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DEMOSTRACION DEL EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURASOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA

1. OBJETIVOS1.1 Demostrar el efecto o influencia del pH sobre la velocidad de reaccin de la amilasa.1.2 Demostrar el efecto o influencia de la temperatura sobre la velocidad de reaccin de la amilasa.

2. INTRODUCCION Las enzimas, en general, al actuar como biocatalizadores, aceleran reacciones qumicas especficas, experimentando cambios fsicos durante ellas, pero recuperando su estado original cuando la reaccin qumica ha terminado. Sin embargo dada la naturaleza proteica de la molcula enzimtica, diferentes factores fsicos y qumicos pueden modificar la actividad de una enzima, siendo lo ms importante la temperatura y el pH. Las enzimas transforman rpidamente los sustratos a temperaturas y a valores de pH ptimos caractersticos para cada una respectivamente.Respecto al pH, las enzimas requieren, para actuar con mxima eficiencia, una determinada concentracin de iones hidrogeno en el medio, por tanto, cada enzima tiene un pH ptimo de accin. El efecto del pH se explica por la accin de la concentracin de protones en la disociacin de distintos grupos del sustrato y en especial de la enzima, que participan tanto en la unin enzima-sustrato y en el mecanismo cataltico mismo, como en el mantenimiento de la determinada conformacin de la enzima. A valores de pH por encima o por debajo del pH optimo, disminuye la actividad enzimtica por lo que, generalmente se describe una curva en forma de campana.Respecto a la temperatura, al igual que el pH, existe un rango, algunas veces muy pequeo, donde es mxima la actividad enzimtica, que est determinado por la magnitud de las variaciones de la velocidad inicial en funcin de la temperatura del medio, lo que significa que la velocidad inicial de reaccin aumentar con la temperatura hasta que se haga prcticamente imposible de medir debido a una activacin. La mayora de las enzimas son completamente inactivadas por encima de los 70 C.La temperatura ptima de reaccin enzimtica es el resultado de un balance entre el incremento en la actividad y la velocidad de destruccin de la enzima. La temperatura ptima no es un valor constante para una enzima dada, sino que depende del tiempo durante el cual se hace la medicin de la actividad. Mientras ms corto sea el tiempo de medicin, ms alta ser la temperatura ptima.Las molculas deben poseer cierta energa de activacin para que puedan reaccionar y las enzimas actan disminuyendo la energa de activacin, permitiendo que la reaccin avance rpidamente. Se puede determinar fcilmente el efecto de la temperatura, exponiendo la enzima a diferentes temperaturas y se mide la cantidad de actividad residual.Para estudiar el efecto de estos factores sobre una reaccin enzimtica, se debe trabajar en condiciones de operacin bien determinadas. Los otros paramentos o factores, deben permanecer constante respecto al factor determinante. Para ello se trabajar como sustrato almidn y se determinara las variaciones del almidn segn procedimiento de identificacin y cuantificacin de sustrato residual, utilizando solucin iodada.

3. MATERIAL METODOS3.1 Material Biolgico :Amilasa

3.2 Materiales:PipetasTubos de ensayosBao maraCocina elctricaBalanza

3.3 reactivosSolucin buffer acetato.Solucin buffer fosfato.Solucin buffer carbonato.Solucin de almidn al 1%.Solucin de enzima al 1%.Solucin NaCl 0.1MHCl 0.05 MSolucin IodadaSol. Cprico alcalino

4. PROCEDIMIENTO:

4.1. OBTENCION DE ENZIMA AMILASA En un matraz colocar saliva aproximadamente 20 -30 mL Mezclar a la misma proporcin con buffer fosfato Con una gasa o algodn proceder a filtrar la mezcla El filtrado corresponde a la enzima4.2. EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA AMILASA SALIVAL.A. Sistema de Incubacin:COMPONENTES Y PROCESOSISTEMA (Tubos)

123

Soluc. Almidn 1%1.01.01.0

Buffer pH 2.53.0--

Buffer pH 6.8-3.0-

Buffer pH 9.0--3.0

Soluc. de NaCl 0.1N0.50.50.5

Mezclar y Pre-Incubar a 37 C por 5 minutos.

Soluc. Amilasa 0.5 %0.50.50.5

Mezclar y Pre-Incubar a 37 C por 15 minutos.

Inmediatamente de transcurrido el tiempo respectivo para cada sistema, prepara y seguir con el siguiente sistema.

B. Valoracin de la actividad enzimtica por el sustrato residual:

COMPONENTES Y PROCESOSISTEMA (Tubos)

Blanco123

Soluc. HCl 0.5N4.04.04.04.0

Agua destilada0.5---

De los tubo 1-3 parte A-0.50.50.5

Solucion Iodada0.50.50.50.5

Mezclar, observar y anotar los resultados en cada sistema, bien de manera cualitativa (de acuerdo a la intensidad del color resultante), o bien de manera cuantitativa (leer en el lapso de 30 minutos bien el fotocolormetro con filtro verde, o bien en espectrofotmetro a 660 nm).4.3. EFECTO DE la TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA AMILASA SALIVAL.A. Sistema de Incubacin:COMPONENTES Y PROCESOSISTEMA (Tubos)

123

Soluc. NaCl 0.2N0.50.50.5

Soluc. Amilasa salival.0.50.50.5

Mezclar y colocar los tubo por 2 minutos en:

Bao de agua heladaSI--

Bao mara a 37 C-SI-

Bao mara 65 C--SI

Soluc. Almidn 1%.1.01.01.0

Incubar por 15 minutos a las mismas temperaturas.

Inmediatamente de transcurrido el tiempo respectivo para cada sistema, prepara y seguir con el siguiente sistema.

B. Valoracin de la actividad enzimtica por el sustrato residual:

COMPONENTES Y PROCESOSISTEMA (Tubos)

Blanco 1Blanco 2123

Soluc. HCl 0.5N4.04.04.04.04.0

Agua destilada0.5----

Soluc. Almidn 1%-0.5---

De los tubo 1-3 parte A--0.50.50.5

Solucion Iodada0.50.50.50.50.5

Mezclar, observar y anotar los resultados en cada sistema, bien de manera cualitativa (de acuerdo a la intensidad del color resultante), o bien de manera cuantitativa (leer en el lapso de 30 minutos bien el fotocolormetro con filtro verde, o bien en espectrofotmetro a 660 nm).

5. RESULTADOS:

INDICADORT1pH 4T2pH 7T3pH8

Color resultanteAmarilloAmarilloAmarillo

Presencia de sustrato residual (Almidn)NoNoNo

Actividad amilsicaSiSiSi

5.1. Cuadro N01: pH

5.2. Cuadro N02: Temperatura CINDICADORT10CT237CT3100C

Color resultanteAmarillo - azuladoAmarilloAzulado

Presencia de almidn residual SiNoSi

Actividad amilsicaNoSiNo

6. DISCUSIONES:

En la primera experimentacin que realizamos con la influencia del pH al medio en actividad enzimtica de la -amilasa hubo un gran error. Ya sea por los resultados que nos dio en la coloracin de los tubos que eran los tres de color amarillenta, lo cual no podra darse en una experimentacin correcta. Lo correcto que se hubiera presentado que el pH en extremos (es decir, muy cidos o muy bsicos) la enzima no funcionaria, o al menos disminuyera notablemente su actividad. Ente los pH 6 y 7 tendra que aparecer el efecto acromtico para su dilucin ptima. Sin embargo, a un pH 4 (ms cido), no se encontrara cambios (es decir, no hubo efecto acromtico). Igualmente con un pH 12 (ms bsico) no hubiera un efecto acromtico. Por lo que los tubos de los pH extremos se hubieran teido de color azul y el nico tubo que se hubiera teido de amarillo sera el de pH neutro.

En la segunda experimentacin que realizamos con la influencia de la temperatura al medio en actividad enzimtica de la -amilasa se dio resultados positivos a lo esperado. Ya sea por la teora que explica que la estructura proteica es la que determina la actividad enzimtica, cualquier causa que perturbe esta estructura puede llevar a una prdida de actividad en este caso la temperatura. Aunque el rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen tener una considerable influencia. En la experimentacin las temperaturas 0 C y a 100 C, al momento de poner la solucin yodada se presentaron cambios de color en los tubos de la gradilla, es decir que el color azul apareci en estos tubos. Por lo tanto, se podra decir que la amilasa no actu. En cambio, a temperatura ambiente se presentaron cambios al momento de poner la solucin yodada, es decir que el color amarillo se present en este tubo. Esto era de esperarse, ya que cada enzima tiene un rango de temperatura ptima y, en el caso de la amilasa, al encontrarse sta en el cuerpo humano (que siempre tiene una temperatura de 37 C), se supone que a temperatura ambiente no va a perder su actividad, pero s disminuirla, ya que los choques intermoleculares van a ser menores dndose el efecto acromtico.

7. CONCLUSIONES

Se logr demostrar que la temperatura es un factor influyente en cuanto a la velocidad de reaccin de la amilasa. No se logr demostrar que el pH es un factor influyente para determinar la velocidad de la amilasa. Por lo que existi un error al momento de realizar la experimentacin.

8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Propiedades generales de las enzimas. [En lnea]. Recuperado el 12 de setiembre del 2014, de http://www.monografias.com/trabajos-pdf900/actividad-enzimatica-amilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf Actividad enzimtica de la amilasa. [En lnea]. Recuperado el 11 de setiembre del 2014, desde http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/parte02/02.html

CUESTIONARIO:

1. Explique qu ocurre en cada uno de los sistemas de incubacin preparados, tanto en efecto del pH como de la temperatura.2. Grafique el efecto del pH y la temperatura sobre la velocidad de reaccin de la amilasa salival y otras enzimas.3. Investigue los pH y las temperaturas ptimas de otras enzimas importantes.4. Defina que es estabilidad enzimtica y explique la pH estabilidad y termoestabilidad de una enzima.5. Defina el punto isoelctrico (pI) de una enzima (protena).6. Describa un procedimiento para demostrar (pI) de una enzima. Ejemplo amilasa salival.SOLUCION DEL CUESTIONARIOSOLUCIN CUESTIONARIO:

1. A valores de pH por encima o por debajo del pH optimo, disminuye la actividad enzimtica por lo que, generalmente se describe una curva en forma de campana.

La velocidad inicial de reaccin de la enzima aumentar con la temperatura hasta que se haga prcticamente imposible de medir debido a una activacin. La mayora de las enzimas son completamente inactivadas por encima de los 70 C.

2.

Efecto de pH

Efecto de Temperatura

3.

EnzimaRango ptimo de temperaturaRango ptimo de PHFuncin

Fitasa30 - 52C4.4 - 5.5Baja el PH del mash. Ninguna otra utilidad

Beta Glucanasa37 - 45C4.5 - 5.0-

Peptidasa45 - 57C4.6 - 5.2Produce Nitrgeno libre de Aminocidos

Proteasa45 - 57C4.6 - 5.2Rompe grandes protenas que producen turbiedad

Beta Amylasa54 - 66C5.0 - 5.6Produce azcares altamente fermentables

Alpha Amylasa68 - 75C5.3 - 5.8Azcares menos fermentables

4. La estabilidad enzimtica es la medida en que una enzima mantiene su actividad o conformacin estructural cuando es sometida al almacenamiento, aislamiento y purificacin o varias otras manipulaciones fsicas o qumicas incluyendo enzimas proteolticas y calor. El pH es una medida del grado de acidez o alcalinidad de una sustancia; el grado de acidez o alcalinidad afecta la estabilidad de algunas sustancias, en particular, sustancias orgnicas Las enzimas son protenas que frecuentemente son inactivadas cuando son expuestas a temperaturas demasiado altas

5. El Punto Isoelctrico est definido como el pH en el cual las cargas positivas igualan a las cargas negativas y no existe movimiento en un campo elctrico. Las funcionalidades de las protenas se ven afectadas cuando se aproximan al pI, debido a la atraccin electroesttica de los grupos con carga opuesta. Las enzimas son activadas en una zona muy restringida de pH, y presenta un punto ptimo de pH donde su actividad es mayor.

6. . Un fenmeno fsico importante es que cuando una molcula est en su punto isoelctrico tiende a precipitarse, el cual representa un principio importante de separacin de protenas. Si se quiere determinar con exactitud el pI de una protena se usa frecuentemente isoelectroenfoque, en el cual se usa un gradiente de pH creado por anfolinas. Sin embargo, esta tcnica resulta costosa y es casi de uso exclusivo para los laboratorios de investigacin. Por otro lado, si se conoce la secuencia de una protena existen programas que permiten conocer el punto isoelctrico, tales como el EditSeq de DNA star. Ya que una protena precipita en su punto isoelctrico, en esta prctica determinaremos el punto isoelctrico aproximado de la casena (protena mayoritaria en la leche) al colocarlos en soluciones con diferentes valores de pH.