enzimas determinación cuantitativa

7/23/2019 Enzimas determinacin cuantitativa

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BIOTECNOLOGA DE LOSPRODUCTOS

PROFESOR: ING. SNCHEZ GONZALES, JESSALEXANDER

ALUMNA: MARTNEZ SALDAA, YURICOELIZABETH

CICLO: IX HORARIO: JUEVES 11-1PM

DETERMINACI!N CUANTITATIVA DE LAACTIVIDAD ENZIMTICA DE UN PREPARADO

ENZIMTICO PURO"


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DETERMINACI!N CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE UN PREPARADOENZIMTICO PURO"

LABORATORIO N06

DETERMINACIN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE UN PREPARADOENZIMTICO PURO

I. INTRODUCCIN

Como es bien sabido, las enzimas son protena. Polmeros de residuos amino acdicos unidos

mediante enlaces peptdicos, que tiene la funcin de ser catalizadores de las reacciones qumicas del

metabolismo celular. La produccin de enzimas, de actividades especficas, es seguida por una

purificacin y una estandarizacin del producto. En la formulacin del producto se agregan diversos

excipientes otras protenas y az!cares, por e"emplo#. Por lo que un preparado enzim$tico comercial

no es %&&' puro .(e manera de cuantificar la enzima presente en una formulacin comercial se

realizan determinaciones de su actividad enzim$tica y del contenido de protenas.

II. OBJETIVOS

(esarrollar una curva patrn de calibracin

(eterminar la actividad enzim$tica en unidades usc )nidad *treet Close#

III. FUNDAMENTO TERICO

CINTICA DE REACCIONES QUMICAS

La reaccin qumica tiene dos caractersticas de importancia+ la posicin de equilibrio estabilidad de la

concentracin de productos y reactivos# y la velocidad de reaccin las reacciones tienen por ob"eto

determinar el mecanismo y la velocidad con que interaccionan las molculas ba"o determinadas

condiciones#.

La velocidad de una reaccin qumica puede medirse como la velocidad de formacin de uno o m$s

de su productos o bien la velocidad de utilizacin de sus reactivos. -ntuitivamente podemos suponer

que al aumentar la concentracin de los reactivos la probabilidad de interaccin de los mismos

aumenta con"untamente con la velocidad que procede tal reaccin. mbas variables velocidad de

reaccin y concentracin de los reactivos# son directamente proporcionales, as que matem$ticamente

debe existir un valor constante, de esta manera podemos escribir+

vr/ k. 0reactivos1n


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2elocidad de reaccin# / constante# . Concentracin de reactivos#n

El valor del exponente nes el orden de la reaccin. s si n/ %, estamos en presencia de una reaccin

de primer orden donde la velocidad es proporcional a la reaccin de un solo reactivo. vr/ k. 01

n$logamente, cuando n/ 3, la velocidad es proporcional al producto de las concentraciones de dos

reactivos o al cuadrado de la concentracin de uno solo. Este tipo de reacciones reciben el nombre de

segundo orden. vr/ k. 01 041 / k013

La importancia de determinar el orden de una reaccin qumica radica en que a partir de ese

par$metro puede obtenerse informacin sobre el mecanismo molecular en que opera.

VELOCIDAD DE REACCIN Y EQUILIBRIO

En estado de equilibrio qumico las velocidades de reacciones directa e inversa son exactamenteiguales. Considerando una reaccin de primer orden+

k%01 / k5 % 041

Este principio nos permite llegar f$cilmente a una reaccin entre las constantes de velocidad y de

equilibrio+

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIN: ENERGA DE

ACTIVACIN

Las velocidades de reaccin son generalmente sensibles a la temperatura. En el caso de las

reacciones biomoleculares, un aumento de %&6 C incrementa su velocidad entre %,7 y 7 veces. Para

explicar este 8ec8o se postul que al acrecentar la temperatura aumenta la fraccin de molculas

capaces de tener una energa suficiente para alcanzar un 9estado activado: que luego se transforme

en producto de la reaccin por formacin o ruptura de enlaces qumicos.

*e admite que las !nicas molculas que reaccionan son aquellas que al c8ocar llevan consigo una

energa mayor que un cierto valor mnimo. este valor de energa necesaria se lo denomina energa

de activaciny es un factor de suma importancia para determinar la magnitud de la velocidad de

reaccin.


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CATALIZADORES

U#$ %&$''()# *+('$ /%0 +2$% 3( 3& /&4& 3+5&%$% & 6$7% /& $ &%2$ /& $'(6$'()#.

U#$ 6&8 6'(/$ &3$ 4$%%&%$ & 3(3&$ &67+'(7#$ /& 97%$ $ *+& &2$%0 $ &3$/7 :#$

/& $ %&$''()#. L$ 6&7'(/$/ /& %&$''()# 57/%$ (#'%&$%3& /& /73 $#&%$3;$+$#/7 $ '7#'%$'()# /& '75&


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*on efectivas en peque=as cantidades

>o sufren modificaciones qumicas irreversibles durante la cat$lisis. Es decir que luego de la

reaccin enzim$tica, las molculas de enzimas que reaccionaron son indistinguibles de las que

no lo 8an 8ec8o, la estructura de la molcula se mantiene, al principio y final de la reaccin,

exactamente igual#.

>o afectan la posicin de equilibrio de la reaccin que catalizan. El estado inicial y final de la

reaccin es el mismo, solo que se llega al equilibrio muc8o m$s r$pidamente.

CINTICA DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS

Las consideraciones generales de la cintica qumica pueden aplicarse a las reacciones catalizadas

enzim$ticamente, aunque estas !ltimas tienen la particularidad de mostrar el fenmeno de saturacin

por el sustrato.

una concentracin constante de enzima, si vemos el gr$fico de la velocidad de la reaccin catalizada

enzim$ticamente en funcin de la concentracin del sustrato, es evidente que a ba"as concentraciones

del mismo la velocidad de formacin de producto es proporcional a la concentracin del sustrato.

medida que se aumenta la concentracin de sustrato se aprecia una prdida de la proporcionalidad,

en esta zona la reaccin es de orden mixto y finalmente, a altas concentraciones, la velocidad de la

reaccin es independiente de esta.?a se 8a dic8o que el sustrato se une a la enzima en una regin

determinada del mismo llamada sitio activo. El fenmeno de saturacin "unto con otras evidencias

llevaron a postular la existencia de un comple"o enzima sustrato E 5 *# como etapa previa a la

formacin de productos.

En %@%A LenorBic8elis dedu"o la relacin entre la velocidad m$xima vm# de una reaccin catalizada

enzim$ticamente en trminos de la formacin del comple"o E 5 *. En base a estas consideraciones es

lgico suponer que a altas concentraciones de sustrato, todos los sitios activos de la enzima est$n

ocupados y por lo tanto la velocidad alcanza un m$ximo. El modelo propuesto sirve de base para

explicar las propiedades de la mayora de las enzimas y como se di"o antes asume la existencia de un

comple"o E 5 * como intermediario en la cat$lisis.


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)na enzima E se combina con un sustrato * para formar el comple"o E 5 *, con una constante de

velocidad k%. Este comple"o E 5 * puede seguir dos caminos+ a# puede proceder para formar el

producto con una constante de velocidad kA b# el camino alternativo es disoci$ndose, generando

nuevamente E y * con una constante de velocidad k3.

En base al modelo, la velocidad de la reaccin catalizada enzim$ticamente ser$+

v/ kA0E 5 *1

El valor 0E 5 *1 no es f$cilmente estimable de modo que se necesita una expresin equivalente con

valores conocidos. Bediante desarrollo matem$tico se 8a desarrollado la siguiente ecuacin+

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIN

CATALIZADA ENZIMTICAMENTE. OBTENCIN DEL KMY LA VMAX

*i se mantiene la concentracin de la enzima constante y variamos la concentracin de substrato se

obtiene una curva 8iperblica como la de la figura arriba izquierda#. l principio un aumento de la

concentracin de substrato produce un aumento r$pido de la velocidad de reaccin, pero si se sigue

aumentando la concentracin de substrato, la velocidad de reaccin comienza a disminuir vemos que

a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de reaccin, se dice

que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de reaccin que se

obtiene a esa alta concentracin de substrato se define como la velocidad m$xima vm# de la reaccin

enzim$tica ba"o las condiciones especificadas. La concentracin de substrato 0*1, a la semivelocidad

m$xima de reaccin D v# se puede determinar de la figura y representa la constante de Bic8aelis o

km, la cual es una caracterstica para cada enzima. La inversa de km, o %km, mide aproximadamente la

afinidad de la enzima por el substrato. Bientras m$s peque=o sea el valor de km, mayor ser$ la

afinidad de la enzima por el substrato. *i varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo

substrato, ste ser$ transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad.

s tendremos+


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*implificando#

*i reordenamos la ecuacin tendremos que+

0*1 F km/ 3 0*1 despe"amos# km / 0*1

Esto significa que la concentracin del sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad es el

valor de kmde la enzima.

La expresin de Bic8elis 5 Benten puede ser transformada algebraicamente en otras formas, que son

m$s !tiles para la expresin de los datos experimentales. )na de esas formas consiste en tomar los

recprocos inversa# de ambos miembros de la ecuacin.

Esta expresin conocida con el nombre de ecuacin LineGeaver 5 4urH, corresponde a una recta de

ecuacin+

y = a.m + b

Bidiendo las velocidades para distintas concentraciones de sustrato y representando gr$ficamente al

lado# obtendremos una gr$fica del tipo lineal.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS


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a) Temperatura+ )n aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin

8asta cierta temperatura ptima, ya que despus de aproximadamente I76C se comienza a

producir la desnaturalizacin trmica. Las enzimas de muc8os mamferos tienen una

temperatura ptima de AJ6C, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se

destruyen *in embargo existen especies de bacterias y algas que 8abitan en fuentes de aguas

termales y en el otro extremo ciertas bacterias $rticas tienen temperaturas ptimas cercanas a

&6C.b) Efecto el p! "obre #a $ctividad Enzim%tica+ El p< no afecta la actividad enzim$tica

directamente sino que modifica la concentracin de protones. Los protones adem$s de alterar

la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar tambin en la reaccin como

substrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la

velocidad de la reaccin.Cualquier cambio brusco de p


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IV. MATERIALES Y MTODOS

A. Mat!"a#$ % E&'"()$

Bateriales

Pulpa de papaya 3&g

Extraccin de amilasa#

*olucin yodada.

PEC

*ustrato almidn

gua destilada

Equipos

Batraces Pipetas de %, 3, 7 y %& ml

Probeta de 3&& ml

;ubos de ensayo.

Bortero

Piln.

Mradillas 4alanza analtica

4a=o mara

Centrfuga

Espectrofotmetro.

B. Mt)*)#)+,a

C. P!(a!a-"/ *# P!(a!a*) E/"12t"-) P'!) 3PEC4

Pesar 3& gramos de muestra pulpa de papaya#.

*e tritura en el mortero con el piln.

l triturado lo 8omogenizamos al agregar NCl %& ml a &.%7IB a I6C.

(isolver bien el triturado y luego filtrar.

El filtrado llevar a centrifugacin I&&& rpm x %& min#.

Obtenemos el Preparado enzim$tico Crudo PEC#.

D. Dt!1"/a-"/ * #a A-t"5"*a* Cata#,t"-aE. &'todo de "treet ( lose

Preparar los tubos blanco y problema.

gregar 3.7 ml de solucin de almidn al tubo problema.

gregar &.I ml de agua destilada al tubo problema y 3.@ ml de agua destilada al tubo

blanco.

gregamos &.%mL de PEC al tubo blanco y &.% ml al tubo problema.

Llevar a incubacin A76C por 7 minutos, ambos tubos

*e agregar$ 3.7 ml de a los dos tubos.

*e agregar$ &.% ml de solucin de iodo a los dos tubos.


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*. reparacin de tubos para la curva de calibracin

Preparar los tubos blanco, % 3 A I y 7del mismo modo que el tubo problema

gregar & &.7 %.& %.7 3.& 3.7 ml de solucin de almidn I&&ppm# en cada uno de

los tubos respectivamente. Benos en el tubo 4lanco gregar A.& 3.7 3.& %.7 %.& &.7 ml de agua destilada a cada uno de los tubos

respectivamente.

gregar 3.7 ml de a cada uno de los tubos respectivamente.

gregar solcuion iodada &.% &.% &.% &.% &.% &.% a todos los tubos.

(e"ar reposar por tiempo de 7 minutos y llevar a medir la observancia a una longitud de

onda de 77& nm en el espectrofotmetro.

Esto se puede ver eb el sgte cuadro+

M. C'a*!) . Dat)$ (!5")$ a #a -'!5a * -a#"7!a-"/.

H. ga!"#$

%

I. &.'(

).'(

L.'(

M.'(

N.*

O. COMPONENT

ES

P.BL

Q.M

R.M

S.M

T.M

U.M

V. S+.A!"#+

%,+-

/

?.@.

X.@.

Y.1.

Z.1.

AA..

AB..

AC. H0O#/,1"a#a

AD.. AE.. A.. AG.1. AH.1. AI.@.

A&.HCL'(*N

A..

AL..

AM..

AN..

AO..

AP..

AQ. S+.Y+#a#

a

AR.@.

AS.@.

AT.@.

AU.@.

AV.@.

A?.@.

AX.V. RESULTADOS Y DISCUSIONES

AY.Ta7#a . Ca/t"*a* * a#1"*/ % A7$)!7a/-"a (a!a #a )7t/-"/ * C'!5a *

Ca#"7!a-"/

AZ. CANTIDAD DE

ALMIDN

BA. ABSORBANCIA

BB. @ BC. @

BD. @. BE. @.

B. @. BG. @.F1

BH. @. BI. @.FF


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BJ. @. B. 1.@1

BL.1 BM. 1.14>.

@ @.@[email protected]@.1F@[email protected]@[email protected]@[email protected]@[email protected]@[email protected]@[email protected]@[email protected]@[email protected]@

@.1

@.

@.

@.

@.F

@.@.

@.

@.

1

1.1

1.

1.

1.

9K 1.F @.@R 1

A!"#$% 2!g3

A,+4a%5"a

4O. F"+'!a . Cantidad de lmidn y bsorbancia

4P.

B8. Ta7#a 9.C2#-'#)$ * #a$ '/"*a*$ St!t C#)$ / t'7)$ P!)7#1a % B#a/-)

4.

BS.

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BT. A

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12/14


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CA. @.@@1

CB. @.11F

CC. @.@11

CD. @.

CE.@.@1

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CG.P

CH. @.11

CMQ.

C>.

CO. *eg!n iseman %@QR#la )nidad miloltica )# es la cantidad de enzima contenida en

%&& ml de muestra, que puede 8idrolizar %& mg de almidn en A& minutos, en las condiciones

de la reaccin. En esta tcnica se incuban %& Kl de muestra con &.37 mg de almidn

contenidos en &.7 ml de solucin de sustrato durante J minutos y medio, lo que equivale a

incubar %&& ml de muestra con %&.&&& mg de almidn durante A& minutos. *i todo el almidn

fuera 8idrolizado, la actividad amil$sica de la muestra sera de %&&& )dl. Para obtener las

unidades de actividad amil$sica, la fraccin de almidn digerido se multiplica por %&&&. En

nuestro pr$ctica para la detreminacion de la actividad enzim$tica, utilizamos la unidad *treet

Close esta unidad no especifica el tipo de enzima solo la cuantifica# lo cual se puede observaren la ;abla 3.

CP.*eg!n (oran 3@@Q# la curva de de referencia construida con cantidades conocidas de

una sustancia por e"emplo la alb!mina srica bovina que vimos antes# que se utiliza para

determinar la cantidad de esta sustancia protenas# presente en una muestra incgnita. En

muc8as determinaciones se cumple una relacin proporcional entre la magnitud o

intensidad de color que da una reaccin y la cantidad del reactivo que la provoca. Por

e"emplo+ si la presencia de %& ug de protenas en una solucin genera la aparicin de un

color azul p$lido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 3& ug de

protena dar$ lugar a que la solucin se torne azul m$s oscuro y as sucesivamente. En

nuestro caso esto se puede observar en los datos obtenidos en nuestra ;abla % la cual

ayud para la obtencin de la curva de calibracin en Sigura %, la cual nos dio una recta y

un coeficiente de determinacin de @@.R@' en lo cual vemos que esta relacin debe estar

dado por la magnitud y la intensidad de color dado en el espectrofotmetro.


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CT. *eg!n 2an(er %@J7# la Curva de Calibracin esta dado con datos reales, los gr$ficos

que se obtienen no son tan ideales, pero esta situacin no es un obst$culo ya que dentro

de ciertos valores es posible trazar la recta m$s probable que une una serie de puntos, con

el uso de los programas de c$lculo de las computadoras.


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Espa=a#.C2. -*EB>, . %@QR#. 9Principios de 4iotecnologa:. Editorial C-4- *.. UMOz

Espa=a#.

C.2>(E B. %@J7#. ;8e enzymatic 8ydrolysis of agar by Cytop8agaf-evensLS sp. nov.;;8esis,

Vniversity of Mroningen, >et8erlands, Q& pp.CW. 2>EEL.P. %@7@#. ;8e effect of special diets on t8e digestion processes enzyme production

and resorption# in t8e african giant snail c8atinafilica4oGdic8. 3. vergl. P8ysiol. I3+ IAAXIIQ.

CY.ANEXOS

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