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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
COMPARACIÓN HISTOPATOLÓGICA DEL EFECTO CICATRIZANTE DE 2
TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS VERSUS 1 TRATAMIENTO
CONVENCIONAL EN HERIDAS EXPERIMENTALES DÉRMICAS EN
COBAYOS EN CAMPO.
Autor: Yadira Estefanía Loya Pachacama
Tutor: Dra. Evelyn Pamela Martínez López
Quito, Diciembre 2018
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Comparación histopatológica del efecto cicatrizante de 2 tratamientos
alternativos versus 1 tratamiento convencional en heridas experimentales
dérmicas en cobayos en campo.
Trabajo de titulación previo a la obtención del título de Médico Veterinario Zootecnista
Autor: Yadira Estefanía Loya Pachacama
Tutor: Dra. Evelyn Pamela Martínez López
Cotutor: Dra: Ana Gabriela Toro Mayorga
Quito, Diciembre 2018
ii
DERECHOS DEL AUTOR
Yo Yadira Estefanía Loya Pachacama en calidad de autor y titular de los
derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación “COMPARACIÓN
HISTOPATOLÓGICA DEL EFECTO CICATRIZANTE DE 2 TRATAMIENTOS
ALTERNATIVOS VERSUS 1 TRATAMIENTO CONVENCIONAL EN HERIDAS
EXPERIMENTALES DÉRMICAS EN COBAYOS EN CAMPO”. Modalidad
presencial. Proyecto de Investigación, de conformidad con el Art. 114 del
CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS
CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la
Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no
exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente
académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra,
establecidos en la normativa citada.
Así mismo autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio
virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de
Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su
forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la
responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta
causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad.
En la ciudad de Quito, a los 26 días del mes de noviembre del 2018. ---------------------------------------------------------
Srta. Yadira Estefanía Loya Pachacama C.I.172149980-2 Email: [email protected]
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo, Evelyn Pamela Martínez López en mi calidad de tutor del trabajo de
titulación, modalidad Proyecto de Investigación, elaborado por YADIRA
ESTEFANÍA LOYA PACHACAMA, cuyo título es: “COMPARACIÓN
HISTOPATOLÓGICA DEL EFECTO CICATRIZANTE DE 2 TRATAMIENTOS
ALTERNATIVOS VERSUS 1 TRATAMIENTO CONVENCIONAL EN HERIDAS
EXPERIMENTALES DÉRMICAS EN COBAYOS EN CAMPO”, previo a la
obtención del Grado de Médico Veterinario Zootecnista; considero que el
mismo reúne los requisitos y méritos para ser sometido a la evaluación por
parte del tribunal examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de
que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación
determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 26 días del mes de noviembre del 2018.
------------------------------------------------------ Dra. Evelyn Pamela Martínez PhD(c) Docente FMVZ Tutor C.I. 1716294002
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El tribunal constituido por: Dr. Richard Salazar, Dr. Jorge Mosquera, Dr. Javier
Vargas, Dr. César Guanoluisa.
Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la
obtención del título (o grado académico) de Médico Veterinario Zootecnista
presentado por la señorita Yadira Estefanía Loya Pachacama.
Con el Título:
“COMPARACIÓN HISTOPATOLÓGICA DEL EFECTO CICATRIZANTE DE 2
TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS VERSUS 1 TRATAMIENTO
CONVENCIONAL EN HERIDAS EXPERIMENTALES DÉRMICAS EN
COBAYOS EN CAMPO”
Emite el siguiente veredicto: (aprobado/reprobado)……………………………..
Fecha:……………………………………
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre y Apellido Calificación Firma
Nombre y apellido Calificación Firma
Presidente Richard Salazar ………………… …………………..
Vocal 1 Jorge Mosquera ………………... ………………….
Vocal 2 César Guanoluisa ..……………….. ………………….
v
DEDICATORIA
A Dios por darme la oportunidad de cumplir el sueño que ha puesto en mi corazón.
A mis padres por el amor, apoyo incondicional y dedicación, sin ustedes no lo habría logrado, gracias por luchar por mí en contra de todas las dificultades.
Al pequeño Jacob quien me mira desde el cielo, sin duda el pensar en ti me dió fuerzas para no detenerme en el camino.
Al Doctor Jorge Mosquera por ser de gran influencia en mí como persona y profesional.
A todos mi cariño y respeto.
vi
AGRADECIMIENTO
A mis padres, hermanos y sobrinos por poner su confianza y recursos en mi carrera y en mi vida, cada uno ha aportado un granito de arena para este sueño.
Al Doctor Carlos Martínez y Doctora Gabriela Toro, quienes en calidad de tutor y cotutora colaboraron con aportes valiosos para el presente trabajo de investigación, y quienes a pesar de tener que haber viajado fuera del país por motivos académicos, han estado pendientes en todo momento de la continuación y culminación del trabajo de investigación, gracias por el apoyo, tiempo y paciencia, sin ustedes el proyecto no habría salido adelante.
A la Doctora Pamela Martínez por tomar la posta como tutora, en esta fase del proyecto, por su tiempo, paciencia, cada consejo suyo ha sido muy valioso y me ha hecho crecer como persona y futura profesional.
Al equipo de trabajo del Laboratorio de Histopatología dirigido por la Licencia Marcela Pazmiño junto con el apoyo de María José Cando, Ariana Pazmiño, Linda Erazo, Santiago Asqui, Byron Sarabia.
A mis amigos de carrera Mary Cazares, Anita Carpio, Bryan Yépez, Ronnie Mayorga, Paola Palate y Santiago Bastidas, por ser un pilar fundamental en mi vida universitaria y diaria, su amistad es muy importante
A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia por la formación académica brindada durante mi formación académica.
vii
Índice de contenido
DERECHOS DEL AUTOR ................................................................................... ii
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN ......................... iii
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL .............................. iv
DEDICATORIA ................................................................................................... v
AGRADECIMIENTO ........................................................................................... vi
Índice de tablas .................................................................................................. ix
Índice de figuras ................................................................................................. x
Índice de anexos ................................................................................................ xi
RESUMEN ........................................................................................................ xii
ABSTRACT ...................................................................................................... xiii
CAPÍTULO I ....................................................................................................... 1
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 1
CAPÍTULO II ...................................................................................................... 3
2. OBJETIVOS ................................................................................................ 3
General ........................................................................................................... 3
Específicos ..................................................................................................... 3
CAPÍTULO III ..................................................................................................... 4
3. MARCO TEÓRICO...................................................................................... 4
3.1. Definición de herida ............................................................................. 4
3.2. Clasificación de las heridas .................................................................. 4
3.3. Proceso de cicatrización de heridas dérmicas ..................................... 5 3.3.1. Fase inflamatoria .............................................................................. 5 3.3.2. Fase proliferativa .............................................................................. 5
3.4. Curación de heridas dérmicas.............................................................. 8
3.5. Tratamientos para heridas dérmicas .................................................... 9 3.5.1. Violeta de genciana .......................................................................... 9 3.5.2. Miel de abejas ................................................................................ 10 3.5.3. Aloe vera ........................................................................................ 12
CAPÍTULO IV ................................................................................................... 14
4. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................... 14
4.1. MATERIALES ........................................................................................ 14
4.2. METODOLOGÍA .................................................................................... 15 4.2.1. Ubicación del estudio ...................................................................... 15 4.2.2. PARTE 1: Fase experimental .......................................................... 15 4.2.5. PARTE 2: Fase de laboratorio......................................................... 22
viii
4.2.3. Análisis estadístico .......................................................................... 28
CAPITULO V .................................................................................................... 31
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................... 31
5.1 RESULTADOS ........................................................................................... 31
5.1.1. Evaluación del proceso inflamatorio y tipo de células inflamatorias.... 31
5.1.2. Evaluación de la proliferación de fibroblastos y deposición decolágeno ...................................................................................................................... 33
5.1.3 Neovascularización .............................................................................. 36
5.1.4. Reepitelización.................................................................................... 37
5.1.6. Análisis de costos parciales ................................................................ 41
5.2 DISCUSIÓN ............................................................................................... 42
CAPITULO VI ................................................................................................... 47
6. CONCLUSIÓNES ......................................................................................... 47
7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 48
8. ANEXOS ...................................................................................................... 56
ix
Índice de tablas
Tabla 1. Lista de materiales utilizados durante la investigación. ...................... 14 Tabla 2. Protocolo prequirúrgico en cobayos. Fuente: Sarabia, (2018) ........... 20
Tabla 3. Protocolo anestésico aplicado durante el proceso quirúrgico en cobayos. Fuente: Sarabia, (2018). ............................................................ 20
Tabla 4. Descripción de las variables dependientes medidas. ......................... 29 Tabla 5. Categoría más frecuente de Inflamación y tipo de celular inflamatorio
de acuerdo al tratamiento y días de observación. ..................................... 31 Tabla 6. Categoría más frecuente de proliferación de fibroblastos y deposición
de colágeno. .............................................................................................. 34 Tabla 7. Categoría más frecuente de neovascularización por tratamiento y días
de observación. ......................................................................................... 36 Tabla 8. Categoría más frecuente de reepitelización en los grupos de acuerdo
al tratamiento y días de observación. ........................................................ 38 Tabla 9. Cuadro comparativo de resultados de acuerdo a las variables
dependientes y tratamientos usados en los animales experimentales. ..... 40 Tabla 10. Prueba Chi cuadrado de las variables bajo estudio. ......................... 41
Tabla 11. Análisis de costos parciales por grupos experimentales y por animal durante los 12 días de experimentación. ................................................... 41
x
Índice de figuras
Figura 1. a,b,c,d,e: División de 4 pozas en 6 partes para la distribución individual de cobayos. ............................................................................... 17
Figura 2. Método de marcaje por tarjetas en los grupos experimentales. ........ 19
Figura 3. Representación gráfica de las incisiones realizadas en las unidades experimentales. Día 0: realización de 3 incisiones lineales paralelas de 3 cm a nivel de todo el dorso del animal, con una separación de 3 cm entre cada una. .................................................................................................. 21
Figura 4. Zonas de referencia para la toma biopsias en los cobayos los días 3, 7 y 12. ....................................................................................................... 21
Figura 5. Biopsia de tejido cicatrizal de cobayo fijado con formol al 10% en donde la línea roja indica donde se realizó el corte de tejido. ................... 22
Figura 6. Corte transversal en tejido cicatrizal de cobayo fijado en formol al 10 %. .............................................................................................................. 23
Figura 7. Bloque de parafina con un corte transversal de tejido cicatrizal. ....... 23 Figura 8. Inflamación leve, dermis de cobayo. H&E.40x. ................................. 24
Figura 9. Inflamación moderada, dermis de cobayo. H&E.40x. ........................ 24 Figura 10. Inflamación severa, dermis de cobayo. H&E.40x. ........................... 25
Figura 11. a) proliferación abundante de fibroblastos, color rojo. b) Depósito homogéneo y abundante de colágeno, color azul. Dermis de cobayo, tinción tricrómica de Masson. 40x ............................................................. 25
Figura 12. Proliferación de fibroblastos y depósito de colágeno escaso. Dermis de cobayo, tinción tricrómica de Masson. 40x ........................................... 26
Figura 13. Proliferación de fibroblastos y depósito colágeno Leve. Dermis de cobayo, tinción tricrómica de Masson. 40x. ............................................... 26
Figura 14. Proliferación de fibroblastos y depósito colágeno Moderada. Dermis de cobayo, tinción tricrómica de Masson. 40x. .......................................... 26
Figura 15. Medición de reepitelización en la zona de cicatrización, dermis de cobayo. H&E. 10x...................................................................................... 27
Figura 16. Medición de neovascularización, dermis de cobayo. H&E.10x ...... 28
Figura 17. Neovascularización en la zona de cicatrización, dermis de cobayo. H&E 10x .................................................................................................... 28
Figura 18. Valoración porcentual de la variable inflamación por grupo de tratamiento y días de observación............................................................. 32
Figura 19. Valoración del tipo celular del proceso inflamatorio por grupo de tratamiento, días de observación y categoría. ........................................... 32
Figura 20. Valoración de la proliferación de fibroblastos por grupo por tratamiento y días de observación............................................................. 34
Figura 21. Valoración de deposición de colágeno por grupos de tratamiento y días de observación. ................................................................................. 35
Figura 22. Valoración de neovascularización por grupo de tratamiento y días de observación. .............................................................................................. 37
Figura 23. Valoración de reepitelización por grupo de tratamiento, días de observación y categoría. ........................................................................... 38
xi
Índice de anexos
Anexo 1. Aprobación del comité de investigación de la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia ............................................................................. 56
Anexo 2. Tabla de distribución de códigos en los grupos experimentales ....... 59 Anexo 3. Identificación de individuos experimentales por tratamiento usado. . 59
Anexo 4. Registro de aplicación de tratamientos. ............................................ 60 Anexo 5. Protocolo de envió de muestras del Laboratorio de Histopatología
FMVZ, UCE. .............................................................................................. 60 Anexo 6. Protocolo de procesamiento de muestras del Laboratorio de
Histopatología de la FMVZ, UCE. ............................................................. 60 Anexo 7. Protocolo de tinción H/E del laboratorio de Histopatología FMVZ, UCE
.................................................................................................................. 62 Anexo 8. Protocolo de tinción tricrómica de masson del Laboratorio de
Histopatología FMVZ, UCE ....................................................................... 63 Anexo 9. Análisis Estadístico SPSS ................................................................. 64
xii
RESUMEN
TÍTULO: Comparación histopatológica del efecto cicatrizante de 2 tratamientos alternativos versus 1 tratamiento convencional en heridas experimentales dérmicas en cobayos en campo.
La cicatrización de heridas dérmicas por segunda intensión, es un problema
muy frecuente en animales domésticos en las diferentes áreas de la medicina
veterinaria. Esto se ha convertido en un reto para los profesionales de la salud,
para quienes se vuelve cada vez más necesario el estudio de nuevas
alternativas eficientes, económicas y sobretodo sin efectos secundarios.
El objetivo de la presente investigación fue comparar histopatológicamente el
efecto cicatrizante de la violeta de genciana, como tratamiento convencional,
versus el tratamiento de miel de abejas y aloe vera, como tratamientos
alternativos, en heridas dérmicas en cobayos a nivel de campo.
Cinco cobayos fueron aleatoriamente designados a cada tratamiento y a un
grupo control, por lo tanto, un total de veinte cobayos fueron sometidos a
estudio. A cada animal se le realizaron tres incisiones dérmicas de 3 cm. de
largo a nivel del dorso, en las que se aplicó el tratamiento correspondiente a su
grupo, cada doce horas durante doce días. Se obtuvieron biopsias de piel del
área cicatrizal, para la evaluación histopatológica de las diferentes fases de
cicatrización como: inflamación, tipo celular inflamatorio, fibroplasia, deposición
de colágeno, reepitelización y neovascularización en los días tres, siete, y doce
posteriores a la incisión.
Los resultados mostraron diferencias cualitativas en los parámetros evaluados
entre tratamientos. Sin embargo, no existió diferencia significativa entre
tratamientos (P > 0,05), excepto en el parámetro de neovascularización en el
día siete. Los tres tratamientos evaluados histológicamente mostraron
hallazgos consistentes con un proceso cicatrizal; sin embargo, de acuerdo al
análisis cualitativo, calidad cicatrizal y costos, se determinó que el mejor
tratamiento fue el de miel de abejas.
Palabras clave: evaluación histopatológica, cuyes, cicatrización, miel de
abejas, aloe vera, violeta de genciana.
xiii
TITLE: Histopathological comparison of the healing effect of 2 alternative treatments versus 1 conventional treatment on dermic wounds in guinea pigs in a field experiment.
ABSTRACT
Healing of dermic scars after second intention is a very frequent issue in domestic animals within the different fields of veterinary medicine. This has become a challenge for the health care professionals, for whom it becomes increasingly necessary the study of new alternatives more efficient, economical, and especially with no side effects.
The aim of this study was to compare histopathologically, the healing effect of gentian violet, as a conventional treatment, versus honey and aloe vera, as alternative treatments on dermic wound healing, in guinea pigs in a field experiment.
Five guinea pigs were randomly assigned to each treatment and to a control group, thus, a total of twenty guinea pigs were included in the study. Each animal had three dermic provoked wounds of 3 cm. long on the back on which, the assigned treatment was applied every twelve hours for twelve days.
Skin biopsies, from the scar area, were collected for the histologic evaluation of the different stages of wound healing: inflammation, cellular inflammatory type, fibroplasia, collagen deposition, reepithelialization and neovascularization on days three, seven and twelve post wound incision.
The results showed qualitative differences in the evaluated parameters between treatments. However, there was no significant difference between treatments
(P0.05) except in neovascularization on day seven. The three treatments evaluated showed histological findings consistent with a wound healing process; however, it was determined that, according to the qualitative analysis, quality of the process, and costs, the best treatment was honey.
Key words: histopathologic evaluation, guinea pigs, wound healing, honey,
aloe vera, gentian violet.
I CERTIFY that the above and foregoing is a true and correct translation of the original document in Spanish.
Firma
Dra. Pamela Martínez
ID: 1716294002
1
CAPÍTULO I
1. INTRODUCCIÓN
Las heridas dérmicas son consideradas como uno de los problemas más
frecuentes en animales domésticos, las cuales son predispuestas por factores
como: manejo, producción, instalaciones, hábitat y comportamiento de las
especies animales (Pavletic, 2018). Las heridas han sido manejadas mediante
tratamientos empíricos y desde 1994 su manejo se basa en siete aspectos
claves como: primero, remover los exudados y los componentes tóxicos;
segundo, mantener un alto nivel de humedad en la interface herida – curación;
tercero, permitir el intercambio gaseoso; cuarto, proveer aislamiento térmico;
quinto, proteger de infección secundaria; sexto permitir ser removida en forma
atraumática y finalmente, ser económica (García, 2015; Muñoz et al., 2013)
En la práctica veterinaria, las heridas más comunes son de incisión, punción,
contusiones, golpes y mordeduras, las cuales tienen una alta probabilidad de
infectarse (Muñoz et al., 2013; Villalba & Bilevich, 2008). Por lo tanto, para el
tratamiento de las mismas se requiere conocer el proceso fisiológico de la
cicatrización de heridas, así como de la localización, la profundidad y las
características de la piel circundante (Andrades, Sepúlveda, & González, 2004;
Muñoz, 2012; Negrini, 2016).
Para establecer una cicatrización óptima, es necesario el uso de productos que
estimulen y aceleren la cicatrización y que actúen como reparadores a través
de la disminución y control de la hemorragia, alivio del dolor y aislamiento de la
herida del exterior (García, 2007; Gutiérrez et al., 2014; Muñoz, 2012; Villalba &
Bilevich, 2008). Actualmente, aún se siguen aplicando tratamientos
convencionales como antisépticos, por ejemplo, violeta de genciana, y
antibióticos de amplio espectro, los que pueden tener efectos secundarios. Por
ejemplo, el uso de antibióticos es cada vez más controversial debido a sus
efectos secundarios, relacionados a la resistencia antimicrobiana (Gutiérrez et
al., 2014). Por otro lado, la violeta de genciana es un agente antiséptico y
antifúngico, ampliamente usado en el Ecuador y en varios países, para el
2
tratamiento de quemaduras graves, lesiones de la piel y las encías. Sin
embargo, este tiene efectos secundarios como irritaciones en mucosas, tos,
vómitos si es ingerido, dolores de cabeza, vértigo, trastornos gastrointestinales
y se desconoce si existen residuos en la carne al ser aplicados de forma tópica
(IICA, 2018).
Sin embargo, a pesar del registro de estos efectos secundarios, aún persisten
conceptos ambiguos sobre la aplicación de dichos tratamientos y la relación
costo-efectividad de los productos convencionales, y también de los no
convencionales (G. García, 2015; Muñoz et al., 2013; Roemmers, 2012; Villalba
& Bilevich, 2008). Los tratamientos no convencionales más usados son la miel
de abejas y el aloe vera; estudios han comprobado que ambos son potentes
estimulantes del crecimiento celular y que, comparado con los tratamientos
convencionales, tienen mayor velocidad de curación, no tienen tiempo de retiro
y brindan un mejor pronóstico en cuanto a la cicatrización (San José & San
José de León, 2015; Schencke, Salvo, Veuthey, Hidalgo, & del Sol, 2011).
Por lo tanto, cada vez se vuelve más necesario el estudiar nuevas alternativas
de tratamiento que sean eficientes, económicas y sobre todo sin efectos
secundarios. Además, dichos estudios podrían evaluar su efecto mediante
técnicas como la histopatología, la cual proporciona información valiosa sobre
los procesos tisulares durante el proceso de cicatrización (Gutiérrez et al.,
2014; Villalba & Bilevich, 2008). De esta forma, se podrá encaminar la
elaboración de lineamientos sobre tratamientos cicatrizales, que unifiquen los
criterios de uso de los distintos productos convenciones y no convencionales
(Muñoz et al., 2013).
Dentro de este contexto, el presente estudio tuvo como propósito el evaluar el
proceso de cicatrización a nivel histopatológico, comparando dos tratamientos:
el convencional, violenta de genciana, versus los no convencionales, miel de
abejas y aloe vera, para sugerir el uso de una terapia alternativa para heridas
dérmicas; utilizando como animales experimentales los cobayos y bajo
condiciones de campo.
3
CAPÍTULO II
2. OBJETIVOS
General
Evaluar histopatológicamente el proceso de cicatrización dérmico en cobayos,
usando tratamientos no convencionales, miel de abejas y aloe vera, versus el
tratamiento convencional de violeta de genciana al 0,4%.
Específicos
• Evaluar histopatológicamente parámetros de cicatrización como
inflamación, tipo celular inflamatorio, fibroplasia, deposición de
colágeno, reepitelización y neovascularización en cada grupo
experimental.
• Determinar asociación entre los parámetros de cicatrización y los
tratamientos no convencionales, la miel de abejas y aloe vera, y entre
el tratamiento convencional, violeta de genciana.
• Determinar el costo parcial de los tratamientos utilizados por animal
en cada grupo experimental.
4
CAPÍTULO III
3. MARCO TEÓRICO
3.1. Definición de herida
Una herida es la consecuencia de una agresión por un agente externo sobre un
lugar del cuerpo, induciendo la pérdida de continuidad celular y anatómica de
tejidos de revestimiento, como piel y estructuras anexas. Al existir una herida,
el individuo queda expuesto a infecciones, pérdida de termorregulación local,
agua, electrolitos y proteínas, causando una disminución de las funciones
fisiológicas y protectoras de los mismos (Villalba & Bilevich, 2008; Gutiérrez et
al., 2014; Pavletic, 2018).
Por otro lado, físicamente, a la herida se la define como el producto de la
absorción de energía transferida al cuerpo, sea cual sea el agente externo que
la produzca y cuya gravedad, estará establecida por la potencia de la fuente
energética que la cause, la distribución de energía y del tipo de tejido que
absorbe la misma (Pavletic, 2018).
3.2. Clasificación de las heridas
Las heridas pueden clasificarse de acuerdo al mecanismo de acción que las
producen como son: heridas quirúrgicas y traumáticas.
a. Heridas quirúrgicas: son aquellas que se producen en un
ambiente controlado y estéril, previa limpieza de campo y con
instrumental desinfectado. Se caracteriza por tener bordes
regulares, dimensión y profundidad medidas por el cirujano
(Muñoz et al., 2013; Villalba & Bilevich, 2008).
b. Heridas traumáticas: Son heridas causadas por una incisión,
punción, contusión, mordeduras, las cuales tienen una alta
probabilidad de infección. Se caracterizan por tener bordes y
profundidad irregulares (Muñoz et al., 2013; Villalba & Bilevich,
2008).
5
3.3. Proceso de cicatrización de heridas dérmicas
La cicatrización es un proceso en el que se produce una secuencia de eventos
individuales, simultáneos y dinámicos, con el objetivo de reparar el daño tisular
(Guarín, Quiroga, & Stella, 2013). El proceso de cicatrización comprende las
siguientes fases:
3.3.1. Fase inflamatoria
La fase inflamatoria o preparatoria, tiene una duración de 24 a 96 horas
en donde el tejido se prepara para su proceso de curación posterior a
una agresión (Pavletic, 2018; Zachary, 2017). La fase inflamatoria se
caracteriza por la presencia de los signos típicos como: rubor, dolor,
calor y edema (Pavletic, 2018).
La vasoconstricción es la primera respuesta del organismo frente a una
agresión. Durante esta fase, las plaquetas intervienen mediante la
adhesión y agregación al colágeno, el cual se encuentra en la membrana
basal subyacente del endotelio lesionado. Posteriormente, se produce
una vasodilatación y hemostasia, debido a la formación del coágulo en la
luz y parte externa del vaso sanguíneo, generando una matriz
provisional que permitirá la migración de células inflamatorias (Kumar,
Abbas, & Aster, 2015; Pavletic, 2018; Senet, 2008). La primera línea de
defensa celular son los neutrófilos, los cuales producen enzimas
proteolíticas para despejar desechos celulares propios de la herida. A
partir del día 3, macrófagos y linfocitos son predominantes los cuales
van a crear un ambiente adecuado para la fase de granulación,
angiogénesis y deposición de la matriz celular, a través de la fagocitosis
y degradación de restos celulares de tejidos dañados (A. García, 2007;
Zachary, 2017) . Es importante recalcar que la presencia de una
inflamación excesiva en la herida no permitirá una cicatrización correcta
(Zachary, 2017; Kumar, et al, 2015).
3.3.2. Fase proliferativa
La fase proliferativa ocurre a partir del día 3 al 20 posterior a la agresión.
Dentro de esta fase existen 4 procesos:
6
a. Neovascularización o angiogénesis
Es el proceso relacionado a la formación de nuevos vasos
sanguíneos en la zona de la lesión, a partir de vasos
preexistentes. Este procesos es crucial para la cicatrización, ya
que aporta con oxígeno y nutrientes al tejido dando paso a la
cicatrización (Cañizares, 2016; Pavletic, 2018). Durante este
proceso se observa una marcada proliferación de células
endoteliales que se desplazan a lo largo de la matriz extracelular,
dando originen a nuevos vasos sanguíneos. Este proceso es
estimulado por proteasas, factores de crecimiento endotelial
vascular, y factores de crecimiento de fibroblastos (Garcia, 2011).
El proceso inicia con la vasodilatación y separación de las células
de Rouget de la membrana basal, mismas que maduran para
convertirse en el origen de nuevas células endoteliales y de
músculo liso. A partir del día 2 o 3, se forman capilares y grandes
vasos a través de la acción de proteínas, angiopoyetinas 1 y 2, y
enzimas de la matriz extracelular. Posteriomente, se da paso a la
extensión y remodelación del vaso, seguido por el cese de
migración de células endoteliales y deposición de la membrana
basal (Zachary, 2017; Kumar, et al, 2015). Del día 5 al 7 la
neovascularización será máxima. Cuando no existe hipoxia en el
tejido, la estimulación de la producción de elementos
angiogénicos se detiene, lo que conlleva a la apoptosis de los
vasos que ya no se requieren (Koilpillai & Devika, 2014; Kumar et
al., 2015).
b. Proliferación de fibroblastos o fibroplasia
Se caracteriza por la formación del tejido de granulación
compuesto por nuevos capilares, proliferación de fibroblastos y
una nueva matriz extracelular. A partir de las setenta y dos horas
posterior a la lesión, los fibroblastos se desplazan hacia la herida
y proliferan de forma rápida durante los primeros siete días,
alcanzando niveles máximos hacia el día catorce (Kumar et al.,
2015; Villalba & Bilevich, 2008). Los fibroblastos son células
7
fundamentales para la formación del tejido de granulación ya que
producen colágeno, elastina, fibronectina, ácido hialurónico y
proteasas, como colagenasa, mismos que son fundamentales en
la regeneración epitelial (Cañizares, 2016; Maxie, 2006), y
formación de una matriz extracelular (MEC) suelta (Villalba &
Bilevich, 2008).
Adicionalmente, en este proceso las células inflamatorias,
plaquetas y células endoteliales estimulan la formación de
factores de crecimiento y proteínas como: Factor de crecimiento
transformante alfa (TGF-α), factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor
de crecimiento de fibroblastos (FGF), interleucina 1 y factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-α), que intervienen en el
desplazamiento y proliferación de fibroblastos. Además, el tejido
mesenquimal y perilesional viable darán origen a nuevas células
(Takeo, Lee, & Ito, 2015).
c. Deposición de colágeno
A partir del día 3 al 5, los fibroblastos empiezan a producir
colágeno. Este proceso necesita la acción de enzimas
hidrolizantes (propil hidroxilasa y lisil hidroxilasa) y agentes como:
oxígeno, hierro, alfa cetoglutarato y ascorbato (vitamina C) para la
adecuada síntesis de colágeno (A. García, 2007; Pavletic, 2018).
El colágeno es una glicoproteína compuesta de glicina, prolina y
otros aminoácidos, capaz de organizarse de forma tridimensional
provisionando resistencia tensil a la cicatriz (Lizarbe, 2002). Al
inicio de la reparación del tejido dañado, se sintetiza colágeno tipo
III para posteriormente ser reemplazado por colágeno tipo I, el
que es más fuerte y mismo que se encuentra presente en tejidos
sanos (Pavletic, 2018; Roemmers, 2012).
d. Reepitelización
Este proceso inicia en el día 1 o 2 posterior a la lesión. La
reepitelización dura entre 7 y 10 días en heridas superficiales, 2
8
semanas en heridas medianamente profundas y 3 a 4 semanas
en heridas profundas (Kloeters, Schierle, Tandara, & Mustoe,
2011; Solís, Cortés, Saavedra, & Ramírez, 2007). En este
proceso, las células epiteliales se alojan y proliferan en dirección
lateral en las áreas viables de la herida a nivel de la zona basal.
Las enzimas proteolíticas secretadas en esta fase, hacen que la
costra que fue formada por el coagulo sea separada junto con el
estroma dañado, y comience así la regeneración epitelial
(Kloeters et al., 2011).
Por otro lado, las células basales sufren una alteración de su
morfología, agrandándose y aplanándose a medida que pierden el
contacto con la membrana basal y células adyacentes,
promoviendo la mitosis y migración celular por medio de la
colagenasa (Kumar et al., 2015). Las fibras de colágeno guían la
migración epitelial y la matriz extracelular expresa receptores de
superficie con la finalidad de facilitar la migración celular (Pavletic,
2018).
3.4. Curación de heridas dérmicas
a. Primera intención: Se refiere a la curación primaria de forma
directa de los bordes de la herida por medios externos, con
mínima contaminación y donde exista escasa formación de tejido
de granulación (Zachary, 2017).
b. Segunda intensión: Ocurre cuando la herida no puede ser
suturada por diversas razones como: tamaño, nivel de
contaminación, infección, flexibilidad, extensión de la piel y
localización de la herida. Por lo tanto, la herida permanece abierta
y la remodelación del tejido está dada por la presencia de tejido
de granulación en los bordes libres junto a la proliferación de
tejido conectivo y vascular. Cuando una herida se cicatriza por
segunda intensión se observa una intensa reacción inflamatoria
(Pavletic, 2018; Zachary, 2017).
9
3.5. Tratamientos para heridas dérmicas
Dentro de las opciones de tratamiento para heridas están los convencionales y
alterativos. Por un lado, el tratamiento convencional más común en animales es
la violeta de genciana, mientras que la miel y aloe vera cada vez son más
usados como tratamientos alternativos para el manejo de heridas.
3.5.1. Violeta de genciana
La violeta de genciana es un colorante de trifenilmetano que ha sido
ampliamente usado desde 1950 (Erdely & Sanders, 2013; FDA, 2012;
Maley & Arbiser, 2013). Ha sido usada para tratar infecciones
intestinales inespecíficas en cerdos y aves, como suplemento vitamínico
y mineral para el ganado, agente antibacteriano y antifúngico en peces, y
como antiséptico, antimicótico y antibacteriano para infecciones de piel y
ojos en animales (FDA, 2012, 2017; Szépvölgyi et al., 2014). Además, la
violeta de genciana también ha sido usada en humanos para tratar
parásitos intestinales y como antimicótico por periodos cortos de tiempo
(Erdely & Sanders, 2013; Maley & Arbiser, 2013).
La violeta de genciana tiene las siguientes propiedades:
• Antibacteriana: Debido a que logra atravesar los componentes
celulares bacterianos como: peptidoglicano, polisacáridos,
mitocondrias y ADN. De esta forma, altera el metabolismo celular,
función celular, estructura y síntesis de ciertos componentes
celulares (Erdely & Sanders, 2013; Maley & Arbiser, 2013). La
violeta de genciana es altamente eficaz para la mayoría de bacterias
Gram positivas y moderadamente efectivo en las Gram negativas.
Por ejemplo, es eficaz contra Streptococcus aureus
y Staphylococcus aureus, bacterias Gram positivas que se
encuentran en la piel (Maley & Arbiser, 2013), y contra
Pseudomonas spp.,bacterias Gram negativas (Andjelić, Zupančič, &
Hawlina, 2014; Erdely & Sanders, 2013).
Cicatrizante: Actúa estabilizando y secando las costras, creando
así una barrera de protección para evitar la infección por
10
microorganismos oportunistas, y subsecuente cicatrización de la
herida (Farid, Kelly, & Roshin, 2011).
Antifúngica: Actúa atravesando las estructuras celulares
permeabilizándolas y debilitándolas para luego adherirse a su ADN.
Además, disminuye el biofilm e inhibe el crecimiento celular. Se ha
investigado el efecto favorable contra infecciones por Candida spp.
en niños y onicomicosis (Erdely & Sanders, 2013).
Sin embargo, el uso de la violeta de genciana ha sido muy cuestionada
en cuanto a su seguridad en animales de producción. Poco se conoce
sobre posibles efectos residuales después de su uso en productos de
origen animal y, a su vez, los posibles efectos en los consumidores
(FDA, 2017; Szépvölgyi et al., 2014).
La Food and Drug Administration (FDA) emitió una resolución en junio
de 1980, donde se indica la prohibición del uso de este producto como
aditivo en alimento y como medicamento para tratar enfermedades en
animales de producción. Esta prohibición estará hábil hasta demostrar a
largo plazo si no tiene efecto cancerígeno (FDA, 2012; Sun, Ricker,
Osborne, Marder, & Schmitz, 2018). Países como Estados Unidos y
Australia no permiten el uso de violeta de genciana en animales de
consumo humano. Por otro lado, en Canadá, el uso tópico de la violeta
de genciana es autorizado principalmente para tratar problemas
dermatológicos (tiña, heridas) y problemas oculares (el ojo rosado)
(FDA, 2012, 2017; Sun et al., 2018)
3.5.2. Miel de abejas
Desde la antigüedad, la miel ha sido usada por los seres humanos con
fines alimenticios y terapéuticos. La miel es producida a nivel mundial y
actualmente se estima una producción de 1,2 millones de toneladas
anuales (Meo, Al-Asiri, Mahesar, & Ansari, 2017).
Es una sustancia dulce producida por la abeja Apis mellifera a partir del
néctar de flores o secreciones de plantas vivas (Martínez, 2014; San
José & San José de León, 2015). De acuerdo a los autores Da Silva,
11
Gauche, Gonzaga, Oliveira, & Fett (2015), la miel está compuesta por
más de 200 elementos, sin embargo, entre los más importantes están:
Carbohidratos: Los carbohidratos más importantes están la
fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa, isomaltosa, turanosa,
nigerosa, los cuales en total componen el 80% de la miel.
Agua, presente en un 15 %.
Ácidos orgánicos: Presentes en un 0,6%, entre estos están: el
ácido glucorónico, butírico, acético, láctico, málico entre otros, que
le proporcionan a la miel un pH acido.
Vitaminas: piridoxina, tiamina, niacina, riboflavina, ácido ascórbico
y ácido pantoténico
Minerales: hierro, cobre, calcio, zinc y antioxidantes
Sustancias volátiles como flavonoides y agentes fenólicos.
Durante siglos se ha atribuido diversas propiedades a la miel tanto a nivel
nutricional, estético y principalmente medicinal. Entre las más importantes
están:
Antibacterial: Se ha demostrado eficacia de la miel en bacterias
como: E. coli, Staphylococcus aureus y Pseudomona areuginosa
(Martínez, 2014; White, 2016). Las características antibacteriales
están dadas por 4 factores existentes en ella:
- pH 4 ácido: inhibe el crecimiento bacteriano y evita el daño
tisular producido por el amonio resultante del metabolismo
de los microorganismos (Martínez, 2014).
- Osmolaridad: al ser una sustancia hiperosmótica
deshidrata a los microorganismos y confiere a la herida
humedad, estabilizando la costra y acelerando el proceso
de cicatrización (San José & San José de León, 2015).
- Fuente floral: de acuerdo al tipo de flor de la que las abejas
obtienen el néctar para elaborar la miel, la presencia y
cantidad de componentes puede variar (Meo et al., 2017).
12
- Presencia de peróxido de hidrogeno: su liberación
periódica, aparece cuando existe la transformación de
glucosa en ácido glucónico y peróxido de hidrógeno
mediante la acción de la enzima glucoxidasa presente en
la miel. La cantidad como la dosis de este agente en la
miel es terapéutica por lo que no produce daño a nivel
tisular (Li et al., 2017).
Antiinflamatorio: Actúa como inmunomodulador inhibiendo el
complemento, estimulando la producción de citoquinas
inflamatorias, óxido nítrico, células MM6 relacionadas
específicamente con la regeneración de tejidos. Posteriormente,
se liberan las interleucinas IL-1B e IL-6 y factor de necrosis
tumoral alfa que enviará señales químicas para promover la
activación de los macrófagos (Calderon, Figueroa, Arias,
Sandoval, & Torre, 2015; Schencke et al., 2011; Schencke,
Vásquez, Sandoval, & del Sol, 2016)
Antioxidante: Actúa disminuyendo la cantidad de radicales libres,
fase inflamatoria, junto con la inactivación y supresión de especies
reactivas de oxígeno en la herida. Esta acción inhibe la
producción de fibroblastos y por lo tanto, contracción de la herida,
reduciendo la apariencia hipertrófica de la misma. La acción
antioxidante está dada por acción sinérgica entre flavonoides,
ácido ascórbico, vitaminas del complejo B, selenio, catalasa,
aminoácidos y selenio presentes en la miel (Alvarez et al., 2012).
Propiedades físicas: Actúa como barrera física al aplicar de
forma directa en la herida (White, 2016).
3.5.3. Aloe vera
El aloe vera es una planta fanerógama medicinal perteneciente a la
familia Liliaceae que ha sido usada a lo largo de la historia para
tratamientos sistémicos y tópico debido a sus propiedades terapéuticas,
bajo costo y fácil acceso (Domíguez et al., 2012).
13
Las propiedades del aloe vera están dadas por su composición, se han
reconocido por lo menos 75 principios activos como: componentes
fenólicos, polisacáridos, vitaminas E y C, enzimas, minerales, lignina,
saponinas, ácidos salicílicos, y aminoácidos (Gowri, 2015). Las
principales propiedades del aloe vera son:
Cicatrizante: Se atribuye esta propiedad al polisacárido
glucomanano y el factor de crecimiento de las giberelinas, las
cuales interactúan con los receptores del factor de crecimiento de
fibroblastos promoviendo su actividad y proliferación, y posterior
formación de colágeno (Sahu et al., 2013). Mejora la oxigenación
del tejido mediante la estimulación de la angiogénesis y
proporciona un ambiente hidratado en la zona de lesión (Haesler,
2017). Interviene en la composición del colágeno para la
contracción de la herida y produce un aumento en la síntesis de
ácido hialurónico ( Hamman, 2008; Sahu et al., 2013).
Antiséptica: Actúa como antiséptico gracias a la presencia de
agentes como lupeol, ácido salicílico, nitrógeno ureico, ácido
cinnamónico, fenoles y azufre. Estudios in vitro revelan acción
efectiva contra Streptococcus spp. y Shigella spp. (Calderón,
Quiñones, & Pedraza, 2011).
Antiinflamatorio: Actúa como antiinflamatorio debido a su
composición en ácidos grasos como: colesterol, campesterol y β-
sitosterol (Celestino & López, 2018; Hamman, 2008).
Inmunomodulador: Actúa sobre la activación celular en
macrófagos para la producción de óxido nítrico, generación de
citocinas y marcadores de superficie, existe también una
influencia en la respuesta de los linfocitos, y previene la
supresión de la inmunidad local (Hamman, 2008).
Sin embargo, debido a algunos componentes como las antraquinonas,
aloína y barbaloin, la administración tópica de aloe vera puede producir
reacciones alérgicas dérmicas, provocando ardor y prurito (Gowri, 2015;
Haesler, 2017).
14
CAPÍTULO IV
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. MATERIALES Los materiales usados en esta investigación están detallados en la Tabla 1.
Tabla 1. Lista de materiales utilizados durante la investigación.
Materiales Descripción
Unidades experimentales 20 cobayos
Insumos médicos
Algodón Cámara digital Guantes de examinación Ficha de registro Lápiz marcador Mascarillas Overol Desinfectante
Insumos del laboratorio
Cuchillo Tabla de picar Bandeja Colador Carpetas Cuchillas Guantes de examinación Hojas de registro de laboratorio (A4) Mandil Mascarillas Microscopio Placas portaobjetos y cubre objetos Reloj con cronómetro
Reactivos
Agua Agua destilada Formol al 10% Formol buferado al 10%. Alcohol al 50% Alcohol al 80% Alcohol al 90% Alcohol al 95% Alcohol al 100% Agua ácida Parafina
15
Tratamientos Miel de abejas Violeta de genciana Aloe vera
Tinciones Hematoxilina Eosina Tricrómica de Masson
Equipos Microscopio y software“Motic BA210" Cámara de microscopio “Moticam 2.0 mp” Cámara de Flujo “BIOBASE” Equipo de Inclusión “MEDIMEAS
4.2. METODOLOGÍA 4.2.1. Ubicación del estudio
El presente estudio tuvo dos etapas:1) Parte experimental de campo y 2) Etapa
de laboratorio para la evaluación histopatológica. La parte experimental se
realizó en las instalaciones del Centro Experimental Uyumbicho (CEU) de la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ), de la Universidad
Central del Ecuador (UCE). El CEU se encuentra en la provincia de Pichincha,
cantón Mejía, parroquia de Uyumbicho, cuyas coordenadas geográficas son:
Latitud: 0°23'55.867" S; Longitud: 78°32'3.893" O. (Googlemaps.com, 2018).
La parte de laboratorio fue realizado en el Laboratorio de histopatología
“Eduardo Vásconez” de la FMVZ de la UCE. El laboratorio se encuentra
ubicado en la provincia de Pichincha, cantón Quito, Parroquia: Belisario
Quevedo, cuyas coordenadas geográficas son: latitud 0°11′59″S; Longitud:
78°30′20″O. (Googlemaps.com, 2018).
4.2.2. PARTE 1: Fase experimental
a) Diseño de estudio
El presente estudio fue de tipo experimental completamente al azar, realizado
entre el mes octubre 2017 y octubre 2018. En el estudio se comparó
histopatológicamente el efecto cicatrizal de dos tratamientos no
convencionales: miel de abejas (T1), aloe vera (T2), un tratamiento
convencional: violeta de genciana al 4%(T3), y un grupo control (T0), el cual no
tuvo ningún tipo de tratamiento.
16
b) Unidades experimentales
Una vez aprobada la realización del presente estudio por el comité de
investigación de la FMVZ detallado en el Anexo 1, Se obtuvieron los animales
experimentales de la explotación de cuyes del CEU. Al finalizar el estudio,
todos los individuos fueron reingresados a la misma
c) Proceso de selección de los animales experimentales
Los individuos fueron seleccionados en base al cumplimiento de los siguientes
criterios de inclusión: cobayos tipo A, adultos, machos, aparentemente sanos
de 4 meses de edad y con peso comprendido entre 1.1 y 1.3 kg. Se
seleccionaron al azar un total de 20 individuos que cumplían dichas
características, los cuales fueron distribuidos aleatoriamente a cada uno de los
tratamientos de la siguiente manera:
T0: 5 cobayos como grupo control
T1: 5 cobayos tratados con miel de abejas
T2: 5 cobayos tratados con aloe vera
T3: 5 cobayos tratados con violeta de genciana
d) Manejo de cobayos
Instalaciones
Todas las unidades experimentales fueron colocadas y mantenidas en las
pozas del galpón de explotación de cuyes del CEU. El monitoreo de las
instalaciones fue diario y se verificó el estado físico y de funcionamiento
del galpón donde se realizó la experimentación.
Un total de 4 pozas fueron usadas, las cuales fueron divididas con malla
en 6 partes cada una, a una densidad de 1 animal por cada subdivisión
(600 cm2 por animal). Todas las pozas contaron con cama de 10 cm de
espesor a base de viruta (ver figura 1)
17
Figura 1. a,b,c,d,e: División de 4 pozas en 6 partes para la distribución individual de cobayos.
Además, el galpón de experimentación cuenta con ventilación y luz natural
proporcionada por ventanas cubiertas con mallas y rejas. El piso es de
cemento enlucido y las paredes son de ladrillo enlucido. El techo está
recubierto por láminas corrugadas de fibrocemento.
aa
b
c d
e
18
Alimentación y administración de agua de bebida
Todas las unidades experimentales recibieron el mismo tipo de
alimentación y forma de administración de agua de bebida, al igual que los
animales criados en la explotación, durante toda la fase experimental, de
acuerdo al manejo ya establecido por el CEU para los cobayos en el
galpón. El alimento constó de una combinación de 80% forraje y 20%
concentrado. Esta combinación de alimento es la usada de forma rutinaria
usada en la explotación de cuyes en el CEU. El forraje fue oreado bajo
sombra por lo menos 24 horas antes de su administración. Se agregó
agua en el concentrado, proporcionando así a los animales alimento
remojado, como una forma de administración de agua de bebida; este fue
colocado en comederos individuales de la siguiente manera: a las 07:00
horas se administró el concentrado 30 g por animal, más la mitad de la
ración diaria de forraje y a las 16:00 horas el resto de forraje.
Limpieza
Se realizó la limpieza y desinfección inicial de las pozas con amonio
cuaternario, previo a la colocación de la cama a base de viruta y
colocación de animales en las pozas. Las camas fueron removidas dos
veces por semana y las pozas fueron limpiadas diariamente, para evitar
procesos infecciosos.
Todos estos aspectos fueron monitoreados y realizados por Yadira Loya
Autora de la presente investigación.
Identificación y registros de los animales
Para la identificación de los cobayos se realizó por el método de tarjetas
de identificación individual: método indirecto de marcaje de animales
experimentales que consistió en colocar una tarjeta codificada en cada
poza individual de los animales. La información contenida en la tarjeta
correspondió a la identificación de cada individuo (Muñoz, 2010) (referirse
a la figura 2 y anexo 3). Todo esto bajo el siguiente criterio:
PCCNº: Proyecto Cobayos Control 1-5
19
PCMNº: Proyecto Cobayos Miel 1-5
PCANº: Proyecto Cobayos Aloe Vera 1-5
PCVNº: Proyecto Cobayos Violeta de genciana 1-5
En donde: PC= proyecto cobayos, T= grupo de tratamiento (Miel de
abejas: M; Aloe vera: A; Violeta de genciana: V; C= control), Nº= # de
animal (ver Anexo 2). El formato de registro aplicado durante esta
investigación se encuentra en el Anexo 4.
Figura 2. Método de marcaje por tarjetas en los grupos experimentales.
La selección de este método de marcaje se justifica, ya que los animales
serían sometidos a manipulación durante los 12 días de
experimentación. Por lo que en este aspecto, el objetivo principal era el
de causar el menor malestar, daño o estrés en los animales
experimentales, usando métodos indoloros y no invasivos que
disminuyen la probabilidad de alteración en los resultados esperados.
Proceso prequirúrgico y postquirúrgicos
Todos los procesos para la realización de heridas, manejo y cuidados
médico veterinarios estuvieron a cargo de la autora del presente trabajo,
bajo la supervisión del Dr. Carlos Martínez, docente de la FMVZ. En la
tabla 2 y 3 se detallan los protocolos realizados en la parte prequirúrgica y
anestésica.
20
Tabla 2. Protocolo prequirúrgico en cobayos. Fuente: Sarabia, (2018)
Procedimiento Descripción
Ayuno 2-3 horas
Evaluación clínica
Signos vitales normales Temperatura:38-39 ºC Frecuencia cardíaca: 230-280 lat./ minuto Frecuencia respiratoria: 82-90 resp./ minuto.
Prevención de hipotermia
Mantenimiento de la temperatura corporal mediante medios físicos: mantas y bolsas calientes hasta la recuperación de la anestesia
Prevención de desecación de la cornea
Aplicación de solución fisiológica en cada ojo
Preparación del paciente
Asepsia del área Rasurado Embrocado con clorhexidina al 10%, alcohol etílico al 70% y povidona yodada
Tabla 3. Protocolo anestésico aplicado durante el proceso quirúrgico en cobayos. Fuente: Sarabia, (2018).
Anestésico Dosis Tiempo de retiro
Ketamina Xilazina
25-50 mg/kg vía intramuscular 5 mg/kg vía intramuscular
5 días No tiene tiempo de retiro
Atención clínica postquirúrgica
Monitorización de los animales experimentales hasta que haya pasado el
efecto anestésico e inclusión de agua de bebida y alimento cuando el animal
este completamente despierto.
Procedimiento quirúrgico y tomas de biopsias post tratamiento.
La cirugía se llevó a cabo en un área adaptada en las instalaciones del
CEU. Esta área contó con una mesa quirúrgica, una fuente de luz
adecuada, aplicándose todas las normas de asepsia, antisepsia y
desinfección: como el uso de instrumental quirúrgico estéril, batas y
campos quirúrgicos, rasurado, limpieza y desinfección del área quirúrgica
con: clorhexidina, alcohol metílico y yodo.
21
En la figura 3 se representa las áreas donde se realizaron las incisiones
en las unidades experimentales. Cabe mencionar que se consideró como
día cero, la fecha en que se realizaron las incisiones.
Figura 3. Representación gráfica de las incisiones realizadas en las unidades experimentales. Día 0: realización de 3 incisiones lineales paralelas de 3 cm a nivel de todo el dorso del animal, con una separación de 3 cm entre cada una.
A partir del día 0, se contaron 3, 7 y 12 días, para llevar a cabo la toma de
biopsias, las mismas que fueron de forma elíptica, alrededor de cada una
de las lesiones (Figura 4). Para la toma de las biopsias, se siguieron los
protocolos prequirúrgicos anestésicos y post quirúrgicos detallados
anteriormente.
Figura 4. Zonas de referencia para la toma biopsias en los cobayos los días 3, 7 y 12.
3cm 3cm
3 IN
CIS
IÓN
1 IN
CIS
IÓN
2 IN
CIS
IÓN
2
º BIO
PS
IA
3ºB
IOP
SIA
1º B
IOP
SIA
Día 7 Día 3 Día 12
22
La biopsia obtenida fue depositada en un frasco con formol al 10% para su
envío al Laboratorio de Histopatología de la FMVZ (Anexo 5). Luego de la
toma de cada biopsia, la herida generada por este procedimiento fue
suturada con sutura Nylon 3-0, con la finalidad de que esto no interfiera con
las heridas experimentales adyacentes.
4.2.5. PARTE 2: Fase de laboratorio
Dos fases principales fueron realizadas a nivel de laboratorio: procesamiento
histológico de las muestras y lectura de placas.
El procesamiento de las muestras histológicas fue basado en los protocolos ya
establecidos por el Laboratorio de Histopatología de la FMVZ, UCE.
4.2.5.1 Procesamiento histológico de las muestras
Para el estudio histopatológico de la biopsia, se realizó un corte transversal en
la zona central del área cicatrizal, con la finalidad de obtener una vista tanto de
los bordes de la herida como de la región central (Figura 5 y 6).
El procesamiento de las muestras se realizó según los protocolos
estandarizados por el laboratorio de dispuesto, en donde los tejidos se
procesaron para inclusión en parafina formando bloques (Figura 7). Un total de
120 placas histológicas fueron obtenidas: 60 teñidas en Hematoxilina eosina
(H&E) y 60 en tinción Tricrómica de Masson siguiendo los protocolos descritos
y en los Anexos 7 y 8.
Figura 5. Biopsia de tejido cicatrizal de cobayo fijado con formol al 10% en donde la línea roja indica donde se realizó el corte de tejido.
23
Figura 6. Corte transversal en tejido cicatrizal de cobayo fijado en formol al 10 %.
Figura 7. Bloque de parafina con un corte transversal de tejido cicatrizal.
4.2.5.2 Lectura de placas histológicas
En total se realizó el análisis microscópico de 120 placas histológicas, en pares
y de forma independiente. El primer análisis fue realizado por la tesista, y el
segundo por la Dra. Gabriela Toro, docente responsable del Laboratorio de
Histopatología FMVZ, UCE. Posteriormente, los registros de lecturas fueron
evaluados en conjunto para obtener una hoja única de resultados de alta
veracidad.
Las placas fueron numeradas de forma aleatoria para mantener la evaluación
microscópica a ciegas, es decir, las personas a cargo de la evaluación del
tejido desconocían el tratamiento y día al que correspondían. Se mantuvo un
24
registro primario de identificación para conocer el número asignado a cada
placa y su correspondiente código de procedencia.
La lectura se realizó con dos tipos de tinciones, sesenta placas histológicas
fueron con tinción Hematoxilina y Eosina (H&E) donde se evaluaron los
parámetros de inflamación, reepitelización y angiogénesis; y sesenta placas
con tinción Tricrómica de Masson, en las que se evaluó la deposición de
colágeno y fibroplasia. Cada placa fue leída en tres campos microscópicos
utilizando fotografías de la herida, con la ayuda de un microscopio triocular
Motic B216 y el software Amscope, por medio del cual se realizó también la
medición de cada una de las variables detalladas a continuación.
a) Fase inflamatoria
Para el análisis de la fase inflamatoria se utilizó un aumento de 40x. Para la
evaluación se consideraron los parámetros de referencia obtenidos del trabajo
de Sarabia (2018). (Ver Tabla 4).
Figura 8. Inflamación leve, dermis de cobayo. H&E.40x.
Figura 9. Inflamación moderada, dermis de cobayo. H&E.40x.
25
Figura 10. Inflamación severa, dermis de cobayo. H&E.40x.
b) Fibroplasia y deposición de colágeno
La valoración de fibroplasia y depósito de colágeno se realizó con un aumento
de 10x. Para esta fase, se evaluó de forma cualitativa en color rojo a los
fibroblastos y en azul las fibras de colágeno como se observa en la Figura 11.
(Sarabia, 2018).
Figura 11. a) proliferación abundante de fibroblastos, color rojo. b) Depósito homogéneo y abundante de colágeno, color azul. Dermis de cobayo, tinción tricrómica de Masson. 40x
a
a
b
26
Figura 12. Proliferación de fibroblastos y depósito de colágeno escaso. Dermis de cobayo, tinción tricrómica de Masson. 40x
Figura 13. Proliferación de fibroblastos y depósito colágeno Leve. Dermis de cobayo, tinción tricrómica de Masson. 40x.
Figura 14. Proliferación de fibroblastos y depósito colágeno Moderada. Dermis de cobayo, tinción tricrómica de Masson. 40x.
27
c. Reepitelización y neovascularización
La valoración de reepitelización y neovascularización se realizó con el software
de AmScope con un aumento de 4x. Con este programa se obtuvieron
fotografías para medir ambos parámetos. Para reepitelización, se midió la
extensión total de la herida, y las zonas donde la capa de epitelio estuvo
completamente formado y adherido a la dermis superficial (Figura 15). Para
neovascularización, se midió el área total por debajo de la zona de
reepitelización, y el área donde se observa la presencia de neovascularización
(Sarabia, 2018). (ver Figuras 16 y 17)
Figura 15. Medición de reepitelización en la zona de cicatrización, dermis de cobayo. H&E. 10x
28
Figura 16. Medición de neovascularización, dermis de cobayo. H&E.10x
Figura 17. Neovascularización en la zona de cicatrización, dermis de cobayo. H&E 10x
.
4.2.3. Análisis estadístico
a) Variables de observación
En la tabla 4 se presenta las variables dependientes bajo estudio. La escala de
los parámetros de inflamación, tipo celular, deposición de fibroblastos y
colágeno están basados en los rangos establecidos por Sarabia (2018).
Debido a que en el presente estudio existió manipulación de los animales
experimentales para aplicación de tratamientos, se evidencio un incremento en
el tamaño de las áreas cicatrizales. Por lo tanto, las variables de
neovascularización y reepitelización no pudieron ser comparadas con los
rangos establecidos para la categorización por el estudio de Sarabia (2018). Ya
que en dicho estudio los animales no fueron manipulados, dando como
resultado áreas cicatrizales más pequeñas. Siendo necesario establecer
nuevas escalas para su posterior evaluación. Las nuevas escalas fueron
establecidas mediante dos criterios: 1) cálculo de percentiles (25, 50 y 75) de
las observaciones obtenidas en este estudio y, 2) análisis cualitativo de los
cortes histopatológicos.
29
Tabla 4. Descripción de las variables dependientes medidas.
VARIABLE INDICADORES ESCALA
Inflamación*
Número de células inflamatorias.
(ver figuras 8,9 y10)
Escala Valoración
Leve 1-200 células Inflamatorias,
moderado 200-400 células inflamatorias en tejido cicatrizal viable.
Severo > 400 células inflamatorias en tejido cicatrizal viable.
Tipo celular inflamatorio*
Células inflamatorias
Leve Polimorfonucleares
moderado Igual
Severo Mononucleares
Proliferación de fibroblastos*
Presencia de fibroblastos
(ver figuras 11,12,13,14)
Escaso Escasa proliferación de fibroblasto.
Leve
Proliferación leve de fibroblastos en forma de haces.
Moderado
Mayor grado de organización y acumulación de fibroblastos.
Abundante Gran cantidad de fibroblasto reactivo.
Deposición de colágeno*
Formación de colágeno
(ver figuras 9, 10, 11, 12)
Escaso Colágeno casi imperceptible.
Leve
Láminas colágenas acumuladas esporádicamente y de forma leve.
Moderado Acumulación moderada y multifocal de colágeno intercelular.
Abundante Marcada deposición de colágeno.
Neovascularización Cantidad vasos
sanguíneos en el tejido cicatrizal.
Nulo 0 mm2 de área de Neovascularización
Leve 0,01 – 0,15 mm
2 de área de
Neovascularización
Moderado 0,16 - 0,42 mm
2 de área de
Neovascularización
Abundante 0,43 – 0,mm
2 de área de
Neovascularización
Reepitelización
Formación y longitud de epitelio.
Escaso 0,14 - 0,34 mm de longitud de reepitelización
Leve 0,35 - 0,54 mm de longitud de reepitelización
Moderado 0,55 - 0,80 mm de longitud de reepitelización
Completo
>0,81 mm de longitud de reepitelización
*Categorías estandarizadas en base a la investigación de Sarabia (2018).
b) Factores bajo estudio
Los factores bajo estudio o variables independientes, fueron los tres
tratamientos: miel de abejas (T1), aloe vera (T2) y violeta de genciana al
4%(T3). Todos los tratamientos fueron aplicados siguiendo el mismo esquema.
Cada tratamiento fue aplicado directamente sobre la extensión total de la
herida, dos veces al día con previa limpieza de la zona con suero fisiológico,
durante doce días.
30
c) Estadística inferencial
Para determinar asociación entre las variables dependientes y variables
independientes (tratamientos) se utilizó la prueba estadística de Chi cuadrado
X2, con un nivel de significancia del 5% (Celis de la Rosa & Labrada, 2016).
Adicionalmente, cada análisis de asociación fue realizada en cada uno de los
días de observación 3, 7 y 12.
d. Análisis de costos parciales
El cálculo de costos parciales se realizó de acuerdo al valor comercial de cada
tratamiento, dividido para la cantidad de producto usado durante los doce días
de experimentación. El cálculo fue realizado por animal y por grupo de
tratamiento. Adicionalmente, para el cálculo de costos se tomó en cuenta que
en los días 1-3 existieron tres heridas dérmicas, mientras que los días 4 - 7
existieron dos heridas, y en los días 8 - 12 existió solo una herida.
31
CAPITULO V
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 RESULTADOS
5.1.1. Evaluación del proceso inflamatorio y tipo de células inflamatorias
En la tabla 5 se presenta un análisis del proceso inflamatorio de acuerdo a la
categoría de inflamación más frecuente según el tratamiento utilizado. Al día 3,
la categoría predominante fue moderada en los tratamientos con aloe vera,
miel de abejas, y el grupo control. Sin embargo, en el tratamiento con violeta de
genciana la inflamación es severa. Al día 7 la inflamación es moderada en
todos los grupos con una población celular variable. Al día 12 existe
inflamación leve en los grupos de tratamiento con aloe vera, miel de abejas y
violeta de genciana.
Tabla 5. Categoría más frecuente de Inflamación y tipo de celular inflamatorio de acuerdo al tratamiento y días de observación.
Tratamiento % (n/N) Categoría de inflamación
% (n/N) Tipo celular
Día 3
Control 60 (3/5) Moderado 80 (4/5) Polimorfonucleares Aloe Vera 60 (3/5) Moderado 60 (3/5) Polimorfonucleares Miel de abejas 60 (3/5) Moderado 100 (5/5) Polimorfonucleares Violeta de genciana 60 (3/5) Severo 80 (4/5) Polimorfonucleares Día 7
Control 60 (3/5) Moderado 40 40
(2/5) (2/5)
P+M Polimorfonucleares
Aloe Vera 60 (3/5) Moderado 40 40
(2/5) (2/5)
P+M Mononuclear
Miel de abejas 60 (3/5) Moderado 40 40
(2/5) (2/5)
Mononuclear P+M
Violeta de genciana 60 (3/5) Moderado 60 (3/5) P+M Día12
Control 60 (3/5) Severo 60 (3/5) Mononuclear Aloe Vera 60 (3/5) Leve 60 (3/5) P+M Miel de abejas 80 (4/5) Leve 100 (5/5) Mononuclear Violeta de genciana 100 (5/5) Leve 80 (4/5) Mononuclear
P+M: igual cantidad de células polimorfonucleares y mononucleares
En las figuras 18 y 19 se presenta el análisis de valoración porcentual por
unidad de experimentación (cobayos) y por grupo de tratamiento durante los
días de observación (3ero, 7mo y 12vo día). De forma general, independiente al
32
tipo de tratamiento usado, los individuos bajo experimentación presentaron un
proceso inflamatorio de tipo moderado durante los días 3 y 7, y leve en el día
12. En cuanto al tipo de celular inflamatorio el día 3 se presenta un predominio
de polimorfonucleares pasando al día 7 con la presencia de poblaciones
celulares variables (mononucleares y polimorfonucleares al mismo tiempo) y el
día 12 con predominio de células mononucleares.
Figura 18. Valoración porcentual de la variable inflamación por grupo de tratamiento y días de observación.
Figura 19. Valoración del tipo celular del proceso inflamatorio por grupo de tratamiento, días de observación y categoría.
20 40
60 60 20
40 20
40 20
20
80 60 60
20 20
20
40
80 60 60
20
40 20
100
40 60
60
20
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2 D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2 D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
L E V E M O D E R A D O S E V E R O
%
Control Aloe Miel Violeta de Genciana
80 40 20 20 40 20 20
60
60
20 20
40 60
20 40
40
100
20 40
40
100
80
60
20
20
40
80
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2 D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2 D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
P O L I M O R F O N U C L E A R E S P O L I + M O N O M O N O N U C L E A R
%
Control Aloe Miel Violeta de Genciana
33
Análisis Histopatológico
En la evaluación histopatológica al día 12, en el grupo control, se observaron
frecuentes granulomas por cuerpo extraño y ocasionales comedones, con una
inflamación piogranulomatosa asociada de leve a moderada. En los casos de
aloe vera, se observó frecuente inflamación intralesional principalmente en las
áreas de la dermis superficial. En la miel de abejas, la inflamación neutrofílica
se ubicó principalmente y en forma extensiva en la dermis superficial,
inmediatamente por debajo de la costra. En violeta de genciana existieron
ocasionales focos inflamatorios esporádicos o áreas de inflamación leve en las
áreas laterales y superficiales del área cicatrizal.
5.1.2. Evaluación de la proliferación de fibroblastos y deposición
decolágeno
Las dos categorías son evaluadas de forma simultánea ya que están
íntimamente relacionadas entre sí. En la tabla 6 se describe el análisis de
acuerdo a la categoría de inflamación más frecuente según el tratamiento
utilizado por unidad experimental en el total de la población.
Independiente al tratamiento, en el día 3 la proliferación de fibroblastos y
deposición de colágeno fue 100% escasa. En el caso de proliferación de
fibroblastos, en el día 7 existió el aumento de la actividad de fibroblastos en los
grupos de aloe vera y control. La categoría moderada fue la más frecuente en
la mayor parte de individuos. En el grupo de miel de abejas, el 100% de los
individuos tuvieron proliferación de fibroblastos de tipo moderado. Para el
grupo violeta de genciana se observó la categoría leve como la más frecuente.
En el día 12 la categoría que predomina fue la abundante, destacándose el
grupo de miel de abejas con el 100% de individuos dentro de la categoría
abundante.
La deposición de colágeno fue moderada en los grupos control, miel de abejas
y aloe vera, mientras que en el grupo violeta de genciana un 40% de individuos
presentaron la categoría abundante y el otro 40% moderado en el día 7. Por
34
100
0 0 40
0 60 40
0 60
100
0 0
40
20 0
60 20
0
60
100
0 0
100 100
100
20
60
20
40
20
40
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
E S C A S O L E V E M O D E R A D O A B U N D A N T E
%
Control Aloe Miel Violeta de Genciana
otro lado, la categoría abundante predominó con respecto a la deposición de
colágeno en el día 12.
Tabla 6. Categoría más frecuente de proliferación de fibroblastos y deposición de colágeno.
Tratamiento % (n/N) Categoría en proliferación de fibroblastos
% (n/N) Categoría en deposición de colágeno
Día 7
Control 60 (3/5) Moderado 80 (4/5) Abundante
Aloe Vera 60 (3/5) Moderado 60 (3/5) Abundante
Miel de abejas 100 (5/5) Moderado 60 (3/5) Abundante
Violeta de genciana 60 (3/5) Leve 80 (4/5) Moderado
Día12
Control 60 (3/5) Abundante 60 (3/5) Moderado
Aloe Vera 60 (3/5) Abundante 60 (3/5) Moderado
Miel de abejas 100 (5/5) Abundante 60 (3/5) Moderado
Violeta de genciana 40 (2/5) Moderado 40 (2/5) Moderado
40 (2/5) Abundante 40 (2/5) Abundante
En las figuras 20 y 21 se presenta el análisis de valoración porcentual de las
variables proliferación de fibroblastos y deposición de colágeno,
respectivamente, por unidad de experimentación (cuyes) y por grupo de
tratamiento durante los días de observación (3ero, 7mo y 12vo día).
Figura 20. Valoración de la proliferación de fibroblastos por grupo por tratamiento y días de observación.
35
Figura 21. Valoración de deposición de colágeno por grupos de tratamiento y días de observación.
Análisis Histopatológico
De manera general se observa en el tratamiento de miel de abejas una
tendencia estable en el 100% de los individuos en cada día de evaluación y con
un crecimiento exponencial.
En el análisis histopatológico, al día 12, se logró evidenciar una proliferación
gradual y uniforme de fibroblastos, con una deposición de colágeno
organizada. En todos los casos de este grupo el proceso fue marcado en la
dermis profunda y avanzó de manera uniforme hacia la dermis superficial.
En el tratamiento de aloe vera se observó una proliferación similar de los
fibroblastos, las fibras de colágeno fueron homogéneas, pero se depositaron
multifocalmente de forma desordenada en el espacio intersticial; así mismo, el
tejido no tuvo una recuperación uniforme pues se apreció desorganización en
la dermis superficial. En los tratamientos de violeta de genciana y control, hubo
una proliferación de fibroblastos muy desorganizada. Las fibras de colágeno
fueron heterogéneas y se depositaron frecuentemente de forma irregular y
desordenada en el espacio intersticial.
80
0 20 0 20 0 20 60
0
80
20
100
0 0
40
0
40
60
0
60
100
0 0 0
40
60
0
60
40
80
0 20 20
0 0
80
40
0
20
40
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2 D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2 D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2 D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
E S C A S O L E V E M O D E R A D O A B U N D A N T E
%
Control Aloe Miel Violeta de Genciana
36
5.1.3 Neovascularización
En la tabla 7 se presenta un análisis de la categoría más frecuente en la
neovascularización, según el tratamiento utilizado. Al día 3 no existió la
presencia de neovascularización en ninguno de los tratamientos. A partir del
día 7 ya se observa cambios, donde la neovascularización fue abundante en el
grupo control, moderada en los grupos miel de abejas y violeta de genciana, y
leve para el grupo de aloe vera. En el día 12 la neovascularización fue leve en
el grupo control, abundante en el grupo aloe vera y moderado en los grupos
miel de abejas y violeta de genciana.
Tabla 7. Categoría más frecuente de neovascularización por tratamiento y días de observación.
Tratamiento % (n/N) Categoría
Día 7
Control 80 (4/5) Abundante
Aloe Vera 60 (3/5) Leve
Miel de abejas 60 (3/5) Moderado
Violeta de genciana 60 (3/5) Moderado
Día12
Control 60 (3/5) Leve
Aloe Vera 100 (5/5) Abundante
Miel de abejas 60 (3/5) Moderado
Violeta de genciana 80 (4/5) Moderado
En la Figura 22 presenta el análisis de valoración porcentual de la variable
neovascularización por unidad de experimentación (cobayos) y por grupo de
tratamiento durante los días de observación (3ero, 7mo y 12vo día).
37
Figura 22. Valoración de neovascularización por grupo de tratamiento y días de observación.
Análisis Histopatológico
Histológicamente, en los grupos de aloe vera y miel de abejas se apreció una
neovascularización consistentemente más organizada al día 12; se apreciaron
abundantes vasos sanguíneos bien diferenciados con disposición transversal al
tejido conectivo en proliferación.
5.1.4. Reepitelización
En la tabla 7 se presenta un análisis del proceso inflamatorio de acuerdo a la
categoría de inflamación más frecuente según el tratamiento y días de
observación.
En el día 3 en los grupos aloe vera, miel de abejas y violeta de genciana la
categoría de reepitelización fue escasa, mientras que para el grupo control fue
leve. El día 7 las categorías de reepitelización son variables, en el grupo control
se aprecian dos categorías en las que el 40% es leve y el 40% moderado, el
grupo de miel de abejas presentan la categoría leve como la más frecuente,
mientras que el grupo aloe vera y violeta de genciana es moderado.
100
0 0 0 60
0 20 20 0
80 20
100
0 0 60
0
40
0
100
100
0 0
40
0
60
60
0
40
100
20
20
0
60 80
0
20
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
N U L O L E V E M O D E R A D O A B U N D A N T E
%
Control Aloe Miel Violeta de Genciana
38
El día 12 existió uniformidad en la reepitelización en los grupos control, aloe
vera y violeta de genciana, pero en el grupo miel de abejas la categoría leve y
completa fueron las más importantes (40 % en ambas).
Tabla 8. Categoría más frecuente de reepitelización en los grupos de acuerdo al
tratamiento y días de observación.
Tratamiento % (n/N) Categoría
Día 3 Control 60 (3/5) Leve
Aloe Vera 100 (5/5) Escaso
Miel de abejas 80 (4/5) Escaso
Violeta de genciana 60 (3/5) Escaso
Día 7
Control 40 40
(2/5) (2/5)
Leve Moderado
Aloe Vera 60 (3/5) Moderado
Miel de abejas 60 (3/5) Leve
Violeta de genciana 60 (3/5) Moderado
Día12 Control 80 (4/5) Completo
Aloe Vera 100 (5/5) Completo
Miel de abejas 40 40
(2/5) (2/5)
Completo Leve
Violeta de genciana 100 (5/5) Completo
En la figura 23 se presenta el análisis de valoración porcentual por unidad de
experimentación (cuyes) y por grupo de tratamiento durante los días de
observación (3ero, 7mo y 12vo día).
Figura 23. Valoración de reepitelización por grupo de tratamiento, días de observación y categoría.
100
0 0 40
0 0 0 0
100
40
0 0 60
20
0 0 20 0 0
80
80
0 0
20 60
40 0 0
20 0 0
40
60
0 0
40
40
0 0 0 0
100
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
D Í A 3 D Í A 7 D Í A 1 2
E S C A S O L E V E M O D E R A D O C O M P L E T O
%
Control Aloe Miel Violeta de Genciana
39
Análisis Histopatológico
En la examinación microscópica al día 12, en el grupo de miel de abejas no se
observó epitelio superficial recubriendo el área total de la herida. Sin embargo,
se observaron áreas proliferativas laterales a los dos lados de la superficie
cicatrizal, compuestas por queratinocitos bien diferenciados. La superficie
estuvo, con frecuencia, cubierta de detritos celulares mezclados con células
inflamatorias degeneradas, hemorragia y pigmentos de hemosiderina. En el
grupo de aloe vera se observó una epidermis con hasta 20 capas superpuestas
de queratinocitos bien diferenciados. Se evidenció la formación de estratros
epiteliales y queratinización gradual. En una de las muestras se encontró
regeneración tardía de epitelio con acumulación superficial de desbridado
epitelial. En el grupo de violeta de genciana se observó la formación de epitelio
con hasta 15 capas superpuestas de queratinocitos bien diferenciados con
queratinización abrupta y gradual; no se apreciaron capas epidérmicas.
El área de interfase tuvo áreas frecuentes de edema intersticial y la capa basal
de la epidermis se notó pobremente adherida a la dermis superficial donde se
observaron múltiples áreas de hemorragia intersticial leve a moderada. En el
grupo control se observó la epidermis fina, con hasta 10 capas superpuestas
de queratinocitos pobremente diferenciados; no se evidenciaron capas dentro
del epitelio. La queratinización fue abrupta. La zona de interfase entre la dermis
superficial y epidermis fue difusamente laxa con abundante edema intersticial.
Adicionalmente se observó hemorragia intersticial leve a moderada
inmediatamente por debajo de la zona de reepitelización.
Comparación de tratamientos
En base al análisis comparativo histopatológico entre los tratamientos (Tabla
9), se puede sugerir que la miel de abejas fue el mejor tratamiento cicatrizante,
pues en este existió un control adecuado de la inflamación desde el inicio hasta
el final del proceso de cicatrización, existió un aumento de fibroblastos activos,
disposición más organizada del colágeno, e incremento de neovascularización
en el tejido. Todo este conjunto de características determina una mejor calidad
40
de cicatriz a pesar de la manipulación dada durante la fase de experimentación.
Por lo tanto, se puede considerar que la miel de abejas es eficaz para curar
heridas dérmicas en animales a nivel de campo.
Tabla 9. Cuadro comparativo de resultados de acuerdo a las variables dependientes y tratamientos usados en los animales experimentales.
Variable dependiente
Miel de abejas Aloe vera Violeta de genciana
Inflamación Control eficaz de la inflamación desde los primeros días post lesión de M-L
Control eficaz de la inflamación desde los primeros días post lesión M-L
Los primeros días post lesión no existe un control adecuado de la inflamación, pero va ejerciendo su capacidad antiinflamatoria con el paso de los días. Pasando de S- L.
Proliferación de fibroblastos y depósito de colágeno
Aumento de la cantidad de fibroblastos activos con una tendencia estable en el 100% de la población pasando de M-A, y con un mayor depósito de colágeno en el área cicatrizal. Evidenciándose la proliferación gradual y uniforme fibroblastos con deposición de colágeno organizada.
Cantidad de fibroblastos activos sin uniformidad en la población que pasan de M-A con depósito de colágeno de forma desorganizada y multifocal en el espacio intersticial
Proliferación de fibroblastos muy desorganizada que pasa de L-A y las fibras de colágeno fueron heterogéneas y se depositaron de forma desordenada en el espacio intersticial
Neovasculariza-cion
Neovascularización consistentemente más organizada con vasos sanguíneos bien
diferenciados.
No se aprecia una neovascularización marcada
Reepitelización Este proceso no fue completado en el 100% de los individuos. Pudo evidenciarse zonas laterales con capas de queratinocitos bien diferenciados a diferencia de la parte central donde no existió indicio de células epiteliales. Pese a esto la barrera física que representa su aplicación de forma tópica permite la observación de detritos celulares mezclado con células inflamatorias degeneradas
Se observa hasta 20 capas de queratinocitos bien diferenciados con una capa basal pobremente adherida a la dermis superficial con un adelgazamiento del epitelio en la zona central
Formación de epitelio con hasta 15 capas superpuestas de queratinocitos bien diferenciados, con una capa basal pobremente adherida a la dermis superficial y con un adelgazamiento del epitelio en la zona central
L= Leve, M= Moderado, S= Severo, A= Abundante
41
5.1.5. Estadística inferencial
En la tabla 8 se presenta los resultados obtenidos del análisis con Chi-
cuadrado. No se observó diferencias significativas entre tratamientos usados
con respecto a los parámetros de cicatrización, a excepción de la variable de
neovascularización en el día 7 (P <0,05).
Tabla 10. Prueba Chi cuadrado de las variables bajo estudio.
VARIABLE Día 3 Día 7 Día 12
X2 P X2 P X2 P
Inflamación 4,27 0,64 1,60 0,95 8,27 0,22
Tipo de células inflamatorias
4,50 0,61 2,76 0,84 8,13 0,23
Deposición de fibroblastos NA* NA* 8,38 0,21 9,66 0,38
Deposición de colágeno 2,22 0,53 3,84 0,28 9,14 0,43
Reepitelización 4,76 0,19 3,40 0,76 9,50 0,15
Neovascularización NA* NA* 19,55 0,02 18,78 0,05
*NA= No analizado
5.1.6. Análisis de costos parciales
En la tabla 9 se describe el costo de los tratamientos por grupo de tratamiento
y por animal. El tratamiento convencional de violeta de genciana costó $ 5,70
por grupo experimental, con un promedio de $ 1,14 por animal. Por otro lado,
los tratamientos no convencionales como: 1) miel de abejas tuvo un costo de $
4,40 por grupo experimental con un promedio de $ 0,88 por animal, y 2) Aloe
vera tuvo un costo de $1,5 por grupo experimental con un promedio de $ 0,30
por animal.
Tabla 11. Análisis de costos parciales por grupos experimentales y por animal durante los 12 días de experimentación.
Tratamiento PVP Cantidad utilizada (5 animales en ml)
Costo del tratamiento (5 animales)
Costo por animal
Violeta de genciana $ 5,70/frasco 275 5,7 1,14
Miel de abejas $10/kg 330 4,4 0,88
Aloe vera $3/planta 440 1,5 0,30
42
5.2 DISCUSIÓN
Para este estudio se realizó la comparación histopatológica del proceso de
cicatrización en cobayos usando 4 tratamientos: miel de abejas, aloe vera,
violeta de genciana y grupo control. Se obtuvieron biopsias en los días 3, 7 y 12
posterior a la incisión realizada en tres lugares del área dorsal en cobayos. El
proceso de cicatrización presentó diferencias cualitativas entre tratamientos y
durante los doce días de observación, sin embargo, no se obtuvieron
diferencias significativas entre las variables observadas, excepto para
neovascularización en el día 7.
Proceso inflamatorio y tipo celular
La variabilidad de los hallazgos histopatológicos, en relación a la severidad de
la inflamación y a la naturaleza del infiltrado celular, puede estar directamente
relacionada a procesos inflamatorios superpuestos de diferente cronicidad
(Guarín et al., 2013). Es decir, cada vez que los animales se manipularon para
la aplicación de tratamientos o toma de muestras, se podría haber generado
pequeñas lesiones nuevas en las áreas con cicatrización avanzada; dando
como resultado dos oleadas de inflamación en tiempos diferentes.
Con violeta de genciana no se evidenció un control eficaz de la inflamación
hasta el día 3, debido a que la inflamación fue severa en el 100% de los
individuos. Sin embargo, mostró un control estable, con presencia de focos
esporádicos de inflamación leve en el 100% de los individuos al día 12. A pesar
de que no existe información sobre la propiedad antiinflamatoria de la violeta de
genciana, esta propiedad puede dar por medio de dos mecanismos de acción:
1) estabilizando la costra, la cual forma una barrera física impidiendo la
proliferación bacteriana y futura cicatrización, y 2) actúa como un potente
antibacteriano al actuar a nivel del ADN bacteriano alterando sus funciones
metabólicas (Andjelić et al., 2014; Farid et al., 2011)
En los casos de miel de abejas hubo inflamación en la dermis superficial, que
puede estar asociada directamente a la exposición del tejido a injurias físicas,
por la ausencia de recubrimiento epitelial. La miel de abejas actúa como
43
barrera física por su alta viscosidad previniendo así, la entrada de agentes
infecciosos a la herida (Meo et al., 2017). Este mecanismo explicaría la
inflamación neutrofílica ubicada a nivel de dermis superficial, pero sin
proliferación en dermis profunda. Además, en los casos de aloe vera fue
evidente la inflamación neutrofílica en la dermis superficial asociada al
desprendimiento de la costra, siendo compensada por la acción de la
bradicinina sustancia que regula los síntomas de la inflamación, reducción de la
prostaglandina E2 y la presencia de esteroles vegetales que ejercen un efecto
antiinflamatorio en etapas agudas (Sahu et al., 2013).
Adicionalmente, tanto en los tratamientos con aloe vera como en miel de
abejas se observó una intervención temprana en el cese de la inflamación.
Desde el día 3, existió un control de la inflamación siendo esta moderada y leve
hasta el día 12. Ambos tratamientos son considerados como potentes
antiinflamatorios y esta propiedad ha sido ampliamente descrita, principalmente
al ser aplicado de forma tópica e incluso en condiciones no controladas
(Calderón et al., 2011; Jull AB , Walker N, 2013; Nordin et al., 2017).
Proliferación de fibroblastos y depósito de colágeno
Nula o poca es la información disponible acerca de la proliferación de
fibroblastos y depósito de colágeno de heridas cutáneas de cobayos. Estudios
han evaluado estos parámetros de forma clínica, en cerdos, tomando en cuenta
la reducción del tamaño cicatrizal de la herida asociándolo directamente con la
calidad de colágeno generado en la herida (Farid et al., 2011; Nizama, 2017).
La contracción de la herida fue mucho más evidente en los tratamientos de
violeta de genciana y aloe vera, observándose en el día 12 una cicatriz más
pequeña, con proliferación abundante de fibroblastos. Resultados similares
fueron observados en los estudios de Nizama (2017) y Gonzáles (2015),
quienes determinaron que existe una disminución en el tamaño de la herida
con la violeta de genciana en comparación con miel de abejas.
Por otro lado, el aloe vera presentó una proliferación abundante de fibroblastos
con deposición de colágeno multifocal desorganizada. Celestino y López
(2018), realizaron un estudio histopatológico con ratas albinas, en donde se
aplicó aloe vera de forma tópica, reportándose un aumento en la cantidad de
44
fibroblastos y colágeno. Sin embargo, en dicho estudio no se menciona la
disposición de las fibras de colágeno en la dermis superficial y profunda. Pese
a que varios autores mencionan la acción directa del aloe vera sobre la
composición y calidad del colágeno, la disposición de este podría ser un factor
que influya directamente a nivel de resistencia tensil de la herida (Sahu et al.,
2013).
En el tratamiento de miel de abejas se observó una mayor síntesis de colágeno
en cuanto a cantidad y calidad, principalmente en los días 7 y 12. Esto pudo
deberse a la influencia directa de la miel en la proliferación de fibroblastos. Se
ha descrito que la miel protege del estrés oxidativo a los fibroblastos,
permitiendo la migración celular hacia el centro de la herida y posterior síntesis
de colágeno (Alvarez, Giampieri, González, & Damiani, 2012).
Además, el resultado observado coincide con Schencke et al (2015), quien
observó una mayor cantidad de fibroblastos reactivos al tratar con miel de
abejas heridas por quemaduras en cobayos. Adicionalmente, el incremento en
la deposición de colágeno en el tratamiento de miel de abejas también está
documentada en los hallazgos de la investigación realizada por Ozlem et al.
(2010), donde se evaluó el efecto de 3 tipos de miel de abejas en heridas
cutáneas en conejos.
Neovascularización
Al día 3 no existió neovascularización en ninguno de los grupos experimentales
a diferencia de la investigación de Sarabia (2018). Esta diferencia pudo ser
resultado de la manipulación de las heridas durante este estudio, y factores
ambientales no controlados a nivel de campo como humedad y temperatura.
En cuanto a los grupos aloe vera y miel de abejas, se observó
neovascularización a partir del día 7, la que fue más organizada, con vasos
bien diferenciados en comparación con los grupos de violeta de genciana y
control. Por lo tanto, es posible que en los dos primeros tratamientos, se haya
presentado una recuperación más saludable del tejido, por una mayor
circulación de sangre en la herida, permitiendo una mejor oxigenación e
irrigación de nutrientes (Cañizares, 2016; Lucha, Muñoz, & Fornes, 2008;
Pavletic, 2018; Zafra, 2016). Además, se ha descrito el alto poder angiogénico
45
del aloe vera gracias al componente alantoina, la que promueve la formación
de nuevas células endoteliales a nivel de la herida (Calderon, 2011).
Reepitelización
En el tratamiento con violeta de genciana, se evidenció la formación de estratos
epiteliales bien diferenciados, pero con una interfase pobremente adherida. De
acuerdo a lo observado histopatológicamente podemos asumir que esto puede
generar inestabilidad en la permanencia del epitelio cuando existe
manipulación. Estudios han demostrado la propiedad reepitelizante de la violeta
de genciana, actuando sobre las células de la membrana basal e induciendo un
efecto queratoplastico (Nizama, 2017). Sin embargo, no hay información
disponible sobre las características microscópicas de reepitelización con este
tratamiento.
En el caso del tratamiento con miel de abejas, al día 12 no se observó
reepitelización completa, pero sí la presencia de áreas proliferativas laterales
en la superficie de cicatrización. Este resultado fue similar a los obtenidos por
Schencke et al (2015). En dicho estudio se comparó la cicatrización de heridas
con miel de abejas y vitamina C oral, se evidenció ausencia de reepitelización
al aplicar solo miel de abejas.
Por otro lado, en el grupo con tratamiento de aloe vera se observó una
reepitelización diferenciada al día 12 en todos los individuos. Sin embargo, al
igual que violeta de genciana se observó una interfase poco estable. Este
resultado fue similar al encontrado en un estudio realizado en ratas, donde se
evaluó el efecto cicatrizante del aloe vera, observándose una formación rápida
y completa del epitelio, con una alta diferenciación de los estratos epiteliales y
calidad de tejido conectivo adyacente (Celestino & López, 2018).
Es importante recalcar que la reepitelización completa al día 12, no es
indicador de la finalización del proceso de cicatrización, pues en el grupo
control al día 12 existe formación de epitelio fino con capas de queratinocitos
pobremente diferenciadas. En los tratamientos de violeta de genciana y aloe
vera, se observó desprendimiento del epitelio con la manipulación dada durante
el proceso de experimentación. Por otro lado, con el tratamiento de miel de
abejas pese a no existir reepitelización completa de la dermis superficial y
46
profunda, esta fue lo suficientemente fuerte para soportar la manipulación, sin
que exista una lesión nueva en el tejido cicatrizal.
Análisis de costos
En este estudio se determinó una diferencia de USD 0,26 centavos a favor del
tratamiento de miel de abejas, y de USD 0,84 centavos a favor del tratamiento
de aloe vera, en comparación con el tratamiento violeta de genciana que costó
USD 1,14 Este resultado concuerda con el análisis de costos realizado por
Velásquez (2018), en donde se comparó un tratamiento de una crema
cicatrizante a base de neomicina+ prednisolona vs el tratamiento tópico con
miel de abejas estableciendo un costo a favor de este último de USD 1,98
Finalmente, es importante mencionar que el presente estudio tuvo una
limitación importante. El número de individuos incluido en cada grupo de
experimentación, fue insuficiente para determinar diferencias significativas de
los parámetros de cicatrización entre cada tratamiento. La prueba de Chi
cuadrado proporciona un valor de significancia aproximada, donde mientras
mayor es el número de la muestra existe una mayor exactitud (Laguna, 2014).
Por lo tanto, se recomienda usar un mayor número de individuos por
tratamiento en futuras investigaciones.
Por otro lado, se puede remarcar algunas fortalezas del presente estudio.
Primero, este es un estudio de tipo pionero en cuanto al uso de métodos
histológicos para la evaluación del proceso de cicatrización en cobayos. Se ha
descrito que los métodos histológicos son valiosos tanto para la evaluación de
cada fase del proceso de cicatrización, como para la evaluación de la eficacia
de los tratamientos dérmicos usados (Gonzales, 2002). Y segundo, no se
espera tener errores metodológicos, ya que para la lectura de las placas
histológicas fue a ciegas y en pares, obteniendo así resultados certeros.
47
CAPITULO VI
6. CONCLUSIÓNES
En base a los resultados obtenidos en esta investigación, se puede
concluir que el tratamiento convencional, violeta de genciana, y los
tratamientos no convencionales, miel de abejas y aloe vera, tuvieron
efectos positivos en el proceso de cicatrización de heridas dérmicas en
cobayos a nivel de campo.
Existieron diferencias de tipo cualitativo en las fases de cicatrización
entre los tratamientos y, de acuerdo al análisis comparativo
histopatológico entre los tratamientos, se puede concluir que la miel de
abejas fue el mejor tratamiento, ya que existió un control adecuado de la
inflamación desde el inicio hasta el final del proceso de cicatrización,
aumento de fibroblastos activos, disposición más organizada del
colágeno e incremento de neovascularización en el tejido, características
que en conjunto determinan un proceso cicatrizal saludable y eficiente.
No existieron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos
de tratamiento y las fases cicatrizales, a excepción de la variable
neovascularización en el día 7.
De acuerdo al análisis de costos y calidad cicatrizal proporcionada por el
tratamiento usado, se determina que el tratamiento de miel de abejas es
el más económico con una diferencia de USD 0,26 a favor de la misma
en comparación con el tratamiento convencional.
48
7. BIBLIOGRAFÍA
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8. ANEXOS
Anexo 1. Aprobación del comité de investigación de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
57
58
59
Anexo 2. Tabla de distribución de códigos en los grupos experimentales
GRUPO CONTROL
GRUPO VIOLETA DE GENCIANA
GRUPO MIEL GRUPO ALOE VERA
PCC1 PCV1 PCM1 PCA1
PCC2 PCV2 PCM2 PCA2
PCC3 PCV3 PCM3 PCA3
PCC4 PCV4 PCM4 PCA4
PCC5 PCV5 PCM5 PCA5
Anexo 3. Identificación de individuos experimentales por tratamiento usado.
Figura: a, b, c, d. Método de identificación de los animales experimentales por tarjetas en pozas individuales.
PCM5 PCM4
PCM2
PCM1
PCM3 PCV1 a
PCV4
PCV5 PCV3
PCV2 PCC1
PCC2 b
PCC3
PCC4
PCC5
c d
PCV5
PCA2
PCA3 PCA1
PCV4
60
Anexo 4. Registro de aplicación de tratamientos.
Anexo 5. Protocolo de envió de muestras del Laboratorio de Histopatología FMVZ, UCE.
A. Rotulación.-El envase de envío se debe constar con los siguientes datos:
Nombre del paciente
Identificación de pieza anatómica
Número de contenedores
Fecha de toma de muestra
B. Fijación y preservación de la muestra.- Para la fijación se debe sumergir
el tejido en relación 1:10 con formol buferado al 10%.
Anexo 6. Protocolo de procesamiento de muestras del Laboratorio de Histopatología de la FMVZ, UCE.
Luego del estudio macroscópico se debe colocar en el procesador de tejidos,
registrando la cantidad de casetas en el registro correspondiente
1. Procesador de tejidos
a. Formol al 10% por 30 minutos
b. Agua por 18 minutos
c. Deshidratar con alcohol al 80% por 1 hora 30min
d. Deshidratar con alcohol al 90% por 1 hora 30min
e. Deshidratar con alcohol al 95% por 1 hora 30min
f. Deshidratar con alcohol al 100% por 1 hora 30min
g. Deshidratar con alcohol al 100%por 1 hora 30min
h. Aclarar en Neoclear por 1 hora 30min
i. Infiltrar en parafina por 1 hora 30min
Responsable Hora DIA1
DIA 2
DIA 3
DIA 4
DIA 5
DIA 6
Observaciones Yadira Loya
Grupo Código M T M T M T M T M T M T M T
Hora DIA7
DIA 8
DIA 9
DIA 10
DIA 11
DIA 12
Observaciones
Grupo Código M T M T M T M T M T M T M T
61
j. Infiltrar en parafina por 1 hora 30min
2. Inclusión del tejido o formación del bloque.
a. En el equipo de inclusión que debe estar previamente encendido se
colocan las casetas en la bandeja.
b. Se retira la tapa de la caseta
c. Se revisa el tamaño de la masa para poder seleccionar el molde
adecuado
d. En el molde adecuado se dispensa parafina
e. Debe enfriarse la base para colocar el tejido
f. Fijar el tejido en la parafina, cuidando que toda la masa se encuentre
a la misma altura, para evitar problemas el momento del corte
g. Colocamos la caseta que contiene la identificación de la muestra
h. Enfriar en la plancha fría a -1 °C
i. Retirar el molde metálico con cuidado, evitando realizar mucha fuerza
evitando que se dañe el bloque de tejido.
3. Desbaste, corte y pesca.
a. Desbaste de la muestra, retirar el exceso de parafina de los
alrededores del bloque
b. Igualar la muestra de tejido en el micrótomo, eliminando el exceso de
parafina sobre este.
c. Colocar en hielo.
d. Etiquetar las placas de acuerdo a: la identificación de la caseta, el
número de placas a cortar y la coloración a realizar.
e. Cortar las muestras formando cintas de tejido, el grosor será de 4- 6
micras.
f. En el baño maría colocar la cinta de tejido, seleccionar el tejido libre
de: burbujas, artefactos, sin rupturas.
g. Sumergir la placa de manera vertical, con la identificación hacia
adelanta, y retirar el fragmento de tejido, lento y evitando que se
rompa, este procedimiento se denomina pesca.
h. Colocar la placa en la plancha caliente previamente estabilizada a
86°C.
i. Al terminar colocar las muestras en una gradilla e introducirle por 30
minutos en la estufa a 60°C.
62
j. Colorear las placas.
A. Interpretación de Resultados
Placas histológicas con tejido.
Anexo 7. Protocolo de tinción H/E del laboratorio de Histopatología FMVZ, UCE
1. Desparafinizar el tejido con Neoclear N°1, 30 min
2. Desparafinizar el tejido con Neoclear N° 2, 15 min
3. Desparafinizar el tejido con Neoclear N° 3, 15 min
4. Hidratar con alcohol al 100% por 10 min
5. Hidratar con alcohol al 80% por 10 min
6. Hidratar con alcohol al 50% por 10 min
7. Sumergir en agua destilada 3 inmersiones
8. Hematoxilina 3 minutos
9. Lavar en agua corriente
10. Sumergir 2 veces en agua ácida
11. Lavar en agua corriente 1 min
12. Sumergir 6 veces en Eosina
13. Lavar en agua corriente
14. Deshidratar con alcohol al 50% por 10 min
15. Deshidratar con alcohol al 80% por 10 min
16. Deshidratar con alcohol al 100% por 10 min
17. AcalararenNeoclearN°3 15 inmersiones
18. AcalararenNeoclearN°3 15 inmersiones
19. Dejar secar la placa
20. Colora unas gotas de medio de montaje.
21. Aplicar el cubreobjetos sobre la preparación.
22. Listo para su observación en el microscopio
B. RESULTADOS
Citoplasma: rosado
Núcleos: azul
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Anexo 8. Protocolo de tinción tricrómica de masson del Laboratorio de Histopatología FMVZ, UCE
1. Desparafinizar el tejido con Neoclear N°1, 30 min
2. Desparafinizar el tejido con Neoclear N° 2, 15 min
3. Desparafinizar el tejido con Neoclear N° 3, 15 min
4. Hidratar con alcohol al 100% por 10 min
5. Hidratar con alcohol al 80% por 10 min
6. Hidratar con alcohol al 50% por 10 min
7. Sumergir en Agua destilada 3 inmersiones
8. Sumergir las placas en solución de bouin por una hora a una
temperatura de 56 °C o toda la noche a temperatura ambiente.
9. Dejar enfriar por 10 minutos
10. Lavar en agua corriente hasta que se aclare en tejido.
11. Colocar en Hematoxilina de Weiger por 15 minutos.
12. Lavar en agua corriente durante 1 hora. Enjuagar en agua destilada
13. Sumergir en la solución de Fuscina ácida- escarlata de Biebrich durante
15 minutos.
14. Diferenciar con la solución de ácido fosfotugsticomolibdímico por 15
minutos. (ver que el formol no este rojo, caso contrario se deberá colocar
por más tiempo en esta solución)
15. Colocar en azul de anilina durante 5 min.
16. Lavar en agua corriente.
17. Colocar en ácido acético al 1 % por 5 min.
18. Deshidratar con alcohol al 50% por 10 inmersiones
19. Deshidratar con alcohol al 80% por 10 inmersiones
20. Deshidratar con alcohol al 100% por 10 inmersiones
21. Aclarar en Neoclear N°3 15 inmersiones
22. Aclarar en Neoclear N°3 15 inmersiones
23. Dejar secar la placa
24. Colora unas gotas de medio de montaje.
25. Aplicar el cubreobjetos sobre la preparación.
26. Listo para su observación en el microscopio
C. RESULTADOS
Citoplasma, músculo y queratina: rojo
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Núcleos: negro
Colágeno: azul.
Anexo 9. Análisis Estadístico SPSS
REEPITELIZACION NEOVASCULARIZACIÓN
N Válido 60 60
Perdidos 0 0
Moda 1,00 ,00
Desviación estándar ,30498 ,21439
Rango ,86 ,79
Mínimo ,14 ,00
Máximo 1,00 ,79
Suma 35,23 12,75
Percentiles 25 ,3425 ,0000
50 ,5400 ,1550
75 1,0000 ,4200