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MÉTODOS DE ENSAYOS
TOXICOLOGICOS I
Msc.. LEON F. VILLEGAS V.
Dpto. Ciencias Celulares y Moleculares
Sección Ciencias Farmacéuticas
FACULTAD DE CIENCIAS-UPCH
TOXICIDAD AGUDA
• Administración de la sustancia a los animales en una ocasión.
• El objetivo es determinar la sintomatología consiguiente a la administración de la sustancia y su grado de letalidad.
• El procedimiento inicial consiste en investigar una serie de rangos de dosis del compuesto (Dosis maxima y minima). Seleccionar vía de administración y preparar la sustancia de una manera adecuada para su administración.
• Se usa la vía oral cuanto menos además de las otras con el objeto de comparar con otros compuestos relacionados y para ver estudios de toxicidad prolongada posteriormente.
• Independiente de las especies seleccionadas, los animales de xperimentación deben estar sanos y ser observados antes de los ensayos (ratones y ratas 1 semana y perros 3 a 4 semanas)
• Experimentación preliminar.Tiempo de observación minimo 24 hora. Determinación de la DL50.
• Vía inhalatoria CTL50 (50% de animales muertos para una exposición es de 4 horas)
• Observar efectos durante la determinación experimental de la toxicidad, los cuales pueden ayudar algunas conclusiones sobre el cnetro y psoible meanismo de acción.
EXAMEN FISICO Y OBSERVACION DE
ANIMALES EN ESTUDIO DE TOXICIDAD
• ACTIVIDAD: locomotora y de saltos
• REACCION EXTRAÑA: Movimientos acrobáticos,
vagabundeo sin proposito fijo, movimiento hacia atrás,
hociquear, lamer, mov. empujar con la nariz, fijar mirada
con ojos vidriosos, dar vueltas.
• FONACION: Normal, anormal
• SENSIBILIDAD AL DOLOR: Inc., Dis. O Analgesia.
• SENSIBILIDAD AL SONIDO: Inc., Dis. Reactividad
• SENSIBILIDAD AL TACTO:Sensibilidad, reflejo del pabellón de la oreja
• INTERACCION SOCIAL: Comportamiento exploratorio, frecuencia de erguimiento, altura de rguimiento.
• COLA ANORMAL: rigida, flácida
• COMPORTAMIENTO AGRESIVO: Especie contra especie, hacia los experimentadores
• ATAXIA (alteracion en la capacidad de coordinar movimientos)
• CONVULSIONES: tonicas, clonicas, mixtas
• TONO MUSCULAR: tronco, extremidades
• PARALISIS
• RESPUESTA SOMATICA: aseo,frotarse la nariz, rascarse, retorcimiento
• REFLEJOS POSTURALES: reflejo colocación, asinamiento, enderezamiento
• POSTRACION: perdida de conciencia
• TEMBLORES: En reposo y movimiento, solo en movimiento
• EXOLFTALMIA: Protrusión marcada de los globos oculares
• IRRITACION OCULAR: Opacidad, papadeo excesivo, iritis
• REFLEJO CORNEAL
• LACRIMACION
• NISTAGMO (Movimientos oculares involuntarios)
• REFLEJOS PUPILAR A LA LUZ (FOTOMOTOR)
• FOTOFOBIA
• TAMAÑO DE LA PUPILA
• DEFECACION: Diarrea, Depocisión sanguinolenta
• SALIVACION: salivación, sequeda de la boca
• MICCION: Hematuria
• APNEA (ausencia de rspiración espontanea)
• DISNEA(falta de aliento o difcultad para respirar)
• RESPIRACION: ritmo respuratorio, profundidad respuartoria, respiración irregular
• CORAZON: Ritmo cardiaco, pulso
• DESCARGA NASAL
• TEMPERATURA CORPORAL
• CIANOSIS (coloración azulada de la piel y de las mucosasproducidas por un incremento de hemoglobina desoxigenada en la sangre)
• DEFICIT MOTOR: en pista inclinada, barra rotatoria, en alambre horizontal
• PILOERECCION
• MUERTE
• AUSENCIA DE EFECTOS
• ENSAYOS FUNCIONALES ESPECIALES: Comportamiento frente al condicionamiento de evitación, respuesta de reflejos condicionados
TOXICIDAD PROLONGADA
• Objetivo evaluar de forma general y caracterizar
todos los efectos cuando una sustancia es
administrada reiteradamente.
• Tres a cuatro mesesaplicación de tecnicas
analiticas para determinar efectos sobre la
química de la sangre, orina, liquidos biologicos y
la función especifica de los órganos
• Incluyen la evaluación de todos los animales
patologicamente e histologicos.
PRUEBAS ANALITICAS Y FUNCIONALESHEMATOLOGIA SANGRE ORINA ESPECIALES
-Eritrocitos
-Leucocitos
-Diferencial de
leucocitos
-Hematocrito
-Hemoglobina
-Sodio y potasio
-Cloruros y
calcio
-Doxido de
carbono
-Transaminasa
sérica
(Glutamato-
piruvato* y
Glutamato-
oxalacetato+)
-Fosfatasa
alcalina sérica*
-Electroforesis
de proteínas
séricas
-pH
-Peso especifico
-Proteínas
totales
-Examén
microscopico del
sedimento
-Glucosa
-Cetonas
-Bilirrubina
-Creatinina
-Ac. Urico
-Retención de
bromosulfaleína*
-Turbidimetría
con timol*
* = Ensayos de funcionalismo hepatico
+ = Ensayo para células de tejidos lesionados
EXAMENES PATOLOGICOS E HISTOLOGICOS
PESOS EXAMENES HISTOLOGICOS
•Corporal
•Tiroides
•Corazón
•Hígado
•Bazo
•Riñones
•Capsulas suprarrenales
•Testículos con epidídimo
•Riñon y Capsulas
suprarrenales
•Carazon
•Higado
•Intestino grueso y delgado
•Bazo
•Ovario
•Nodulos linfaticos mesentericos
•Todas las lesiones tisulares
•Pituitaria
•Tiroides
•Estomago
•Pancreas
•Vejiga urinaria y testiculos
TOXICIDAD CRONICA
• Ensayos de un año o más son llevados para
demostrar ausencia de toxicidad cuando la
dosis implicadas representan un cierto nivel
practico y evaluación del potencial
carcinogenico
• Alimento 100 veces la dosis para el hombre
utilizada
• Evaluación patologica e histologica aintervalos
de 6 a 12 semanas o bien cuando los animales
enfermen debido a la sustancia.
ENSAYOS DE POTENCIACION
• Posibilidad de sumación de efectos biologicos cuando dos o mas agentes con acción similar se administran simultaneamente.
• Tambien puede darse la condición que surge cuando el efecto combinado de dos sustnacias quimicas es mayor que la suma de las toxicidades de las sustancias individuales.
• Se realiza haciendo un ensayo normal de toxicidad aguda o prolongada con una mezcla de 1:1 de los dos compuestos y luego se comparan con los efectos producidos individualmente.
ENSAYOS SOBRE PIEL Y OJOS
• Trata de evaluar los efectos locales producidos
por sustancias muchas veces irritantes sobre la
zona de contacto.
• Es el caso de jabones,detergentes,
emulsificantes, cosmeticos, disolventes y una
gran variedad de colorantes.
• Obtener información de efectos en el curso de
su uso habitual asi como el uso
inadecuado.medir el tipo y grado de efcto sobre
piel y ojo.
IRRITACION PRIMARIA -PIEL
• Utiliza el conejo albino, el cobayo albino y el ratón.
• Cuando se absorben por piel puede derminarse su DL50
• Se utilizan dos grupos de animales, el dorso desde la
cabeza hasta los cuartos traseros se afeitan y depilan.
• Se necesita un sistema de calificación:
• 0=ningun eritema, 1= eritema ligero, 2=eritema bien
definido, 3=eritema moderado, 4=eritema grave, lo
mismo se hace con respecto al edema.
• ENSAYOS DE SENSIBILIZACION
CUTANEA: Ensayos en piel de conejos.
• ENSAYOS DE FOTOTOXICIDAD Y
FOTOALERGIA: se utilizan cobayos,
evalua los efectos de la luz ultravioleta
sobre problemas de toxicidad o alergias
a nivel de piel.
• ENSAYOS EN OJO: Se utiliza conejos
albinos, se evalua los efectso sobre,
cornea, conjuntiva e iris (metodo de
Draize).
Metodos de ensayo toxicologico II:
Ensayos teratologicos,
reproducción y embriotoxicos
Msc.. LEON F. VILLEGAS V.
Dpto. Ciencias Celulares y Moleculares
Sección Ciencias Farmacéuticas
FACULTAD DE CIENCIAS-UPCH
• Teratologia es el estudio de las causas,
mecanismos y manifestaciones desarrollo
anomalo de naturaleza estructural y
funcional.
• Algunos productos son letales mientras que
otros son predominantemente capaces de
producir malformaciones en el feto, que se
llaman teras (o lesiones teráticas) y el agente
que la produce se designa como teratógeno
o agente teratogénico.
ENSAYOS
TERATOLOGICOS
• El efecto embriotoxico depende de la
dosis y en la fase de gestación en la
que el feto esta expuesto al compuesto
ensayado.
• Existen otros factores que pueden
generar anormalidad en el periodo de
gestacion: deficiencia en la
alimentacion, infecciones viricas,
hipertermia, desequilibrio hormonales y
stress.
• Los ensayos en una especie tienen un valor
limitado en cuanto a predecir los efectos
sobre otras especies. Por ejemplo la
cortisona es teratogenico en ratones pero
solo en algunas cepas de ratas.
• Cuando existen marcadas diferencias entre
especies en cuanto a su respuesta a una
sustancia dada, cabe pensar que hay
diferencias en la biotransformacion del
compuesto en dichas especies y que el
agente puede ser un metabolito del
compuesto original.
• Las ratas Hooded y Sprague-Dawley son resistentes a la TALIDOMIDA y sin embargo son suceptibles a los agentes alquilantes.
• Los efectos toxicos sobre el embrion se obtienen experimentalmente mediante administracion del agente a la madre. El embrion depende del organismo materno para su crecimiento y sustento.
• La placenta puede ser una barrera mas o menos eficiente.
• Los ratones, ratas y conejos son los animales
de experimentacion mas frecuentes
empleados en los ensayos de
teratogenicidad.
• Se utilizan por su disponibilidad en los
laboratorios de ensayo y porque con ellas se
pueden operar con un numero de animales
suficientes para satisfacer las exigencias
estadisticas. En numero de ratas minimo es
10 esto produce aprox. 100 fetos si los
resultados son dudosos se repite el
experimento con 20 hembras como minimo
en cada grupo.
• La secuencia de todos los ensayos teratologicos es: producir gestacion, confirmar la gestacion y administrar la sustancia a ensayar y establecer el efecto teratogenico.
• Las ratas y ratones deben ser seleccionados con ciclos estruales regulares mediante control diario de su frotis vaginal y el apariamiento se realizara en el proestro.
• Estro= periodo de celo o ardor sexual de los mamiferos hembras
• El ciclo estral se determina usando
como parametro la cantidad, o
ausencia, de tres tipos de celulas en un
frotis vaginal: leucocitos (neutrofilos),
celulas epiteliales y celulas
cornificadas.
• El ciclo estral presenta 4 fases.
• Proestro: predominio de celulas
epiteliales sobre celulas cornificadas.
Presencia de leucocitos residuales.
• Estro: cantidad maxima de celulas cornificadas y celulas epiteliales minimo. El animal esta listo para aparearse.
• Metaestro I: La cantidad de celulas cornificadas ha disminuido y hay pocas celulas epiteliales
• Metaestro II: Cantidad de leucocitos aumentado hay algunas celulas cornificadas y epiteliales.
• Diestro: mayor cantidad de leucocitos ocupan todo el campo de visualizacion microscopica y se observa un incremento de celulas epiteliales
• Se debe de observar el tapon vaginal, presencia de espermatozoides en el fluido vaginal y el desarrollo de un diestro permanente.
• Periodo de gestacion de ratones es de 21 dias, en las ratas 21 a 22 dias y en los conejos 30 a 35 dias.
• Los experimentos se llevan a cabo en dos especies y minimo con 3 dosis. Ademas del control negativo es importante un control positivo.
• Cuando se trabajan con ratas y ratones la dosificacion se lleva a cabo administrando diariamente, a partir del 7o hasta el 15o dia de gestacion.
• La gestacion es interrumpida por cesarea: 20 dias ratones, 21 rats y 31 conejos.
• Autopsia completa a la madre contabilizacion de fetos vivos y muertos y se inspeciona el utero para observar resorcion fetal.
• Los fetos son examinados
sistematicamente y se realiza estudios
de histopatologia.
• Si no se encuantran fetos puede
pensarse de posible aborto, por lo cual
el experimento debe ser repetido y
debe de observarse mejor.
• Los perros, los gatos y primates
plantean problemas de manejo con
respecto al seguimiento de su
gestacion.
ENSAYOS DE REPRODUCCON
• Un estudio bien diseñado y realizado de reproduccion constituye un unico protocolo los suficientemente amplio como para que se puedan manifestar practicamente todas las formas de toxicidad, salvo la acrcinogenica.
• Los ensayos de fectos sobre la reproduccion tienen como objetivo final una estimacion de los efectos sobre la fertilidad, la gestacion y la descendencia.
• Los efectos toxicologicos sobre la reproduccion presentan tres posibilidades.
• 1. Los efectos pueden manifestarse
sobre el progenitor macho o hembra o
en ambos, y pueden ser el resultado
directo de una alteracion en el
funcionalismo de las gonadas, en el
ciclo estro, en el comportamiento en el
apariamiento, el indice de concepcion o
en los primeros estadios de gestacion,
tales como efectos sobre la
implantacion del ovulo fertilizado.
• 2. Puede ser sobre el desarrollo del
feto, su grado de normalidad, icluyendo
efectos teratogenicos y mutagenicos y
la mortalidad intrauterina.
• 3. Puede ser efectos sobre la madre,
como efectso sobre la lactancia y
aceptacion de la progenie; y sobre
dicha progenie en lo referente al
crecimiento, desarrollo y maduracion
sexual.
• La evaluacion de la ausencia de un
efecto sobre la reproduccion requiere
una valoracion de la probabilidad y
aplicar el criterio cientifico en la
interpretacion de resultados obtenidos.
• El experimento debe de considerar un
numero adecuado de animales, tres
dosis de ensayo siendo la dosis mayor
proxima ala maxima tolerada.
Metodos de ensayo toxicologico
III:
Ensayos mutagenicos,
carcinogenicos
y sobre comportamiento
MsC. LEON F. VILLEGAS V.
Dpto. Ciencias Celulares y Moleculares
Sección Ciencias Farmacéuticas
FACULTAD DE CIENCIAS-UPCH
• Es la inducción de alteraciones en
la información (DNA) de un
organismo o de una célula, que no
son el producto de la
recombinación normal.
• En organismos superiores la lesion
genetica puede darse a nivel de
celulas germinales o somaticas.
• Las mutaciones somaticas en un
organismo en desarrollo puede
generar una diferenciacion anormal
de sus celulas.
MUTACIONES
• Las alteraciones en celulas
somaticas en division de
un adulto puede dar
cancer. Este efecto es
sobre el individuo y no
sobre su progenie.
• Las alteraciones en celulas
germinales pasan a
generaciones sucesivas.
• Las mutaciones germinales
pueden producir la muerte
hasta anormalidades en el
desarrollo de la
descendencia.
• Existen 2 tipos de alteraciones en el material genetico
espontaneamente o por induccion quimica: mutaciones
pun tuales y aberraciones cromosomicas.
• Una mutacion puntual es una alteracion en un unico par
de nucleotidos del DNA y da cambios en una funcion
bioquimica.
• Las mutaciones puntuales se detectan en los cambios del
fenotipo y puden ser localizados mediante el mapa
genetico.
• Las aberraciones cromosomicas
incluyen mutaciones
estructurales (ruturas y
reordenamiento de cromosomas)
y cambios en el numero de
cromosomas.
• Las alteraciones se detectan
mediante examen citologico de
los cromosomas.
• La hidroxilamina es un ejemplo
de mutageno que produce
alteraciones puntuales.
• Los mutagenos que producen
radicales libres, causan ruturas
cromosomicas con mayor
frecuencia que alteraciones
puntuales.
• Los sistemas para evaluar estos efectos incluyen el uso
de bacterias, plantas e insectos.
• Pero la desventaja es que carecen de una fisiologia y
de un metabolismo de los mamiferos.
• Se ha superado aumentando a los medios de cultivo
los sistemas metabolizadores propios de los
mamiferos.
• Deben realizarse ensayos in vivo como in vitro.
• Se ha recomendado tres ensayos in vivo: ensayo del
dominante letal, ensayo por medio de hospedador y
citogenetica in vivo.
• Es aquella que mata a un individuo heterocigote.
• La lesion genetica se da en forma de aberraciones cromosomicas estructurales y numericas.
• El procedimiento consiste en tratar ratones o ratas machos con una dosis subtoxica (1/5 DL50) de la ssustancia a ensayar.
• Los ratones copulan con ratones no inoculadas.
• Las hembras luego son sacrificadas a los 14 dias despues de la copula se disecan y se estudian: cuerpos luteos, muertes fetales prematuras, muertes fetales tardias y las implantaciones totales.
ENSAYO DEL DOMINANTE LETAL
• I.M. = [(m.f.p./imp.totales)] X100
• Da cuenta de las mutaciones
cromosomicas pero no las puntuales.
• Principalmente se evaluan agentes
alquilantes.
ENSAYO POR MEDIO DE HOSPEDADOR
• Emplea microorganismos como indicadores de lesion genetica en un sistema de ensayo mamifero.
• Hay sustancias que no son mutagenicas en microrganismos pero son covertidas en mutagenos activos en los mamiferos.
• Estos ensayos tienen en cuenta la metabolizacion del mutageno potencial por el animal hospedador.
• Se inyecta intraperitonealmente a un raton, rata o hamster un microorganismo indicador como Salmonella o Neurospora. Luego el animal es tratado con el mutageno potencial, que es administrado por otra via.
• Despues de un tiempo se extrae una muestra de la cavidad peritoneal del hospedador y se mide la frecuencia de mutaciones en los microorganismos. Simultaneamente se ensaya in vitro la accion mutagenica del compuesto y esta es comparada con el resultado del ensayo hecho en el hospedador.
CITOGENICA in vivo
• Existen metodos in vivo como in vitro para el examen microscopico de las aberraciones cromosomicas de celulas de mamiferos.
• Los ensayos in vitro permiten una regulacion mas precisa de la dosis y del tiempo de exposicion.
• Para detectar las anormalidades cromosomicas es el ensayo in vivo, permite el examen directo de celulas animales tratados o expuestos accidentalmente.
• Los tejidos son medula osea para ver efectos sobre mitosis, linfocitos para las lesiones que se dan antes de la sintesis de DNA, fibroblastos de piel para efectos de largo plazo, gametocitos meoisis, y cultivo de celulas de liquido amniotico para lesiones de la progenie.
CARCINOGENICIDAD
• El tumor es una masa anormal de tejido cuyo crecimiento excede el de los tejidos normales y no esta coordinando su ciclo celular.
• Tumores benignos y malignas
• Los tumores benignos tienen caracteristicas estructurales identicas a las del tejido normal que lo origino, su crecimiento es solo expansivo no invade tejidos aledaños.
• Tumor maligno no son tipicas e invaden tejidos proximos.
• El tumor maligno tiende a desarrollar
secundariamente al sitio de su origen.
Estos tumores son metastasicos.
• Los tumores malignos: carcinomas (cel.
Epiteliales) y sarcomas (tej. Sosten o
conectivos).
• Sustancia que producen cualquier
tumor: tumorigenos
• Sustancia que producen tumores
malignos: carcinogenicos (carcinoma o
sarcoma).
• Los ensayos se interpretan siempre en
funcion del efecto del compuesto sobre la
incidencia de aparicion de tumores en
animales de experimentacion en
comparacion con un control.
• Los estudios se hacen en ratones y en rata,
aunque se han empleado perros, conejos y
cobayos.
• Los estudios son evaluados durante toda la
vida del animal de experimentacion.
• Se ha desarrollado un metodo invitro, un
ensayo bacteriano simple para la deteccion
de mutagenos (Ames 1974).
• Se utiliza una cepa de Salmonella typhymurium (His-) que necesita histidina exogena para su desarrollo, en el medio de cultivo se agrega la sustancia a evaluar.
• En presencia de un mutageno la cepa mutante de Salmonella tiende a revertir (His+).
• Como muchos carcinogenos requieren de ac tivacion metabolica el ensayo in vitro que emplea la cepa mutante de Salmonella(His-), se incluye un sistema de biotransformacion (homogenizado de higado de rata la fraccion S9)
COMPORTAMIENTO
• Efectos a dosis sucesivas o exposiciones
repetidas.
• Ensayos de: rueda giratoria, campo abierto,
jaula normal y laberinto residencial.
• La rueda giratoria es el mas antiguo, se utiliza
para medir la actividad diurna de los animales, y
puede detectarse efectos estimulantes sobre el
sistema nervioso central inducido por
medicamentos (psicotropicos). Lesiones
cerebrales asociados a hiperactividad.
• La tecnica de campo abierto: cuantifica
la actividad exploratoria de los animales
en un ambiente que no les es familiar;
en genral ello implica normalmente
observacion del animal durante un corto
periodo de tiempo. Es una prueba
simple que se ha visto sirve para
demostrar la hiperactividad debida
alesion cerebral en roedores jovenes
tras la exposicion de sales inorganicas
de plomo.
• La jaula normal o domestica: jaula
donde el animal se cria y en donde su
actividad de comer, asearse o
interactuar socialmente es registrado.
• El laberinto residencial: se utiliza par
determinar hiperactividad nocturna en
ratas jovenes que han sido expuestas a
altas dosis de monoxido de carbono.
• Ensayos especificos de recompensa o
castigo.