Tema 3Tema 3. Análisis estructural de enzimas.

1.-Determinación de la Masa molecular.

2.- Determinación de la composición aminoacídica y estructura primaria.

3.- Estructura secundaria y terciaria.

Determinación estructural: RMN, Cristalografia.

4.- Estructura cuaternaria.

Determinación sub-unidades, tipo

Funcionalidad

1.- Determinación de la Masa molecular.

Técnicas electroforéticas

Podemos estimar la masa molecular relativa con el uso de marcadores

Electroforesis en gel.

Dis

tanc

ia e

n cm

Controlar la pureza

Cromatografía por filtración en gel: Tamaño Las proteínas se separan por exclusión molecular mediante el uso de bolitas porosas de un polímero insoluble como dextrano o agarosa (Sephadex, Sepharosa).

Técnicas cromatográficas

Se determina Vo con Blue Dextran

Ve se determina para cada proteína

Vt se calcula de la fórmula r 2 x h

Kav =Ve-Vo / Vt-Vo

Espectrometria de masas

MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight

Se determina el tiempo que tardan en ser detectados que

es función de su masa.

Se generan iones de las proteínas y se aceleran a través de un campo

eléctrico.

ESI: electrospray ionization mass spectrometry

MALDI-TOF

Resultado de una espectrometría de masas

Información del peso molecular

Permite la conversión en concentración de proteínas en solución a Molaridad

1. Composición:

¿cuántos aminoácidos de un tipo hay en la molécula?

2.- Actividad catalítica

¿cuántas moléculas de substrato son transformadas por una molécula de enzima por segundo?

3.- Uniones a ligandos

¿cuántas moléculas de ligando se une por molécula de enzima?

2.- Determinación de la composición aminoacídica y estructura primaria.

Los aminoácidos se unen entre si mediante enlace covalente de tipo amida (R-CO-NH-R) para formar péptidos

Las proteínas son polímeros lineales formados por monómeros llamados aminoácidos

Enlace peptídico

-El equilibrio está más desplazado hacia la hidrólisis, por ello la formación del enlace requiere un aporte de energía (ATP).

-Sin embargo el enlace peptídico es cinéticamente muy estable y en ausencia de un catalizador, el tiempo de vida en disolución acuosa es de 1000 años.

Las proteínas son polímeros lineales formados por monómeros llamados aminoácidos

1. Ayuda a conocer su mecanismo de acción. Identificación de regiones funcionales en una enzima

2. Interpretar datos estructurales cristalográficos, RMN.

3. La secuencia determina la estructura tridimensional

Estructura primaria

Enlace peptídico

Corresponde a la posición de cada aminoácido en la secuencia codificada por el ADN

Cada proteína tiene una secuencia de aas única y definida con precisión

Reacciones del grupo amino:- Reacción de Edman: Fenilisotiocianato. Absorbancia a 254nm

- Reacción de Sanger: 1-fluoro,2,4 dinitrobenceno (FDNB). Ab. 360nm

- Reacción con el cloruro de dansilo: compuestos fluorescentes.

- Reacción con la ninhidrina o fluoroescamina. compuestos fluorescentes.

Composición aminoacídica de cadenas polipeptídicas

Identificación del extremo amino terminal

METODOS TRADICIONALES DE SECUENCIACIÓN

Reacción de EDMAN

Fenilisotiocianato

: 254 nm

Degradación de EDMANHasta 50 residuos contiguos de un polipéptido

Polipéptidos de gran tamaño

1. Romper la proteína en fragmentos por métodos químicos o enzimáticos

2. Romper puentes disulfuros3. Purificar cada fragmento y secuenciarlo por Degradación de EDMAN4. Determinar el orden de los fragmentos y dónde se localizan, si los hay, los puentes disulfuros.

Rotura de puentes

disulfuros

Métodos para fragmentar las cadenas polipeptídicas

METODOS ACTUALES DE SECUENCIACIÓN

Secuenciación MS-MS

Sólo se permiten los giros alrededor de los enlaces C-N y C-CEl carácter parcial de doble enlace del enlace peptídico limita la

capacidad de rotación del mismo

Los ángulos de giro (ángulos de torsión) se denominan: (fi) y (psi).

Estructura secundariaDisposición regular y repetida del esqueleto de la cadena

polipeptídica en una dirección determinada. No se tienen en cuenta las cadenas laterales

3.- Determinación de la estructura secundaria y terciaria.

Los valores para los giros fi y psi están comprendidos entre 180º y -180º

Estructura secundaria

Plot de Ramachandran

Las posibilidades de giro van a determinar en gran medida el plegamiento de las proteínas

Indica los valores de los ángulos fi y psi de conformaciones permitidas

Estructura secundaria

¿ Cuáles son los valores estéricamente permitidos ?

Estructura secundaria

Existen dos tipos de estructuras secundarias termodinámicamente favorables

-Hélice Hoja plegada

En principio un péptido puede adoptar muchas conformaciones diferentes según los ángulos phi y psi

Adopta la más favorable desde el punto de vista energético:

• menores impedimentos estéricos• menor repulsión electrostática

Estructura secundaria: -hélice

Puente de Hn y n+4

- 57º - 47º

Estructura secundaria: -hélice

Estructura secundaria: -hélice

Radicales hacia el exterior de la hélice

NO PARTICIPAN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA

1- Repulsión o atracción electrostática entre aminoácidos cargados.

Restricciones para la formación de una -hélice

2- Volumen de los grupos R adyacentes. No podrían ir seguidos varios aminoácidos voluminosos.

3- Interacciones entre cadenas laterales de aminoácidos separados por 3 ó 4 residuos.

4- Presencia de prolina. X-Pro.

Las hojas antiparalelas son más estables por la alineación de los

puentes de H

Los puentes de H conectan un residuo con dos residuos de la cadena

adyacente (grupo NH de R1 y el CO de R2 de la cadena adyacente y entre el grupo CO de R1 y el NH de

R3 de la cadena adyacente)

Estructura secundaria: hojas-

Proteína globular con alto contenido en estructura

Concanavalina A

Las diferentes estructuras secundarias co-existen en una misma proteína

Estructura secundaria: giros, codos o lazos

Permiten el giro de 180º en la dirección de las cadenas polipeptídicas

Estabilizado por puentes de H entre el aa1 y el aa4 (aai e aai+3)

Estructura suprasecundaria

Agrupaciones estables de estructuras secundarias frecuentes en las proteínas.

Motivos estructurales

Todo alfa Todo beta Alfa-beta

Unidades Meandro Barril Unidad

- Hélice-vuelta-hélice.- Siete hélices transmembrana. - Mano EF.- Cremallera de leucina.

- Horquilla - Meandro

- Barril

- Dedo de Zn.

Estructura supersecundaria o motivos

Todo alfa

Todo beta

Alfa-beta- Motivo

Dos -hélices cortas. Dos -hélices yuxtapuestas

Interaccionan entre sí mediante cadenas laterales de leucina

(cremallera de leucina)

Presente en proteínas que se unen a calcio

como calmodulina o troponina

Mano EF

Todo alfa

Siete hélices transmembran

abacteriorrodopsina

Proteínas de unión al ADN

reguladoras de la transcripción

(c-fos, c-jun)

Dos estructuras adyacentes orientadas de forma antiparalela

Horquilla beta

Barril beta

Proteína que se une al retinol humano

Todo beta

Meandro

Dedos de Zinc

Estructuras alfas y betas unidas por un átomo de Zinc que interacciona con Cys e His

Alfa-beta

Proteínas de unión a ADN

Dedo de Zn

Motivo

Estructura subterciaria

Dominio:

Parte de la cadena polipeptídica que tiene un plegamiento propioe independiente del resto de la proteína (Unidad de plegamiento).

La unión estable de varios motivos da lugar a los dominios.

Frecuentemente asociado a una función específica.

Proteínas de más de 200 residuos

Dominio

Dominio

Dominio

Regiones de 100 a 150 aminoácidos

Estructura subterciaria

Disposición tridimensional de todos los átomos de una proteína

Estructura terciaria

Mioglobina

Estructura terciaria

Fuerzas que estabilizan la estructura terciaria

Interacciones débiles

• Iónicas (puentes salinos)• Hidrofóbicas• Enlaces de hidrógeno• Fuerzas de Van derWaals

Interacciones covalentesEntre restos de Cys

RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

Núcleos en diferentes ambientes resonaran a frecuencias de radiación distintas

Proteína con 55 aminoácidos

B-sheet

Efecto de la proximidad de dos núcleos

NOESY “Nuclear Overhause Enhancement Spectroscopy”

Muestra pares de protones muy cercanos menor de 5 A

Magnetización se transfiere

Proteína de 55 aminoácidos

Diagonal

Primera dimensión

Genración de proteínas marcadas 13C, 15N y 2H

RMN en tres dimensiones

Dominio de dedo de Zn

CRISTALOGRAFÍA RAYOS X

Longitud de onda igual longitud que el enlace covalente

Proteínas cristalizan en la configuración biológica activa

Los electrones de los átomos dispersan los rayos X

La forma de dispersión dependen del ordenamiento atómico

Transformación de Fourier

Mapas de densidad electrónica

4. Estructura cuaternaria

Hace referencia al ordenamiento de diferentes subunidades en una

proteína multimérica

Uniones no covalentes

Interacciones débiles

• Iónicas (puentes salinos)• Hidrofóbicas• Enlaces de hidrógeno• Fuerzas de Van derWaals

1. ¿Cuantas sub-unidades y de que tipo?

Estudios de determinación de peso molecular. Agentes desnaturalizantes (Guanidina)

Tipos y número de subunidades (precaución trazas de proteasas, al disociar las sub-unidades)

Estudios de crosslinlinking

Agentes químicos: Dimetilsuberimidato

Desnaturalización SDS

4X 3X 2X XDeterminación

Peso molecular

SDS-PAGE

Estudios de evaluación Peso Molecular

Estudios de uniones a ligandos

Número de sitios de una enzima por un substrato indica el número de sub-unidades (Disposición de las sub-unidades)

Alcohol DH Levadura 2 moles de NADH/mol ADH (Dímero)

Hígado 4 moles de NADH/mol ADH (Tetramero)

Estudios de simetria

Estudios de Cristalografía Ejes de simetria

Aspartato carbamoiltransferasa 6 unidades catalíticas y 6 regulatorias

Estudios de identidad de sub-unidades

Secuenciación N-terminal y C-terminal

Espectrometría de masas de las sub-unidades

2.Enzimas oligoméricas: Funcionalidad 1. Aumenta la posibilidad de regulación catalítica

2. Variaciones en la propiedades catalíticas

Ej.Triptofano Sintasa Proteínas Multienzimáticas.

3. Estabilidad. Lactato DH

4. Generación de estructuras complejas con funciones biológicas. Economía información genética

Proteasoma