Instituto Tecnológico de Bahía de Banderas

Ingeniería Ambiental IV

Microbiología

Practica No.2

PRAPARACION, FIJACION Y TINCION SIMPLE DE UN FROTIS.

Fernando de Jesús Palomares García

La Cruz de Huanacaxtle a 11 de Marzo del 2010.

Practica No. 2

PRAPARACION, FIJACION Y TINCION SIMPLE DE UN FROTIS.

OBJETIVO El alumno aprenderá las técnicas de preparación de frotis, fijación y coloración más

utilizadas en el estudio de microorganismos de cultivo bacteriano obtenidos en medios sólidos y líquidos.

Identificara las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterización morfológica de estos microorganismos.

INTRODUCCION. Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos se requiere de un microscopio óptico ya sea de campo claro o de campo oscuro para hacer la descripción morfológica de estos. El microscopio de uso más común es el microscopio de campo claro, en el que la observación de células vivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso de gran cantidad de luz. La utilización de frotis teñidos es más recomendable, el frotis se prepara haciendo una extensión de los microorganismos en una superficie transparente donde se fijan y tiñen. Podemos tener tinciones: Simple, diferencial, negativa y selectiva. Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos cagados conocidos como cromóforos por ejemplo: Cloruro de azul de metileno. Si el cromóforo es un ion positivo del colorante es de tipo básico y si la carga es negativa es de tipo acido.

MATERIALES REQUERIDOS. 1 probeta graduada. Vaso de precipitado. 100 o 250 ml. Mechero. Asa de siembra. Porta objetos. Piceta con agua destilada. Microscopio compuesto de campo claro. Azul de metileno. Alcohol etílico. Aceite de inmersión. PROCEDIMIENTO. FROTIS.

METODOLOGIA 1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos y etiquetarlos. 2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo. 3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. 4. Acercar el mechero al tubo de ensayo quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo, introducir el asa y tomar cuidadosamente la muestra. 5. Los cultivos líquidos son colocados en el porta objetos, extenderla suavemente en un área circular y esterilizar el asa nuevamente. Dejar enfriar el frotis. 6. En los sólidos se deposita una gota de agua al centro y se toma la muestra que será homogenizada y expandida en la superficie en forma circular.

FIJACIÓN. 1. Se fijan los cultivos líquidos con una gota de alcohol y dejar secar alejado del mechero. 2. Los cultivos sólidos completamente secos se fijan con calor.

TINCION SIMPLE. 1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos o 1 minuto. 2. Eliminar el exceso lavando con agua corriente o con ayuda de la Piceta con agua destilada.

3. Dejar secar. 4. Realizar observación al microscopio.

OBSERVACIÓN. 1. Limpiar los objetivos y el ocular del microscopio. 2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación. 3. Colocar el porta objeto en la platina y localizar la preparación con el objetivo 10x posteriormente el 40x. Para el objetivo 100x se coloca previamente una gota de aceite de inmersión en la preparación. 4. Al finalizar limpiar nuevamente el microscopio. 5. Reportar observaciones.

DESARROLLO1. Se Lavaron los portaobjetos, se etiquetaron con una “S” para muestra seca y con una “L”

para muestra liquida.2. Para la muestra seca, se fijo con el mechero, haciéndole pequeñas pasadas del porta

objetos por el fuego.3. Después se destapo el tubo de ensayo se flameo al quitarle la taparrosca, previamente se

calentó la aza al rojo vivo, para desinfectarla; con la aza se tomo la bacteria del tubo de ensayo para colocarla en el portaobjetos.

4. En el líquido solo se tomo la muestra y se puso en el porta objetos. Se dejo secar.5. La muestra liquida se fijo con una gota de alcohol, mientras que la muestra seca se fijo con

calor.6. Después de secarse las muestras se les coloco azul de metileno durante un minuto. Luego

se les quito el exceso con agua destilada.

RESULTADOS

No en todos los frotis se logro observar con claridad, pues en algunos fue fallida la técnica, pero como opción preventiva se realizaron 6 frotis, para que se lograra observar por lo menos 1. De lo observado, se logro observar poco debido a que no tomo debidamente la coloración.

DISCUSIÓN

La clave de la realización de la tinción simple en seco, está en que al momento de la fijación, esta debe de ser cuidadosamente, pues se corre el riesgo de que se queme la muestra; por otro lado también al momento de retirar el exceso de azul de metileno con agua, debe ser de una manera lenta y cuidadosa, pues se corre el riesgo de que se vaya con todo y muestra.

CONLUSION La observación de bacterias mediante esta técnica no es muy precisa pero se logran algunas buenas observaciones con el lente 100X.

ANEXOS