sistema microanalÍtico de valoraciÓn
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SISTEMA MICROANALÍTICO DE VALORACIÓN
COULOMBIOFOTOCOLORIMÉTRICA DE INSTRUMENTACIÓN DE BAJO
COSTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN MUESTRAS
DE JUGOS ARTIFICIALES
MARIO ENRIQUE HEREDIA PÉREZ
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
MAESTRÍA EN CIENCIAS QUÍMICAS
MONTERÍA
2020
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SISTEMA MICROANALÍTICO DE VALORACIÓN
COULOMBIOFOTOCOLORIMÉTRICA DE INSTRUMENTACIÓN DE BAJO
COSTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN MUESTRAS
DE JUGOS ARTIFICIALES
MARIO ENRIQUE HEREDIA PÉREZ Trabajo de grado presentado en la modalidad de trabajo de investigación, como
requisitos para optar al título de Magister en Ciencias Químicas.
DIRECTOR
JOSÉ LUÍS MARRUGO NEGRETE
Doctor en Ciencias Químicas
Grupo de investigación en aguas Química Aplicada y Ambiental
CODIRECTOR
ALEJANDRO BAEZA REYES
Doctor en Química Analítica
Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México
JOSÉ JOAQUÍN PINEDO HERNÁNDEZ
Magíster en Ciencias Ambientales Grupo de Investigación en Aguas Química Aplicada y Ambiental
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
MAESTRÍA EN CIENCIAS QUÍMICAS
MONTERÍA
2020
3
Nota de aceptación
_____________________________________
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_____________________________________
____________________________
Firma del jurado
____________________________ Firma del jurado
Montería, Noviembre de 2020
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A Dios,
mi familia en especial a mis hijos
´´Samuel y Miguel Ángel´´
5
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mis agradecimientos primero que todo a Dios por darnos la oportunidad
de estar con vida en estos momentos difíciles; a mis directores de trabajo de grado José
Luis Marrugo Negrete y Alejandro Baeza Reyes, por su tiempo y dedicación durante todo
el desarrollo de este proceso. Además, a José Joaquín Pinedo Hernández por su apoyo y
acompañamiento incondicional en esta investigación.
El autor desea dar las gracias a la Universidad de Córdoba, a la facultad de Ciencias
Básicas y en especial al cuerpo de docentes de la maestría de Ciencias Químicas, gracias
por sus consejos y por compartir sus experiencias académicas que de una u otra forma
contribuyeron a la realización de este trabajo
Al grupo de investigación en Aguas, Química Aplicada y Ambiental (GQAA), por todo el
apoyo recibido para desarrollar esta investigación, al director del grupo y a sus
integrantes, excelentes amigos y compañeros de trabajo.
A los jurados y demás personas que de una u otra manera se involucraron en el
desarrollo de este trabajo; gracias por su dedicación y apoyo.
A mi familia por su amor y comprensión
6
ACRÓNIMOS
A.A: Ácido ascórbico
ANOVA: Análisis de varianza
AOAC: Association of Official Analytical Chemists
CV: coeficiente de variación
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético
%E: Porcentaje de error
[KI]: Concentración de yoduro de potasio
[KNO3]: Concentración de nitrato de potasio
LDM: Límite de detección del método
%R: Porcentaje de recuperación
M: Molaridad
MSR: Metodología de superficie de respuesta
7
TABLA DE CONTENIDOS
Pag
RESUMEN 12
ABSTRAC 13
INTRODUCCIÓN 14
2. MARCO TEÓRICO 16
2.1 Química a microescala 16
2.1.2 Generalidades de la Química a Microescala 16
2.2 Coulombimetría 17
2.2.1 Coulombimetría potenciostática 17
2.2.2 Coulombimetría amperostática o valoración coulombimétrica 18
2.3 Métodos ópticos de análisis 21
2.3.1 Colorimetría, Fotocolorimetría y Espectrofotometría 22
2.3.2 Ley límite de Lambert-Beer-Bouger 23
2.3.3 Instrumentación óptica de un espectrofotómetro 27
2.3.3.1 Fuente de radiación 27
2.3.3.2 Selectores de longitud de onda 28
2.3.3.3 Filtros 28
2.3.3.4 Monocromadores 29
2.3.3.5 Celda de absorción 30
2.3.3.6 Detectores de radiación 30
8
2.3.3.7 Registrador 31
2.3.3.8 Procesador 32
2.4 Validación de métodos 32
2.4.1 Límite de detección del método 34
2.4.2 Precisión 34
2.4.3 Exactitud 35
2.4.4 Incertidumbre 36
2.4.4.1 Componentes de la incertidumbre 38
2.4.4.1.1 Incertidumbre combinada 43
2.5 Ácido ascórbico 44
3. OBJETIVOS 45
3.1 Objetivo general 45
3.1.1 Objetivos específicos 45
4. METODOLOGÍA 46
4.1 Diseño y construcción de equipos 46
4.1.1 Sistema de valoración microculombiométrica 46
4.1.2 Microfotocolorímetro 47
4.2 Parámetros de validación del método 48
4.2.1 Rango lineal 48
4.2.2 Precisión 48
4.2.3 Exactitud 49
4.2.4 Límite de detección 49
9
4.2.5 Incertidumbre 49
4.3 Análisis de estándares y muestras 50
4.3.1 Análisis microcoulombiofotométrico 50
4.3.2 Análisis volumétrico 51
4.4 Análisis estadístico 51
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES 53
5.1 Optimización de las condiciones de operación 53
5.2 Validación del método 57
6 CONCLUSIONES 67
7 REFERENCIAS 68
10
LISTA DE TABLAS
Pag
Tabla 1. Criterios para seleccionar el tipo de función de distribución 38
Tabla 2. Rango de factores independientes y sus niveles 52
Tabla 3. Matriz diseño factorial 32 – análisis de superficie de respuesta
(MRS)
52
Tabla 4. Análisis de varianza para evaluación de los efectos simples y
combinados de la [KI] y [KNO3]
55
Tabla 5. Condiciones óptimas de operación sistema
coulombiofotocolorimétrico
56
Tabla 6. Costo instrumental sistema microcoulombifotocolorimétrico 57
Tabla 7. Análisis de varianza para modelo de regresión lineal sistema
acople coulombiometría – fotocolorimetría
58
Tabla 8. Límite de detección sistema microcoulombiométrico con detección
visual y fotocolorimétrico
61
Tabla 9. Parámetros de control de calidad analítica - validación de métodos 62
Tabla 10. Determinación de ácido ascórbico por aplicación de diferentes
métodos de análisis.
64
11
LISTA DE FIGURAS
Pag
Figura 1. Sistema microanalitico de valoración coulombifotocolorimétrico 47
Figura 2. Diagrama causa – efecto para sistema
microcoulombiofotocolorimétrico
50
Figura 3. Diagrama de Pareto - sistema coulombiofotocolorimétrico 56
Figura 4. a) Curvas de calibración, detección visual detección
microfotocolorimetrica para n = 3, b) grafico de residuos detección
sistema microcoulombiofotocolorimétrico,
57
Figura 5. Efecto de la concentración y voltaje en la respuesta, 60
Figura 6. Rango lineal sistema microcoulombiofotocolorimétrico 61
Figura 7. Incertidumbre sistema microcoulombiofotocolorimétrico 65
12
RESUMEN
Este proyecto evalúo la factibilidad técnica de un sistema microanalítico de
valoración coulombimétrica con acople fotocolorimétrico en línea, de mínima
instrumentación, con materiales de bajo costo y accesibles para la determinación
del ácido ascórbico en muestras de jugos artificiales. Para evaluar los efectos
simples y combinados de los parámetros independientes [KNO3] y [KI], sobre la
variable de respuesta tiempo y optimización de las condiciones del proceso, se
utilizó un diseño factorial 32 con análisis estadístico de metodología de superficie
de respuesta (MSR). El método cumple con los criterios de aceptación
establecidos por la AOAC y permite la determinación de ácido ascórbico en jugos
de frutas con límite de detección de 0.001 M (176 mg L -1), precisión expresada
como coeficiente de variación de 1.7%, exactitud como porcentaje de recuperación
de 97.6% y error de 1.6% e incertidumbre combinada promedio de 0.0002 en un
rango de trabajo de 0.001 a 0.01 M. Los resultados de precisión y exactitud
respecto al método de referencia de valoración redox y diferentes métodos de
análisis reportados como espectrofotométrico, electroanalítico, colorimetría digital,
fluorescencia y cromatografía, no presentan diferencia estadísticamente
significativa. El método propuesto resultó simple, sensible, preciso, exacto y
costos instrumentales muy bajos e indica que puede ser útil para la determinación
rutinaria de ácido ascórbico como herramienta de control de calidad en diversas
formulaciones.
13
Palabras claves: coulombimetría, fotocolorimetría, ácido ascórbico, microescala.
ABSTRACT
This project evaluated the technical feasibility of a microanalytical coulometric
titration system with on-line photocolorimetric coupling, with minimal
instrumentation, with low-cost and accessible materials for the determination of
ascorbic acid in artificial juice samples. To evaluate the simple and combined
effects of the independent parameters [KNO3] and [KI], on the response variable
time and optimization of the process conditions, a 32 factorial design was used
with statistical analysis of response surface methodology (MSR). The method
meets the acceptance criteria established by the AOAC and allows the
determination of ascorbic acid in fruit juices with a detection limit of 0.001 M (176
mg L -1), precision expressed as a coefficient of variation of 1.7%, accuracy as
recovery percentage of 97.6% and error of 1.6% and average combined
uncertainty of 0.0002 in a working range of 0.001 to 0.01 M. The precision and
accuracy results with respect to the redox titration reference method and different
analysis methods reported as spectrophotometric , electroanalytical, digital
colorimetry, fluorescence and chromatography, do not present statistically
significant difference. The proposed method was simple, sensitive, precise, exact
and very low instrumental costs and indicates that it can be useful for the routine
determination of ascorbic acid as a quality control tool in various formulations.
Key words: coulombimetry, photocolorimetry, ascorbic acid, microscale
14
1. INTRODUCCIÓN
El ácido ascórbico (AA) es una vitamina esencial en la dieta humana, y su
determinación por técnicas sensibles y rápidas, es importante para evaluar su
estabilidad en diferentes productos alimenticios (Bazel y Tirpák, 2018). A pesar de
la innovación y desarrollo instrumental en metodologías analíticas como
cromatografía líquida (Cotrut y Badulescu, 2016; Koblová et al., 2012; Zappielo et
al., 2019 ), cromatografía de gases (Silva, 2005), colorimetría (Peng et al.,
2015; Wang et al., 2018), electroforesis capilar (Versari et al., 2004), fluorescencia
molecular (Meng et al., 2017), quimioluminiscencia (Wang et al., 2012) y titulación
con agentes oxidantes (Arya et al., 2000); los métodos ópticos y electroquímicos
de análisis son y seguirán siendo ampliamente utilizados, y en muchos casos
como la técnica de primera elección, por las ventajas que representa,
principalmente por el relativo bajo costo de los equipos y la simplicidad del
análisis, comparado por ejemplo con los equipos cromatograficos (Zaporozhets y
Krushinskaya, 2002 ; Bazel et al., 2018; Wang et al., 2018; Savk et al., 2019). Por
lo cual la implementación de técnicas electroanalíticas ó fotocolorimétricas y
acople en línea entre estas, en especial a microescala, resulta de gran interés en
la actualidad para el desarrollo de equipos con materiales de bajo costo y finalidad
de ser aplicados en diferentes campos de las ciencias ó industrias para el control
de calidad, sin la necesidad de contar con grandes y sofisticadas instalaciones,
laboratorios especializados, instrumentación costosa, personal técnico capacitado
15
y cantidades de reactivos. Siendo así las técnicas de microanálisis o microescala
una importante alternativa a implementar en los laboratorios de análisis químico ya
que ofrece ventajas frente a otros métodos instrumentales. Además, la utilización
de las técnicas microanalíticas culombiometría – fotocolometría, permite mostrar
una posibilidad de que laboratorios e instituciones dedicados a la enseñanza
instrumental generen autonomía tecnológica (Merino y Herrero, 2007; Doria,
2009), al utilizar una propiedad eléctrica voltaje, corriente o resistencia y asociarla
a un significado analítico, relacionado en algunos casos con una propiedad física,
por ejemplo, el color que puede ser utilizado como una medida de la concentración
de un compuesto en solución ya que este puede adquirir un valor numérico o
como indicador visual del equilibrio de una reacción al considerar un sistema
químico – sensor. El objetivo de este estudio fue evaluar un sistema microanalítico
de valoración culombiofotocolorimétrica de instrumentación de bajo costo y
materiales accesibles para la determinación de ácido ascórbico en muestras de
jugos artificiales que permita que la innovación y desarrollo asociado a
instrumentación y automatización de los métodos analíticos a microescala se
convierta en una herramienta útil en diferentes campos de la ciencia o industrias.
16
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Química a microescala
Se define como un método de análisis que utiliza cantidades de material químico,
reducidas al nivel mínimo en el que un experimento dado puede llevarse a cabo,
logrando el mismo nivel de aprendizaje y resultados que los de un laboratorio a
macroescala; característica por poseer técnicas seguras y de fácil manipulación, y
por requerir equipo y cristalería en miniatura así como el de poseer habilidades de
alta calidad; considerando ser es un método de prevención de la contaminación
ambiental, que disminuye la cantidad del desecho químico generado durante los
experimentos de laboratorio (López et al., 2005; Abdullah et al., 2009; González y
Urzúa, 2012; Aponte et al., 2013).
2.1.2 Generalidades de la química a microescala
Según Hernández y Pineda, (2003) el Instituto de investigación de Medio Oeste
(MRI, por sus siglas en ingles) indica que los fundamentos esenciales de la
química a microescala son:
Una reducción de reactivos químicos a volúmenes y masas cien veces más
pequeña que las usadas en los laboratorios tradicionales.
Un cambio en la utilización de la cristalería común a los materiales plásticos o
polímeros modernos en los instrumentos para la transferencia,
almacenamiento y reacción.
17
La utilización de herramientas de observación para múltiples muestras lo que
permite una rápida preparación intuitiva, comparación y variación de
sistemasquímicos en todas sus fases: gases, líquidos y sólidos.
La química a microescala utiliza equipo de bajo costo, de fácil obtención como
mondadientes, pajillas, pipetas plásticas y platos de micro reacción para
realizar experimentos químicos sofisticados que tradicionalmente requieren
cristalería, reactivos e instrumentación costosa.
2.2 Coulombimetría
Se determina la cantidad de carga eléctrica (electrones) necesaria para modificar
cuantitativamente el estado de oxidación del analito; son normalmente más
rápidos y no necesitan que el producto de la reacción electroquímica sea un sólido
pesable. Son tan precisos como los procedimientos gravimétricos o volumétricos
convencionales (Harris et al., 2001; Asakai et al., 2004).
En general, pueden clasificarse en coulombimetría potenciostática y
coulombimetría amperostática o titulación coulombimétrica (Harris et al., 2001).
2.2.1 Coulombimetría potenciostática
En la culombiometría a potencial controlado, el potencial del electrodo de trabajo
se mantiene a un nivel constante de forma que solamente el analito sea el
responsable de conducir la carga a través de la interfase electrodo/disolución. La
carga requerida para convertir el analito en su producto de reacción se determina
registrando e integrando la curva corriente frente a tiempo durante la electrolisis.
18
2.2.2 Coulombimetría amperostática o valoración coulombimétrica
Las valoraciones culombiometricas son similares al resto de las valoraciones en
las que los análisis se basan en la medida de la capacidad de combinación del
analito con un reactivo patrón. El equipo requerido para una valoración
culombiométrica comprende una fuente de corriente constante en miliamperios,
celda de valoración, un interruptor, cronometro y dispositivo para monitorizar la
corriente. En el procedimiento culombiométrico, el reactivo son los electrones y la
disolución patrón es una corriente constante de magnitud conocida. Se añaden los
electrones al analito (vía corriente continua) o a determinadas especies que
reaccionan de inmediato con el analito hasta alcanzar el punto final en el cual la
electrolisis se detiene. La cantidad de analito se determina a partir de la magnitud
de la corriente y del tiempo requerido para completar la valoración. La magnitud de
la corriente en amperios es análoga a la molaridad de la disolución patrón y la
lectura de tiempo es análoga a la medida del volumen en las valoraciones
convencionales. Debido a los efectos de la polarización por concentración, para
mantener la eficiencia de corriente del 100% con respecto al analito resulta
necesaria la presencia de un gran exceso de reactivo auxiliar que sea oxidado o
reducido en el electrodo para dar un producto que reaccione con el analito.
La valoración culombiométrica ofrece diversas ventajas importantes sobre los
procedimientos volumétricos convencionales. En las principales ventajas está la
eliminación de problemas asociados con la preparación, normalización y
almacenamiento de las disoluciones patrón. Además, valoraciones de pequeñas
cantidades de analito, ya que eligiendo una corriente apropiada se pueden
19
producir cantidades de muy baja proporción con facilidad y precisión. Una ventaja
adicional del procedimiento culombiometrico es que una sola fuente de corriente
constante suministra reactivos para las valoraciones por precipitación, formación
de complejos, neutralización u oxido/reducción. Por último, las valoraciones
culombiométricas se automatizan fácilmente, debido a que es más sencillo tener
control sobre la corriente que sobre un flujo líquido.
Valoraciones de neutralización
Son aquellas en las cuales se valoran los iones (𝐻+) tanto de ácidos fuertes como
débiles con los iones (𝑂𝐻−) generados en la electrolisis; donde el ion hidróxido
puede producirse en la superficie de un cátodo de platino sumergido en una
disolución ácida que contiene el analito:
2H2O + 2e− ↔ 2OH− + H2 (g) (1)
2H+ + 2OH− ↔ H2O (2)
Las valoraciones culombiométricas de ácidos son mucho menos sensibles al error
del carbonato que ocurre en los métodos volumétricos. Este error se puede evitar
si el dióxido de carbono del disolvente se elimina hirviendo o haciendo burbujear
un gas inerte, como el nitrógeno, a través de la disolución durante un breve
tiempo. Cabe resaltar que los iones hidrogeno generados en la superficie del
ánodo platino de mayor aplicación en este método y se pueden utilizar para la
valoración culombiometrica de ácidos fuertes y débiles; donde generalmente el
ánodo de platino se debe aislar mediante un diafragma para eliminar la posible
interferencia de los iones hidrógenos producidos por la oxidación anódica del
20
agua. Una alternativa es sustituir el ánodo de platino por un alambre de plata,
siempre que se adicione iones cloruro o bromuro a la disolución del analito donde
ocurre la siguiente reacción en el ánodo.
Ag(s)+ Br− ↔ AgBr (s) + 2e− (3)
Valoración de precipitación y formación de complejos
Se han desarrollado una gran variedad de valoraciones coulombimétricas en las
que se utilizan los iones plata o mercurio generados en un electrodo generador
(ánodo) formado por un hilo grueso de plata o un electrodo de mercurio. Los
puntos finales se detectan bien potenciométricamente o bien con indicadores
químicos.
En esta clase de valoraciones es muy frecuente el empleo de electrodos de plata
para la producción de iones (Ag+) mediante la oxidación del metal y los iones
formados se utilizan para la valoración de otros iones.
↓Ag ↔ Ag+ + e− (4)
Ag+ + Cl− ↔ ↓AgCl (5)
Valoraciones culombiometricas con EDTA se pueden llevar a cabo por la
reducción del quelato EDTA amina mercurio (II) en el cátodo de mercurio:
HgNH3Y−2 + NH4+ ↔ Hg(l) + 2NH3
+ HY−3 (6)
21
Debido que el quelado de mercurio es más estable que los complejos
correspondientes de cationes como el calcio, zinc, plomo o cobre, la formación de
complejos de estos iones tienen lugar solo después de que el ligando ha sido
liberado por el proceso del electrodo se pueden generar diversos reactivos
precipitantes culombimétricamente.
Valoraciones de oxidación / reducción
Existen muchos reactivos que pueden ser generados coulombimétricamente. Son
importantes aquellos reactivos que no se encuentran normalmente en análisis
volumétrico por la gran inestabilidad de sus disoluciones: el ion plata divalente,
el manganeso trivalente o el complejo de cloruro con el cobre monovalente.
El bromo electrogenerado ha demostrado ser muy útil y constituye la base de
numerosos métodos. En este tipo de análisis se determina un elemento mediante
la oxidación por medio de un ión, por ejemplo yodo, el cual es generado y utilizado
para la valoración.
2I− ↔ I2 + 2e− (7)
2.3 Métodos ópticos de análisis
Se definen como aquellos que miden la radiación electromagnética que emana o
interactúa con la materia. Estos métodos, tienen como objeto, la medida de la
radiación que es emitida, absorbida, o transmitida al interactuar el campo eléctrico
o magnético de la radiación con los campos eléctricos o magnéticos de la materia;
o bien la medida de la radiación que es reflejada, refractada, difractada, polarizada
22
o dispersada cuando interactúa con la materia (Harris et al., 2001; Skoog et al.,
2001).
2.3.1 Colorimetría, Fotocolorimetría y Espectrofotometría, (Skoog et al., 2005).
Pocos son los autores que hacen mención de las diferencias entre estos métodos
de análisis ópticos. Pero, es necesario mencionar las diferencias de cada uno de
ellos, ya que aun se siguen usando indistintamente, inclusive por los profesionales
que los utilizan a diario.
Se dice que la colorimetría es aquel método en que el detector es el ojo humano.
El mejor ejemplo de este tipo lo constituye el papel pH, el cual cambia de color o
adquiere uno en especial según el pH del medio en el cual se ha sumergido. Para
determinación de hemoglobina (Hb) se reportó un método de medición con esta
técnica, llamado método de Tallqvist. Evidentemente, la determinación de
parámetros como el pH o la determinación de Hb en una muestra, da lugar a
resultados pobres en exactitud y precisión.
Cuando se sustituye el ojo humano por un detector fotoeléctrico, como los son las
fotoceldas o fotorresistencias, y se hace incidir un rayo de luz sobre una muestra
que pasa a través de un filtro de un color determinado, se dice que se trata de un
método por fotocolorimetría. Este método presenta mayor sensibilidad que el
colorimétrico, ya que las pequeñas cantidades de luz absorbidas por la muestra
pueden ser detectadas por el detector que se use, que por el ojo humano. Sin
embargo, la selectividad del método es mínima, y solo sirve para muestras que
exhiban máximos de absorción en un intervalo amplio de . Evidentemente, la
23
fotocolorimetría no es recomendable para mezclas o muestras dentro de matrices
que también absorban. En el caso de la Hb, este es un método recomendable, y
de hecho es el que se propone más adelante.
Finalmente, cuando se ha sustituido el ojo humano por un detector fotoeléctrico, y
el filtro de luz ahora es sustituido por un monocromador, como lo es una rejilla de
difracción, y se puede filtrar la luz incidente a una determinada, tal que sea la
mejor para el análisis, se habla de espectrofotometría donde la relación de
respuesta vs concentración debe cumplir con la ley lambert-beer-bouger.
2.3.2 Ley límite de Lambert-Beer-Bouger, (Martínez – Nuñez, 2004).
Medir la capacidad de absorción de una sustancia es posible. Sea I0 el poder
incidente de luz monocromática que cae sobre una muestra que contiene un i-
ésimo analito de concentración [i], a través de un camino óptico que posee una
longitud l. El número de lugares absorbentes del haz durante el paso de la
radiación por el paso óptico l, debe estar expresado en función de [i] y de l, y dicha
función tiene la forma de una diferencia total, como la siguiente:
𝑑𝐼 = (𝜕𝐼
𝜕𝑙)[𝑖]𝑑𝑙 + (
𝜕𝐼
𝜕[𝑖])[𝑙] 𝑑[𝑖 ] 𝑝𝑎𝑟𝑎 [𝑖] = 𝜙𝐶0 (8)
Lambert declaró que la tasa de disminución en la intensidad de la luz al pasar por
un camino óptico o cubeta de espesor (l) del medio es proporcional a la intensidad
24
de la luz incidente. Cuando se expresa matemáticamente en la ley de Lambert-
beer de tal forma que:
Ley de Lambert: (∂I
∂l)[i] = −kl I (9)
Ley de Beer y Bouger: (𝜕𝐼
𝜕[𝑖])[𝑙] = −k[𝑖] I (10)
Sustituyendo lo enunciado en las leyes de Lambert-Beer-Bouger en la ecuación
diferencial (9), y multiplicando por -1 ambos miembros de la ecuación se obtiene
lo siguiente:
−dl = kl Idl + k[𝑖] Id[𝑖] (11)
Dividiendo la ecuación 10 entre I se obtiene:
−𝑑𝑙
𝐼= 𝑘𝑙𝑑𝑙 + 𝑘[𝑖]𝑑[𝑖] (12)
Integrando la ecuación (12) desde l = 0, [i] = 0 cuando I = I0, hasta l = l e [i] = [i]
cuando I = I:
− ∫𝑑𝐼
𝐼
𝐼
𝐼0= ∫ 𝑘𝑙
([𝑖],𝑙)
0,0𝑑𝑙 + 𝑘[𝑖]𝑑[𝑖] (13)
El término de la derecha de la ecuación (13) es una integral que de acuerdo al
teorema de Green Swokowski et al. (1982) se reduce a:
− ∫𝑑𝐼
𝐼
𝐼
𝐼0= ∬ (
𝑑𝑘𝑙
𝑑[𝑖]−
𝑑𝑘𝑖
𝑑𝑙) 𝑑𝑙𝑑[𝑖] (14)
𝑙 [𝑖]
0 0
Si kl y k[i] son funciones lineales de [i] y de l, respectivamente, la ecuación anterior
se convierte en:
25
∫𝑑𝐼
𝐼
𝐼
𝐼0
= ∬ (𝑘1 − 𝑘2)𝑑𝑙𝑑[𝑖] (15)
𝑙 [𝑖]
0 0
Donde k1 y k2 son constantes definidas por dk1/d[i] y dk[i]/dl respectivamente.
Resolviendo la integral y rearreglando (k1 - k2) = K, se obtiene la conocida ley de
Lambert-Beer-Bouger:
ln𝐼
𝐼0= −𝐾𝑙[𝑖] (16)
Ahora bien, la relación I/I0 se puede determinar experimentalmente si se mide la
respuesta de un detector sensible a la luz. Los fotodetectores usados en
fotocolorimetría proporcionan una respuesta en forma de diferencia de potencial
eléctrico que puede medirse con un voltímetro. Se busca que el detector responda
de acuerdo a la siguiente ecuación (Reilley y Crawford, 1995).
R = Rr + K I; Iu < I < Isat (17)
donde Rr es la respuesta residual, es decir, la respuesta del detector a la poca luz
que se filtra conocida como luz parásita; k es una constante que representa la
rapidez de respuesta lineal del detector, dR/dI; Iu es la intensidad umbral, es decir,
la mínima cantidad de luz que genera una respuesta lineal del detector; Isat es la
intensidad de saturación, es decir, la máxima cantidad de luz que proporciona una
respuesta lineal y se caracteriza porque (dR/dI) → 0.
El detector ideal para fotocolorimetría y espectrofotometría es aquel que presente
las Siguientes características: Rr = 0, Iu = 0, Isat↑ y k↑.
26
La determinación del cociente I/I0, conocido como transmitancia, T, puede
efectuarse experimentalmente si se determina Rr (la respuesta con la luz
apagada), R0 (la respuesta del medio de reacción) y Ri (la respuesta de la
disolución del analito absorbente de concentración molar [i]) (Martínez, et al.
2004), ya que:
Para el blanco
𝐼0 =𝑅0 − 𝑅𝑟
𝑘 (18)
Disolución de analito absorbente
𝐼𝑖 = 𝑅𝑖 − 𝑅𝑟
𝑘 (19)
Entonces es posible determinar el parámetro adimensional conocido como
tramitancia T, por medio de la medición de la respuesta R del detector, de la
siguiente manera:
𝑇 =𝐼𝑖
𝐼0=
𝑅𝑖 − 𝑅𝑟
𝑅0 − 𝑅𝑟 (20)
A partir de la ecuación anterior se puede calcular un segundo parámetro
adimensional que relaciona la variación de la irradiación del haz de luz medida por
el fotodetector conocido como absorbancia.
𝐴 = −𝑙𝑜𝑔𝑇 = 𝑝𝑇 = −𝑙𝑜𝑔 (𝑅𝑖−𝑅𝑟
𝑅0−𝑅𝑟) (21)
2.3.3 Instrumentación óptica de un espectrofotómetro, (Harris et al., 2001; Skoog
et al., 2001- 2005, Martínez – Nuñez, 2004).
Los instrumentos para el análisis o medidas de absorción, algunas veces son
sencillo y baratos, y otras veces son complejos informatizados. No obstante los
27
sistemas más sencillos, en algunos casos proporcionan información tan rápida y
satisfactoria como la obtenida con los equipos sostificados. Generalmente estos
métodos instrumentales de análisis ópticos siguen un esquema lineal, que se
encuentra compuesto por una serie de componentes como los siguientes: fuentes
de radiación, selectores de longitud de onda, recipiente para la muestra,
detectores de la radiación, procesadores de señal y dispositivos de lectura.
2.3.3.1 Fuente de radiación
La fuente ideal es aquella que proporciona una radiación constante y uniforme
sobre una amplia región espectral. Las fuentes de radiación se pueden clasificar:
Fuentes continúas: las fuentes continuas se usan ampliamente en
espectroscopia de absorción y de fluorescencia. La fuente más común para la
región ultravioleta es la lámpara de deuterio. Cuando se precisa una fuente
particularmente intensa, se utilizan lámparas de arcos llenas de un gas argón,
xenón o mercurio a alta presión. Para la región visible del espectro la lámpara
de filamento de wolframio se usa casi universalmente.
Fuentes de líneas: las fuentes que tienen pocas líneas discretas son muy
utilizadas en espectroscopia de adsorción atómica, en espectroscopia de
fluorescencia atómica y molecular y en espectroscopia raman. Las lámparas de
vapor de mercurio y de sodio, utilizadas en distintos experimentos
espectroscópicos proporcionan relativamente pocas líneas agudas en la región
ultravioleta y visible.
28
2.3.3.2 Selectores de longitud de onda
Para la mayoría de los análisis espectroscópicos se necesita una radiación
constituida por un grupo limitado, estrecho y continuo de longitudes de onda
denominados banda. Esto se debe a que una anchura de banda estrecha aumenta
la sensibilidad de las medidas de absorbancia. De tal forma que al garantizar que
se aísla la longitud de onda donde las moléculas de la muestra absorben más, se
genera un aumento de la relación lineal entre la señal óptica y la concentración
(ecuación de Lambert-Beer-Bouguer). Existen dos clases de selectores de
longitud de onda, los filtros y los monocromadores (Skoog et al., 2001).
2.3.3.3 Filtros
La función de un filtro es transmitir una banda de radiación en particular y la
absorción de todas las demás. Se emplean dos tipos de filtros para la selección de
la longitud de onda: los filtros de interferencia denominados también filtros de
Fabry-Perot que operan en la región ultravioleta, visible y buena parte del infrarrojo
y los filtros de absorción que se limitan a la región visible del espectro
electromagnético.
2.3.3.4 Monocromadores
Dispositivos que producen un haz de radiación de alta pureza espectral con un
ancho de banda muy angosto, cuya longitud de onda se puede variar de forma
continua y en un amplio intervalo; es decir, permite realizar un barrido espectral.
Existen dos tipos, los de prisma que pueden utilizarse para dispersar la radiación
ultravioleta, visible o infrarroja y de red que dirigen un haz policromático a través
29
de una red de transmisión o hacia la superficie de una red de reflexión; esta última
es con mucho la más usual.
Los componentes comunes son:
- Rendija de entrada: la rendija de entrada proporciona una imagen óptica
rectangular.
- Lente colimadora: una lente colimadora o un espejo, producen un haz paralelo
de radiación.
- Prisma: es un dispositivo que se encarga de dispersar la radiación en sus
longitudes de ondas individuales
- Focalizador: un elemento focalizador se encarga de formar de nuevo la imagen
en la rendija de entrada y la enfoca en la superficie plana denominada plano
focal.
- Rendija de salida: Aísla la banda espectral deseada.
2.3.3.5 Celda de absorción
Tienen la función de contener a la disolución estándar o de muestra a la cual se le
va a determinar su absorbancia. Los materiales utilizados para la fabricación de
las celdas deben de ser transparentes en la región del espectro electromagnético
en la que se pretenda utilizar. Para trabajar en la región del ultravioleta (por debajo
de 350 nm) se requiere cuarzo o sílice fundida; cualquiera de estas sustancias
son transparentes en la región del visible y en la región del infrarrojo, hasta
aproximadamente 3µm. Los vidrios de silicatos pueden emplearse en la región
30
entre 350 y 2000 nm. En la región visible también pueden utilizarse los recipientes
plásticos.
2.3.3.6 Detectores de radiación
Sensores que generan una señal eléctrica dependiente de la luz u otra radiación
electromagnética que recibe. Algunos están basados en el efecto fotoeléctrico,
otros en el fotovoltaico, otros en el fotoelectroquímico y otros en la
fotoconductividad.
Célula fotovoltaica: dispositivo simple que se usa para detectar y medir la
radiación de la región visible. Estas consisten en un electrodo plano de cobre o
hierro sobre el que se deposita una capa de material semiconductor como el
selenio.
Fototubos de vacío: Consiste en un cátodo semicilíndrico, y un ánodo de
filamento encerrado herméticamente, en un recipiente trasparente al vacío. La
superficie cóncava del electrodo está cubierta de una capa de material
fotoemisor, que al ser irradiado tiende a emitir electrones. Cuando se aplica un
potencial a través de los electrones, los electrones emitidos fluyen hacia el
ánodo del filamento generando una fotocorriente, que para una intensidad
radiante dada, suele ser la décima parte de la de una célula fotovoltaica.
Tubos fotomultiplicadores: utilizado para medida de potencias radiantes
pequeñas Esta conformado de varias etapas de amplificación dentro del
recubrimiento del tubo, utilizando una serie de ánodos y una emisión
controlada de electrones secundarios.
31
2.3.3.7 Registrador
Los registradores son sistemas de adquisición de datos que pueden tomar una
serie de señales de entradas desde un gran número de fuentes, y realizar ciertas
funciones. Un registrador de datos consiste esencialmente en un multiplexor, un
elemento de muestreo y retención, un convertidor analógico/digital y algún sistema
de registro o manipulación y registro de salida (Agrawal et al., 2002).
Característicos por ser dispositivos electrónicos que, amplificando o no la señal
eléctrica del detector, transforman la señal, por medio de circuitos electrónicos, en
una lectura. Ejemplos típicos son los microamperímetros, amperímetros,
galvanómetros y óhmetros. Cada uno es utilizando según la señal que se genere
en el detector; así, si la señal es una corriente el microamperimetro o el
amperímetro se utilizan como registradores, si es una diferencia de potencial se
utiliza un galvanómetro y si es una resistencia se utiliza un óhmetro.
2.3.3.8 Procesador
Dispositivo que transformará los datos obtenidos en el registrador generalmente
en una gráfica (espectro de absorción, curva de calibración, cromatograma, entre
otras representación de respuestas). El procesador de señal es generalmente un
dispositivo electrónico que amplifica la señal eléctrica del detector. Además, puede
cambiar la señal de corriente continua a corriente alterna o reciproco, cambiar la
fase de la señal y filtrarla para eliminar los componentes no deseados. Además, el
procesador de señal puede utilizarse para llevar a cabo operaciones matemáticas
como diferenciar, integrar o convertir a algoritmo.
32
2.4 Validación de métodos
Para garantizar que un método analítico está generando datos confiables es
necesario validar los parámetros que evalúan la calidad analítica, por ello en la
validación de un método de ensayo se confirma mediante el examen y el
suministro de evidencia objetiva, que se están cumpliendo los requerimientos
particulares para un uso deseado especificado del método y es el establecimiento
de la evidencia documental de que un procedimiento analítico conducirá, con un
alto grado de seguridad, a la obtención de resultados precisos y exactos, dentro
de las especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos
(Aguirre et al., 2006) .
Importancia de validación de métodos analíticos
Los objetivos primordiales de una validación es establecer un método y confirmar
su desempeño por medio de tratamientos estadísticos y apreciaciones cualitativas
por parte del laboratorio en general. De ahí radica la importancia de una adecuada
validación, ya que establece bajo qué circunstancias debe realizarse un análisis
asegurando que los datos obtenidos cumplen en la totalidad la calidad deseada
brindando seguridad y respaldo. Además, proporciona criterios para el rechazo o
re análisis de lecturas anómalas (NTC/ISO/IEC 17025, 2017).
Necesidad de la validación de un método analítico
Millones de mediciones analíticas se realizan diariamente en miles de laboratorio
alrededor del mundo. Hay innumerables razones para realizar esas mediciones,
por ejemplo: Como una forma de evaluar bienes para propósito de comercio; como
33
apoyo a la salud; para verificar la calidad del agua para consumo humano; el
análisis de la composición elemental de una aleación para confirmar su
conveniencia en la construcción de aeronaves; en análisis forenses de fluidos
corporales en investigaciones criminales, análisis de alimentos para control de
calidad. Virtualmente cada aspecto de la sociedad está apoyado de algún modo
por mediciones analíticas (Eurachem, 2010).
Entre los parámetros estadísticos que garantizan la calidad analítica de un método
se encuentran:
2.4.1 Límite de detección del método
Concentración de analito que, cuando se procesa a través del método completo,
produce una lectura con una probabilidad del 99% de ser diferente del blanco.
Para determinar el LDM se añade el analito al agua grado reactivo o a la matriz de
interés para obtener una concentración (CEb) próxima al LDM estimado; se
analizan diez o siete partes de esta solución y se calcula la desviación estándar; a
partir de una tabla de distribución de t, se selecciona el valor de t para n-1 grados
de libertad y un nivel de confianza del 95% (Thompson et al., 2010).
𝐿𝑀𝐷 = 𝐶𝐸𝑏 + 𝑡𝑛−1 × 𝑆 (22)
Dónde: t: es una t de Student para un nivel de confianza del 99% con n-1 grados
de libertad, n: es el número de réplicas, S: es la desviación estándar en el análisis
de las réplicas., CEb: concentración próxima al LDM estimado.
34
2.4.2. Precisión
Es el grado de concordancia entre los resultados independientes de un ensayo
obtenido bajo condiciones estipuladas. Esta se puede medir como repetibilidad y
reproducibilidad (Miller y Miller, 2002; IDEAM, 2009).
- Repetibilidad: Precisión obtenida bajo las mismas condiciones de operación en
un intervalo corto de tiempo (mismo día), por un mismo analista, en la misma
muestra homogénea y en el mismo equipo.
- Reproducibilidad: Expresa la precisión entre laboratorios (distintas condiciones)
como resultado de estudios inter- laboratoriales diseñados para estandarizar la
metodología.
La precisión se evalúa con la desviación estándar (s) y con el coeficiente de
variación (CV).
𝑆 = √∑ (𝑥𝑖 − �̅�)2𝑖
𝑖=1
𝑛 − 1 (23) 𝐶𝑉 =
𝑆 × 100
�̅� (24)
Dónde: n = número de medidas, X =Valor promedio de las medidas, Xi =Valor de
la i-ésima medida
2.4.3 Exactitud
Grado de concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia o
valor “Verdadero” aceptado. Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado,
35
sea como un valor convencional verdadero (material de referencia interno de la
firma), sea como un valor de referencia aceptado (material de referencia
certificado o estándar de una farmacopea) y el valor encontrado (valor promedio)
obtenido al aplicar el procedimiento de análisis un cierto número de veces
(IDEAM, 2009).
La exactitud puede medirse como error relativo y como porcentaje de
recuperación.
Error relativo:
%𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = 𝑋𝑒𝑥𝑝 − 𝑋𝑟𝑒𝑎𝑙
𝑋𝑟𝑒𝑎𝑙 × 100 (25)
Dónde: Xexp = valor de referencia, Xreal = valor experimental encontrado.
% Recuperación:
%𝑅𝑀 = 𝐶𝑀𝐴 − 𝐶𝑀
𝐶𝐴 × 100 (26)
Dónde: CM=concentración promedio de la muestra no adicionada, CMA= medida
de la concentración en la muestra adicionada, y CA= concentración conocida
adicionada a la muestra.
El porcentaje de recuperación puede variar con el nivel de concentración en el
intervalo lineal de respuesta, por esto se debe evaluar este parámetro a distintas
concentraciones.
36
2.4.4 Incertidumbre
La incertidumbre de una medición es un parámetro asociado con el resultado de
una medida, que caracteriza la dispersión de los valores que pueden ser
razonablemente atribuidos al mensurando. El proceso de estimación de la
incertidumbre de medición involucra los siguientes pasos: especificar el
mensurando, identificar las fuentes de incertidumbre, cuantificar los componentes
de la incertidumbre y calcular la incertidumbre combinada (CENAM, 2009;
Eurachem, 2010).
En la estimación de la incertidumbre global de un método puede ser necesario
tratar por separado cada fuente de incertidumbre para obtener su contribución al
total, denominada componente de incertidumbre o incertidumbre estándar cuando
se expresa como una desviación estándar. Para la mayoría de los propósitos se
utiliza la incertidumbre expandida, U, que es un intervalo en el cual se espera
encontrar el valor del mensurando con un nivel de confianza de referencia.
Para la identificación de las fuentes de incertidumbre se elabora una lista de las
fuentes relevantes de incertidumbre, partiendo de la expresión básica de cálculo
del mensurando. Todos los parámetros de esta expresión pueden ser fuentes
potenciales de incertidumbre y además pueden haber otros parámetros que no
aparecen explícitos en la ecuación pero que afectan el mensurando, incluso
surgidos de suposiciones químicas.
37
Una vez elaborada la lista de fuentes, sus efectos sobre el resultado se
representan mediante una ecuación que corresponde al modelo del proceso de
medición en términos de todos los factores individuales.
Para identificar posibles fuentes de incertidumbre en los procedimientos analíticos
se divide el proceso en pasos genéricos y se identifican en cada uno los factores a
considerar, como pueden ser: efectos instrumentales, pureza de reactivos,
estequiometria, condiciones de medición, efectos de cálculo, efectos de operador,
efectos aleatorios.
Para ayudar en la identificación de las fuentes de incertidumbre se debe elaborar
un diagrama de causa-efecto (diagrama de Ishikawa o de espina de pescado), que
ayuda a evidenciar la relación entre fuentes de incertidumbre, identificar su
influencia en el resultado.
2.4.4.1 Componentes de la incertidumbre
La cuantificación se puede hacer por alguna de las siguientes vías, o más
usualmente por su combinación: evaluación de la incertidumbre generada por
cada fuente individual, o determinación directa de la contribución combinada a la
incertidumbre de algunas o todas las fuentes mediante los datos de rendimiento
del método.
Para convertir cada componente de la incertidumbre a su respectiva incertidumbre
estándar, u(x), se emplean los siguientes criterios para seleccionar el tipo de
función de distribución que presenta el componente en cuestión (Tabla 1).
38
Tabla 1. Criterios para seleccionar el tipo de función de distribución
Distribución Significado Se utiliza cuando: Incertidumbre
Rectangular
cada valor en el intervalo
tiene la misma probabilidad
de suceder
Un certificado u otra especificación
establece límites (a) sin
especificar un nivel de confianza, o
cuando se hace un estimado en la
forma de un intervalo (a) sin
conocimiento del tipo de
distribución.
273
au(x)
Triangular
la probabilidad de
ocurrencia es mayor para
valores en el centro del
intervalo y menor hacia los
límites
Los valores cercanos a x son más
frecuentes que los cercanos a los
límites (a), o cuando se hace una
estimación en la forma de un
intervalo (a) descrito por una
distribución simétrica.
286
au(x)
Normal
los datos varían
aleatoriamente con
distribución normal de
probabilidad
Se obtiene un estimado por
observaciones repetidas.
29su(x)
Se reporta una incertidumbre
como desviación estándar,
desviación estándar relativa o
coeficiente de variación, sin que se
especifique la distribución.
30su(x)
31)/( xsxu(x)
32100/CVxu(x)
Se reporta una incertidumbre en la
forma de un intervalo de confianza
(c), sin que se especifique la
distribución.
333 2/ ócu(x)
para 95 ó 99,7%
39
A continuación se indica la forma de cuantificar fuentes individuales de
incertidumbre aportadas por procesos de análisis y su manera de combinar los
factores para calcular la incertidumbre estándar de cada fuente.
Medición de masa (o peso)
Aplica para el pesaje de reactivos estándares usados en el método, que
generalmente se hace por diferencia entre el peso bruto y el peso del recipiente en
el cual se pesa el reactivo; en cada pesaje los factores a considerar, tanto en la
tara como en el peso bruto, son:
Incertidumbre en la calibración de la balanza, que generalmente recomienda
considerar una distribución rectangular para convertirla a incertidumbre estándar:
𝑢(𝑚𝐿) = 𝑎𝐿
√3 (34)
Resolución de la escala de la balanza.
Variación entre lecturas (repetibilidad). Se estima a partir de la desviación
estándar de ensayos de repetibilidad que pueden ser una serie de diez pesajes:
𝑢(𝑚𝑟) = 𝑆𝑒𝑛𝑠𝑎𝑦𝑜𝑠 (35)
Desplazamiento diario, expresado como la desviación estándar de los valores de
verificación diaria de la balanza a largo plazo.
Efectos de densidad en base convencional, causados por el efecto de
desplazamiento del aire, generalmente no se consideran debido a que todos los
40
resultados de pesaje están dados para peso en el aire y su efecto es
insignificante.
Efectos de densidad en base vacío, similar a los anteriores.
Como generalmente la pesada de reactivos se hace por diferencia, la contribución
se debe contar dos veces, una por cada pesada. Las contribuciones más
significativas se combinan para dar la incertidumbre estándar u(m) de la masa m,
como la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de cada contribución.
𝑢(𝑉) = √2 × (𝑢(𝑚𝐿)2 + 𝑢(𝑚𝑟)2 + ⋯ ) (36)
Medición de volumen
Está sujeta a tres fuentes principales de incertidumbre:
- Calibración del volumen interno certificado del material.
La diferencia entre la temperatura de preparación de la solución y la temperatura a
la que fue calibrado el material; la incertidumbre estándar se calcula asumiendo
una distribución rectangular para la variación de temperatura:
𝑢(𝑉𝑇) = 𝑉𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 × 𝑎𝑇 × 2,1 × 10−4
√3 (37)
- Variación en el llenado del material hasta el aforo (repetibilidad entre
lecturas).
𝑢(𝑉𝑟) = 𝑆𝑒𝑛𝑠𝑎𝑦𝑜𝑠 (38)
41
Las tres contribuciones se combinan para dar la incertidumbre estándar u(V) del
volumen V, como la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de cada
contribución:
𝑢(𝑉) = √𝑢(𝑉𝑐)2 + 𝑢(𝑉𝑇)2 + 𝑢(𝑉𝑟)2 (39)
- Si la temperatura promedio del laboratorio, difiere significativamente de la
temperatura de calibración del material volumétrico, usualmente 20ºC, se
debe corregir el volumen realmente medido, a partir del volumen calibrado.
Preparación de estándares
En la preparación de estándares o material de referencia se consideran como
fuentes de incertidumbre las siguientes, que generalmente se cuantifican por
separado:
La pureza del reactivo patrón, para calcular la incertidumbre estándar u(P) se
asume una distribución rectangular:
𝑢(𝑃) = 𝑎𝑃
√3 (40)
Concentración de MRC (material de referencia certificado), reportada por el
fabricante en el certificado, usualmente con límites que deben considerarse como
una distribución rectangular para calcular la incertidumbre estándar.
Concentración por diluciones del material de referencia.
La masa molar del patrón.
42
2.4.4.1.1 Incertidumbre combinada
La cuantificación de los componentes de la incertidumbre consiste de un número
de contribuciones a la incertidumbre global, ya sean asociadas con fuentes
individuales o con los efectos combinados de varias fuentes. Estas contribuciones
se expresan como desviaciones estándar y se combinan de acuerdo con las
reglas apropiadas, para dar una incertidumbre estándar combinada. Finalmente,
se aplica el factor de cobertura apropiado para obtener una incertidumbre
expandida.
Incertidumbre estándar combinada
La relación general entre la incertidumbre estándar combinada uC(y) de un valor y
y la incertidumbre de los parámetros independientes xn de los cuales depende
(y(xn)) es llamada la ley de propagación de incertidumbre:
𝑢𝐶(𝑦(𝑥𝑛)) = √∑ 𝐶𝑖2𝑢(𝑥𝑖)2
𝑛
1
= √∑ 𝑢(𝑦, 𝑥𝑖)2
𝑛
1
(41)
Dónde:
ci es el coeficiente de sensibilidad
u(y,xi) es la incertidumbre en y debida a la incertidumbre en xi.
Incertidumbre expandida
La incertidumbre expandida U(CX) se obtiene multiplicando la incertidumbre
estándar combinada por un factor de cobertura k, dependiente de los grados de
43
libertad, para obtener un intervalo en el cual se abarque una gran cantidad de la
distribución de valores que puedan ser razonablemente atribuidos al mensurando;
para la mayoría de los casos se utiliza k=2 que equivale a un nivel de confianza de
95%:
𝑈𝑐 = 2𝑢𝑐(𝐶𝑥)
𝐶𝑥 (42)
Sin embargo, si la incertidumbre combinada se basa en observaciones
estadísticas con pocos grados de libertad (menos de seis), se debe seleccionar el
valor de k de acuerdo con los grados de libertad de una tabla t de Student de dos
colas para el nivel de confianza requerido.
2.5 Ácido Ascórbico
Una ingesta de ácido ascórbico o vitamina C es necesaria dado que es requerida
diariamente por el hecho de no poder ser sintetizada endógenamente por el
organismo humano y es vital para la respiración celular, para la función
enzimática, por ser un componente en la formación de colágeno y últimamente se
ha descubierto una participación importante de dicha vitamina en el proceso de
absorción de hierro en el cuerpo (Borah et al., 2019; Chen et al., 2019).
Lo anterior, sumado al hecho de ser la única vitamina que ayuda a la prevención y
cura del escorbuto, razón por la cual fue introducida a las necesidades diarias de
la población ya que se comprobó que solo 10 mg de ésta son necesarios para
44
curar el escorbuto y 60 mg diarios ayudan a prevenirlo (Frajese et al., 2016;
Pisoschi et al., 2014).
Si bien es cierto, existen mil fuentes de vitamina C en la naturaleza, también debe
enfrentarse la realidad que hoy en día, las personas enfrentamos una cotidiana
lucha contra el tiempo y se lleva una vida tan agitada que a muchos los obliga a
volverse prácticos incluso en lo que a dieta y nutrición se refiere, al punto de optar
por alimentos envasados y pre-elaborados o de “fácil preparación”, colocando en
un gran riesgo su salud (Chambial et al., 2013).
Esta misma razón hace que los productores de alimentos opten por elaborar
productos “enriquecidos” con algunas de las sustancias más necesarias para el
consumidor. Sin embargo no solo por el hecho de rotular un alimento que está
“enriquecido” debe confiarse en él. Además, considerando la degradación del
ácido ascórbico durante el almacenamiento y el calentamiento, es necesario
comprobar dicho enriquecimiento o concentración y determinar si realmente el
producto contiene lo que el productor le rotula (Ismail et al., 2014; Topcu y
Karatas, 2017).
45
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo General
Evaluar un sistema microanalítico de valoración culombiofotocolorimétrica de
instrumentación de bajo costo para la determinación de ácido ascórbico en
muestras de bebidas artificiales.
3.1.1. Objetivos Específicos
Construir con materiales de bajo costo y fácil acceso un sistema de titulación
microculombiométrica.
Acoplar a la microcelda de valoración culombimétrica un sistema de monitoreo
microfotocolorimétrico de bajo costo con captura de datos digital en tiempo
real.
Determinar parámetros de validación analítica: precisión, exactitud, límite de
detección, rango lineal e incertidumbre como efecto de contraste con el método
a escala convencional de valoración para la determinación de ácido ascórbico
en jugos artificiales.
46
4. METODOLOGÍA
4.1 Diseño y construcción de equipos
En esta etapa de proceso experimental fue considerado los criterios del análisis y
diseño instrumental para el análisis coulombiométricos y fotocolorimétricos
descrito por reportes en libros y artículos científicos (Harris et al., 2001; Skoog et
al., 2005; Martínez y Baeza, 2004; Marín et al., 2014). El material utilizado para la
construcción del sistema de mínima instrumentación propuesto presento la
característica de bajo costo y fácil accesibilidad.
4.1.1 Sistema de valoración microculombiométrica
El diseño del prototipo de valoración microcoulombiométrica se realizó siguiendo
el esquema de la instrumentación coulombimétrica convencional, utilizado para
valoraciones redox con detección del tiempo de viraje visual ó cronométrico (Harris
et al., 2001; Skoog et al., 2005; Marín et al., 2014). La figura 1 muestra el sistema
microcoulombiométrico; el cual constó con dos electrodos de acero conectados a
una fuente de potencial (cargador regulable 1,5 – 12 voltios) e introducidos en un
recipiente plástico trasparente (microcelda: tapa plástica) de capacidad 5,0 mL,
con agitación constante (50 RPM) de la muestra mediante un microagitador. El
tiempo de respuesta en función del cambio de viraje visual fue determinado
utilizando un cronometro.
47
Figura 1. Sistema microanalitico de valoración coulombifotocolorimétrico
4.1.2 Microfotocolorímetro
El prototipo en línea para monitoreo en tiempo real de datos digital de la valoración
microcoulombiométrica fue realizado considerando el esquema lineal de la
instrumentación óptica: fuente de radiación, sistema dispersivo, celda de
absorción, fotodetector y registrador (Harris et al., 2001; Skoog et al., 2005;
Martínez y Baeza, 2004).
Se colocó los componentes dentro de la microcelda coulombiométrica de color
negro en su totalidad para evitar filtraciones de luz parásita (Figura 1). Entre ellos,
bombilla LED como fuente lumínica o radiación, alineado a una celda fotorresistiva
o fotoreceptor. La respuesta del fotodetector a la luz emergente no absorbida
durante el proceso de microelectrólisis fue registrada en unidades de resistencia
(ohmios) mediante utilización de un multímetro con posterior transformación en
unidades de absorbancia. Además, se realizó registro del tiempo de equilibrio de
reacción para alcanzar la máxima absorbancia, utilizando cronometro y registro
48
mediante video para posterior análisis de regresión lineal de concentración vs
tiempo de viraje.
4.2 Parámetros de validación del método
Para efecto de contraste con el método empleado a escala convencional de
titulación para la cuantificación de ácido ascórbico y confiabilidad de los resultados
se realizó la determinación de los parámetros de control de calidad analítica y que
hacen parte de los procesos de validación de métodos: precisión, exactitud, límite
de detección, rango lineal e incertidumbre. Lo anterior se realizó acorde a los
criterios de validación de métodos analíticos propuestos por Eurachem (2010).
4.2.1 Rango lineal
Para verificar la linealidad del método se realizó gráfica de la respuesta de
medición (tiempo) contra la concentración del mesurando; utilizando siete (7)
estándares (0,0005 – 0,3 M; n = 3) que se prepararon considerando la relación de
respuesta mínima de un estándar de muy baja concentración y/o la concentración
en muestras de jugos artificiales como punto de referencia para evaluar un rango
de trabajo del método. Al obtener rango lineal (0,001 – 0,01 M) se realizó análisis
de regresión lineal para obtener ecuación de recta y/o curva de calibrados para
posterior cuantificación.
4.2.2 Precisión
Fue evaluada como el coeficiente de variación de las determinaciones por
triplicado en estándares y muestras para cada nivel de concentración; durante un
49
tiempo de procesos de análisis de tres días. Estándares evaluados: 0,003M y
0,008M; Jugo comercial: 40%VD = 0,002M.
4.2.3 Exactitud
Se determinó como porcentaje de error relativo (%E) en análisis de estándares de
concentración conocida y porcentaje de recuperación (%R) en muestras
fortificadas; durante un tiempo de procesos de análisis de tres días. Estándares
evaluados + adicionados: 0,003M y 0,008M.
4.2.4 Límite de detección
Para la determinación de este parámetro se prepararon siete estándares de
concentración de 0,0007 M. Lo anterior fue realizado debido a que la lectura de
blancos de método presenta respuesta de tiempo altas producto de coloración no
acorde al cambio de viraje del indicador (almidón).
4.2.5 Incertidumbre
Para la cuantificación de la incertidumbre del método se evaluaron diferentes
variables como: peso de los reactivos, alícuotas de análisis de muestras y
estándares, reproducibilidad, equipos de lectura y expresión básica de cálculo del
mensurando; las cuales se resumen en el diagrama causa-efecto (figura 2).
50
Figura 2. Diagrama causa – efecto para sistema microcoulombiofotocolorimétrico 4.3 Análisis de estándares y muestras
4.3.1 Análisis microcoulombiofotométrico
Para la implementación del sistema de valoración microcolumbiofotocolométrico
se realizó la determinación de ácido ascórbico en muestras de jugos artificiales
procedentes de la compra en supermercados de cadena y estándares de
concentración conocida preparados a partir de una solución madre de ácido
ascórbico; basado en la electrogeneración de yodo, en medio yodurado, utilizando
un pulso de corriente constante entre dos electrodos.
Para cada análisis de estándar y/o muestra en la microcelda columbiométrica se
adicionó 4,0 mL de agua destilada, un exceso de KNO3 como electrolito soporte
inerte y KI utilizado para electrogeneración de yodo, CH3COOH concentrado como
medio ácido (pH = 5,0), 100 µL de muestra e indicador almidón para visualización
del equilibrio de reacción. Bajo microagitación magnética los electrodos se
conectaron a la fuente de potencial (1,5 – 12 V). En el momento de conectar los
51
electrodos se registró la respuesta tiempo de viraje del indicador con monitoreo
visual y microfotocolorimétrico en línea acoplado a un dispositivo de video
(celular). Para todos los análisis se realizará por triplicado.
4.3.2 Análisis volumétrico
Como punto de comparación de metodología analítica se realizaró la
determinación de ácido ascórbico en muestras de jugos artificiales mediante el
método de valoración yodimétrica generalmente considerado el más convencional.
Basado en la oxidación de ácido ascórbico en presencia de yodo, el cual convierte
en ácido deshidroascórbico, con valoración de exceso de yodo con una disolución
de tiosulfato de sodio de concentración conocida utilizando como indicador
almidón.
Para el análisis se trabajaró con un volumen de muestra de 10 mL, adicionar, 1mL
de solución estándar de yodato de potasio 0,1N, cristales de yoduro de potasio, 2
gotas de indicador almidón. Homogenizar la muestra mediante agitación antes de
iniciar la titulación con tiosulfato de sodio 0,1N hasta un punto final incoloro ó color
inicial de la muestra (Ismail et al., 2014).
4.4 Análisis estadístico
Para optimizar las condiciones del proceso de análisis, considerando la variable de
respuesta tiempo de viraje se utilizó un diseño factorial 32 (Tabla 3) asociado a un
análisis estadístico de superficie de respuesta (MSR) para evaluar los efectos
simples y combinados de los parámetros independientes de [KNO3] y [KI],
52
considerados los factores que determinan el proceso de electrogeneración del
valorante in situ. Los factores se codificaron como (-1) que representan los niveles
inferiores, (0) que indican puntos centrales y (+1) que muestran los niveles
superiores, acorde a los niveles indicados la tabla 2.
Los resultados para cada muestra se calcularán como la media ± la desviación
estándar de las determinaciones por triplicado. Se realizó prueba de t-student para
evaluar si existe diferencia significativa entre las concentraciones promedio de
ácido ascórbico que se determinó por las técnicas microanalíticas y convencional
de volumetría. El análisis estadístico se realizará con el software estadístico SPSS
v23.0.0.0. con el criterio de significancia para todos pruebas estadísticas de
p<0.05.
Tabla 2. Rango de factores independientes y sus niveles
Variable Factores Niveles
Xi -1 0 1
[KNO3] = M X1 0,1 0,3 0,6
[KI] = M X2 0,1 0,3 0,6
Tabla 3. Matriz diseño factorial 32 – análisis de superficie de respuesta (MRS)
Ensayo [KNO3] [KI] 0,002 M
1 0 -1 0,00206
2 0 1 0,00104
3 0 0 0,00191
4 -1 -1 0,00224
5 1 -1 0,00206
6 -1 0 0,00152
7 1 0 0,00188
8 1 1 0,00112
9 -1 1 0,00094
53
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
5.1. Optimización de las condiciones de operación
En los métodos coulombimétricos se determina la cantidad de carga eléctrica
(electrones) necesaria para modificar cuantitativamente el estado de oxidación del
analito en función del tiempo para una disolución que se encuentra bajo agitación
constante; determinando el tiempo desde el inicio del experimento hasta finalizar
el proceso de electrólisis; donde posterior con la aplicación de la ecuación de
faraday se determina la cantidad de analito electrolizado (Harris et al., 2001;
Skoog et al., 2001, 2005, 2008).
Basado en este principio se propuso un sistema microanalítico de valoración
culombiofotocolorimétrica de instrumentación de bajo costo para la determinación
de ácido ascórbico en muestras de jugos artificiales como se indicó en la figura 1,
con aplicación de corriente constante entre dos electrodos de acero y debido a los
efectos de la polarización por concentración para mantener la eficiencia de
corriente del 100% con respecto al analito, resultó necesaria la presencia de un
gran exceso de reactivo auxiliar que sea oxidado en el electrodo anódico para dar
un producto que reaccione con el analito (Harris et al., 2001).
En este caso exceso de yoduro, producto de la reacción de electrooxidación
anódica en el tiempo de electrólisis (Ec 43), seguido de la formación de yodo-
yodurado especie soluble (Ec 44) que durante la reacción de valoración permite el
mecanismo completo del electroanálisis (Ec 45), utilizando ácido acético
concentrado como amortiguador in situ del pH para generar el par conjugado
54
acético/acetato necesario para neutralizar los iones hidroxilo producto de la
reducción del agua y con la finalidad de no separar los electrodos con puente
salino y/o membranas, evitando la contaminación cruzada entre las semiceldas
(Baeza et al., 2004; Marin et al., 2014) y promoviendo la reacción de monitoreo
visual o fotocolorimetrico del final de la valoración (Ec 46); empleando agitación
constante para evitar que la trasferencia de masa límite los procesos y KNO3 para
una corriente de electrólisis farádica constante e impedir que se presente una
caída de potencial óhmica (Gómez et al., 2002); alcanzando el punto de
equivalente, donde la electrolisis se detiene y la cantidad de analito se determina a
partir del tiempo requerido para completar la valoración, el cual es directamente
proporcional a la cantidad inicial de analito acorde con la ecuación de Faraday y
mediante un ajuste de modelo de regresión lineal como lo reporta Olvera et al.
(2018) conduce a una línea recta con una pendiente igual a (nF/i).
2 I- I2 (s) + 2 e- (43)
I2 (s) + I- I3
- (44)
C6H8O6 C6H6O6 + 2H+ + 2e- (45)
I3- (exceso) + almidón complejo azul (46)
Considerando lo anterior, las condiciones óptimas de operación se establecieron
acorde a los siguientes criterios: a) implementación del equipo propuesto de forma
portátil a potencial constante de 9 Voltios, considerado como referencia de
potencial para promover mayor versatilidad de aplicación técnica y relación de
costos al poder trabajar con una batería (9,0 V) de fácil adquisición comercial. b)
55
evaluando los efectos simples y combinados de los factores independientes
[KNO3] y [KI] sobre la variable respuesta a potencial constante acorde a los
resultados experimentales indicados en la tabla 3; donde mediante el análisis
estadístico de MRS se generó un modelo de regresión de segundo orden (Ec 47),
con coeficiente de determinación (r2) de 0,927, explicando el 92,7 % de la
variación de los resultados a través de variables independientes y cumpliendo con
los criterios estadísticos establecidos por Montgomery (2000) al ser superior a
75%; indicando la posibilidad de continuar con la metodología.
Molaridad = 0,00217 + 0,00039*KI – 0,00038*KNO3 – 0,00483*(KI)2 +
0,00171*KI*KNO3 + 0,00092*(KNO3)2 (47)
No obstante, para probar la significancia estadística de los efectos en función del
modelo matemático, se realizó un análisis de varianza (Tabla 4); demostrando que
el término lineal A=[KI] es el único factor estadísticamente significativo (p<0,05) y
con influencia negativa (inversamente proporcional) sobre la variable respuesta
como se muestra en el diagrama de pareto (figura 3).
Tabla 4. Análisis de varianza para evaluación de los efectos simples y combinados de la [KI] y
[KNO3].
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio F P
A:KI 1,723 x 10-6
1 1,723 x 10-6
67,07 0,0038
B:KNO3 2,160 x 10-8
1 2,160 x 10-8
0,84 0,4268
AA 7,476 x 10-8
1 7,476 x 10-8
2,91 0,1866
AB 2,965 x 10-8
1 2,965 x 10-8
1,15 0,3614
BB 6,043 x 10-9
1 6,043 x 10-9
0,24 0,6609
Error total 7,706 x 10-8
3 2,569 x 10-8
Total (corr.) 1,978 x 10-6
8
56
Figura 3. Diagrama de Pareto - sistema coulombiofotocolorimétrico.
Finalmente, se observa que las condiciones óptimas de operación mediante MRS
(Tabla 5) evaluadas en forma experimental no presentan diferencia
estadísticamente significativa respecto a los resultados con los factores óptimos
indicados por el modelo, lo que confirma la optimización de los parámetros del
proceso y demostrando ser una alternativa viable desde el punto de vista técnico y
económico respecto a otros equipos de innovación tecnológica, al presentar un
costo instrumental de $ 549.500 (Tabla 6). Aunque este resultado ilustra la
viabilidad económica, sus costos pueden disminuir al implementar sistemas de
registros digitales con interfaz a dispositivos electrónicos, por ejemplo tablet.
Tabla 5. Condiciones óptimas de operación sistema coulombifotocolorimétrico a potencial de 9V.
Parámetros Valor optimo Valor experimental
[A.A]* 0,0021M a 0,00206M
a
[KI] 0,1 M 0,1 M
[KNO3] 0,3 M 0,3 M
* A. A: ácido ascórbico
57
Tabla 6. Costo instrumental sistema microcoulombifotocolorimétrico
Elementos Valor ($)
Texter 10000
Microagitor 5000
Batería (9V) 6000
Cargador regulable 1.5 - 12 V 20000
Regulador de voltaje 2000
Cableado 2000
Celular 500000
Electrodos 500
Led 500
Fotoresistencia 1000
Celda 2000
Total 549500
5.2. Validación del método
La figura 4a muestra la curva de calibración para la determinación de ácido
ascórbico con aplicación independiente de microculombiometría con detección
visual y el acople microfotocolorimetrico para la determinación del tiempo de viraje,
aplicando un potencial de 9 V.
a)
b)
Figura 4. a) Curvas de calibración, detección visual detección microfotocolorimetrica para n = 3, b)
grafico de residuos detección sistema microcoulombiofotocolorimétrico
0.000 0.003 0.006 0.009 0.0120
20
40
60
80
100
Y = 8281.4X + 1.507; r2 = 0.9955
Y = 8353.1X + 4.552; r2 = 0.9986
Visual
Fotocolorimetrico
Tie
mp
o (
s)
Molaridad
58
Los resultados indican que no existe diferencia estadísticamente significativa (p >
0,05) para los diferentes tiempos de respuesta y variables de la ecuación de recta
para cada curva de calibrado. Se observa alta correlación de datos en función del
coeficiente de determinación (r2), con mejores resultados de linealidad y
sensibilidad para el acople coulombiometría y detección fotocolorimétrica;
corroborado con el análisis estadístico ANOVA (Tabla 7); donde p - valor es
inferior al nivel de significancia (α = 0,05), demostrando una relación
estadísticamente significativa entre el tiempo vs concentración que explica el
99,86% de la variabilidad de los datos, acorde al modelo matemático con
coeficiente de determinación (r2 = 0,9986) y confirmado mediante el análisis de
residuos que no muestran una tendencia definida (figura 4b), indicando la
linealidad de la curva en el rango de concentraciones, con una alta sensibilidad
conforme al valor de la pendiente en la ecuación de recta (8353,1), lo que
manifiesta una alta variación de la concentración con cambios en la respuesta
tiempo.
Tabla 7. Análisis de varianza (Anova) para modelo de regresión lineal sistema acople
coulombimetría – fotocolorimetría.
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Modelo 11149,3 1 11149,3 6721,4 0,0000
Residuo 21,6 13 1,7
Total (Corr.) 11170,9 14
Error absoluto (s) = 1,13
Lo anterior, indica la validez de la ecuación de faraday para el análisis
culombiométrico en la determinación de la masa electrolizada de ácido ascórbico
59
asociada a la reacción electroquímica; corroborando que la dosificación
electroanalítica del valorante es constante bajo una intensidad de corriente
constante impuesta; donde el tiempo necesario para completar la reacción es una
medida directa del número de electrones (Asakai et al., 2004; Marin et al., 2014).
No obstante, aunque no se presenta diferencia estadísticamente significativa entre
las diferentes técnicas, la detección instrumental corresponde a la mejor opción
debido a la sensibilidad y versatilidad de la precisión en la obtención de la
respuesta al registrar mediante video el tiempo de viraje del indicador en
condiciones de agitación constante relacionado a la lectura de resistencia y/o
absorbancia.
Sin embargo, los procesos de innovación y desarrollo asociados a los de mejora
continua y calidad, repercuten en los procedimientos analíticos siendo cada vez
son más estrictos en el control de calidad analítica, por lo cual para mejorar aún
más la precisión y exactitud de los resultados lo ideal o complemento instrumental
corresponde a un monitoreo en tiempo real sin utilización de cronómetros con
equipos de videos, donde se pueda emplear un medidor eléctrico de tiempos,
accionado por la propia corriente del dispositivo como se realiza en los equipos de
innovación tecnológica actual para el análisis culombiometrico, amperométrico,
potenciométrico y polarografico.
El registro del punto final de valoración aplicando microfotocolorimetría se realiza
mediante lectura de la resistencia (ohmios) cuando se presenta un cambio de
viraje del indicador asociado a un tiempo de atenuación de la luz por el
fotodetector; la cual se puede transformar en unidades de absorbancia mediante la
60
ecuación (Ec14). Lo anterior, permitió conocer que independiente de la
concentración y potencial aplicado la respuesta (absorbancia) al final del proceso
de electrolisis asociada al viraje del indicador (almidón) presentan resultados
similares de absorbancia, aun considerando variaciones de potencial donde el
efecto se presenta con una disminución en el tiempo de electrolisis (figura 5).
Figura 5. Efecto de la concentración y voltaje en la respuesta
En consecuencia, para la determinación del rango lineal y límite de detección el
tiempo de electrolisis asociado al potencial y la concentración juegan un papel
importante. En el caso del límite de detección se consideró evaluar un estándar de
0,0007 M a un potencial de 9V (Tabla 8) para garantizar la determinación de la
cantidad o concentración mínima de sustancia que puede ser detectada con
fiabilidad por el método analítico ya que para este nivel de concentración el
registro del tiempo de electrolisis promedio de 9 segundos fue con mayor
eficiencia respecto a otros niveles de concentración más bajos donde la respuesta
0.000 0.003 0.006 0.009 0.0120
20
40
60
80
100
120
Aborbancia = 0.088 ± 0.004
Y = 8353.1X + 4.552; r2 = 0.9986
Y = 6220.2X + 3.693; r2 = 0.9972
9 V
12 V
Tie
mp
o (
s)
Molaridad)
61
del tiempo de electrolisis presento resultados iguales o muy similares. Cabe
resaltar, el análisis del blanco difiere en forma significativa de los resultados
esperados producto de la coloración innata del sistema al adicionar KI, por lo cual
no fue utilizado para la evaluación del límite de detección del método.
El rango lineal se ajusto entre las concentraciones 0,001 a 0,01 M, donde para
concentraciones menores ó superiores a este rango se presenta desviación de la
linealidad (figura 6). Además, el ajuste de potencial a 9 V representa una
respuesta de tiempo con resultados superiores a la aplicación de potenciales
superiores.
Tabla 8. Límite de detección sistema microcoulombiométrico con detección visual y
fotocolorimétrico.
Parámetro Fotocolorimetría Visual
0,001M 0,0007M 0,001M 0,0007M
Promedio 0,00089 0,00056 0,00085 0,00048
S 0,00004 0,00008 0,00004 0,00004
% CV 3,98 13,82 4,56 7,341
LDM 0,0010 0,00079 0,00096 0,00059
%E 3,5 12,5 3,8 15,9
62
Figura 6. Rango lineal sistema microcoulombiofotocolorimétrico.
Para evaluar el efecto de la matriz sobre la exactitud del análisis, se realizó una
prueba de recuperación, expresada en términos de porcentaje (Tabla 9).
Tabla 9. Parámetros de control de calidad analítica - validación de métodos.
Método
% E / (%CV) %R / (%CV) Incer**
(x10-4
) 0,003 M 0,008 M J*+0,003 M J+0,008 M
Volumetría a 2,4±0,5/(0.8) 1,8±0,4/(0.5) - - -
Coulombiometría a 4,3±2,4/(2.3) 3,1±2,5/(2.5) 97,0±0,98/(1.0) 97,9±1,19/(1.2) 2,6
Coulombiofotocolometría a 1,5±1,1/(1.2) 1,7±1,5/(2.2) 97,6±0,53/(0.5) 98,6±0,32/(0.3) 2,0
* [Bebida comercial]= 40%VD = 0.002M, ** Incertidumbre expandida promedio, a
no indica diferencia
estadísticamente significativa
El acople micro coulombiometría - fotocolorimetría mostró mejores resultados de
precisión y exactitud para el análisis de un estándar y muestra de jugo comercial
de concentración conocida, indicando menor desviación de los resultados (%CV),
0.00 0.02 0.040
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0.000 0.004 0.008 0.0120
20
40
60
80
Y = 6461.3X + 1.867; r2 = 0.9947
0.0005 - 0.01
0.000 0.004 0.008 0.0120
20
40
60
80
Y = 6220.2X + 3.693; r2 = 0.9975
0.001 -0.01
0.0005 - 0.03
Tie
mp
o (
s)
Molaridad
63
porcentaje de error (%E) < 5% y porcentajes de recuperación (%R) cercanos al
100%; cumpliendo con los criterios de aceptación establecidos por AOAC entre 80
– 100% y demostrando que no existen perdidas significativa de analito (< 80%) y
efectos de matriz (> 110%).
Además, no se presenta diferencia estadísticamente significativa por método y
entre diferentes métodos de análisis; mostrando que cualquiera de los dos podría
resultar ser adecuado para el análisis de ácido ascórbico en muestras de jugos y
la elección de cuál utilizar depende del interés particular del análisis y materiales
de trabajo.
El análisis volumétrico podría ser el más utilizado por la facilidad técnica y
materiales de trabajo. Sin embargo, la espectrofotometría y colorimetría digital
puede ser preferible cuando se requiere el contenido total de acido ascórbico, pero
no para el análisis individual de especies de metabolitos que puede presentar; por
lo cual el método cromatografico o electroanalítico son más adecuados cuando el
interés del análisis corresponde a una especie de ácido ascórbico como índice de
deterioro de los productos alimenticios.
Cabe aclarar, la aplicación de la coulombiometría y/o acople con otras técnicas
como fotocolorimetría no presentan reportes para la determinación de ácido
ascórbico en muestras de jugo por lo cual este estudio comprende los primeros
reportes proponiendo un sistema coulombiofotocolorimétrico de mínima
instrumentación construido con materiales de bajo costo, de alta precisión y
exactitud para la cuantificación de acido ascórbico; útil en diferentes campos de
las ciencias, sin la necesidad de contar con grandes y sofisticadas instalaciones,
64
laboratorios especializados, instrumentación costosa, personal técnico capacitado
y cantidades de reactivos.
Además, comparado con otros métodos aunque no presente resultados de límite
de detección y rango lineal bajos como se presentan en otros reportes (Tabla 10),
se observa que en cuanto a parámetros de precisión y exactitud son comparables
a otros métodos analíticos de innovación tecnológica.
Tabla 10. Determinación de ácido ascórbico por aplicación de diferentes métodos de análisis.
Método LDM (mg/L) Rango lineal (mg/L) *CV - % R Referencia a
Espectrofotométrico 0,090 0,2 – 14 1,3 – 2,1/99,2 – 101 1
Espectrofotométrico 0,677 0,5 – 100 - /98, 86 – 100,48 2
Espectrofotométrico 0,001 0,003 – 0,53 2,1 – 3,9/98 – 102,3 3
Electroanalítico 0,83 - 7/91-108 4
Electroanalítico - 17,6 – 1760 -/94,35 – 104 5
Colorimetría digital 0,005 - 1.2/- 6
Fluorescencia molecular 0,0038 0,0176 – 1.76 - 7
Cromatografía 0,010 - < 2%/- 8
Cromatografía 0,00743 0,2 – 0.8 0,68 – 0,97/98,25 – 99,17 9
Coulombiofotocolorimetría 123 176 -1760 1,2 – 2,2/97-99 Este estudio
*CV: coeficiente de variación (%), R: porcentaje de recuperación a 1. Vishnikin et al. (2011), 2. Elgailani y Alghamdi, (2017), 3. Bazel et al. (2018), 4. de Faria et al.
(2020), 5. Pisoschi et al. (2008), 6.Porto et al. (2019), 7. Meng et al. (2018), 8. Quirós y Fernández,
(2009), 9. Alam et al. (2019)
Lo anterior, es fundamental al considerar la muestra de interés, en este caso jugos
comerciales donde puede presentar concentraciones de 10, 40 ó 100% VD de
contenido de ácido ascórbico, por lo cual parámetros como límite de detección o
rango lineal no juegan un papel primordial en la cuantificación del analito ya que
depende en forma directa de procesos de dilución que se realice para que al
65
momento de la determinación se encuentre dentro del rango de trabajo del método
en especial en el 50%, donde generalmente se presentan los mejores resultados
de precisión y exactitud en una marcha analítica por cuantificación mediante curva
de calibrados.
Finalmente, la evaluación de incertidumbre, trata de determinar todas las fuentes
que influyen en la medición, calcularlas, y luego sumarlas de manera tal, que se
pueda determinar la incertidumbre general de la medición.
En este estudio se consideraron a nivel general las siguientes variables:
Incertidumbre del peso de los reactivos, alícuotas para análisis o preparación de
estándares, aforo de soluciones, reproducibilidad y ecuación de recta.
De las anteriores el factor que aporta mayor grado de incertidumbre a los
resultados fue la reproducibilidad (figura 7), relacionado posiblemente a las
condiciones de lectura al no contar con registrador o controlador de tiempo con
una interfaz a una computadora para monitoreo y registro de datos.
66
Figura 7. Incertidumbre estándar relativa - sistema microcoulombiofotocolorimétrico
Lo anterior, indica que existen distribuciones de tipo normal en que los datos
varían aleatoriamente con este tipo de probabilidad, lo que corrobora que la
evaluación de incertidumbre en su mayoría fue basado en un análisis estadísticos
de una serie de mediciones (Incertidumbre tipo A) con poca influencia de la
evaluación de incertidumbre tipo B que comprende todas las demás formas de
estimar la incertidumbre en el mensurado.
En consecuencia, el número de repeticiones puede influir en los resultados, razón
por lo cual, se puede dar una recomendación general; al incrementar el número de
repeticiones incrementa el nivel de confianza en el valor de la desviación. Sin
embargo, factores como la precisión y exactitud al trabajar con volumen muy bajos
y limpieza de electrodos deben ser considerados de gran importancia al momento
0 0,02 0,04 0,06 0,08
IER Patrón concentrado AA
IER KI
IER KNO3
IER Medición de alícuota análisis
IER Medición de alícuota
IER Equipos
IER Reprod patrón utilizado
IER Curva calibrados
0.008M
0.005M
0.001M
67
de realizar un análisis; ya que pueden influir en forma negativa en la respuesta y
reacción de electroquímica en proceso, respectivamente.
Es por ello que para calcular la reproducibilidad, se recomienda el uso de gráficos
de control, para determinar la desviación normal en un período de tiempo
relativamente largo donde se realicen múltiples análisis; manteniendo condiciones
adecuadas de trabajo que eviten oxidación de los electrodos, deterioro de circuitos
y caducidad de las soluciones preparadas.
68
6. CONCLUSIÓN
La construcción del el equipo microcoulombiofotocolorimétrico con materiales de
fácil acceso presento costos instrumentales muy bajos ($ 549.000). Además,
mínima instrumentación, simple, fácil operación, portátil, tiempo de análisis cortos
y respetuoso con el ambiente (volumen de muestra y reactivos muy bajos).
El acople en línea microfotocolorimétrico a la microcelda de valoración
culombimétrica corresponde a un sistema de monitoreo de mayor eficiencia para
la determinación del punto final del proceso de reacción electrolítica del analito.
El método microcoulombiofotocolorimetrico propuesto y validado para el análisis
de ácido ascórbico en bebidas de interés comercial evaluado bajo condiciones
optimas de operación 0,1M (KI), 0,3M (KNO3) y potencial (9V), resultó ser preciso,
reproducible, exacto, sensible y con grado de incertidumbre de resultados bajos.
En general, comparado con otros procedimientos de referencia ó métodos
instrumentales; ofrece grandes promesas para el análisis de rutina de ácido
ascórbico en muestras de bebidas alimentarias como herramienta analítica de
control de calidad.
69
7. REFERENCIAS
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