Universidad nacional del altiplano puno

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO PUNOFACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIACURSO DE PATOLOGA CLNICAPRUEBA DE LA SERONEUTRALIZACIONPRESENTADO POR: GERMAN FELIX CALCINA CUCHUIRUMIDOCENTE:DR. VICTOR ZANABRIA HUISA

7/14/201101El mtodo de seroneutralizacin (SN) consiste en determinar la capacidad que tiene el suero objeto de estudio de neutralizar el efecto de un virus sobre la lnea celular sensible . Para ello se utilizan diferentes diluciones del suero problema y se comparan sus resultados frente a un suero control. Nos indica la capacidad que tiene un suero para neutralizar la actividad biolgica del antgeno. Estos mtodos son ampliamente utilizados en los laboratorios para valorar la capacidad de un suero frente a toxinas bacterianas, bacteria y/o virus.

Este mtodo est considerado de referencia para cualquier estudio serolgico pues es el que ms se correlaciona entre la respuesta "in vitro" y la respuesta "in vivo". Introduccin7/14/201102 Identificacin y aislamientos del virus utilizando sueros especficos de referencia. Diagnstico de infeccin viral demostrando aumentos de ttulos de anticuerpos especficos en el curso de una enfermedad. Determinar niveles de proteccin a nivel poblacional ya que, en general, los anticuerpos neutralizantes persisten durante tiempo ms prolongados. Cuantificacin de virus o anticuerpos. Monitoreo de muestras que por otras tecnicas( por ej.: ELISA) son dudosas. Objetivo de la PrcticaDeterminacin del ttulo del anticuerposseroneutralizantes contra HVB-1 en sueros de bovinos.

Objetivo de la Tcnica

7/14/201103Estas pruebas son ms laboriosas, requieren de cultivos celulares, esterilidad, adems de ser generalmente ms lentas que todas las anteriores, por lo que no est indicada para un gran nmero de muestras.Sin embargo son altamente especificas y sensibles, y se consideran las pruebas de referencia para cualquier valoracin serolgica.Es la tcnica de referencia para la confirmacin de resultados.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS7/14/201104El procedimiento bsico consiste en mezclar diluciones apropiadas de suero y virus, incubarlas en ciertas condiciones e introducir la mezcla en un sistema susceptible donde el virus no neutralizado pueda producir un efecto reconocible como muerte, lesiones especficas, hemoaglutinina, efecto citoptico, etc., detectndose entonces, infectividad residual. Estos sistemas susceptibles pueden ser animales de experimentacin sensibles (ratn, rata, cobayo, hamster), huevos embrionados y cultivos celulares (de lnea o primarios). El tiempo y temperatura de incubacin, pH, presencia o no de complemento, etc., son factores que intervienen en la neutralizacin. Para implementacin de la prueba de seroneutralizacin se emplean dos mtodos principales:

PROCEDIMIENTOS7/14/201105El mtodo comprende tres etapas:Preparacin y titulacin del virus desafo (CVS)Seroneutralizacin del virus: preparacin del suero y las mezclas suero-virus e inoculacin en ratones.Interpretacin de resultados.

Suero variable-virus fijo: Donde una cantidad medida de virus (por titulaciones previas) se mezcla con diluciones variables de un suero problema y se inocula en un sistema husped susceptible. La ms alta dilucin (o menor cantidad de suero) que protege de la infeccin se denomina ttulo seroneutralizante.Suero constante-virus variable: Donde diferentes concentraciones de virus se enfrentan a una concentracin srica uniforme. Los resultados se expresan como ndice seroneutralizante (IN) y representan la diferencia entre ttulo del virus en presencia de suero control negativo y el ttulo del virus en presencia del suero problema.

MTODOS7/14/201106En ambos mtodos debe definirse el punto final de infectividad, que consiste en la ms alta dilucin de suero o virus que protege o infecta una unidad de sistema susceptible. Los puntos finales 100% no son convenientes debido a que por encontrarse en los extremos, permiten detectar diferencias mayores al 100%. El tipo de punto final deseable para la estimacin de una respuesta en la mitad de las unidades prueba, o sea, el denominada punto final 50%. La precisin en la estimacin del valor 50% depender del nmero de unidades de prueba utilizadas por dilucin

7/14/201107a. Las microplacas con el cultivo celular se enjuagan dos veces por Medio de Lavado, dejando en cada pocillo algunas gotas del mismo. que se descartarn en el momento de la inoculacin:b. El virus conocido se diluye en MEM-G o BME con 3% de suero normal bovino a fin de obtener 10 3,3 DICT50/ml (100 dosis infecciosas en la mezcla suero-virus e inocular: 0,1 ml).c. El suero se diluye en el mismo medio, en diluciones dobles a partir de 1/2 hasta la dilucin final elegida (considerar que el factor de dilucin ser el doble al agregar igual volumen de dilucin viral). Se mezclan iguales volmenes de cada dilucin srica con la dilucin viral (por ejemplo, 0,3 ml. dilucin srica y o,3 ml. dilucin de virus).d. Los controles positivo y negativo se preparan de la misma manera, el titulo del control positivo debe estar entre 1/8 y 1/64, y el negativo no debe inhibir el efecto citopatico viral a una dilucion se incluye un control de la dilucin viral (0,3 ml. de la dilucin viral ms 0,3 ml. de medio con suero).e. Se agita suavemente y se lleva a 37C durante 60 minutos. La reaccin se detiene a 4C durante 30 minutos.f. Se descarta con cuidado al Medio de Lavado de la microplaca, se seca con papel absorbente y se inoculan 4 pocillos por cada dilucin suero-virus, con un inoculo de 0,1 ml. El control de dilucin viral se titula a fin de determinar la exacta concentracin viral: tres tubos con 1,8 ml. de medio con suero, colocando en el primero 0,2 ml. de la dilucin de virus utilizada (dilucin 1/10), se mezcla, se traspasan 0,2 ml. al siguiente (dilucin 1/100) y, finalmente 0,2 ml. al tercero (dilucin 1/1000).g. En cada microplaca que se utiliza se deben dejar pocillos de control celular que slo se completan con medio.

Suero variable-virus fijo (para BHV-1) - Prueba de Seroneutralizacin7/14/201108a. Las microplacas se preparan como en el mtodo anterior.b. El o los sueros problemas inactivados se diluyen 1/5 con medio con suero.c. Se preparan diluciones logartmicas de virus: 2 x 101, 2 x 102, 2 x 103, etc.d. Se incluyen controles de suero positivo y negativo.e. Se mezclan iguales volmenes de dilucin de suero y de dilucin viral (por ejemplo, 0,3 ml. y 0,3 ml.) El control de cada dilucin viral se prepara con 0,3 ml. de cada una de ellas, con 0,3 ml. de medio con suero negativo.f. Se mezcla y se incuba como en el caso anterior.g. Se inocula 0,1 ml. de cada mezcla dejando pocillos de control celular.

. Suero constante-virus variable (para BHV-1)7/14/201109 Microplacas de 96 pocillos, de fondo chato, con monocapas de 48 horas de TEB (Testculo de feto bovino) secundario. Papel absorbente estril. Medio de lavadoMEM-G o BME con antibitico y 3% de suero normal bovino para las diluciones sricas y virales.Suero control positivo y negativo; estos, como el o los sueros problemas, deben estar inactivados a 56 (+-) 1C, durante 30(+-) 5 minutos. El control positivo debe tener un titulodentre 1/8 hasta 1/64 y el negativo no debe inhibir el efecto citopatico viral desde la dilucion . Segn el mtodo a utilizar, virus o suero de ttulo conocido

MATERIALES Y REACTIVOS7/14/201110La incubacin se realiza a 37C durante 72 horas, al cabo de las cuales se observa al microscopio la presencia de efecto citoptico en los pocillos.Se controlan los sueros positivos y negativo, los pocillos de control de clulas y los de control de dilucin viral. Una vez chequeados los controles, se procede a la lectura de los pocillos con y sin efecto citoptico correspondientes a cada dilucin.

INTERPRETACIN7/14/201111

14.07.2011 23:54 et

Gracias por la atencin prestada

7/14/201112