tema-14. las enzimas en el interior celular

Tema-14. Las enzimas en el interior celular

1.- Velocidad total para el modelo S P

2.- Resolución de la ecuación de velocidad en el estado

estacionario

3.-Resolución gráfica de ecuaciones cinéticas:

Método de King y Altman

4. Análisis de la ecuación

1. Velocidad total

* Hasta ahora hemos considerado cinéticas sencillas, in vitro, descritas por el modelo:

E S <===> P

Modelo que cumple la condiciones de partida de M&M:

Las reacciones se han estudiado en condiciones de velocidades iniciales, que son velocidades unidireccionales

extrapoladas a tiempo cero.

La velocidad total, vt, no es la suma algebraica de dos

velocidades iniciales.

* Por otro lado, en el interior de la célula, es decir, in vivo, el producto de reacción, P, siempre está presente, por lo que no

es posible extrapolar el comportamiento de la enzima en la célula a las condiciones de velocidades iniciales de las

condiciones in vitro.

* Para intentar acercarnos a las condiciones de in vivo,

intentaremos estudiar la velocidad de reacción total, vt,

S <===> PPara el que, en este caso, si se cumple:

vt = v1 - v2Donde:

v1 es la velocidad actual de la reacción S --> P v2 es la velocidad actual de la reacción P --> S

* Teniendo en cuenta los distintos complejos que se pueden formar, podemos escribir el modelo, de una manera más realista,

de la siguiente manera:

k1 k3 k5 E + S ES EP E + P k2 k4 k6 Para este modelo se cumplirá:

[Eo] = [E] + [ES] + [EP]dt

dP

dt

dSvt

PEkEPkdt

dPv

ESkSEkdt

dSv

t

t

65

21

Calculo vt necesitamos conocer las concentraciones siguientes:

[E] y [ES] o [E] y [EP]

Plantear las correspondientes ecuaciones diferenciales y resolverlas asumiendo una situación de estado estacionario:

vt = k1[E ][S] - k2[ES] = k5[EP] - k6[E][P]

[So] >>>[Eo] [ES] despreciable frente a [S]

EPESEEdt

EPddt

ESddt

Ed

0

0

0

0

2.- Resolución de la ecuación de velocidad en el estado

estacionario

k1 k3 k5 E + S <===> ES <===> EP <===> E + P k2 k4 k6

Cálculo del valor de las concentraciones de las diferentes formas de las Enzimas en el estado estacionario. Plantea un sistema de ecuaciones

EPkESkEPkSkdt

Ed

vvdt

Edconsumoformación

5261 )(0

0

Empezamos por la enzima libre

k1 k3 k5 E + S <===> ES <===> EP <===> E + P k2 k4 k6

k1 k3 k5 E + S <===> ES <===> EP <===> E + P k2 k4 k6

EPkESkkESkdt

ESd

vvdt

ESdconsumoformación

4321 )(0

0

EPkkESkEPkdt

EPd

vvdt

EPdconsumoformación

)(0

0

5436

[ES]

[EP]

Tenemos un sistema de 4 ecuaciones y tres incógnitas (E, ES, y EP), que de acuerdo con el Teorema de Rouché tendrá solución si

una de las ecuaciones es combinación lineal de otras dos.

-1[ii) + iii)] = iv)

ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] [E] + k2 [ES] + k5 [EP]

iii) 0 = k1(S) [E] - (k2+k3) (ES) + k4 (EP)

iv) 0 = k6(P) [E] + k3 [ES] - (k4+ k5) [EP]

i) [Eo] = [E] + [ES] + [EP]

EPESEE

EPkkESkEPkdt

EPd

EPkESkkESkdt

ESd

EPkESkEPkSkdt

Ed

0

5436

4321

5261

)(0

)(0

)(0

iv) 0 = k6(P) (E) + k3 (ES) - (k4+ k5) (EP)

ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] (E) + k2 (ES) + k5 (EP)

iii) 0 = k1(S) (E) - (k2+k3) (ES) + k4 (EP)

0 = - k1(S)(E) – k6(P)(E) + k1(S)(E) + k2(ES) – k2(ES) –k3(ES) + k5(EP) + k4(EP)

0 = – k6(P)(E) – k3(ES) + k5(EP) + k4(EP)

0 = – k6(P)(E) – k3(ES) + (k4+ k5)(EP)

Si multiplicamos por -1

0 = k6(P)(E) + k3(ES) - (k4+ k5)(EP)Que es exactamente igual que la ec:

vt = k1[E][S] - k2[ES]

Por lo tanto, para calcular la velocidad total vt,

Sólo necesitamos calcular [E] y [ES]

* Aplicando la regla de Cramer al sistema formado por las tres primeras ecuaciones:

ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] (E) + k2 (ES) + k5 (EP)

iii) 0 = k1(S) (E) - (k2+k3) (ES) + k4 (EP)

i) (Eo) = 1(E) + 1(ES) + 1(EP)

Luego el sistema tiene solución

Y teniendo en cuenta que la matriz de coeficientes, , viene dada por:

1 1 1

-[k1(S) + k6(P)] k2 k5

k1(S) - (k2+k3) k4

=

El cálculo de [E] y de [ES] lo podemos realizar de la siguiente manera:

[E]=

Eo 1 1

0 k2 k5

0 -(k2+k3) k4

1 1 1

-[k1(S) + k6(P)] k2 k5

k1(S) - (k2+k3) k4

[ES]=

1 Eo 1

-(k1(S) + k6(P) 0 k5

K1(S) 0 k4

1 1 1

-[k1(S) + k6(P)] k2 k5

k1(S) - (k2+k3) k4

Resolución de un determinante de orden 3

PkkkkkkSkkkkkkkkkkkk

SkkPkkSkkEoES


kkkkkkEoE

)()()(

)(

)()()(

)(

646362514131535242

516441

646362514131535242

535242

Las concentraciones en estado estacionario serán

vt = k1[E][S] - k2[ES]

(k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P] vt = Eo

------------------------------------------------------------------------------

(k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P]


SkkPkkSkkEoES


kkkkkkEoE

)()()(

)(

)()()(

)(

646362514131535242

516441

646362514131535242

535242

Llevando a la ecuación de velocidad total

Reorganizando algebraicamente

* Esta es la ecuación de velocidad total obtenida en función de las constantes microscópicas de velocidad

Es una ecuación de manejo complicado

No es fácil obtener las Constantes cinéticas

Solución transformación según el tratamiento de Michelis-Menten

Obtención de constantes cinéticas michaelentianas

(k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P] vt = Eo

------------------------------------------------------------------------------


Transformación función de las constantes cinética características de la enzima

KmS, KmP, VmaxS y VmaxP

Numerador 1 num1= (k1k3k5)

Numerador 2 num2= (k2k4k6)

Constante Cte = (k2k4+k2k5+k3k5)

Coeficiente de Substrato coefs= (k1k3+k1k4+k1k5)

Coeficiente de Producto coefp= (k2k6+k3k6+k4k6)

(k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P] vt = Eo

------------------------------------------------------------------------------


num1[S] – num2 [P] vt = Eo

----------------------------------------------------- cte + Coefs [S] + Coefp [P]

Multiplicando y dividiendo numerador y denominador por

Substituimos

PSCoefCoef

cte

PCoefCoef

CteCoefS

CoefCoefCteCoef

CoefCoefCteCte

PCoefCoefnumCte

SCoefCoefnumCte

Ev

PS

P

PS

S

PS

PSPSt

21

0

Teniendo en cuenta las defiiniciones de las constantes cinéticas de Michaelis para el Substrato y Producto KmS y KmP y las velocidades máximas VmS y VmP

Los valores se deducen en velocidades iniciales por lo tanto [P] = 0

mSS

mS

SmS

VEokkkk

kkkEo

Coef

numEoV

Coef

numEoV

3531

5311

1

)(

PmP Coef

numEoV 2

K6 y k4 son iguales a 0

Coefp es cero

k3 es el paso limitante de la reacción global (despreciable como sumando frente a k5)

Se deduce lo mismo para el lado contrario P S

sS

S Kmk

kk

kkk

kkk

kkkkkk

kkkkkk

Coef

CteKm

1

32

531

325

514131

535242

)(

)(

k4 =0 y k3<<<k5 PP Coef

CteKm

VmS KmP[S] – VmP KmS[P]

vt = ---------------------------------------------- KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]

Esta es la ecuación de velocidad total obtenida en función de las constantes de velocidad de Michaelis-Mentem (Vm y Km) y de la concentración de S y de P.

El método gráfico, de K&A, consiste en la construcción, en primer lugar, de un polígono de tantos vértices como especies químicas puede presentar la enzima.

Para el sistema más simple:

E + S <==> ES <==> EP <==> E + P

3.- Resolución gráfica de ecuaciones cinéticas: Método de King y Altman

Se utiliza para todos los sistemas: Con más de un Substrato y Producto

ES

E

EP

Método esquemático para la resolución de ecuaciones con mecanismo cinético complejo

En el estado estacionario la concentración total del enzima será igual a la suma de todas las especies químicas de esta

EXiEo

* A continuación se construyen tantos polígonos abiertos como lados tiene el polígono, dejando un lado abierto en cada uno de

ellos.

ES

E

EP

S k1

k2

P k6

k5

k3

k4

ES

E

EP

ES

E

EP

S k1

k2

k3

k4ES

E

EP

S k1

k2

P k6k5

ES

E

EP

P k6k5

k3

k4

* Por otro lado, se cumple que la razón entre una determinada especie química [EXi] y la concentración total de enzima [Eo], [Exi]/[Eo], es igual a la suma de los términos que afectan a la

especie, partido por la suma de todos los términos que afectan a todas las especies.

de los términos que afectan a la especie EXi [EXi]/[Eo] = ----------------------------------------------------------------------- de los términos que afectan a todas las especies químicas

¿Cómo calculamos el numerador y el denominador?

* Los términos que afectan a una especie se calculan en cada polígono abierto recorriendo el camino para llegar a la

especie , multiplicando las constantes de velocidad y las concentraciones de S y P, si hubiera lugar.

ES

E

EP

S k1

k2

k3

k4ES

E

EP

S k1

k2

P k6k5

ES

E

EP

P k6k5

k3

k4

[E] (k2k4) + (k2k5) + k3k5)

ES

E

EP

S k1

k2

k3

k4ES

E

EP

S k1

k2

P k6k5

ES

E

EP

P k6k5

k3

k4

[ES] (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P)

ES

E

EP

S k1

k2

k3

k4ES

E

EP

S k1

k2

P k6k5

ES

E

EP

P k6k5

k3

k4

[EP] (k1k3S) + (k2k6P) + (k3k6P)

[E] (k2k4) (k2k5) (k3k5)

[ES] (k1k4S) (k1k5S) (k4k6P)

[EP] (k1k3S) (k2k6P) (k3k6P)

TÉRMINOSFORMAS DE LA ENZIMA

EPESE

EXi

Eo

EXi

Así pues,

(k2k4 + k2k5 +k3k5) [E] = [Eo] --------------------------------------------------------------------------- (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P)

(k1k4S + k1k5S + k4k6P) [ES] = [Eo] ------------------------------------------------------------------------- (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P)

(k1k3S + k2k6P + k3k6P) [EP] = [Eo] ------------------------------------------------------------------------- (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P)

- Como vt viene dado por: vt = k1[E][S] - k2[ES]

- Sustituyendo los valores de [E] y [ES] tendremos:

(k2k4 + k2k5 +k3k5) (k1k4S + k1k5S + k4k6P)

vt = k1[Eo] ------------------------ [S] - k2[Eo]

------------------------------ t

tDonde:

t = (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P +

k3k6P)

y operando, obtenemos:

(k1k2k4S + k1k2k5S +k1k3k5S - k1k2k4S - k1k2k5S - k2k4k6P) vt = [Eo]

[----------------------------------------------------------------]

t

(k1k3k5) (S) (k2k4k6) (P) vt = [Eo] [------------------ - -------------------] t t

-Simplificando

- Si en t ordenamos las contantes y sacamos factor común,

podemos escribir:

t = (k2k4 + k2k5 +k3k5) + k1(k3k4k5) (S) + k6(k2k3k4) (P)

Cte. CoefS CoefP

Usando estas simplificaciones, e introduciendo otras, y operando adecuadamente.

* Expresión de la ecuación de velocidad total en presencia de P y S

VmS KmP[S] – VmP KmS[P]

vt = ---------------------------------------------- KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]

Misma ecuación que la obtenida en mediante la resolución de sistemas de ecuaciones diferenciales en el estado estacionario

4. Análisis de la ecuación:

VmS KmP[S] – VmP KmS[P] vt = -----------------------------------------

KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]

1. En condiciones de velocidad inicial [P] = 0, la ecuación se convierte en la ecuación de M-M

VmS KmP[S] – VmP KmS[P] vt = -----------------------------------------


SKm

SVmv

s

s

Tarea. Si consideramos velocidades iniciales, qué forma tomará la anterior ec. general para la reacción en sentido P --> S?

2. En condiciones de velocidad iniciales y unidireccionales si [P] ≠ 0La ecuación tiene el siguiente valor

SKmP

Km

SVmv

Ps

s

1

01

Ecuación similar a la de la Inhibición competitiva. El producto si está presente en velocidades iniciales se comporta como un inhibidor competitivo

Kcat dirección S es 0

VmP = 0

En condiciones de equilibrio químico, vt = 0, se deduce la

siguiente relación:

VmS KmP[S]eq - VmP KmS[P]eq = 0- Donde [S]eq y [P]eq son las concentraciones en el equilibrio.

[P]eq VmS KmP

Keq = --------- = -----------------

[S]eq VmP KmS

3. Relación de Haldane

Relación que recibe el nombre de Relación de Haldane.

VmS KmP[S] – VmP KmS[P] vt = ---------------------------------------------= 0


- La relación de Haldane nos permite obtener la constante de equilibrio, Keq, de la reacción a partir de las constantes

cinéticas .

Y por extensión, podemos, también calcular el valor de G’º de la reacción a partir de las constantes cinéticas enzimáticas, ya que:

VmSKmP G’º = -RT ln -------------

VmPKmS

Las constantes cinéticas son fáciles de calcular experimentalmente.

Resumen

• El análisis cinético de M-M está referido a velocidades iniciales

En el interior celular in vivo el producto de la reacción está siempre presente, habrá que tener en cuenta la velocidad total no las velocidades iniciales

Velocidad total es la suma de las velocidades unidireccionales

Las ecuaciones referidas a las velocidades totales solamente se resuelven en el estado estacionario: Variación de las concentraciones de las diferentes especies químicas en las que se encuentre la enzima respecto al tiempo es cero

Resolución de las ecuaciones de velocidad total se realizada con diferente aproximaciones:

Estado estacionario,se obtiene una expresión de velocidad total en función de las constantes cinéticas Vms, Vmp, Kms Kmp y de las concentraciones de P y S.

VmaxS KmP(S) - VmaxP KmS(P)

vt = -------------------------------------------------

KmS KmP + KmP(S) + KmS(P)

Resolución gráfica propuesta por King y Altman método sencillo permite la resolución de planteamientos enzimáticos complejos

Relación de Haldane, cuando la velocidad total es cero es decir en condiciones de equilibrio relaciona la constante de equilibrio con las constantes cinéticas de la enzima (estudiadas de acuerdo con las condiciones de M-M).

tema-14. las enzimas en el interior celular

Documents