practicas bioquimica general-2012 uacj

7/17/2019 Practicas Bioquimica General-2012 uacj

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZINSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICASACADEMIA DE BIOQUÍMICA

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA GENERALMEDICINA (PLAN NUEVO)

PROPUESTA DE HOMOLOGACIÓN CON ODONTOLOGÍA Y ENTRENAMIENTO

DEPORTIVO

FECHA DE ACTUALIZACIÓN MAYO 2012DRA. LAURA A. DE LA ROSA CARRILLO



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Contenido

PRACTICA #. 1 ................................................................................................................................................ 3

BIOSEGURIDAD Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO ..................................................................... 3

PRÁCTICA #2 ................................................................................................................................................. 9

MANEJO DEL POTENCIÓMETRO Y TITULACIÓN ÁCIDO BASE ....................................................................... 9

PRACTICA # 3 ............................................................................................................................................... 13

REACCIONES DE IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS ................................................................................. 13

PRACTICA # 4 ............................................................................................................................................... 17

Práctica # 5 .................................................................................................................................................. 22

ANALISIS ENZIMATICO CUALITATIVO.......................................................................................................... 22

Práctica # 6 .................................................................................................................................................. 25

EXTRACCIÓN DE GLUCOGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS ......................... 25Práctica # 7 .................................................................................................................................................. 29

CUANTIFICACION DE COLESTEROL SERICO ................................................................................................. 29

Práctica # 8 .................................................................................................................................................. 48

METABOLISMO ANAEROBIO: REACCIÓN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA ............................. 48



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PRACTICA #. 1BIOSEGURIDAD Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

OBJETIVO

Que el alumno se familiarice con el material como de instrumentación aplicable a técnicas de

experimentación en el área bioquímica así como con el material Peligroso Biologico infeccioso, sumanejo y desecho adecuado, de acuerdo a las normas mexicanas NOM-087 y NOM 052.

PRERREQUISITOS

1.- Conocimientos sobre diluciones, soluciones y mezclas.2.- Definición de ácido, base y amortiguador.3.- Conocimiento básico del manejo del potenciómetro y el fotocolorímetro.4.- Que es una solución Molar, Normal y % w/v

INTRODUCCION

Para llevar a cabo con éxito un experimento en cualquier laboratorio es necesario que se manejen

técnicas básicas de experimentación tales como:

- Técnicas de medición de líquidos.- Técnicas de pesado de sólidos.- Técnicas de mezclado de líquidos y sólidos.

Todas estas técnicas se relacionan con frecuencia con las actividades que cotidianamente se llevan acabo en el laboratorio de Bioquímica. A continuación se dan algunos datos sobre cada una de estas

técnicas.

Medición de líquidos: Los instrumentos de medición de líquidos más utilizados son: pipetas, probetas y

matraces volumétricos. Las pipetas sirven para medir volúmenes de hasta 25 ml. En este rango de

volumen, las pipetas tienen un uso muy frecuente en el laboratorio por su exactitud y confiablilidad. hay

dos tipos generales de pipetas: las serológicas y las volumétricas.

La pipetas serológicas miden volúmenes diversos debido a que están graduadas en diferentes medidas,

por ejemplo, una pipeta de 1.0 ml. esta graduada en décimas de mililitro y por lo tanto sirve para la

medición de cualquier volumen menor de 1.0 ml. Las pipetas más frecuentemente usadas son de 1.0,2.0, 5.0 y 10.0 ml..

Las pipetas volumétricas sólo miden volúmenes fijos ya que están graduadas para medir un solo

volumen, por ejemplo, una pipeta volumétrica de 1.0 ml. solo servirá para medir este volumen.

Algunas pipetas están diseñadas para que al momento de liberar el líquido que se está midiendo quede

una pequeña porción en la punta de las mismas, esta porción debe dejarse contenida en la pipeta



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porque de otra manera se introducirá un error en la medición. La manera de reconocer este tipo de

pipetas es por las letras TD ( To Deliver ) que se encuentran en la parte superior de la pipeta. Otras

pipetas están diseñadas para liberar todo el volumen incluyendo la porción que se queda en la punta,

este tipo de pipetas se reconocen por las letras TC ( To Contain ), en este caso, si no se libera el total del

líquido medido se incurre en un error de medición.

Las buretas varían en tamaño, generalmente de 1 a 100 ml. El flujo del líquido es controlado por una

llave de vidrio o de teflón. Si es de vidrio requiere lubricación. Las buretas deben llenarse por arriba de

la marca de cero y posteriormente abrir la llave cuidadosamente para que fluya el líquido y el menisco

se ajuste a cero. Dentro de los usos indicados para las buretas se encuentran las titulaciones y para

medición de volumenes de líquidos tóxicos, ácidos, sustancias corrosivas, etc.

Las probetas son cilindros graduados que miden volúmenes por arriba de los 25 ml. todas ellas son

usadas para medir volúmenes diversos, por ejemplo, con una probeta de 50 ml. se pueden medir

volúmenes de 26, 38 o 42 ml etc.. Estos volúmenes se denotan por marcas que se encuentran entre una

graduación y otra. las probetas más frecuentemente utilizadas son: 50, 100, 250, 500 y 1000 ml.. Para

medir volumen en una probeta se tiene que tomar en cuenta la siguiente regla: La superficie de un

líquido dentro de una probeta siempre forma una curva o menisco. El diseño de la probeta esta hechopara medir volúmenes exactos al igualar la parte inferior del menisco con la graduación. Si se mide el

volumen con la parte superior del menisco, se incurrirá en un error.

Los matraces volumétricos, tambien llamados de aforación, sirven para medir volúmenes exactos y son

usados cuando se hacen soluciones porcentuales y molares. Los matraces más frecuentemente usados

son de 50, 100, 500 y 1000 ml.. El uso de estos matraces sigue la misma técnica de medición que las

probetas.

Todos los recipientes arriba mencionados son material de vidrio, por lo tanto, están expuestos a

cambios de tamaño en altas y bajas temperaturas y esto puede modificar drásticamente la exactitud de

la medición. El diseño de este material de cristalería está hecho para medir volúmenes a una

temperatura promedio de 25°C.

Medición de sólidos: La balanza granataria y la balanza analítica son las más utilizadas en la medición de

reactivos químicos de textura sólida. La granataria tiene una exactitud de aproximadamente una

décima de gramo, se utiliza para pesar cantidades mayores de un gramo y cuando la precisión no sea

menor de 0.1 g.

La balanza analítica se utiliza cuando el peso deseado requiera una precisión menor de 0.1 g. Es uno de

los instrumentos más sensibles y permite pesar hasta décimas de miligramo.

Sin embargo, el uso de ambos tipos de balanzas requiere de cuidados básicos comunes tales como:

limpieza completa de todas las partes de la balanza; mantener la tara específica de la balanza antes de

cualquier pesada y hacer pesadas racionales con respecto a la capacidad de la balanza.

Las balanzas de torción son útiles en el laboratorio de bioquímica como una herramienta para el buen

uso de la centrífuga ya que para equilibrar los tubos de centrífuga siempre debe hacerse en base al peso

y no al volumen del contenido.



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La centrífuga es un aparato que permite separar sólidos de líquidos. Es un instrumento que separa

suspensiones a alta velocidad. El material sólido se queda en la base del recipiente (sedimento) y la

porción líquida en la parte superior del recipiente (líquido sobrenadante).

Los recipientes utilizados en la centrífuga generalmente son tubos de ensayo y estos siempre deben

balancearse en cuanto a peso y al ser colocados en la centrífuga siempre debe ser en direcciones

opuestas.

Mezclado de líquidos y sólidos: Las soluciones normales, molares y porcentuales así como los diferentes

tipos de diluciones son las mezclas más utilizadas en el laboratorio. Frecuentemente, las soluciones

involucran mezclas de sólidos en líquidos o de líquidos en líquidos en tanto que las diluciones solo

involucran mezclas líquidos en líquidos. De la destreza con que se lleven a cabo estas mezclas depende

el éxito de la experimentación en el laboratorio.

El fotocolorímetro permite cuantificar concentración de sustancias en base al color desarrollado. La

concentración de una sustancia en solución generalmente es determinada por una reacción de color,

siendo el principio general que a mayor concentración de la sustancia en la solución mayor será la

intensidad del desarrollo del color. Los fotocolorímetros son instrumentos que nos sirven para hacerestas determinaciones.

Residuos peligrosos biológicos infecciosos

¿Qué son los residuos peligrosos biológicos infecciosos?

Los residuos peligrosos biológicos infecciosos en lo sucesivo (RPBI), son aquellos que se generan durante

las actividades asistenciales a la salud de humanos o animales en los centros de salud, laboratorios

clínicos o de investigación, bioteros, centros de enseñanza e investigación, principalmente; que por el

contenido de sus componentes puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente.

¿Cuáles son considerados los RPBI?

De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, son considerados los

siguientes:

La sangre

La sangre y los componentes de ésta, sólo en su forma líquida, así como los derivados no comerciales,

incluyendo las células progenitoras, hematopoyéticas y las fracciones celulares o acelulares de . lasangre resultante (hemoderivados).

Los cultivos y cepas de agentes biológico-infecciosos

Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así como los generados en

la producción y control de agentes biológico-infecciosos.



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Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes

biológico-infecciosos.

Los patológicos

Los tejidos, órganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la cirugía o algún otro

tipo de intervención quirúrgica, que no se encuentren en formol.

Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico, excluyendo orina

y excremento.

Los cadáveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes enteropatógenos en centros de

investigación y bioterios.

Los residuos no anatómicos

Son residuos no anatómicos los siguientes:

Los recipientes desechables que contengan sangre líquida.

Los materiales de curación, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de los siguientes

fluidos corporales: líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido pleural, líquido Céfalo-Raquídeo o líquido

peritoneal.

Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier material usado

para contener éstos, de pacientes con sospecha o diagnóstico de tuberculosis o de otra enfermedad

infecciosa según sea determinado por la SSA mediante memorándum interno o el Boletín

Epidemiológico.

Los materiales desechables que estén empapados, saturados o goteando sangre, o secreciones de

pacientes con sospecha o diagnóstico de fiebres hemorrágicas, así como otras enfermedades infecciosas

emergentes según sea determinado por la SSA mediante memorándum interno o el Boletín

Epidemiológico.

Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a agentes

enteropatógenos.

Los objetos punzocortantes

Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biológicas durante el

diagnóstico y tratamiento, únicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, agujas de jeringas

desechables, agujas hipodérmicas, de sutura, de acupuntura y para tatuaje, bisturís y estiletes de

catéter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deberá desinfectar o

esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal.

¿Por qué representan un riesgo a la salud o al ambiente?



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Por sus características, ya que pueden contener agentes biológicos infecciosos que se definen como

“cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando esta presente en

concentraciones suficientes (inóculo), en un ambiente propicio (supervivencia), en un

hospedero susceptible y en presencia de una vía de entrada)”.

¿Existe regulación para los RPBI?

Con la finalidad de prevenir alguna situación de emergencia debida al mal manejo de los RPBI, la

autoridad Ambiental (SEMARNAT) publicó el 7 de noviembre de 1995 la Norma Oficial Mexicana NOM-

087-SEMARNAT-1995, Que establece los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento,

recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico-infecciosos

que se generan en establecimientos que presten atención médica.

Debido a que esta Norma presentó algunos problemas de interpretación como en su aplicación, se

gestiono en coordinación con la Secretaría de Salud, su modificación, derivándose el 1 de noviembre de

2001 el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2000, Protección Ambiental -

Salud Ambiental – Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos – Clasificación y especificaciones de

manejo. De este proyecto se derivaron 370 comentarios, mismos que fueron contestados y publicados

en el Diario Oficial de la Federación el día 20 de enero de 2003.

Finalmente el 17 de febrero de 2003 se publica en el Diario Oficial de la Federación la Norma Oficial

Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Protección Ambiental – Salud Ambiental – Residuos

Peligrosos Biológico-Infecciosos – Clasificación y especificaciones de Manejo.

¿A quines aplica la NOM-087-SEMARANT-SSA1-2002?

Con base en el campo de aplicación de esta norma es de observancia obligatoria a todos aquellos que

por sus actividades generen los RPBI descritos en la Norma, sin importar el volumen de sus generación,

aclarando que aquellos que su generación sea menor a 25 kilogramos al mes, podrán ubicarse como

generadores de Nivel I, esto para el tiempo de almacenamiento de sus RPBI.

¿Existe otra Norma Oficial Mexicana donde aparezcan los RPBI?

Existe la Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005 que establece las características, el

procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos, sin embargo estaes de carácter General, por lo que para los RPBI prevalecen las condiciones establecidas en la NOM-

087-SEMARNAT-SSA1-2002.

¿Cuál es la infraestructura para el tratamiento de los RPBI?



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A partir de la publicación de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-1995, se desarrollo la

infraestructura para el tratamiento de este tipo de residuos, con la condición de que dicha norma

establece que los residuos denominados patológicos sean incinerados, por ese motivo se incremento el

número de hornos para el tratamiento de los residuos, sin embargo han sido muchos equipos que han

cerrado por no cumplir con los parámetros establecidos en la Norma Oficial Mexicana NOM-098-

SEMARNAT-2002, Protección ambiental-Incineración de residuos, especificaciones de operación y

límites de emisión de contaminantes. Actualmente la incineración es uno de los procesos de tratamientomás observados por las asociaciones no Gubernamentales por ese motivo se concluye que las empresas

que actualmente cuentan con esta autorización son capaces de cumplir con los parámetros establecidos

en la NOM-098.



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PRÁCTICA #2MANEJO DEL POTENCIÓMETRO Y TITULACIÓN ÁCIDO BASE

OBJETIVO:

Que el alumno conozca el instrumento de medición, principios y fundamento para aplicarlo en lascaracterísticas ácido base de las soluciones.

Observar una reacción acido-base fuerte utilizando un indicador de pH y comprobar el pH de la solución

mediante el uso del potenciómetro.

INTRODUCCIÓN:

El potenciómetro, es un sensor utilizado en el método electroquímico como equipo de medición, en la

cuantificación del potencial Hidrógeno (pH) de cualquier disolución.

La determinación del pH, consiste en medir el potencial que se desarrolla a través de una fina

membrana de vidrio que separa dos soluciones, con diferente concentración de protones. En

consecuencia, se conoce la sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio ante el pH.

Un electrodo para medir el pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel (mercurio, cloruro de

mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolución en la que queremos encontrar el pH. El soporte

del electrodo es de vidrio común y no es conductor, mientras que el bulbo sensible se encuentra

formado por un vidrio polarizable (vidrio sensible de pH). Se llena el bulbo con la solución de HCl 0.1N

saturado con AgCl. El voltaje en el interior del tubo es constante (pH 7) de manera que la diferencia de

potencial solo depende del pH del medio externo. El alambre que se sumerge al interior (normalmenteAg/AgCl) permite conducir este potencial hasta un amplificador.

El pH metro es relativamente inmune a las interferencias de color, turbidez, material coloidal, cloro

libre, substancias oxidantes y/o reductoras. La medición es afectada solo cuando la superficie de la

membrana está sucia con grasa o material orgánico insoluble en agua, que le impide hacer contacto con

la muestra, por lo que se recomienda la limpieza escrupulosa de los electrodos. Los electrodos deben ser

enjuagados con agua destilada entre muestras (el uso adecuado de la pizeta es de vital importancia),

posteriormente deberá secarse el electrodo preferentemente con papel klenex o papel sanitario de

textura suave pero que no deje pelusa, nunca debe secarse con tela porque podría cargase

electrostáticamente.

Como los electrodos de vidrio de pH cuantifican la concentración de H+ relativa a sus referencias, deben

ser calibrados periódicamente para asegurar la precisión, es por eso que se utilizan soluciones

específicas llamadas buffers de calibración (disoluciones reguladoras de pH conocido). Estas soluciones

son: solución buffer (fosfato) de pH 7 color amarillo, solución buffer (biftalato) de pH 4 color rojo,

solución buffer (borato) de pH 10 color azul.

INTRODUCCION



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Es una técnica o método de análisis cuantitativo muy usada, que permite conocer la concentración

desconocida de una disolución de una sustancia que pueda actuar como ácido o base, neutralizándolo

con una base o ácido de concentración conocida.1 Es un tipo de valoración basada en una reacción

ácido-base o reacción de neutralización entre el analito (la sustancia cuya concentración queremos

conocer) y la sustancia valorante.

Un indicador de pH es una sustancia que permite medir el pH de un medio. Habitualmente, se utilizan

como indicador sustancias químicas que cambian su color al cambiar el pH de la disolución. El cambio de

color se debe a un cambio estructural inducido por la protonación o desprotonación de la especie. Los

indicadores Ácido-base tienen un intervalo de viraje de unas dos unidades de pH, en la que cambian la

disolución en la que se encuentran de un color a otro, o de una disolución incolora, a una coloreada.

Los más conocidos son el naranja de metilo, que vira en el intervalo de pH 3,1 - 4,4, de color rojo a

naranja, y la fenolftaleína, que vira desde un pH 8 hasta un pH 10, transformando disoluciones incoloras

en disoluciones con colores rosados / violetas.

Los indicadores de pH tienen una constante de protonación, K, que informa sobre el desplazamiento de

la reacción de protonación de la forma básica del indicador.

Se dice que el cambio de color de un indicador es apreciable cuando la concentración de la forma ácida

o de la forma básica es superior o igual a 10 veces la concentración de la forma básica o la forma ácida

respectivamente.

MATERIALES

2 buretas 50 mL2 Matraz erlenmeyer 150 mlHCl 0.1NNaOH 0.1NFenolftaleina



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pHmetro digital portátil Conductronic pH 10, modelo 1024, electrodo y batería cuadrada. El electrodo

debe mantenerse siempre humedecido.

MATERIALES

2 buretas 50 mL2 Matraz erlenmeyer 150 ml

HCl 0.1NNaOH 0.1NFenolftaleina

1. Calibración del pHmetro

Para su calibración a un punto:

1. Conecte el electrodo al instrumento y encienda la tecla ON.

2. Introduzca el electrodo en la solución patrón de pH 7 y permita la lectura que la lectura se estabilice(aproximadamente 30 seg).

3. Ajuste la perilla de compensación de temperatura temp oC a la temperatura de la solución patrón(buffer).

4. Ajuste la perilla de calibración calíbrate, hasta que el medidor indique el valor pH 7.0 de la soluciónpatrón (buffer).

5. Retire el electrodo de la solución patrón (buffer) y enjuáguelo muy bien con agua destilada (pizeta),pero no seque el electrodo.

6. Ajuste la perilla de compensación de temperatura temp. oC a la temperatura a la temperatura de lasolución a medir.

7. Introduzca el electrodo en la solución a medir y lea el valor pH del medidor. Si el valor de la soluciónno está entre ± 3 unidades de pH de la solución patrón (7.0 pH), se necesita hacer una calibración a

dos puntos (con dos buffers de diferente pH, 7 y 4, o 7 y 10 dependiendo de las soluciones que vayaa manejar).

8. Después de cada medición, retire el electrodo y enjuáguelo muy bien con agua destilada (pizeta)

Calibración a dos puntos

1. Siga los pasos de calibración a un punto hasta el paso 5

2. Sumerja el electrodo en la segunda solución patrón de pH 4.00 o pH 10.00. La temperatura de estasolución patrón debe ser idéntica a la de la primera

3. Ajuste el control de pendiente slope, hasta que el medidor indique el valor del pH de la segunda

solución patrón.4. Retire el electrodo, enjuáguelo con agua destilada y proceda a efectuar las mediciones. No olvide

enjuagar el electrodo muy bien con agua destilada (pizeta) después de cada medición.

Precauciones

El pHmetro debe siempre mantenerse en su estuche si no se está utilizando, con respecto al electrodo

deberá mantenerse en la solución buffer de pH 4.0, misma que se encuentra en el pequeño recipiente

en el que descansa el electrodo.



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2. Titulación ácido base

1. Verter NaOH y HCl en buretas graduadas.

2. Tomar 20 mL de HCl y colocarlo en un matraz erlenmeyer.

3. Medir el pH de la solucion un potenciómetro

4. Agregar 4 gotas de fenolftaleína y mezclar

5. Agregar gota por gota NaOH a los 20 mL de HCl siempre mezclando

6. Observar cambios de coloración.

7. Una vez obtenido el cambio de coloración del indicador de pH medir una vez más el pH de lasolución ahora titulada.

RESULTADOS

Volumen de NaOH utilizado durante la titulación de HCl_____________

Concentración de NaOH y de HCl en la solución final ______________

Establecer la relación entre el indicador de pH y el pH obtenido con el potenciómetro.



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PRACTICA # 3REACCIONES DE IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS

OBJETIVO

Al término de esta practica el alumno sera capaz de diferenciar a los aminoácidos utilizando técnicas

colorimétricas mas comunes para identificarlos, así cómo, relacionar la estructura de los aminoácidos

con su reactividad y sus funciones en el organismo.

PREREQUISITOS

1.- Conocer las caracteristicas diferenciales de la estructura de los aminoácidos.

2.- Identificar las diferencias y semejanzas de los aminoácidos con otros monómeros (por ejemplo :

carbohidratos y lípidos).

3.- Identificar las propiedades químicas en base a su polaridad.

INTRODUCCION

Los aminoácidos son los monómeros que dan la estructura de los polímeros conocidos como proteínas o

polipéptidos, 20 tipos de aminoácidos, son los principales componentes de las proteínas, los cuales

poseen las siguientes caracteristicas estructurales:

Contienen un carbón asímetrico (con excepción de la glicina) llamado carbono alfa. Al cual se le unen

cuatro radicales que son:

- un grupo carboxilo (COO-)

- un grupo amino (+NH3)

- un átomo de hidrógeno (H)

- un radical de composición variable que permite diferenciar a los aminoácidos (R). Llamado cadena

lateral.

Debido a las caracteristicas fisicoquímicas de la cadena lateral, es posible relacionar su posición, dentro

de la estructura proteíca ya que si es de caracteristicas no polares (hidrofóbico), al contacto con el agua

tenderá a esconderse; o en su defecto, si es de caracteristicas polares (hidrofílico), tenderá a

interaccionar con el agua. Desde luego, para saber cual es la estructura de la cadena lateral debemos de

conocer cual es el pH de la solución ya que dependiendo del pH la cadena lateral estará protonada (H+) o



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desprotonada, este parámetro se puede conocer utilizando los pKa de cada aminoácido y la ecuación de

Henderson-Hasselbach lo cual permite determinar cual es la estructura predominante a un pH dado.

Los cambios de carga observados en el aminoácido mostrado, dependen del pH en que se encuentre el

aminoácido, ya que como se observa en la figura anterior, bajo condiciones ácidas el aminoácido está

totalmente protonado y en condiciones alcalinas está totalmente desprotonado, esto se debe a que los

aminoácidos son ácidos débiles y por lo tanto tienen una constante de disociación por cada grupo o

radical capaz de comportarse como ácido o base débil. Esto permite conocer el punto isoelétrico de un

aminoácido, el cual se define como el pH en el cual la carga neta es cero.

Los aminoácidos que son utilizados para la síntesis de proteínas son 20, los cuales se les ha identificado

como aminoácidos naturales y los no naturales son los que aún cuando siendo aminoácidos, no forman

parte estructural de las proteínas (no están codificados en el código genético).

El cuerpo humano es incapaz de sintetizar los 20 aminoácidos requeridos para la formación de todas las

proteínas y por lo cual partiendo de esta base, los aminoácidos se dividen en : esenciales; porque es

necesario que el individuo ingiera en la dieta y no esenciales; los cuales son producidos por el propio

organismo y por lo tanto no es crítico si el individuo no los consume en su dieta. Cabe hacer notar, quelos 20 aminoácidos son importantes para el buen desarrollo del organismo.

MATERIAL.-

1.-15 tubos de ensaye5.-pipetas de 5.0 ml2.-gradilla6.-pipeta de 10.0 ml3.-pipetas de 1.0 ml7.-Bureta4.-pipetas Pasteur

METODOLOGIA

Nota.- A menos que se especifique, todos los volúmenes a añadir están dados en mililítros (ml)

Experimento No. 1

Prueba de sullivan

REACTIVOS BLANCO PATRON PROBLEMA

AGUA 0.5 ----------- --------

CISTEINA ---------- 0.5 ---------

NH4OH 2 gotas 2 gotas 2 gotas

NaCN 0.5 0.5 0.5

NITROPRUSIATO DE 2 gotas 2 gotas 2 gotas



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SODIO

Sol. Problema ------------ ---------- 0.5

Experimento No. 2

Reacción de identificación de fenoles para-sustituidos (tirosina)


AGUA 1.0 --- ---

TIROSINA --- 1.0 ---

PROBLEMA --- --- 1.0

NITROSONAFTOL 2 gotas 2 gotas 2 gotas

Mezclar y calentar en baño a ebullición durante 5 minutos.

ACIDO NITRICO 2 gotas 2 gotas 2 gotas

La aparición de un color rosa violáceo es positiva.

Experimento No. 3

Reacción de identificación de aminoácidos con ninhidrina

La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un agente oxidante que reacciona con todos los alfa

aminoácidos dando un color purpura. La prolina e hidroxiprolina da un color amarillo.


AMINOACIDO --- 1.0 ---

PROBLEMA --- --- 1.0

NINHIDRINA 1.0 1.0 1.0

AGUA 1.0 --- 1.0

Mezclar y calentar en baño de agua hirviendo durante 10 min.

La aparición de un color azul violáceo es positiva con excepción de la prolina y la hidroxiprolina.

RESULTADOS

En la siguiente tabla indicar si los resultados del problema fueron positivos o negativos.

Tubo EXP. No. 1 EXP. No. 2 EXP. No. 3



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1

2

3

4

Por lo cual concluímos que el o los aminoácidos presentes en la muestra son:______________

CUESTIONARIO

1.- Mencione 5 diferencias fundamentales tanto químicas como bioquímicas que permiten diferenciar a

los aminoácidos de los carbohidratos y de los lípidos.

2.- Existe un enorme grupo de aminoácidos no naturales, mencione 10 ejemplos e indique su

importancia bioquímica.

3.- Cómo se calcula el punto isoeléctrico de un aminoácido?

4.- Cual es el fundamento de la reacción de Pauly.

5.- Que importancia médica tiene la identificación de los aminoácidos.?

6.- Cuál es el mecanismo de identificación de aminoácidos al utilizar ninhidrina.

7.- Cuál es la función del cianuro de sodio en la reacción del nitroprusiato?



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PRACTICA # 4IIDDEENNTTIIFFIICCAACCIIOONN Y Y CCUUAANNTTIIFFIICCAACCIIOONN DDEE PPRROOTTEEIINNAASS

INTRODUCCION:

La palabra proteína proviene del griego preemintente, que significa primero. Fue

inicialmente propuesta por Berzelius en 1838 para referirse a una serie de compuestos

orgánicos con cierta complejidad, nitrogenados, que se encuentran altamente distribuidos en la

naturaleza y son la base estructural y funcional de todo organismo vivo.

Las proteínas están compuesta por aminoácidos naturales ordenados en una secuencia

discreta, y unidos entre si por enlaces peptídicos que siempre involucran radicales amino y

carboxilo de cada aminoácido de la siguiente manera:

Aminoácido 1: Aminoácido 2:

NH2-CH-COOH H-N-CH-COOH

R H R

Pérdida de Agua

Enlace peptídico:

La variabilidad de las proteínas se debe a una serie de aspectos tales como:complejidad estructural, residuos aminoácidos que la forman, propiedades químicas y físicas de

cada proteína en el organismo que la contiene.

Por tanto el análisis químico de las proteínas en base a sus propiedades es muy amplio.

Ya que la identificación de proteínas es muy importante en el campo medico, clínico y

para su investigación, existen técnicas muy utilizadas con este objetivo. En esta ocasión

consideramos algunas como: reacción de Xantoproteica, reacción con ninhidrina y reacción de

Biuret.

Reacción Xantoproteica:Esta reacción afecta la integridad estructural de los residuos aminoacídicos de las

proteínas. Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo,

cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba es específica, y da

resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos,

especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un

álcali vira a un color anaranjado oscuro (anillo por esterificación).

Reacción de Biuret:



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Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto para

su identificación, destaca la reacción de Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las

proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH

que se destruye al liberarse los aminoácidos. En el reactivo de Biuret (CuSO 4 + NaOH), el Cu,

en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos, formando un

complejo de color violeta, cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas.

Reacción con Ninhidrina: Al igual que las otras reacciones, esta forma un complejo color púrpura, para todas las

sustancias o mezclas que presentan aminoácidos. No es específica como las anteriores, pero

es de gran ayuda para la identificación “primaria” de proteínas, que después nos lleven a

realizar más pruebas de identificación ya específica.

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es también una técnica

de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta,

cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el

diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos sebasan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la

formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos

colorantes. En la Tabla I se recogen los métodos más usados así como algunas de sus

ventajas e inconvenientes.

Tabla I. Principales métodos para la cuantificación de proteínas, principales ventaja e

inconvenientes

Método Ventajas Inconvenientes

Método s d e Ab so rc ión No se pierden las muestras Interfieren muchoscompuestos que absorben enel UV

Méto do s Der iv ados Col or imétr ic os

Biuret Bastante específico paraproteínasMuestra pocas interferenciasEs barato

Tiene poca sensibilidad

Lowry Tiene bastante sensibilidad No todas las proteínasreaccionan igualMustra muchas interferenciascomo detergentes no iónicos,sulfato amónico etc.

Bradford Muy sensible Muestra interferencias condetergentes

BCA Es el método mas sensibleEs el que muestra menos interferencias

Méto do s Der iv ados Flu or imétr ic os

o-ftalaldehido Muy sensible La interferencia de aminascontaminantes en la muestraNo todas las muestrasreaccionan igual



19

En esta práctica para la cuantificación de proteínas por el metodo de Biuret, se realizara: una

curva estándar, el cálculo del coeficiente de extinción y el rango de sensibilidad. Se realizará la

cuantificación de dos muestras problemas de baja y alta concentración, respectivamente, y se

discutirá las ventajas e inconvenientes de cada uno de los métodos.

OBJETIVO:

Identificar proteínas por la presencia de enlaces peptídicos y grupos aromáticos, y

cuantificarlas mediante la técnica de Biuret.

MATERIAL:

- 15 tubos de ensaye

- 1 gradilla- 5 pipetas de 1.0mL- 4 pipetas Pasteur- 2 pipetas de 5.0mL- 1 pipeta de 10.0mL- 1 bureta

METODOLOGIA:

Experimento No. 1: Identificación de proteínas

A) Reacción de Ninhidrina

Los estándares utilizados para esta prueba serán Peptona, Gelatina, Albúmina y

Tirosina. Tomar estándares en tubos limpios y etiquetados.

Colocar las cantidades indicadas de estos éstandares y de ninhidrina en tubos por

separado, como se muestran en el siguiente cuadro:

Tubo Estandar (mL) Agua Dest. (mL) Ninhidrina (mL)

1 0.5 peptona - 0.5

2 0.5 gelatina - 0.5

3 0.5 albúmina - 0.5

4 0.5 tirosina - 0.5

5 (blanco) - 0.5 0.5

Se dejan reposar las soluciones de cada tubo por 10 minutos para leer resultados.



20

B) Reacción Xantoprotéica

Colocar los mismos estándares de la prueba anterior en tubos por separado, como lo

indica el siguiente cuadro:

Tubo Estandar (mL) Agua Dest. (mL) HNO3 (mL)

1 0.5 peptona - 0.5

2 0.5 gelatina - 0.5

3 0.5 albúmina - 0.5

4 0.5 tirosina - 0.5

5 (blanco) - 0.5 0.5

Las soluciones anteriores, se llevan a ebullición por 5 minutos en baño maría

previamente preparado en estufa.

Se deja reposar y enfriar por 10 minutos y se le agregan a todos los tubos algunas gotas

de NH4OH por estratificación para observar los cambios de color y en algunos casos la

formación de anillo de interfase.

C) Reacción de Biuret.

Colocar los mismos estándares de la prueba anterior en tubos por separado, como lo indica el

siguiente cuadro:

Tubo Estandar (mL) Agua Dest. (mL) Reactivo de Biuret

1 1 peptona - 1

2 1 gelatina - 1

3 1 albúmina - 1

4 1 tirosina - 1

5 (blanco) - 1 1

Experimento II . Curva de calibración y cuantificación de proteínas por el método de Biuret.

1.-.Tomar 1 mL de cada solución estpándar de albúmina (0, 1, 2, 5 y 10 mg/mL ) y

colocarlos en tubos limpios y etiquetados (5 tubos).

2.- Tomar 1 mL de cada muestra problema y colocarlos en otros tubos.



21

3.- Agregar a cada tubo 1 mL de reactivo de Biuret.

4.- Colocar en reposo durante 15 minutos, a temperatura ambiente, esperando el

cambio de color.

5.- Medir en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595nm, utilizando como

blanco agua destilada.

6.- Con las absorbancias medidas para cada uno de los estándares de calibración,

realizar una curva de calibración que será utilizada para determinar la concentración de las

muestras problema.

RESULTADOS:

Se reportan los resultados de las pruebas de Ninhidrina, Xantoproteica, y Biuret, como

la descripción de los cambios de colores en las soluciones de la siguiente forma: (++) color

intenso, (+) cambio ligero, y (-) sin formación de color. Indicar que significa el cambio de color

en cada reacción.

Se reportara una gráfica en la que se presenten las distintas concentraciones de

albúmina (estándares) contra la absorbancia que presentan de modo que se obtenga una curva

de calibración. Incluya una tabla con los valores de absorbancia de cada estándar y muestra

problema.

Utilizar esta curva para determinar las concentraciones de las soluciones problema con

su respectivo porcentaje de error:

CUESTIONARIO:

1) Describir y explicar mediante un esquema la reacción entre el reactivo de Biuret y los

enlaces peptídicos.

2) Investigue otros dos métodos empleados comúnmente para cuantificar proteínas. Diga cual

es el rango de concentraciones en el que se utilizan estos dos métodos, así como el método de

Biuret. ¿Cuál de los tres métodos es el mas sensible?

3) Explique por qué razón en la presente práctica se utilizó una curva de calibración de

albúmina para luego cuantificar muestras problema que no contenían albúmina.



22

PRÁCTICA # 5ANALISIS ENZIMATICO CUALITATIVO

OBJETIVO:

Al término de esta práctica, el alumno será capaz de definir el efecto fisicoquímico que generan las

enzimas sobre diferentes sustratos. Indicando además, las propiedades químicas que permiten que un

enzima, catalize la modificación de un sustrato

PREREQUISITOS:

1. Definición de enzima, substrato, apoenzima, holoenzima, proenzima, zimógeno, coenzima,cofactor.

2. Determine lo que significa: especifidad enzimática y alosterismo.3. Defina el efecto de una hidrolasa, oxidoreductasa, transferasa, liasa, ligasa e isomerasa.

INTRODUCCION:

Todos los organismos vivos pueden obtener y gastar la energía muy rápidamente, debido a la presencia

de catalizadores biológicos llamadas enzimas. Al igual que los catalizadores inorgánicos; las enzimas

modifican la velocidad de una reacción química sin afectar el equilibrio final y sólo se requieren

pequeñas cantidades para efectuar la transformación de un gran número de moléculas de sustrato. Sin

embargo, a diferencia de la mayoría de los catalizadores inorgánicos las enzimas son bastante

específicas ya que catalizan un número comparativamente pequeño de reacciones; en algunos casos,

tan solo una reacción , así mismo las enzimas funcionan solo bajo condiciones muy definidas de pH,

temperatura, concentración de sustrato, coenzimas etc.

Estas condiciones se ilustran en algunos de los experimentos que se tienen determinados en este tema.

Las enzimas se designan y se clasifican de acuerdo con el tipo de reacción que catalizan; los 6 gruposprincipales de enzimas son: Oxidoreductasas, Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas, Ligasas o

Sintetasas.

MATERIAL:

1.- 6 tubos de ensaye2.- 3 pipetas de 1.0 ml3.- 2 pipetas de 5.0 ml4.- 2 pipetas Pasteur5.- 2 gradillas6.- Tapones de algodon

METODOLOGIA.-

Experimento No. 1

EFECTO DEL CALOR SOBRE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS. "ACTIVIDAD DE LA UREASA"

Tubo 1 2 3

Semilla de Vegetal pizca pizca pizca



23

Agua 0 5.0 5.0

Mezclar para tratar de homogenizar el polvo de sandia y enseguida coloque un tapón de algodón a los

tubos 1 y 2 y colóquelos en baño a ebullición durante 20 minutos. (cuidar que no se acabe el agua del

baño,)

Agua 5.0 0 0

Azul de Bromotimol 2 Gotas 2 Gotas 2 Gotas

Añadir ácido débil (GOTAS) en caso de que la solución tenga un color azul.

Urea 5.0 5.0 5.0

Mezclar y tomar el tiempo que transcurre hasta alcanzar el vire de color amarillo a azul en cada uno de

los tubos.

Experimento No. 2

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE RENINA.

Tubo 1 2 3

Leche 3.0 3.0 3.0

Oxalato de Amonio 0 0.5 0.5

Solución renina 3 Gotas 3 Gotas 3 Gotas

Mezclar e incubar a 37°C durante 10 minutos y anotar los cambios observados en cada uno de los tubos.

Calentar el tubo No. 2 a ebullición y enfriar.

Cloruro de Calcio 0 10 Gotas 10 Gotas

Mezclar y comparar los cambios observados en los tubos No 2 y 3 con el 1.

CUESTIONARIO:

1.- Deacuerdo a la clasificación enzimática a que clase pertenecen las enzimas utilizadas (renina y

ureasa) y porqué?

2.- Mencione 3 bacterias que contengan la enzima ureasa:

3.- Qué grupos químicos participan en el sitio activo de las enzimas ?

4.- Las enzimas cambian la constante de equilibrio de las reacciones que catalizan ? si, no ; porqué?

5.- Porqué algunas proteínas actúan como catalizadores (enzimas) de reacciones con alta especificidad,

mientras que otras proteínas que también contienen aminoácidos en su estructura no lo hacen?



24



25

PRÁCTICA # 6EXTRACCIÓN DE GLUCOGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO.

a) Desarrollar una técnica de extracción de glucógeno a partir de tejido hepático de conejo o rata y

determinar la calidad del glucógeno obtenido por medio de reacciones cualitativas de

caracterización.

b) Conocer las técnicas de análisis cualitativo que permiten identificar carbohidratos y su

utilización como herramienta de trabajo en ciertos experimentos.

PREREQUISITOS.

1. Identificar la composición del glucógeno y sus diferencias estructurales y funcionales con elalmidón.

2. Diferenciar los efectos sobre el metabolismo del glucógeno de las siguientes hormonas :Insulina, Glucagón y Adrenalina

3. Identificar las características de por lo menos tres enfermedades por almacenamiento deglucógeno.4. Definir el término carbohidrato.5. Diferenciar los tipos de carbohidratos y mencionar ejemplos.6. Identificar las propiedades químicas de los carbohidratos.

INTRODUCCIÓN.Los carbohidratos son derivados aldehídicos o cetónicos de alcoholes superiores polivalentes ( más de

un OH). se clasifican en base al número de moléculas que los componen. Monosacáridos (azúcares

simples) no se pueden hidrolizar en moléculas más sencillas, pueden subdividirse en triosas, tetrosas,

pentosas, hexosas etc. según el número de átomos de carbono que tengan. Las siguientes reacciónes

permiten identificar de manera cualitativa la presencia de cierto tipo de azucares en una muestraproblema y se utilizan en la práctica tanto clínica como vegetal.

Muchas de las pruebas que se estudiarán en el laboratorio requieren tiempo para que aparezca un

precipitado o se desarrolle un color. La mayaría de las reacciones son muy sensibles, por lo que el uso de

reactivos en cantidades mayores pueden conducir a interpretaciones erróneas.

El glucógeno es un polisacárido ramificado constituído de moléculas de alfa d-glucosa unidas por enlaces

glucosídicos. Es el único polisacárido que se produce y se almacena en el humano, siendo el hígado el

principal promotor de la glucogénesis que es la vía metabólica de dicho polisacárido.

Todas las células del organismo son capaces de producir glucógeno y la capacidad de síntesis de cadacélula estará dada por la cantidad de enzima glucógeno sintetasa que presenta. El hepatocito, por lo

tanto, es la célula que mayor cantidad de glucógeno sintetasa presenta.

Desde el punto de vista energético, éste polisacárido es importante ya que por ser una fuente

almacenadora de glucosa es factible que se pueda utilizar cuando el organismo así lo requiera mediante

una vía de hidrólisis del glucógeno que se conoce como glucogenolisis.



26

Tanto en la glucogénesis como la glucogenolisis son vías reguladas hormonal y alostéricamente. La

insulina promueve la actividad de la glucogénesis y en forma directa sobre la glucógeno sintetasa y la

adrenalina activa en forma indirecta a la glucogenólisis e inhibe de la misma forma a la glucogenesis esto

es , induce la formación de AMP-Cíclico para que este a su vez active a la glucogeno-fosforilasa e inhiba

a la glucógeno sintetasa.

El mecanismo de regulación es complejo y algunas veces puede fallar a tal grado que altera el

almacenamiento de glucógeno y generar estados patológicos llamados glucogénosis, algunos de los

cuales pueden llegar a ser fatales tales como las enferedades de Von-Gierke, Andersen, de Pompe, Mc.

Ardle, Hers, etc. Estas enfermedades se caracterizan por presentarse debido a una deficiencia congénita

de algunas de las enzimas arriba mencionadas y otras relacionadas con ellas.

MATERIAL.

1. 6 Tubos de ensaye 15 X 150 mm2. 1 Mortero con pistilo3. 2 Pipetas de 1.0 ml.4. 1 Pipeta de 5.0 ml.

5. 1 vaso de precipitados6. Gradilla.7. Vidrio de reloj

8. Balanza granataria9. Probeta de 100 ml.10.- Baño de agua a ebullición11 Tubos de ensaye

12.- 2 Pipetas de 1.0 ml13.- Pipeta de 5.0 ml14.- Gradilla

METODOLOGIA:

Extracción de Glucógeno

1. Pesar 5g de hígado y cortarlo en trozos pequeños (utilizar el vidrio de reloj).2. Colocar unos trozos en un mortero frío al cual se le añade TCA al 10 % en proporción de 1.0 ml

por cada gramo de tejido y una pizca de arena lavada.3. Centrifugar 5 min. a 2000 r.p.m.

4. Recuperar el sobrenadante en un tubo de ensaye grande y medir el volúmen.5. Añadir 2 volúmenes de alcohol al 95 % por volúmen de sobrenadante agitando lentamentehasta que el glucógeno flocule.

6. Centrifugar a 2 000 r.p.m. 5 Min.7. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 4.0 ml. de agua destilada.8. Utilizado la suspensión de glucógeno como muestra problema, desarrolle las técnicas de Fehling

,Lugol y Molish al mismo tiempo que los carbohidratos proveídos por el profesor.

EXPERIMENTO # 1

REACCION DE FEHLING (IDENTIFICACION DE COMPUESTOS REDUCTORES )Esta reacción nos identifica carbohidratos con capacidad reductora, se basa en que algunos azúcares en

un medio fuertemente alcalino y en presencia de oxígeno o de diversos agentes oxidantes ej. Cu, Ag dan

las reacciones de reducción que dependen de la existencia de un grupo carbonilo libre como en la

glucosa, galactosa, fructosa, maltosa y lactosa. Si la prueba se efectúa con una solución que contenga

cloroformo como conservador, puede obtenerse un resultado positivo, sin que exista azúcar, las sales de

amonio también interfieren en la reacción. Si la solución problema es ácida debe neutralizarse antes de

efectuar la prueba.



27

Fundamento: si calentamos una solución de Cu(OH)2 en un medio alcalino formamos oxido cúprico

(negro) CuO y en presencia de sustancias reductoras se precipita como oxido cuproso Cu2O de color

café rojizo pardo .

Solucion A contiene sulfato de cobre .

Solucion B contiene tartrato de sodio y potasio e Hidroxido de potasio .

METODO

MUESTRA (carbohidratos señalados y glucógeno) 1.0 ml.SOL. DE FEHLING A 0.5 mlSOL. DE FEHLING B 0.5 ml.MEZCLAR Y CALENTAR A BANO DE EBULLICION 5 MIN. COLOR ROJO ES POSITIVO.

EXPERIMENTO # 2

REACCION DE MOLISH-UDRANSKY .Esta prueba es positiva con aldehidos y algunos ácidos como el fórmico, oxálico, láctico, cítrico, etc. Esta

reacción es muy sensible , dicha sensibilidad para la glucosa es de hasta 0.001% y para sacarosa de0.0001%.

METODO

MUESTRA (carbohidratos señalados y glucógeno) 1.0 mlReactivo de Molish 3 GOTAS

Mezclar y añadir 0.5 ml de ácido sulfúrico concentrado ( resbalando por la pared del tubo ) NO

mezclar.

La aparición en la interfase de un anillo violáceo es indicativo de que la prueba resultó positiva.

EXPERIMENTO # 3

REACCION DE SELIWANOFF

Está reacción permite diferenciar Aldosas de Cetosas. Anote el tiempo en el cual aparece el color en

cada uno de los tubos. Una reacción positiva está dada por la aparición de un color rojo. Es utilizada

para diferenciar Cetosas de Aldosas ( Reacción de Seliwanoff )

METODO

MUESTRA (carbohidratos señalados y glucógeno) 1.0 mlREACTIVO DE SELIWANOFF 5.0 ml

Mezclar y calentar en baño de ebullición durante 1 minuto, anote el resultado.

Las cetosas dan un color rojo y las aldosas dan la prueba débil y lentamente.

EXPERIMENTO # 4

REACCION DEL YODO O LUGOL



28

Esta reacción identifica los polisacáridos como Amilosa, Amilopectina, Glucogeno, Almidon formando

un complejo adsortivo entre el Iodo y las cadenas helicoidales del polisacárido (enlaces alfa 1,4

glucosídicos y enlaces alfa 1,6 glucosídicos de por lo menos 8 residuos de glucosas ) .

METODO.

MUESTRA (carbohidratos señalados y glucógeno)………… 1.0 ml.

LUGOL ………… 3 GOTAS

Mezclar y si es necesario calentar 2 segundos en baño de ebullición.

La aparición de un color azul o violeta indica la presencia de un polisacarido.

RESULTADOS

FEHLING LUGOL MOLISH

MUESTRA

GLUCÓGENO

AGUA

CUESTIONARIO1. Mencione las diferencias en las propiedades químicas de los monosacáridos con los aminoácidos

y los lípidos.

2. Mencione 3 funciones fundamentales de los carbohidratos en la célula, ejemplificando en cada

caso.

3. Mencione 2 homopolisacaridos y 3 heteropolisacaridos y su composición, indicando también los

tipos de enlaces que presentan.

4. Defina y ejemplifique con carbohidratos los siguientes conceptos: Isomería óptica, Anomerismo,Epimerismo.

5. Explique el mecanismo de acción de los segundos mensajeros en la regulación hormonal y

enzimática del metabolismo del glucógeno.

6. Describa las implicaciones bioquímicas que se presentan en la enfermedad de Von Gierke

7. Describa dos eventos bajo los cuales se puede activar la vía de la glucogenolisis.



29

PRÁCTICA # 7CUANTIFICACION DE COLESTEROL SERICO

OBJETIVO:

Determinar la concentración de colesterol sérico y analizar las implicaciones clínicas de niveles

anormales de colesterol.

PRE-REQUISITOS.

1. Estructura, función y tipos de colesterol2. Relación metabólica entre el colesterol y las lipoproteínas3. Análisis de la digestión del colesterol esterificada y no esterificado4. Relación de las Lipoproteínas plasmáticas con la Aterogénesis.

INTRODUCCION.

El colesterol es uno de los lípidos que se encuentran en mayor concentración en la sangre, se puede

afirmar que la fracción lipídica del colesterol, es la segunda en cuanto a concentración y ésta se localiza

principalmente formando parte de las lipoproteínas. Químicamente el colesterol es un compuesto

cíclico con estructura básica de perhidrofenantreno con un total de 27 carbones, un radical OH en el

carbono 3 y un doble enlace entre los carbonos 5 y 6.

El colesterol existe en dos formas: como colesterol libre en muy pequeñas cantidades y como colesterol

esterificado mediante la unión de un ácido graso no saturado de cadena media al carbono 3. Este tipo

de colesterol es el más frecuente tanto en sangre como en tejidos.

La mayor parte de colesterol que existe en el organismo es sintetizado en el hígado, ésto implica que el

colesterol exógeno tenga menor importancia metabólica. La síntesis de colesterol endógeno es activada

en primera instancia ante el excedente de Acetil-S-CoA que haya en el hepatocito, ya que éste funciona

como metabolito precursor y en segunda instancia ante la presencia de efectores hipercolesterolémicos

que aumentan la síntesis de colesterol o bién disminuyen el catabolismo del colesterol ya formado. El

colesterol exógeno se reduce en el intestino por medio de enzimas bacterianas para dar lugar al ß

colestanol y así entra a la sangre en pequeñas concentraciones, otra parte del colesterol exógeno se

convierte en un producto de excresión llamado coprostano que se libera con las heces.

El colesterol endógeno con frecuencia se cataboliza en el hígado y en otros órganos. El 7-

dihidrocolesterol se obtiene por oxidación del colesterol; éste compuesto predomina en la piel y enpresencia de radiación ultravioleta se convierte en colecalciferol que es una de las formas de vitamina D.

Otros productos del catabolismo del colesterol son los ácidos biliares que en general se deben a una

carboxilación de la cadena lateral del colesterol y ésta reacción sucede en el hígado. Entre los ácidos

biliares más comunes está el ácido cólico, el ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico y el ácido

litocólico. Por último, otros metabolitos son la progesterona y los esteroides corticales, así como

hormonas androgénicas y estrogénicas.



30

METODOLOGIA

Fundamento químico : Esta técnica se basa en utilizar los derivados polienos del colesterol como

elementos cromóforos( que dan reacción de color). En presencia de ácido sulfúrico concentrado yanhídrido acético ( reactivo de colesterol) se producen diferentes tonalidades de color verde cuya

tonalidad es proporcional a la cantidad de colesterol presente en la muestra. Los polienos son

estructuras cíclicas que resultan de la oxidación del colesterol.

La cuantificación de HDL colesterol se determina por métodos de precipitación en los cuales la

formación de complejos insolubles se debe a interacciones entre los grupos cargados negativamente de

los polianiones y los grupos positivos de las subunidades proteicas de las lipoproteínas

TECNICA: preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro.

REACTIVOS Colesterol HDL Patron o Estandar BlancoSUERO 0.05 ml. -- -- --

SOL. PATRON -- -- 0.05 ml. --

AGUA -- -- -- 0.05 mL

SOBRENADANTE* -- 0.05 ml -- --

REACTIVO DECOLESTEROL

2.0 ml. 2.O ml 2.0 ml. 2.0 ml

*NOTA: Para adquirir sobrenadante: A 0.5 ml de suero, agregar 0.05 ml de Reactivo precipitante de

HDL-COLESTEROL, mezclar, reposar 5 minutos y centrifugar 5 min a 3000 rpm.

Mezclar y dejar que se lleve a cabo la reacción durante 20 minutos a temperatura ambiente y añadiren forma directa sobre la superficie del líquido 0.20 ml. de Acido sulfúrico concentrado.

Colocar los tubos por separado inmediatamente despues de la adición del ácido sulfúrico en un baño de

agua a temperatura ambiente y agitar suavemente. Se deben mantener los tubos en baño de agua

mínimo 5.0 minutos.

Leer la absorbancia del problema y el patrón ajustando a cero con el tubo blanco a una longitud de onda

de 640nm.

CALCULOS:

[Colesterol Total] = Abs. problema / Abs. del Patrón X [ conc. patrón mg/dl ]

[ HDL-COLESTEROL ] = Abs problema / abs patrón x [ conc. Patrón]



31

PRÁCTICA # 8METABOLISMO ANAEROBIO: REACCIÓN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA

OBJETIVO:

Analizar la actividad de una enzima clave del metabolismo anaerobio y su dependencia de la presenciade nicotinamida adenin dinucleótido (NAD).

PRERREQUISITOS:

1.- Identificar las reacciones metabólicas del metabolismo aerobio y anaerobio de los carbohidratos.2.-Identificar el papel del NAD en ambas rutas.

INTRODUCCION:

La mayoría de las manifestaciones metabólicas de un organismo, se relacionan con cambios de energía,

la cual se obtiene por la oxidación sistemática de los nutrientes y esto es debido a que en los procesos

de oxidorreducción hay transferencias de energía generadas por diferencias en el potencialelecroquímico. Un sistema de potencial elevado, oxida al de más bajo potencial con la consiguiente

liberación de energía para las necesidades vitales.

En todas las reacciones de oxidorreducción, existe transferencia de electrones. La oxidación se define

como: la pérdida de electrones por parte de un compuesto, mientras que la reducción es la ganancia de

dichos electrones por otro compuesto. Por lo tanto, la oxidación y la reducción son fenómenos que se

realizan en forma simultánea.

La oxidación biológica implica transferencia de hidrógenos y electrones a través de una serie de sistemas

enzimáticos que actúan como intermediarios, para llegar al aceptor final que es el oxígeno. El proceso

oxidativo se inicia por la oxidación de una deshidrogenasa específica que no reacciona directamente conel oxígeno, sino que requiere intermediarios como el NAD, las flavoproteínas y los citocrómos.

Piruvato Lactato

En el presente experimento, se pretende realizar un estudio cualitativo, donde se utilizará la

deshidrogenasa láctica de músculo de rata; que sólo es activa en estado de anaerobiosis y requiere NAD

como intermediario para completar su actividad, la cual se manifiesta en la siguiente reacción:

Con este experimento se pretende demostrar que: Si la LDH es una enzima que funciona normalmente,

en base a la concentración de NAD y anerobiosis promoviendo la reducción del piruvato en presencia de



32

NADH + H+; entonces, aumentando la concentración de NAD+ podemos revertir la reacción para oxidar

al lactato y generar NADH + H+ el cual reccionará con el azul de metileno y provocará su decoloración. Si

esta premisa se cumple se habrá demostrado que la concentración de la coenzima puede regular la

dirección de la actividad de una enzima reversible.

MATERIAL :

1. 4 tubos de ensayo de 20 x 150 mm.2. 3 pipetas de 5.0 ml.3. 1 pipeta de 2.0 ml.4. 1 pipeta de 1.0 ml.5. 2 vasos de precipitado de 150 ml.6. 1 matraz erlenmeyer de 125 ml.7. 1 mortero con pistilo.8. 1 baño María ajustado a 37°C.9. Arena lavada. (agente triturante).10. NaCl al 0.9% (solución isotónica para suspender células)11. KCN al 0.5% (inhibidor de las deshirogenasas mitocondriales).

12. Lactato de sodio al 1.0%.(substrato de la LDH).13. Azul de metileno 0.002 M.(indicador redox que reacciona con NAD).14. Aceite mineral. (compuesto que al sellar los tubos promueve la anaerobiosis).

METODOLOGIA :

Preparación de la enzima LDH:

1. Colocar 5 gr de músculo de res en un mortero previamente sumergido en hielo y añadir NaCl al0.9% (10 ml. por gramo de tejido) y agregar un poco de arena. Triturar perfectamente.

2. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 minutos.3. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y recuperar el sobrenadante etiquetándolo como LDH.

Preparación de la coenzima NAD:

1. Obtener otros 3 gr. de tejido muscular.2. Cortar el músculo en fragmentos más pequeños y ponerlo en agua a ebullición por 5 minutos en

un matraz Erlenmeyer de 125 ml. en una proporción de 8 ml. de agua por gramo de músculo.3. Pasar la preparación a un mortero con un poco de arena y triturar perfectamente.4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como NAD.

Preparación de la enzima DSC a partir de músculo cardiáco

1. Tomar de 2 a 3 g de músculo de corazón cortarlo en fragmentos pequeños.

2. Colocar el tejido en un mortero previamente sumergido en hielo y añadir NaCl al 0.9% enuna proporción de 10 ml. por gramo de músculo, agregar un poco de arena lavada y triturarperfectamente.

3. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 min.4. Centrifugar el homogeneizado a 3000 rpm por 15 min. Recuperar el sobrenadante y

etiquetarlo como DSC.

Detección de la actividad enzimática de LDH:



33

Preparar una serie de cuatro tubos de ensayo como se indica a continuación:

NOTA: se debe tener precaución al utilizar el KCN ya que es altamente tóxico. utilice bureta.

TUBO 1 2 3 4

KCN 0.5% 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

Lactato de Sodio al

1.0%

1.0 ml 1.0 ml --------- 1.0 ml

Azul de metileno

0.002 M

0.3 ml 0.3 ml 0.3 ml 0.3 ml

Agua destilada 1.0 ml ---------- 1.0 ml 1.0 ml

Coenzima ( NAD ) -------- 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

Enzima ( LDH ) 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml ---------

Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar 1.0 ml. de aceite mineral, evitando mezclarlos.

Incubar en baño de agua a 37°C los tubos MANTENIENDOLOS INMOVILES y observar los grados de

decoloración de cada solución. Hacer estas observaciones en intervalos de 15 minutos durante 45

minutos.



RESULTADOS :

TUBO 1 2 3 4

15 min

30 min

45 min

DISCUSION:

1.- Relacione el efecto de cada reactivo con los resultados obtenidos.

2.- Determine si los resultados que obtiene son acordes con los esperados.

3.- Explique el fundamento químico de la reacción entre el azul de metileno y el NAD.

4.- Mencione los errores, si es el caso, en el planteamiento o en el manejo del experimento que

pudieran modificar los resultados.

CUESTIONARIO:

1.- Mencione las diferencias entre una enzima y un cofactor.

2.- Explique cual es el efecto del oxígeno en la actividad de las oxidasas.

3.- Mencione cinco coenzimas que actúen con transferasas.

4.- Explique la relación que existe entre algunas coenzimas y las vitaminas del complejo B.

5.- Describa la función del fosfato de piridoxal en la reacción que cataliza la enzima transaminasa

glutámico oxaloacética (GOT).

practicas bioquimica general-2012 uacj

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