 10-15 min para que se absorba elexceso del inóculo.

- Aplicar las tiras de E-test sobre la superficie delagar, bien manualmente o con el aplicadorsuministrado por la casa comercial, colocando 5tiras si la placa es de 14 cm de diámetro y 2 si esde 9 cm, situando el extremo de mayorconcentración del antifúngico hacia la parte exteriorde la placa.

7.3. INCUBACIÓN.Se debe realizar a 35ºC en aerobiosis durante 24-

48 horas para Candida spp. y 48-72 horas para C.neoformans y hongos filamentosos.

7.4. LECTURA.En los azoles, la CMI es la concentración de

antifúngico en el punto de intersección de la elipse

de inhibición de crecimiento con la tira. En el caso deobservarse colonias de menor tamaño en el interiorde la elipse de inhibición de los azoles, no hay quetenerlas en cuenta para la determinación de la CMI.A veces, con algunos azoles, se observa doble halode inhibición pero con colonias del mismo tamaño(grandes) en su interior, en este caso debeconsiderarse resistente. En el caso de observarsetriple halo de inhibición, la CMI es la concentracióndonde las colonias cambian de tamaño.

En el caso de la anfotericina B, toda colonia en elinterior de la elipse de inhibición,independientemente de su tamaño, debe valorarsepara la lectura de la CMI.

No existen unos criterios de interpretación propiosde esta técnica comercial. Se aconseja que se siganlos recogidos en los métodos de referencia.

7.5. CONTROL DE CALIDADEl control de calidad se realiza siguiendo de

forma similar al descrito en los documentos dereferencia.- Se recomienda hacer controles de los lotes de

RPMI y del proceso de preparación de las placasde microdilución.

- Se recomienda mantener las cepas control decalidad a -70 C. Si se quieren manteneralmacenadas para uso frecuente, puedensubcultivarse en agar Sabouraud y conservar a 2-8ºC, durante 15 días. Tras esas dos semanasdeben subcultivarse de nuevo.

- Las cepas control de calidad deben incluirsesiempre que se realicen pruebas de sensibilidad,para comprobar que sus CMIs están dentro delintervalo de control.

- Si tras repetir el test 20 veces en días distintos, laCMI de la cepa control no se incluye en el intervaloen más de una ocasión, debe analizarse todo elproceso en busca del error.

La tabla 1 incluye los valores de referencia para lascepas de control de calidad más utilizadas, segúnrecomienda el fabricante de la técnica.

Tabla 1. Intervalos de CMIs de las cepas control para la técnica de E-test. Para otros antifúngicos no existendatos. Datos en mg/L

Antifúngico C. parapsilosis ATCC 22019 C. krusei ATCC 6258

Anfotericina B 0,25-2,0 0,50-2,0

Fluorocitosina 0,12-0,50 > 32

Fluconazol 2,0-8,0 > 256

Itraconazol 0,06-0,25 0,12-0,50

Ketoconazol 0,03-0,12 0,25-1,0

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8. PROCESAMIENTO DE LA TÉCNICA DEDIFUSIÓN CON DISCOS DE FLUCONAZOL YVORICONAZOL

Para realizar esta técnica deben seguirse lasrecomendaciones recogidas en el documento M44-Adel CLSI estadounidense.

8.1. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVOEl medio recomendado es el agar Mueller-Hinton(MHA) suplementado con un 2% de glucosa y 0,5µg/ml de azul de metileno. El procedimiento es elsiguiente:

- Añadir 100 µl de una solución de azul demetileno (5 mg/l) a 100 ml de la solución madrede glucosa (0,4 g/l). La solución resultante tendráuna concentración de azul de metileno de 5µg/ml, y de glucosa de 0,4 g /ml).

- Esterilizar por filtración.- Añadir 1 ml a la superficie de las placas de MHA

de 9 cm de diámetro. En el caso de utilizar placasde 15 cm de diámetro se añadirán 2,9 ml.

- Extender y dejar que se absorba durante toda lanoche.

8.2. PREPARACIÓN DEL INOCULO EINCUBACION

- Preparar una suspensión al 0,5 McFarland ensolución salina (0,85 % de NaCl) a partir de uncultivo de 24 horas en SDA.

- La inoculación de las placas se realiza de formasimilar a la recogida en el punto 7.2.

- La colocación de los discos de antifúngicos y laincubación deben realizarse según lasrecomendaciones del documento M44-A.

8.3. LECTURA DE LAS PLACASPuede realizarse de dos formas, visualmente con

regla o calibre, o automáticamente con el sistema elBIOMIC V3 (Giles Scientific Inc.), un método queincluye una cámara de video y un programainformático para interpretar los halos de inhibición.La tabla 2 recoge los criterios interpretativos de estatécnica.

8.4. CONTROL DE CALIDADEl control de calidad se realiza de forma similar aldescrito en el apartado 7.5.La tabla 3 incluye los valores de referencia para lascepas de control de calidad más utilizadas.

9. RESPONSABILIDADES- El procedimiento deberá llevarse a cabo por personal

técnico cualificado con un entrenamiento específico.- La supervisión de la técnica y de los resultados

emitidos deberá realizarla un facultativo especialistaresponsable del laboratorio de microbiología.

- Las responsabilidades deben estar perfectamentedescritas en el manual general de organización dellaboratorio de microbiología y en las fichas dedescripción de los puestos de trabajo.

Tabla 2. Criterios interpretativos de los halos de inhibición para la técnica de difusión en agar con discos defluconazol y voriconazol

Antifúngico Sensible Sensible dosisdependiente Resistente

Fluconazol < 14 mm 15-18 mm > 19 mm

Voriconazol < 13 mm 14-16 mm > 17 mm

Tabla 3. Intervalos de los mm de los halos de inhibición CMIs de las cepas control para la técnica de difusión condiscos.

Antifúngico Discos C. albicansATCC 90028

C.parapsilosisATCC 22019

C. tropicalisATCC 750

�C. kruseiATCC 6258

Fluconazol 25 µg 28-39 22-33 26-37 --

Voriconazol 1 µg 31-42 28-37 -- 16-25

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10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO- Todos los procedimientos deben seguir las normas

de bioseguridad e higiene en microbiología, quedeben estar recogidas en un protocolo normalizadodel laboratorio.

- Con estas técnicas de difusión o comerciales sepuede proporcionar una información rápidamente,que puede ser de utilidad clínica.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO- Estas técnicas no son muy útiles para realizar

pruebas con especies de levaduras de crecimientolento

- La interpretación de los resultados debe hacersecon prudencia. No existen puntos de corte paramuchas especies y antifúngicos y, además, engeneral no hay buena correlación entre las pruebasde sensibilidad y la evolución clínica de pacientescon micosis graves.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Clinical Laboratory Standards Institute. Method forAntifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts.Approved Guideline, M44-A. 2004. Wayne, Pa.2. Cuenca-Estrella M, Gomez-Lopez A, Mellado E,Rodriguez-Tudela JL. Correlation between the procedurefor antifungal susceptibility testing for Candida spp. of theEuropean Committee on Antibiotic Susceptibility Testing(EUCAST) and four commercial techniques. Clin MicrobiolInfect 2005; 11:486-492.3. PfallerMA, Boyken L, Messer SA, Tendolkar S, Hollis RJ,Diekema DJ. Evaluation of the Etest method using Mueller-Hinton agar with glucose and methylene blue fordetermining amphotericin B MICs for 4,936 clinical isolatesof Candida species. J Clin Microbiol. 2004; 42:4977-4979.4. Pfaller MA, Diekema DJ, Rinaldi MG, Barnes R, Hu B,Veselov AV, Tiraboschi N, Nagy E, Gibbs DL. Results fromthe ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study: a6.5-year analysis of susceptibilities of Candida and otheryeast species to fluconazole and voriconazole bystandardized disk diffusion testing. J Clin Microbiol. 2005;43:5848-5859.