manual practicas bioquimica

BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. LUPE JIBAJA

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

PRACTICAS DE BIOQUIMICA

CARBOHIDRATOS; PROTEINAS Y LIPIDOS.

2007-2008

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INDICE DE CONTENIDOS

CAPÍTULO I_________________________________________________________________1

1. CARBOHIDRATOS______________________________________________________1

1.1 Reacciones de reconocimiento De hidratos de carbono____________________________11.1.1 Reacción con α-naftol_____________________________________________________________11.1.2 Prueba con naftorresorcina_________________________________________________________2

1.2 Reacciones de reconocimiento de hidratos de carbono reductores__________________31.2.1 Prueba con el hidróxido___________________________________________________________31.2.2 Reacción con el licor de Fehling_____________________________________________________41.2.3 Reacción con sales de bismuto Nylander______________________________________________51.2.4 Reacción con Fenilhidrazina________________________________________________________61.2.5 Reconocimiento de la fructosa en una disolución (reacción de A.F. Selivánov)_______________101.2.6 Reacción de reconocimiento de las pentosas con orcina_________________________________101.2.7 Reacción con floroglucina_________________________________________________________111.2.8 Reacción de reconocimiento de la desoxirribosa_______________________________________12

1.3 Disacáridos_______________________________________________________________121.3.1 Reacción de reconocimiento de la sacarosa___________________________________________121.3.2 Reacciones de reconocimiento de la maltosa y lactosa___________________________________131.3.3 Reacciones de reducción de iones metálicos__________________________________________141.3.4 Reacción con la fenilhidrazina_____________________________________________________14

1.4 Polisacáridos_____________________________________________________________151.4.1 Almidón_______________________________________________________________________15

CAPÍTULO II______________________________________________________________19

2 LOS LÍPIDOS Y SUS METABOLITOS______________________________________19

2.1 Reacciones de reconocimiento de las grasa_____________________________________192.1.1 Reacción de la grasa y el aceite con el Sudán III_______________________________________192.1.2 Determinación de la glicerina en las grasas___________________________________________192.1.3 Solubilidad de las grasas__________________________________________________________202.1.4 Determinación de las constantes de la grasa___________________________________________212.1.5 Determinación de la temperatura de fusión___________________________________________212.1.6 Determinación del número acídico__________________________________________________232.1.7 Determinación del índice de iodo___________________________________________________242.1.8 Determinación del número (índice) de saponificación___________________________________252.1.9 Emulsificación de las grasas_______________________________________________________272.1.10 Hidrólisis de los glicéridos con lipasa_____________________________________________28

2.2 Fosfolípidos______________________________________________________________302.2.1 Aislamiento de los fosfolípidos_____________________________________________________302.2.2 Aislamiento de las lecitinas de la yema de huevo_______________________________________302.2.3 Detección de los ácidosgrasos superiores_____________________________________________30

CAPÍTULO III______________________________________________________________32

3 PROTEINAS___________________________________________________________32

3.1 Reacciones De Reconocimiento De Las Proteínas_______________________________32

3.2 Reacciones De Precipitación De Las Proteínas_________________________________32

2


3.2.1 Salificación de las proteínas_______________________________________________________323.2.2 Precipitación de las proteínas con sulfato amónico._____________________________________343.2.3 Precipitación de las proteínas con cloruro sódico y sulfato de magnesio_____________________353.2.4 Purificación de las proteínas de los cristaloides con método de diálisis._____________________363.2.5 Precipitación de las proteínas con iones de metales pesados.______________________________373.2.6 Precipitación de las proteínas con ácidos minerales.____________________________________383.2.7 Precipitación de las proteínas con ácidos orgánicos.____________________________________393.2.8 Precipitación de las proteínas con alcohol y acetona____________________________________40

3.3 Reacciones de reconocimiento de las proteínas_________________________________413.3.1 Descubrimiento de los enlaces peptídicos en las moléculas de proteínas (reacción del biuret)____423.3.2 Reacción con el ácido pícrico______________________________________________________44

3.4 Reacciones De Reconocimiento De Los Aminoacidos__________________________453.4.1 Reacción del triptófano___________________________________________________________453.4.2 Reacción de la arginina___________________________________________________________463.4.3 Reacción de los aminoácidos que contienen azufre_____________________________________473.4.4 Reacción de reconocimiento del glutatión____________________________________________483.4.5 Diazorreacción de reconocimiento de la tirosina, el triptófano y la histidina__________________503.4.6 Descubrimiento del componente de hidrato de carbono en las proteínas_____________________51

3.5 Proteínas conjugadas______________________________________________________513.5.1 Aislamento de la desoxirribonucleoproteina___________________________________________513.5.2 Obtención de la nucleoproteína a partir de la levadura___________________________________533.5.3 Hidrólisis de la nucleoproteína_____________________________________________________543.5.4 Detección de las proteínas sencillas_________________________________________________543.5.5 Detección de las pentosas_________________________________________________________55

3.6 Glicoproteínas____________________________________________________________563.6.1 Aislamiento de la mucina de la saliva________________________________________________56

3.7 Métodos de determinación de la cantidad de proteínas en los tejidos y de algunos productos de su metabolismo______________________________________________________57

3.7.1 Determinación cuantitativa de la proteína mediante la reacción del biuret______________583.7.2 Determinación cuantitativa de la proteína en los líquidos biológicos con ayuda del ácido nítrico 583.7.3 Determinación cuantitativa de la proteína según el método de Lowry_______________________60

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CAPÍTULO I

1. CARBOHIDRATOS

1.1 Reacciones de reconocimiento De hidratos de carbono

1.1.1 Reacción con α-naftol

Esta reacción es general para hidratos de carbono y se aplica para detectar la

presencia de estos en los materiales biológicos. El quimismo de la reacción se

reduce al hecho de que mediante la acción del ácido sulfúrico concentrado se forma

furfural a partir de las pentosas; 5-hidroximetilfurfural a partir de las hexosas;

Furfural 5-Hidroximetilfurfural

Al combinarse los últimos con α-naftol surge una coloración violeta característica y al

combinarse con timol, una coloración roja.

Instrumentos.- Soporte con tubos de ensayo

Reactivos.- Α-naftol, disolución al 0,2% . Timol, disolución al 1% en alcohol etílico.

Ácido sulfúrico. Sacarosa, disolución al 1%.

Marcha de los trabajos.- En dos tubos de ensayo se vierten 2 ml de disolución de

sacarosa en cada uno. En el primer tubo de ensayo se añaden de 4 a 6 de disolución

Bibliografía: Chechetklin. A.V.; “Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral”; Editorial Mir Moscú;

4

H

O

O

C

C

C

C

C

H

O

C

C

C

C

C

H2CHO C


de α-naftol y en otro, igual cantidad de disolución de timol. En ambos tubos de

ensayo se vierten con cuidado, por la pared, 1 o 2 ml de ácido sulfúrico concentrado

sin mezclarlo con la capa acuosa. En el contacto con las capas aparece una

coloración violeta (en el caso de α-naftol) y roja (en el caso de timol).

1.1.2 Prueba con naftorresorcina

La reacción se basa en la capacidad de los hidratos de carbono de condensarse con

los sistemas aromáticos, formando sustancias coloreadas. Así, al ácido glucorónico

al condensarse con naftorresorcina, forma derivados de dinaftilmetano o xantina.

Instrumentos.- Soporte con tubos de ensayo.

Reactivos.- Glucosa, disolución al 5%. Naftorresorcina, disolución alcohólica al 1%.

Acido clorhídrico concentrado. Éter. Benceno.


5

HO

C

C

C

C

C

C

CC

CC OH

2 +

C

O

H

(CHOH)4

C

OH

O

C

C

C

C

C

C

CC

C

C

C

C

C

C

C

C

C

CC

C

C

(CHOH)4

CO

OH

OH HOHO OH

C

C

C

C

C

C

CC

C

C

C

C

C

C

C

C

C

CC

C

C

(CHOH)4

CO

OH

OOHHO


Marcha de los trabajos.- En el tubo de ensayo se vierten de 5 a 6 ml de disolución

de glucosa, se añade 1 ml de disolución de naftorresorcina y 1 ml de ácido

clorhídrico concentrado. La mezcla se calienta con cuidado y se hierve durante 1

min. Luego se enfría, se añade de 1 a 2 ml de éter o benceno y agita. La capa etérica

(bencénica) se tiñe de color verde azulado. Igual coloración den la galactosa y la

manosa, mientras que la xilosa y la arabinosa proporcionan una coloración azul

oscura y los ácidos urónicos, una coloración violeta.

1.2 Reacciones de reconocimiento de hidratos de carbono reductores

Los hidratos de carbono cuya molécula contiene un grupo carbonilo libre, se

denominan reductores. Estos azúcares en medio alcalino tienen la capacidad de

oxidarse, reduciendo a su vez las sales de óxido cúprico (valencia +2) a sales de

óxido cuproso (valencia +1); Las sales de plata, hasta plata metálica; las sales de

óxido de bismuto, hasta bismuto metálico. En esto se basa una serie de métodos de

determinación cualitativa y cuantitativa de los hidratos de carbono.

1.2.1 Prueba con el hidróxido

Cúprico (II), reacción de Trommer

En disolución alcalina los mono y disacáridos reductores reducen el hidróxido cúprico

(II) a óxido cuproso (I):

Glucosa ácido glucónico



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Reactivos.- Glucosa, disolución al 1%. Hidróxido sódico, disolución al 10%. Sulfato

cúprico, disolución al 1%.

Marcha de los trabajos.- En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 ml de disolución

de glucosa, un volumen igual de disolución de hidróxido de sodio y, agitándolo, se

añade, gota a gota, la disolución de sulfato cúprico. En presencia de la glucosa, el

precipitado de hidróxido cúprico (II) formado se disuelve, coloreando el líquido de

color azul claro. La capa superior del líquido se calienta hasta ebullición. La aparición

de un precipitado amarillo (hidróxido cuproso (I)) y luego rojo (óxido cuproso) indica

que la reacción de Trommer es positiva.

En otro tubo de ensayo se mezclan de 2 a 3 ml de disolución de hidróxido de sodio

con varias gotas de disolución de sulfato cúprico. Disolución de glucosa no se añade.

Se forma un precipitado de hidróxido cúprico de color azul claro. Al calentar esta

disolución, se forma un precipitado negro de óxido cúprico. Por lo tanto, en la

reacción de Trommer debe evitarse el exceso de sulfato cúprico, ya que la reacción

entre el hidrato de carbono reductor y el hidróxido cúprico transcurre

cuantitativamente. El exceso del último durante el calentamiento pierde agua y se

transforma en óxido cúprico negro, los que oscurece la reacción principal y constituye

un defecto del método: Cu(OH)2 CuO + H2O.

1.2.2 Reacción con el licor de Fehling

La reacción con el licor o reactivo de Fehling se basa en el mismo principio que la

reacción de Trommer. La diferencia consiste en que en las reacciones no se emplea

hidróxido cúprico libre. Este último se encuentra en estado combinado y forma parte

del reactivo de Fehling. El licor de Fehling representa un compuesto complejo de

cobre con tartrato de sodio y potasio de color azul. En su composición el ion cobre

en estado de oxidación «+2» se encuentra en forma de un compuesto complejo con

tartratos. Por eso durante el calentamiento, incluso con exceso de reactivo dado, no

se forma el precipitado negro CuO y no oscurece la reacción con pequeñas

cantidades de glucosa.

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Reactivos.- Glucosa, disolución al 1%. Reactivo de Fehling (preparación: disolución

1. En un matraz de 500 ml se disuelven 34,65 g de cristales no aireados de vitriolo

azul (CuSO4 . 5H2O), primero en una pequeña cantidad de agua destilada y al

disolverse os cristales, el volumen se lleva hasta la raya de enrase.. Disolución 2. En

un matraz de 500 ml se disuelven, en pequeña cantidad de agua destilada, 173 g de

sal de Rochelle (tartrato de sodio y potasio) , se añaden 62,5 g de sosa cáustica

disuelta en 100 ml de agua destilada, se mezcla bien y el volumen se lleva hasta la

raya de enrase. Antes de utilizar las disoluciones 1 y 2 se mezclan en proporciones

iguales).

Marcha de los trabajos.- A 1 o 2 ml de disolución de glucosa se añaden igual

volumen de reactivo de Fehling y se agita. La capa superior del líquido se calienta

hasta la ebullición. Aparece, al igual que en la reacción de Trommer, un precipitado

amarillo de hidróxido cuproso CuOH o bien u precipitado rojo de óxido cuproso

Cu2O.

1.2.3 Reacción con sales de bismuto Nylander

Para detectar los azucares reductores se emplean frecuentemente las sales de

bismuto. En la composición del reactivo de Nylander, análogo al de Fehling, entra

nitrato dibásico de bismuto que, en prece4ncia de hidróxido de sodio, forma hidróxido

de bismuto. Este último se encuentra en estado combinado con el tartrato de sodio y

potacio. Al reaccionar con la glucosa, el hidróxido de bismuto se reduce a bismuto

metálico y el líquido adquiere un color negro.

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Reactivos.- Glucosa, disolución al 1%. Reactivo de Nylander (preparación: 2 g de

nitrato dibásico de bismuto y 4 g de tartrato de sodio y potacio (sal de Rochelle) se

disuelve en 100ml de la sosa cáustica al 10% y se hierven hasta disolverse la mayor

parte de la sal de bismuto. El precipitado formado se enfría y se separa por

filtración).

Marcha de los trabajos.- A 2 ml de disolución de glucosa se añade 1 ml de reactivo

de Nylander y se hierve durante 2 o 3 min. El liquido oscurece debido a la formación

de un precipitado negro de bismuto metálico.

1.2.4 Reacción con Fenilhidrazina

Una particularidad importante de los monosacáridos consiste en su capacidad de

entrar en reacción con fenilhidrazina y formar fenilhidrazonas y osazonas. La

reacción de formación de osazonas transcurre en tres etapas. Al reaccionar los

monosacáridos con fenilhidrazina, en la primera etapa se forman fenilhidrazonas

solubles en agua (reacción de sustitución). En la asegunda etapa, con

fenilhidrazonas soluble sen agua (reacción de sustitución). En la segunda etapa, con

la fenilhidrazona formada reacciona otra molécula de fenilhidrazina y, oxadándola,

transforma el grupo hidroxilo en grupo carbonilo. La tercera molécula de

fenilhidrazina entra en reacción de sustitución con el grupo carbonilo recién

formado, lo que reduce a la formación de compuestos poco solubles en agua:

osazonas, que producen cristales de color amarillo, de forma característica. La


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H11C5 C

O

H

H11C5 C

O

OH

2Bi(OH)3 2Bi 3H2O


forma de los cristales de osazonas es variable y depende de la estructura de los

monosacáridos, de los cuales se forman las osazonas.

Las osazonas de diferentes monosacaridos se distinguen por la forma de los

cristales, punto de fusión, solubilidad y actividad óptica. Por eso, estas propiedades

se utilizan para aislar los monosacáridos de la disolución, como también para

distinguir unos azúcares de otros (fig. 10).

Instrumentos.- Soporte con tubos de ensayo, Baño de María. Vaso con hielo.

Portaobjetos y cubreobjetos. Pipeta. Microscopio.

Reactivos.- Glucosa, disolución al 1%. Mezcla de clorhidrato de fenilhidrazina

cristalino y acetato de sodio anhidro (2 : 3)

Marcha de los trabajos.- En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 ml de

disolución de glucosa, se añade 0,5 g de mezcla de clorhidrato de fenilhidrazina y

acetato de sodio, se agita y se calienta durante 5 min. en el baño de María hirviendo.

Luego se coloca el tubo de ensayo en el vaso con hielo. Al enfriarse lentamente, de

la disolución precipitan cristales de osazona. Estos últimos se observan bajo el

microscopio.

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Ilustración 1.-Cristales de osazonas de mono y disacáridos:

Fila superior-glucosa, galactosa, arabinosa: fila inferior- lactosa, maltosa, xilosa

Cuando se forma glucosazona bajo el microscopio se ven finos haces

característicos, formados por finos cristales de osazona, como también cristales

suelto sen formad e agujas finas. Su punto de fusión es 208º C. Si el líquido esta

muy concentrado, adquiere una coloración roja intensa y los cristales se desprenden

sólo después de diluirlo con agua destilada.

11


.

12


1.2.5 Reconocimiento de la fructosa en una disolución (reacción de A.F.

Selivánov)

Esta reacción se aplica especialmente para el reconocimiento de las cetosas; sobre

todo va bien con la fructosa y con aquellos azúcares complejos que por hidrólisis dan

fructosa (sacarosa, inulina). La reacción se basa en la formulación del 5-

hidroximetilfurfural, mediante el calentamiento de la fructosa con un ácido. El 5-

hidroximetilfurfural da con la resorcina (meta-dihidroxibenceno) un producto de

condensación de color rojo.

Las aldohexosas también dan esta reacción, pero transcurre más lentamente y en

condiciones especiales (temperatura y acidez del medio).

Instrumentos.- Soporte con tubos de ensayo. Baño de María.

Reactivos.- Fructuosa, disolución al 1%. Reactivo de Selivánov (preparación: 0.05

g de resorcina se disuelven en 100 ml de ácido clorhídrico al 20%).

Marcha de los trabajos.- En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 ml de reactivo

de Selivánov, se añaden 2 ó 3 gotas de disolución, de fructosa y se calienta de 1 a 2

min en el baño de María hirviendo. Se observa la coloración roja del líquido.

En el caso de ebullición prolongada, esta reacción tiene lugar también con la

glucosa, maltosa y sacarosa. Por eso, si en la disolución a investigar están

presentes dichos hidratos de carbono, la concentración del ácido clorhídrico no

deberá sobrepasar el 12%. En el proceso de la reacción el precipitado y la coloración

deberán aparecer no más tarde que a los 20 ó 30 segundos desde el inicio de la

ebullición.

1.2.6 Reacción de reconocimiento de las pentosas con orcina

Bajo la acción del ácido clorhídrico concentrado las pertosas, al calentarse, se

deshidratan y se transforman en furfural. Este último se condensa con la orcina

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(metildihidroxibenceno) en presencia de trazas de cloruro férrico (o + 3 y forma un

compuesto que da coloración verde


Reactivos.- Pentosa (arabinosa o xilosa). Disolución al 1%. Reactivo de orcina que

se prepara disolviendo 0,2 g de orcina en 100 ml de ácido clorhídrico al 30% y

añadiendo 0,1 g de cloruro férrico.

Marcha de los trabajos.- En un tubo de ensayo se vierte 1 ml de disolución de

pentosa e igual volumen de reactivo de orcina. La mezcla se calienta en el baño de

María hirviendo durante 20 min. Aparece coloración verde de la disolución.

La coloración verde la proporciona también los ácidos urónicos, pero después de un

calentamiento más prolongado.

1.2.7 Reacción con floroglucina

Durante el calentamiento de las pentosas con HCl, éstas se transforman en furfural,

el cual al condensarse con la floroglucina (trihidroxibenceno), da color rojo guinda.

Instrumentos.- Soporte con tubos de ensayo. Pipeta. Espátula. Baño de María.

Reactivos.- Pentosa (arabinosa o xilosa), disolución al 1%. Acido clorhídrico

concentrado. Floroglucina cristalina.


de pentosa o una pequeña cantidad de serrín de madera, se añade igual volumen

de ácido clorhídrico concentrado y varios cristales de floroglucina. El tubo de

ensayo se coloca en el baño de María Caliente. Durante el calentamiento aparece

una coloración roja.

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1.2.8 Reacción de reconocimiento de la desoxirribosa

Las 2-desoxipentosas, en particular la desoxirriborsa, al calentarse con un ácido en

condiciones suaves, forman alcohol furfurílico, aldehído hidroxilevulínico y otros

cromógenos afines que se condensan con las aminas aromáticas formando

compuestos de color azul.

Instrumentos.- Soporte con tubos de ensayo. Baño de María. Pipetas.

Reactivos.- Desoxitribosa. Disolución al 1%. Disolución de difenilamina

(preparación: 1 g de difenilamina recristalizada dos veces del alcohol al 70% o éter

de petróleo, se disuelve en una mezcla de 2,75 ml de ácido sulfúrico concentrado y

100 ml de ácido acético glacial).

Marcha de los trabajos.- En un tubo de ensayo se vierte 1 ml de disolución de

desoxirribosa y luego 2 ml de disolución de difenilamina. El contenido del tubo de

ensayo se hierve en el baño de María durante 10 min. Se desarrolla una coloración

azul estable durante varias horas.

1.3 Disacáridos

1.3.1 Reacción de reconocimiento de la sacarosa

La sacarosa es un disacárido no reductor y durante la hidrólisis (por ácido o

enzimática) su molécula se descompone en glucosa y fructosa:

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La sacarosa da con el sulfato de cobalto en un medio alcalino un complejo de color

violeta.


Reactivos.- Sacarosa, disolución al 1%. Sulfato de cobalto, disolución al 2%.

Hidróxido sódico, disolución al 10%.


de sacarosa, se añaden varias gotas de disolución de sulfato de cobalto. Al añadir

exceso de hidróxido sódico (1ml) el líquido adquiere un color violeta.

1.3.2 Reacciones de reconocimiento de la maltosa y lactosa

La maltosa y lactosa son disacáridos reductores:

Bibliografía: Chechetklin A.V. “Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral”; Editorial Mir Moscú Pág 103-108

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1.3.3 Reacciones de reducción de iones metálicos

La reacción positiva con el hidróxido cúprico, con el licor de Fehling y las sales de

bismuto (véase la marcha del trabajo en las pág. 95-97) se explica por la presencia

en las moléculas de maltosa y lactosa del grupo aldehído libre.

Las reacciones de reducción de los iones metálicos transcurren con los disacáridos

algo más lentamente que con los monosacáridos.

Reactivos.- Maltosa, disolución al 1%. Lactosa, disolución al 1%. Lo demás, igual

que para el análisis de los monosacáridos.

1.3.4 Reacción con la fenilhidrazina

La lactosa forma con la fenilhidrazina osazonas, cuyos cristales tienen forma de

agujas que se unen en aglomeraciones esféricas (véase la fig. 10).

La maltosa también da osazonas características (véase la fig. 10) con cristales en

forma de placas juntadas en escarapelas.

Los cristales de osazonas de la maltosa y lactosa se disuelven en disolución caliente

y precipitan sólo después de enfriarla.

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1.4 Polisacáridos

1.4.1 Almidón

1.4.1.1 Reacciones Coloreadas del Almidón

Una reacción característica para reconocer el almidón es la aparición de una

coloración azul al combinarse con la disolución de iodo ioduro potásico. La reacción

de los polisacáridos, en particular del almidón, con todo es un proceso complejo. La

coloración que aparece depende de la estructura de polisacárido. En el curso de la

reacción se forma un complejo de polisacárido con yodo. Este proceso es bien

expresado de la amilosa. En el caso de polisacáridos de cadenas ramificadas, por

ejemplo, la amilopectina y el glicógeno, junto con el proceso de formación del

complejo, tiene gran importancia también el proceso de adsorción de iodo sobre la

superficie de las moléculas ramificadas. Se ha demostrado la relación entre la

longitud de las cadenas laterales y la coloración resultante de la reacción con iodo

(B. N. Stepanenko).

Instrumento.- Soporte con tubos de ensayo.

Reactivos.- Almidón, disolución al 1%. Disolución de lugol (preparación: en 100 ml

de agua se disuelven 20 g de yoduro de potasio y 10 g de yodo. Para la reacción con

el almidón la disolución obtenida se diluye con agua destilada en proporción 1:5%).

Hidróxido sódico, disolución al 10%. Alcohol etílico.

Marcha de los trabajos.- En un tubo de ensayo se vierten 2 ó 3 ml de disolución de

almidón y se añade 1 gota de disolución de Lugol. El líquido se colorea de azul. El

contenido del tubo de ensayo se divide en tres partes: a la primera parte se añade 1

ó 2 ml de disolución de hidróxido sódico, a la segunda, 2 ó 3 ml de alcohol etílico, la

tercera parte se calienta. La coloración desaparece siempre. En la tercera muestra la

coloración vuelve a aparecer después del enfriamiento.

Bibliografía: Chechetklin A.V. “Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral”; Editorial Mir Moscú Pág 108-114

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Esto indica que la prueba con iodo debe realizarse sólo con disolución de almidón

fría. Debido a la inestabilidad del complejo de adsorción entre iodo y almidón, esta

reacción es sensible a la presencia de alcohol, al calentamiento y a la acción de los

álcalis con los cuales el iodo forma hipoioditos.

1.4.1.2 Hidrólisis Ácida Escalonada del Almidón

En el curso del calentamiento del almidón con ácido clorhídrico diluido, él se

descompone con la formación de los fragmentos de diferente tamaño llamados

dextrinas. Éstas se distinguen entre sí en cuanto a la masa molecular y al carácter de

la coloración que surge al tratarlas con la disolución de iodo. Más abajo se da el

esquema de la hidrólisis ácida del almidón:

Instrumentos.- Soporte con tubos de ensayo. Pipetas.

Reactivos.- Almidón, disolución al 1%. Ácido clorhídrico concentrado. Disolución de

Lugol (véase la preparación en la pág. 109). Papel de tornasol, Hidróxido sódico,

disolución al 10%. Licor de Fehling (véase la preparación en la pág. 96).

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Almidón HCl diluido, t = 100 °C 1 ó 2 minAmilodextrinas + I2 coloración violeta azul Eritrodextrinas + I2 coloración rojiparda Acrodextrinas no dan coloración Maltodextrinas no dan coloración Maltosa no dan coloración Glucosa no dan coloración



de almidón y se añaden varias gotas de ácido clorhídrico concentrado. Se mezcla

cuidadosamente y se hierve a fuego abierto. Luego de 1 ó 2 min. iniciada la ebullición

se toma una muestra para la reacción con yodo. Para esto se extraen varias gotas de

disolución con una pipeta y se vierten en un tubo de ensayo que contenga 5 ó 6 ml

de agua destilada, se añaden 1 ó 2 gotitas de disolución de Lugol. La coloración

violeta azul aparecida indica la presencia de las amilodextrinas en disolución. El tubo

de ensayo con la disolución de almidón se hierve 1 ó 2 min. más y se repite la misma

prueba con yodo; aparece una coloración rojiparda condicionada por la presencia de

las eritrodextrinas. Se hierve nuevamente la disolución y pasada los 2 ó 3 min. se

repiten las pruebas con iodo. El almidón se desintegra al finas hasta la glucosa,

produciendo como productos intermedios acrodextrinas, maldodextrinas y maltosa.

La reacción con iodo será negativa: el líquido adquiere un color amarillo a cuenta de

la coloración de la disolución de Lugol.

El hidrolizado de almidón se neutraliza, según un papel de tornasol, con disolución

de hidróxido sódico, se añade el licor se Fehling y se calienta. Se forma un

precipitado amarillo de hidróxido cuproso, o rojo, de oxido cuproso, lo que indica la

presencia de la disolución de productos de la hidrólisis que poseen propiedades

reductoras.

1.4.1.3 Hidrólisis Enzimática del Almidón

Bajo la influencia de la enzima amilasa el almidón se desdobla con la formación de

un disacárido, la maltosa, que luego se descompone por la maltasa hasta la glucosa.

Instrumentos.- Soporte con tubos de ensayo. Pipetas. Baño de María con

termómetro.

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Reactivos.- Preparado de saliva (1 ó 2 ml de saliva se coloca en un vaso y se

diluyen 5 veces con agua destilada, se mezclan cuidadosamente). Los demás

reactivos son los mismos que en el experimento anterior.

Marcha de los trabajos.- En un tubo de ensayo se vierten de 3ª 5 ml de disolución

de almidón y se añade 0,5 ó 1 ml de saliva, se mezcla cuidadosamente y se pone en

el baño de María durante 10 o 15 min. a una temperatura de 37 a 40° C.

Se hacen repetidamente las pruebas con yodo, la ausencia de la coloración

característica demuestra que la hidrólisis ha finalizado. La presencia de la glucosa se

confirma por la reacción positiva con el color de Fehling.

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CAPÍTULO II

2 LOS LÍPIDOS Y SUS METABOLITOS

2.1 Reacciones de reconocimiento de las grasa

2.1.1 Reacción de la grasa y el aceite con el Sudán III

Instrumentos.- Vidrio de reloj o placas de vidrio.

Reactivos.- Sudán III, disolución al 0,2% (preparación: en 200mg de Sudán III se

añaden 100ml de alcohol etílico al 70% calentado en un baño de María, se mezcla y

se deja en reposo durante 24h por lo menos). Aceite vegetal.

Marcha de los trabajos.- Sobre el vidrio de reloj se aplica una gota de aceite, se

añade una gota se Sudán III y se mezcla. Se observa la parición de una coloración

naranja de la mezcla.

En el colorante Sudán III se aplica en las investigaciones histológicas para localizar

las grasas en los tejidos.

2.1.2 Determinación de la glicerina en las grasas

En el curso del calentamiento de una grasa en presencia de agentes deshidratantes,

en particular, de hidrosulfatos de potasio o sodio se desprenden fácilmente de la

glicerina dos moléculas de agua, y ella se convierte en acroleína, que es un aldehído

no saturado.

22


La reacción de formación de la acroleína se hace con el propósito de reconocer la

glicerina libre o ligada en la molécula de grasa. Los lípidos que no contienen glicerina

(ceras, esterinas, inositolfosfolípidos y esfingolípidos) dan reacción de acroleína

negativa.

Instrumentos.- Soporte con tubos de ensayo. Mechero de gas o internilla.

Reactivos.- Grasa o aceite vegetal, cera. Hidrosulfato potásico (sódico), cristalino.

Marcha de trabajos.- El experimento debe realizarse en la campana de humos. En

un tubo de ensayo se vierten 8 o 10 gotas de aceite, en el otro se pone de 0,3 a 0,5g

de cera. En ambos tubos se añade aproximadamente 1g de hidrosulfato potásico. La

mezcla en los tubos de ensayo se calienta, con cuidado pero fuertemente. La

formación de la acroleína en el tubo de ensayo con la grasa se reconoce por la

aparición de un olor característico, acre intenso. En el otro tubo de ensayo no se

forma acroleína.

2.1.3 Solubilidad de las grasas

El trabajo se realiza con el aceite vegetal y diferentes disolventes.


Reactivos.- Aceite de girasol. Alcohol etílico. Benceno. Cloroformo.

23


Marcha de los trabajos.- En cuatro tubos de ensayo se vierten de 5 a 7 gotas de

aceite de girasol. En el primer tubo se añaden 2ml de agua, en el segundo 2ml de

alcohol, en el tercero 2ml de benceno y en el cuarto 2ml de cloroformo. La mezcla de

los tubos de ensayo se agita enérgicamente. Se observan los siguientes cambios: en

el primer tubo se forma una emulsión inestable que se separara rápidamente; en el

segundo, una disolución turbia, que indica la mala solubilidad del aceite en alcohol;

en el tercero y el cuarto tubos de ensayo se forman disoluciones transparentes

debido a una buena solubilidad del aceite en benceno y cloroformo.

2.1.4 Determinación de las constantes de la grasa

Sobre la naturaleza y la calidad de una grasa se puede juzgar a partir de sus

constantes físicas y químicas o sus números (índices), las constantes físicas de la

grasa más importantes son sus temperaturas de fusión y de endurecimiento y la

viscosidad; entre las químicas se destacan el número acídico (índice de acidez), el

índice de yodo, el número o índice de acetilo (índice de éster) y el número o índice

de saponificación.

2.1.5 Determinación de la temperatura de fusión

La temperatura de fusión de una grasa es uno de los indicadores que permite, en

cierta medida, juzgar sobre su asimilamiento. Las grasas que funden a baja

temperatura se emulsifican más fácilmente y, en consecuencia, se asimilan con

mayor facilidad.

La temperatura de fusión de los glicéridos es condicionada por sus ácidos grasos

constituyentes. Como regla, el punto de fusión de la grasa es tanto más bajo, cuanto

más alto es el contenido de los ácidos de cadena corta o no saturados. A la

temperatura ambiente las grasas de origen vegetal son líquidos, puesto que en su

composición la cantidad de ácidos grasos no saturados alcanza un 95 ó 97%. En la

24


composición de las grasas sólidas poco fusibles de origen animal prevalecen los

ácidos grasos de cadenas de carbono largas.

Las grasas naturales no poseen un punto de fusión determinado, ya que no son

sustancias químicas individuales, sino mezcla de diferentes glicéridos, ácidos grasos

libres, pigmentos, vitaminas y otras sustancias. La temperatura de fusión de las

grasas depende de la especie del animal y oscila dentro de los límites siguientes en º

C) ovejas 49 – 54, venados 48 – 52, ganado vacuno 48 – 50, cabras 46 – 48,

camellos 36 – 48, cerdos 37 – 45, caballos 28 – 32, perros 23 – 27, conejos 22 – 25.

Instrumentos.- Capilar de vidrio de 1,5 ó 2mm en diámetro. Termómetro. Tobo de

ensayo. Vaso químico. Lupa.

Reactivos.- Grasa de origen animal (fundida y filtrada).

Marcha de los trabajos.- El capilar limpio y seco se llena de grasa a una altura de

unos 2cm y se mantiene durante 1h sobre hielo o en agua corriente fría. Terminando

el enfriamiento, la parte del capilar llenada de grasa se corta, dejando la columna de

grasa de 0,5cm de altura. El capilar se ajusta mediante un anillo de goma en la parte

inferior del termómetro de tal manera que su punta llena de grasa sea dirigida hacia

arriba y su otro extremo libre de grasa, hacia abajo. El termómetro con capilar se

mete en el tubo de ensayo donde se ajusta con ayuda de un tapón. El tubo de

ensayo se sumerge en el vaso con agua y se sujeta en la patilla del soporte en

posición vertical. El nivel de agua en el vaso debe ser más alto que el término

superior del capilar. El agua se calienta poco a poco, removiéndola frecuentemente,

y a través de la lupa se observa el aumento de la temperatura y el estado de la

columna de grasa en los capilares. La indicación del termómetro en el momento

cuando la grasa empiece a fluir por el capilar y en la parte superior de este último se

forme un espacio libre, se anota como la temperatura de fusión.

Entre el inicio y el final de la transición de la grasa desde el estado sólido al líquido

transcurre cierto tiempo. Por lo tanto, para evitar errores, la temperatura de fusión de

25


la grasa se determina por lo menos dos veces, y el resultado se calcula como

promedio.

2.1.6 Determinación del número acídico

El número acídico caracteriza la presencia de ácidos grasos libres en la grasa. El

número acídico se expresa en cantidad de miligramos de hidróxido de potasio

necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres en un gramo de grasa.

El índice es uno de los indicadores más importantes de la calidad de la grasa. El

número acídico de la grasa fresca de distintos tipos no sobrepasa, comúnmente, una

magnitud de 1,2 a 3,5. En el curso de almacenaje de la grasa tiene lugar la hidrólisis

de los glicéridos y acumulación de los ácidos grasos libres. Una elevada acidez de

una grasa indica la pérdida de su calidad.

Instrumentos.- Matraz Erlenmeyer. Bureta. Pipetas de 1 y 10ml.

Reactivos.- Aceite de girasol. Mezcla neutralizada de alcohol con éter (mezcla de

alcohol con éter 1:2 que se neutraliza con disolución 0,1N de hidróxido potásico

según la fenolftaleína). Hidróxido potásico, disolución 0,1N. Fenolftaleína, disolución

0,1%.

Marcha de trabajos.- En el matraz Erlenmeyer se vierte un gramo de aceite de

girasol, se añaden 10ml de mezcla de alcohol con éter, el contenido se agita

cuidadosamente. Se agregan 2 ó 3 gotas de fenolftaleína, y la disolución se valora

rápidamente con al disolución de hidróxido potásico 0,1N, con agitación, hasta la

aparición de una coloración rosa que persista más de 1 min.

El número acídico se calcula según la fórmula

26


Donde x es el número acídico, en mg; a es el volumen de disolución de hidróxido

potásico de 0,1N consumido para la valoración de la prueba a investigar, en ml; 5,6

es la cantidad de hidróxido potásico (mg) que se contiene en 1ml de disolución de

hidróxido potásico; c es la muestra pesada de aceite, en g.

2.1.7 Determinación del índice de iodo

Se denomina índice de iodo la cantidad de gramos de iodo que pueden combinarse

con 100 g de grasa.

Este número permite evaluar el grado de no saturación de la grasa provocada por la

presencia de glicéridos con ácidos grasos de dobles enlaces, la capacidad de la

grasa para la oxidación, para la reducción y otras reacciones. Cuando mayor es el

contenido de ácidos grasos no saturados en la grasa, tanto mayor es su índice de

iodo.

El índice de iodo de algunas grasas y aceite oscila dentro de los siguientes límites:

deres, 27-47; de carnero, 31-46; de cerdo, 46-66; de perro, 56-67; aceite de girasol,

129-136; aceite de cáñamo, 145-162; aceite de linaza, 175-201.

El principio del método. La determinación del índice del iodo se basa en la reacción

de adición del iodo al lugar de ruptura de los dobles enlaces en las moléculas de

ácidos grasos, que se verifican cuantitativamente según el esquema:

El iodo que no ha reaccionado se valora con tiosulfato.

Instrumentos.- Matraces Erlenmeyer de 50 ml con tapones. Bureta. Pipeta de 10ml.

Reactivos.- Aceite de girasol. Cloroformo. Iodo, disolución 0,1 N en alcohol (la

preparación: 12,691 g de iodo recién sublimado se disuelven en 1 l de alcohol etílico

al 96%). Tiosulfato sódico, disolución 0,1 N. Almidón, disolución al1%.

27


Marcha de los trabajos.- En una matraz (prueba experimental) se pone 0,1 de

aceite de girasol (se pesa en una balanza analítica) , en el otro ( prueba de control)

0,1 ml de agua, y se añaden de la bureta 5ml de cloroforma en cada uno.

Cuando la muestra de aceite se disuelta, en los matraces se añaden con la pipeta

10ml (¡Exactamente!) de disolución 0,1 N de iodo en alcohol, los matraces se cierran

con tapones, el contenido se remueve agitándolo, y los matraces dejan en la

oscuridad.

Al cabo de 5 min las pruebas se evalúan, agitando permanentemente, con disolución

de tiosulfato sódico 0,1 N, primero hasta que la coloración se ponga amarilla clara, y

luego, al añadir 1 ml de disolución de almidón al 1%, hasta la Fl índice de yodo (x,g)

se calcula según la fórmula.

x =

Donde b es el volumen de disolución de tiosulfato sódico 0,1 N, consumiendo en la

valoración de la prueba de control, en ml; a es el volumen de la disolución de

tiosulfato sódico 0,1 N consumido en la valoración de la prueba experimental, en ml;

K es el coeficiente de corrección del título de la disolución 0,1 N de tiosulfato sódico;

0,01269 es la cantidad de iodo (g) equivalente a 1ml de disolución de tiosulfato

sódico 0,1 N; 100 es el coeficiente de recuento para los 100g de grasa; c la muestra

pesada de grasa, g.

2.1.8 Determinación del número (índice) de saponificación

Número de saponificación se denomina el número de miligramos de hidróxido

potásico que se necesitan para neutralizar todos los ácidos grasos (libres y ligados

en forma de glicéridos) que se contienen en 1 g de grasa.

El número de saponificación de algunos aceites y grasas de buena calidad tiene los

valores siguientes: grasa de buey, 190-200; grasa de carnero, 192-198; manteca de

cerdo, 193-200; manteca de vaca, 212-247; aceite de linaza, 187-195.

28


Instrumentos.- Baño de María, Matraces Erlenmeyer de 50 ml con refrigerantes de

reflujo. Bureta. Pipetas graduadas de 1ml.

Reactivos.- Aceite de girasol. Hidróxido potásico, disolución alcohólica 0,5 N (la

preparación: 30g de hidróxido potásico químicamente puro se disuelve en 30ml de

agua destilada, y el volumen se lleva a 1 l con alcohol etílico al 96%; al cabo de 24 h

la disolución se filtra). Ácido clorhídrico, disolución 0,5 N. Fenolftaleína, disolución al

0,1%.

Marcha de los trabajos.- En un matraz (prueba experimental) se pone 0,5 g aceite

de girasol, en el otro (prueba de control) 0,5 ml de agua, y en cada uno se añaden de

la bureta 15 ml de disolución alcohólica de hidróxido potásico 0,5 N.

A los matraces se conectan los refrigerantes de reflujo, y la mezcla se calienta con

agitación gentil en el baño de María hasta la ebullición débil durante 30 ó 40 min.

Terminada la saponificación, a cada matraz se le añaden 4 gotas de fenolftaleína en

cada uno, y su contenido se valora con disolución de ácido clorhídrico 0,5 N hasta la

desaparición de la coloración de rosa.

El número de saponificación se determina según la fórmula

x =

Donde x es el número de saponificación, g; b es el volumen de disolución de ácido

clorhídrico 0,5 N consumido en la valoración de la prueba de control, ml; a es el

volumen de disolución de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la valoración de la

prueba experimental, ml ; 28,05 es la cantidad de hidróxido potásico ( mg) que

corresponde a 1 ml de disolución de ácido clorhídrico 0,5 N; K es el coeficiente de

corrección del título de la disolución de ácido clorhídrico 0,5 N ; c es la muestra

pesada de grasa, g.

29


2.1.9 Emulsificación de las grasas

A la acción de las enzimas del tracto gastrointestinal y de los tejidos son accesibles

las grasas que se encuentran en estado emulsificado. En el tacto gastrointestinal

existen las condiciones para transformar las grasas en emulsión, y los

estabilizadores (emulsionantes) principales de ésta son las sales de ácidos biliares,

las proteínas, los fosfolípidos, jabones e hidrocarbonatos de metales alcalinos. Las

moléculas de los emulsionantes se adsorben en la capa exterior de las gotitas de

grasa y disminuyen bruscamente la tensión superficial en el contacto de las fases, lo

que se traduce en un aumento de la estabilidad de la emulsión. Cuando ocurre esto,

los grupos hidrófobos se disuelven en la grasa, favoreciendo a su atomización en

gotas menudas, esto es, a la emulsificación.


Reactivos.- Aceite de girasol. Bilis diluida dos veces. Disolución de proteína (véase

su preparación en la pag.155). Jabón, disolución al 1%.

Hidrocarbonato sódico disolución al 1%. Lecitina (véase su preparación en la pag.

142)

Marcha de trabajos.- Se toma seis tubos de ensayo. En los dos primeros tubos se

vierte 1 ml de agua, en el tercero 1 ml de bilis, en el cuarto 1 ml de disolución de

proteína, en el quinto 1 ml de disolución de jabón, en el sexto 1 ml de disolución de

hidrocarbonato sódico. En el segundo tubo de ensayo se introduce un pedacito de

lecitina. En cada tubo de ensayo se añaden 5 gotas de aceite de girasol, los tubos se

agotan enérgicamente y se dejan en reposo duramte 5 min.

En todos los tubos, menos en el primero, se forman emulsiones estables.

30


2.1.10 Hidrólisis de los glicéridos con lipasa

En el organismo las grasas se digieren bajo la acción de una enzima, la lipasa, que

se contiene en los jugos gástricos, del páncreas y de los intestinos.

La lipasa cataliza el desdoblamiento hidrolítico de las grasas en glicerina y ácidos

grasos libres:

En éste proceso desempeñan un papel importante los ácidos biliares que no sólo

participan en la emulsificación y adsorción de las grasas, sino que también activan la

lipasa.

El principio del método. Sobre la actividad de la enzima se juzga por el incremento

en el medio de incubación de los ácidos grasos libres que se liberan en el curso de la

descomposición de la grasa por la lipasa pancreática. La concentración de los ácidos

grasos libres se determina mediante la valoración con hidróxido sódico por la

fenolftaléina.

Instrumentos.- Vasos químicos de 50 ml. Matraces Erlenmeyer de ml. Pipetas de

1,2 y 10 ml. Termostato ajustado a 38ºC. Bureta.

31


Reactivos.- Leche hervida y diluida dos veces. Extracto de páncreas (la preparación:

1g de pancreatina comercial se disuelve en 100 ml de disolución de hidrocarbonato

sódico al 0,4%). Bilis diluida dos veces. Fenolftaleína, disolución al 0.1%. Hidróxido

sódico, disolución 0,01 N.

Marcha de trabajos.- En dos vasos se pone 10 ml de leche y 1 ml de extracto de

lipasa en cada uno. En uno de ellos se añade 1 ml d agua, en el otro 1 ml de bilis

( para activar la lipasa), y el líquido se mezcla rápidamente aspirándolo con la pipeta

y dejándolo derramarse.

De cada vaso se toman 2 ml de mezcla y se traslada en matraces para valoración, se

añaden 2 gotas de fenolftaleína y se valora con la disolución de hidróxido sódico 0,01

N hasta la aparición de una coloración rosada débil.

La mezcla que se quedó en los vasosa se incuba en el termostato a 38ºC. Tras cada

15 min de los vasos se toman 2 ml de mezcla y se valoran del modo descrito

anteriormente.

Resultado de las valoraciones pueden anotarse en la tabla.

La cantidad de álcali consumida para la neutralización de los ácidos grasos libres

formados en el curso de la hidrólisis de la grasa se determina por la diferencia entre

los resultados de la primera y las siguientes valoraciones.

Basándose en los datos obtenidos se traza el gráfico de la acción de la lipasa en el

tiempo, con y sin bilis. En el eje de abscisas del gráfico se pone el tiempo y en el eje

de ordenadas el número de mililitros de disolución de hidróxido sódico 0,01 N

consumida en la valoración de los ácidos grasos libres formados mediante un

intervalo de tiempo determinado.

32


2.2 Fosfolípidos

2.2.1 Aislamiento de los fosfolípidos

Unos objetos cómodos para el aislamiento y el estudio de la composición química de

los fosfolípidos son el tejido nervioso, la yema de huevo, el hígado, la leche, donde

ellos se encuentran en considerable cantidad.

2.2.2 Aislamiento de las lecitinas de la yema de huevo

Instrumentos.- Vaso químico. Soporto con tubos do ensayo. Embudos. Filtros de

papel. Varilla de vidrio.

Reactivos.- Yema de huevo. Alcohol etílico, al 96%. Acetona.

Marcha de los trabajos.- En el vaso se pone la mitad de una yema, le añaden 20 mi

de alcohol caliente y se mezcla con una varilla de vidrio. La mezcla se enfría y se

filtra en un tubo de ensayo seco. Al ser turbio el extracto, la filtración se repite.

Para detectar la lecitina en el filtrado, en un tubo de ensayo seco se vierten 5 rnl de

acetona y se le añade, gota a gota, el filtrado obtenido. La aparición de turbidez

indica precipitación de lecitina.

En el otro tubo de ensayo seco se vierten 3 mi de filtrado y se añade, gota a gota, "el

agua. Se forma una emulsión estable. El filtrado que queda se utiliza para otras

reacciones de reconocimientos de las lecitinas.

2.2.3 Detección de los ácidosgrasos superiores

Marcha de los trabajos.- El hidrolizado alcalino obtenido se diluye con 2 ml de agua

y se le añade, gota a gota, la disolución de ácido clorhídrico al 10% hasta que se

separen los ácidos grasos superiores que suben a la superficie en forma de una capa

líquida. Los ácidos grasos liberados se eliminan mediante la filtración.

El filtrado transparente se neutraliza con disolución de hidróxido sódico al 10% hasta

una coloración rosada débil de fenolftaleína y se evapora en el baño de María hasta

33


quedar bien seco. En el residuo seco se detecta la presencia de la glicerina y el ácido

fosfórico.

34


CAPÍTULO III

3 PROTEINAS

3.1 Reacciones De Reconocimiento De Las Proteínas

Todas las reacciones de reconocimiento de las proteínas se basan en la presencia

en ellas de ciertos grupos químicos, de ciertos enlaces o en las propiedades físico-

químicas.

Las reacciones de reconocimiento de las proteínas pueden ser divididos en dos

grupos independientes: reacciones de precipitación y reacciones coloreadas.

Las reacciones de precipitación de las proteínas pueden dividirse en dos subgrupos:

la precipitación de las proteínas sin su desnaturalización (sales de los metales

pesados, temperatura, ácidos minerales y orgánicos, reactivos de reconocimiento de

los alcaloides).

3.2 Reacciones De Precipitación De Las Proteínas

3.2.1 Salificación de las proteínas

En el curso de estas reacciones las proteínas precipitadas no se someten a las

alteraciones profundas, y los precipitados de las proteínas obtenidos (gel) pueden ser

disueltos de nuevo en el mismo disolvente de partida (transformación en sol). Las

macromoléculas de las proteínas en este caso, conservan sus propiedades iniciales

(nativas) y no sufren variaciones considerables (desnaturalización).

35


La precipitación reversible de las proteínas se logra por adición a las disoluciones

acuosas, de las sales neutras de los metales alcalinos o sales amónicas. A tales

sales pertenecen las sustancias siguientes:( NH4)2SO4,

NH4 Cl,Na2SO4,NaCl, KCl, etc. El mecanismo de acción de estas sales sobre la

partícula coloidal se reduce a la adsorción, sobre esta última, de los iones con carga

opuesta. De esta manera, la partícula proteínica se vuelve eléctricamente neutra

(sucede la anulación de la carga), lo que resulta en la disminución de su estabilidad

en la disolución. Además, las sales de los metales alcalinos, al disolverse, enlazan

grandes cantidades de agua, par concentraciones elevadas, esto provoca la

deshidratación de las partículas coloidales y las priva del segundo factor de la

estabilidad del estado de agregación, su envoltura de hidratación. Las proteínas se

precipitan.

Este método de precipitación de las proteínas, es decir, la precipitación por iones de

las sales de metales alcalinos, se denomina salificación. Los precipitados de las

proteínas ( gel ) obtenidos por salificación pueden ser disueltos de nuevo al disminuir

la concentración de las sales mediante diálisis o por disolución en agua. De esta

manera, la salificación de las proteínas es un proceso reversible. Como es sabido,

las proteínas de los tejidos son heterogéneas con respecto a su masa molecular, y

esta dispersión de la masa molecular se usa para su separación fraccionada

empleando las sales de diferente concentración.

Las disoluciones concentradas de sulfato amónico salifican casi todas las proteínas.

Por ejemplo, todas las fracciones de globulinas se precipitan anta la semisaturación

de la disolución de proteínas con sulfato amónico, mientras que las albúminas se

precipitan con una saturación absoluta.

Los cloruros de sodio y potasio, así como el sulfato de magnesio, precipitan las

globulinas en estado de saturación: con acidulación débil ( en punto isoeléctrico)

36


estas sales precipitan también las albúminas, y en esta caso se utilizan disoluciones

de más baja concentración.

3.2.2 Precipitación de las proteínas con sulfato amónico.

Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. Embudo con filtro.

Reactivos: Suero de sangre o disolución de clara de huevo ( de tres huevos de

gallina ) que se prepara mezclando las claras de huevo con 700 ml de agua destilada

y 300 ml de disolución saturada de cloruro sódico con posterior filtración a través de

varias capas da gasa. Sulfato amónico ( disolución saturada). Sulfato amónico en

forma de cristales desmenuzados finamente. Hidróxido sódico, disolución al 10 %.

Sulfato cúprico, disolución al 1 %.

Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se vierten 2 ó 3 ml de suero de la

sangre o de disolución diluida de clara de huevo, se añade igual volumen de

disolución saturada de sulfato amónico y se agita. Se precipitan unas proteínas: las

globulinas. Luego de 5 ó 7 min, el contenido de los tubos de ensayo se filtra. En el

filtrado quedan las albúminas y sobre el filtro, las globulinas.

Para precipitar las albúminas, al filtrado se le añade sulfato amónico cristalino hasta

la saturación completa, es decir, hasta que quede un polvo no soluble. Se precipitan

las albúminas que se separan por filtración.

Con 2 ó 3 ml de filtrado se hace la reacción de biuret (véase en la pág 167 ). La

reacción negativa indica la ausencia de proteínas en el filtrado y la plenitud de la

precipitación.

El precipitado de albúminas junto con el filtro se traslada a un tubo de ensayo y se

disuelve en 4 ó 5 ml de agua, agitando el tubo de ensayo.

37


La disolución de albúminas se filtra; con ella se hace la reacción de biuret.

Precipitación reversible de las proteínas con sulfato amónico

Los instrumentos y reactivos son los mismos que en el experimento anterior.

Marcha de los trabajos: En el tubo de ensayo se vierten 2 ó 3 ml de suero de la

sangre o clara de huevo diluida. Se agregan 2 ó 3 ml de disolución saturada de

sulfato amónico y se agita. Se precipitan proteínas. Entonces se añade igual volumen

de agua destilada, se mezcla bien y se observa la desaparición paulatina del

precipitado de proteínas.

3.2.3 Precipitación de las proteínas con cloruro sódico y sulfato de magnesio

Instrumentos: Los mismos que en experimento en la precipitación con sulfato

amónico (véase la pág. 155).

Reactivos: Cloruro sódico cristalino. Sulfato de magnesio cristalino. Acido acético,

disolución al 1 %.

Marcha de los trabajos: En dos tubos de ensayo se vierten 2 ó 3 ml de suero de la

sangre o clara de huevo diluida en cada uno.

En uno de los tubos de ensayo se añade, hasta la saturación completa, el cloruro

sódico y en el otro, el sulfato de magnesio. Al cabo de 2 ó 3 min en ambos tubos

aparece el precipitado de globulinas.

El contenido de los tubos de ensayo se filtra. En el filtrado quedan las albúminas que

en disoluciones neutras no son precipitadas por dichas sales incluso con saturación

completa.

Al filtrado se le añaden 4 ó 6 gotas de disolución de ácido acético al 1 %, entonces,

las albúminas se precipitan. Al pasar 5 min, estas se filtran. Por medio de la reacción

38


del biuret se comprueba la ausencia de las proteínas en el filtrado (véase la pág.

167)

3.2.4 Purificación de las proteínas de los cristaloides con método de diálisis.

Diálisis es un método de separación de los coloides

y los cristaloides mediante la difusión de estos

últimos a través de membranas especiales,

impermeables para los coloides.

Las proteínas , como sustancias macromoleculares

coloidales, no se difunden a través de los,poros de

la membrana semipermeable.

En esta propiedad de las proteínicas se basa el mé-

todo de purificación de las proteínas de impurezas

orgánicas y minerales de bajo peso molecular. Ilustración 2.- Dializador Elemental

Instrumentos: Dializador, que es una bolsa de colodión sumergida en un vaso con

agua destilada Soporte con tubos de ensayo.

Reactivos: Disolución de proteína que contiene cloruro sódico ( véase su

preparación en la pág.154). Nitrato de plata, disolución al 1%. Acido nítrico,

disolución al 10 %. Hidróxido sódico, disolución al 10 %. Sulfato cúprico, disolución al

1 %.

Marcha de los trabajos: Con la disolución de proteína se hace la reacción de biuret

Se vierten de 10 a 15 ml de disolución de proteína en la bolsa de colodión

sujetándola con ayuda de pinzas de madera dentro del vaso con agua destilada, de

tal manera que el borde de la bolsa sobresalga de la superficie del agua. Al cabo de

unos 40 ó 60 min, del vaso toman 2 ó 3 ml de agua en un tubo de ensayo donde se

39


añaden 3 ó 5 gotas de disolución de nitrato de plata con fin de detectar los iones

cloruro. En el otro tubo de ensayo se toman 1 ó 2 ml de líquido del vaso y se hace la

reacción de biuret. Si el experimento se ha realizado correctamente, esta reacción

debe ser negativa.

El agua del vaso puede cambiarse cada 15 ó 20 min, hasta aparecer en la disolución

el precipitado de globulinas que se forma debido a la disminución de la concentración

de cloruro sódico en la bolsa de colodión. En disoluciones pobres en sales, las

globulinas se precipitan.

3.2.5 Precipitación de las proteínas con iones de metales pesados.

Bajo la influencia de los iones de las sales de metales pesados ( plomo, cobre, plata,

mercurio, etc. ) , las proteínas desde el estado de sal coagulan irreversiblemente en

gel. Los iones de las sales de metales pesados forman con las proteínas compuestos

complejos estables. Además, los metales pesados anulan la carga eléctrica y, por lo

visto, cambian profundamente la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de la

proteína.

Para la precipitación de las proteínas con sales de metales pesados se necesitan

bajas concentraciones y pequeñas cantidades des estas sales, en comparación con

la precipitación de las proteínas con sales neutras de metales alcalinos.

En presencia de un exceso de acetato de plomo y sulfato cúprico el precipitado

formado por ellos se disuelve, lo que se explica por la adsorción de un exceso de

iones de metal y la recarga del complejo proteínico; como resultado, a la disolución

pasa un complejo de proteínas obtenidos por la acción de las sales de metales

pesados son insolubles en disolvente de partida, es decir, en agua o en disoluciones

débiles de sales, incluso después de la eliminación de las sales por diálisis o

después de la dilución con agua.

La capacidad de las proteínas de enlazar los metales pesados se aprovecha

ampliamente en la práctica medicinal y veterinaria: las proteínas sirven de antídotos

en caso de envenenamiento con sales de mercurio, cobre, plomo, etc.

40


Las reacciones de precipitación de las proteínas con sales de metales pesados

transcurren con plenitud, y ellas se utilizan no sólo para el aislamiento de las

proteínas desde disoluciones y líquidos biológicos sino también para liberar estos

últimos de las proteínas.

Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. Varillas de vidrio.

Reactivos: Disolución de clara de huevo en 20 volúmenes de agua que se filtra a

través de varias capas de gasa. Acetato de plomo, disolución al 0.5 %. Sulfato

cúprico, disolución al 5 %. Nitrato de plata, disolución al 3 %. Disolución saturada de

cloruro sódico.

Marcha de los trabajos: En tres tubos de ensayo se vierten en cada uno de 1 a2 ml

de disolución de proteína. En el primer tubo se añade, gota a gota, la disolución de

acetato de plomo; en el segundo la de sulfato cúprico; en el tercero la de nitrato de

plata. En los tres tubos se forman precipitados de proteínas.

En los tubos de ensayo con los precipitado obtenidos con acetato de plomo y sulfato

cúprico se añade el exceso de estas sales, observándose, entonces, la disolución de

los precipitados.

3.2.6 Precipitación de las proteínas con ácidos minerales.

Los ácidos minerales concentrados (menos el ácido fosfórico) causan precipitación

irreversible de las proteínas desde sus disoluciones. Esta precipitación se explica por

el fenómeno de la deshidratación de las partículas coloidales de proteína, la

anulación de su carga, formación de sales de la proteína y el ácido, etc.

La reacción con ácido nítrico se emplea ampliamente para las investigaciones

diagnósticas.

Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo.

41


Reactivos: Acido Clorhídrico concentrado. Acido Sulfúrico concentrado. Disolución

de proteína para las reacciones de precipitación

Marcha de los trabajos: En tres tubos de ensayo se vierten con cuidado 1 ml de

ácidos en cada uno: ácido clorhídrico en el primero, ácido sulfúrico en el segundo y el

nítrico en el tercero.

En todos los tubos de ensayo se aplica con cuidado sobre el ácido una capa de

disolución de proteína(alrededor de 1 ml ). En el contacto de dos líquidos aparece un

precipitado de proteínas en forma de pequeño círculo (anillo) blanco.

Cada tubo de ensayo se agita con cuidado. El precipitado se disuelve en los dos

primeros tubos de ensayo donde hay exceso de ácidos clorhídrico y sulfúrico; en el

tercer tubo, que contiene ácido nítrico, el precipitado no desaparece en el curso de la

agitación, yq eue las proteínas no se disuelven en el exceso de ácido nítrico.

3.2.7 Precipitación de las proteínas con ácidos orgánicos.

Las proteínas pueden precipitarse de sus disoluciones también con ácidos orgánicos,

aunque distintos ácidos actúan sobre la proteína de diferentes maneras. Así , por

ejemplo, el ácido tricloroacético ( CCl3COOH ) y el ácido sulfosalicílico [C6H3 (OH)

COO—HSO3H ] son, en relación a las proteínas, reactivos muy específicos y fuertes

y se aplican ampliamente en la práctica de investigación.

La precipitación de las proteínas con ayuda de ácido tricloroacético de concentración

final de 2,5 a 5 % se usa para eliminar completamente las proteínas desde los

líquidos biológicos u homogeneizados de los tejidos, puesto que el ácido

tricloroacético precipita sólo las proteínas, mientras que los productos de su

desintegración (metabolismo), esto es, la urea, el ácido úrico, las amidas de los

aminoácidos, los aminoácidos, los péptidos de bajo peso molecular etc., se quedan

42


en disolución. Esto tiene importancia para determinar por separado el nitrógeno

proteínico y no proteínico (restante) en los tejidos.


Reactivos: Acido tricloroacético, disolución al 5 %. Acido sulfosalicílico disolución al

20%. Disolución de proteína para la precipitación

Marcha de los trabajos: En dos tubos de ensayo se vierten 1 ó 2 ml de disolución

de proteína y se añaden al primer tubo varias gotas de disolución de ácido

tricloroacético al 5 % y al segundo, varias gotas de ácido sulfosalicílico. Los tubos de

ensayo se agitan y se observa la precipitación de la proteína.

3.2.8 Precipitación de las proteínas con alcohol y acetona

Los disolventes orgánicos precipitan las proteínas de una disolución neutra o

débilmente ácida. Ellos desplazan las proteínas de las disoluciones acuosas. El

mecanismo de acción del alcohol y otros disolventes orgánicos puede ser explicado

por la deshidratación de las micelas de proteína, lo que conduce a la merma de su

estabilidad en disolución. Si en la disolución de proteína hay presentes sales (Na Cl),

el precipitado se forma más rápidamente debido a la anulación de la carga desde la

partícula coloidal. Este fenómeno disminuye aún más estabilidad de la disolución de

la proteína.

Si la precipitación se hace en frío y el precipitado se separa rápidamente del alcohol,

entonces, la proteína puede ser de nuevo disuelta en agua, es decir, sus

propiedades no varían, la desnaturalización no logra realizarse, y la precipitación

resulta ser reversible. Durante una estancia prolongada con alcohol, la proteína se

desnaturaliza y se vuelve insoluble en el disolvente inicial.


43


Reactivos: Disolución de proteína para las reacciones de precipitación (véase su

preparación en la pág. 154).Alcohol etílico al 96 %, Acetona,Cloruro sódico cristalino.

Marcha de los trabajos: En dos tubos de ensayo se vierten 1 ó 2 ml de disolución

de proteína, con cucharita se añade un poco (0.2 ó 0.3 g) de cloruro sódico y se agita

enérgicamente.

Al primer tubo de ensayo se añaden gradualmente (gota a gota) 2 ó 3 ml de alcohol,

y al segundo, 2 ó 3 ml de acetona.

Los tubos se agitan enérgicamente y después de 3 ó 6 min se observa la formación

de un precipitado fino de proteínas.

3.3 Reacciones de reconocimiento de las proteínas

La determinación cualitativa de las proteínas se basa en dos tipos de reacciones:

a) las reacciones en que intervienen los enlaces peptídicos de la molécula

proteínica.

b) las reacciones de los grupos amino presentes en la molécula de la proteína.

Estas son reacciones coloreadas de reconocimiento de las proteínas.

44


3.3.1 Descubrimiento de los enlaces peptídicos en las moléculas de proteínas

(reacción del biuret)

En la disolución alcalina, al añadir sulfato cúprico, tales sustancias como el biuret, la

oxamida, los polipéptidos y las proteínas forman sales complejas coloreadas de un

color violeta. Esta reacción es condicionada por la presencia de la unión

péptida ( )

El nombre de «reacción del biuret» proviene de un derivado de la urea, el biuret,

que, en condiciones apropiadas, da esta reacción. El biuret se forma en el curso

del calentamiento de la urea con desprendimiento de amoniaco:

La estructura de la sal compleja coloreada de Cu-Na-biuret que se forma en medio

alcalino, puede representarse del modo siguiente:

Como se ve en la fórmula indicada más arriba. el biuret en un medio alcalino sufre la

ionización completa según el esquema

45


Dos moléculas de biuret en forma dienólica se combinan con el hidróxido cúprico

formando un complejo en que los enlaces de coordinación son formados a cuenta de

los pares electrónicos de los grupos imino.

De un modo análogo esta constituido el complejo de cobre con los grupos

enolizados peptídicos de cualquier proteína o polipéptido.

Los complejos de este tipo poseen sobre todo, un color rojo (el máximo de

absorción esta situado en la región de 520 a 535 nm). En caso de formarse

complejos cúpricos con participación de tres o dos átomos de nitrógeno, su

coloración es preferentemente violeta y azul (el máximo de absorción

es de 540 a 580 nm y de 615 a 670 nm). Por lo tanto la coloración de las

disoluciones varia, al verificarse la reacción del biuret, del azul al rojo, con

preponderancia del color violeta.


Reactivos: Urea cristalina. Hidróxido sódico disoluciones al 10 % y 30%. Sulfato

cúprico, disolución al 1%. Disolución de proteína (claras de dos huevos mezcladas

con un litro de agua destilada).

Marcha de los trabajos: Reacción con el biuret. En un tubo de ensayo seco se

toma una pequeña cantidad (0,5 g) de urea y se calcina con cuidado en la llama

de un mechero de gas. La urea primero se funde en el curso del calentamiento

46


ulterior se desprende amoniaco. Al enfriarse, a la masa fundida se le añade 1 ó 2

ml de hidróxido sódico al 10% y varias gotas de disolución de sulfato cúprico al 1

%. Después de agitada la mezcla, se desarrolla una coloración violeta azul de la

disolución.

Reacción con la proteína. A 1 ó 2 ml de disolución de proteína se le añade un

volumen doble de disolución de hidróxido sódico al 30%. Se mezcla

cuidadosamente y se agregan 2 ó 3 gotas de disolución de sulfato cúprico al 1%. De

nuevo se mezcla cuidadosamente. Se desarrolla una coloración roji-violeta. Siendo

pequeña la concentración de la proteína, la sensibilidad de la reacción puede ser

aumentada, aplicando sobre la capa de disolución de proteína en álcali 1 ml de

disolución de sulfato cúprico al 1%. Estando el tubo de ensayo en reposo, en el

contacto de dos capas aparece un anillo violeta. Este método puede emplearse

para la determinación de la proteína en la orina.

3.3.2 Reacción con el ácido pícrico

El ácido pícrico al ser calentado con la proteína en un medio alcalino, se reduce

formando el ácido picrámico. Esta reacción puede realizarse también con otros

reductores, por ejemplo, con la glucosa:

Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. Espátula

47


Reactivos: Acido pícrico, disolución saturada. Disolución de proteína. Glucosa,

disolución al 0.1 %. Hidrocarbonato sódico seco.

Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se vierten 2 ml de disolución de

proteína y se añade de 0.3 a 0.5 g de Hidrocarbonato sódico, luego se agrega 1 ml

de disolución saturada de ácido pícrico. El tubo de ensayo se calienta durante varios

minutos en la llama del mechero. La coloración amarilla de la disolución

gradualmente pasa a ser roja debido a la reducción del ácido pícrico en picrámico.

En el otro tubo de ensayo se efectúa la misma reacción con disolución de glucosa al

0,1 % en lugar de la proteína. Se observan los mismos fenómenos que en el caso de

la proteína.

3.4 Reacciones De Reconocimiento De Los Aminoacidos

3.4.1 Reacción del triptófano

Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. Pipetas de 1 ml.

Reactivos: Disolución de proteína. Sacarosa, disolución al 10 %. Acido sulfúrico

concentrado.

Marcha de los trabajos: En el tubo de ensayo se vierte 1 ml de disolución de

proteína, aproximadamente, y se añaden 2 gotas de disolución de sacarosa. Luego

mediante la pipeta se deja bajar al fondo 1 ml de ácido sulfúrico concentrado. En el

contacto de los líquidos aparece una coloración guinda roja en forma de un anillo.

48


La esencia de la reacción se reduce a que bajo la influencia del ácido sulfúrico ocurre

la hidrólisis de la sacarosa hasta monosacáridos que se deshidratan, convirtiéndose

en hidroximetilfurfural. El triptófano, al combinarse con el hidroximetilfurfural, forma

un complejo de color guinda rojo.

3.4.2 Reacción de la arginina

La arginina en presencia del -naftol se oxida con hipobromito, perdiendo a la vez un

grupo imino. La arginina oxidada, al combinarse con el -naftol, forma una sustancia

de color rojo que se supone posee la estructura siguiente:

Las proteínas que tienen en su composición arginina , dan una coloración roja con

hipobromito o hipoclorito y -naftol en medio alcalino.


Reactivos: Hidróxido sódico, disolución al 10%. -naftol, disolución al 0.2 %

(preparación: se disuelve 0.5 g de -naftol en 50 ml de alcohol etílico; antes de usar

5 ml de dicha disolución básica se diluye 5 veces con agua ). Hipobromito sódico

(preparación: se disuelven 300g de hidróxido sódico en 1 l de agua, se enfrían y se

añaden bajo la campana de humos, con cuidado y removiendo constantemente, 50g

de bromo puro (alrededor de 16 ml); la disolución se guarda en un frasco oscuro

durante tres meses). Arginina, disolución al 0.01 % en ácido sulfúrico 0,1N.

Disolución de proteína: (véase su preparación en la página 154).

49


Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se vierten 2 ml de disolución de

proteína. Se añaden 2 o 3 gotas de disolución de hidróxido sódico y 2 gotas de -

naftol. El contenido del tubo de ensayo se mezcla y se agrega 1 gota de

hipobromito. Aparece una coloración carmesí roja.

En el mismo orden que se efectúa la reacción con la disolución de arginina. Aparece

una coloración roja ladrillo.

3.4.3 Reacción de los aminoácidos que contienen azufre

En la composición molecular de la mayoría de las proteínas entran aminoácidos que

contienen azufre: la cisteína, cistina y metionina. Al calentarse con álcali, de estos

aminoácidos se desprende azufre en forma de sulfuro de hidrógeno que se detecta

en la reacción con el acetato de plomo:

Instrumentos: Soporte con tubos do ensayo.

Reactivos: Clara de huevo no diluida. Hidróxido sódico, disolución al 20%. Acetato

de plomo, disolución al 0,5%

Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se vierten 1 ó 2 mi de clara de huevo

y se añade igual volumen de disolución de hidróxido sódico, se calienta hasta la

ebullición y se agregan 1 ó 2 gotas de acetato de plomo. Se observa un

oscurecimiento paulatino de la disolución.

50


3.4.4 Reacción de reconocimiento del glutatión

El glutatión es un tripéptido compuesto de los restos del ácido glutámico, la cisteína y

la glicina:

En los tejidos y células del organismo animal el glutatión se encuentra en forma

reducida (como tripéptido G—SH) y en forma oxidada (como tripéptido GS—S—S—

G). La reducción del glutatión se realiza a través de la reacción con el DANPH2:

En el organismo el glutatión se oxida, interaccionando con los aminoácidos de

proteínas. La función más importante del glutatión es mantener en el estado reducido

los grupos tioles de la cisteína en las proteínas.

El glutatión puede servir de agente de transferencia de hidrógeno intermediario en

las reacciones de oxidación del aldehído fosfoglicérico y de activador de una serie de

enzimas (proteinasas). Sobre la catalasa, fosfatasa y algunas otras enzimas el

glutatión ejerce una acción inhibidora.

Contienen glutatión la sangre, el hígado, los músculos, los riñones, las glándulas

suprarrenales y otros órganos. En la sangre de los animales sanos se contiene de

4,4 a 32,3 mg% de glutatión, mientras que por ejemplo en la sangre de las vacas

enfermas de cetosis su contenido alcanza a 22,5-23,2 mg%. Estos indicadores

51


reflejan la alteración de los procesos de oxidación-reducción en los tejidos del

animal.

El principio del método. En el medio alcalino del glutatión se desprende el sulfuro

sódico que, al combinarse con el nitroprusiato de sodio, forma un compuesto de color

carmesí:

Instrumentos: Mortero con machaca. Polvo de vidrio. Soporte con tubos de ensayo.

Pipetas. Infernilla.

Reactivos: Hígado fresco. Sulfato amónico, disolución saturada. Nitroprusiato de

sodio, disolución al 2%. Amoníaco concentrado.

Marcha de los trabajos: En el mortero se trituran cerca de 1 g de hígado con una

pequeña cantidad de polvo de vidrio y 3 ó 4 mi de disolución saturada de sulfato

amónico. El contenido del mortero se divide en dos porciones iguales que se ponen

en dos tubos de ensayo. El tubo de ensayo 1 sirve de control, él se calienta hasta la

ebullición para desnaturar las proteínas y el glutatión. En el tubo de ensayo 2

(experimental) el glutatión queda intacto. En ambos tubos se añaden 2 mi de

amoníaco y 1 mi de disolución de nitroprusiato de sodio. En el tubo de ensayo 2 se

observa la aparición de una coloración carmesí.

3.4.5 Diazorreacción de reconocimiento de la tirosina, el triptófano y la

histidina

52


Con el diazorreactivo las proteínas dan una coloración roja anaranjada. El color

depende de la formación de los azocompuestos coloreados a partir de los restos de

aminoácidos, la tirosina, el triptófano y la histidina que forman parte de la

composición de la molécula proteínica.

La diazorreacción se emplea para la determinación cuantitativa y cualitativa de la

tirosina e histidina en los hidrolizados proteínicos.

Instrumentos: Soporto con tubos de ensayo.

Reactivos: Reactivo diazo (preparación: 0,9 g de ácido sulianílico se disuelven en 9

mi de ácido clorhídrico concentrado y se agrega agua hasta completar 100 mi. Ésta

es una disolución básica que puedo guardarse largo tiempo. Se toma 1,5 mi de

disolución básica de ácido sulfanílico y se vierte en un matraz aforado de 50 mi

puesto en hielo, se añaden 1,5 mi de disolución de nitrito sódico recién preparado. Al

cabo do 5 min se agregan, agitando, otros 6 mi de disolución de nitrito sódico al 5% .

Tras 1 min se añade poco a poco (durante el enfriamiento) agua hasta la raya de

enrase. La disolución se agita y se deja sobre el hielo durante 15 ruin. La disolución

puede guardarse en hielo durante 24 h. Tirosina, disolución 0,01°o en ácido sulfúrico

0,1 N. Disolución de proteína (véase su preparación en la pág. 154). Carbonato

sódico, disolución al 10°o.

Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se vierten 2 mi de disolución de

tirosina, ü,5 mi de disolución de sosa y 1 mi de reactivo diazo. Aparece una

coloración roja anaranjada.

De manera análoga se efectúa con la proteína utilizando la disolución de proteína en

lugar de la de tirosina. En este caso también aparece una coloración roja anaranjada.

3.4.6 Descubrimiento del componente de hidrato de carbono en las proteínas

53


Ciertas proteínas (glicoproteínas, nucleoproteínas, etc.) tienen en su composición

hidratos de carbono. En presencia del ácido sulfúrico concentrado tales proteínas

dan una coloración característica para los hidratos de carbono: violeta con -naftol y

roja con timol. Esta coloración aparece como resultado de la interacción con el a-

naftol o el timol del furfural e hidroximetilfurfural que se forman bajo la influencia del

ácido sulfúrico concentrado (deshidratación de los monosacáridos).

Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo.

Reactivos. a-Naftol, disolución al 0,2% que se prepara disolviendo 0,5 g de -naftol

en 50 mi de alcohol etílico. Timol, disolución al 1% en alcohol. Acido sulfúrico

concentrado. Glucosa, disolución al 0,1% Disolución de proteína.

Marcha de los trabajos. En dos tubos de ensayo se vierten, en cada uno, 2 mi de

disolución de glucosa. Al primer tubo se le añaden de 4 a 6 gotas de disolución de a-

naftol, al otro tubo, de 4 a 6 gotas de disolución de timol. En ambos tubos se deposita

en el fondo, formando una capa, con cuidado, 1 ó 2 mi de ácido sulfúrico

concentrado. Se observa una coloración violeta (en el caso del a-naftol) o roja (en el

caso del timol) en la unión del ácido sulfúrico y la disolución de glucosa.

Se realiza la misma reacción con la disolución de proteína. Se anota la reacción

positiva de reconocimiento del componente de hidrato de carbono.

3.5 Proteínas conjugadas

3.5.1 Aislamento de la desoxirribonucleoproteina

Las desoxirribonucleoproteínas son la componente principal de los núcleos de las

células. Ellas se denominan también proteínas de núcleo o nucleoproteínas. La mejor

fuente de desoxirribonucleoproteína son los tejidos ricos en núcleos celulares

(leucocitos, timocitos, espermatozoides, glándulas linfáticas, esplenitis, hígado,

mamas y el oviducto de las aves). Una propiedad característica de las proteínas de

54


núcleo es su capacidad de formar disoluciones muy viscosas en las disoluciones

concentradas de sales (cloruro sódico y otras), y su insolubilidad en las disoluciones

salinas diluidas.

Al ser precipitadas desde las disoluciones salinas, las proteínas de núcleo se

sedimentan en forma de hilos. Ellas constituyen la parte principal de las llamadas

proteínas estructurales de diferentes tejidos.

Instrumentos: Mortero con machaca. Centrífuga de 2500 ó 3000 revoluciones.

Probetas de centrífuga graduadas (10 mi). Vaso GC- 300 ó 400 mi. Probeta graduada

de 100 mi. Varilla de madera con entallados. Vidrio de reloj. Balanza técnica.

Reactivos: Esplenitis. Glándula linfática, limo o hígado (de conejo o bovino). Cloruro

sódico, disolución 1 N.

Marcha de los trabajos:. 2 g de tejido se desmenuzan primero con tijeras sobre el

vidrio de reloj y luego se trituran en el mortero.

En el mortero se añaden, por porciones pequeñas, de 70 a 80 ml de disolución de

cloruro sódico 1 N, triturando el contenido cuidadosamente durante 10 ó 15 min.

La disolución viscosa obtenida se reparte en las probetas de centrífuga graduadas

(10 ml en cada una) y se centrífuga durante 10 min a una velocidad de 2500 a 3000

r.p.m. Luego el líquido se decanta en la probeta graduada y se mide su volumen.

Se toma un volumen séxtuplo de agua (con respecto al líquido centrifugado), se

vierte en el vaso, y girando lentamente la varilla de madera en el agua, se le agrega

el líquido centrifugado.

Los hilos de proteína de núcleo formados se arrollan sobre la varilla, se trasladan con

cuidado a un tubo de ensayo y se usan posteriormente para realizar las reacciones

de reconocimiento del ADN.

55


3.5.2 Obtención de la nucleoproteína a partir de la levadura

Las levaduras son ricas en ribonucleoproteínas. Estas pueden ser extraídas de las

células de levadura destruidas en un medio alcalino de la disolución, y precipitado

por acidulación.

Instrumentos. Mortero con machaca. Vaso o matraz de 50 a 100 ml. Probeta

graduada de 100ml. Centrífuga de 2500 ó 3000 r.p.m. Probetas de centrífuga

graduadas ( de 10 ml ) . Pipeta de 10 ml. Varilla de vidrio.

Reactivos. Levadura prensada. Éter dietílico. Arena de vidrio. Hidróxido de sodio ,

disolución al 0,4%. Ácido acético, disolución al 5%.

Marcha de los trabajos. En el mortero se colocan 5 g de levadura , se añaden 10

gotas de éter y 10 gotas de agua, una pulgarada de arena de vidrio, se tritura

cuidadosamente. A la masa homogeneizada se le agregan 30 ml de disolución de

hidróxido sódico y se sigue triturando durante 15 min más.

El contenido del mortero se reparte en tres probetas de centrífuga, llevando el

volumen a 10 ml. Se centrifugan durante 5 ó 10 min a 2500 r.p.m.

El líquido de todas las probetas se decanta en un vaso donde se vierte la disolución

de ácido acético (12 ml) removiendo constantemente con la varilla hasta la completa

precipitación de la nulceoproteína.

El precipitado de la nulceoproteína se separa mediante otra centrifugación y se utiliza

para la reacción de hidrólisis.

3.5.3 Hidrólisis de la nucleoproteína

Esta reacción puede verificarse mediante la ebullición de la nucleoproteína con el

ácido sulfúrico al 5% durante 1h. Entonces, la nucleoproteína se desdobla en

proteína y ácido nucleico. Este último se descompone en mononucleótidos

individuales, de los cuales luego se desprenden el ácido fosfórico y las bases púricas

(adenina y guanina). La proteína, mientras tanto, también se somete a una hidrólisis

parcial hasta polipéptidos de bajo peso molecular y aminoácidos. En el hidrolizado

56


pueden ser determinados, consecuentemente, la proteína, las bases púricas, la

pentosa y el ácido fosfórico.

Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. Matraz con refrigerante de reflujo.

Embudo con filtro. Vaso químico de 100 ml

Reactivos: Acido sulfúrico, disolución al 5%.

Marcha de los trabajos: La nucleoproteína obtenida a partir de la levadura se

traslada al matraz para hidrólisis y se le añaden 15 ml de disolución de ácido

sulfúrico al 5%. El matraz se cierra con un tapón provisto de refrigerante de reflujo y

se hierve con cuidado durante 1h.

Al enfriarse, el hidrolizado se filtra en el vaso químico y se utiliza para el análisis de

los productos de hidrólisis.

3.5.4 Detección de las proteínas sencillas

Para este fin pueden emplearse dos reacciones, la del biuret y la de reconocimiento

de la tirosina (Ensayo de Millon).


Reactivos. Hidróxido sódico, disolución al 10%. Sulfato cúprico, disolución al 1%.

Reactivo de Millon (véase su preparación en la pág. 172)

Marcha de los trabajos. En un tubo de ensayo se vierte 0,5ml de hidrolizado

filtrado, éste se neutraliza por el papel de tornasol con hidróxido sódico y se añade

0,5 ml de hidróxido sódico, luego se agregan 2 ó 3 gotas de sulfato cúprico. El tubo

de ensayo se agita y se observa la reacción del biuret positiva ( coloración rosada o

violeta ).

57


En el otro tubo de ensayo se vierte 1 ml de hidrolizado y se añade 0,3 ml de reactivo

de Millon. Se calienta, y el precipitado adquiere un color rosado o rojo ladrillo.

3.5.5 Detección de las pentosas

Se realiza una de las reacciones de oxidación de las aldopentosas. Para ello es

cómoda la reacción con el licor de Fehling.


Reactivos. Hidróxido sódico, disolución al 10%. Reactivo de Fehling ( véase su

preparación en la pág. 96).

Marcha de los trabajos. En un tubo de ensayo se vierte 0,5 ml de hidrolizado y éste

se neutraliza por el papel de tornasol con disolución de álcali.

Al hidrolizado neutralizado se añade igual volumen de reactivo de Fehling, el tubo se

agita, y la capa superior del líquido se calienta. Se observa la aparición de un

precipitado rojo amarillo de óxido cuproso e hidróxido cuproso.

3.6 Glicoproteínas

3.7

Las glicoproteínas son proteínas conjugadas compuestas por las proteínas sencillas

y grupo prostético en cuya composición entran los hidratos de carbono tanto del tipo

de homopolisacáridos, como de heteropolísacárídos. Los grupos prostéticos de

ciertas glicoproteínas se denominan mucopolisacáridos. A los mucopolisacáridos

pertenecen la heparina, los ácidos hialurónico y condroitinsulfúrico. Algunos

mucopolisacáridos contienen ácidos siálicos.

58


3.7.1 Aislamiento de la mucina de la saliva

Las mucinas se encuentran en la saliva, la mucosidad de vías gástricas y de otros

órganos.

La mucína es una proieína de propiedades acidas, insoluble en agua pero muy

soluble en álcalis y en el ácido clorhidrico. De la disolución alcalina la mucina se

precipita con ácido acético, cuyo exceso no disuelve la mucina.

Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Varilla de vidrio

Reactivos. Acido acético, disolución al 1%. Hidróxido sódicdisolución al 10%. Acido

clorhirico, disolución al 0,1%. Sulfato cúprico, disolución al 1%. α-naftol, disolución al

0,2%. Acido sulfúrico concentrado.

Marcha de los trabajos. En tres tubos de ensayo se colecta 1 ó 2 ml. de saliva en

cada uno y se añade, gota a gota, una disolución de ácido acético al 1% hasta

aparecer los floculos de mucina. El precipitado de mucina se lava cuidadosamente

con agua, deteniendo el floculo con la varilla.

1. Después del lavado, al floculo de la mucina en el primer tubo de ensayo se le

añade 1 ml de disolución de hidróxido sódico al 10%, se mezcla, y al diluirse la

mucina, se realiza la reacción de biuret Para ello se añade 5 a 6 gotas de

hidroxido sódico y 1 ó 2 gotas de sulfato cúprico. El tubo de ensayo se agita y

se observa un cambio del color por el rosa o violeta.

2. En el segundo tubo de ensayo se añade 1 ml de disolución de ácido

clorhídrico al 0,1%, y se observa la disolución de la mucina.

3. Al flóculo de mucina en el tercer tubo se le añaden 5 0 6 gotas de ∞-naftol, se

mezcla y se agrega, con cuidado, ácido sulfúrico concentrado. En el límite

entre dos capas de líquido surge una coloración violeta. La reacción es debida

a la presencia, en el grupo prostético, de la mucina de los monosacáridos y

59


sus derivados que bajo la influencia del ácido sulfúrico se convierten en

furfural e hidroximetilfurfural, y estos últimos dan con el α-naftol sustancias

coloreadas.

3.8 Métodos de determinación de la cantidad de proteínas en los tejidos y de

algunos productos de su metabolismo

Una serie de los métodos de determinación cuantitativa de las proteínas se basa en

la medición de la cantidad total de nitrógeno en una muestra pesada de tejido. El

nitrógeno total en las proteínas de los tejidos y órganos anímales es una magnitud

relativamente estable y constituye de 15 a 17%, es decir, un 16% en promedio.

Partiendo de este índi-ce, 16 g de nitrógeno corresponden a 100 g de proteína, y 1 g

de nitrógeno, a 6,25 g de proteína (100:16 = 6,25). La última cifra es coeficiente

proteínico medio. Multiplicando el contenido de nitrógeno en d tejido hallado (en un

tanto por ciento) por 6,25g se calcula el contenido de proteína en ese tejido.

3.8.1 Determinación cuantitativa de la proteína mediante la reacción del

biuret

El método se basa en la capacidad de las proteínas de dar con sulfato cúprico una

coloración violeta cuya intensidad depende de la cantidad de proteína (enlaces

peptídicos) en el tejido a investigar.

Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Embudos con filtros

Espectrocolorímetro. Pipetas de 1 y 10 ml.

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Reactivos. Gelatina, disolución al 1%. Hidróxido sódico (potásico), disolución al

30%. Sulfato cúprico, disolución al 1%. Clara de huevo diluida con agua 4

veces.

Marcha de los trabajos. En un tubo de ensayo se vierten 10 ml de disolución

estándar de gelatina, en el otro, 10 ml de clara de huevo diluida. En ambos tubos

de ensayo se añaden 1 ml de disolución de álcali al 30% y 1 ml de disolución de

sulfato cúprico al 1%, se mezcla bien, se filtra y se mide la coloración.

La cantidad de proteína (%) en una disolución de concentración desconocida se

calcula por la formula:

donde x es la cantidad de proteína, %; 1 es la concentración de la disolución

estándar; h es la altura de la columna del liquido estándar; h1 es la altura de la

columna de la disolución a investigar; 4 es el grado de dilución de la clara de

huevo.

3.8.2 Determinación cuantitativa de la proteína en los líquidos biológicos

con ayuda del ácido nítrico

El método esta basado en la capacidad del ácido nítrico de precipitar la proteína al

cabo do dos minutos, siendo la concentración de la proteína en disolución no

menos de 0,0033%.

Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Pipetas de 1 y 2 ml.

Reactivos. Ácido nítrico concentrado. Disolución de proteína (la preparación: se

separan claras de dos huevos de gallina, se disuelven en 500 ml de agua y se

filtran a través de cuatro capas de gasa).

Marcha de los trabajos. Se numeran 5 ó 6 tubos de ensayo. En el primer tubo de

ensayo se vierte 1 ml de disolución de proteína, en los otros, 1 ml de agua

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destilada en cada uno. En el segundo tubo de ensayo se añade 1 ml de disolución

de proteína, se mezcla con agua, se toma 1 ml de esta mezcla y se traslada en el

tercer tubo de ensayo, se mezcla; se toma 1 ml del tercer tubo de ensayo y se

traslada en el cuarto, se mezcla; se toma 1 ml del cuarto tubo de ensayo y se

traslada en el quinto, se mezcla; desde el quinto tubo de ensayo se toma 1 ml y

se bota en un vaso. De esta manera, se obtiene la siguiente serie de diluciones:

Tabla 1: Diluciones

Numero del tubo de ensayo

Dilución

1

1,0

2

0,5

3

0,25

4

0,125

5

0,062

5

En otros cinco tubos de ensayo se vierten, en cada uno, 2 ml de ácido nítrico

concentrado. Luego 1 ml de disolución de proteína del primer tubo de ensayo se

aplica, con cuidado, sobre el ácido nítrico en el primer tubo de ensayo de esta

serie, anotando el tiempo; del segundo tubo de ensayo también se traslada 1 ml

de disolución de proteína y se aplica sobre el ácido nítrico del segundo tubo de

ensayo, registrando el tiempo, y así se procede con los demás tubos de ensayo. La

ultima disolución en que aparece un anillo blanco de precipitado al final del

segundo o al principio del tercer minuto, contendrá 0,0033% de proteína.

La cantidad de proteína en la disolución a investigar es igual a x = 0,0033.n,

donde n es la dilución en dicho tubo de ensayo.

Este método puede utilizarse para la determinación de la cantidad de proteína

en la orina y otros líquidos biológicos, lo que tiene aplicación en la practica de

veterinaria y medicina.

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3.8.3 Determinación cuantitativa de la proteína según el método de Lowry

Entre los métodos basados en la determinación cuantitativa de las proteínas por sus

reacciones coloreadas, el mis ampliamente usado y el más sensible es el método de

Lowry.

El método de Lowry se basa en la medición de la intensidad de la coloración de la

disolución en que se verifican simultáneamente por lo menos dos reacciones

coloreadas: la reacción del buiret (véase la pag. 165) y la reacción con las unidades de

tirosina y cisteina en la molécula proteínica. Esta reacción consisto en la reducción

de una mezcla de ácidos fosfowolfrámico y fosfomolíbdico (reactivo de Folin) con

formación de un complejo de color azul. La segunda reacción no es muy especifica,

pero muy sensible. Por lo tanto el método de Lowry permite determinar las proteínas

en disoluciones muy diluidas en que su cantidad se expresa en términos de una o

varias decenas de microgramos por mililitro, Como regla, este método se usa para

analizar las proteínas en elevados de las columnas en la cromatografía de

intercambio iónico o en la filtración por gel, como también para determinar las

proteínas en el suero de la sangre, la linfa y los homogeneizados desgrasados de

los tejidos.

Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. Probetas graduadas de 10 y 50 ml.

Pipetas graduadas de 1,5 y 10 ml. Fotoelectrocolorímetro.

Reactivos:

Disolución A: carbonato sódico al 2% en disolución de hidróxido sódico al 1%. Esta

disolución se prepara en tal cantidad que alcance para trabajar con todos los grupos

de disoluciones. Una vez preparada, la disolución se filtra a través de algodón de

vidrio y se guarda en un frasco bien cerrado con tapón de goma.

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Disolución B: sulfato cúprico, disolución al 1%; tartrato potásico, disolución al 2%,

Inmediatamente antes de usar, ambas disoluciones se mezclan en proporción 1:1,

de esta manera se obtiene la disolución B.

Disolución C: la mezcla de 50 ml disolución A y 1 ml de disolución B (exactamente)

que se prepara antes del experimento.

Reactivo de Folin, o disolución D (la preparación: en 700 ml de agua se disuelven

100 ml dc wolframato sódico Na2W04.2H20 y 25 g de molibdato sódico

Na2Mo04.2H2O, se añaden 50 ml do disolución de ácido ortobórico al85% y 100 ml

de ácido clorhídrico concentrado. Esta mezcla se hierve con refrigerante de reflujo

durante 10—12 h. Terminada la ebullición, se agregan 160 g de sulfato de litio, 50

ml de agua y varias gotas de bromo. Para eliminar el exceso de bromo, la se

hierve bajo la campana de humos (sin refrigerante) durante un tiempo de 10 a 15

min. Al enfriarse, la mezcla se diluye con agua hasta 1 L se filtra a través de

algodón de vidrio lavado previamente con agua destilada, El reactivo de Folin se

valora con disolución 1 N de hidróxido sódico según la fenoftaleina, y a base de

los resultados de valoración se diluye con agua hasta obtener la disolución 1 N.

Se guarda en frasco oscuro). Albúmina de huevo, recristalizada cuatro voces.

Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se echa 0,1 ml de suero de la

sangre o disolución de otra proteína, se añaden 9 ml de reactivo C, se mezcla

bien y se deja en re poso durante 10 min a temperatura ambiente.

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Ilustración 3.- Curva de calibración para determinar la concentración de la proteína.

Luego se añaden 0,9 ml de reactivo D y el contenido se mezcla en seguida (!). Las

pruebas se dejan en reposo durante 30 min, al cabo de los cuales la coloración se

prepara con filtro de luz roja. El calculo se hace según el grafico de calibración que

se prepara con disoluciones estándar de albúmina de huevo.

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manual practicas bioquimica

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